DE69233507T2

DE69233507T2 - Hbgad und higad polypeptide und nukleinsäuren und deren verwendung zur diagnose und behandlung von gad autoantigen assoziierten krankheiten

Info

Publication number: DE69233507T2
Application number: DE69233507T
Authority: DE
Inventors: Leonard Harrison; Margo Honeyman; David Cram; Henry De Aizpurua
Original assignee: Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research
Current assignee: Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research
Priority date: 1991-02-22
Filing date: 1992-02-21
Publication date: 2009-09-10
Anticipated expiration: 2012-02-22
Also published as: JPH06505385A; EP0572478A4; ATE304050T1; CA2104225C; EP0572478B1; AU659133B2; AU1274892A; CA2104225A1; WO1992014485A1; EP0572478A1; DE69233507D1; US5837812A; DK0572478T3; JP3027190B2; US6211352B1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf das Identifizieren, Klonen und Sequenzieren von Nukleinsäuremolekülen, die eine Isoform des Enzyms Glutaminsäure-Decarboxylase kodieren, und bezieht sich ferner auf die Verwendung dieser Moleküle und/oder Peptide und Polypeptide, die dadurch kodiert sind, bei diagnostischen Tests auf insulinabhängigen Diabetes Mellitus oder andere Krankheiten, bei denen Glutaminsäure-Decarboxylase ein Autoantigen ist, und bei der Behandlung von Patienten, die an diesen Krankheiten leiden.
Das Enzym Glutaminsäure-Decarboxylase (nachfolgend mit ”GAD” bezeichnet) katalysiert die Umwandlung von L-Glutaminsäure in die Hemmungs-Neurotransmitter-γ-Amino-Buttersäure (nachfolgend mit ”GABA” bezeichnet). GAD wird ausgedrückt sowohl in den GABA sekretorischen Neuronen des Zentralnervensystems (1–3), in den β-Zellen des Pankreas (4, 5), als auch in Spermatozoen (6). Eine Analyse von immunoaffinitätsgereinigtem, enzymatisch aktivem Gehirn-GAD hat verschiedene Formen von GAD mit M_r 54–67,000 identifiziert (7, 8). Unter Verwendung von Antiseren, die zu gereinigtem Gehirn-GAD gezüchtet wurden, um Gehirn-cDNA Ausdrucksreihen abzuschirmen, wurden cDNAs, die Vollängen-Ratten-(9)- und -Katzen-(10)-GAD-Sequenzen kodieren, isoliert und sequenziert bzw. aufgereiht. Vergleiche der abgeleiteten Aminosäure-Sequenzen von Ratten- und Katzen-GAD zeigen, daß beide Proteine zu 95% identisch und daher während der Evolution in hohem Grade erhalten sind.
Mit GAD in GABA-ergischen Neutronen reaktive Autoantikörper sind in der Mehrzahl der Seren von Patienten mit der seltenen neurologischen Krankheit ”Stiff Man Syndrom” (nachfolgend mit ”SMS” bezeichnet; 11, 12) vorhanden. Für GAD-Autoantikörpeer positive Patienten haben eine erhöhte Häufigkeit von Polyendocrin-Autoimmunität, insbesondere insulinabhängiger Diabetes Mellitus (nachfolgend mit ”IDDM” bezeichnet). Während der vorklinischen Phase von IDDM und bei Patienten mit vor kurzem auftretendem klinischen IDDN werden Autoantikörper häufig gegen ein Inselzellen-M_r 64.000-Protein, genannt ”64K” (13), entdeckt. In einem neuerlichen Bericht wurde das 64K-Autoantigen mutmaßlich als GAD identifiziert (14). Genovese (15) jedoch hat darauf hingewiesen, daß GAD mit einem separaten 64K-Protein kopräzipitiert wird, letzteres ausgezeichnet durch tryptische Produkte von M_r 37.000/40.000, die verschiedenen sind von einem M_y 50.000-Produkt von GAD. GAD umfaßt mindestens zwei Isoformen, die durch separate Gene kodiert werden (16, 17, 18). Die vorhergesagten Molekulargewichte der bekannten Isoformen sind annähernd 67.000 und 65.000 (jeweils als die ”67K”-. bzw. ”65K”-Isoformen bezeichnet). Die Verteilung von GAD-Isoformen in verschiedenen Geweben ist noch nicht gut definiert, aber es ist wahrscheinlich, daß die 65K-Isoform die GAD-Komponente des 64K-Autoantigens erklärt.
Bei der zur vorliegenden Erfindung führenden Arbeit suchten die Erfinder die 67K-Isoform von GAD aus menschlichen und anderen Spezies für diagnostische und/oder therapeutischen Verwendung zu klonen. Menschengehirn (HB), menschliche Pankreasinselchen (HI) und Mausgehirn (MB) GAD (nachfolgend jeweils mit ”HBGAD”, ”HIGAD” und ”MBGAD” bezeichnet) wurden geklont und sequenziert. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf HBGAD und HIGAD. In weiterer Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurden rekombinante GAD-Proteine entsprechend der 67K-Isoform und deren Fragmente und Derivate als ein Antigen verwendet, um Antikörper und T-Zellen zu entdecken, die mit GAD reaktiv sind, wobei dadurch eine Basis für einen neuen Bereich von Diagnostiken und Therapeutiken gebildet wird für Krankheiten des Typs, der vorklinischen und klinischen IDDM und SMS und andere Krankheiten einschließt, bei denen GAD ein Autoantigen ist.
Mit der ”67K-Isoform” ist die Form von GAD gemeint, die annähernd M_r 67.000 und/oder jede Bruchteile, Derivate, Homologe und/oder immunologische Verwandte davon aufweist und die von der M_r 65.000-Form von GAD unterscheidbar und/oder anderweitig verschieden sind und die vorwiegend auf T-Zellen und/oder Autoantikörper von Individuen mit klinischem oder vorklinischem IDDM, SMS und/oder anderen ähnlichen Krankheiten reagieren.
Demgemäß sieht ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung Nukleinsäurenmoleküle vor, die innerhalb ihrer Sequenzen eine Nukleotidsequenz nach 1 oder eine Nukleotidsequenz aufweist, die das Komplement einer Nukleotidsequenz nach 1 ist.
