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Verfahren zur Herstellung eines abgeschwächten, zur Immunisierung von Menschen gegen Masern geeigneten Virus
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines abgeschwächten, lebenden, zur Immunisierung von Menschen gegen Masern geeigneten Virus unter Verwendung eines lebenden Masernvirus, das für das Wachstum in Vogelembryogewebezellkulturen adaptiert worden ist, das aber als solches zur Immunisierung von Menschen ohne Herbeiführung eines hohen Prozentsatzes relativ schwerer unerwünschter Reaktionen nicht geeignet ist, als Ausgangsmaterial.
Auf Grund älterer Arbeiten ist es gelungen, das Masernvirus so zu adaptieren, dass es auf Tiergewebe oder Zellkulturen wächst und sich vermehrt (vgl. z. B. die deutsche Auslegeschrift 1130 558).
Stämme des Masernvirus, die zur Impfung von Menschen geeignet sind, konnten durch Abschwächung in solchen Kulturen von Tierzellen erhalten werden.
Die klinische Erprobung des adaptierten und abgeschwächten lebenden Masernvirus, das in dieser Weise erhalten worden ist, zeigte, dass es die Fähigkeit besitzt, in den geimpften Personen gegen Maserninfektionen immunisierende Antikörper zu bilden. Leider aber zeigten sich bei einem Grossteil der geimpften Personen unerwünschte Reaktionen, wie hohes Fieber. Ein Grossteil der Kinder, die mit Vakzinen aus adaptierten und abgeschwächten Stämmen der bisher zur Verfügung stehenden Masernviren beimpft worden waren, zeigten als Nachwirkungen der Impfung schwere Hautausschläge und andere Reaktionen.
Durch gleichzeitige Injektion von Gammaglobulin, das bei Kindern eine beachtliche Schutzwirkung gegen die schwereren Symptome der unerwünschten Reaktionen zeigt, konnten die unangenehmen Nebenwirkungen bis zu einem gewissen Grad unterdrückt oder vermieden werden. Eine Vorbeugung gegen Nebenreaktionen durch gemeinsame Verabfolgung von Masernvakzin und Gammaglobulin ist jedoch umständlich und teuer und kommt im allgemeinen für Impfaktionen grossen Massstabes nicht in Betracht.
Es wurde nun gefunden, dass erhebliche Nebenwirkungen und unerwünschte Symptome vermieden oder wenigstens stark vermindert werden können, wenn man erfindungsgemäss ein für das Wachstum in Vogelembryogewebezellkulturen adaptiertes Virus in einer das Wachstum des Gewebes fördernden und gegenüber dem Virus nichttoxischen Nährflüssigkeit bei einer Temperatur von etwa 28 bis etwa 320C zur Förderung des Wachstums des Virus bebrütet, wenigstens einen Teil des so gebildeten Virus erntet und ein solches geerntetes Virus in eine frische Kultur von Vogelembryogeweben einführt und solche Kulturpassagen des Virus reihenweise unter Bebrütung bei Temperaturen von etwa 28 bis etwa 320C (unternormale Temperaturen) bei einer genügenden Anzahl von Passagen wiederholt, wodurch ein Virus erhalten wird, das,
ohne Verlust der Antigenwirkung zur Bildung von Masern-Antikörpern, im Hinblick auf die Schwere der Reaktion des Menschen auf dieses Virus, genügend abgeschwächt ist.
Ein erfindungsgemäss erhältlicher, abgeschwächter, lebender Masernvirusstamm ist der sogenannte Schwarz-Stamm des Masernvirus (von der Fa. Glaxo Laboratories Ltd., Greenford, England, beziehbar) ; er unterscheidet sich von den bisher bekannten Stämmen des Masernvirus durch das Fehlen von wesent-
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lichen unerwünschten Nebeneffekten und Reaktionen bei Personen, die damit geimpft worden sind, und durch das praktische Fehlen der üblichen pathologischen Symptome der Masern, ohne dass eine erkenn- bare Verminderung bezüglich Immunisiervermögen und Wirksamkeit eintritt.
