DE69634438T2

DE69634438T2 - Von humanem hitzeschockprotein 60 hergeleitete peptide zur behandlung von diabetis, entsprechende zusammensetzungen, verfahren und kits

Info

Publication number: DE69634438T2
Application number: DE69634438T
Authority: DE
Inventors: R. Irun COHEN; Dana Elias; Rivka Abulafia; Jana-C/O Joan Fraser-Nys/Pediatrics Bockova
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1995-06-30
Filing date: 1996-07-01
Publication date: 2006-02-09
Anticipated expiration: 2016-07-02
Also published as: CZ295110B6; NO976094L; ZA965565B; NO976094D0; IL122757A; DK0845943T3; MX9800191A; ES2239770T3; AR003446A1; HUP9901688A2; DE69634438D1; IL122757A0; CN1102598C; JP3955627B2; EP0845943A1; KR19990028640A; EP0845943A4; EP0845943B1; UY24270A1; CZ411797A3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Peptid, das ein Epitop des humanen 60 kDa Hitzeschockproteins (hsp60) ist, und pharmazeutische Zusammensetzungen und seine Verwendung in Verfahren und Testkits zur Diagnose von Insulin-abhängigem Diabetes mellitus (IDDM).
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Typ I Diabetes, oder IDDM, ist eine Autoimmunerkrankung, die durch T-Zellen, die in den Pankreasinseln gelegene, Insulin produzierende β-Zellen angreifen und zerstören (Castano und Eisenbarth, 1990), verursacht wird. Der Autoimmunvorgang, der seinen Höhepunkt in IDDM erreicht, beginnt und schreitet ohne Symptome fort.
Die Erkrankung tritt klinisch nur an die Oberfläche, wenn der sich summierende Verlust an β-Zellen die Kapazität der restlichen β-Zellen, Insulin zu liefern, übersteigt. Man glaubt in der Tat, dass der Zusammenbruch der Glucose-Homeostase und klinischer IDDM erst auftritt, nachdem 80–90% der β-Zellen durch das Immunsystem inaktiviert wurden. Daher sind Patienten, die als an IDDM leidend identifiziert werden können, zwangläufig in einem fortgeschrittenen Stadium der Autoimmunzerstörung ihrer β-Zellen. Überdies kann eine Diagnose von beginnendem, prä-klinischem Diabetes durch den Nachweis von immunologischen Markern von β-Zellautoimmunität erst nach dem Einsetzen des Autoimmunvorgangs gemacht werden. Daher besteht der therapeutische Ansatz darin, einen sicheren, spezifischen und wirksamen Weg zu finden, einen Autoimmunvorgang, der bereits weit fortgeschritten ist, abzuschalten.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung untersuchten diese Frage zuvor durch Untersuchen an spontanen Diabetes, der sich in Mäusen des NOD-Stamms entwickelt, der als ein genaues Modell humanen IDDMs betrachtet wird (Castano und Eisenbarth, 1990). NOD Mäuse entwickeln ungefähr im Alter von 4 Wochen eine Entzündung der Langerhans'schen Zellen, welche als ein mildes Infiltrat um die Inselzellen herum beginnt und zu schwerer Intra-Inselzellen Entzündung fortschreitet. Hyperglykämie, welche die Insulin-Insuffizienz bestätigt, beginnt in den Weibchen in der Kolonie ungefähr im Alter von 14–17 Wochen. Im Alter von 35–40 Wochen haben nahezu alle weiblichen NOD Mäuse schweren Diabetes entwickelt, und ohne Insulin-Behandlung sterben die meisten. Männliche NOD Mäuse weisen eine geringere Erkrankungshäufigkeit auf, deren Gründe nicht klar sind. Es wurde gezeigt, dass der Diabetes von NOD Mäusen durch Autoimmun-T-Zellen verursacht wird (Bendelac et al., 1987).
T-Zellreaktivität und Autoantikörper gegen verschiedene Antigene wurden sowohl in menschlichen IDDM Patienten als auch in NOD Mäusen nachgewiesen (Elias, 1994), und es ist nicht klar, ob Immunität gegenüber jedem einzelnen der möglichen Zielantigene die Hauptursache für die Erkrankung ist. Abgesehen von der Frage der Ursache besteht die Frage der Therapie.
Es wurde gezeigt, dass das Auslösen des Autoimmunvorgangs in NOD Mäusen verhindert werden kann, indem man die Mäuse verschiedenen Manipulationen, wie beschränkter Diät, viralen Infektionen oder unspezifischer Stimulierung des Immunsystems vor dem Beginn der Diabetes aussetzt (Bowman et al., 1994). NOD Diabetes ist auch durch Herbeiführen von immunologischer Toleranz gegenüber dem Antigen Glutaminsäure-Decarboxylase in prä-diabetischen Mäusen verhinderbar (Kaufman et al., 1993; Tisch et al., 1993).
Insulin-abhängiger Diabetes mellitus (IDDM), der sich spontan in weiblichen NOD Mäusen entwickelt, wurde mit Immunreaktivität gegenüber einer Reihe von Eigenantigenen assoziiert (Bach, 1994). Bemerkenswert unter diesen Antigenen ist das p277 Peptid aus der Sequenz des 60 kDa Hitzeschockprotein- (hsp60)Moleküls aus Säugetieren. Dies entspricht den Resten 437–460 im humanen hsp60 Molekül (Elias et al 1991, Israelische Patentanmeldung Nr. 94241, PCT Patent-Veröffentlichung WO90/10449). Das humane p277 Peptid weist die folgende Sequenz auf:
Prä-diabetische NOD Mäuse manifestieren spontane, diabetische T-Zellantworten auf hsp60 und auf die humanen (2) oder Mausvarianten des p277 Peptids (3). Die Maus und humanen Peptide unterscheiden sich durch 1 Aminosäure und sind immunologisch kreuzreaktiv (3). Einige nicht zu Diabetes neigende Mäusestämme, wie C57BL/6, entwickeln eine vorübergehende Hyperglykämie und eine Entzündung der Langerhans'schen Zellen, wenn sie gegen p277 immunisiert werden, das kovalent an ein fremdes, immunogenes Trägermolekül konjugiert ist (4). Mäuse des C57BL/KsJ Stammes entwickeln spontane T-Zellantworten gegen hsp60 und gegen p277 nach Behandlung mit einer sehr niedrigen Dosis des β-Zelltoxins Streptozotocin (STZ), das Autoimmundiabetes auslöst (5).
Zusätzlich zur Beteiligung an der Ausprägung der Erkrankung scheint Peptid p277 in einer Heilung des Autoimmunvorgangs zu funktionieren: Subkutane Verabreichung von p277 in inkompletten Freundschen Adjuvanz (IFA; Mineralöl) führte zu einem Stillstand des Fortschreitens der Erkrankung in jungen NOD Mäusen (2) oder in 12–17 Wochen alten NOD Mäusen mit fortgeschrittener Entzündung der Langerhans'schen Zellen (6, 7). Sowohl die humanen (6, 7) als auch die Maus (3) -Varianten von p277 waren wirksam. NOD Mäuse, die transgen für das Maus hsp60-Gen an einem MHC Klasse II Promotor sind, zeigten eine Herunterregulierung ihrer spontanen, proliferativen T-Zellantwort auf p277 und ein signifikanter Anteil der Mäuse blieb von der Entwicklung von Diabetes verschont (8).
Überdies verhinderte die Verabreichung von p277 an C57BL/KsJ Mäusen die Entwicklung von Autoimmundiabetes in Mäusen, die vorher eine sehr niedrige Dosis STZ erhalten hatten; Behandlung dieser Mäuse mit einem Peptid des GAD65 Moleküls war nicht wirksam (9).
