NO152937B - Fremgangsmaate til fremstilling av et attenuert panelukopeni-virus - Google Patents

Abstract

FREMGANGSMÅTE TIL FREMSTILLING AV ET ATTENUERT PANLEUKOPENI-VIRUS.

Description

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte til fremstilling av attenuert Panleukopenivirus stamme B W 10 3 som er deponert i Institut fiir Hygiene und Epidemiologie i Prag nr. CNTCC

AO 3/77.

Kattepest er en felidenspesifikk virussykdom. Frembringer-

en, en parvovirus, har en elektronemikroskopisk størrelse på 20 - 25 nm. Viruset overføres over åndedretts- og for-døyelseskanalen, over nesesekretet og avføring utskilles det. Etter en inkubasjonstid fra 2 til 6 dager begynner sykdommen med f6rvegring, feber, brekninger, for det meste diaré og økende svakhet med uttørkning på grunn av væsketap. Som karakteristikum opptrer en høygradet panleukopeni. Letali-teten utgjør inntil 90 %.

Katter som overlever sykdommen blir immune. De kan over kolostralmelk overføre antistoff til unge katter. Imidler-

tid også de er snart uten beskyttelse, da de maternale antistoff etter hvert avbygges.

Kattepest er utbredt verden over, infektiositeten og pato-geniteten av dens frembringere er meget stor og kattene derved meget truet.

Det er allerede forsøkt å utvinne et til fremstilling av et kattepestvaksine egnet attenuert virus ved passasjer i vevkulturer. Minst seks passasjer, spesielt ti til tredve passasjer er imidlertid ikke tilstrekkelig til å oppnå et stabilt attenuert virus som kan tjene som aktivt prinsipp til vaksinen. Det iakttas nemlig at podningsviruset utskilles og opptas av andre katter. Ved slike dyrepassasjer kan det komme til tilbakemutasjoner.

For formering av den attenuerte kattepestvirus er det også allerede benyttet embryonalvev fra katter. Katteembryonet er imidlertid meget lite vev, således at denne metode for-

byr seg av økonomiske grunner.

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte til fremstilling

av en attenuert panleukopeni-virus stamme B W 103 som er deponert i Institut fur Hygiene und Epidemiologie i Prag under nr. CNTCC AO 3/77, idet fremgangsmåten er karakterisert ved at man passerer patogen panleukopeni-virus minst 80 ganger på kattenyreceller, og deretter minst 18 ganger

på permanente vevceller fra felider eller mustelider, fortrinnsvis på Crandells kattenyrecellelinje.

Det første trinn ved attenueringen som hensiktsmessig om-fatter 80 til 100 passasjer foregår i cellekulturer av katte-nyrer, som kultiveres i et for celleformering vanlig næringsmedium. Kulturen av cellene kan såvel foregå som celleplen-er som også som cellesuspensjon. Det må overholdes en temperatur fra 35 til 39°C, fortrinnsvis 36,5 til 37,5°C. En slik kultur skal infiseres tidlig, senest imidlertid når cellene er utvokset til ca. 75 %. Som infeksjonsmedium tjen-er det overstående av den på forhånd infiserte cellekul-

tur. Det tilsttes den nye cellekultur i forhold 1:5 til 1:120. 2 til 16 dager etter infeksjonen kan det overstående utvinnes og overføres på neste cellekultur.

Etter 80 til 100 passasjer på den omtalte måte overføres det virusholdige overstående på en permanent vevcellekultur av felider eller mustelider. Tilsvarende permanente kulturer er kjent fra litteraturen. Et eksempel på slike permanente cellekulturer er Crandells kattenyrecellelinje, en permanent kattenyre-celle. Infeksjonenn av dennne cellekultur med det overstående fra en infisert cellekultur og den videre forarbeidelse foregår som tidligere omtalt.

Etter minst 18 passasjer i permanente vevceller er viruset tilstrekkelig attenuert. Det er helt apatogent, uskadelig og godt forenlig. Ved attenueringen taper det ikke i immu-nogenitet og den herav fremstilte vaksine har gode immuniserende egenskaper.

