FI60408B - Foerfarande foer framstaellning av vaccin mot parvovirus-panleukopeni hos felider - Google Patents

Description

ESSF^l ΓβΙ m>KUULUTUSJULKAISU ^γΛ/Aq MA lBJ (11) UTLÄGGNINGSSKRIFT 0U4UÖ C Patentti ayönnetty 11 01 1932 ^ Patent «eddelat ^ ^ ^ (51) Ky.ik?/int.ci.3 C 12 N 7/08, A 61 K 39/23 SUOMI_FINLAND (21) ρ«·η«ιι·Α·π*Μ—αμλμλλιολ»* ττοιδι (22) HtkrnnlspCM —AMBkninpdtg 20.01.77 (23) AlkupUvt—Glltl|h«tsdag 20.01.77 (41) Tullut iutklMksI — Bllvlt offtmllg 2h. 07.77

Patentti, ja rekist«rih.llitu. n·***— j. kuuLJulk^uu

Patent- och registerstyrelsen ' ' Anrtkan utlagd och utl.»krift«m publicared 30.09.8l (32)(33)(31) Pyydetty «tuolkuut—Bagird prioriuc 23.01.76

Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken

Tyskland(DE) P 2602^78.2 (71) Behringvrerke Aktiengesellschaft, Marburg/Lahn, Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (72) Othmar Ackermann, Marburg/Lahn, Helmut Stegmann, Riichenbach, Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (7*0 Oy Kolster Ab (5*0 Menetelmä rokotteen valmistamiseksi kissaeläinten parvovirus-panleukope-niaa vastaan - Förfarande för framställning av vaccin mot parvovirus-pan-leukopeni hos felider

Keksinnön kohteena on menetelmä rokotteen valmistamiseksi kudos-viljelmässä kissaeläimien parvovirus-panleukopeniaa vastaan.

Kissarutto eli maha-suolitulehdus on kissaeläimille ominainen virussairaus. Elektronimikroskopian mukaan sen aiheuttajan, erään parvo-viruksen koko on 20-25 nm. Virus tarttuu hengitys- ja ruoansulatus-tiehyiden kautta ja poistuu nenäerityksen ja ulosteiden mukana. 2-6 päivän inkubointiajän kuluttua sairaus alkaa ruokahaluttomuutena, kuumena, oksennuksena, yleensä ripulina, lisääntyvänä voimattomuutena ja nestehukasta johtuvana kuivumisena. Tunnusomaista on erittäin voimakas yleisvalkosolukato (panleukopenia). Kuolleisuus on jopa 90 %.

Sairaudesta parantuneet kissat ovat immuuneja. Ternimaidon välityksellä ne voivat siirtää vasta-aineita nuoriin kissoihin. Mutta nämäkin ovat pian suojattomia, koska äidistä peräisin olevat vasta-aineet hajoavat vähitellen.

Kissarutto on levinnyt kaikkialle maapallolle, ja sen aiheuttajan tarttuvuus ja patogeenisuus on erittäin suuri. Siten kissat ovat sille hyvin alttiita.

2 60408

Aikaisemmin on jo yritetty saada elävän kissaruttorokotteen valmistukseen sopiva heikennetty virus kudosvi1jelmäsarjän avulla (ks. US-patentti 2 293 130). Vähintään kuusi, muttei edes 10-30 vaihetta kuitenkaan riitä pysyvän heikennetyn, rokotteen tehoaineena toimivan viruksen saamiseksi. On nimittäin havaittu, että rokotevirus voi erittyä rokotetusta eläimestä ja joutua muihin kissoihin. Viruksen siirtyessä eläimestä toiseen voi tapahtua takautuvia mutaatioita.

Heikennetyn kissaruttoviruksen valmistamiseen on käytetty myös kissan sikiökudosta. Kissan sikiöistä saadaan kuitenkin hyvin vähän kudosta, joten taloudellisista syistä tämä menetelmä on sopimaton .

On myös tunnettua pienentää mahdollisesti esiintyvä kontaminaatio muilla kissan viruksilla siten, että heikennetty panleukopenia-virus siirretään frettisoluviljelmällä (US-patentti 3 892 627).

Nyt on keksitty menetelmä panleukopeniarokotteen valmistamiseksi, jolle on tunnusomaista, että patogeenistä panleukopeniavirusta siirretään sarjana vähintään 80 kertaa kissan munuaissoluilla, ja sitten vähintään 18 kertaa kissaeläimen tai turkiseläimen pysyvillä kudossolu-linjoilla, edullisesti Crandell-soluilla, ja viljellään näin saatua heikennettyä virusta kissan sikiösolulinjoilla, jolloin mahdollisesti saanto korjataan useita kertoja, jonka jälkeen otetaan heikennetty virus, joka on talletettu merkinnällä CNTCC AO 3/77 laitokseen "Institut fur Hygiene und Epidemiologie", Praha, Tsekkoslovakia, talteen ja työstetään se tavanomaisella tavalla rokotteksi.