Die erhöhte Sicherheit und Leistung des Schwarz-Stammes des Masernvirus als Impfstoff kann da- durch erklärt werden, dass die Virulenz des Virus stärker geschwächt wird als im Falle der bisher ange- wendeten Abschwächungsverfahren. Das abgeschwächte Virus bewirkt, wenn es noch nicht gegen Ma- sern immunen Kindern injiziert wird, dass die Bildung von schützend wirkenden Masernantikörpern ohne
Hervorrufung nennenswerter Hausausschläge, hohen Fiebers oder anderer üblicher pathologischer Symp- tome der Masern stimuliert wird.
Die genaue Zahl der Reihenpassagen, die im Rahmen des erfindungs- gemässenverfahrens bei der unternormalen Temperatur erforderlich sind, wird in Abhängigkeit von sol- chen Faktoren wie der spezielle Stamm des angewendeten Masernvirus, die Vorbehandlung im Kultur- medium desselben und die speziellen in der Gewebekultur verwendeten Vogelembryogewebe, abhängen.
Bei Kückenembryogewebekulturen werden gute Ergebnisse in bezug auf Abschwächung erreicht, wenn etwa 40 Reihenpassagen des Virus bei einer Bebrütungstemperatur von 28 bis 320C ausgeführt werden.
Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens können gewisse Variationen angewendet werden. So können z. B. die Reihenpassagen bei 28 - 320C durch eine oder wenige Passagen bei höheren Temperaturen unterbrochen werden, vorausgesetzt dass die Gesamtzahl der Passagen bei der unternormalen Temperatur ausreichend ist, um die gewünschte Abschwächung zu erreichen.
Nachdem die gewünschte Abschwächung erreicht ist, können eine oder zwei Vermehrungspassagen zur Vermehrung des Vakzinansatzes, gewünschtenfalls bei geeigneten höheren Temperaturen, ausgeführt werden.
Ist eine Abschwächung des Virus in der erfindungsgemässen Weise erreicht, so kann der gewünschte, abgeschwächte Stamm des Virus in einer Gewebekultur der gleichen Type von Gewebe, an welche das Virus adaptiert worden ist, und unter fortgesetzter Bebrütung bei Temperaturen von 28 bis 320C aufbewahrt werden.
Im allgemeinen ist es wünschenswert, aber nicht notwendig, das Virus auf frische Gewebekulturen zu überführen, wenn etwa 20-75%, vorzugsweise etwa 25-50%, der Zellen in einem gegebenen Ansatz von beimpfter Gewebekultur einen cytopathogenen Effekt zeigen.
Ähnliche Verfahrensweisen werden zur Vermehrung des abgeschwächten Virus angewendet, um einen Ansatz für die Vakzineherstellung zu erhalten. Bei der zuletzt genannten Verfahrensweise wird die Kultur bebrütet, bis das Virus sich unter Bildung einer geeigneten Konzentration desselben vermehrt hat, und die Flüssigkeit wird aus dem Behälter mit der Gewebekultur durch Dekantation unter aseptischen Bedingungen abgetrennt und durch Zentrifugieren, Filtrieren od. dgl. geklärt. Das entstehende Produkt kann direkt als Vakzine verwendet werden, oder es kann, in Abhängigkeit von der darin enthaltenen Viruskonzentration, mit einem geeigneten injizierbaren Verdünnungsmittel oder mit einer Stabilisierungslösung, die gegenüber dem Virus nichttoxisch ist, verdünnt werden, um eine fertige, flüssige Vakzine herzustellen.
Wenn ein entsprechender Anteil der Vogelembryogewebezellen in der Kultur infolge der cytopathogenen Wirkung des wachsenden Virus noch nicht zerstört ist, wird frische Flüssigkeit, wie eine geeignete Vakzinestabilisatorlösung, isotonische Salzlösung, frisches Nährmedium od. dgl., nach dem oben angegebenen Dekantationsschritt zum Kulturbehälter zugeführt, und Kessel sowie Inhalt werden einem Gefrier- und Auftauzyklus unterworfen, um weiteres Virus aus den Gewebezellen freizusetzen. Die entstehende Flüssigkeit wird abgetrennt und mit der vorstehend erhaltenen Flüssigkeit vereinigt, um ein Vakzinekonzentrat zu schaffen. Das letztere wird in geeigneter Weise von Vogelembryogewebezellen und Zellbruchstücken befreit, und der Virusgehalt wird durch Titration, wie z. B. gegen Menschengewebekulturzellen, standardisiert.