Die vorliegende Erfindung sieht außerdem ein rekombinantes Nukleinsäure-(z. B. DNA)-Molekül vor, das eine Nukleotidsequenz, wie oben beschrieben, aufweist, die betriebsmäßig mit einer Ausdrucks-Kontrollsequenz verbunden ist. Ein solches rekombinantes Molekül kann beispielsweise einen Ausdrucksvektor umfassen. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich ferner auf eine Wirtszelle wie ein Bakterium, Hefe, Säugetier- oder Insektenzelle, transformiert mit einem solchen rekombinanten Molekül. Eine bevorzugte Säugetier-Zellenlinie ist die ”Chinese-Hamster-Ovary-(CHO)-Zellenlinie.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung richtet sich auf ein Polypeptid, das die Aminosäure-Sequenz nach 2 umfaßt, wobei dieses Polypeptid die Antigenität der ganzen oder eines Teils einer Isoform von GAD wiedergibt, der mit Autoantikörpern und/oder T-Zellen reaktiv ist.
Ein solches Polypeptid kann beispielsweise durch rekombinante Mittel präsentiert werden, wie z. B. durch den Ausdruck einer Wirtszelle, die mit den oben beschriebenen rekombinanten Molekülen transformiert ist. Das Polypeptid kann mit einem weiteren Peptid oder Polypeptid verschmolzen sein. Alternativ kann es durch chemische Synthese zubereitet werden, z. B. durch das bekannte Merrifield-Festphase-Synthese-Verfahren. Das synthetische (z. B. rekombinante) Polypeptid kann eine GAD-enzymatische Aktivität behalten oder auch nicht. Obwohl synthetisches GAD ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel darstellt, erstreckt sich die Erfindung außerdem auf biologisch reine Zubereitungen des natürlich vorkommenden Enzyms oder dessen Fragmente. Mit ”biologisch rein” ist eine Zubereitung von mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 70%, besser noch mindestens 80% und noch bevorzugter mindestens 90% nach Gewicht Enzym gemeint.
Mit der vorliegenden Erfindung wird auch in Betracht gezogen ein Verfahren zum Nachweis von Autoantikörpern, die IDDM zugeordnet sind, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen eines Polypeptids nach der Erfindung mit einer biologischen Probe von einem Patienten, der getestet werden soll, für eine Zeitdauer und unter Bedingungen, die ausreichen, damit sich ein Komplex zwischen dem Peptid oder Polypeptid und einem Antikörper bildet, der für GAD empfänglich ist, und dann die Ermittlung des Komplexes umfaßt. Vorzugsweise ist die biologische Probe Serum. Noch bevorzugter wird das Peptid oder Polypeptid auf einem festen Körper vor, während oder nach dem Kontakt mit dem Serum unbeweglich gemacht. Nachweisverfahren sind allgemein bekannt und umfassen kalorimetrische, fluorometrische und radioaktive Verfahren. Andere Nachweisverfahren können ebenfalls verwendet werden, die beispielsweise das Verkleben einschließen. Diese Prüfung oder Erprobung kann auf vielfältige Weise verändert werden, ohne vom Schutzbereich der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auch auf die Verwendung eines Polypeptids, das ein Polypeptid nach der Erfindung ist, als ein Antigen bei einem Diagnosetest auf Krankheiten des Typs, der IDDM und SMS einschließt, oder zur Abschirmung asymptomatischer Personen durch Nachweis oder Bestimmung des Titer von Antikörpern in einem Patientenserum, z. B. unter Anwendung der ELISA- oder RIA-Technologie oder einer Verklebungsprobe unter Verwendung antigenbeschichteter Kügelchen oder dergleichen.
Dieser Aspekt der vorliegenden Erfindung kann zweckmäßig ausgeführt werden durch die Ermittlung und/oder Bestimmung des Titer von Autoantikörpern in einer biologischen Probe (z. B. Serum) aus einem menschlichen Körper, wobei dieses Verfahren das Inkontaktbringen der genannten Probe mit dem Polypeptid für eine Zeitdauer und unter Bedingungen, die genügen, damit sich ein Komplex zwischen dem Polypeptid und einem für GAD empfänglichen Antikörper bildet, und dann das Ermitteln des Komplexes und/oder der Menge von Polypeptid, welches in dem Komplex gebunden worden ist, umfaßt. Vorzugsweise wird das Polypeptid auf einem festen Träger vor, während oder nach dem Kontakt mit der Probe und dem Polypeptid unbeweglich gemacht.
Alternativ können solche Krankheiten festgestellt oder zumindest ein negatives Ergebnis erneut bestätigt werden oder sonstwie durch Abschirmung gegen GAD zugeordnete Immunkomplexe.
Es ist z. B. möglich, daß ein negatives Autoantikörperergebnis verursacht werden könnte durch Autoantikörper, die Komplexe mit GAD bilden, wobei sie dadurch nicht für eine Bindung in der vorerwähnten Probe verfügbar sind. Um auf herkömmliche Weise GAD-Immunkomplexe zu ermitteln, wird Serum oder ein anderes biologisches Medium mit einem Anti-GAD-Antikörper (z. B. einem monoklonalen Antikörper) in Kontakt gebracht für eine Zeitdauer und unter Bedingungen, die ausreichen, damit sich ein GAD-Autoantikörper-Immunkomplex bindet. Vorzugsweise wird der Anti-GAD-Antikörper zunächst auf einem festen Träger unbeweglich gemacht. Ein Anti-Immonoglobulin-Antikörper, allgemein mit einem angebrachten Etikett oder anderen Reportermolekül, wird dann verendet, um die Antikörperkomponente des GAD-Komplexes abzuschirmen.
Ein Fachmann auf diesem Gebiet wird sofort erkennen, daß die hier in Betracht gezogenen Proben bzw. Analysen ohne Abweichung vom Schutzbereich der vorliegenden Erfindung modifiziert werden können. All solche Modifikationen und Variationen dieser Proben, Prüfungen bzw. Analysen werden durch die vorliegende Erfindung erfaßt.