Heikentämisen ensimmäinen vaihe, joka sopivimmin sisältää 80-100 viljelyvaihetta, suoritetaan kissan munuaissoluviljelmällä. Viljely voi tapahtua tavanomaisissa soluviljelyravinnealustoissa. Soluviljely voidaan suorittaa sekä solupäällys- että solususpensioviljelmänä. Lämpötila pidetään 35°-39°C:ssa, edullisesti 36,5° -37,5°C:ssa. Tällainen viljelmä voidaan tartuttaa aikaisin ja viimeistään, kun solut ovat kasvaneet n. 75-%:sesti. Tartuntaväliaineena voidaan käyttää edellisen tartutetun soluviljelmän päällä olevaa nestettä. Uuteen soluviljelmään sitä lisätään suhteessa 1 : 5-1 : 20. Päällä oleva neste voidaan erottaa 2-6 päivää tartuttamisen jälkeen ja siirtää seuraavaan soluviljelmään.

Kun kuvatulla tavalla on suoritettu 80-100 siirtoa, virus-pitoinen, viljelmän päällä oleva neste siirretään kissaeläimien tai turkiseläimien (Mustelidae) pysyvälle kudossoluviljelmälle. Nämä pysyvät viljelmät ovat tunnettuja kirjallisuudesta. Esimerkki tällai- > ·'' · 3 60408 sista pysyvistä soluviljelmistä on Grandell-solu, joka on kissan pysyvä munuaissolu. Tämän soluviljelmän tartuttaminen tartutetun soluviljelmän päällä olevalla nesteellä ja edelleenkäsittely suoritetaan yllä kuvatulla tavalla.

Kun virusta on siirrostettu vähintään 18 kertaa pysyviin kudosviljelmiin, se on heikentynyt riittävästi. Se on täysin tautia aiheuttamaton, vaaraton ja hyvin siedettävissä. Heikennys ei vaikuta immunointikykyyn, ja viruksesta valmistetulla rokotteella on erinomaiset immunointiominaisuudet. Heikennetty virus, jonka tieteellinen nimitys on "Panleukopenia-virus, kanta BW 103”, on deponoitu numerolla CNTCC AO 3/77 (Institut fur Hygiene und Epidemiologie, Praha).

Tällä tavalla heikennettyä virusta voidaan lisätä kissan sikiöiden kudosviljelmissä. Erityisen sopivia ovat sikiöt, jotka on erotettu elinten kehitysvaiheessa, so. raskauden viimeisellä kolmanneksella. Kudosviljelmissä voidaan käyttää koko sikiötä tai osia siitä. On suositeltavaa, että soluviljelmässä ei käytetä raajoja, päätä tai ihoa. Solut käsitellään tavalliseen tapaan esim. tryps.ini-soimalla kiinteänä viljelmänä, pyöritysviljelmänä tai suspensio-viljelmänä ja viruksen lisäämiseksi solut tartutetaan yllä kuvatulla tavalla. Tuote erotetaan 2-6 päivän kuluttua. Tartutettuja soluviljelmiä voidaan viljellä edelleen lisäämällä uutta ravinneliuosta. Tämä vaihe voidaan toistaa useita kertoja, esim. kiinteissä viljelmissä vähintään 4-6 kertaa ja pyöritysviljelmissä vähintään 20-25 kertaa. Tämän jälkeen solut on yleensä käytetty loppuun. Viimeisessä käsittelyvaiheessa solut voidaan saannon parantamiseksi tuhota esim. syväjäädyttämällä tai ultraäänikäsittelyllä.

Tällä tavalla saatiin ensimmäisen kerran sellainen heikennetty panleukopeniavirus, joka ei enää ollut patogeeninen kissa- ja turkiseläimille ja joka ei pystynyt levittämään sairautta.

Lisäksi osoittautui, että kissan munuaissolulinja oli yllättävän kestävä; heikennettyä virusta voitiin ottaa talteen lukuisia kertoja, jopa 20-25 kertaa.

Lisääntymisviljelmiä käsittelemällä saatu aines voidaan tavalliseen tapaan käsitellä rokotteeksi. On suositeltavaa lisätä stabilisaattori, esim. gelatiinia, lihauutetta tai peptoni- tai sokeri-liuoksia erityisesti silloin, kun tarkoituksena on lyofilisoida 4 60408 rokote. Tämä on suositeltavaa paremman kestävyyden saavuttamiseksi. Haluttaessa voidaan lisätä tavanomaisia apuaineita.

Kun lyofilisoidussa muodossa oleva rokote on liuotettu sopiviin liuottimiin, se voidaan antaa ihon alle tai lihakseen. Tunnettuihin rokotteisiin verrattuna sillä on seuraavat edut: 1) Vasta-aineiden suuri puhtaus.

2) Koska virus lisääntyy homologisessa kudoksessa, vieraiden proteiinien aiheuttamia reaktioita ei esiinny. Annettaessa toistuvasti ei ilmene shokkireaktioita eikä allergisia reaktioita.

3) Rokotevirus on tasalaatuista ja puhdasta, koska se lisääntyy yhtenäisellä, tutkitulla solualustalla.

4) Nopea suojavaikutus.

Keksinnön mukaan valmistetun elävän panleukopeniarokotteen ominaisuuksia, siedettävyyttä, vaarattomuutta ja tehoa testattiin useissa laboratoriotutkimuksissa ja -kokeissa sekä eläinkokeilla.

