NO320715B1 - Nye peptider avledet av humant varmesjokkprotein 60, farmasoytiske preparater omfattende slike og anvendelse av de nye peptider for fremstilling av farmasoytiske preparater for behandling og forebyggelse av insulinavhengig diabetes mellitus, samt fremgangsmate og sett for diagnostisering av IDDM. - Google Patents

Description

OPPFINNELSENS FELT

Foreliggende oppfinnelse angår nye peptider som er epitoper av det humane 60KDa varmesjokkproteinet (hsp 60), farmasøytiske sammensetninger omfattende disse, og anvendelse av de nye peptidene for fremstilling av farmasøytiske preparater for forebyggelse og behandling av IDDM. Videre omfatter oppfinnelsen fremgangsmåter og sett for diagnose og behandling av insulinavhengige diabetes melHtus (IDDM).

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Type I diabetes eller IDDM, er en autoimmun sykdom forårsaket av T-celler som

angriper og ødelegger de insulin-produserende B-cellene lokalisert i øyene i pankreas (Castano og Eisenbarth, 1990). Den autoimmune prosessen som kulminerer i IDDM starter og utvikles uten symptomer. Sykdommen kommer først till syne klinisk når det kulminative tapet av B-celler overskrider kapasiteten til de gjenværende B-cellene for tilførsel av insulin. Faktisk, er kollapsen av glukosehomeostasen og klinisk IDDM,

antatt å opptre kun etter at 80-90% av B-cellene har blitt inaktivert av immunsystemet. Pasienter som kan bli identifisert å lide av IDDM, må være i et fremskredent trinn av autoimmundestruksjon av deres B-celler. Videre, kan diagnostikk av startende,

preklinisk diabetes ved deteksjon av immunologiske markører av B-celler autoimmunisitet, kun bli gjort etter start av den autoimmune prosessen. Derfor, er det terapeutiske målet å finne en sikker, spesifikk effektiv måte å stoppe den autoimmune prosess som allerede er godt i gang.

Foreliggende oppfinnere har undersøkt dette spørsmålet tidligere ved studering av den spontane diabetes som utvikles hos mus i NOD-stammen, som er ansett å være en troverdig modell på human IDDM (Castano og Eisenbarth, 1990). NOD-mus utvikler insulitis når de er omkring 4 uker gamle som starter som en mild peri-øyinifltrering og forløper mot alvorlig intra-øyinflammasjon. Hyperglykemia som skyldes utilstrekkelig insulin, starter hos hunnkjønnsdyr i den benyttede stammen ved en alder på omkring 14-17 uker. Ved alder på omkring 35-40 uker, vil nesten alle hunnkjønns NOD-mus ha utviklet alvorlige diabetes og de fleste vil dø i fravær av insulinbehandling. Hannkjønns NOD-mus har lavere hyppighet av sykdommen, av uklare grunner. Diabetes hos NOD-mus har blitt vist å være forårsaket av autoimmune T-celler (Bendelac et al., 1987).

T-celleaktiviteten og autoantistoffene overfor forskjellige antigener har blitt detektert i humane IDDM pasienter så vel som i NOD-mus (Elias, 1994), og det er ikke klart om immuniteten overfor et hvilket som helst enkelt av de mulige målantigener, er den primære årsaken til sykdommen. Bak spørsmålet om årsakssammenheng er spørsmålet om terapi.

Det har blitt vist at initieringen av den autoimmune sykdommen hos NOD-mus kan bli forhindret ved å utsette musen, før starten av diabetes, for forskjellige manipuleringer slik som begrenset diett, virale infeksjoner eller ikke-spesifikk stimulering av immunsystemet (Bowmann et al., 1994). NOD-diabetes blir også forhindret ved induksjon av immunologisk toleranse i prediabetiske mus overfor antigenet glutaminsyre-dekarboksylase (Kaufmann et al., 1993; Tisch et al., 1993).

X.-D- Yang et al., Experientia, vol. 48,1992, side 650-656, D. Ellias et al., The Lancet, vol 343,1994, side 704-706 og D. Ellias et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, vol. 88, 1991, side 3088-3091 beskriver varmesjokk proteiner og spesielle sekvenser identifisert å være viktige epitoper ved utvikling og mulig behandling av IDDM.

Insulinavhengige diabetes mellitus (IDDM) som utvikler seg spontant hos hunnkjønns NOD-mus har blitt assosiert med immunreaktivitet overfor forskjellige egenantigener (Bach, 1994). Verdt å merke seg blant disse antigenene er p277-peptidet fra sekvensen til det mammaliske 60 kDa varmesjokkprotein (hsp 60) molekylet. Dette tilsvarer restene 437-460 i det humane hsp60 molekylet (Elias et al. 1991, Israel patentsøknad WO90/10449). Det humane p277 peptidet har den følgende sekvensen: Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp (aminosyre 437-460 i SEQ. ID. Nr. 1).

Prediabetiske NOD-mus manifesterer spontan, diabetogen T-celle respons overfor hsp60 og overfor human (2) eller musevarianter av p277 peptidet (3). Peptidene fra mus og menneske skiller seg med en aminosyre og er immunologisk kryssreaktive (3). Noen non-diabetes utsatte stammer av mus, slik som C57BL/6, utvikler forbigående hyperglykemi og insulitis når de blir immunisert med p277 kovalent konjugert til et fremmed immunogent bæremolekyl (4). Mus av C57BL/KsJ-stammen utvikler spontane T-celleresponser overfor hsp60 og p277 etter behandling med forskjellige lave doser av JJ-celletoksin streptozotosin (STZ) som induserer autoimmun diabetes (5).

I tillegg til å bli involvert i ekspresjonen av sykdommen, synes peptid p277 å være funksjonelt i heling av autoimmun prosess: subkutan administrering av p277 i ufullstendig Freunds adj uvant (IFA; mineralolje) fører til stans i sykdomsutviklingen hos unge NOD-mus (2) eller i 12-17 uker gamle NOD-mus med fremskreden insulitis (6,7). Både de humane (6, 7) og muse (3) variantene av p277 er effektive. NOD-mus som er transgene for mus hsp60 genet på en MHC-klasse II promotor, viste nedregulering av deres spontane T-celle proliferative respons overfor p277 og betydelige andeler av musene ble spart for utviklingen av diabetes (8). Videre, stanset administreringen av p277 til C57BL/KsJ-mus utviklingen av autoimmun diabetes hos mus som tidligere hadde mottatt en meget lav dose STZ; behandling av disse musene med peptid av GAD65-molekylet var ikke effektiv (9).