Die Erfindung erstreckt sich auch auf die Verwendung eines Polypeptids, bestehend aus einem Polypeptid nach der Erfindung, bei der Behandlung von Patienten. In diesem letzten Aspekt umfassen solche Behandlungsmethoden deren Verwendung als ein Adsorbens, um Autoantikörper oder autoreaktive Zellen aus einem Patienten zu entfernen, deren Verwendung in direkter Administration für einen Patienten als ein Mittel zur Desensibilisierung oder Einführung von Toleranzen, um die Reaktivität von autoreaktiven T-Zellen oder Autoantikörpern auf das IDDM-Autoantigen zu beseitigen oder abzuschwächen oder T- Zellen-Linien oder Klone zu erzeugen, die für oder als therapeutische Mittel verwendet werden sollen.
Wie beabsichtigt, umfaßt das Behandlungsverfahren die folgenden Behandlungsbeispiele, ist aber nicht auf diese beschränkt. Ein erstes Behandlungsbeispiel ist die Desensibilisierung oder Toleranzeinführung unter Verwendung einer effektiven Menge eines GAD-Polypeptids, wie vorher erklärt, um T-Zellen-Erkennung von GAD zu ändern und T-Zellen-Unterdrückung einzuführen. Dies kann erreicht werden durch Verwendung des bekannten Effektes von bestimmten Ultraviolett-Wellenlängen, insbesondere UV-B, um die Antigen-Präsentation durch die Haut hindurch zu modifizieren (siehe 19). Effektive Mengen an GAD-Polypeptid, wie hier definiert, würden epikutan auf der Haut von Versuchspersonen zur Anwendung gebracht, die periphere Blut-T-Zellen-Reaktivität auf GAD zeugen, und zwar nachdem die Haut der UV-B-Strahlung ausgesetzt wurde. Die Behandlung würde wiederholt bis zu einem Zeitpunkt, daß die T-Zellen-Reaktivität auf GAD unterdrückt wurde. Eine zweite Behandlung umfaßt die Applikation eines GAD-Polypeptids, wie hierin definiert, auf der Haut, zusammen mit einem oder mehreren Zytokinen, aber nicht beschränkt auf TNF-α oder -β. Eine dritte Behandlung umfaßt T-Zellen-Immunisierung, wodurch T-Zellen-Linien erzeugt werden, um ein GAD-Polypeptid, wie hier definiert, durch Standardverfahren auszudrücken, Zellen werden geschwächt durch Fixierung mit Agenzien, wie Glutaraldehyd oder Paraformaldehyd, gewaschen unter sterilen Bedingungen und dem Patienten erneut injiziert für eine Zeit und unter Bedingungen, die eine Unterdrückung des endogenen T-Zellen-Ansprechens auf GAD verursachen. Diese Betrachtungsweisen der Behandlung sind anwendbar zur Prävention von klinischem IDDM wie auch bei dem erneuten Auftreten von IDDM bei Patienten, die Pankreas-, Inselzellen- oder Transplantate von Insulin produzierenden Zellen erhalten haben. Diese Betrachtungsweisen sind ebenfalls anwendbar auf SMS und andere Krankheiten, wo GAD ein Autoantigen ist. In Übereinstimmung mit der Erfindung beträgt die effektive Menge eines GAD-Polypeptids 0,1 μg bis 10 mg pro Dosis und vorzugsweise 1,0 μg bis 1 mg pro Dosis. Eine Dosis kann eine einzige Verabreichung oder ein Verabreichungsprotokoll umfassen. Die Verabreichung kann durch jede herkömmliche Mittel erfolgen, wie, aber nicht ausschließlich, intravenös, subkutan, epikutan, durch Infusion, oral, lokal, intranasal, supositorische oder intraperitoneale Verabreichung. Das GAD-Polypeptid kann alleine oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen aktiven Molekülen, Molekülen, die die GAD-Polypeptid-Aktivität erleichtern, wie Zytokine und insbesondere TNF-α und/oder TNF-β.
Die Erfindung bezieht sich ferner auf die Verwendung eines GAD-Polypeptids, wie hierin definiert, bei der Bereitung von Zusammensetzungen und Produkten für die Verwendung bei den hierin definierten Behandlungen.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist mit der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines Polypeptids nach der Erfindung beabsichtigt, um die Reaktivität von Zellen eines Patienten auf das IDDM-Autoantigen zu messen. Das Polypeptid kann zugefügt werden in Lösung oder gebunden an einen festen Träger, zusammen mit Zellen von einem Patienten, die aus peripherem Blut oder aus Gewebebiopsien herrühren, und zwar unfraktioniert, fraktioniert oder als eine kontinuierliche Zellenlinie abgeleitet. Die Reaktivität auf das Autoantigen kann dann durch die Standard-Prolifikationsversuche gemessen werden, wie Einverleibung von tritiummarkiertem Thymidin, zytotoxische Standardversuche, wie Freilassung von Markierer-Radioaktivität aus Zielzellen, Messungen von ausgedrückten oder sekretierten Molekülen, wie Zytokine oder andere Standardversuche von Zell-Reaktivität, die in der einschlägigen Technik allgemein bekannt sind.
Eine diagnostische Ausrüstung kann zur Überprüfung von Patienten-T-Zellen verwendet werden. Schachtplatten (well plates) nach Standard 96, wie sie bei ELISA-Versuchen verwendet werden, werden vorbeschichtet mit einem monoklonalen Antikörper (Mab) zu einem T-Zellen-Zytokin, wie (γ-IFN) mit oder ohne Antigen. Alternativ wird Antigen in löslicher Form zusammen mit Teilmengen von peripherem Blut, mononuklearen Zellen oder T-Zellen zugefügt. Eine Inkubation wird für zwei oder mehr Tage zugelassen, die Zellen werden abgewaschen, die ”wells” wieder gewaschen und Platten entwickelt mit einem bezeichneten zweiten Mab zu dem Zytokin, wie Anti-γ-IFN, konjugiert mit alkalischer Phosphatase oder Meerettich-Peroxidase. Kolimetrische Reaktions- und Ablesesysteme können dann eingesetzt werden. Alternativ ist es möglich, einzelne Stellen auf Böden von ”wells” mikroskopisch in Augenschein zu nehmen, die Zytokin repräsentieren, das an einem einzelnen T-Zellen-Level erzeugt wird, wodurch es ermöglicht wird, die Vorläufer-Häufigkeit von antigenreaktiven T-Zellen zu bestimmen.