Kokeita ja tuloksia

Vaarattomuus

Vaarattomuuskokeet suoritettiin valkoisilla hiirillä ja marsuilla. Viidelle hiirelle annettiin kullekin 0,5 ml uudelleenliuo-tettua rokotetta ihon alle ja kahdelle marsulle kummallekin 2 ml vatsaonteloon. Koe-eläimien oli pysyttävä terveinä 10 päivän tark-kailuajan. Erityistä huomiota kiinnitettiin kissalla suoritettuihin vaarattomuus- ja siedettävyyskokeisiin. Tähän saakka on kontrolloiduissa laboratorio- ja kenttäkokeissa annettu keksinnön mukaisesti valmistettua rokotetta ihon alle tai lihakseen pääasiassa eristettynä pidetylle 962 kissalle ja 174 suurelle kissaeläimelle, esim. leijonille, tiikereille ja gepardeille. Tavallinen tarkkailu-aika oli 14 päivää ja osaksi useita viikkoja. Paikallis- ja yleis-reaktioiden tarkkailun lisäksi laboratoriokokeissa laskettiin valkosolujen määrä. Todettiin, että keksinnön mukaisesti valmistettu rokote oli vaaraton. Siedettävyys oli hyvä (ks taulukko 5).

Myös ST-kissojen (ST = spesifisesti patogeeniton), joista osa oli pidetty eristettynä yli kaksi vuotta, rokottaminen ei antanut aihetta huomautuksiin.

5 60408 Säilyvyys

Keksinnön mukaisesti valmistetun rokotteen hyvän tehon säilymiseksi on viruspitoisuuden ohella tarpeen sen hyvä säilymiu-kyky. Tämä testattiin määrittämällä rokoteviruksen pitoisuus varastoitaessa rokotetta eri lämpötiloissa 24 kuukauteen saakka valmistuksesta. Saadut vasta-ainepitoisuudet ilmenevät taulukosta 1.

Taulukko 1

Rokotteen säilyvyyskoe varastoitaessa eri lämpötiloissa.

. . 4 833 Lähtöpitoisuus valmistuksen jälkeen: 10 5 ID^/ml

Varastointiaika Viruspitoisuus LDrn varastointilämpöti-

lassa bU

+ 37°C + 20°C + 10°C + 4°C - 35°C

1 viikko 103’833 3 viikkoa 103’375 1 kuukausi ΙΟ3’375 104’166 2 kuukautta 101,50 104,375 3 kuukautta ΙΟ1’375 104’375 104’833 1Q4,833 4 kuukautta ei virusta 104’^83 6 kuukautta 1Q3’33 pg4»833 ^4,625 1Q4,833 9 kuukautta 103,50 10 12 kuukautta ΙΟ3’3 ΙΟ4’823 2.04’333 ]_q^»833 18 kuukautta ]_q2,625 pg4,625 pg4,833 -^4,833 24 kuukautta ΙΟ2’525 104’5 iq4’833 1q4,833 6 60408

Teho ja siedettävyys

Keksinnön mukaisesti valmistettua tuotetta testattiin sarjalla kissalla suoritettuja immunisointikokeita. Suoritettaessa kokeita karanteenissa pidetyillä kissoilla on otettava huomioon panleukopeniaviruksen ja muiden kissaeläinten taudinaiheuttajien laaja levinneisyys. Vieraiden tartuntojen estämiseksi ja tarkkojen koetulosten saamiseksi on syytä käyttää spesifisesti patogee-nittomia, ns. ST-kissoja.

Eläinkoe n:o 1

Ensimmäisessä eläinkokeessa testattiin esimerkin mukaisesti valmistetun rokotteen (valmistuksessa käytetty Crandell-soluja) tehoa ja siedettävyyttä kuudella ST-kissalla. Yhteisessä eristys-tilassa olleista kissoista neljälle annettiin rokote ihon alle.

Kaksi kissaa toimi rokottamattomina vertailukohteina. Yleisen terveydentilan tarkastuksen lisäksi kiinnitettiin erityistä huomiota siihen, alensiko rokote selvästi valkosoluarvoja rokottamattomiin kissoihin verrattuna. Näin ei tapahtunut tässä eikä seu-raavissa kokeissa. Tehoa testattiin serologisesti laskemalla vasta-ainepitoisuus ja tämän jälkeisellä kuormitustartunnalla. Tämän kokeen tulokset ilmenevät taulukosta 2. Taulukosta ilmenee, että ennen rokotusta kissat olivat alttiita panleukopenialle. Jo kaksi viikkoa myöhemmin rokotetut kissat olivat serologisesti immuuneja ja kuormitettavissa, vertailukohteet sitävastoin olivat suojattomia ja kuolivat tartuntaan.

Taulukossa 3 on esitetty sellaisen keksinnön mukaisesti valmistetun rokotteen neutralointikokeen tulokset, joka on valmistettu käyttäen turkiseläimen munuaissoluja Crandell-solujen sijasta (Panleukopeniavirus siirrettiin 86 kertaa kissan munuaissoluilla ja sen jälkeen 19 kertaa turkiseläimen munuaissoluilla).