WO 90/10449 offenbart Peptidepitope p277 und p278, die den Positionen 437–460 und 458–474 des humanen hsp60 Moleküls entsprechen, und deren Verwendung zu Diagnose, Behandlung und Impfung gegen IDDM. Young et al. (Experientia, 48, 650–656, 1992) offenbart, dass zwei Regionen von hsp um die Reste 180–188 und 458–474 an einer Autoimmunerkrankung, insbesondere IDDM, beteiligt sind.
Varianten des p277 Peptids, in denen ein oder beide Cysteinreste an Positionen 6 und 11 durch Valinreste ersetzt wurden, bezeichnet als p277(Val⁶), p277(Val¹¹) beziehungsweise p277(Val⁶–Val¹¹), werden in der internationalen Patentanmeldung WO 96/19236, die der israelischen Patentanmeldung Nr. 112094 entspricht, beschrieben und es wurde gezeigt, dass sie ebenso wirksam wie p277 in der Behandlung von Diabetes sind.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, zusätzliche Peptide des humanen hsp60 bereitzustellen, wobei die Peptide zur Diagnose und Behandlung von IDDM verwendbar sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einer Studie von Fragmenten und Peptiden des humanen hsp60 Moleküls wurde unerwarteterweise herausgefunden, dass IDDM Patienten und NOD Mäuse auf andere hsp60 Epitope reagieren, die zur Diagnose und Behandlung von IDDM verwendet werden können.
Diese Epitope, für sich allein oder zusammen mit p277 oder einer p277 Variante, ausgewählt aus p277(Val⁶), p277(Val¹¹) und p277 (Val⁶–Val¹¹), können die Wirksamkeit der Behandlung verbessern.
Diese neuen Peptide werden in Tabelle 1 identifiziert.
Tabelle 1 – Synthetische Hsp60 Peptide und deren Sequenz
Von anderen hsp60 Peptiden, einschließlich solcher, die als p278 (entsprechend den Positionen 458–474 in der humanen hsp60 Sequenz), p19 (entsprechend den Positionen 271–290 in der humanen hsp60 Sequenz) und p21 (entsprechend den Positionen 301–320 in der humanen hsp60 Sequenz) bezeichnet werden, wurde gezeigt, dass sie nicht so wirksam sind. Es ist bekannt, dass der Aminoterminus von p278 mit dem wirksamen p277 Peptid um drei Reste (NED) überlappt und der Carboxyterminus von p278 überlappt mit dem wirksamen p32 Peptid um 9 Reste (EIIKRTLKI). Daher sind die restlichen 11 Reste von p32 kritisch (PAMTIAKNAGV).
Die vorliegende Erfindung betrifft daher das Peptid p32, identifiziert in Tabelle 1, und Salze und funktionstüchtige Derivate davon.
Es ist weiter eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren und Kits für die frühe Diagnose von IDDM, unter Verwendung der Peptide der Erfindung, bereitzustellen. Im Verlauf der Entwicklung von IDDM exprimieren Tiere hsp60 Moleküle oder Moleküle, die damit kreuzreaktiv sind, welche ihren Weg in das Blut und den Urin der Tiere finden. Sie exprimieren auch Antikörper und T-Zellen, die spezifisch gegen solche Moleküle gerichtet sind. Deshalb dient das Vorhandensein von hsp60 (oder Molekülen, die damit kreuzreaktiv sind) oder Antikörpern oder T-Zellen, welche hierfür spezifisch sind, in Blut oder Urin als ein Assay für den Nachweis des IDDM-Vorgangs, bevor die Zerstörung von Betazellen beendet ist und das Individuum zu lebenslangem Diabetes verurteilt ist.
Das Vorhandensein oder Anfangsstadium von IDDM in einem Patienten kann durch Testen des Bluts oder Urins des Patienten auf das Vorhandensein von Antikörpern oder T-Zellen, die immunologisch mit humanem hsp60 reaktiv sind, diagnostiziert werden, unter Verwendung eines p32 Peptids der Erfindung als ein Antigen.
Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Diagnostizieren des Vorhandenseins oder Anfangsstadium von IDDM in einem Patienten bereit, das ein Testen des Patienten auf das Vorhandensein von anti-hsp60 Antikörpern oder einer T-Zelle, die mit hsp60 immunreagiert, unter Verwendung eines Peptids der vorliegenden Erfindung als ein Antigen umfasst, wobei ein Ergebnis, welches auf das positive Vorhandensein von anti-hsp60 Antikörpern oder einer T-Zelle, die mit hsp60 immunreagiert, hinweist, auf eine hohe Wahrscheinlichkeit für das Vorhandensein oder Anfangsstadium von IDDM hinweist.
In dem Verfahren zum Diagnostizieren von IDDM kann der Patient auf das Vorhandensein von anti-hsp60 Antikörpern getestet werden, wobei das Testverfahren einen Radioimmunoassay oder einen ELISA-Test umfassen kann.
Der Patient kann auch auf das Vorhandensein einer T-Zelle, die mit hsp60 immunreagiert, getestet werden. In einer Ausführungsform dieses Aspekts umfasst das Testverfahren einen T-Zell-Proliferationstest, welcher die Schritte umfasst:

(i) Herstellen einer Fraktion von mononukleären Zellen, welche T-Zellen enthält, aus einer vom Patienten erlangten Blutprobe;
(ii) Zufügen eines Antigens, ausgewählt aus dem Peptid der Erfindung, zu der Fraktion von mononukleären Zellen;
(iii) Inkubieren der Zellfraktion in der Gegenwart des Antigens für einen geeigneten Zeitraum und unter geeigneten Kulturbedingungen;
(iv) Zufügen eines markierten Nukleotids zu der inkubierten Zellkultur von (iii) zu einem geeigneten Zeitpunkt vor dem Ende des Inkubationszeitraums, um für einen Einbau des markierten Nukleotids in die DNA der proliferierenden T-Zellen zu sorgen; und
(v) Bestimmung der Menge an proliferierenden T-Zellen durch Analyse der Menge des in die T-Zellen eingebauten, markierten Nukleotids.

Im obigen Schritt (iv) ist das markierte Nukleotid vorzugsweise 3H-Thymidin. Die Bestimmung der Menge an proliferierenden T-Zellen wird durch die Berechnung des Stimulierungsindex der T-Zellen mit Standardverfahren gemacht.
In einer weiteren Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung umfasst das Testverfahren einen T-Zell-Cytokinantwort-Test, in welchem Schritte (i) bis (iii) wie in dem obigen T-Zell-Proliferationstest sind und in einem vierten Schritt (iv) das Vorhandensein eines Cytokins, wie IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL10, TNFα oder TGFβ, die von den reagierenden Lymphocyten in das Medium sezerniert werden, durch Standardverfahren mit kommerziell erhältlichen Kits nachgewiesen wird.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein in vivo Verfahren bereit, wobei ein Antigen, ausgewählt auf den Peptiden der Erfindung, subkutan in einen Patienten injiziert wird und das Auftreten einer nachweisbaren Hautreaktion (Hypersensitivität vom verzögerten Typ, DTH) beobachtet wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Mittel zum Durchführen solcher Assays, sowie Kits zum Durchführen solcher Assays. Die Kits können zum Durchführen jedes, der verschiedenen Assays, die zum Erzielen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, hergestellt werden.
