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Verfahren zur Herstellung von Masernimpfstoffen Die Erfindung betrifft
ein Verfahren zur Herstellung von Masernimpfstoffen durch Verbreitung und Wachstum
eines adaptierten und geschwächten Stammes von Masernviren in einem lebende tierische
Zellen enthaltenden Kulturmedium und durch Abtrennung dieser Zellen sowie des Zellenrestmaterials
von dem Kulturmcdium. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, daß während der zur Schwächung
und Vermehrung der Masernviren nötigen Durchgänge oder während eines Teiles dieser
Durchgänge die Temperatur auf 28 bis 32"C gehalten wird.
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Man hat Masernviren bereits früher mit Erfolg dahingehend adaptiert,
daß sie in Nichthumangewebe-oder Zellkulturen wachsen und sich ausbreiten. Man hat
ferner schon festgestellt, daß man Stämme von Maseraviren, die zum Impfen von Menschen
geeignet sind, dadurch gewinnen kann, daß man die in solchen Isichthumanzellkulturen
ichth umanzellkulturen gewonnenen Viren schwächt.
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Klinische Versuche mit adaptierten und geschwächten aktiven Masernviren,
die man auf diese Weise erhalten hat, waren in der Lage, in den geimpften Personen
Antikörper zu bilden und diese somit gegen Masern infekt ion immun zu machen. Unglücklicherweise
traten jedoch unerwünschte Erscheinungen auf: Es trat bei einer großen Anzahl der
geimpften Personen starkes Fieber ein. Bei Impfung von Kindern mit 1 mpfstoffen,
die aus adaptierten und geschwächten Stämmen bisher verfügbarer Masernviren gewonnen
worden waren, traten außerdem ein starker Ausschlag und andere un erwünschte Nebenerscheinungen
auf.
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Die unerwünschten Nebenerscheinungen konnten unterdriickt oder weinigstens
bis zu einem gewissen Grad dadurch vermieden werden, daß man gleichzeitig y-Globulin
einspritzte, welches einen ausgesprochenen Effekt insokm zeigte, als es Kinder vor
den ernsteren Symptomen der unerwünschten Reaktion schützte. Die Verhinderung solcher
Nebenerscheinungen durch die kombinierte Anwendung von Masernimpfstoff und y-Globulin
ist unpraktisch und teuer und insbesondere ungeeignet für Impfprogramme großen Umfangs.
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Es hat sich gezeigt, daß merkbare Nebenerschei nungen und unerwünschte
Symptome vermieden oder wenigstens weitgehend reduziert werden können, wenn man
zur Impfung erfindungsgemäß hergestellten Impfstoff verwendet. Dieser neue Impfstoff
macht nicht mehr die gleichzeitige Impfung von y-Globulin erforderlich. Man kann
durch Anwendung des verbesserten Impfstoffes allein mindestens ebenso gute Resultate
hinsichtlich der Häufigkeit und Gefährlichkeit der Nebenerscheinungen erzielen,
als man sie
bisher durch gleichzeitige Anwendung bekannter Impfstoffe und y-Globulin
erzielen konnte.
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Der aus dem erfindungsgemäßen Verfahren zugrunde liegende sogenannte
Schwarz-Stamm des Masernvirus unterscheidet sich von den bisher bekannten Stämmen
dadurch, daß im wesentlichen keine unerwünschten Nebenerscheinungen und Reaktionen
bei den geimpften Personen auftreten und durch das Fehlen der üblichen pathologischen
Masernsymptome, ohne daß eine Verminderung der immunisierenden Wirkung eintreten
würde.
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Statt ursprüngliche Masernviren - zu adaptieren. ist es auch möglich,
als Ausgangsmaterial einen bereits adaptierten Stamm von Masernviren zu verwenden,
etwa einen Stamm, wie er durch Adaptierung und Schwächung des Edmonston-Stammes
gewonnen wurde; ein solcher adaptierter und geschwächter Stamm ist z. B. der Enders-Stamm.
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Bei einer bevorzugten Durchführungsform des Verfahrens zur Gewinnung
des Schwarz-Stammes von Masernviren werden Gewebekulturen tierischen Nichthumangewebes
in an sich bekannter Weise in eine Nährflüssigkeit gebracht, welche für Masernviren
nicht toxisch ist und welche das Wachstum solchen Gewebes unterstützt, in diese
mit Zellen beschickte
79ährflüssigkeit werden die lebenden Masernviren
eingeimpft.