7 60408 (3 μ> C (I) r c m \ iH 2 Z3 M · . > -μ ο ε seE'i’d k .-1 . . · · fO rO n3 1) 3 0) φ <D CD (Λ <Λ 3

Eh -H ^ I ' o r 5 Ή fo 2 ω 1 iT3 -H 5

g * -s S S S -H

H ,y Ί) (0 S Λί o rH

g « -g £S > C « S

q +-1 7h 3 3 13 5 C ^¾ ro Φ hJ 3 χ3 Οπω μφ en

ω O -H

3 X +J

m H ω »H :nj (O · · O :rö > c*°

•H > W

Ο. Ή *H O

qj :¾ Φ lo CO. ^ •H >» " m 1—1 11 o i) I tO CO CM O O in

f/\ H · rt·» CD CO CO ^ Q

% G -n S CU & > ^ ·

, O nj rH —I CO

T LO · °* § * c en f0 o >,x μ CM ti £ 10 ·Η <0 _y ä <0 3 O · Φ ω ,Η C .X o

M -H c M

X C :m .... o ^4 Ή QJ *^0 · ^ C3 CS f5 F» o c > £ £ £ a e « 3 3 £ c^-A 0) φ φ φ Φ 0) g 5 ^ '3 '3 Λ J O en X -H μ .μ 3 ' rj ί r‘ fö <1)

Eh Ή f- J_J V rH

ci) M ...Η ΐ 3 £ il Φ ·Η h -h

^2 cS» H H § OH

s s .sib g * s a 1 H

C S Se o I 5 H.

SS SI2 -H -H s "> 5 tj r- O Sd -H Π3 o 1 S g ^5 ·π * g g £ :* >, +- ϋ C G * LJ 3

«•HO) c 4-1 -H G

S 3« S 5 S 5 •μπω ^ 3 en 3 .Η-μ ° 0 ° ° ° ° O E CO i-

> °g «-SS

j .s o u « "i ” ^ ^E-l II II (f) Il

" .fH

O '7 . .

‘ ro ε ·η ·μ C ..1¾¾ ^ f- o) ω en en en

z g^CMtOCHr-tJ

CO CO CO CO CO

8 60408

Taulukko 3

Kissa n: o Seeruminäyte ennen Seeruminäyte 3 viikon kuluttu-i rokottamista rokottamisesta 256 El l°yde^ty pa.nleuk.o- 1Q4,625 _ 42 1?g ND /ml pemavasta-ameita 50 257 ” 104,833 _ 68 13Q ND5Q/ml = 50 % neutraloiva annos Eläinkoe n:o 2

Rokotteet, jotka sisältävät eläviä, tautia aiheuttamattomia panleukopeniaviruksia, johtavat yleensä nopeaan rokotussuojaan, jonka ennen kaikkea voidaan katsoa johtuvan yhteisvaikutusilmiöstä. Tällöin rokotevirus estää tautia aiheuttavan viruksen lisääntymisen isäntäsolussa. Kahdellatoista nuorella kissalla kokeiltiin, olivatko ne jo 72 tuntia keksinnön mukaisesti valmistetun rokotteen annon jälkeen riittävästi suojattuja kuormitustartuntaa vastaan. Tämän tutkimuksen tulokset ilmenevät taulukosta H. Koe osoittaa, että rokote pystyy lyhyen ajan, so. kolmen päivän kuluttua suojaamaan panleukopenialta. Ennen rokotusta kaikki kissat olivat suojattomia. Jo kolme päivää myöhemmin rokotetut eläimet kestivät tautia aiheuttavalla panleukopeniaviruksella suoritettua kuormitus-tartuntaa. Laskemalla päivittäin yli kahden viikon ajan valkosolujen määrä kuormitustartunnan jälkeen voitiin havaita, että kissat olivat erittäin terveitä eikä niissä voitu todeta selvää valkosolumäärän laskua. Kokeen aikana saadut lähtö- ja minimiarvot ilmenevät taulukosta 4. Yleensä valkosolujen väheneminen alle 2000/mm on panleukopenian tunnusomainen sairausoire. Rokottamattomat kissat sairastuivat panleukopeniaan ja neljä eläintä kuudesta kuoli tartuntaan.

9_60408 I ..... ιϊ* Ιχ! ' t' Γ*.

-μ μ ο m co to ιο ro to n n n m ro n o > c f= e πεεεεεπεε

> G £ (Ξ E EEEEEEEEE

G ro

03 -HO o o o οοοοοοοο 3 g O O O OOCDDOOOO

H (J rl W O VO to r- CN VO t^ O.· CS CM CO in O <D G „ ° m ω μ o o in o cc m »- *- sr n c O 44 E *-*-*" g 4; H 03 I—1 inzJ -- ... -________ *r~) 1 ~ rtf > > c 03 -μα; μ ai en μ in 44 μ 3 ^ 5 ζ o o o o oooooooot’ ° > o o CO U coocooooo £ j o H m t) v- o to to -C V- CN to VO CC “ 3 44 Iti , μ μ o :o to o csj <· *- co v-o m cm o o G μ V- rj t- »— r— %- r— <r- τ— *— τ~ e £ μ • rO r0 :r0 en C C 44 μ O) C 44 öp 03 3 03 n. . ' .....»-..........—j.,-..1---- ,4 μ m ' 1 o μ G en m

:n3 03 O

•r~> μ C μ 1'

en o G

G 3 0 3 ·· · · · · ·· ....