Anschliessend kann das Vakzinekonzentrat gewünschtenfalls direkt zur Vakzination nicht-immuner Menschen verwendet werden, oder es kann mit einem sterilen Stabilisator, wie z. B. Lactose-Glutamatlösung, verdünnt, für die Lagerung, vorzugsweise bei einer Temperatur von -20 bis -700C, eingefroren und bei dieser Temperatur bis zur Verwen- dung aufbewahrt werden. Man kann die stabilisierte Vakzine auch einer Gefriertrocknung unterwerfen, um ein trockenes Vakzineprodukt zu schaffen, das leicht lagerfähig ist und das mit sterilem Wasser od. dgl. unmittelbar vor der Verwendung rekonstituiert werden kann.
Eine unter Verwendung des neuen, erfindungsgemäss erhältlichen Virus hergestellte Vakzine macht eine gleichzeitige Injektion von Gammaglobulin überflüssig. Eine ebenso gute oder noch höhere Leistung bezüglich der verminderten Häufigkeit und Stärke der Reaktionen bei den geimpften Personen kann nun erreicht werden, wenn ausschliesslich die verbesserte, gemäss der Erfindung hergestellte Masemvakzine eingesetzt wird.
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Wenn die Vermehrung des erfindungsgemäss erhältlichen, abgeschwächten, lebenden Virus und ins- besondere des Schwarz-Stammes des Masernvirus bei Bedingungen und Temperaturen ausgeführt wird, bei welchen die Möglichkeit besteht, dass das Virus in eine stärker virulente Form zurückkehrt, liegt eine vorteilhafte Vorsichtsmassnahme bei der Herstellung und bzw. oder Zubereitung des Saat- bzw.
Stammansatzes aus dem bestehenden Schwarz-Stamm des Virus darin, wenigstens mehrere Passagen un- ter virulenzvermindernden Bedingungen einzuschalten, z. B. durch Züchtung des Virus während mehre- rer Passagen bei Temperaturen unter 32 C. Sollte der Schwarz-Stamm des Virus trotz aller Vorkehrun- gen in eine stärker virulente Form zurückkehren, so stellt er kein geeignetes Ausgangsmaterial für die
Zwecke der Erfindung mehr dar und soll durch neues Material ersetzt werden, welches der oben ange- gebenen Definition des Schwarz-Stammes des Masernvirus entspricht.
Das beim erfindungsgemässen Verfahren als Ausgangsmaterial verwendete adaptierte Virus kann aus nativem, lebendem Masernvirus erhalten werden.
Wenn frisches, natives Masernvirus für die Verwendung als Ausgangsmaterial beim erfindungsge- mässen Verfahren adaptiert werden soll, ist es häufig wünschenswert, die anfängliche Vermehrung des
Virus in einer Menschengewebekultur, wie Menschennierengewebekultur, Menschenfötushautgewebe- kultur oder Menschenherzgewebekultur, oder in einem Tiergewebe, das bekanntermassen leicht als
Wirtgewebe für die Vermehrung solcher nativer Viren wirksam ist, wie z. B. Hundenierengewebekultur, durchzuführen. Bei solchen Behandlungen kann es zweckmässig sein, die Züchtung auf solchen Men- schen-oder Hundegeweben durch eine Reihe von Passagen fortzusetzen, bis die Identität und Reinheit des jeweiligen Virus festzustellen ist. Anschliessend wird die Adaption des Virus an Vogelembryogewebezellkulturen, insbesondere Kückenembryogewebezellkulturen, vorgenommen.
Bei Adaptionsschritten vor der Einleitung der erfindungsgemässen Bebrütung bei unternormalen Temperaturen können die vorkommenden Übertragungen auf andere Gewebe oder im Embryonale durch übliche Massnahmen ausgeführt werden. Das Virus wird vorzugsweise der Reihe nach durch aufeinanderfolgende Frisch-Vogelembryogewebekulturen unter Bebrüten bei 350C geführt werden, wobei einige wenige, vorzugsweise etwa 10, Reihenpassagen durchgeführt werden, um eine Adaption an das Vogelembryogewebe zu erreichen.