Diese Kits enthalten alle Materialien, die zum Durchführen eines einzelnen Assays oder einer festgelegten Zahl von Assays notwendig sind. Zum Beispiel kann solch ein Kit zum Bestimmen des Vorhandenseins von anti-hsp60 Antikörpern ein, an einer festen Phase immobilisiertes, Peptid der Erfindung und einen markierten Antikörper enthalten, der in der Lage ist, die nicht-variable Region des nachzuweisenden anti-hsp60 Antikörpers zu erkennen, wie ein markierter anti-humaner Fab. Der Kit kann auch Anweisungen zur Verwendung des Kits und Behälter enthalten, um die Kitmaterialien aufzubewahren. Jede gewöhnliche Markierung oder Kennzeichnung, wie ein Radioisotop, ein Enzym, eine Chromophore oder eine Fluorophore, kann verwendet werden. Ein typisches Radioisotop ist Jod-125 oder Schwefel-35. Typische Enzyme für diesen Zweck schließen Meerrettich-Peroxidase, Meerrettich-Galaktosidase und Alkalische Phosphatase ein.
Ein Kit zum Diagnostizieren des Vorhandenseins von IDDM durch Testen auf das Vorhandensein von anti-hsp60 Antikörpern umfasst:

(i) ein Antigen, ausgewählt aus den Peptiden der Erfindung, und
(ii) einen markierten Antikörper, der in der Lage ist, die nicht-variablen Region der nachzuweisenden anti-hsp60 Antikörper zu erkennen.

Ein Kit zum Diagnostizieren des Vorhandenseins von IDDM durch Testen auf das Vorhandensein einer T-Zelle, welche mit hsp60 immunreagiert, wird

(i) ein Antigen, ausgewählt aus den Peptiden der Erfindung;
(ii) ein geeignetes Medium zur Kultur von Lymphocyten (T-Zellen); und
(iii) entweder ein markiertes Nukleotid für den T-Zell- Proliferationstest oder ein Cytokin, z.B. Interferon-Gamma, -Assaykit für den Cytokin-Test

Für den in vivo Test, wird der Kit nur ein Peptid der Erfindung in einer zur Injektion geeigneten Form umfassen.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter die Verwendung von Peptid p32 zur Verhinderung oder Behandlung von IDDM. Impfung mit einem Antigenpeptid der vorliegenden Erfindung kann eine spezifische Herunterregulierung der Autoimmunität gegen das Antigen bereitstellen und erzeugt wirksam eine Resistenz gegen den Autoimmunvorgang von IDDM. Das gleiche trifft hinsichtlich einer Impfung mit T-Zellen zu, die spezifisch für solche Antigene sind, in abgeschwächter oder nicht virulenter Form, oder nachdem sie behandelt wurden, um ihre Antigenität zu verbessern, oder Fragmenten oder aktiven Taten davon. Wenn von dem Patienten gezeigt wurde, dass er sich bereits in den präklinischen Anfangsstadien von IDDM befindet, kann eine Injektion mit solch einem Antigen oder solch einer T-Zelle (oder Fraktion) eine Herunterregulierung der Autoimmunität gegen dieses Antigen erzeugen und so den Autoimmunvorgang zum Stillstand bringen, bevor signifikanter, dauerhafter Schaden entstanden ist. Das Peptid kann auch als ein therapeutisches Mittel verwendet werden, um den Autoimmunvorgang zum Stillstand zu bringen, auch wenn er schon weit fortgeschritten ist, wie kürzlich durch das Labor der vorliegenden Erfinder hinsichtlich der Behandlung von NOD Mäusen mit dem Peptid p277 (Elias und Cohen, 1994) gezeigt wurde.
Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Präparat zum Verhindern oder Behandeln von Insulin-abhängigem Diabetes mellitus (IDDM) bereit, umfassend: (a) T-Zellen, die eine Spezifität für ein Protein oder Peptid entwickelt haben, welches immunologisch kreuzreaktiv mit einem Peptid der Erfindung ist, wobei die Zellen durch Inkubieren in der Gegenwart des Peptids aktiviert wurden; (b) die T-Zellen, die bestrahlt oder auf andere Weise geschwächt wurden; (c) die T-Zellen, die einer Druckbehandlung mittels hydrostatischem Druck, Behandlung mit einem chemischen Kreuzvernetzungsmittel und/oder Behandlung mit einem Cytoskelett-Kreuzvernetzungsmittel ausgesetzt wurden (d) Fragmente von oder Oberflächenproteine abgestoßen von (a), (b) oder (c); oder (e) ein Peptid, bestehend im Wesentlichen aus der variablen Region des Rezeptors von (a), der spezifisch für das Protein ist, oder ein Salz, funktionstüchtiges Derivat, Vorgängermolekül oder aktive Fraktion davon.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Präparat humane T-Zellen, die durch in vitro Kontakt mit dem Peptid der Erfindung Spezifität entwickelt haben.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verhinderung oder Behandlung von IDDM bereit, umfassend einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und als aktives Prinzip eine wirksame Menge eines Peptids der Erfindung, eines Salzes oder funktionstüchtigen Derivats davon.
Die Erfindung betrifft weiter die Verwendung von Peptid p32 zum Verhindern oder Behandeln von IDDM, umfassend das Verabreichen einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend Peptid 32, ein Salz oder ein funktionstüchtiges Derivat davon umfasst, oder ein Präparat, welches T-Zellen umfasst, die eine Spezifität für das Peptid der Erfindung entwickelt haben, an einen Patienten mit Bedarf dafür umfasst.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Positionen der Peptide, auf die sich hierin bezogen wird, auf der gesamten Sequenz des humanen hsp60 Moleküls.
2 zeigt eine T-Zell-Proliferation von NOD Mäusen auf humane hsp60 Peptide p12, p32, p277(Val⁶–Val¹¹) und p278.
3 ist eine Graphik, welche die proliferative T-Zellantwort von NOD Mäusen auf Peptide zeigt. Gruppen von drei NOD Mäusen wurden mit Maus p12, Maus p277, GAD-p35 und MT-p278 Peptiden in IFA, jeweils mit einer Dosis von 25 μg in IFA immunisiert. Die ableitenden Lymphknoten wurden 10 Tage später entfernt und auf proliferative Antworten auf das entsprechende Peptid in den Konzentrationen von 5, 10, 20, und 50 μg/ml getestet. Die Stimulation der optimalen Konzentration von 20 μg/ml wird gezeigt. Die folgenden cpm-Bereiche wurden in Medium-Kontrollen erhalten: Maus p12, 881; Maus p277, 1243; MT-p278, 698 und GAD-p35 1430. Maus p38 Peptid ist ein von Maus hsp60 (556–573) abgeleitetes Peptid, das keine Sequenzhomologie mit den getesteten Peptiden aufweist und als negative Kontrolle für die Spezifität dient. Diese Ergebnisse sind repräsentativ für die drei durchgeführten Experimente. Jeder Assay wurde in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, wofür die SD-Werte durch die Balken angegeben werden. Es gab keine Kreuzreaktivität zwischen den Peptiden (nicht gezeigt).
4 ist eine Graphik, welche die Wirkung der Verabreichung von Peptid auf Diabetes zeigt. Gruppen von 10–20 NOD Mäusen wurden im Alter von 10 Wochen mit 100 μg Maus p12, p277, p35-GAD oder MT-p278 in IFA, oder IFA allein behandelt. Den Mäusen wurde monatlich Blut entnommen und auf das Einsetzen von Hyperglykämie verfolgt. Im Vergleich mit den mit IFA behandelten Kontrollen waren die mit p12 und p277 behandelten Mäuse signifikant geschützt, P < 0,05.
5 zeigt die IgG1, IgG2a und IgG2b Antikörper-Isotypen als Antwort auf die Peptidbehandlung. Mäuse wurden wie in der Legende von 4 beschrieben, behandelt. Individuelle Proben wurde auf Antikörper gegen Maus p12 A; p277 B; GAD-p35 C; und MT-p278 D, der IgG1, IgG2a und IgG2b Isotypen, analysiert.