Det attenuerte virus, som har den vitenskapelige beteg-nelse "panleukopeni-virus, stamme B'W 103" ble deponert i Instituttet for Hygiene og Epidemiologi, Prag, under regi-streringsnummer CNTCC AO 3/77.

Det således attenuerte virus kan formeres i vevkulturer av kattefostere. Hertil egner det seg spesielt fostre som ble uttatt i stadiet for organogenese omtrent i siste tredjedel av drektigheten. For anlegg av vevkulturer kan fostrene forarbeides samlet eller deler herav. Det lønner seg ikke for cellekulturen å anvende ekstremiteter, hodet og huden. Cellene opparbeides på vanlig måte, f. eks. ved trypsinering anlagt som stasjonærkultur, som rullekultur eller som suspen-sjonskultur og infiseres som tidligere omtalt med det attenuerte virus for formering. Innhøstningen av det overstående foregår etter 2 — 6 dager. De infiserte cellekulturer kan viderekultiveres under tilsetning av ny næringsoppløsning. Denne operasjon kan gjentas flere ganger, f. eks. ved den stasjonære kultur minst 4-6 ganger og ved rullekulturen minst 20-25 ganger. Deretter er cellene generelt uttømt. Ved siste opparbeidelse kan cellene for fremstilling av et større utbytte eksempelvis ødelegges ved dypfrysing eller ultralydbehandling.

Det ved opparbeidelsen av formeringskulturen oppnådde

material kan opparbeides på vanlig måte til et podningsstoff. Det lønner seg å tilsette en stabilisator, eksempelvis gela-tin, kjøttekstrakt, pepton- eller sukkeroppløsninger,spesielt når det er foreskrevet en lyofilisering av podningsstoffet. En slik lønner seg på grunn av den bedre holdbarhet. Podningsstoffet kan imidlertid også anvendes som væskepodnings-stoff. Tilsetningen av et av de vanlige adjuvanter er hvis ønsket mulig.

Podningsstoffet kan - hvis det foreligger i lyofilisert form, etter oppløsning i en av de hertil vanlige oppløsningsmid-ler administreres subkutant eller intramuskulært. Det har

i forhold til kjente podningsstoffer følgende fordeler:

1) Stor renhet av antigenene.

2) Ved formering på homolog vev ingen fremmedeggehvite-reaksjoner. Ved gjentatt administrering ingen sjokkreak-sjoner eller allergi. 3) Jevntblivende kvalitet og renhet av podeviren, da formeringen foregår på et enhetlig undersøkt cellesubstrat.

4) Hurtig beskyttelse.

Panleukopenilevende podningsstoff ble

undersøkt i en rekke undersøkelser og prøver i laboratorium og i dyreforsøk på egenskaper, tålbarhet, uskadelighet og virkning.

Forsøk og resultater:

Uskadelighet.

Undersøkelser på uskadelighet foregikk på hvite mus og marsvin. 5 mus podes subkutant med hver 0,5 ml av den gjenoppløste vaksine. 2 marsvin får hver 2 ml intraperitonealt. I løpet av en iakttagelsestid på 10 dager må forsøksdyrene forbli friske. Spesiell verdi ble lagt på uskadelighets- og tål-barhetsundersøkelse hos katt. I kontrollerte laboratorie- og feltforsøk ble podestoffet subkutant eller intramuskulært podet på 962 overveiende isolert holdte katter og 174 storkatter, som løver, tigre, geparder osv.

og iakttatt vanligvis 14 dager, delvis flere uker.

Etter kontrollen av lokale og generelle reaksjoner foretas ved laboratorieforsøk også leukozyttelling. Derved viste det seg at podningsstoff ble tålt godt. Også podningen av SPF (SPF = spesifisert patogenfri) - katter, som delvis ble holdt isolert over 2 år ga ingen anledning til beklagelse.

Stabilitet

For en jevntblivende god virkning av podningsstoffet ifølge oppfinnelsen er det ved siden av virustiteren nødvendig med en god holdbarhet. Undersøkelsen av denne foregikk ved fastslåelse av innhold av podevirus etter lagring av pod-ningsstof f et ved forskjellig temperatur inntil 24 måneder etter fremstillingen. De oppnådde antigentitere fremgår av tabell 1.