Varianter av p277 peptidet i hvilke en eller begge systeinrestene ved posisjon 6 og 11 var erstattet med vahnrester, betegnet henholdsvis p277 (Val6), p277 (Val<11>) og p277 (Val<6->Val<n>), ble beskrevet i den parallelt løpende israelske patentsøknaden nr. 112094, og viste å være lite aktiv som p277 ved behandling av diabetes.

Foreliggende oppfinnelse har som formål å fremskaffe ytterligere peptider av human hsp60, slike peptider er nyttig for diagnostikk og behandling av IDDM.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

I en studie av fragmenter og peptider avledet fra det humane hsp60 molekylet, ble det uventet funnet at IDDM-pasienter og NOD-mus er responsive overfor andre hsp60 T-celle epitoper som kan bli benyttet for diagnostikk og terapi av IDDM. Disse epitopene, i seg selv eller i sammenheng med p277 eller en p277-variant valgt blant p277 (Val") og p277 (Val^Val1 \ kan forbedre effektiviteten til behandlingen.

Disse nye peptidene er identifisert i tabell 1.

Andre peptider av hsp60, inkludert de betegnet p278 (tilsvarende posisjon 458-474 i den humane hsp60 sekvensen), pl9 (tilsvarende posisjon 271-290 i den humane hsp60 sekvensen), og p21 (tilsvarende posisjon 301-320 i den humane hsp60 sekvensen) ble vist ikke å være så effektive. Det ble registrert at aminoterminalen til p278 overlapper med det effektive p277 peptidet med tre rester (NED) og karboksyterminalen av p278 overlapper med det effektive p32 peptidet med 9 rester (EDKRTLKI). De gjenværende 11 restene av p32 er således kritisk (PAMTIAKNAGV).

Foreliggende oppfinnelse angår således peptid, kjennetegnet ved at det utgjøres av peptidet p32 bestående av aminosyrerester nr. 466-485 ifølge SEQ ID NO. 1, og salter og åpenbare derivater derav med i størrelsesorden den samme biologiske aktivitet.

Oppfinnelsen angår videre et preparat, kjennetegnet ved at det omfatter et peptid sammen med et peptid valgt fra gruppen bestående av p277, p277(Val<6>), p277(Val<1>') og p277(Val<6->Val).

Det er videre et mål med foreliggende oppfinnelse å fremskaffe fremgangsmåter og sett for tidlig diagnose av IDDM ved anvendelse av peptidene ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen angår således en fremgangsmåte for diagnostisering av nærværet eller begynnelsen av insulinavhengig diabetes mellitus (IDDM) hos en pasient, kjennetegnet ved at den omfatter testing in vitro av blod eller urin til nevnte pasient med et peptid ifølge krav 1 som antigen for nærværet av antistoffer eller T-celler som er immunologiske reaktive med humant hsp60.

I utviklingsforløpet for IDDM, uttrykker dyrene hsp60-molekyler eller molekyler som er kryss-reaktive med dette, som finner sin vei til blod og urin fra dyrene. De uttrykker også antistoffer og T-celler rettet spesifikt mot slike molekyler. Nærværet av hsp60 (eller molekyler som er kryssreaktive med dette), eller antistoffer eller T-celler spesifikke for dette i blod eller urin, tjener som en analyse for deteksjon av IDDM-prosessen før destrukson av B-cellene er fullført og individet er dømt til livslang diabetes.

Nærværet eller starten av IDDM hos en pasient kan bli diagnostisert ved testing av blod eller urin til nevnte pasient for nærværet av antistoffer eller T-celler som er immunologisk reaktive overfor humant hsp60 ved anvendelse som antigen av et peptid pl2 eller p32 ifølge oppfinnelsen.

Følgelig, fremskaffer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for diagnostisering av nærværet eller start av IDDM hos en pasient omfattende testing av nevnte pasient for nærværet av anti hsp60 antistoffer eller av en T-celle som immunoreagerer med hsp60 ved anvendelse av et peptid ifølge foreliggende oppfinnelse som antigen, hvorved et resultat indikerer det positive nærværet av anti hsp60 antistoffer eller av en T-celle som immunoreagerer med hsp60 for å indikere en høy sannsynlighet for nærværet eller start av IDDM.

I fremgangsmåten for diagnostisering av IDDM, kan pasienten bli testet for nærværet av anti-hsp60 antistoffer, hvori nevnte testmetoder kan omfatte en radioimmunanalyse eller en ELISA-test.

Pasienten kan også bli testen for nærvær av en T-celle som immunoreagerer med hsp60. I en utførelsesform ifølge dette aspektet, omfatter fremgangsmåten en T-celle proliferingstest omfattende trinnene: (i) preparering av en mononuklear cellefraksjon inneholdende T-celler fra en blodprøve oppnådd fra nevnte pasient; (ii) tilsetting til nevnte mononukleare cellefraksjon et antigen valgt blant peptidene ifølge oppfinnelsen; (iii) inkubering av nevnte cellefraksjon i nærvær av nevnte antigen i en passende tidsperiode og under passende kulturbetingelser; (iv) tilsetting av et merket nukleotid til den inkuberte cellekulturen fra (iii) i en passende tid før slutt av nevnte inkuberingsperiode for å sikre inkorporering av nevnte

merkede nukleotid i DNA til proliferende T-celler;

(v) bestemme mengden proliferende T-celler ved analyse av mengden merket nukleotid

innlemmet i nevnte T-celler.

I trinn (iv) ovenfor er nevnte merkede nukleotid fortrinnsvis 3H-tymidin. Bestemmelse av mengden proliferende T-celler ble gjort ved beregning av stimuleringsindeksen av T-cellene ved standardmetoder.

Ifølge en annen utførelsesform av dette aspektet av oppfinnelsen, omfatter testmetoden en T-celle cytokinresponstest, i hvilken trinn (i) til (iii), er som i T-celle proliferasjonstesten ovenfor og i et fjerde trinn (iv) blir nærværet av cytokin slik som IFN-y, IL-2, IL-4, IL-6, EL-10, TNF-a eller IGFp utskilt ved responderende lymfocytter i mediet, detektert ved standardmetoder med kommersielt tilgjengelig sett.

