CN1102598C

CN1102598C - 由人热激蛋白60衍生的新型肽类及其组合物和应用

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Publication number: CN1102598C
Application number: CN96196403A
Authority: CN
Inventors: 伊伦·R·科恩; 戴娜·埃利亚斯; 里夫卡·阿布拉菲亚; 亚娜·博茨科娃
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1995-06-30
Filing date: 1996-07-01
Publication date: 2003-03-05
Anticipated expiration: 2016-07-01
Also published as: CZ295110B6; ES2239770T3; NO976094D0; KR19990028640A; EP0845943B1; AU6484596A; CN1193889A; IL122757A0; US6682897B1; EP0845943A4; IL122757A; KR100454554B1; MX9800191A; UY24270A1; AU710882B2; DK0845943T3; WO1997001959A1; EP0845943A1; AR003446A1; NO976094L

Abstract

本发明披露了一些新型肽类，为人60KDa热激蛋白(hsp60)的一些表位(抗原决定簇)，可用于诊断和治疗胰岛依赖性糖尿病(IDDM)。还披露了含这些肽的医药组合物，和用于诊断IDDM的试剂盒。

Description

由人热激蛋白60衍生的新型肽类及其组合物和应用

发明领域

本发明是关于一些新型肽类即人60KDa热激蛋白(hsp60)的表位(抗原决定簇)和包含用于诊断与治疗胰岛素依赖性糖尿病(IDD M)的一些医药组合物。

发明背景

1型糖尿病，或者IDDM，是一种由T细胞引起的自体免疫疾病，该T细胞攻击和消灭位于胰岛中产生胰岛素的β细胞(Castano和Eisen-barth，1990)。最终成为IDDM的自体免疫过程，开始和发展时没有症状。只有当β细胞累积损失超过残留β细胞供给胰岛素的能力(量)时，这种病才在临床上有所表现。的确，葡萄糖体内平衡稳定的破坏和临床IDDM，被认为仅在80-90％的β-细胞被免疫系统灭活后才发生。因此，被确诊患有IDDM的病人，必然处于其β细胞自体免疫破坏的晚期阶段。而且，初期的临床前糖尿病的诊断，只能在自体免疫过程开始之后通过检测β细胞自体免疫性的免疫学标示物而知。因而，医疗的探索是要找到一个安全的、专一的和有效的方法来关闭已经处于发展中的自体免疫过程。

本发明的发明者们以前曾经考察了这一问题，是通过研究NOD(非肥胖型糖尿病)品系小鼠正在发展中的一些自发性糖尿病，NOD小鼠被认为是一种人IDDM的可信模型(Castano and Eisenbarth，1990)。NOD小鼠大约生长4周时产生了胰岛炎，它开始为一种轻微的胰岛周围浸润并发展成严重的胰岛内炎症。证实为胰岛素缺乏的高血糖症，在我们被试群体中约生长14-17周的雌鼠中，开始产生。在生长35-40周时，几乎所有的雌NOD小鼠都得了严重的糖尿病并在无胰岛素治疗的情况下大多数死亡。雄性NOD小鼠有较低的发病率，原因还不清楚。NOD小鼠的糖尿病已证明是由自体免疫T细胞引起(Bendelac et al.，1978)。

对各种抗原的T细胞的反应性和自体抗体，已经在人IDDM病人身上及NOD小鼠体内检测到(Elias，1994)，并且还不清楚是否对任何一个单一的靶抗原的免疫性为该病的主要原因。除了对病因的探讨之外就是对治疗方法的探讨。

已经证明，初始NOD小鼠体内自体免疫过程能够得到预防，办法是将小鼠在产生糖尿病之前进行各种处理，诸如限制饮食，病毒感染，或者免疫系统的非特异性刺激(Bowman et al.，994)。NOD糖尿病也可通过对抗原谷氨酸脱羧酶诱发前糖尿病小鼠的免疫耐受性而得到预防(Kaufman etal，1993；Tisch et al.，1993)。

在NOD雌鼠体内自生发展的胰岛素依赖性糖尿病已证明与各种自身抗原免疫反应性有联系(Bach，1994)。在这些抗原中，明显的是来自哺乳动物60KDa热激蛋白(hsp60)分子序列的P277肽。这相当于人hsp60分子中的残基437-460(Elias et al.，1991，以色列专利申请号NO.94241，PCT专利申请公开WO90/10449)。这种人P277肽具有如下序列：

Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp(a.a.437-460 of SEQ ID NO：1)