Virkning og tålbarhet

Ved siden av undersøkelse av innholdet av levende podningsvirus ved virustitrering i cellekultur ble produktet ifølge oppfinnelsen undersøkt i en rekke immuniseringsforsøk på katt. Den sto-re utbredelse av panleukopenivirus og andre felidepatogene frembringere må tas hensyn til ved foretak av forsøkene ved innkjøpt katt ved tilsvarende karanteneholding. For å unngå fremmedinfeksjoner og å oppnå nøyaktige forsøksresultater er det hensiktsmessig å anvende spesifisert patogenfri katt, så-kalt SPF-katt.

Dyreforsøk nr. 1.

I et første dyreforsøk ble det undersøkt virkningen og tål-barheten av podestoffet på 6 SPF-katter. Av de i et isolerings-anlegg felles anbragte katter ble 4 vaksinert subkutant med podningsstoffet. 2 katter forble som upodede kontroller. Ved siden av en undersøkelse av den generelle sunnhetstilstand, ble det spesielt påsett om det etter administrering av podningsstoffet opptrådte en merkbar nedgang av leukozytverdien i forhold til en ikke-podet katt. Dette var i foreliggende og ytterligere forsøk ikke tilfelle. Virkningen ble undersøkt serologisk ved antilegememåling og etterfølgende belastningsinfeksjon. Resultatet av denne undersøkelse gjengis sammen-fattet i tabell 2. Herav sees at før podningen var kattene panleukopenifølsomme. 2 uker senere var de podede katter allerede serologisk immune og belastbare, kontrollene derimot forble beskyttelsesløse og fikk infeksjon.

Dyreforsøk nr. 2.

Podningsstoff som inneholder levende apatogen panleukopeni-virer fører vanligvis til en hurtig podningsbeskyttelse,

som fremfor alt er å tilskrive fenomenet interferens. Derved hindres formeringen av patogen virus i vertscellen ved podningsvirus. I et forsøk på 12 unge katter ble det under-søkt om disse allerede 72 timer etter administrering av podningsstoffet er beskyttet tilstrekkelig mot en belastningsinfeksjon. Resultatet av disse undersøkel-ser gjengis i tabell 3. Forsøket viser at podningsstoffet er i stand til å beskytte mot panleukopeni på kort tid, nemlig i løpet av 3 dager. Alle kattene var før podningen ubeskyttet.

3 dager senere motsto allerede de podede dyr en belastnings-inf eks jon med patogen panleukopenivirus. Ved en etter belast-ningsinf eks jon foretatt daglig leukozyttelling, som strakk seg over to uker ble det fastslått at kattene utseendemessig forble sunne og ikke viste tydelig leukozytfall. De under undersøkelsestiden fastslåtte utgangs- og minimalverdier ble innført i tabell 3. Et leukozytfall under 2000/mm 3 er vanligvis et karakteristisk sykdomstegn for panleukopeni. De ikke-podede kontrollkatter ble mer eller mindre sterkt syke av panleukopeni, idet 4 av 6 dyr fikk infeksjon.

Dyreforsøk nr. 3.

Ifølge dyreforsøk 2 beskytter podningsstoffet fremstilt fra

det svekkede viruset allerede 3 dager etter vaksinasjon (3 d.p.v.) for en sykdom av panleukopeni (PL).. For

å fastslå om samme vaksine også allerede før 3. d.p.v. gir en beskyttelse mot PL, ble det utført nedenstående forsøk.

16 for panleukopeni følsomme katter ble vaksinert med hver 1 dose av podningsstoffet og oppdelt i 4 grupper på hver 4 dyr. En gruppe herav ble allerede umiddelbart etter vaksinasjonen

i andre grupper i rekkefølge hver gang i avstand på 1 dag belastet med patogen panleukopenivirus, seks ubehandlede kontrollkatter ble sammen med siste gruppe infisert på 3 d.v.p. Som tabell 4 viser, viser dette forsøk at podningsstoffet allerede en dag etter vaksinasjonen formår å beskytte en del av de podede katter for en sykdom av panleukopeni. Av fire katter av angjeldende gruppe ble det sykt og døde bare ett dyr av panleukopeni, de andre tre dyr forble friske.