Foreliggende oppfinnelse angår sett for utførelse av slike analyser. Settene blir tilberedt for å utføre et hvilket som helst av de forskjellige analysene benyttet for å oppnå foreliggende oppfinnelse. Hvert slikt sett omfatter alle materialene som er nødvendige for å utføre en enkel analyse eller et bestemt antall analyser. For eksempel, kan et slikt sett for å bestemme nærværet av anti-hsp60 antistoffer inneholde en fast-fase immoblisert peptid ifølge oppfinnelsen og et merket antistoff være i stand til å gjenkjenne den ikke-variable regionen av anti-hsp60 antistoffet som skal bli detektert, slik som merket antihumant Fab. Settet kan også inneholde bruksanvisninger for anvendelse av settet og en beholder for å holde materialene i settet. Et hvilket som helst konvensjonell markør kan bli benyttet, slik som en radioisotop, et enzym, en kromofor eller en fluorofor. En typisk radioisotop er jod-125 eller svovel-35. Typiske enzymer for dette formålet er pepperrot-peroksidase, pepperrot-galaktosidase og alkalisk fosfatase.

Oppfinnelsen angår videre et sett for diagnostisering av nærværet av IDDM ved testing for nærværet av anti-hsp60 antistoffer ifølge fremgangsmåten kjennetegnet ved at settet omfatter: (i) et antigen som er et peptid; (ii) et merket antistoff som er i stand til gjenkjenning av den ikke-variable regionen av nevnte anti-hsp60 antistoffer som skal detekteres.

Oppfinnelsen angår videre et sett for diagnostisering av nærværet av IDDM ved testing av nærværet av en T-celle som immunoreagerer med hsp60 ifølge fremgangsmåten kjennetegnet ved at det omfatter: (i) et antigen i form av et peptid;

(ii) et merket nukleotid; og

(iii) et passende medium for dyrking av lymfocytter.

For en in vivo test vil settet omfatte kun et peptid ifølge oppfinnelsen i en passende form for injeksjon.

Foreliggende oppfinnelse angår dessuten farmasøytiske sammensetninger omfattende et peptid ifølge oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabel bærer. Sammensetningen kan brukes til å forhindre eller behandle IDDM.

Oppfinnelsen angår også anvendelse av et peptid ifølge oppfinnelsen til fremstilling av en farmasøytisk sammensetning.

Vaksinering med et antigenpeptid ifølge foreliggende oppfinnelse kan gi en spesifikk form for regulering av autoimmunisiteten overfor antigenet og effektivt danne en resistens overfor autoimmunprosessen ved IDDM. Det samme er tilfellet med hensyn på vaksinering med T-celler som er spesifikke for slike antigener, i attenuert eller avirulent form eller etter å ha blitt behandlet for å forbedre deres antigenisitet, eller fragmenter eller aktive fraksjoner derav. Dersom det viser seg at pasienten allerede er i det prekliniske innledningsstadiet til IDDM, kan injeksjon med et slikt antigen eller T-celle (cellefraksjon) gi en nedregulering av autoimmunisiteten for dette antigenet og således stanse autoimmunresponsen før signifikant, permanent skade blir gjort. Peptidet kan også bli benyttet som et terapeutisk middel for å stanse den autoimmune prosessen selv etter at den er meget avansert, som nylig vist ved laboratoriet til foreliggende oppfinnere vedrørende behandling av NOD-mus med peptid p277 (Elias og Cohen, 1994).

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1 viser posisjonene til peptidene referert til heri på hele sekvensen til det humane hsp60-molekylet. Figur 2 viser NOD-mus T-celle proliferasjon overfor human hsp60 peptider pl2, p32, p277(Val<6->Val<n>)ogp278. Figur 3 er en kurve som viser T-celle proliferativ respons til NOD-mus overfor peptider. Grupper på tre NOD-mus ble administrert med peptider mus pl2, mus p277, GAD-p35 og MT-p278 i IFA hver med en dose på 25 ug i IFA. De drenerende lymfenodene ble fjernet 10 dager senere og analysert for proliferative responser overfor de tilsvarende peptider ved konsentrasjoner på 5,10,20, og 50 ug/ml. Stimuleringen ved den optimale konsentrasjonen på 20 ug/ml er vist. De følgende områdene cpm ble oppnådd i mediumkontroller: mus pl2,881; mus p277,1243; MT-p278,698 og GAD-p35 1430. Mus peptid p-38 er et peptid avledet fra mus-hsp60 (556-573), som ikke har noen sekvenshomologi med de testede peptidene og tjener som en negativ kontroll for spesifisitet. Disse resultatene er representative for de tre utførte eksperimentene. Hver analyse ble gjort i triplikat på hvilke SD-verdiene ble indikert ved søylene. Det var ingen kryss-reaktivitet mellom peptidene (ikke vist). Figur 4 er en kurve som viser effekten av peptidadministrasjon på diabetes. Grupper på 10-20 NOD-mus ble behandlet ved 10 ukers alder med 100 fig på mus pl2, p277, p35-GAD eller MT-p278 i IFA eller IFA alene. Musene ble blodtappet månedlig og fulgt for å se start av hyperglysemia. Som sammenlignet med IFA-behandlet kontrollgruppe, var musene behandlet med pl2 og p277 signifikant beskyttet, p<0,05. Figur 5 viser IgGl, IgG2a og IgG2b antistoff isotyper som respons på peptidbehandling. Mus ble behandlet som beskrevet i forklaringen til figur 4. Individuelle prøver ble analysert ved antistoff overfor mus pl2 A; p277 B; GAD-p35 C; og MT-p278 D, av IgGl, IgG2a og IgG2b isotyper. Lignende effekter ble oppnådd i to eksperimenter.

Resultatene er angitt som absorbans ved 405 nm (OD) av 10 individuelle mus i hver gruppe. Signifikansnivået for hyppigheten av IgGl og IgG2b antistoffer i gruppene A og B sammenlignet med C og D er P<0,001. Forskjellene mellom nivåene av IgGl og IgG2b antistoffer sammenlignet med IgG2a antistoffer i gruppene A og B var signifikant (p<0,001). Det var ingen kryss-reaktivitet mellom antistoffene (ikke vist). Figur 6 viser den negative korrelasjonen mellom antistoffer og blodglykose. En gruppe på NOD-hunnkjønnsmus ble behandlet med pl2 (10 mus) eller med IFA alene (9 mus) som beskrevet i forklaringen til figur 4. Mengden anti-pl2 spesifikt antistoff (Elisa O.D. enheter i sera fortynnet 1:50, målte ved 7 måneders alder) er plottet sammen med blodglukosekonsentrasjon mål ved 7 måneders alder. Graden av korrelasjon mellom høye antistoffhivåer og blodglukose er p<0,002. Figur 7 er en kurve som viser T-celle proliferative responser (S.L) til en IDDM-pasient donor overfor recall-antigener, overfor hsp60-protein og overfor hsp60 syntetiske peptider. Figur 8 er en kurve som viser T-celle proliferative responser (S.L) til en frisk donor overfor recall-antigener, hsp60 og overfor hsp60 syntetiske peptider. Figur 9 er en kurve som viser T-celle proliferative responser (S.I) til en annen IDDM pasient donor overfor recall-antigen, overfor hsp60 og overfor hsp60 syntetiske peptider. Figurene 10 A og 10 B er kurver som viser T-celle proliferative responser (S.I.) til to IDDM-pasientdonorer overfor hsp60 syntetiske peptider.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN.