03 μ 44 44 EE S E E E ·η ·η ή ·η μ ·η ο ιη μ 44 ιη ·· · · »·οίθ3ο3ο3ο3θ3η

44 Ε ·Η μ 0)03 α) α) 0)03 enin en en en en Q

^ 3 G ·Η 03 Μ μ ο > ι—ι Ο 3 >ι Ο 44 44 esi Ο--———————------- 44 ί-ι π3 bO 03 •H G 44 ·Η 44 ο3 μ 03 \ μ μ •H C 03 Ο 3 3 μ 3 44 m ο3 Ο G μ ι—ι ο μ

μ 3 :ο3 M G

μ esi *ι ) ο3 <0 3 3 c~~ ο Ο 03 03 μ cm e o g > μ μ 03 c-~ en α) μ·Ηο)ω3 3 ω 03 μ 3 3 μ ο μ44 n α μ G 44 44 μ 3 C 3 ·Η

03 Εμ μ Ο 03 > C

μ GO Ε 44 44 I 3 Ο 44 03 μ r4 3 C 30 μ 44 ο3 ex, ω

03 44 G

03 -.....—-------------— ___________ μ Ή μ .μ ο ιη 03 44 03 μ μ

ο ω 9 £ C

oi *d % o) 8 ^ o3

□ ^ ,H -K C Η Λ. ·Η CC

Q) "H rH CU fd μ .S^ind μ P. o3 o ·§ μ o «j o o μ

44 e en G G 44 G

O μ μ G G μ 3 Q3 04 en 6 o3 C3 e 030.

-¾ α 44 Ο μ o sJe ·> <—I Ή G 44 -----L_---------------:ol 03 3 03 Λ ft 0) e > h

μ I :π3 μ G

03 O μ 3 03

I 44 μ G CG

03 Ο μ 3 μ G 44 μ μ tn G ω 3 03 G 03 03 G μ > eu μ o □ o e o o o o o o o o E G μ ι G en μ o J e 3 μ o3 3 O. 03 μ o) ω 44 ’ "* ' ..... , - r r - , .,..' ...... ' —- n —r— n M n 03 en oo to σι o-j-udcd ομ lo n e~~ g μ , r .

cnO co en σι σ ο ο <ο oo ooo *3 Jf3 μ·· esi lo lo cc co cd cm coco co co <o 03 ω

44 G_ I | | 1 I ι I I

10 60408

Eläinkoe n:o 3

Eläinkokeen 2 tulosten mukaan keksinnön mukaisesti valmistettu rokote suojasi kissoja panleukopeniatartunnalta jo kolme päivää rokotuksen jälkeen. Jotta voitaisiin tutkia saman rokotteen kykyä suojata panleukopeniatartunnalta jo ennen kolmatta päivää rokotuksen jälkeen suoritettiin seuraava koe.

Kuusitoista panleukopenialle altista kissaa rokotettiin kukin yhdellä annoksella rokotetta, ja nämä jaettiin neljäksi, neljä eläintä sisältäväksi ryhmäksi. Yksi ryhmä tartutettiin tautia aiheuttavalla panleukopeniaviruksella välittömästi rokotuksen jälkeen ja muut ryhmät peräkkäin päivän välein. Kuusi käsittelemätöntä vertailukissaa ja viimeinen ryhmä tartutettiin kolme päivää rokotuksen jälkeen. Kuten taulukosta 4 ilmenee, tämä koe osoittaa, että rokote pystyi jo päivän kuluttua rokotuksesta suojaamaan osaa rokotetuista kissoista sairastumasta panleukopeniaan. Ko. ryhmän neljästä kissasta vain yksi eläin sairastui ja kuoli panleukopeniaan kolmen muun eläimen pysyessä terveenä.

Eläimistä, jotka tartutettiin kaksi päivää rokotuksen jälkeen, vain yhdessä neljästä kissasta havaittiin neljäntenä ja viidentenä päivänä tartunnan jälkeen lievää valkosolujen vähenemistä (arvoihin 4200 ja 5100/mm )· Kissat, jotka tartutettiin kolme päivää rokotuksen jälkeen, kestivät tartunnan reaktioitta.

Kaikki vertailukissat kuolivat panleukopeniaan.

Lisäyksityiskohtia löytyy taulukosta 5.

60408 11

^ I

· ^~N ..—. ^-N O

• ·Γ—) · ·I 1 · . ··*··· PC

•I ) · -I—) · -|—) -H -I—1*1—I *1—1*1—1*1—>*l—> r—I

• +-1 · +-1 · ή ...... 115 -μ. -μ. -μ ρ< μ μ μ μ μ μ > • Q-j · **·*··

(/) Oh Oh · Oh · * s-<' · · · · * O-ι Pi Oi Oi Oh O» C

O CN O £ £3 ^ S £ £ ^ ^ Ή G

rH [N H 00 H · en ..O. - . . · CD cO CO CO CC CO ,—I (V

μ W m N_/ CU CU P CU d> CD CL·' 0> w ^ w v_^ o3 CU

h ° — -* + + + + + +++ + + + Ή

w C !0J

J CU ·Γ~ι --- -1—J--“ “ " e

H C

'-Iti E 03 LO μ cu e " nj μ cc e m o e cu e μ μ e o3 μ: μ M to μ ·Η ,ν :π3 μ 3 3 ο3 >03 μ μ e Cu e μ*