Bevorzugterweise werden Gewebekulturen von Vogelembryogeweben in üblicher Weise in einer Nährflüssigkeit angesetzt, die gegenüber dem Masernvirus nicht toxisch ist und das Wachstum solcher Gewebe unterhält. Diese Gewebe werden mit lebendem Masernvirus beimpft. Die beimpften Gewebekulturen werden dann eine Zeitlang bei 35 - 370C bebrütet und das Virus wird durch eine Reihe von Passagen auf dem gleichen Vogelembryogewebe geführt, wobei eine genügende Zahl von Passagen angewendet wird, um eine Adaption des Virus an die Wachstumsbedingungen in den Vogelembryogewebezellkulturen zu gewährleisten.
Anstatt natives Masernvirus zu adaptieren, ist es auch möglich, einen adaptierten Stamm des Masernvirus als Ausgangsmaterial zu verwenden, wie er durch Adaption und Abschwächung gemäss früheren Arbeiten aus dem Edmonston-Stamm des Masernvirus erhalten worden ist, wie der Enders-Stamm. Gleiche Ergebnisse können auch mit Stämmen erhalten werden, die von Patienten während einer Epidemie in Grönland isoliert wurden, sowie mit in Dänemark isolierten Stämmen.
Während der Bebrütung des Virus kann eine schwache Bewegung des Kulturbehälters, wie z. B. mittels einer Walzentrommelanordnung, vorgesehen werden ; es können aber auch statische Kulturmethoden benutzt werden, vorausgesetzt dass für ein Eintauchen der Gewebezellen in die Nährflüssigkeit Sorge getragen wird. Die Vermehrung des Virus zeigt sich üblicherweise durch einen deutlichen cytopathogenen Effekt auf den Gewebezellen, welcher unter dem Mikroskop beobachtet werden kann. In einzelnen Fällen jedoch, insbesondere in Frühstadien der Adaption des Virus, wird ein beobachtbarer pathogener Effekt, falls ein solcher überhaupt auftritt, nur nach langen Bebrütungsabschnitten festzustellen sein.
In solchen Fällen kann jedoch die Vermehrung des Virus durch Titration eines Teiles der beimpften Gewebekulturflüssigkeit in einer Kultur von gegenüber dem Virus empfindlichem Menschengewebe, z. B. Menschenfötushautgewebe, Menschenherzgewebe od. dgl., verfolgt werden. Letzteres zeigt deutlich einen typischen cytopathogenen Effekt, wenn es mit Masernvirus infiziert wird.
Beispiel l : Herstellung des Virus-Ausgangsmaterials.
8 - 10 Tage alte Kückenembryos werden nach Entfernen der Augen unter aseptischen Bedingungen fein gehackt, und das entstehende zerkleinerte Gewebe wird mit Phosphat-gepufferter Salzlösung gewaschen. Das gewaschene Gewebe wird in der üblichen Weise in einem Erlenmeyerkolben unter Rühren mit einem Magnetrührer trypsinisiert. Das trypsinisierte Gewebe wird mit 1000 Umdr/min 3 min zentrifugiert und die entstehenden angereicherten Zellen werden in einem Züchtungsmedium suspendiert,
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um eine Konzentration von 500 000 bis 600 000 Zellen/ml einzustellen.
Das Züchtungsmedium besteht aus Earlels Basissalzlösung (6,8 g Natriumchlorid, 0,4 g Kaliumchlorid, 0,2 g Kalziumchlorid, 0, 2 g
Magnesiumsulfatheptahydrat, 0, 125 g saures Natriumphosphat, 1, 0 g Glukose, 2, 2 g Natriumbicarbonat und 0, 02 g Phenolrot, die in Wasser unter Einstellung eines Volumens von 1000 ml gelöst werden), die 50/0 Kalbserum und 0, 5% Lactalbuminhydrolysat sowie ferner 200 Einheiten Penicillin und 200 y Strep- tomycin/ml enthält. Die entstehende Suspension wird in Mengen von 1 ml zur Beimpfung steriler Pro- bierröhrchen verwendet, die dann für 24 - 48 h bei 350C bebrütet werden.