Alltid når "peptid ifølge oppfinnelsen" eller en annen individuell betegnelse slik som "peptid pl2" eller "peptid p32" er nevnt i foreliggende beskrivelse og krav, er det også omfattet salter og åpenbare derivater derav så lenge den biologiske aktiviteten til peptid med hensyn på diabetes blir opprettholdt.

"Salter" av peptider ifølge oppfinnelsen omfattet av foreliggende oppfinnelse, er fyisologisk akseptable organiske og uorganiske salter.

"Åpenbare derivater" av peptider ifølge oppfinnelsen som benyttet heri dekker derivater som kan bli fremstilt fra de funksjonelle gruppene som opptrer som sidekjeder på rester eller de N- eller C-terminale gruppene, med midler som er kjent i teknikken, og er inkludert i oppfinnelsen så lenge de forblir farmasøytisk akseptable, det vil si de

ødelegger ikke aktiviteten til peptidet, bidrar ikke til toksiske egenskaper i sammensetningene inneholdende dem og gir ingen negative effekter på de antigene egenskapene derav.

Disse derivatene kan for eksempel omfatte alifatiske estere av karboksylgrupper, amider av karboksylgrupper produsert ved reaksjon med ammoniakk eller med primære eller sekundære aminer, N-asylderivater av frie aminogrupper av aminosyrerester dannet ved reaksjon med akrylgrupper (for eksempel alkanoyl eller karbosykliske aroylgrupper) eller O-asylderivater av frihydroksylgrupper (for eksempel de av seryl- eller treonylrester) dannet ved reaksjon med asylgrupper.

Peptidene ifølge oppfinnelsen kan bli benyttet som immunogener i farmasøytiske sammensetninger, spesielt vaksiner for lettelse og behandling av IDDM, så vel som et antigen i diagnostiske sammensetninger for diagnose av IDDM. Disse farmasøytiske og diagnostiske sammensetningene som kan bli fremstilt på en måte kjent i teknikken, danner også del av foreliggende oppfinnelse.

Den terapeutiske sammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli administrert oralt eller parentalt slik som subkutant, intramuskulært, intravenøst, intranasalt eller intrarektalt.

Oppfinnelsen vil nå bli illustrert på ikke-begrensende måte ved de følgende eksempler og vedlagte figurer.

EKSEMPLER

Materialer og metoder

(i) Mus, mnavlshunnkiønnsmus av NOD/Lt-stammen ble levert av Animal Breeding Center of the Weizmann Institute of Science, Rehovet, Israel, eller av Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME. Disse musene utvikler spontan autoimmun diabetes

ved 14 til 17 ukers alder som ligner IDDM hos mennesker.

( ii) Anti<g>ener. Peptider ble syntetisert i Department of Organic Chemistry of the Weizmann Institute of Science ved anvendelse av en automatisert multipel peptid syntetisator (Abimed model AMS 422; Langenfeld, Ty

skland) ved å følge firmaets protokoll for N-a-fluroenylmetoksykarbonyl (Fmoc) syntese. Råprodukter ble renset ved reversfase HPLC på semi-preparativ C8-kolonne

(Lichrosorb RP-8,7 mm, 250 x 10 mm, Merck, Darmstadt, Tyskland). Eluering av peptider ble oppnådd ved lineære gradienter etablert mellom 0,1% trifluoreddiksyre i vann og 0,1% trifluoreddiksyre i 75% asetonitril i vann (v/v). Renheten av det enkle peptidproduktet ble sikret ved analytisk reversfase HPLC og aminosyreanalyse. Peptid MT-p278 er fra sekvensen fra mykobakterielt hsp60 (431-447). Peptid p277 er

substituert ved posisjon 6 og 11 med valin (V) i stedet for systen C) i den native

i sekvensen. Substitusjon av de to C-restene med V øker sterkt stabiliteten til peptidet uten å påvirke dets immunologiske aktivitet: det V-substituerte peptidet er fullstendig kryssreaktivt med det native peptidet ved T-celle- og antistoffanalyser. Når dette ikke er spesifisert, er det ment den humane sekvens. Mus pl2 og mus p38-peptider avledet fra

mus hsp60-molekylet og tilsvarer til dets henholdsvise 168-188,437-460 og 556-573 sekvenser. Peptid GAD-p35 er fra GAD65 molekylet (524-543). Aminosyresekvensene til alle peptidene benyttet heri er vist i tabell 2

(iii) T-celle proliferasjon til peptider.

Mus: Ni ukers gamle NOD-mus eller mus fra andre stammer ble immunisert i bakfotputene med 0,1 ml emulsjon inneholdende 25 ug peptid i complete Freund's adjuvant (CFA; Difco, Detroit, MI.) blandet med et likt volum fosfatbufferet saltvann (PBS). De drenerende popliteale lymfeknutene ble fjernet 10 dager senere og suspensjoner av lymfocytter i triplikate kulturer ble testet for proliferasjon i nærvær av de forskjellige peptidene (5 ug/ml) ved anvendelse ved inkorporering av [<3>H]-tymidin som beskrevet (Elias et al., 1991). Resultatene er vist som stimuleringsindeksen (SI): forholdet av gjennomsnittlig cpm i nærvær av testpeptid til gjennomsnittlig cmp til kontrollkulturer uten peptid. Standardavvik var alltid lavere enn 10% av gjennomsnittene.

(iv) Behandling oe oppfølging. Peptider. 100 mg, i PBS, ble emulgert med et likt volum IFA og injisert subkutant i 10 ukers gamle NOD-hunnkjønnsmus beskrevet (Elias og Cohen, 1995). Kontrollmus fikk et likt volum PBS emulgert i IFA. Musene ble overvaket månedlig for ikke-fastende blodglukose kl. 10.00 ved anvendelse av Blood Glucose Sensor (MediSense, Inc., Waltham, MA). Mus med en blodglukose større enn 11,1 mmol/1 ble ansett å være diabetiske; denne konsentrasjon av glukose er større en 3 standardavvik over gjennomsnittlig blodglukosekonsentrasjon målt i ikke-diabetiske mus (Elias og Cohen, 1995).JHistologiske undersøkelser av øyene i pankreas ble gjort på seksjoner farget med hematoksylin og eosin. Snittene ble bedømt uavhengig av to observatører som begge ikke var klar over identiteten til gruppene. Chi-square-testen ble benyttet for å bedømme

statistiske forskjeller mellom de forskjellige behandlingene.