Ähnliche Wirkungen wurden in zwei Experimenten erhalten. Die Ergebnisse werden als Absorption bei 405 nm (OD) von 10 individuellen Mäusen in jeder Gruppe dargestellt. Der Grad der Signifikanz der Prävalenz von IgG1 und IgG2b Antikörpern in den Gruppen A und B im Vergleich zu C und D beträgt P < 0,001. Die Unterschiede zwischen den Graden von IgG1 und IgG2b Antikörpern im Vergleich zu den IgG2a Antikörpern in den Gruppen A und B waren signifikant (P < 0,001). Es gab keine Kreuzreaktivität zwischen den Antikörpern (nicht gezeigt).
6 zeigt die negative Korrelation zwischen Antikörpern und Blutglucose. Eine Gruppe von weiblichen NOD Mäusen wurde mit p12 (10 Mäuse) oder mit IFA allein (9 Mäuse), wie in der Legende von 4 beschrieben, behandelt. Die Menge an anti-p12 spezifischem Antikörper (ELISA O.D Einheiten in 1:50 verdünnten Seren, gemessen im Alter von 7 Monaten) wurde gegen die Blutglucose-Konzentration, gemessen im Alter von 7 Monaten, aufgetragen. Der Grad der Korrelation zwischen hohen Antikörpern und Blutglucose beträgt P < 0,002.
7 ist eine Graphik, welche die proliferativen T-Zellantworten (S.I.) eines IDDM Donorpatienten auf Recall-Antigene, auf hsp60 Protein und auf synthetische hsp60 Peptide zeigt.
8 ist eine Graphik, welche die proliferativen T-Zellantworten (S.I.) eines gesunden Donors auf Recall-Antigene, auf hsp60 Protein und auf synthetische hsp60 Peptide zeigt.
9 ist eine Graphik, welche die proliferativen T-Zellantworten (S.I.) eines anderen IDDM Donorpatienten auf Recall-Antigene, auf hsp60 Protein und auf synthetische hsp60 Peptide zeigt.
10A und 10B sind Graphiken, welche die proliferativen T-Zellantworten (S.I.) von zwei IDDM Donorpatienten auf synthetische hsp60 Peptide zeigen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wann immer "Peptid der Erfindung" oder eine der individuellen Bezeichnungen, wie "Peptid p12" oder "Peptid p32" in der vorliegenden Patentschrift und den Ansprüchen erwähnt wird, werden auch Salze und funktionstüchtige Derivate davon in Betracht gezogen, so lange die biologische Aktivität des Peptids hinsichtlich des Diabetes erhalten bleibt.
"Salze" der Peptide der Erfindung, die von der Erfindung in Betracht gezogen werden, sind physiologisch akzeptable, organische und anorganische Salze.
"Funktionstüchtige Derivate" der Peptide der Erfindung, wie hierin verwendet, deckt Derivate ab, die aus den Funktionsgruppen, welche als Seitenketten an den Resten oder den N- oder C-terminalen Gruppen durch im Stand der Technik bekannte Mittel hergestellt werden, und sind in der Erfindung eingeschlossen, so lange sie pharmazeutisch akzeptabel bleiben, d.h. sie zerstören die Aktivität des Peptids nicht, verleihen Zusammensetzungen, die sie enthalten, keine toxischen Eigenschaften und beeinträchtigen deren antigene Eigenschaften nicht.
Diese Derivate können zum Beispiel aliphatische Ester der Carboxylgruppen, Amide der Carboxylgruppen, die durch eine Reaktion mit Ammoniak oder mit primären oder sekundären Aminen hergestellt wurden, N-Acyl-Derivate von freien Aminogruppen der Aminosäurereste, die durch eine Reaktion mit Acryl-Komponenten (z.B. Alkanoyl- oder carbocyclische Aroyl-Gruppen) gebildet wurden, oder O-Acyl-Derivate von freien Hydroxylgruppen (zum Beispiel, die von Seryl- oder Threonylresten), gebildet durch eine Reaktion mit Acyl-Komponenten, enthalten.
Die Peptide der Erfindung können als Immunogen in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, insbesondere Impfstoffen zur Erleichterung und Behandlung von IDDM, sowie als ein Antigen in diagnostischen Zusammensetzungen für die Diagnose von IDDM. Diese pharmazeutischen und diagnostischen Zusammensetzungen, die in einer im Stand der Technik bekannten Weise hergestellt werden können, bilden ebenfalls einen Teil der vorliegenden Erfindung.
Die therapeutischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können oral oder parenteral, wie subkutan, intramuskulär, intravenös, intranasal oder intrarektal, verabreicht werden.
Die Erfindung wird nun in nicht-einschränkender Weise durch die folgenden Beispiele und begleitenden Figuren veranschaulicht werden.
BEISPIELE Materialen und Methoden
(i) Mäuse.
Weibliche Inzucht-Mäuse des NOD/Lt Stamms wurden durch das Animal Breeding Center des Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel, oder das Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME geliefert. Diese Mäuse entwickeln im Alter von 14 bis 17 Wochen spontan Autoimmundiabetes, der IDDM im Menschen gleicht.
(ii) Antigene.
Peptide wurden im Department of Organic Chemistry des Weizmann Institute of Science unter Ver wendung eines automatischen, Mehrfach-Peptidsynthesizers (Abimed Modell AMS 422; Langenfeld, Deutschland) unter Befolgung des Herstellerprotokolls für eine N-α-fluorenylmethoxycarbonyl(Fmoc)synthese synthetisiert. Rohe Produkte wurden durch Umkehrphasen-HPLC auf einer semipräparativen C8-Säule (Lichrosorb RP-8, 7 mm, 250 × 10 mm, Merck, Darmstadt, Deutschland) gereinigt. Elution der Peptide wurde durch lineare Gradienten, die zwischen 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser und 0,1% Trifluoressigsäure in 75% Acetonitril in Wasser (vol./vol.) etabliert wurden, erreicht. Die Reinheit der einzelnen Peptidprodukte wurde durch analytische Umkehrphasen-HPLC und Aminosäurenanalyse ermittelt. Peptid MT-p278 ist aus der Sequenz von mycobacteriellem hsp60 (431–447). Peptid p277 ist an Positionen 6 und 11 durch Valin (V) an Stelle des Cysteins (C) in der nativen Sequenz substituiert. Substitution der zwei C-Reste durch V erhöht die Stabilität des Peptids stark, ohne seine immunologische Aktivität zu beeinflussen: das V-substituierte Peptid ist mit dem nativen Peptid nach T-Zell- und Antikörperassays vollständig kreuzreaktiv. Wenn nicht im Einzelnen angegeben, ist die humane Sequenz gewünscht. Die Maus p12 und Maus p38 Peptide werden vom hsp60 Molekül der Maus abgeleitet und entsprechen seinen 168–188, 437–460 beziehungsweise 556–573 Sequenzen. Peptid GAD-p35 ist aus dem GAD65 Molekül (524–543). Die Aminosäuresequenzen aller hierin verwendeten Peptide werden in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2 – Synthetische Peptide und deren Sequenzen
(iii) T-Zell Proliferation auf Peptide.
Mäuse.
Neun Wochen alte NOD Mäuse oder Mäuse anderer Stämme wurde in die hinteren Fußballen mit 0,1 ml einer Emulsion immunisiert, die 25 μg Peptid in kompletten Freundschen Adjuvanz (CFA; Difco, Detroit, MI.) gemischt mit einem gleichen Volumen Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) enthielt. Die ableitenden, poplitealen Lymphknoten wurden 10 Tage später entfernt und Suspensionen von Lymphocyten-Kulturen in dreifacher Ausfertigung wurden in der Gegenwart der verschiedenen Peptide (5 μg/ml) unter Verwendung des Einbaus von [3H]-Thymidin, wie beschrieben (Elias et al., 1991), auf Proliferation getestet. Die Ergebnisse werden als Stimulierungsindex (SI) gezeigt: das Verhältnis des cpm-Mittelwerts in der Gegenwart des Testpeptids zum cpm-Mittelwert von Kontroll-Kulturen ohne das Peptid. Standardfehler betrugen immer weniger als 10% der Mittelwerte.