前糖尿病NOD小鼠显示出自生的致糖尿病T细胞应答，即对hsp60和对人(2)或鼠P277肽(3)一些变异体作出应答。小鼠和人的肽的区别在于1个氨基酸，这些肽是免疫学上交叉反应的(3)。小鼠的某些不易患糖尿病的品系，例如C57BL/6，当用共价共轭于一外来免疫原载体分子(4)上的P277进行免疫时，便会出现短暂的高血糖和胰岛炎。并且C57BL/KSJ品系的小鼠会产生对hsp60和对P277的自发T细胞应答，在用能诱发自体免疫糖尿病(5)的非常低剂量β-细胞毒素链脲菌素(STZ)处理之后。

除涉及疾病的表现之外，肽P277还表现出在治愈自体免疫过程是有功能作用的：皮下给药在不完全Freund佐剂(IFA；矿物油)中的P277，会导致阻止年青NOD小鼠(2)或有晚期胰岛炎的已生长12-17周NOD小鼠(6，7)的疾病发展。无论人(6，7)和小鼠(3)的P277的变异体，都是有效的。在MHC11类启动子上转入hsp60基因的NOD转基因小鼠，显示出向下调节它们的自发T-细胞增殖应答，并且大部分小鼠可避免产生糖尿病(8)。而且，对一些C57BL/KsJ小鼠施用P277，能够抑制自体免疫糖尿病的产生，在曾经接受早期很低STZ剂量的一些小鼠中；但用GAD65分子肽治疗小鼠是无效的(9)。

P277肽的一些变异体，其中有一个或两个半胱氨酸残基在位6和11上被缬氨酸残基代替，被分别定名为P277(val⁶)，P277(val¹¹)和P277(val⁶-val¹¹)，这已描述于相应的以色列专利申请NO.112094，并显示出在治疗糖尿病方面活性如同P277。

本发明的目的是提供另外一些人hsp60肽类，这些肽类将有效地用于诊断和治疗IDDM。

发明概述

在研究人hsp60分子的一些片段和肽类过程中，料想不到地发现一些IDDM病人和NOD小鼠会对另外一些hsp60 T细胞抗原决定簇有应答，后者可用于IDDM的诊断和治疗。这些表位(抗原决定簇)本身或与P277或P277变异体相结合，这些变异体是选自P277(val⁶)，P277(val¹¹)和P277(val⁶-val¹¹)，可以改善治疗的有效性。

这些新肽类示于表1

表1.Hsp 60合成肽类及其序列

肽类 SEQ ID NO：1中的残基序号氨基酸序列(一字编码)

p3 31-50 KFGADARALMLQGVDLLADA

p10 136-155 NPVEIRRGVMLAVDAVIAEL

p11 151-170 VIAELKKQSKPVTTPEEIAQ

p12 166-185 EEIAQVATISANGDKEIGNI

p14 195-214 RKGVITVKDGKTLNDELEII

p18 255-274 QSIVPALEIANAHRKPLVIIA

p20 286-305 LVLNRLKVGLQVVAVKAPGF

p24 346-365 GEVIVTKDDA4LLKGKGDKA

p29 421-440 VTDALNATRAAVEEGIVLGG

p30 436-455 IVLGGGCALLRCIPALDSLT

p32 466-485 EIIKRTLKIPAMTIAKNAGV

p35 511-530 VNMVEKGIIDPTKVVRTALL

p39 343-366 GKVGEVIVTKDDAM

另外一些hsp60肽类，包括定名为P278(相当于在人hsp60序列中的458-474位)，P19(相当于在人hsp60序列中的271-290位)以及P21(相当于在人hsp60序列中的301-320位)，已证明是无效的。已发现，P278的氨基末端与有效P277肽有三个残基(NOD)的重迭及P278的羧基末端与有效P32肽由有9个残基(EIIKRTLKI)的重迭。因而P32的其余11个残基(PAMTIAKNAGV)是关键性的。

因而本发明涉及示于表1中的肽类，及其盐类和功能衍生物。

本发明进一步的目的是提供一些方法和试剂盒，用本发明的肽类进行早期诊断IDDM。在IDDM产生过程中，动物会表达hsp60分子，或者一些与其有交叉反应的分子，它们能找到适当途径进入动物的血液和尿中。它们也能表达专门指向这些分子的一些抗体和T细胞。因而，在β细胞被完全破坏和病人注定要成为终生糖尿病之前，血液或尿中存在的hsp60(或与其为交叉反应的一些分子)或对其具有特异性的一些抗体或T细胞，都可用于检测IDDM过程。

在某一病人体内IDDM的存在或初始，可通过检测病人的血液或尿而诊断，即利用本发明的肽P12或P32作为抗原检测其中存在的能与人hsp60发生免疫反应一些抗体或T细胞。

因而，本发明提供了一种方法用于诊断病人体内IDDM的存在或初始，包括用本发明的一种肽作为抗原来检测所说病人是否存在能与hsp60产生免疫反应的抗-hsp60抗体或T细胞，以此一种表明存在能与hsp60产生免疫反应的抗hsp60抗体或T细胞的阳性结果，即指示IDDM存在或初始的高的几率。