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Die geimpften Gewebekulturen werden sodann bei 35 bis 37"C für eine
bestimmte Zeit inkubiert; der Virus wird in mehreren Durchgängen auf das gleiche
tierische Gewebe gegeben, um die Adaptierung des Virus an das jeweilige Gewebe durchzuführen
und die Wachstumsmöglichkeit in diesem Gewebe zu schaffen.
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Es hat sich gezeigt, daß auf diese Weise der Masernvirus in Kaninchennierengewebe,
Rindernierengewebe, Schweinenierengewebe und Kükenembryogewebe zum Wachsen gebracht
werden kann. Anschließend an die soweit beschriebene Adaptierungsbehandlung wird
der Virus serienmäßig in Gewebekultur gegeben, und zwar auf dem jeweiligen Substrat,
an das er adaptiert worden ist, wobei die Inkubation des Virus bei einer Untertemperatur
von 28 bis 32"C durchgeführt wird; dadurch wird die Modifizierung des Virus erreicht;
wenn der so modifizierte Virus schließlich Kindern geimpft wird, welche gegen Masern
nicht immun sind, so ist er imstande, die Erzeugung von Masernantikörpern anzuregen,
ohne daß in merklichem Umfang Ausschlag, hohes Fieber und ähnliche pathologische
Symptome von Masern eintreten.
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Eine andere Möglichkeit zur Erzeugung des Schwarz-Stammes von Masernviren
als Ausgangsmaterial für den erfindungsgemäßen Impfstoff besteht darin, daß der
ursprüngliche aktive Masernvirus in tierische Gewebekulturen eingeimpft und bei
Untertemperatur inkubiert wird, ohne daß vorher eine Adaptierung in das jeweilige
Gewebe bei normaler Inkubationstemperatur stattgefunden hat. Anschließend wird die
serienmäßige Übertragung und Inkubation bei diesen Untertemperaturen von vorzugsweise
etwa 28 bis etwa 32"C für eine ausreichende Zahl von Durchgängen fortgesetzt, um
die erstrebte Schwächung des Virus zu erreichen.
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Wenn man von frischen natürlichen Masernviren ausgeht, ist es zweckmäßig,
die anfänglicheVermehrung des Virus in Humangewebekulturen durchzuführen, etwa in
Nierengewebekulturen, Amniotagewebekulturen (Amnion = ein Embryonalhäutchen [s.
Van Nostrand's Scientific Encyclopedia, 3. Auflage, 1958, S. 85]) oder Herzgewebekulturen,
daneben aber auch in tierischen Gewebekulturen, die als Gastkulturen für die Vermehrung
ursprünglicher Viren bekannt sind, z. B. Kaninchennierenkulturen. Es empfiehlt sich
die Behandlung auf solchen Human- oder Kaninchengeweben für so viele Durchgänge
fortzusetzen, bis die Identität und Reinheit des gebildeten Virus untersucht werden
kann. Anschließend wird dann die Adaptierung des Virus in andere tierische Nichthumangewebe
und die Schwächung des Virus durch Inkubation bei niederen Temperaturen durchgeführt.
In den Verlauf der Adaptierungsmaßnahmen können natürlich von Übertragungen auf
andere Gewebe oder Embryonaleier nach herkömmlicher Verfahrenstechnik eingeschaltet
sein, ohne daß vom Grundgedanken der Erfindung abgegangen wird.
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Die genaue Zahl der aufeinanderfolgenden Durchgänge, die bei den
niederen Temperaturen erforderlich sind, hängt von verschiedenen Umständen ab, so
von dem jeweiligen Masernvirenstamm, von dem ausgegangen wird, von der behandlungsmäßigen
Vorgeschichte dieses Stammes und von dem jeweiligen Gewebe, das in der Gewebekultur
verwendet wird.
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Bei Kükenembryogewebekulturen hat man günstige Resultate hinsichtlich
der Schwächung erhalten, wenn
man in etwa vierzig aufeinanderfolgenden Durchgängen
des Virus eine Inkubationstemperatur von 28 bis 32"C angewandt hat.
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Während des Durchgangs wird man den Virus zweckmäßig immer dann auf
Frischgewebekulturen übertragen, wenn 20 bis 750/o, vorzugsweise 25 bis 500/0, der
Zellen in einer bestimmten Charge geimpfter Gewebekultur einen Zytopathogeneffekt
zeigen.
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Ähnliche Verfahrensmaßnahmen werden angewandt, um den geschwächten
Virus zu vermehren und Ansätze für Impfstoffherstellung zu gewinnen.