. πΐ 03 -μ ·Η μ C 3 C

e μ μ > > μ ο 3 αι;ο3 0) C C I ι 0) C3 ω ·η :Π3 cu 3 3 CJ jea) 3 <-> > χ μ μ Ph clC-V*' η ο ή μ μ μ α> ·η ° > :£ :rc π3 Π3 <—I 1—1 ε bO μ en μ Ρι -r~) μ Η Ε £ ,ΓΙ μ Ο 03 ω 03 O Ä 3 η cc μ μ μ μ y μμ (U μ----^-——--23 ο en μ C > en ·ι-ι -v e a; e μ <υ n μ μ ο χ . · ο μ '—ι ^-3 e.

lo y y :ο3 ο ·μ μ o e

:23 (U

X :ο3 ω > ^ χ -Η 3 ο μ cm οο μ :23 μ 3 Λ Ο

X

μ μ Ο μ 3 03 •μ ·

23 -C

μ μ C

Η > — Ό — ” 03 μ >Η e r. Ο) ο 03 Ρ- μ Ο :03 ο μ X > X Q) 3 :03 CU μ μ ι> μ Ε—ι Ο 03 '3 μ Ρ Λί μ μ e τι

en ο *—ι 1—' id 3C

3 μ ο3 ο ρ. μ μ μ Qj ο μ e μ με χ E o e 3 οχ ο μ ·η ρe μ -η y μ φ ο

3 II

_____y

CU C

C cu li E

•H C

o3 C + ω

i <u oJ

o) μ μ μ tn w ε ρ 2(^ μ ocMOo ο ο ο ο οσοο οοοα αοοοοο > ο ο <ό I ln y J Q Ο α, 2: μ 03 eno t'- cm οο ο οο σο σ> μ~ en y cj οο o m ω σι μ μ co en ro j tn·· μ cm cm co μ cn cm co μ cm to co cm cm co co m ro in in cd cd •h e σσομ οοομ οομμ οομμ οομμμμ

X ι—! ι—I ι—I t—I ι—li—I ι—I ι—I ι—!i—I ι—I ι—I , i—!i—I i—li—I μι—li—li—Ιι—I H

60408 12

Eläinkoe n:o H

Suoja-ajan arvioimiseksi ST-kissoilla suoritettiin lisäkoe.

Kissat pidettiin tarkoin eristettyinä. Kymmenestä ST-kissasta kahdeksan sai rokoteannoksen ihon alle. Rokoteviruksen erittymisen ja mahdollisen edelleenleviämisen arvioimiseksi molemmat rokottamattomat vertailukissat asetettiin samaan huoneeseen. Kaikista kissoista otettiin verinäytteet vasta-ainemääritystä varten. Tämän tutkimuksen tulokset ilmenevät taulukosta 6· Koe osoittaa, että rokote aiheuttaa aktiivisen immuniteetin ja suuren vasta-ainepitoisuuden, mikä antoi rokotetuille kissoille koko tarkkailuajaksi luotettavan suojan pan-leukopeniaa vastaan. Lisäksi se osoittaa, että vertailukissoihin ei muodostunut vasta-aineita. Tämä merkitsee sitä, että kokeen aikana ei tapahtunut rokoteviruksen edelleenleviämistä, mikä rokotetuissa eläimissä olisi johtanut luonnolliseen voimistumiseen tai vertailukohteina olleiden eläinten sairastumiseen ja sitä seuraavaan vasta-ainekehitykseen. Koska koekissoja tarkkailtiin päivittäin, voitiin todeta, että koko koeaikana ei ilmennyt reaktioita, jotka olisi voitu tulkita epäsiedettäviksi tai haitallisiksi.

13 60408

•r-ι ro cm c-~ cm c-~ cm P

• r—I CD /—v i—I CD rH I—I CD O

PCOHXCMrHCMCMiH O

• O Q *H

AC co ro p- oo p- p- co P

X

oo P

____________ d cx c . :d r—1 CMCMCOi—IrHCNOOi—I Ό • CDCOCO['-r'~CD ,Hr~~ >i p (—I I—( P" OO CO I—I 00 CO U) . a a

pCOOOOrHCMCMCOCOCM P

d

CD 1—I

— - - I i. — . ,! — —- .. " — — ·— —— rH

I—l 0

£ P

\ . -X

o m—) co cm r~ cm cm cm r~~ c~~ LO I—|LD|—ICDCOCDi—I I—I ft! Q p CO >—( CM i—ft—li—I CN CM U) g o o co • .Xcocop-oooocop-p- ή

P in -X

a) d Ρω d____________ ^

X cn X

rH ·Η

:d O

•r-ι ^-ι.ρ-, o oo cd oo r- o a a

• Η · I—I I—I CD (—I I—t I—t CD I—I

C CXP CM CO p- CO CN CM CO O- aj a) · o o CO C X p- CD rH CO p- p- p- 00 X -Η Ή O4

d d CM

•H I------------ · 0 d c X P 0)

cd Ο cn <U

pdTooocNooor^ooroo X

• I—I CD I—I CD (—I rH I—I r—I ' t O d ip co I—I oo cd cm oo oo r~^ :rd cn d ο ο ή