Die vorliegende Erfindung umfaßt andere Formen von Ausrüstung und diagnostische Versuche, einschließlich einer Ausrüstung mit einem Behälter, der zur Aufnahme eines Polypeptids gemäß der Erfindung eingerichtet ist. Die Ausrüstung kann einen zweiten Behälter enthalten, der zur Aufnahme einer zu testenden Probe eingerichtet ist oder diese enthält. Ein dritter Behälter kann vorhanden sein, der Reagenzien zur Ermittlung von GAD-Antikörper-Komplexen enthält. Wo die Ausrüstung GAD-Immunkomplexe ermitteln soll, kann alternativ die Ausrüstung einen oder mehrere Behälter aufweisen (z. B. ”wells”), der bzw. die zur Aufnahme eines GAD-spezifischen Antikörpers (z. B. eines monoklonalen Antikörpers) bestimmt ist bzw. sind. Zusätzliche Behälter bei der Ausrüstung können dann Behälter zur Aufnahme von Flüssigkeitsproben und eines etikettierten Antikörpers enthalten.
In weiterer Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung kann der Ausdruck der die hierin beschriebenen Polypeptide kodierenden cDNA-Einlage in einer Anzahl von verschiedenen Wegen erzielt werden.
Als Beispiel kann ein erfolgreicher Ausdruck des Autoantigen als ein Verschmelzungsprotein unter Verwendung der gGEX-Vektoren erzielt werden, die einen Ausdruck von Glutathion-S-Transferase-Fusions-Proteinen ergeben, unter Verwendung von E-Coli als Wirtszellen. Ein Ausdruck könnte auch beispielsweise erzielt werden unter Verwendung der allgemein bekannten pEV-Vektoren oder der Polyhistidin-Ausdrucks-Vektoren (23), wieder unter Verendung von E-Coli als Wirtzellen. Alternativ kann GAD ausgedrückt werden als ein nicht-verschmolzener Polypeptid, und zwar durch Verwendung passender Vektor- und Wirtszellen-Kombinationen. Andere Vektor- und Wirtszellen-Kombinationen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, umfassen eine Anzahl von gut beschriebenen Hefe-Schleuse-Vektoren zur Verwendung in Hefezellen oder eukaryotische Vektoren, die in kontinuierlichen Zell-Linien (z. B. CHO-Zellen) oder transgenischen Tieren nützlich sind.
Die Erfindung wird nunmehr mit Bezug auf die folgenden, nicht-einschränkenden Figuren und Beispiele beschrieben.
In den Figuren zeigt:
1 einen Vergleich der 540 Nukleotid-DNA-Sequenzen, entsprechend dem Menschenhirn-GAD (HBGAD) und menschlichen Inselchen-GAD (HIGAD) bei Ausschluß von Oligonucleotid-Sequenzen;
2 die abgeleiteten Aminosäuren-Sequenzen von HBGAD und HIGAD und deren Reihe mit der äquivalenten Region im Katzen-GAD (Aminosäuren 218–398);
3 die Nukleotid-Sequenz und abgeleitete Aminosäure-Sequenz entsprechend dem Mausgehirn GAD (MBGAD) voller Länge;
4 die Nukleotid-Sequenz und abgeleitete Aminosäure-Sequenz entsprechend dem N-Terminalfragment von MBGAD, mit MBGAD12 bezeichnet, das Aminosäuren 1–204 der publizierten Katzen-GAD-Sequenz (10) kodiert;
5 die Nukleotid-Sequenz und abgeleitete Aminosäure-Sequenz entsprechend dem Mittelregion-Fragment von MBGAD, mit MBGAD34 bezeichnet, entsprechend den Aminosäuren 198–404 der publizierten Katzen-GAD-Sequenz;
6 die Nukleotid-Sequenz und abgeleitete Aminosäure-Sequenz entsprechend dem C-Terminalfragment von MBGAD, mit MBGAD56 bezeichnet, entsprechend den Aminosäuren 392–593 der publizierten Katzen-GAD-Sequenz;
7 die Nukleotid-Sequenz voller Länge und abgeleitete Aminosäure-Sequenz entsprechend dem Menschenhirn-GAD (HBGAD-FL);
8 die Nukleotid-Sequenz und abgeleitete Aminosäure-Sequenz entsprechend dem N-Terminal-Fragment von HBGAD, mit HBGAD17 bezeichnet, entsprechend den Aminosäuren 1–250 der publizierten GAD-Sequenz;
9 die Nukleotid-Sequenz und abgeleitete Aminosäure-Sequenz entsprechend dem Mittelregion-Fragment von HBGAD oder HIGAD, bezeichnet als HBGAD14 oder HIGAD14, entsprechend den Aminosäuren 208–404 der publizierten Katzen-GAD-Sequenz;
10 die Nukleotid-Sequenz und abgeleitete Aminosäure-Sequenz entsprechend dem C-Terminalregion-Fragment von HBGAD, mit HBGAD65 bezeichnet, entsprechend den Aminosäuren 392–594 der publizierten Katzen-GAD-Sequenz, und
11 die Nukleotid-Sequenz voller Länge und abgeleitete Aminosäure-Sequenz entsprechend dem menschlichen Inselchen-GAD (HIGAD-FL).
BEISPIEL 1
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Maus-RNA. Maus-RNA wurde aus Gehirnen von BALB/C-Mäusen gewonnen.
Menschen-RNA. RNA wurde aus menschlichem Erwachsenen-Gehirn und pankreatischen Inselchen gewonnen. Inselchen wurden aus einer Spender-Bauchspeicheldrüse durch ein intraduktales Kollagenase-Streckungsverfahren isoliert. Individuelle handentnommene Inselchen wurden in 5 M Guanadinisothiocyanat, 10 mM Tris pH 7,6, 10 mM EDTA und RNA lysiert, gereinigt durch Zentrifugieren durch ein 5,7M-CsCl-Polster. Gesamtes RNA aus menschlichem Gehirn war eine Schenkung von Claude Bernard von der Latrobe University School of Behavioural Science, Australien.
Menschliche cDNA-Reihen. Zwei auf λgt-11 basierte cDNA-Ausdrucksreihen wurden als eine Quelle für GAD cDNA verwendet. Eine vom Hirn stammende cDNA-Reihe wurde erworben von Clonetech, und die Inselzellenreihe war eine Gabe von Alan Permutt von der Washington School of Medicine, St. Louis. cDNA wurde aus Phage-Beständen durch ein Platten-Lysis-Verfahren (20) präpariert.
Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Auf Grundlage der veröffentlichten Ratten (9)- und Katzen (10)-GAD-cDNA-Sequenzen wurden Oligonukleotid-Primer aus konservierten Regionen entworfen. Die zum Absondern der verschiedenen Klone verwendeten Primer sind in Tabelle 1 dargestellt. Zuerst wurde eine Fasersynthese von Gesamt-RNA (1 μg) durchgeführt in 10 mM Tris pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 100 μM dNTPs (PCR-Puffer), enthaltend 2 pmol von komplimentärem Primer, 40 U RNasin und 5 U MoMLV-Umkehr-Transkriptase bei 37°C für 30 Min. in einem 50 μl-Reaktionsvolumen. λgt-11-cDNA (100 ng) oder 10 μl der ersten Faserreaktion wurde verstärkt im PCR-Puffer, der 20 pmol von jedem Primer und 2,5 U von TaqI-Polymerase enthält, um 30 Thermalzyklen (ein Zyklus: 1,5 Min bei 95°C, 2,0 Min. bei 37–45°C, 2,0 Min. bei 72°C). Reaktionen wurden analysiert auf niedrigschmelzende Agarosegels und Produkte der erwarteten Größe durch Phenolextraktion (20) gereinigt.
Klonen und DNA-Sequenzierung. PCR-verstärkte DNA-Fragmente wurden geklont in den Plasmid-Ausdrucksvektor pGEX 1–3(21) und außerdem in den Histidin-Ausdrucksvektor pDS56, (–1) und (–2) (23). Die Nukleotidsequenz wurde bestimmt durch die Dideoxy-Ketten-Abschluß-Methode (22) unter Verwendung des M13-Universalprimers und spezifischer Primer, die aus interner GAD-Sequenz ausersehen waren, wie in Tabelle 1 beschrieben.
BEISPIEL 2
Klonen des menschlichen GAD
Um menschliches GAD zu klonen, cDNA, Oligonukleotid-Paare, die zwischen Ratten und Katzensequenzen konservierte Streckungen überlappen, wurden synthetisiert und in PCR-Reaktionen verwendet, um aus Gehirn- und Insel-λgt-11-Ausdrucksreihen extrahiertes cDNA sowie auch aus RNA, extrahiert aus menschlichem Gehirn oder menschlichen Inseln, zu verstärken. In umfangreichen PCR-Reaktionen, unter Verwendung verschiedener Kombinationen von Oligonukleotid-Primen und Entspannungstemperaturen wurde ein Produkt von 600 Nukleotiden aus sowohl Gehirn- als auch Insel-cDNA-Schablonen mit den Oligonukleotid-Primen erhalten:
5' ACTGCCAATACCAATATGTTCACATATGA 3 and
5' CCGAATTCTGTAGAGGGTTCCAGGTGAC 3' (komplementär, enthält ein Eco-RI-Stelle), was jeweils Nukleotid-Positionen 739–768 und 1312–1330 des veröffentlichten Katzen-cDNA entsprechen würde (10), welches das Mittelteilstück des GAD-Offenleserahmens repräsentiert. Die beiden 600-Nukleotid-PCR-Produkte wurden mit EcoRI und SmaI digeriert, die mit pGEX-3X-DNA gebunden waren, abgespalten mit EcoRI und SmaI und in E. coli transformiert. Restriktionsanalyse von Plasmid-DNA aus Transformanten identifizierten ein Menschengehirn-GAD-Klon (HBGAD) und ein Insel-GAD-Klon (HIGAD).
Die sowohl für HBGAD – als auch HIGAD bestimmten 540-Nukleotid-Sequenzen, ausschließlich der Oligonukleotid-Sequenzen, sind in 1 dargestellt. Diese beiden Sequenzen zeigen 90% Ähnlichkeit mit der Katzen-GAD-Sequenz und bestätigen daher die Identität der menschlichen Klone. Eine Ausrichtung der HBGAD-Sequenz mit der HIGAD-Sequenz zeigte, daß sie identisch waren, außer für vier Nukleotid-Änderungen bei Position 88(T-A), 91(T-C), 128(C-T) und 366(C-T).
2 zeigt die abgeleiteten Aminosäuren-Sequenzen von HBGAD und HIGAD und deren Ausrichtung mit der entsprechenden Region im Katzen-GAD-Protein (aa 218–393). Die vier Nukleotid-Differenzen zwischen HBGAD und HIGAD würden in drei konservativen Aminosäuren-Änderungen bei Resten 247 (Leucin-Isoleucin) und 260 (Threonin-Isoleucin) und 248 (Phenylalanin-Leucin) resultieren; der Rest 339 (Leucin) bleibt unverändert, weil die Nukleorid-Differenz bei Position 366 sich ausschweigt. Diese Aminosäure-Differenzen zwischen dem mittleren Drittel der Gehirn- und Insel-GAD-Proteine liefern einen Beweis für die Existenz von isomerischen Formen des GAD in menschlichem Gewebe.
Eine Infiltration der pankreatischen Inselchen mit mononuklearen Zellen kulminiert in der Zerstörung von Insulin produzierenden β-Zellen und klinischem IDDM (20). Das Enzym GAD wurde kürzlich als ein vermutliches Insel-Autoantigen in IDDM identifiziert auf der Basis der Fähigkeiten von verschiedenen IDDM-Seren, das 64K-Inselzellen-Protein und GAD (14) zu kopräzipitieren, und es ist gezeigt worden, daß periphere Blut-T-Zellen aus Objekten (Probanten) mit vorklinischem und klinischem IDDM durch Insel-Membranpräparationen aktiviert werden können, die das 64K-Autoantigen und GAD enthalten (24, 25). Der Befund von Sequenzdifferenzen zwischen Gehirn- und Insel-GAD kann nunmehr eine genetische Basis für selektive Autoimmunzerstörung von pankreatischen Inseln liefern.
BEISPIEL 3
Konstruktion eines menschlichen Gehirn- und Insel-GAD-cDNA Normales Gehirn-RNA würde rückübertragen mit entweder GAD 5-(5' CCCATAAACTCATGTTCTTG 3') oder GAD 7-(5'GGAGAAAATATCCCATCACC 3') Oligonukleotiden. Wie in Tabelle 1 gezeigt, erzeugte die Verstärkung der GAD67- und GAD5-Erstrang-Produkte durch PCR unter Verwendung von GAD-spezifischen Oligonukleotiden ein cDNA, das aa 1–250 HBGAD17 kodiert, und ein überlappendes cDNA, das aa 208–594 kodiert. Einhundert Nanogramm von jedem Fragment wurden bei 95°C in PCR-Puffer- und Hybridmolekülen denaturiert, verlängert und verstärkt unter Verwendung von RGAD 1- und GAD 5-Oligonukleotiden, die am Ende der hybridisierten Molekühle (Tabelle 1) tempern, um ein menschliches GAD-Klon voller Länge zu erzeugen, das den 594aa-GAD-Offenleserahmen kodiert, um ein HBGAD und HIGAD voller Länge zu erzeugen (7 und 11).
BEISPIEL 4
Klonen von Mausgehirn GAD
Mausgehirn wurde geklont wie oben für HBGAD und HIGAD beschrieben, mit Ausnahme, daß Primer RGAD1 und RGAD6 (Tabelle 1) verwendet wurden.
BEISPIEL 5
T-Zellen-Reaktionen auf rekombinante Proteine