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Bei den zuletzt genannten Vorgängen wird die Kultur inkubiert, so
lange, bis sich der Virus in einer Weise vermehrt hat, die eine brauchbare Konzentration
liefert, worauf die Flüssigkeit aus der Gewebekultur geerntet wird, etwa durch Dekantieren
unter aseptischen Bedingungen sowie Klären durch Zentrifugieren, Filtrieren od.
dgl. Das so erhaltene Produkt kann unmittelbar als Impfstoff verwendet werden oder
je nach seiner Konzentration mit einem zur Impfung geeigneten Verdünnungsmittel
verdünnt werden; auch kann eine für den Virus nichttoxische Stabilisierungslösung
zugegeben werden, um einen gebrauchsfertigen flüssigen Impfstoff zu gewinnen. Wenn
eine merkliche Anzahl der Gewebezellen in der Kultur durch den Zytopathogeneffekt
des Virenwachstums nicht aufgelöst worden ist, so kann Frischflüssigkeit, etwa eine
Impfstoffstabilisatorlösung, eine Salzlösung, ein frisches Nährmedium od. dgl. anschließend
an die Dekantierung zugegeben werden, worauf der Inhalt einer Reihe von Ausfrier-
und Tauvorgängen unterworfen wird, um weitere Viren aus den Gewebezellen zu erhalten.
Die resultierende Flüssigkeit wird dann geerntet und mit der vorhergehenden Ernte
zusammengegeben, um ein Impfstoffkonzentrat zu erhalten.
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Letzteres wird von Gewebezellen und Zellrückständen befreit, und der
Virengehalt wird durch Titration, z. B. gegen Humanzellenkulturen, standardisiert.
Hierauf kann das Impfstoffkonzentrat, wenn gewünscht, direkt zum Impfen von nicht
immunen Personen verwendet werden; es kann auch mit einem sterilen Stabilisator
verdünnt werden, z. B. mit einer Laktoseglutamatlösung und im gefrorenen Zustand,
vorzugsweise bei einer Temperatur von -20 bis -70"C, bis zum späteren Gebrauch aufbewahrt
werden. Andererseits kann der stabilisierte Impfstoff auch einer Gefriertrocknung
unterworfen werden, so daß ein trockener Impfstoff entsteht, der leicht aufbewahrt
werden und mit sterilem Wasser od. dgl. vor Gebrauch wiederhergestellt werden kann.
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Beispiel 1 Gewebekulturverfahren 8 bis 10 Tage alte Kükenembryos
wurden unter aseptischen Bedingungen fein zerhackt, nachdem die Augen entfernt worden
waren; das so gewonnene zerkleinerte Gewebe wurde mit phosphatgepufferter Salzlösung
gewaschen. Das gewaschene Gewebe wurde sodann in üblicher Weise in einem Erlenmeyer-Kolben
mit magnetischem Rührwerk trypsinisiert. Das trypsinisierte Gewebe wurde bei 1000
Umdrehungen pro Minute 3 Minuten lang zentrifugiert; das dabei gewonnene Zellkonzentrat
wurde in einem Wachstumsmedium suspendiert, so daß 500 000 bis 600 000 Zellen auf
1 ml entfielen. Das Wachstumsmedium war eine basische Lösung nach E a r 1(6,8 g
Natriumchlorid,
0,4 g Kaliumchlorid, 02 g Kalziumchlorid, 0,2 g
Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,125 g natriumsaures Phosphat, 1,0 g Glukose, 2,2 g
Natriumbikarbonat und 0,02 g Phenolrot in Wasser gelöst, derart, daß die Gesamtmenge
1000 ml beträgt), enthaltend 5°/0 Kalbsserum, 0,5 0/o Laktalbuminhydrolysat, 20û
Einheiten Penizillin und 200 ug Streptomyzin pro Milliliter. Die entstehende Suspension
wurde in Mengen von 1 ml in sterile Röhrchen gegeben und 24 bis 48 Stunden lang
bei 35 C inkubiert. Ein ähnliches Verfahren wurde angewandt, um größere Mengen zu
gewinnen, und zwar wurden 60 bis 70 ml der Suspension in Kulturflaschen nach B 1
a k e oder R o u x eingegeben.
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Anschließend an die anfängliche Inkubationsperiode für r die Kükenembryogewebezellen
wurde das Wachstumsmedium entfernt, mld die Zellen wurden zweimal mit einem Medium
-t- 199 nach M o r g a n und P a r k e r (s. Aufsatz von M o r g a n u. a. in Proccedings
of the Society for Experimental Biology and Medicine, 1950, 73, S, 1 bis 8) gewaschen;
hierauf wurden 2 ml des Mediums # 199 ohne Serum und eingestellt auf einen pH-Wert
von 7 bis 7,2 in jedes Röhrchen gegeben oder 100 ml des Mediums in jede Flasche.