Av dyrene som ble belastet to dager etter vaksinasjonen viste bare en av fire katter på 4. og 5. dag etter infeksjonen et lite leukozytfall, (til 4200 resp. 5100/mm<3>). De katter som ble infisert tre dager etter vaksinasjonen motsto belastningen uten reaksjon.

Av kontrollkattene døde alle av panleukopeni.

Ytterligere detaljer kan utledes av tabell 4.

Dyreforsøk nr. 4.

For undersøkelse av beskyttelsesvarigheten ble det gjennom-ført et ytterligere forsøk på SPF-katter som ble holdt under streng isolering. Av 10 SPF-katter fikk 8 hver en dose av podningsstoffet subkutant. De to ikke-podede kontrollkatter ble for undersøkelse av utskillelse og en eventuell videre-forarbeidelse av podeviruset resp. PL-virus-innføring anbragt i samme rom. Hos alle katter ble det uttatt blodprøver til antilegememåling. Resultatene av denne undersøkelse fremgår av tabell 5. Forsøket viser at podningsstoffet fører til en aktiv immunitet med en høyverdig antilegemetiter som gir podede katter over det samlede iakttagelsestidsrom en tilforlatelig beskyttelse mot panleukopeni. Det viser også at kontrollkattene forblir antilegemefri. Det betyr at under forsøkstids-rommet foregikk verken en videreutbredelse av podningsviruset eller en innføring av PL-virer, som ved podningene ville ha ført til en naturlig bostering, resp. kontrollene til en pan-leukopenisykdom med etterfølgende antistoffutvikling. Da forsøkskattene daglig ble passet og iakttatt kunne det fast-slås at under det samlede forsøkstidsrom opptrådte ingen reaksjoner som lot slutte til en utålbarhet eller skadelighet. Patogen panleukopeni-virus som var isolert fra en katt som var død av panleukopeni, ble brukt til infisering av en katt som ble avlivet 7 dager senere i sterk syk tilstand med en laukocyttverdi på 200 mm3 .

Nyrene ble fjernet og behandlet i en 25%-ig trypsinoppløs-ning for utvinning av en cellesuspensjon. Den dannede virussuspensjon sedimenteres og sedimentet suspenderes i forhold 1:300 i et kulturmedium av følgende sammensetning:

52,2% Hanks' medium

5,8% laktalbuminhydrolysat

20,0% Tissue Culture Medium 199

20,0% kalveserum

1,0% natriumhydrogenkarbonat (5%-ig)

1,0% NSP-oppløsning.

Suspensjonen holdes ved 37°C, derved kommer det til en formering av panleukopeni-virusen i cellene. Viruset kan påvises ved overføring av den overstående kultur på friske katter.

Viderekultiveringen av virusen foregår som følger: Av friske katter uttas nyrene og trypsineres på ovennevnte måte og suspenderes i næringsoppløsningen. Når cellemassen er utvokst til ca. 75%, podes den med det overstående virusholdige fra panleukopeni-viruskulturen.

Hertil blandes det overstående med friskt næringsmedium

i forhold 1:10 og helles over cellene. Etter fire dager frahelles det overstående som inneholder den formerte panleukopeni-virus. Etter ca. 80 gangers gjentagelse er-stattes de inntil da anvendte kattenyreceller ved en permanent kattenyrecellelinje ifølge Crandell og passasjene gjentas enda 17 ganger.

For kultiveringen av stabile kattenyreceller anvendes følgende medium:

10 % Eagle's Medium

10 % kalveserum

1,5% natriumhydrogenkarbonat (5%-ig)

1,0% NSP-oppløsning

ad 100% Aqua bidest.

Ved viruspodning reduseres serumdannelsen til 3%. Etter 103. passasje har virusen tapt sin patogenitet, men beholder sine gode immuniserende egenskaper. Den kan anvendes for fremstilling av et podningsstoff.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av et attenuert panleukopeni-virus stamme BW 103 som er deponert i Institut fur Hygiene und Epidemiologie, i Praha, under nr. CNTCC AO 3/77,karakterisert ved at man passerer patogen panleukopeni-virus minst 80 ganger på kattenyreceller og deretter minst 18 ganger på permanente vevceller fra felider eller mustelider, fotrinnsvis på Crandells kattenyrecellelinje.