在诊断IDDM的方法中，可对病人检测是否存在抗hsp60抗体，其中所说的检测方法可包括一放射性免疫试验或一ELISA试验。

对病人还可检测其是否存在能与hsp60进行免疫反应的T细胞。在本发明这方面一实施例中，试验方法包括一T细胞增殖检验，该检验包括如下步骤：

(I)由病人身上采集的血样中制备含T细胞的单核细胞级分；

(II)向所说的单核细胞级分中添加一种选自本发明的肽的抗原；

(III)在所说的抗原存在下温育所说的细胞级分，经过一适当时间和于一些适当的培养条件下；

(IV)在温育期结束前的适当时间向(III)的细胞培养物中，添加一种标记的核苷酸以使所说的标记的核苷酸掺入增殖的T细胞的DNA中；以及

(V)通过分析掺入到所说T细胞中的标记核苷酸的量来测定增殖T细胞的量。

在上述步骤(IV)中，所说的标记核苷酸最好是³H-胸(腺嘧啶脱氧核)苷。测定增殖T细胞的量，是用标准方法通过计算T细胞的刺激指数而得。

在本发明这方面的另一实施例中，试验方法包括T细胞的细胞因子(Cytokine)应答试验，其中步骤(I)至(III)与上述T细胞增殖试验相同，及在第4步(IV)中细胞因子，例如由应答的淋巴细胞分泌到培养基中的IFN-r，IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，TNFα或TGFβ等的存在，是用标准方法用商品试剂盒检测的。

另一方面，本发明提供了一种体内检测方法，其中将选自本发明一些肽类的一种抗原通过皮下注射到病人体内，并且观测出现的可测皮肤反应(延迟类型的过敏性；DTH)。

本发明还涉及一种进行这些试验的装置以及进行这些试验用的一些试剂盒(Kits)。这些试剂盒可被制备成可用于完成本发明需进行各种试验的任何一种。每个这样的试剂盒，包括要进行一项试验或固定数目的一些试验需要的所有材料。例如可用于测定抗hsp60抗体的存在的试剂盒可包含有本发明的一种固相固定化肽和一标记的抗体，该标记抗体能够识别要检测的抗hsp60抗体的恒定区域，例如标记的抗人Fab。这种试剂盒还可包括使用这种试剂盒的说明书及盛放试剂盒材料的一些容器。任何普通标记物均可使用，例如放射同位素，酶，发色团或荧光团。典型的放射同位素是碘-125或硫-35。用于这一目的的酶类，包括辣根过氧化物酶，辣根半乳糖苷酶及碱性磷酸(酯)酶。

通过检测抗hsp60抗体的存在来诊断IDDM存在的试剂盒包括：

(I)选自本发明肽类的一种抗原；及

(II)能够识别要检测的抗hsp60抗体的恒定区域的一种标记杭体。

通过检测能与hsp60进行免疫反应的T细胞的存在，来诊断IDDM存在的一试剂盒包括：

(I)选自本发明肽类的一种抗原；

(II)一种适用的培养基，用于培养淋巴细胞(T细胞)；及

(III)一种标记的核苷酸用于T细胞增殖试验，或一种细胞因子，例如干扰素-伽马试剂盒，用于细胞因子试验。

对体内试验，该试剂盒仅包括一种本发明的肽，为注射用的适当形式。

本发明进一步涉及一种用于预防或治疗IDDM的方法。接种本发明的一种抗原肽能够向下调节对该抗原的自体免疫性，并有效地产生对IDDM的自体免疫过程的抵抗性。同样也可以接种对这些抗原有特异性的T细胞或其碎片或活性部分，该T细胞以减毒或无毒力形式存在或在经过处理以改善其抗原性之后。如果病人已处于IDDM的临床前发病阶段，注射这样一种抗原或T细胞(或其部分)能够向下调节这种抗原的自体免疫性，因而在遭受严重的，永久性损伤之前能够抑制自体免疫。这种肽还能用作一种治疗剂来抑制自体免疫过程，甚至已远远发展到后期，例如本发明的一些发明人最近在实验室用肽P277治疗NOD小鼠的结果所示(Elias and Cohen，1994)。

因而，本发明提供了一种预防或治疗胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)的制剂，包含有：(a)对一种与本发明的肽具有免疫交叉反应性的蛋白或肽已产生出特异性的T细胞，这种细胞已在上述肽存在下温育而活化；(b)已被照射或以其它方式减毒的上述T细胞；(c)已经过处理的上述T细胞，处理包括利用流体静力学压力进行压力处理，用化学交联剂处理和/或用一种细胞骨架交联剂处理；(d)由上述(a)、(b)或(c)脱落的一些碎片或表面蛋白；或者(e)基本上由对所说的蛋白有特异性的上述(a)受体的可变区域所组成的一种肽，或其盐、功能衍生物、前体或活性部分。