(v) Serum antistoffer. Mus ble blodtappet månedlig for å detektere antistoff-responser.

Elisa-analysen ble gjort som beskrevet (Elisa et al., 1991). Kort, ble flatbunnede Maxisorbplater (Nunc, Roskilde, Danmark) belagt for deteksjon av anti-peptid antistoffer, med 100 ml/brønn av peptid i PBS, ved en konsentrasjon på 10 mg/ml i to timer ved romtemperatur fulgt av inkubering over natten ved 4°C. Etter inkubering med peptid ble platene vasket og blokkert i to timer ved 37°C med 7% BSA (Sigma) i PBS. Sera ble fortynnet i 1:50, så tilsatt i 2 timer ved 37<*>C fulgt av inkubering i 2 timer med 100 ml pr. brønn av geite-antimus IgG (gammakjede Fc spesifikk), konjugert til alkalisk fosfatase (Jackson, Philadelphia, PA). Etter vasking ble platene inkubert med substratet, dietanolamin (Sigma) og lest ved anvendelse av en ELISA-leser 405 nm.

EKSEMPEL 1

Kartlegging av hsp60 epitoper i NOD-mus.

Immunogenisiteten til hsp60-peptidene pl2, p32, p277 (Val<6->Val<n>) og p278 i NOD-mus ble testet ved immunisering av musene med peptidene emulgert i CF A i bakfotputene, og analysering av de proliferative responsene i de drenerende lymfeknutecellene etter 10 dager som beskrevet ovenfor i seksjon iii (a). Som vist i figur 2, var peptidene p277 (Val<6->Val<1>'), pl2 og p32 sterkt immunogene mens p278 ikke var immunogen.

EKSEMPEL 2

Behandling av NOD-mus med p277 (Val<6->Val'<l>), pl2 eller p32.

For å teste om pl2 og p32 peptidene kan blokkere progresjonen av diabetes som p277 (Val<6->Val<u>), ble p277 (Val<6->Val<n>), pl2 eller p32 peptidene (100 ug i en 0,1 cc emulsjon IFA) administrert subkutant til grupper av 10-12 uker gamle NOD/Lt hunnkjønnsmus fra Jackson Laboratory, Bar-Harbor, ME. Diabetes, bestemt som vedvarende blodglukosenivå over 11,1 mmol/1, ble testet ved 25 ukers alder. Kontroilmus var ikke behandlet eller ble behandlet med p278.

Som vist i tabell 1, var p277 (Val<6->Val<11>), pl2 og p32 effektive i behandling av diabetes, hyppigheten av diabetes i ikke-behandlede mus eller i p278-behandlede mus var 90%, mens p277 (Val<6->Val<1>'), pl2 og p32-behandlede mus viste en hyppighet på henholdsvis 10%, 20% og 30%. På den andre side, hadde kontroll p278 peptidet ingen terapeutisk effekt.

Det er mulig at en kombinasjon av to eller tre hsp60 epitoppeptider vil være mer effektiv enn kun et peptid, da flere T-cellepopulasjoner vil bli påvirket av terapien.

EKSEMPEL 3

Nylig diagnostiserte IDDM- pasienter viser T- celle proliferative responser overfor hsp60. p277 ( Val"- Val'\ p! 2 og p32.

For å bestemme T-celleresponsene overfor forskjellige hsp60-peptider, ble lymfocytter

fra perifert blod av nylig diagnostiserte (2 uker til 4 måneder) IDDM-pasienter testet i en proliferasjonsanalyse. 10-20 ml blod ble tatt opp i sterile rør inneholdende heparin som antikoagulant og fortynnet i PBS 1:2. Perifere mononukleære celler (PBMC) ble isolert ved sentrifugering av blodet over et lymfoprep lag. PBMC ble testet for proliferasjon i triplikater, i nærvær av forskjellige antigener (10 ug/ml) i 6 dager ved anvendelse av inkorporering av [<3>H]tymidin som et mål for proliferasjon. De testede antigenene var humant hsp60 eller hsp60 peptidene p277 (Va^-Val1'), pl2, p32 og kontrollpeptidet p278. Den T-celle proliferative responsen ble angitt som stimuleringsindeks (SI): Forholdet mellom peptidstimulerte tymidininkorporering og bakgrunn (intet antigen tilsatt) tymidininkorporering av T-cellene.

Resultatene er oppsummert i tabell 4.

En stimuleringsindeks (SI) på mer enn 2,0 er ansett å være en positiv respons.

N.D. - Beke bestemt; p277 (V) = p277 (Val<6->Val<n>)

Det kan bli sett at de fleste av pasientene responderte overfor hsp60 (6/8) og at alle av de seks som responderte overfor hsp60 også responderte overfor minst et av de tre hsp60 peptidene: pl2, p32 eller p277 (Val6-Val11). Således, kan en respons til gruppen av peptider tjene til å karakterisere individene som responderer for hele hsp60 molekylet.

EKSEMPEL 4

T-Celle-proliferative responser.

Spontane T-celle respons hos prediabetiske NOD-mus ble detektert overfor mus p277 peptidet (Elias et al., 1991: Birk et al., 1996) og overfor større fragmenter av mus hsp60 molekylet som inneholdt mus p277 sekvensen (Birk et al., 1996). For å detektere andre T-celle epitoper på mus hsp60 molekylet, ble NOD-mus administrert forskjellige preparater med peptider som overlappet hsp60 sekvensen og det ble funnet at alle musene hadde sterke responser overfor både mus p277 og mus pl2 (figur 3). Andre peptider som er immunogene for NOD-mus, er MT-p278 peptidet (rester 458-474 i det mykobakterielle hsp60-molekylet) og GAD-p35 (restene 524-543 i GAD 65-molekylet). Figur 3 viser at MT-p278 er sterkt immunogent slik som mus p277 og mus pl2; GAD-p35 er også immunogent, men ikke så sterkt.

En langtids studie av hunnkjønns NOD-mus ved alder 3-16 uker viste ingen spontane responser overfor mus pl2 i deres milter (ikke vist), selv om responser overfor mus p277 og hele mus hsp60, ble sett. Således, av fire immunogene peptider: pl2 og p277 fra mus hsp60molekylet, GAD-p35 fra det diabetes-assosierte GAD65 molekylet og MT-p278, et fremmed immunogen, ble det kun detektert responser overfor mus p277 og MT-p278.

Peptidbehandling.