67 Versuchspersonen wurden auf ihre T-Zellen-Reaktionen auf HBGAD und HIGAD getestet.

Versuchspersonen-Hintergründe waren wie folgt:

15	Kürzlich auftretende klinische Diabetiken (weniger als 3 Monate nach Auftreten von Symptomen);
44	vorklinische Diabetiken (asymptomatische Verwandte ersten Grades einer Person mit IDDM, die für Inselzellen-Antikörper positiv waren, welche mit Inseln in gefrorenen Abschnitten von menschlichem Pankreas reagieren;
8	Kontrollen (normal gesunde junge Erwachsene).

Periphere mononukleare Blutzellen (PBMC) wurden durch Ficoll-Hypaque-Dichte-Gradient-Zentrifugierung getrennt und zweimal gewaschen. Die Zellen wurden dann resuspendiert (2 × 10⁶/ml) in kompletem Kulturmedium (RPMI 1640 mit Hepes-Puffer 20 mM, Penizillin 100 Einheiten/ml, Streptomyzin 100 μl/ml, 10^–5M2-Mercaptoäthanol und 5% autologes Serum) und in 96 gut rundsöhlige Mikrotiter-Platten eingesät. Die rekombinanten GAD-Fusions-Proteine HBGAD sind HIGAD, die die 196-Aminosäure-Mittelteilstücke von menschlichem Gehirn- bzw. menschlichem Insel-GAD enthalten, wie in Tabelle 1 beschrieben, wurden Endkonzentrationen von 10, 1,0 und 0,1 μg/ml zugefügt, zusammen mit einer Glutathion-S-Transferase (GST), mit welcher das rekombinate GAD-Antigen verschmolzen ist. Beschallte fetale Schweine-Inselchen, bei denen die vorliegenden Erfinder nachgewiesen haben, daß sie GAD (24) enthalten, wie auch fetale Schweineleber, Schilddrüse und Niere wurden ebenfalls als Quellen für Antigen(e) verwendet.

Die Kulturen wurden 5 Tage land in einer befeuchteten 5%-CO₂-Atmosphäre ausgebrütet, mit Zugabe von ³H-Thymidin (1 μCi/Behälter) für die letzten 17 Stunden. Die Zellen wurden dann für Szintillationszählung geerntet. Mittelwertzählungen pro Minute (cpm) von jedem Vierfachen wurden verwendet, um Stimulationsindizes abzuleiten, d. h. cpm mit Antigen/cpm ohne Antigen. Ein positives Ergebnis wurde definiert als ein Stimulationsindex, der größer ist als derjenige, der mit GST- (rekombinanten GAD)-Proteinen erhalten wird oder größer ist als 2,0 (Fetalgewebe). Tabelle 2 Reaktivität von peripheren Blut-T-Zellen

	Antigene
Subjektgruppe	H-Insel-GAD14	H-Hirn-GAD14	fetale Schweine pro Inseln
jüngst auftr. klinische Diabetes	10/15	8/14	5/12
vorklinischer Diabetes	25/44	18/36	16/34
Kontrollen	3/8	3/8	1/8