在本发明一优选实施例中，该制剂包含有人T细胞，它在体外与本发明的所说的肽接触已产生出特异性。

本发明也提供了一种预防和治疗IDDM的药物组合物，包括一种药用可接受的载体和作为活性组分的、有效量的本发明的肽、其盐或功能衍生物。

本发明进一步涉及一种预防和治疗IDDM的方法，包括给需要治疗的病人施用一种医药组合物，其中含有本发明的一种肽，其盐或功能衍生物，或者一种制剂，其中包含有对本发明的上述肽已产生出特异性的T细胞。

附图简述

图1说明本文所提及的肽在人hsp60分子完整序列上所处位置。

图2说明NOD小鼠对人hsp60肽P12，P32，P277(val⁶-val¹¹)及P278的T-细胞增殖应答。

图3是表示NOD小鼠T-细胞对一些肽的增殖应答。将3个NOD鼠为一组的n组鼠用溶于IFA(不完全Freund佐剂)中的肽类鼠P12，鼠P277，GAD-P35及MT-P278处理，每个的剂量为25μg在IFA中。在10天之后将导流淋巴结取出并试验其对浓度为5、10、20及50μg/ml相当的肽的增殖应答。显示了在最佳浓度20μg/ml时的刺激作用。在一些培养基对照中得到了如下范围的cpm计数：小鼠P12，811；小鼠P277，1243；MT-P278，698；以及GAD-P35，1430。肽鼠P38是由鼠hsp60(556-573)衍生的一种肽，它与被试验的一些肽类没有序列同源性并被用作一种特异性的负对照样品。这些实验是所完成的三次实验的代表。每次实验作三份，其SD值由一些柱状图表示。在各肽类之间无交叉反应性(未示出)。

图4显示了肽施用对糖尿病的作用。10-20 NOD小鼠的鼠组，是生长10周的小鼠，用溶于IFA的100μg的鼠P12.P277，P35-GAD及MT-P278或用IFA单独处理。对这些小鼠每月抽取血样并观察高血糖的发作。与单独IFA处理的对照组相比较，用P12和P277治疗的小鼠大大地得到了保护，P＜0.05。

图5表示对肽处理应答的IgG1，IgG2a及IgG2b抗体同种型.小鼠的处理如对图4附图说明所述。对单个样品进行针对小鼠P12A；P277B；GAD-P35C；及MT-P278D的IgG1，IgG2a及IgG2b同种型抗体的分析。在两次实验中得到了相似的效果。这些结果以每组中的10个单独小鼠在405nm光吸收(O.D即光密度)表示。在组A和组B中的IgG1，IgG2b抗体存在的水平与C和D组相比显著水平为P＜0.001。在组A和B中与IgG2a抗体相比在IgG1与IgG2b抗体的水平之间的差别是显暑的(P＜0.001)。在各抗体之间无交叉反应性(未示出)。

图6表示了各抗体与血液葡萄糖之间没有关系。将一组NOD雌鼠用P12(10个小鼠)或用IFA单独处理(9个小鼠)，如对图4的插图描述中所述。抗P12特异性抗体的量(ELISA在血清稀释1∶50情况下的光密单位，对生长7个月的小鼠测量)对生长7个月小鼠血液葡萄糖浓度作图。高抗体与血液葡萄糖之间的相关程度，是P＜0.002。

图7表示一个IDDM病人供血者的T细胞增殖应答(S.I.，即刺激指数)，即对回忆(recall)抗原，对hsp60蛋白以及对hsp60合成肽类的应答。

图8表示一个健康供血者的T细胞增殖应答，(S.I.)，即对回忆抗原，对hsp60及对hsp60合成肽类的应答。

图9说明另一IDDM病人供血者的T细胞增殖应答(S.I)，即对回忆抗原，对hsp60以及对hsp60合成肽类的应答。

图10A和10B说明两个IDDM病人供血者的T细胞增殖应答，(S.I)，即对hsp60合成肽类的应答。

发明的详细描述

在本发明说明书和权利要求中所提到的“本发明的肽”或任何一个个体名称如“肽P12”或“肽P32”等，也包括它们的盐类和功能衍生物，只要它们保留了这些肽对糖尿病的生物学活性。

本发明的肽类的“盐类”在发明中是指它们的生理学上可接受的有机和无机盐类。

本文所使用本发明的肽类的“功能衍生物”包括这样一些衍生物，它们可通过本技术领域已知的方法制自在氨基酸残基上以侧链存在的一些官能团或N-或C-末端基团，只要保持生理上的可接受性，亦即它们不破坏这种肽的活性，对含有它们的药用组合物不赋予毒性以及对其抗原性能没有相反的效应，它们也包括在本发明中。