XU) ·Η X CO 00 CO p- p- CO CD OO

•HP fH cm P

d O <U -H <D

cn Pu v)

rH U) 0 X

•H X 3 d -X d -p

1 <U ·π O

d Π <—I · X

G0Ppt>-CNCN['~C~-CMCNO 0 [H d · i—ICOCOi—li—IcDcO CD p O D-ι X 0sj I—I I—( cm cm I—i (—I cd pi o O d

cn CMp-oooop-p-oorop- P

CU ^ I—l P

X r-l P

_____________ (¾

P H

d I P

•n O P

ox x

d O

co P " C d οοοοοοσ σοο · cu -P ·γ-> C cn

C 3 G

W P

__1 I I 1 I I I___ x I rö P P> •H cn P1 m cn ·η d cu ·η

X d P Ρ rH

cn cu X -P i—! <—l

<U o X d cu d O

p P £ P P

O P H O P P

λ: d £ p x o p o :o o x o

X, rH rH p p -H X

d cn eno pcnp-ldcdc^oo cdooo

•H·· lD CD lD CD lO lO lO „ lD lD CD

x, P '—i r—' 1—^ p 1—^ 1—' 1—' i 1—i 1—' 1—' 60408 14 •π • co cm o- cm ro co οο £-1 i—I LO i—t LO i—i i—t (—i • 00 rH CM H 00 CO 00

O O

LO CO j}- CO CO CO LO

LO CM

•ro • LO CM LO CM CO CO C- £-i LO CO LO LO i—| rH r—t

^ · ΖΓ ί—I -d" (—I CO 00 CM T

rO Λ4 o (_Li O i—I oo i—l co co <£> p- L ' X co

P CM

(¾ ----------- •ro •o • I—t CNI CM CD CM CM Γ—

CO f-ir-CO CM CO CD CD i—I fH

• CO rH jJ-J-rHHCM r ^ ° ° qj O CM CO r-Ι0ΟΓΟ3-

I- -H

^ 1—1 rO

:qj

C

3 · :rd •n p i—t · CM CD CD CD ip CM i—| f-lCMCD rH CO t"- U3 O- n 3 · CO .3" CO i—) CO r.

X O O t j

rO r-H i—( CM CO CM

HM §

M

----------- II

•ro T

• CM CM CM CM o co 4—1

Im LO LO H LO CO CO rH |

• rH rH CM f—I i—1 LO CO

M o o

CO CO Zt CO CO st LO

rH rH

rH

rö

CO rH CMJ-lOlOC-COCDCOO

C00 LO lOlOlOlOlOlOlOlOlO

•H ·· i—I rH i—IrHrHrHrHi—ti—I rH

mci | I 1 | | | I 1 60408 15

Eläinkoe n:o 5

Taulukossa 7 on esitetty sellaisen keksinnön mukaisesti valmistetun rokotteen siedettävyyskokeen tulokset, joka on valmistettu käyttäen turkiseläimen munuaissoluja Crandell-solujen sijasta (Panleukopeniavirus siirrettiin 86 kertaa kissan munuaissoluilla ja sen jälkeen 19 kertaa turkiseläimen munuaissoluilla).

Taulukko 7 Rokotteen siedettävyys

Kissa Valkosoluarvo mm^/vrk rokottamisen jälkeen n: o 0 1 2 3 4 5 6 254 15 900 16 400 16 800 12 700 9 000 8 500 9 200 255 13 600 12 500 9 600 7 700 8 200 7 300 10 100 256 - 12 300 11 200 10 700 8 600 5 900 4 200 257 - 14 600 13 200 8 200 7 500 9 100 8 200

Kissa Valkosoluarvo mm0/vrk rokottamisen jälkeen n: o 7 8 9 10 11 12 13 254 10 600 12 400 15 800 15 900 16 300 13 400 16 800 255 7 000 9 800 18 200 16 300 16 700 18 000 16 800 256 6 000 4 200 9 600 10 400 15 300 13 400 11 800 257 4 600 9 800 11 200 8 000 16 300 11 300 10 700 __ _ _

Kissa Valkosoluarvo mm /vrk rokottamisen jälkeen n: o 14 15 16 17 18 19 20 21 254 16 400 - - - - - 255 20 000 - - - - 256 20 000 12 100 16 400 13 500 12 400 14 400 11 300 12 400 257 10 500 10 700 12 600 12 100 10 700 12 400 10 500 14 200 X ) t ,

Kissat rokotettiin 1 ml :11a panleukopeniavirussuspensiota.

60408 16

Esimerkki 1) Kissan sikiökudosviljelmän valmistus

Kantava kissa tapettiin kivuttomasti ja sikiöt poistettiin steriileissä olosuhteissa. Sikiöstä poistettiin pää, raajojen päät ja iho ja loput ruumiista leikattiin saksilla n. 2-4 mm:n suuruisiksi paloiksi.

Palat asetettiin 0,25-%:iseen trypsiiniliuokseen, ja seos lämmitettiin sekoittaen 37°C:seen. Noin 10-20 minuutin välein trypsiini-liuos ja siihen suspendoituneet solut erotettiin, ja ne korvattiin uudella trypsiiniliuoksella.

Erotetusta solusakasta lietettiin 6 ml laimennuksena 1:300 seu-raavaan väliaineeseen: 10 % Eaglen väliainetta (kymmenkertainen) 10 % pässin tai vasikan veriheraa 2 % laktalbumiinihydrolysaattia (5 %:inen) 1 % NSP-liuosta (neomysiini-streptomysiini-penisilliini, 50 ^ig/ml vast. 20 000 IE/ml) 2 % natriumvetykarbonaattia (5 %:inen) kaksi kertaa tislattua vettä ad 100 %.

Seos siirrettiin viljelykolveihin ja pidettiin 37°C:ssa.