Ved å følge en protokoll som er vist å være effektiv med mus p277 (Elias et al., 1991; Elias og Cohen, 1994; Eliase og Cohen, 1995), ble grupper på 10 uker gamle NOD-mus behandlet ved en enkel subkutaninjeksjon av et peptid (100 mg) emulgert i IFA. Musene ble observert for utvikling av diabetes gjennom 8 måneder. Figur 4 viser at peptidene mus p277 og mus pl 2 var begge effektive i hemming av utvikling av diabetes (p<0,05). Derimot, behandling med peptider MT-p278 GAD-p35 var ikke forskjellig fra behandling med IFA alene. Totalt 3 eksperimenter viste hovedsakelig de samme resultater.

Antistoffer

Suksessfull behandling av STZ-indusert diabetes med mus peptid 277 var assosiert med forsvinningen av anti-peptid antistoffer hovedsakelig av IgGl og IgG2b isotyper (Elias og Cohen, 1996). De peptid-behandlede NOD-musene ble derfor undersøkt for deres serum antistoffer. Figur 5 viser at de to peptidene som er effektive i å stanse diabetes, mus pl 2 og mus p277, også var effektive i indusering av sterke antistoff titer av IgGl og IgG2b isotypene (P<0,001). IgGl og IgG2b antistoff-titerne var også signifikant større enn IgG2a antistoff titer i disse gruppene (p<0,001). Musene behandlet med peptider MT-p278 eller GAD-p35, responderte ikke så sterkt; ingen av de GAD-p35-behandlede musene fremstilte spesifikke IgGl antistoffer og kun to av de ti MT-p278-behandlede musene fremstilte antistoffer av IgGl isotypen. Musene behandlet med MT-p278 eller GAD-p35 fremstilte signifikant lavere titere av IgG2b antistoffer (P<0,001). Effektiviteten i hemming av diabetes var således assosiert med induksjonen av en antistoffrespons hovedsakelig av IgGl og IgG2b isotypene.

Forholdet mellom en effektiv terapeutisk respons og titeren av antistoff ble bekreftet ved en sammenligning av konsentrasjonen av blodglukose med konsentrasjonen av antistoffer i individuelle mus ved 7 måneders alder. Figur 6 viser at musene som hadde høyere titer av antimus pl2 antistoffer, hadde en tendens til å ha lavere blodglukosekonsetrasjoner; motsatt, hadde mus pl2-behandlede mus som fremstilte noe antistoff overfor mus pl 2, en tendens til å ha høyere blodglukose (P<0,002).

DISKUSJON

Resultatene presentert i dette eksemplet indikerer at peptid pl2 av mus hsp60 molekylet, som peptidet p277, kan være effektivt i behandling av mus nær utbruddet av åpen hyperglysemia. Derimot, ble spontane T-celle proliferative responser overfor pl2 i milt av prediabetiske NOD-mus ikke observert. En spontan antipeptid proliferativ respons detekterbar i periferien, er således ikke et krav for at peptid skal være effektiv i blokkeringen av den diabetiske autoimmune prosessen.

Funnet at peptid p277 ikke er det eneste hsp60 peptidet som kan modulere NOD diabetes, er signifikant. Det er sannsynlig at involveringen av hsp60 i NOD diabetes kan skyldes likheten mellom p277 peptidet i hsp60 og et ukjent molekyl som er mer spesifikk for p-celler (Cohen, 1991). Imidlertid er det meget usannsynlig at to forskjellige segmenter av hsp60, p277 og pl2, begge kan ligne segmentene av det foreslåtte, men ukjente p-cellemolekylet. Effektiviteten til pl2-peptidet i behandling støtter konklusjonen av det hsp60-lignende molekylet som er funksjonell i diabetes, er hsp60 selv (Birk et al., 1996).

Svikten til peptid MT-p278 og GAD-p35 å stanse utviklingen av diabetes indikerer at ikke et hvilket som helst selvantigen eller et hvilket som helst spontant T-celle proliferende antigen, kan bli benyttet for å stanse den autoimmune prosessen. Det er interessant at MT-p278 svikter i å indusere høye titer av antistoffer eller beskytte, til tross for det faktum at deres peptider er sterkt immunogene for T-celler (ikke publisert observasjon). Imidlertid, påvirker induksjon av antistoffer overfor en hvilken som helst spesifisitet, ikke nødvendigvis NOD-diabetes; behandling av NOD-mus med BS A som induserer høye titer av antistoffer så vel som sterke T-celleresponser (ikke vist), påvirker ikke utviklingen av diabetes (Elias og Cohen, 1994). Selv om GAD-p35 ikke ble runnet her å være så sterkt immunogent for T-celler som de andre peptidene (figur 3), har NOD-mus blitt rapportert å manifestere spontane T-celleresponser for deres peptider (Kaufman et al., 1989).

Til sist, kan assosieringen av effektiv behandling med induksjon av antistoffer spesifikke for peptidet, antyde at de terapeutiske effektene av pl2 og p277 kan være relatert til aktiveringen av Th2-type T-celler som er ansvarlige for å hjelpe til i induksjonen av spesifikke IgGl antistoffer, antistoffer regulert ved produksjon av IL-4 (Mossmann og Coffmann, 1993). Slike T-celler kan undertrykke Thl T-cellene antatt å være foreslått å være ansvarlig for skading av p-cellene (Katz et al., 1995; Liblau et al., 1995). Faktisk har det blitt funnet at p277 peptid-terapien av NOD-diabetes er assosiert med et utbrudd av IL-4 og IL-10 produserende T-celler i milten og et fall T-celler som produserer INF-y både i milt og i øyer (ikke publisert observasjon). Opptreden av peptidspesifikke antistoffer som bærer Th2 isotyper som respons for peptid-terapi, synes å være en indikator for en fordelaktig respons.

EKSEMPEL 5

Ytterligere peptider til hvilke IDDM-pasienter kan manifestere T-celle responser. Tjueseks nydiagnostiserte (1 til 16 uker etter IDDM diagnose) IDDM-pasienter ble registrerte. Pasientenes alder varierte fra 5 til 60 år. Pasientene ble undersøkt for sine perifere blod T-celle proliferative responser overfor humant hsp60 og humant hsp60 syntetiske peptider vist i tabell 1 og 5 som er deler av den humane hsp60 protein-sekvensen.

Pasientenes T-celler ble analysert også for deres proliferative responser overfor standard recall antigener slik som tetanus toxoid, Candida albicans og influensa, og responsene ble skåret som positive dersom stimuleringsindeksen (S.I.) var to eller større (se nedenfor).

Proliferering ble bedømt ved hjelp av den følgende protokoll:

Celleproliferering og celleprolifereirngsprotokoU.