这些衍生物可以，例如，包括脂肪族羧基酯类，羰基酰胺类即羰基与氨或与伯胺或仲胺的反应产物，氨基酸残基的自由氨基与酰基链段(例如烷酰基或碳环芳酰基)反应形成的一些N-酰基衍生物，或自由羟基(例如丝氨酸或苏氨酸残基)与酰基链段所形成的一些O-酰基衍生物。

本发明的肽类，可在医药组合物中用作免疫原，特别是用于减轻和治疗IDDM的疫苗，以及作为诊断组合物中的抗原用于诊断IDDM。用已知方法制备的这些药物或诊断组合物，也构成本发明的一部分。

本发明的医疗组合物可以口服或进行非肠胃道给药，例如皮下、肌肉、静脉、鼻内或直肠给药。

通过下面的一些实施例和附图对本发明作非限制方式的说明。

实施例

材料与方法

(I)小鼠：NOD/Lt品系的一些近亲繁殖的雌鼠，是由以色列雷霍沃特的魏茨曼(Weizman)科学研究所的动物繁殖中心提供，或由在BarHarbor，ME的Jackson实验室提供。这些小鼠在生长14至17周自发产生了类似人IDDM的自体免疫糖尿病。

(II)抗原。肽类是在魏茨曼科学研究所的有机化学部使用一自动多种肽合成器(Abimed model AMS 422；Langenfeld，德国)合成的，是按照该公司的N-a-芴基甲氧基羰基(Fmoc)合成方法进行的。粗产物的纯化，是用反相HPLC(高性能液体色谱)在半制备C8一柱(Lichrosorb RP-8,7mm，250×10mm，Merck，达姆斯塔特，德国)上进行。通过线性梯度洗脱得到了各肽的洗脱液，该线性梯度是在0.1％三氟乙酸溶于水中与0.1％三氟乙酸溶于75％乙腈在水中(V/V)之间形成的。一些单一肽产品的纯度测定，是用分析反相HPLC和氨基酸分析器进行。肽MT-P278来自分支杆菌属hsp60的序列(431-447)。肽P277是在天然序列中位6和位11的半胱氨酸(C)被缬氨酸(V)所替代而产生的。两个C残基被V替代，大大增强了这种肽的稳定性，而不影响其免疫活性：V-取代的肽，与天然肽是完全交叉反应的，经过T细胞和抗体试验。除非特别说明，所指的是人的序列。鼠P12和鼠P38肽类，都是衍生自鼠hsp60分子并分别相当于其168-188，437-460以及556-573序列。肽GAD-P35是衍生自GAD65分子(524-543)。本文中所用的所有肽类的氨基酸序列，列示于表2。

表2.合成肽类及其序列

肽类 SEQ ID NO：氨基酸序列(一字编码)

p3 1(31-50) KFGADARALMLQGVDLLADA

p10 1(136-155) NPVEIRRGVMLAVDAVIAEL

p11 1(151-170) VIAELKKQSKPVTTPEEIAQ

p12 1(166-185) EEIAQVATISANGDKEIGNI

p14 1(195-214) RKGVITVKDGKTLNDELEII

p18 1(255-274) QSIVPALEIANAHRKPLVIIA

p20 1(286-305) LVLNRLKVGLQVVAVKAPGF

p24 1(346-365) GEVIVTKDDAMLLKGKGDKA

p29 1(421-440) VTDALNATRAAVEEGIVLGG

p30 1(436-455) IVLGGGCALLRCIPALDSLT

p32 1(466-485) EIIKRTLKIPAMTIAKNAGV

p35 1(511-530) VNMVEKGIIDPTKVVRTALL

p39 1(343-366) GKVGEVIVTKDDAM

p19 1(271-290) LVIIAEDVDGEALSTLVLNR

p21 1(301-320) KAPGFGDNRKNQLKDMAIAT

p278 1(458-474) NEDQKIGIEIIKRTLKI

p277(Val) 2 VLGGGVALLRVIFALDSLTPANED

mouse p12 3 EEIAQVATISANGDKDIGNI

MT-p278 4 EGDEATGANIVKVALEA

GAD-p35 5 SRLSKVAPVIKARMMEYGTT

mouse p38 6 PGMGAMGGMGGGMGGGMF

(III)对肽类应答而产生的T细胞增殖

小鼠，将生长9周的NOD小鼠或其它品系的小鼠在后足爪垫中用0.1ml的含有25μg肽的乳液进行免疫，肽是置于完全Freund佐剂(CFA；Difco，Detroit，MI)与等体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。在10天后取出导流蝈淋巴结并在各种肽类(5μg/ml)存在下使用[³H]-胸(腺嘧啶脱氧核)苷掺入法(Elias et al.，1991)检测三份培养基中的淋巴细胞悬浮物中的增殖情况。这些结果以刺激指数(SI)表示：在试验肽存在下的平均cmp与无肽的对照培养物的平均cmp之比。标准误差总是小于平均值的10％。