(iv) Behandlung und Verlaufskontrolle.
Peptide, 100 mg in PBS, wurden mit einem gleichen Volumen IFA emulgiert und subkutan in 10 Wochen alte NOD Weibchen, wie beschrieben (Elias und Cohen, 1995), injiziert. Kontroll-Mäuse erhielten ein gleiches Volumen von in IFA emulgiertem PBS. Der Blutglucosespiegel der Mäuse wurde im nicht nüchternden Zustand monatlich um 10 Uhr unter Verwendung des Blutzuckermessgerätes (MediSense. Inc., Waltham, MA) überwacht. Mäuse mit einer Blutglucose über 11,1 mmol/l wurden als diabetisch betrachtet; diese Glucosekonzentration lag mehr als 3 Standardabweichungen über der mittleren Blutglucose-Konzentration, die in nicht-diabetischen Mäusen (Elias und Cohen, 1995) gemessen wurde. Histologische Untersuchungen der Pankreasinseln wurden an mit Hematoxilin und Eosin gefärbten Schnitten durchgeführt. Die Schnitte wurde unabhängig durch zwei Beobachter beurteilt, die beide die Identität der Gruppen nicht kannten. Der Chi-Quadrattest wurde verwendet, um die statistischen Unterschiede zwischen den verschiedenen Behandlungen zu ermitteln.
(v) Serum Antikörper.
Mäusen wurde monatlich Blut entnommen, um Antikörperantworten nachzuweisen. Der ELISA-Assay wurde wie beschrieben (Elias et al., 1991) durchgeführt. Kurz gesagt, wurden Maxisorb-Platten mit flachem Boden (Nunc, Roskilde, Dänemark) zum Nachweis von anti-Peptid Antikörpern, mit 100 ml/Vertiefung Peptid in PBS, bei einer Konzentration von 10 mg/ml für 2 Std. bei Raumtemperatur beschichtet, gefolgt von einer Über-Nacht Inkubation bei 4°C. Nach Inkubation mit Peptid wurden die Platten gewaschen und für 2 Std. bei 37°C mit 7% BSA (Sigma) in PBS blockiert. Seren wurden 1:50 verdünnt, dann für 2 Std. bei 37°C zugefügt, gefolgt von einer Inkubation mit 100 ml Ziege anti-Maus IgG (Gamma-Kette, Fc spezifisch), konjugiert mit alkalischer Phosphatase (Jackson, Philadelphia, PA), pro Vertiefung für 2 Std. Nach dem Waschen wurden die Platten mit dem Substrat Diethanolamin (Sigma) inkubiert und unter Verwendung eines ELISA-Lesegeräts bei 405 nm ausgelesen.
BEISPIEL 1
Kartieren von hsp60 Epitopen in NOD Mäusen
Die Immogenität der hsp60 Peptide p12, p32, p277(Val⁶–Val¹¹) und p278 in NOD Mäusen wurde durch Immunisieren der Mäuse mit den in CFA emulgierten Peptiden in die hinteren Fußballen und Messen der proliferativen Antworten von ableitenden Lymphknoten-Zellen nach 10 Tagen, wie oben in Abschnitt iii(a) beschrieben, getestet. Wie in 2 gezeigt, waren die Peptide p277(Val⁶–Val¹¹), p12 und p32 stark immunogen, während p278 nicht immunogen war.
BEISPIEL 2
Behandlung von NOD Mäusen mit p277(Val⁶–Val¹¹), p12 oder p32
Um zu testen, ob die Peptide p12 und p32 das Fortschreiten von Diabetes wie p277 (Val⁶–Val¹¹) blockieren können, wurden die p277 (Val⁶–Val¹¹), p12 oder p32 Peptide (100 μg in einer 0,1 cm³ Emulsion von IFA) Gruppen von 10–12 weiblichen, 9 Wochen alten NOD/Lt Mäusen des Jackson Laboratoriums, Bar-Harbor, ME subkutan verabreicht. Diabetes, bestimmt als anhaltender Blutglucose-Spiegel über 11,1 mmol/l, wurde im Alter von 25 Wochen getestet. Kontroll-Mäuse waren unbehandelt oder wurden mit p278 behandelt.
Wie in Tabelle 1 gezeigt, waren p277(Val⁶–Val¹¹), p12 und p32 in der Behandlung von Diabetes wirksam, wobei die Häufigkeit von Diabetes in unbehandelten Mäusen oder in mit p278 behandelten Mäusen 90% betrug, während p277(Val⁶–Val¹¹), p12 und p32-behandelte Mäuse eine Häufigkeit von 10%, 20% beziehungsweise 30% zeigten. Auf der anderen Seite hatte das Kontrollpeptid p278 keine therapeutische Wirkung. Tabelle 3 Therapeutische Wirkung von hsp60 Peptiden
Es ist möglich, dass eine Kombination von zwei oder drei hsp60 Epitoppeptiden wirksamer sein wird, als nur ein Peptid, da mehr T-Zell-Populationen durch die Therapie beeinflusst werden.
BEISPIEL 3
Neu diagnostizierte IDDM Patienten zeigen proliferative T-Zellantworten auf hsp60, p277(Val⁶–Val¹¹), p12 und p32
Um die T-Zellantworten auf die verschiedenen hsp60 Peptide zu bestimmen, wurden Lymphocyten aus dem peripheren Blut von neu diagnostizierten (2 Wochen–4 Monate) IDDM Patienten in einem Proliferationsassay getestet. 10–20 ml Blut wurden in ein steriles Röhrchen, das Heparin als Antigerinnungsmittel enthielt, entnommen und 1:2 in PBS verdünnt. Periphere, mononukleäre Zellen (PBMC) wurden durch Zentrifugieren des Bluts über einer Lymphoprep-Schicht isoliert. Die PBMC wurden in dreifacher Ausfertigung für 6 Tage unter Verwendung des Einbaus von [3H]-Thymidin als ein Maß der Proliferation, in der Gegenwart der verschiedenen Antigene (10 μg/ml) auf Proliferation getestet.
Die getesteten Antigenen waren humanes hsp60 oder die hsp60 Peptide p277(Val⁶–Val¹¹) p12, p32 und Kontroll-Peptid p278. Die proliferative T-Zellantwort wird als Stimulierungsindex (SI) dargestellt: Das Verhältnis zwischen Peptid-stimuliertem Thymidin-Einbau und Hintergrund- (kein Antigen zugefügt) Thymidin-Einbau durch die T-Zellen.
Die Ergebnisse werden unten in Tabelle 4 zusammengefasst. Tabelle 4

N.B.: nicht bestimmt;
p277(V): p277(Val⁶–Val¹¹)

Ein Stimulierungsindex (SI) von mehr als 2,0 wird als eine positive Antwort betrachtet.
Man kann sehen, dass die meisten Patienten (6/8) auf hsp60 reagierten und dass alle der sechs, die auf hsp60 reagierten, auch auf mindestens eines der hsp60 Peptide: p12, p32 oder p277(Val⁶–Val¹¹) reagierten. Daher kann eine Antwort auf die Gruppe der Peptide dazu dienen, die Individuen zu charakterisieren, die auf das gesamte hsp60 Molekül reagieren.