50 ml perifert blod tilsatt 10 IU/ml heparin, ble trukket fra IDDM-pasienter eller fra friske kontroller. To volumer PBS (kalsium- og magnesiumfritt) ble tilsatt. Blod-PBS preparatet ble blandet ved anvendelse av en 10 ml pipette. Et volum på 10 ml Ficoll ble lagt under i blodblandingen, fulgt av sentrifugering med 2.000 omdreininger pr. minutt i 30 minutter ved romtemperatur (R.T.) ved 20-24°C (bremser av). De perifere blod T-cellene i buffy coaten ble høstet ved anvendelse av en 10 ml pipette og overført til et 50 ml testrør. Et volum på 30-40 ml PBS (kalsium- og magnesiumfritt) ble tilsatt til de høstede T-cellene. Dette ble så blandet og sentrifugert ved 1.000 omdreininger pr. minutt i 20 minutter ved romtemperatur (bremsen på).

Supematanten ble tatt av og pelleten av celler ble resuspendert i AJM-V-serumfritt dyrkningsmedium (Gibco, USA). Kulturmediet inneholder AJJM-V tilsatt 1% natrium-pyruvat, 1% L-glutamin (200 mM hver), 1% Hepes (1 M, pH 7,3). Alternativt, ble RPMI tilsatt 10% AB serum fra blodbanken benyttet. Celleblandingen ble så sentrifugert ved 2.000 omdreininger pr. minutt i 10 minutter ved RT (bremsen på). Supematanten ble igjen tatt av og pelleten av celler resuspendert i et mindre volum ferskt AJJM-V (10-20 ml). Cellene ble resuspendert og talt. Celletellingen og levedyktighetsanalyse ble utført ved anvendelse av trypanblå. For dette trinnet ble et hemacytometer og et lysmikroskop benyttet.

Cellekonsentrasjonen ble justert til 2 x IO6 celler/ml i AIM/V-medium. Et volum på 100 ul av celler pr. brønn ble overført til hver brønn i 96-brønners mikrotiterplate. Så ble 100 fil medium inneholdende to ganger den anbefalte antigenkonsentrasjonen (se listen nedenfor over antigener og konsentrasjoner) tilsatt. Analysen ble utført i kvaduplikater. Fire brønner ble analysert med celler og medium uten antigen som kontroll. Platene ble dyrket ved 37°C i en 5% CO2 fuktet inkubator i 7 dager. På den sjette dagen i dyrkningsperioden ble 1 uCi/brønn <3>H-tymidin tilsatt. Dyrkningsperioden fortsatte i 18 timer og ble så høstet. Celleproliferering ble analysert ved <3>H-tymidin inkorporering i DNA, bestemt ved anvendelse av scintillasjonsvæske og en betateller.

Proliferative responser ble målt ifølge tymidin 3H-inkorporert av T-cellenes DNA (Elias et al., 1991). Radioaktiv telling pr. minutt (CPM) ble sammenlignet med celler dyrket med de testede antigenene eller uten antigener (kun medium) som en kontroll. Prolifereringsverdiene ble representert som en stimuleringsindeksverdi (S.I.): gjennomsnittlig CPM med antigen dividert med gjennomsnittlig CPM uten antigen. S.I.-verdier større eller lik 2 ble ansett å være positive.

Resultatene viste at hyppigheten av huma hsp60 eller hsp60-peptid reaktive individer var høyere blant IDDM pasienter (84%) enn blant friske mennesker (30%). Fisher Exact Test p-verdi av forskjellen er 0,0044, som er meget signifikant.

Proliferative responser til to representative IDDM-pasienter og et friskt individ, overfor humant hsp60-protein, overfor hsp60 syntetiske peptider og forskjellige recall antigener, er vist i figurene 7,8 og 9. Tabell S viser to individuelle eksempler på hsp60 syntetiske peptider (pl9, p21) overfor hvilke ingen IDDM-pasienter responderte (se også figurene 10 A og 10 B).

Det kan bli sett at hver av pasientene responderte overfor recall antigener (Candida, tetanus, eller influensa) og overfor humant hsp60 protein og forskjellige humane hsp60 peptider. Kontrollperson responderte kun overfor kontroll recall antigenene.

Sekvensene av hsp60 syntetiske peptider overfor hvilke minst en av IDDM-pasientene responderte, er vist i tabell 1. Hver av disse peptidene har terapeutisk potensiale for behandling av IDDM.

Den foregående beskrivelse av de spesifikke utførelsesformer vil så fullt avdekke den generelle naturen til oppfinnelsen at andre kan ved anvendelse av fagmannens viten (inkludert innholdet av de her refererte sitater), enkelt vil kunne modifisere og/eller tilpasse for forskjellige anvendelser slik som spesifikke utførelsesformer, uten unødig eksperimentering, uten å forlate det generelle konseptet ved foreliggende oppfinnelse. Derfor, er slike tilpasninger og modifikasjoner ment å være innen betydningen av rammen av ekvivalens av de beskrevne utførelsesformer basert på læren og guidingen presentert heri. Det må forstås at de her benyttede fraser eller terminologi er for deskriptive formål og ikke for begrensende formål slik at terminologien og frasologien i foreliggende beskrivelse er ment å bli tolket av fagmannen i lys av læren og guidingen gitt heri i kombinasjon med fagmannens vanlige viten.

REFERANSER

Bach JF (1994) Insulin-Dependent Diabetes Mellitus as an Autoimmun Disease. Endocrin Reviews 15:516-542.

Bendelac A, Carnaud C, Boitard C, Bach, JF. (1987). Syngeneic transfer of autoimmune diabetes from diabetic NOD ice to healthy neonates. Requirement for both L3T4+ and Ly+ -2+ T cells. J. Exp Med. 166: 823-32.

Birk OS, Elias D, Weiss AS, Rosen A, van-der Zee R, Walker MD, Cohen IR. (1996) NOD mouse diabetes: The ubiquitous mouse hsp60 is a beta-cell target antigen of autoimmune T-cells. J. Autoimmun. 9:159- 166.

Bowman MA, Leiter EH and Atkinson MA. (1994). PreventionofdiabetesintheNOD mouse: implications for therapeutic intervention in human disease. Immunoloev Todav.

15:115-20.

Castano L. Eisenbarth GS. (1990) Type-I diabetes: a chronic autoimmune disease of human, mouse and rat. Annu Rev Immunol. 8:647-79.

Cohen JR. (1991) Autoimmunity to chaperonins in the pathogenesis of arthritis and diabetes. Annu Rev Immunol 9:567-589.