(IV)治疗处理和随后观察。将在PBS中的100mg肽类与等体积的IFA进行乳化并通过皮下注入到生长10周的NOD雌鼠，如已述方法(Elias andcohen，1995)。对照小鼠的给药仅为在IFA中的等体积的PBS(磷酸盐缓冲盐水)。用血液葡萄糖传感器(Medisene.INC.，Waltham，MA)每月监视在上午10点钟的非禁食血液葡萄糖。血液葡萄糖大于11.1mmol/L的小鼠被认为已患糖尿病；这种葡萄糖浓度比在无糖尿病小鼠中测得的平均血液葡萄糖浓度大3个标准偏差点(deviations)(Elias and Cohcn，1995)。胰岛的组织观察是用苏木精和暑红(四溴荧光素)对切片染色进行。这些切片由两个观察者单独评定，他们不了解各鼠组的实情况。利用卡方试验(Chisquare test)来确定各种治疗之间的统计学差别。

(V)血清抗体，小鼠每月取血检测抗体应答。用已述方法进行ELISA试验(ELisa et al.，1991)。简言之，将一些平底Maxisorb板(Nunc，Roskilde，丹麦)涂抹以检测抗肽抗体，涂抹以100ml/孔的肽于PBS中，浓度为10mg/ml，室温经过2小时，随之在4℃温育过夜。在用肽温育之后，将这些板冲洗并以7％BSA(Sigma)在PBS中在37℃封闭2小时。将血清稀释1∶50然后加入，在37℃经过2小时，随后用100ml/每孔的山羊抗小鼠IgG(伽马链FC特异的)温育2小时，后者是结合于碱性磷酸酯酶(Jackson，philadelphia，宾夕法尼亚)。在冲洗之后，将这些板与底物，二乙醇胺(Sigma)温育并用-ELISA读出机在405nm读出。

实施例1.NOD小鼠中hsp60表位的定位

试验NOD小鼠中hsp60肽类P12.P32，P277(val⁶-val¹¹)及P278的免疫原性，是在鼠后足爪垫中用在CFA中乳化了的肽类使鼠免疫，在10天之后，试验排出淋巴结细胞的增殖应答，如上节(III)所述。如表2所示，肽类中P277(val⁶-val¹¹)，P12及P32是强烈免疫原的，而P278是非免疫原的。

实施例2

用P277(val⁶-val¹¹)，P12或P32治疗NOD小鼠

为了试验看P12和P32肽类是否能够像P277(val⁶-val¹¹)一样来阻滞糖尿病的发展，将P277(val⁶-val¹¹)，P12或P32肽类(100μg在0.1ccIFA乳液中)以皮下注射施用给Jackson实验室(Bar-Harbor，ME)的10-12个生长9周的NOD/Lt雌鼠。糖尿病，确定为稳定血液葡萄糖水平超过11.1mmol/l，对生长25周的小鼠作了检测。对照小鼠是未给药处理或用P278处理。

如表3所示，P277(val⁶-val¹¹)，P12及P32治疗糖尿病是有效的，在未处理的小鼠中或在P278处理的小鼠中糖尿病的发病率为90％，而P277(val⁶-val¹¹)，P12及P32处理的小鼠的发病率分别为10％、20％、30％。另一方面，对照P278肽没有治疗作用。

表3 hsp60肽类的治疗效果

肽糖尿病(％) 死亡率(％) 受试者数目

none 90 50 100

p278 90 45 100

p277(val⁶-val¹¹) 10^* 5^* 100

p12 20^* 10^* 10

P32 50^* 25^* 20^*P＜0.05

可能两种或三种hsp60表位肽类相结合会比仅一种肽更有效，这由于多种T细胞种群在这样的治疗中受到影响。

实施例3

刚新诊断的IDDM病人对hsp60，277(val⁶-val¹¹)，P12及P32显示出T细胞增殖应答

为测定T细胞对各种hsp60肽类的应答，曾从最近诊断(2周至4个月)为IDDM患者的外周血液中取淋巴细胞，试验T细胞增殖。将10-20ml的血液移入含有肝素(heparin)作为凝血剂的无菌管中用PBS 1∶2稀释；分离外周单核细胞(PBMC)，通过用在Lymphoprep Layer离心分离血液。检验PBMC在三份样品中T细胞增殖，在各种抗原(10μg/ml)存在下经过6天，使用[³H]胸(腺嘧啶脱氧核)苷掺入法作为增殖的检测方法。所试验的抗原为人hsp60或hsp60肽类P277(val⁶-val¹¹)，P12及P32以及对照肽P278。T细胞的增殖应答可用刺激指数(SI)来描述：SI是T细胞的肽刺激胸(腺嘧啶脱氧核)苷掺入与背景(无抗原加入)胸(腺嘧啶脱氧核)苷引入之间的比例。