Eine ähnliche Verfahrens- weise wird auch angewendet, um grössere Ansätze unter Einführung von 60 bis 70 ml der Suspension in Blake- oder Roux-Kulturkolben einzuführen.
Nach der anfänglichen Bebrütungsperiode für die Kückenembryogewebezellen wird das Züchtungs- medium abgetrennt und die Zellen werden zweimal mit Medium Nr. 199 von Morgan und Parker (Morgan et al., Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 73 [1950], S. 1-8) gewa- schen.
Abschwächungsbehandlung :
2 ml des Mediums Nr. 199, die ohne Serum und auf einen pH-Wert von 7 bis 7,2 eingestellt sind, werden zu jedem Röhrchen, oder 100 ml des genannten Mediums zu jedem Kolben, zugesetzt. Jedes Röhrchen wird dann mit 0,2 ml der Suspension von aktiven, lebenden Masernviren oder jeder Kolben mit 1 ml dieser Virussuspension beimpft, und die entstehenden Kulturen werden bei Temperaturen von 32 bis 280C zur Vermehrung des Virus bebrütet. Im allgemeinen wird das Wachstum des Virus durch den Umstand ersichtlich, dass die Zellen in der Gewebekultur einen cytopathogenen Effekt aufweisen, und eine Reihenpassage des Virus auf neuem Gewebekulturmedium wird üblicherweise ausgeführt, wenn etwa 25 - 500/0 der Zellen in der beimpften Kultur den cytopathogenen Effekt zeigen.
Das Wachstum des Virus in der Gewebekultur kann aber auch durch Titration des Kulturmediums in einer Kultur von Menschengewebezellen, wie z. B. Menschenamniongewebe, Menschenherzgewebe oder andern geeigneten Geweben, durch die von Schwarz und Zirbel in Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, Bd. 102 [1959], S. 711-714, angegebene Methode verfolgt werden.
Nachdem genügend Passagen der oben genannten Art durchgeführt worden sind, um die gewünschte Abschwächung des Virus zu erreichen, werden eine oder wenige zusätzliche Passagen in Kückenembryogewebekultur bei 32 - 280C in einem genügend grossen Umfange ausgeführt, um das Virus genügend zu vermehren.
Das vermehrte Virus bildet einen Ansatz des Vakzinekonzentrats. Das Vakzinekonzentrat wird in üblicher Weise durch Dekantieren, Gefrieren und Auftauen sowie Waschen aufgearbeitet. Die gesammelte Vakzine wird durch Zentrifugieren der Kulturflüssigkeit und der Waschflüssigkeiten geklärt, bis diese frei von Gewebezellen und Zellbruchstücken sind.
Beispiel 2 : Herstellung des Virus-Ausgangsmaterials :
Der Edmonston-Stamm des Masernvirus, der von Enders und Mitarbeitern beschrieben wurde, wird in einer Reihenpassage in Kückenembryogewebekultur unter Bebrütung bei 350C durch 19 aufeinanderfolgende Passagen geführt.
Abschwächungsbehandlung :
Dieses kückenembryoadaptierte Virus wird dann nacheinander gemäss der Verfahrensweise des Beispiels 1 durch 37 aufeinanderfolgende Passagen in Kückenembryogewebekultur unter Bebrütung bei 320C geführt. Das erhaltene abgeschwächte Virus aus der 37. Passage wird durch drei Endpassagen mit verdünnter Kückenembryogewebekultur geführt.
Vakzinegewinnung :
Anschliessend werden zwei weitere Passagen in einer solchen Gewebekultur durchgeführt, die eine Vermehrung des Virus und die Bildung eines Vakzineansatzes (Vakzinepool) ermöglicht. Bei jeder dieser letzteren Passagen wird die Kultur bei 320C bebrütet. Die entstehenden Vakzinekonzentrate werden von den Gewebezellen und Zellbruchstücken abgetrennt und mit einem entsprechenden Volumen Laktose-Glutamatlösung als Stabilisator verdünnt. Die Laktose-Glutamat-Stabilisatorlösung hat die folgende Zusammensetzung :
Kaliumglutamat 0, 956 g
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