BEISPIEL 4
proliferative T-Zellantworten
Spontane T-Zellantworten in prä-diabetischen NOD Mäusen auf das Maus p277 Peptid (Elias et al., 1991; Birk et al., 1996) und auf größere Fragmente des Maus hsp60 Moleküls, welche die Maus p277 Sequenz enthielten (Birk et al., 1996), wurden nachgewiesen. Um andere T-Zell-Epitope auf dem Maus hsp60 Molekül nachzuweisen, wurden NOD Mäuse mit Kombinationen von Peptiden, mit überlappender hsp60 Sequenz immunisiert und man fand, dass alle Mäuse eine starke Antwort auf sowohl Maus p277 als auch auf Maus p12 (3) produzierten. Andere, für NOD Mäuse immunogene, Peptide sind das MT-p278 Peptid (Reste 458–474 in dem mycobacteriellem hsp60 Molekül), und GAD-p35 (Reste 524–543 im GAD65 Molekül). 3 zeigt, dass MT-p278 ebenso stark immunogen ist, wie Maus p277 und Maus p12; GAD-p35 ist auch immunogen, aber weniger.
Eine Longitudinalstudie von weiblichen NOD Mäusen im Alter von 3–16 Wochen, zeigte keine spontanen Antworten auf Maus p12 in der Milz (nicht gezeigt), obwohl Antworten auf Maus p277 und auf gesamtes Maus hsp60 gesehen wurden. Daher wurden auf vier immunogene Peptide: p12 und p277 vom Maus hsp60 Molekül, GAD-p35 vom Diabetes-assoziiertem GAD65 Molekül und MT-p278, einem fremden Immunogen, spontane Antworten nur auf Maus p277 und auf MT-p278 nachgewiesen.
Peptidbehandlung
Unter Befolgung eines Protokolls, von dem gezeigt wurde, dass es mit Maus p277 wirksam ist (Elias et al., 1991; Elias und Cohen, 1994; Elias und Cohen, 1995), wurden Gruppen von 10 Wochen alten, weiblichen NOD Mäusen mit einer einzelnen, subkutanen Injektion von jedem Peptid (100 mg), emulgiert in IFA, behandelt. Die Mäuse wurden auf die Entwicklung von Diabetes bis zum Alter von 8 Monaten hindurch beobachtet. 4 zeigt, dass Maus p277 und Maus p12 Peptide beide bei der Hemmung der Entwicklung von Diabetes wirksam waren (P < 0,05).
Im Gegensatz dazu, war eine Behandlung mit MT-p278 oder GAD-p35 Peptiden nicht anders als eine Behandlung mit IFA allein. Insgesamt 3 Experimente zeigten im Wesentlichen die gleichen Ergebnisse.
Antikörper
Erfolgreiche Behandlung von STZ-induziertem Diabetes mit Maus Peptid p277 war mit dem Erscheinen von anti-Peptid Antikörpern, vorwiegend vom IgG1 und IgG2b Isotyp (Elias und Cohen, 1996) verbunden. Die Peptid-behandelten NOD Mäuse wurden deshalb auf ihre Serumantikörper untersucht.
5 zeigt, dass die zwei Peptide, Maus p12 und Maus p277, die Diabetes zum Stillstand bringen auch wirksam beim Auslösen von hohen Antikörpertitern des IgG1 und IgG2b Isotyps (P < 0,001) waren. Die IgG1 und IgG2b Antikörpertiter waren auch signifikant höher als die IgG2a Antikörpertiter in diesen Gruppen (p < 0,001). Die mit MT-p278 oder GAD-p35 Peptiden behandelten Mäuse reagierten nicht so stark; keine, der mit GAD-p35 behandelten Mäuse, bildeten spezifische IgG1 Antikörper und nur zwei der zehn mit MT-p278-behandelten Mäuse bildeten Antikörper vom IgG1 Isotyp.
Die mit MT-p278 oder GAD-p35 behandelten Mäuse machten signifikant niedrigere Titer von IgG2b Antikörpern (P < 0,001). Daher war die Wirksamkeit bei der Hemmung von Diabetes mit dem Auslösen einer Antikörperantwort, haupt sächlich vom IgG1 und IgG2b Isotyp, verbunden.
Das Verhältnis zwischen einer wirksamen, therapeutischen Antwort und dem Titer des Antikörpers wurde durch einen Vergleich der Konzentration der Blutglucose mit der Konzentration von Antikörpern in individuellen Mäusen im Alter von 7 Monaten bestätigt. 6 zeigt, dass die Mäuse mit höheren Titern von anti-Maus p12 Antikörpern dazu neigten, niedrigere Blutglucosekonzentrationen zu haben; umgekehrt tendierten mit Maus p12 behandelte Mäuse, die wenig Antikörper gegen Maus p12 bildeten, dazu eine hohe Blutglucose zu haben (P < 0,002).
DISKUSSION
Die in diesem Beispiel dargestellten Ergebnisse zeigen, dass das Peptid p12 des Maus hsp60 Moleküls, wie Peptid p277, wirksam bei einer Behandlung von Mäusen sein kann, die nahe am Ausbruch von offenkundiger Hyperglykämie sind. Im Gegensatz zu p277, wurden spontane, proliferative T-Zellantworten auf p12 in der Milz von prä-diabetischen NOD Mäusen nicht beobachtet. Daher ist eine spontane, proliferative anti-Peptid-Antwort in der Peripherie keine Voraussetzung dafür, dass ein Peptid wirksam bei der Blockierung des diabetischen Autoimmunvorgangs ist.
Das Ergebnis, dass Peptid p277 nicht das einzige hsp60 Peptid ist, das NOD Diabetes modulieren kann, ist von Bedeutung. Es war vorstellbar, dass die Beteiligung von hsp60 in NOD Diabetes durch Mimikrie zwischen dem p277 Peptid von hsp60 und einem unbekannten Molekül, das spezifischer für β-Zellen ist, (Cohen, 1991) entstanden ist. Es ist jedoch sehr unwahrscheinlich, dass zwei unterschiedliche Segmente von hsp60, p277 und p12, beide Segmenten des unbekannten, aber vorgeschlagenen β-Zellmolküls ähneln. Die Wirksamkeit von p12 in einer Peptidbehandlung unterstützt die Folgerung, dass das hsp60-ähnliche Molekül, das in Diabetes funktionstüchtig ist, hsp60 selbst ist (Birk et al., 1996).
Das Versagen von Peptid MT-p278 und GAD-p35 die Entwicklung von Diabetes zum Stillstand zu bringen, weist darauf hin, dass nicht irgendein Selbstantigen oder irgendein spontan proliferierendes T-Zellantigen zum Abbrechen des Autoimmunvorgangs verwendet werden kann. Es ist interessant, dass MT-p278 keine hohen Antikörpertiter induzieren oder schützen konnte, trotz der Tatsache, dass ihr Peptid stark immunogen für T-Zellen ist (nicht veröffentlichte Beobachtung). Die Induktion von Antikörpern einer beliebigen Spezifität beeinflusst NOD Diabetes nicht notwendigerweise; eine Behandlung von NOD Mäusen mit BSA, das sowohl hohe Antikörpertiter als auch starke T-Zellantworten auslöst (nicht gezeigt), beeinflusst die Entwicklung von Diabetes nicht (Elias und Cohen, 1994). Obwohl von uns herausgefunden wurde, dass GAD-p35 nicht so stark immunogen für T-Zellen ist, wie andere Peptide (3), wurde von NOD Mäusen berichtet, dass sie spontane T-Zellantworten auf ihr Peptid manifestieren (Kaufman et al., 1989).