这些结果可综合如下表4

表4.对下述肽的T细胸增殖应答(SI)患者

hsp60 p277(V) p12 p32 p2781 5.6 4.5 4.0 1.1 0.52 7.5 5.0 4.5 1.3 0.83 8.0 5.6 1.2 7.1 0.74 3.4 1.0 1.9 2.9 0.95 1.2 1.1 1.7 1.0 N.D.6 6.7 1.3 5.2 4.5 N.D.7 10.3 3.9 1.2 6.0 N.D.8 1.3 1.2 1.5 1.1 N.D.大于2.0的刺激指数被认为是正(阳)性应答。

N.D＝未测定；P277(V)＝P277(Val⁶-Val¹¹)。

可以看出，大多数患者对hsp60(6/8)有应答，并且所有hsp60有应答的6个患者也对至少三种hsp60肽类之一有应答：P12，P32或P277(Val⁶-Val¹¹)。因而，对这组肽的应答，可用于表征对完整hsp60分子应答的个体。

实施例4

T细胞增殖应答

在前糖尿病NOD小鼠中曾对鼠P277肽反应而产生的自发T细胞应答作过试验(Elias et al.，1991；Birk et al.，1996)，并试验了其对较大片段鼠hsp60分子的应答，后者含有鼠P277序列(Birk et al.，1996)。为了检测鼠hsp60分子上其它T细胞表位，将这些鼠用互相重迭的hsp60序列的肽库处理，发现所有小鼠对鼠P277和对鼠P12均作出了强烈反应(应答)(图3)。对NOD小鼠为免疫原的其它肽类有MT-P278肽(在分支杆菌hsp60分子中的残基458-474)和GAD-P35(在GAD65分子中的残基524-543)。图3说明MT-P278为强烈免疫原性，同鼠P277和鼠P12一样；GAD-P35也是免疫原的，但却较低。

对生长3-16周的雌性NOD小鼠作纵向(Longitudinal)研究表明，在其脾中(未示出)对鼠P12没有自发性反应，虽然观察到了对鼠P277和完整鼠hsp60均有应答。因而，在4个免疫原肽中，包括P12和P277来自鼠hsp60分子，GAD-P35来自与糖尿病有关的GAD65分子，及MT-P278为一种外来免疫原，仅对鼠P277和对MT-P278检测到了自发应答。

肽治疗处理

按照曾显示可用于鼠P277的方法(Elias et al.，1991；Elias andCohen，1994；Elias and Cohen，1995)，对生长10周的雌性NOD小鼠用在IFA中乳化的每一种肽(100mg)一次皮下注射进行处理。观测小鼠出现糖尿病的情况，直到生长8个月。图4表明，肽鼠P277和鼠P12均在抑制糖尿病发生方面有效(P＜0.05)。相比之下，用肽MT-P278或GAD-P35处理，与单独用IFA处理没有什么差别。3次实验的结果基本上相同。抗体类

用鼠肽P277成功地治疗STZ-诱发的糖尿病，与出现抗肽抗体并主要为IgG1和IgG2b同种型有联系(Elias ant Cohen，1996)。因而又检测了肽处理过的NOD小鼠的血清抗体。图5表明，两种肽对抑制糖尿病有效，它们为鼠P12和鼠P277，同时对诱发IgG1和IgG2b同种型的强抗体效价也是有效的(P＜0.001)。在这些试验组中，IgG1和IgG2b抗体效价也大大高于IgG2a抗体效价(P＜0.001)。用肽MT-P278或CAD-P35处理的小鼠的应答并不强烈；GAD-35处理过的小鼠没有任何一个产生出特异性IgG1抗体，并且在10个MT-P278处理过的小鼠中仅有两个产生出IgG1同种型抗体。用MT-P278或CAD-P35处理过的小鼠，产生了很低滴度的一些IgG2b抗体(P＜0.001)。因而，抑制糖尿病方面的有效性是与诱发抗体应答并且主要为IgG1和IgG2b同种型抗体应答有联系。

有效治疗应答与抗体效价之间的关系是通过生长7个月的小鼠个体中血液葡萄糖浓度与抗体浓度比较来证实的。图6表明，具有较高效价的抗鼠P12抗体趋于有较低的血糖浓度；反之，用鼠P12处理过的小鼠，产生出很少的针对鼠P12的抗体，趋于有较高的血糖(P＜0.002)。