Die in Tabelle 2 gezeigten Ergebnisse deuten an, daß insgesamt 35/39 (59%) jüngst befallene oder klinische Personen zirkulierende T-Zellen haben, die wucherungsfähig sind in Erwiderung auf menschliche Insel-GAD und (26/50) 52% auf Menschenhirn-GAD.
BEISPIEL 6
Antikörper-Reaktionen auf rekombinante Proteine
Serenproben aus Patienten wurden auf ein Antikörper-Ansprechen auf das N-terminale Fragment von rekombinantem Rattenhirn-GAD, MBGAD12 wie auch gegen das rekombinante Menschenhirn-GAD voller Länge getestet.
Als Antigen benutztes Protein
Rekombinantes Mausgehirn CAD12 wurde geklont und als ein Fusionsprotein mit Glutathion-S-Transferase (GST) im pGEX-System ausgedrückt. MBGAD12 wurde mit Thrombin gespaltet und die GAD-Portions-Affinität gereinigt aus GST unter Verwendung von Glutathion-Agarose-Kügelchen. MBGAD34, MBGAD56, HBGAD17 und HBGAD65 wurden geklont und als Fusionsproteine mit sechs Histidinrückständen am N-Terminus ausgedrückt bei Anwendung des Polyhistidin-Ausdrucksystems.
ELISAS
Bei allen ELISA-Nachweisverfahren wurden die rekombinanten GAD-Proteine bei 1 μg/ml auf Plastikschalen einer 96-Schalenplatte überzogen, Schalen wurden einem Blockierungspuffer ausgesetzt, gewaschen und mit duplizierenden Verdünnungen von Testseren ausgebrütet, gewaschen und alkalischem phosphatasekonjugiertem zweiten Antikörper ausgesetzt, gewaschen, entwickelt mit n-Nitophenolchromogen und bei 405 nN gelesen. Ein OD > Mittel + 2 SD mit Kontrollseren wurde als positiv genommen.
Versuchs-Patienten waren wie folgt:
Die Ergebnisse von ELISA bei Verwendung von MBGAD12, MBGAD34 und MBGAD56 sowie HBGAD65 sind jeweils in Tabellen 3 und 4 veranschaulicht:

Tabelle 3

MBGAD12 MBGAD34 MBGAD56

vorklinischer IDDM 5/9 5/9 4/9

jüngst aufgetr. klinischer IDDM 2/13 4/13 3/13

Kontrollen 0/22 0/20 0/20
Sieben von neun (78%) vorklinischer IDDM- und sechs von 13 (46%) jüngst auftretender IDDM-Seren reagierten mit mindestens einem der MBGAD-Peptide. Nur drei von neun (33%) und eines von 13 (8%) vorklinischen und jüngst auftretenden IDDM-Seren regierten jeweils mit allen drei MBGAD-Fragmenten. Keines der drei GAD-Peptide wurde bevorzugt durch irgendeine Serengruppe erkannt. Diese Befunde zeigen, daß Muster von Seren-Reaktivität mit rekombinantem MBGAD heterogen sind und daß mindestens drei Haupt-Epitope in der GAD67-Isoform existieren.

TABELLE 4

Versuchspersonen HBGAD17 HBGAD65

vorklinischer IDDM 7/9 3/9

jüngst aufgetr. klinischer IDDM 3/7 3/7

Kontrollen 0/16 0/16
Die Resultate unter Verwendung der beiden Menschenhirn-GAD-Fragmente HBGAD17 und HBGAD65 in einem ELISA-Format sind vergleichbar mit jenen, die unter Verwendung der äquivalenten Mausgehirn-GAD-Peptide MBGAD12 und MBGAD56 erhalten werden.
Fachleute auf diesem Gebiet werden einsehen, daß die Erfindung, wie sie hier beschrieben wird, für andere Variationen und Modifikationen als jene speziell beschriebenen zugänglich ist. Es versteht sich, daß die Erfindung alle derartigen Variationen und Modifikationen einschließt. Die Erfindung umfaßt auch alle Schritte, Merkmale, Kompositionen und Verbindungen, die in dieser Beschreibung angesprochen werden, und zwar individuell oder kollektiv, sowie auch jegliche und alle Kombinationen von irgendwelchen zwei oder mehr dieser Schritte oder Merkmale.
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Claims