Elias, Dana. (1994) The NOD mouse: A model for autoimmune insulin-dependent diabetes. Autoimmune Disease Models. A Guidebook. pp 147-61.

Elias, D, Cohen JR. (1995) Treatment of autoimmune diabetes and insulitis in NOD mice with heat shock protein 60 peptide p277. Diabetes 44:1132-1138.

Eliase D, ReshefT. Birk Os, van der Zee R, Walker MD, Cohen JR. (1991) Vaccination against autoimmune mouse diabetes with a T-cell epitope of the human 65 kDa heat schock protein. Proe. Nati Acad Sei USA. 88:3088-91.

Elias D and Cohen IR (1994) Peptide therapy for diabetes in NOD-mice. The Lancet. 343:704-706.

Elias D, Cohen IR. (1996) The hsp60 peptide p277 arrests the autoimmune diabetes induced by the toxin streptozocin. Diabetes fin press).

Katz JD, Benoist C, Mathis D. (1995) T helper cell subsets in insulin-dependent diabetes. Science 268:1185-1188.

Kaufmann DL, Clare-Salzler M. Tian J, Fortshuber T, Ting, GSP, Robinson P, Atkinson MA, Sercarz EE, Tobin AJ, Lehmann PV. (1993). Spontaneous loss of T-cell tolerance to glutamic acid decarboxylase in murine insulin-dependent diabetes. Nature. 366:69-72.

Liblau RS, Singer Sm, McDevitt HO. (1995). Thl and Th2 CD4+ T cells in the pathogenesis of organ-specific autoimmune diseases. Immunol Today 16:34-38.

Mossmann TRR, Coffman RI. (1989) TH1 and TH2 cells: different pattems of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annu Rev Immunol 9:145-173.

Tisch R, Yang XD, Singer SM, Liblau RS, Fuggar L, McDevitt HO: (1993) Immune response to glutamic acid decarboxylase with insulitis in non-obese diabetic mice. Nature. 366: 72-75.

Claims (14)

1. Peptid, karakterisert ved at det utgjøres av peptidet p32 bestående av aminosyrerester nr. 466-485 ifølge SEQ ID NO:l, og salter og åpenbare derivater derav med i størrelsesorden den samme biologiske aktivitet.

2. Preparat, karakterisert ved at det omfatter et peptid ifølge krav 1 sammen med et peptid valgt fra gruppen bestående av p277, p277(Val<6>), p277(Val<11>) og p277(Val<6->Val<1>').

3. Fremgangsmåte for diagnostisering av nærværet eller begynnelsen av insulinavhengig diabetes mellitus (IDDM) hos en pasient, karakterisert v e d at den omfatter testing in vitro av blod eller urin til nevnte pasient med et peptid ifølge krav 1 som antigen for nærværet av antistoffer eller T-celler som er immunologiske reaktive med humant hsp60.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at den omfatter testing av blod eller urin til nevnte pasient for nærværet av anti hsp60 antistoffer eller av en T-celle som immunoreagerer med hsp60, hvorved et resultat som indikerer det positive nærværet av anti hsp60 antistoffer eller av en T-celle som immunoreagerer med hsp60 indikerer en høy sannsynlighet for nærværet eller begynnelsen av IDDM.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 3 eller 4, karakterisert ved at blodet eller urinen til nevnte pasient blir testet for nærvær av anti hsp60 antistoffer for eksempel ved en radioimmunanalyse eller en ELISA-test.

Sett for diagnostisering av nærværet av IDDM ved testing for nærværet av anti-hsp60 antistoffer ifølge fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av kravene 3 til 5, karakterisert ved at settet omfatter: (i) et antigen som er et peptid ifølge krav 1; (ii) et merket antistoff som er i stand til gjenkjenning av den ikke-variable regionen av nevnte anti-hsp60 antistoffer som skal detekteres.

7. Sett ifølge krav 6, karakterisert ved at antigenet er immobilisert som en fastfase, settet ytterligere omfatter instruksjon for anvendelse av settet i diagnosen av IDDM og at merket er valgt fra gruppen omfattende radioisotoper, enzymer, kromoforer og fluoroforer.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 3 eller 4, karakterisert ved at blodet fra nevnte pasient blir testet for nærvær av en T-celle som immunoreagerer med hsp60, en testmetode som omfatter en T-celle proliferasjonstest omfattende de følgende trinn: (i) preparering av en mononukleær cellefraksjon inneholdende T-celler fra en blodprøve oppnådd fra nevnte pasient; (ii) tilsetting av nevnte mononukleære cellefraksjon et antigen i form av et peptid ifølge krav 1; (iii) inkubering av nevnte cellefraksjon i nærvær av nevnte antigen i en passende tidsperiode og under passende dyrkningsbetingelser; (iv) tilsetting av et merket nukleotid til den inhiberte cellekulturen av (iii) ved en passende tid før slutten av nevnte inkuberingsperiode for å gi inkorporering av nevnte merkede nukleotid i DNA til proliferende T-celler; og (v) bestemmelse av mengden prolifererende T-celler ved analyse av mengden merket nukleotid inkorporert i nevnte T-celler.

Sett for diagnostisering av nærværet av IDDM ved testing av nærværet av en T-celle som immunoreagerer med hsp60 ifølge fremgangsmåten ifølge hvilket som helst av kravene 3,4 og 8, karakterisert ved at det omfatter: (i) et antigen i form av et peptid ifølge krav 1; (ii) et merket nukleotid; og (iii) et passende medium for dyrking av lymfocytter.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 3 og 4, karakterisert ved at blodet fira nevnte pasient blir testet for nærvær av en T-celle som immunoreagerer med hsp60 ved en testmetode som omfatter en T-celle cytokinresponstest omfattende de følgende trinn: (i) preparering av en mononukleær celle-fraksjon inneholdende T-celler fra en blodprøve oppnådd fra nevnte pasient; (ii) tilsetting til nevnte mononukleære celle-fraksjon et antigen i form av et peptid ifølge krav 1; (iii) inkubering av nevnte celle-fraksjon i nærvær av nevnte antigen i en passende tidsperiode og under passende dyrkningsbetingelser; (iv) måling for nærværet av et cytokin utskilt av de resonderende lymfocyttene inn i mediet.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at cytokinet er DFN-y, JL-2, IL-4, JL-6, IL-10, TNFa, eller TGFp.

12. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter et peptid ifølge krav 1 og en farmasøytisk akseptabel bærer.

Farmasøytisk sammensetning for forhindring eller behandling av IDDM, karakterisert ved at den omfatter et peptid ifølge krav 12 og en farmasøytisk akseptabel bærer.

14. Anvendelse av et peptid ifølge krav 1 for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for behandling av IDDM.