Schließlich legt die Assoziation einer wirksamen Behandlung mit einem Auslösen von Antikörpern, die spezifisch für das Peptid sind, nahe, dass die therapeutischen Wirkungen von p12 und p277 mit der Aktivierung von T-Zellen vom Th2-Typ verbunden sind. Diese Th2-Zellen sind dafür verantwortlich, dass beim Auslösen von spezifischen IgG1 Antikörpern zu helfen. Diese IgG1 Antikörper werden durch die Produktion von IL-4 (Mossman und Coffman, 1993) reguliert. Solche T-Zellen könnten die Th1 T-Zellen unterdrücken, von denen angenommen wird, dass sie für die Schädigung der β-Zellen verantwortlich sind (Katz et al., 1995; Liblau et al., 1995). Tatsächlich wurde herausgefunden, dass eine p277 Peptidtherapie von NOD Diabetes mit einem plötzlichen Erscheinen von IL-4 und IL-10 produzierenden T-Zellen in der Milz und einem Abfall in den INF-γ produzierenden T- Zellen, in sowohl der Milz auch in den Inseln, verbunden ist (nicht veröffentlichte Beobachtung). Das Erscheinen von Peptid-spezifischen Antikörpern, die Th2 Isotypen tragen, als Antwort auf Peptidtherapie scheint ein Anzeichen für eine heilsame Antwort zu sein.
BEISPIEL 5 – Zusätzliche Peptide, auf die IDDM Patienten T-Zellantworten manifestieren können
Sechsundzwanzig neu diagnostizierte (1 bis 16 Wochen nach IDDM Diagnose) IDDM Patienten wurden aufgenommen. Das Alter der Patienten reichte von 5 bis 60 Jahren alt. Die Patienten wurden auf ihre proliferativen T-Zellantworten auf humanes hsp60 und auf humane, synthetische hsp60 Peptide, gezeigt in Tabellen 1 und 5, die Anteile der humanen hsp60 Proteinsequenz sind, im peripheren Blut durchgemustert.
Die T-Zellen der Patienten wurden auch auf ihre proliferativen Antworten auf Standard-Recall-Antigene, wie Tetanustoxoid, Candida albecans und Influenza analysiert, und Antworten wurden als positiv gewertet, wenn der Stimulierungsindex (S.I.) 2 oder höher war (siehe unten).
Die Proliferation wurde unter Verwendung des folgenden Protokolls gemessen:
Zellpräparations- und Zellproliferations-Protokoll
Fünfzig ml peripheres Blut, ergänzt mit 10 IU/ml Heparin, wurden IDDM Patienten oder gesunden Kontrollen abgenommen. Zwei Volumen PBS (Calcium- und Magnesium-frei) wurden hinzugefügt. Die Blut-PBS-Präparation wurde unter Verwendung einer 10 ml Pipette gemischt. Ein Volumen 10 ml Ficoll wurde unter die Blutmischung geschichtet, gefolgt von Zentrifugation bei 2 000 UpM. für 30 Minuten bei Raumtemperatur (R.T.), 20–24°C, (Bremse ausgestellt). Die T-Zellen aus peripherem Blut in der Leukozyten- und Thrombozyten schicht wurden unter Verwendung einer 10 ml Pipette geerntet und in ein neues 50 ml Teströhrchen überführt. Ein Volumen von 30 bis 40 ml PBS (Calcium- und Magnesium-frei) wurde zu den geernteten T-Zellen hinzugefügt. Dies wurde dann gemischt und bei 1 000 UpM. für 20 Minuten bei R.T. zentrifugiert (Bremse angestellt).
Der Überstand wurde abgesaugt und das Zellpellet wurde in AIM-V Serum-freien Kulturmedium (GIBCO, USA) resuspendiert. Das Kulturmedium enthält AIM-V ergänzt mit 1% Natriumpyruvat, 1% L-Glutamin (jeweils 200 mM), 1% Penicillin/Streptomycin (10 000 U/ml/10 000 mg/ml und 2% Hepes (1 M, pH 7,3). Als Alternative wurde RPMI, ergänzt mit 10% AB Serum aus der Blutbank, verwendet. Die Zellmischung wurde dann bei 2 000 UpM. für 10 Minuten bei R.T. zentrifugiert (Bremse angestellt). Der Überstand wurde erneut abgesogen und das Zellpellet in einem kleineren Volumen frischen AIM-V's (10–20 ml) resuspendiert. Die Zellen wurden resuspendiert und gezählt. Zellzahl- und Lebensfähigkeits-Assays wurden unter Verwendung von Trypanblau durchgeführt. Für diesen Schritt wurden ein Hämocytometer und ein Lichtmikroskop verwendet.

Die Zellkonzentration wurde dann auf 2 × 10⁶ Zellen/ml in AIM-V Medium eingestellt. Ein Volumen von 100 μl der Zellen pro Vertiefung wurde in jede Vertiefung einer Mikrotiter-Platte mit 96 Vertiefungen überführt. Dann wurden 100 μl Medium, welches das Zweifache der empfohlenen Antigenkonzentration (siehe eine Liste von Antigenen und Konzentrationen, unten) enthielt, hinzugefügt. Der Assay wurde in vierfacher Ausfertigung durchgeführt. Vier Vertiefungen wurden mit Zellen und Medien ohne Antigen als Kontrolle gemessen. Die Platten wurden bei 37°C in einem 5% CO₂ angefeuchteten Inkubator für 7 Tage inkubiert. Am Tag 6 des Kultivierungszeitraums wurde 1 μCi/Vertiefung 3H-Thymidin hinzugefügt. Die Kulturen wurden für 18 Stunden fortgeführt und dann geerntet. Die Zellproliferation wurde durch 3H- Thymidineinbau in die DNA, unter Verwendung von Szintillationsflüssigkeit und eines Beta-Zähler-Lesegeräts, bestimmt.

getestete Antigene	Konzentration
Tetanustoxoid (Connaught Lab. Inc. Pen. USA)	5 g/ml
Candida albicans (Miles, WA. USA)	20 μg/ml
Rekombinantes, humanes hsp60 (StressGen, Canada)	2–5 μg/ml
Synthetische, humane hsp60 Peptide	20 μg/ml

Proliferative Antworten wurden gemäß des durch T-Zellen in die DNA eingebauten Thymidin- 3H (Elias et al., 1991) gemessen. Radioaktive Zählimpulse pro Minute (CPM) wurden zwischen Zellen, die mit den getesteten Antigenen oder ohne Antigen (nur Medium) als Kontrolle kultiviert wurden, verglichen. Die Proliferationswerte wurden als ein Stimulierungsindexwert (S.I.) dargestellt: Mittelwert der CPM mit dem Antigen dividiert durch den Mittelwert der CPM ohne das Antigen. S.I. Werte größer als oder gleich 2 wurden als positiv betrachtet.
Die Ergebnisse zeigten, dass die Häufigkeit von Individuen, die auf humanes hsp60 oder hsp60-Peptid reagieren, unter IDDM Patienten häufiger war (84%) als unter gesunden Individuen (30%). Der P-Wert beträgt 0,0044 des Unterschieds nach dem exakten Test nach Fisher, was hoch signifikant ist.
Proliferative Antworten von zwei repräsentativen IDDM Patienten und von einem gesunden Individuum auf humanes hsp60 Protein, auf synthetische hsp60 Peptide und auf verschiedene Recall-Antigene werden in 7, 8, und 9 gezeigt. Tabelle 5 zeigt zwei individuelle Beispiele für synthetische hsp60 Peptide (p19, p21), auf die keine IDDM Patienten reagierten (siehe auch 10A und 10B).
Man kann sehen, dass jeder der Patienten auf Recall-Anti gene (Candida, Tetanus oder Influenza) und auf humanes hsp60 Protein und auf verschiedene, humane hsp60 Peptide reagierte. Die Kontrollperson reagierte nur auf Kontroll-Recall-Antigene.