Nukleinsäuremolekül, welches innerhalb seiner Sequenz umfaßt: i) eine menschliche Nukleotid-Sequenz nach 1; oder ii) eine Nukleotid-Sequenz, die das Komplement von einer der menschlichen Nukleotid-Sequenzen nach 1 ist.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei dieses Molekül ferner eine Nukleotid-Sequenz umfaßt, die einen Vektor kodiert.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 2, wobei der Vektor ein Ausdrucksvektor ist.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 2 oder 3, bei dem der genannte Vektor in einer oder mehreren Bakterien-, Hefe-, Säugetier- oder Insektenzellen replizierbar und/oder ausdrückbar ist.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 4, bei dem die Säugetierzellen die Chinesen-Hamster-Eierstock (CHO)-Zellenlinie sind.
Bakterien-, Hefe-, Säugetier- oder Insektenzelle, umgebildet mit dem Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
Polypeptid, das die Aminosäure-Sequenz aus menschlicher Pankreas-Insel-Glutaminsäure-Decarboxylase (HIGAD) nach 2 umfaßt, wobei das Polypeptid mit T-Zellen oder Autoantikörpern gegen Glutaminsäure-Decarboxylase reaktiv ist.
Polypeptid, das die Aminosäure-Sequenz aus Menschenhirn-Glutaminsäure-Decarboxylase (HBGAD) nach 2 umfaßt, wobei das Polypeptid mit T-Zellen oder Autoantikörpern gegen Glutaminsäure-Decarboxylase reaktiv ist.
Polypeptid nach Anspruch 7 oder 8, das ferner eine zweite Aminosäure-Sequenz umfaßt, die der ersten Aminsäure-Sequenz benachbart ist.
Polypeptid nach Anspruch 9, bei dem die zweite Aminosäure-Sequenz entweder Glutathion-S-Transferase (GST) oder einen Teil davon oder ein oder mehrere Histidinreste oder -rückstände umfaßt.
Nukleinsäuremolekül, welches innerhalb seiner Sequenz eine Nukleotid-Sequenz umfaßt, die eine Aminosäure-Sequenz nach 2 kodiert.
Verfahren zum Nachweis von Antikörpern zu GAD in einer Probe, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 7 bis 10 mit einer Probe für eine Zeitdauer und unter Bedingungen, die ausreichen, damit sich ein Komplex zwischen dem Polypeptid und einem Antikörper bildet, der für GAD empfänglich ist, und dann die Ermittlung des Komplexes umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 12, bei dem der Komplex durch kolorimetrische, fluorometrische, radioaktive oder andere Anzeigemittel oder durch Agglutinationsmittel ermittelt wird.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, bei dem die Antikörper Autoantikörper sind.
Verfahren zum Nachweis von Krankheiten des Typs, der IDDM und SMS einschließt, oder zum Abschirmen asymptomatischer Personen durch die Ermittlung und/oder Bestimmung der Konzentration von Autoantikörpern in einer biologischen Probe von dieser Person, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen der genannten Probe mit einem Polypeptid nach einem der Ansprüche 7 bis 10 für eine Zeitlang und unter Bedingungen, die genügen, damit sich ein Komplex zwischen dem Polypeptid und einem für GAD empfänglichen Antikörper bildet, und dann das Ermitteln des Komplexes und/oder der Menge von Peptid oder Polypeptid, welches in einem Komplex gebunden worden ist, umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, bei dem die Probe Serum ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 16, bei dem das Polypeptid auf einem festen Träger vor, während oder nach dem Kontakt mit der Probe unbeweglich gemacht wird.
Diagnostische Ausstattung zur Untersuchung von Autoantikörpern auf GAD, wobei diese Ausstattung oder Ausrüstung in Kammerform eine erste Kammer aufweist, die ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 7 bis 10 enthält.
Ausstattung nach Anspruch 18, die ferner einen zweiten Behälter aufweist, der zur Aufnahme einer auf Autoantikörper zu testenden Probe ausgelegt ist.
Verwendung eines Polypeptids, nach einem der Ansprüche 7 bis 10, bei der Zubereitung einer Komposition zur Reduzierung von Autoantikörpern und/oder auf GAD antireaktiven T-Zellen bei einem Patienten, falls erforderlich, und/oder zur Desensibilisierung oder Einführung von Toleranz, um Reaktivität auf autoreaktive T-Zellen oder Autoantikörper für das Autoantigen zu beseitigen oder zu vermindern.
Verwendung nach Anspruch 20, bei der die genannte Komposition in einer Form vorliegt, die für epikutane Anwendung auf Patienten ausgelegt ist, die eine T-Zellen-Reaktivität auf GAD zeigen, bei folgender Behandlung mit Ultraviolettlicht, um die Antigen-Darstellung zu modifizieren.
Verwendung nach einem der Ansprüche 20 oder 21, bei der in der genannten Komposition die Menge des Peptids oder Polypeptids von GAD 0,1 μg bis 10 mg pro Dosis beträgt.
Verwendung nach Anspruch 22, bei der die Menge 1 μg bis 10 mg pro Dosis beträgt.
Produkt, das ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 7 bis 10 und ein oder mehrere Cytokine als eine kombinierte Zubereitung für gleichzeitige, separate oder Folgeanwendung bei Reduzierung von Autoantikörpern und/oder auf GAD autoreaktiven T-Zellen bei einem Patienten, falls erforderlich, und/oder für Desensibilisierung oder Einführung von Toleranz, um die Reaktivität von autoreaktiven T-Zellen oder Autoantikörpern auf das Autoantigen zu beseitigen oder zu vermindern, enthält.
Produkt nach Anspruch 24, bei dem das Cytokin TNF-α und/oder TNF-β ist.
Verwendung von GAD-reaktiven T-Zellen-Linien oder Klonen, die das Polypeptid nach einem der Ansprüche 7 bis 10 ausdrücken, oder Zellmembranen und/oder Rezeptoren für das Polypeptid aus den genannten GAD-reaktiven T-Zellenlinien oder Klonen für die Zubereitung einer immunogenetischen Zusammensetzung für das Einführen von Verhinderung und/oder Reduzierung von T-Zellen-Reaktionen auf GAD-Autoantigen, um dadurch Autoantikörper und/oder auf GAD autoreaktive T-Zellen bei einem Patienten im Bedarfsfall zu reduzieren und/oder zu desensibilisieren oder Toleranz einzuführen, um die Reaktivität von autoreaktiven T-Zellen oder Autoantikörpern auf das Autoantigen zu beseitigen oder zu mindern.
Verwendung nach Anspruch 26, bei der die GAD-reaktiven T-Zellenlinien oder Klone unversehrt oder nach Abschwächung mit chemischen Quervernetzungs-Reagenzien eingesetzt werden.
Verwendung nach Anspruch 27, bei der die chemischen Quervernetzungs-Reagenzien Glutaraldehyd oder Paraformaldehyd oder andere ähnlich wirksame Agenzien umfassen.
Verfahren zur Feststellung der Reaktivität von Zellen eines Patienten auf das IDDM-GAD-Autoantigen, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 7 bis 10 mit einer Zellenprobe vom Patienten für eine ausreichende Zeitspanne und unter geeigneten Bedingungen sowie das Messen der Reaktivität dieser Zellen auf das Peptid oder Polypeptid umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 29, bei dem die Zellenprobe aus peripherem Blut oder aus Gewebe-Biopsien herstammt.
Verfahren nach Anspruch 29 oder 30, bei dem die Reaktivität durch Ausdruck von löslichen Faktoren oder einer Proliferations- bzw. Wucherungsuntersuchung gemessen wird.
Verfahren nach Anspruch 31, bei dem die löslichen Faktoren Cytokine umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 32, bei dem die Zellen Z-Zellen sind.