Toisena, neljäntenä ja seitsemäntenä päivänä ravinneliuos uusittiin. Kymmenentenä päivänä ravinneliuos erotettiin kaatamalla soluista ja korvattiin liuoksella, jossa oli 95 % trypsinoimisväliai-netta, 1 % dinatriumdivetyetyleenidiamiinitetra-asetaatin 1 %:ista liuosta, 1 % 1 %:ista trypsiiniliuosta ja 3 % 5 %:ista natriumvety-karbonaattiliuosta.

17 60408

Trypsinoimisväliaine sisälsi: 1 1 kaksi kertaa tislattua vettä 7,27 g natriumkloridia 0,36 g kaliumkloridia 0,91 g dekstroosia

Solusidokset katkeavat tässä liuoksessa, jolloin vapautuu yks.it-täissoluja tai pieniä ryhmiä. Näin saatuja soluja viljeltiin useita kertoja yllä kuvatulla tavalla.

2) Panleukopeniarokoteviruksen valmistus

Kissa tartutettiin patogeenisellä panleukopeniaviruksella, joka oli eristetty panleukopeniaan sairastuneesta ja kuolleesta kissasta, ja se tapettiin seitsemän päivää myöhemmin vaikeasti sairaana valko- 3 solumäärän ollessa 200/mm . Munuaiset poistettiin ja käsiteltiin edellä kuvatulla tavalla 25 %:isessa trypsiiniliuoksessa solususpension saamiseksi. Saatu virussuspensio saostettiin ja sakka suspendo Itiin suhteessa 1 : 300 seuraavaan viljelyväliaineeseen: 52,2 % Hanksin väliainetta 5,8 % laktalbumiinihydrolysaattia 20.0 % kudosviljelmäväliainetta 199 20.0 % vasikan veriheraa 1.0 % natriumvetykarbonaattia (5-%:inen) 1.0 % NSP-liuosta

Suspensiota pidettiin 37°C:ssa. Tällöin panleukopeniavirus lisääntyi soluissa. Virus voidaan osoittaa siirtämällä viljelmän päällä oleva liuos terveisiin kissoihin.

Viruksen edelleenviljely tapahtuu seuraavasti. Terveistä kissoista erotetaan munuaiset, trypsinoidaan yllä kuvatulla tavalla ja suspendoidaan ravinneliuokseen. Kun solukerros on kasvanut n. 75 %, se tartutetaan panleukopeniavirusviljelmän päällä olevalla virus-pitoisella nesteellä.

Tällöin päällysnesteeseen sekoitetaan tuoretta ravinnealustaa suhteessa 1 : 10 ja levitetään soluille. Neljän päivän kuluttua viljelmän päällä oleva lisääntynyttä panleukopeniavirusta sisältävä neste erotetaan kaatamalla. Noin 80 siirrostuksen jälkeen kissan munuais-solut korvataan Crandellin mukaisella pysyvällä kissan munuaissolu-linjalla ja siirrostukset toistetaan vielä 17 kertaa.

Kissan pysyvien munuaissolujen viljelyssä käytetään seuraavaa väliainetta: 18 60408 10 -ό Eaglen väliainetta 10 % vasikan veriheraa 1,5 % natriumvetykarbonaattia (5-%:inen) 1,0 % NSP-liuosta kahdesti tislattua vettä ad 100 %

Viruksella tartutettaessa veriheran osuus vähennetään 3 %:iin. Kun on käyty läpi 103 siirrostusta, virus on menettänyt pato-geenisuutensa mutta sen hyvät immunisoivat ominaisuudet ovat säilyneet. Sitä voidaan käyttää rokotteen valmistukseen.

Edellä mainitun Crandellin pysyvän kissan munuaissolulinjän sijasta voidaan käyttää vastaavaa turkiseläimen solulinjaa.

3) Rokotteen valmistus

Kohdan 1) mukaan lisätty kissan sikiösoluviljelmä suspendoi-tiin seuraavaan väliaineeseen: 10 % Eaglen väliainetta (kymmenkertainen) 10 % vasikan veriheraa 2 % laktalbumiinihydrolysaattia (5-%:inen) 2 % natriumvetykarbonaattia (5-%:inen) 1 % NSP-liuosta 75 % kahdesti tislattua vettä

Yhden tai kahden päivän kuluttua ravinneliuos vaihdettiin.

Kun solukerros oli kasvanut 50-75 %, soluviljelmälle pipetoitiin kohdan 2) mukaan saatua 10-%:ista virussuspensiota.

Neljän päivän kuluttua viruspitoinen, viljelmän päällä oleva neste erotettiin kaatamalla ja soluviljelmää viljeltiin edelleen lisäämällä uutta ravinneliuosta. Päällä olevan nesteen viruspitoisuus 5 oli n. 10 IDrn/ml. Lisäämällä seuraava stabilisaattori tämä virus- ou pitoinen, viljelmän päällä oleva neste käsiteltiin rokotteeksi.

4 osaa 2-%:ista gelatiini-lihalientä 1 osa 50-%:ista glukoosia

Rokote lisättiin 1 ml:n annoksina 3 ml:n rengasreunapulloihin, kylmäkuivattiin ja suljettiin tyhjössä.

Virusten lisääminen yllä kuvatulla tavalla voidaan myös suorittaa pyöritys- tai suspensioviljelmänä.