Jedes Röhrchen wurde sodann mit 0,2 ml der aktiven Masernvirensuspension geimpft
bzw. jede Flasche mit 1 ml dieser Suspension; die so gebildeten Kulturen wurden
bei einer Temperatur von 32 bis 28"C inkubiert und zwar so lange, bis eine Vermehrung
des Virus eintrat. Im allgemeinen konnte man Wachstum des Virus auf Grund der Tatsache
feststellen, daß die Zellen in der Gewebekultur einen Zytopathogeneffekt zeigten;
der Übergang des Virus in das nächste Gewebekulturmedium wurde gewöhnlich jeweils
dann ausgeführt, wenn 25 bis 50010 der Zellen in dem jeweils geimpften Medium den
Zytopat h ogeneffekt zeigten. Alternativ kann das Wachstum des Virus in den Gewebekulturen
auch dadurch festgestellt werden, daß man das Kultur medium in eine Kultur von Humangewebezellen,
etwa Humanamniotazellen, Humanherzzellen oder andere geeignete Zellen, titriert,
und zwar nach dem Verfahren von S c h w a r z und Z i r b e l, veröffentlicht in
Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 1959, S. 102,
Zeilen 711 bis 714.
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Nachdem die gewünschte Schwächlung des Virus nach einer ausreichenden
Zahl von Durchgängen erreicht war, wurden ein oder mehrere Durchgänge durch eine
Kükenembryogewebekullur aílgeschlossen, und zwar bei 32 bis 28"C. Diese Durchgänge
erfolgten in so großem Maßstab, daß der Virus genügend vermehrt werden konnte, um
einen Vorrat von IIllpfstoffkonzentrat zu gewinnen. Das Impfstoffkonzentrat wurde
in herkömmlicher Weise durch Dekantieren, Einfrieren, Auftauen und Waschen geerntet.
Der geerntete Impfstoff wurde durch Zentrifugieren der Kulturffnssigkeit und anschließendes
Waschen geklärt, solange, bis er frei war von Gewebezellen und Zellrückständen.
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Beispiel 2 Bereitung und Prüfung des Impfstoffes Bei einer bevorzugten
erfindungsgemäßen Herstellungsweise des Impfstoffes ging man von dem Edmonston-Stamm
des Masernvirus aus, wie er von E n d e r s beschrieben worden ist. Diesen unterwarf
man neunzehn aufeinanderfolgenden Durchgängen
in einer Kükenembryogewebekultur bei
einer Inkubationstemperatur von 35 C. Hierauf unterwarf man diesen in Kükenembryo
adaptierten Virus gemäß dem Verfahren vom Beispiel 1 siebenunddreißig aufeinanderfolgen
den Durchgängen durch eine Kükenembryogewebekultur mit einer Inkubationstemperatur
von 32 C. Der nach dem 37. Durchgang vorliegende geschwächte Virus wurde hierauf
drei abschließenden Behandlungen in verdünnten Kükenembryogewebekulturen unterworfen,
worauf zwei weitere Durchgänge durch solche Kulturen zum Zwecke der Vermehrung und
der Erzeugung eines Impfstoffpools erfolgten. Bei jedem dieser letzteren Durchgänge
erfolgte die Inkubation bei einer Temperatur von 32 C.
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Die entstehenden Impfstoffkonzentrate wurden von dem Zellgewebe und
den Geweberesten abgetrennt und mit einer gleichen Menge von Laktoseglutamatlösung
als Stabilisator verdünnt. Die Laktoseglutamatstabilisatorlösung hatte die folgende
Zusammensetzung: Kaliumglutamat .................. 0,956 g NaOHPO4 ....................
...... 1,25 g KH2PO4 .......................... 0,52 g Laktose ..........................
100,00 g Wasser ............... bis zu 1 1 Gesamtmenge Ein Teil des somit fertigen
Impfstoffes wurde auf Humanherzgewebezellen titriert. Man fand, daß der Impfstoff
103,5 bis 104,3 TCLD50-Einheiten pro 0,2 ml enthielt (tissue culture infective doses
50 per cent [TCID5/] per 0,2 ml). Jeder Impfstoffpool wurde getestet durch Einimpfung
in ein Thioglykolat-Bakteriennährmedium sowie durch intraperitoneale und subkutane
Impfung in Guinea-Schweine und Mäuse sowie durch intramuskulare und intrazerebrale
Impfung bei Affen (monkey cynomolgous); man konnte feststellen, daß die Impfstoffe
frei von Verunreinigungen waren.