Die Sequenzen der synthetischen hsp60 Peptide, auf die mindestens einer der IDDM Patienten reagierte, werden in Tabelle 1 gezeigt. Jedes dieser Peptide hat therapeutisches Potenzial zur Behandlung von IDDM. Tabelle 5 Synthetische hsp60 Peptide, auf die IDDM Patienten nicht reagierten, und deren Sequenz
Die voran stehende Beschreibung der einzelnen Ausführungsformen wird die allgemeine Natur der Erfindung so vollständig offenbaren, dass andere durch Anwenden von Wissen innerhalb des Stands der Technik (einschließlich des Inhalts, der hierin zitierten Literaturangaben), solche einzelnen Ausführungsformen einfach an verschiedene Anwendungen, ohne unzumutbares Experimentieren, modifizieren und/oder anpassen können, ohne vom allgemeinen Konzept der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Daher sollen solche Anpassungen und Modifikationen im Sinne und im Bereich von Äquivalenten der offenbarten Ausführungsformen sein, basierend auf der Lehre und Anleitung, die hierin dargestellt wird. Es gilt als vereinbart, dass Ausdrucksweise oder Terminologie hierin, zum Zwecke der Beschreibung und nicht der Einschränkung ist, so dass die Terminologie oder Ausdrucksweise der vorliegenden Patentschrift durch den versierten Fachmann im Lichte der hierin dargestellten Lehren und Anleitung interpretiert werden muss, zusammen mit dem Wissen eines Durchschnittsfachmanns.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Peptid, verwendbar als ein Immunogen oder Antigen in einer Zusammensetzung zum Diagnostizieren und Behandeln von IDDM, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid Reste 466–485 des Peptids p32 von SEQ ID NR: 1 und Salze und funktionstüchtige Derivate davon ist.
Verfahren zum Diagnostizieren des Vorhandenseins oder Anfangsstadiums von Insulin-abhängigem Diabetes Mellitus (IDDM) bei einem Patienten, das ein in vitro Testen des Bluts oder Urins des Patienten auf das Vorhandensein von Antikörpern oder T-Zellen, die immunologisch mit humanem hsp60 reaktionsfähig sind, mit einem Peptid gemäß Anspruch 1 als ein Antigen, umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 2, das ein Testen des Bluts oder Urins des Patienten auf das Vorhandensein von anti-hsp60 Antikörpern oder von einer T-Zelle, die mit hsp60 immunreagiert, umfasst, wobei ein Ergebnis, welches auf das positive Vorhandensein von anti-hsp60 Antikörpern oder von einer T-Zelle, die mit hsp60 immunreagiert, hinweist, auf eine hohe Wahrscheinlichkeit für das Vorhandensein oder Anfangsstadium von IDDM hinweist.
Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, wobei das Blut oder der Urin des Patienten zum Beispiel durch einen Radioimmunoassay oder einen ELISA-Test auf das Vorhandensein von anti-hsp60 Antikörpern getestet wird.
Kit zum Diagnostizieren des Vorhandenseins von IDDM durch Testen auf das Vorhandensein von anti-hsp60 Antikörpern, gemäß des Verfahrens nach einem der Ansprüche 2 bis 4, umfassend: (i) ein Antigen, das ein Peptid gemäß Anspruch 1 ist, und (ii) einen markierten Antikörper, der in der Lage ist, die nicht-variablen Region der nachzuweisenden anti-hsp60 Antikörper zu erkennen.
Kit gemäß Anspruch 5, wobei das Antigen ein Peptid gemäß Anspruch 1 ist.
Kit gemäß Anspruch 5 oder 6, wobei das Antigen an einer festen Phase immobilisiert ist, der Kit weiterhin Gebrauchsanweisungen für den Kit zur Diagnose von IDDM enthält und die Markierung ausgewählt ist, aus der Gruppe bestehend aus Radiosiotopen, Enzymen, Chromophoren und Fluorophoren.
Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, wobei das Blut des Patienten auf das Vorhandensein einer T-Zelle, die mit hsp60 immunreagiert, mit einem Testverfahren getestet wird, das einen T-Zell-Proliferationstest umfasst, welcher die folgenden Schritte umfasst: (i) Herstellen einer Fraktion von mononukleären Zellen, welche T-Zellen enthält, aus einer von dem Patienten erlangten Blutprobe; (ii) Zufügen eines Antigens, ausgewählt aus einem Peptid gemäß Anspruch 1, zu der Fraktion von mononukleären Zellen; (iii) Inkubieren der Zellfraktion in der Gegenwart des Antigens für einen geeigneten Zeitraum und unter geeigneten Kulturbedingungen; (iv) Zufügen eines markierten Nukleotids zu der inkubierten Zellkultur von (iii) zu einem geeigneten Zeitpunkt vor dem Ende des Inkubationszeitraums, um für einen Einbau des markierten Nukleotids in die DNA der proliferierenden T-Zellen zu sorgen; und (v) Bestimmung der Menge an proliferierenden T-Zellen durch Analyse der Menge des in die T-Zellen eingebauten, markierten Nukleotids.
Kit zum Diagnostizieren des Vorhandenseins von IDDM durch Testen auf das Vorhandensein einer T-Zelle, welche mit hsp60 immunreagiert, gemäß des Verfahrens nach einem der Ansprüche 2, 3 und 8, umfassend: (i) ein Antigen, ausgewählt aus einem Peptid gemäß Anspruch 1; (ii) ein markiertes Nukleotid; und (iii) ein geeignetes Medium zur Kultur von Lymphocyten.
Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, wobei das Blut des Patienten auf das Vorhandensein einer T-Zelle, welche mit hsp60 immunreagiert, mit einem Testverfahren getestet wird, welches einen T-Zell-Cytokinantwort-Test umfasst, der die folgenden Schritte umfasst: (i) Herstellen einer Fraktion von mononukleären Zellen, welche T-Zellen enthält, aus einer von dem Patienten erlangten Blutprobe; (ii) Zufügen eines Antigens, ausgewählt aus einem Peptid gemäß Anspruch 1, zu der Fraktion von mononukleären Zellen; (iii) Inkubieren der Zellfraktion in der Gegenwart des Antigens für einen geeigneten Zeitraum und unter geeigneten Kulturbedingungen; und (iv) Messen des Vorhandenseins eines Cytokins, das von den reagierenden Lymphocyten in das Medium sezerniert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei das Cytokin IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, TNFα oder TGFβ ist.
Kit zum Diagnostizieren des Vorhandenseins von IDDM durch Testen auf das Vorhandensein einer T-Zelle, welche mit hsp60 immunreagiert, gemäß des Verfahrens nach Anspruch 10 oder 11, umfassend: (i) ein Antigen, ausgewählt aus einem Peptid gemäß Anspruch 1; (ii) ein geeignetes Medium für die Kultur von Lymphocyten; und (iii) einen Assaykit zum Messen des Vorhandenseins des Cytokins, das von den reagierenden Lymphocyten in das Medium sezerniert wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Peptid gemäß Anspruch 1 und einen pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff.
Verwendung eines Peptids gemäß Anspruch 1 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von IDDM.
Zusammensetzung, umfassend ein Peptid in Übereinstimmung mit Anspruch 1, zusammen mit einem Peptid, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus p277-Resten 437–460 aus SEQ ID NR: 1; Resten 437–460 aus SEQ ID NR: 1, wobei das Cys an Position 442 durch Val ersetzt ist; Resten 437–460 von SEQ ID NR: 1, wobei das Cys an Position 447 durch Val ersetzt ist; und einem SEQ ID NR: 2 Peptid.