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Neun Kinder, die gegen Masern nicht immun waren, wurden mit 0,2 ml
Dosen des Impfstoffes injiziert, zwei davon intramuskular und sieben subkutan. Keines
der geimpften Kinder zeigte Masernausschlag, und bei nur einem von ihnen trat eine
merkliche Temperaturerhöhung ein; auch diese Temperaturerhöhung war nur kurzzeitig.
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Beispiel 3 Der nach der 37. Untertemperatur (Behandlung gemäß Beispiel
2) gewonnene Virus wurde weiteren Durchgängen gemäß Beispiel 2 unterworfen, so daß
schließlich insgesamt fünfundsechzig Durchgänge bei einer Inkubationstemperatur
von 32°C erfolgt waren.
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Es wurden Impfstoffpools mit Laktoseglutamatstabilisatoren gebildet.
Diese wurden friergetrocknet.
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Die aus dem friergetrockneten Material gebildeten Impfstoffe enthielten
102 5 bis 10l 5 TCID50-Einheiten auf 0,2 ml. Ein Teil des Impfstoffes wurde durch
direktes Einfrieren aufbewahrt. Der Impfstoff wurde wie im Beispiel 2 auf Sicherheit
hin geprüft.
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Siebzig Kinder, die auf Komplement bindende und neutralisierende
Antikörper hin untersucht worden waren und die bei einer Serumverdünnung im Verhältnis
1 : 2 keine solchen Antikörper gezeigt hatten, wurden subkutan mit 0,2 ml der erwähnten
Impfstoffe geimpft und anschließend für eine Zeitspanne von mehreren Wochen in Beobachtung
gehalten.
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Es traten keine lokalen oder unmittelbaren Reaktionen auf mit Ausnahme
eines Kindes, bei dem eine leichte urtikariale Reaktion ungefähr 4Wochen nach der
Impfung
eintrat. Temperaturen wurden mindestens einmal täglich gemessen, bei den meisten
Kindern zweimal täglich während der ganzen Beobachtungszeit. In manchen Fällen trat
eine leichte fiebrige Reaktion ein, die ungefähr 2 Tage dauerte und 7 bis 8 Tage
nach der Impfung in Erscheinung trat. Die mittlere maximale Rektaltemperatur bei
sämtlichen geimpften Kindern betrug 38,4ob. Ein leichter, masernartiger Ausschlag
war nur bei zwei Kindern zu beobachten und zwar am 11. bzw. 13. Tag nach der Impfung.
Es traten keine ernsthaften Komplikationen während der Beobachtungszeiten auf, und
es gab keinen Beweis dafür, daß das Zentralnervensystem in Mitleidenschaft gezogen
wurde. 3 bis 6 Wochen nach der Impfung wurde von jedem Kind eine Blutserumsprobe
entnommen und auf Komplement bindende und neutralisierende Masern-Antikörper hin
untersucht. 97,1 01o der Kinder hatten Antikörperniveaus entwickelt, die denjenigen
bei natürlicher Maserninfektion vergleichbar waren.
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Beispiel 4 Anschließend an die Prozedur von Beispiel 2 wurden Masernviren
nach der 37. Behandlung unter 32"C zehn weiteren Behandlungen mit einer Inkubationstemperatur
von 32 C und sodann fünfzehn Behandlungen mit einer Inkubationstemperatur von 28
° C unterworfen. Die nach der 15. Behandlung unter 28"C gewonnenen Impfstoffe wurden
zur Impfung von nicht immunen Kindern verwendet. Die Beobachtung der geimpften Kinder
zeigte, daß der Virus geschwächt war, was die Heftigkeit der auftretenden
Reaktionen
anbelangte, daß aber keine merkliche Minderung der Antigenität eingetreten war.
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Auf einfache Weise können die Masernviren dadurch geschwächt werden,
daß man sie auf isoliertem Gewebe bei einer Temperatur von 28 bis 32"C einer Kulturbehandlung
unterwirft, wobei man als Gewebe beispielsweise Rindernierengewebe verwenden kann.
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Bei der Herstellung von Gewebekulturen können auch andere geeignete
proteolytische Enzyme an Stelle des Trypsins verwendet werden, um die Gewebezahlen
zu dispergieren. Man kann auch andere Kulturflüssigkeiten, z. B. das basische Medium
nach E a gele, verwenden (Medium ft 199) zusammen mit 5 bis 10oil nichtaktiviertem
Pferdeserum oder ein Medium, bestehend aus 8 Teilen basischer SalzIösung nach E
a r 1 e, 1 Teil 5 °/Oigem Laktalbuminhydrolysat und 1 Teil nichtaktiviertem Pferde-
oder Lammserum.