讨论

本实施中提出的一些结果表明，鼠hsp60分子的肽P12，与肽P277一样，在治疗接近明显高血糖暴发的小鼠可说是有效的。与P277相反，在前糖尿病NOD小鼠的脾中，没有观察到对P12反应的自发T细胞增殖应答。因而，在外周血中可检测到的自发抗肽增殖应答，对于一种肽阻滞糖尿病自体免疫过程并不是必须的。

肽P277并非唯一能调节NOD糖尿病的hsp60肽这一观察意义重大。可以想象，在NOD糖尿病中hsp60的参与，可能是由于hsp60的P277肽与一些更特异于β-细胞的未知分子之间的相像而引起的(Cohen，1991)。然而，两个不同的hsp60片段，P277和P12，完全不可能均相像于提出的但未知的β-细胞分子的片段。在肽治疗中P12的有效性支持这样的结论，即在糖尿病中起作用的hsp60类分子是hsp60本身(Birk et al.，1996)。

肽MT-P278和GAD-P35不能抑制糖尿病的产生与发展，说明并不是任何一种自身抗原或任何一种自发的T细胞增殖抗原能够用于抑制自体免疫过程。有趣的是，MT-P278不能诱发高效价的抗体或保护性，虽然事实是它们的肽对T细胞是强烈免疫原性的(未发表的观点评论)。然而，诱发任何特异性的抗体不一定能对NOD糖尿病有作用；用BSA治疗NOD小鼠，它诱发了高效价的抗体以及强烈的T细胞应答(未示出)，但却未抑制糖尿病的发生(Elias and Cohen，1994)。虽然我们没有发现GAD-P35像其它肽类那样对T细胞是强烈的免疫原性肽(图3)，然而一些NOD小鼠的实验报告证明对其肽有自发的T细胞应答(Kaufman et al.，1989)。

最后，有效治疗与诱发对肽有特异性的抗体之间的联系说明，P12和P277的医疗作用可能与Th2-型T细胞的活化有关，后者有助于诱发一些特异性的IgG1抗体，和通过IL-4的产生来调节的一些抗体(Mossman andCoffman，1993)。这些T细胞能够抑制Th1 T细胞，它被认为破坏β-细胞(Katz et al.，1995；Liblau et al.，1995)。的确，已经发现P277肽治疗NOD糖尿病是与脾中产生IL-4和IL-10T细胞的猛增有联系，并且与在脾中和在胰岛中产生INF-γ的T细胞下降有关(未发表的报告)。对肽应答时携带Th2同种型的肽一特异性抗体的出现，似乎是有利应答的指标。

实例5：IDDM患者可表现出T细胞应答的其它肽类

共有26个新近诊断的(在IDDM诊断后1-16周)IDDM病人记录案例。病人的年龄范围是从5岁到60岁。按照他们对人hsp60和对人hsp60合成肽类(示于表1和表5)，即部分人hsp60蛋白序列，的反应所产生的外周血液T细胞增殖应答，对这些病人作了筛选分类。

还分析了病人的T细胞对一些标准记忆抗原诸如破伤风类毒素，念珠菌(Candida albecans)以及流感病毒等的反应所产生的T细胞增殖的应答，并且如果刺激指数(S.I.)为2或更大则认为是阳性(见下述)。

利用如下方法检验了增殖情况：

细胞制备和细胞增殖方法

从IDDM病人身上或从健康对照人身上抽取50ml外周血液并补充以10IU/ml的肝素。加入2体积的PBS(其中无钙和镁)。用10ml的小管混合血液-PBS制剂。将10ml体积的Ficoll加入血液混合物，随后在室温20-24℃以2.000rpm离心分离30分钟(brake off)。用10ml移液管收取在buffy层中的外周血液T细胞并转移到一个新的50ml试管中。将体积30至40mlPBS(无钙和镁)加入到收取的T细胞中。将这种物质混合并在室温下以1.000rpm离心分离20分钟(brake on)。

将上清液吸出，并将细胞团再悬浮于无AIM-V血清的培养液中(GIBCO.USA)。培养基含有AIM-V补充以1％的丙酮酸钠，1％的L-谷氨酰胺(每个200mM)，1％的青霉素/链霉素(10.000U/ml/10.000mg/ml)及2％的Hepes(1M，pH7.3)。或者使用RPMI补充以来自血库的10％AB血清。然后将细胞混合物在室温以2.000rpm离心分离10分钟(brakeon)。将上清液再吸出并将细胞团再悬浮在一个较小体积的新鲜AIM-V中(10-20ml)。将细胞再悬浮和计数。用锥虫兰对细胞计数和细胞存活性进行检测。对这一步是使用血球计和光显微镜。

然后将细胞浓度调节到2×10⁶细胞/ml于AIM-V介质中。将每孔中体积为100μl的细胞转移到96孔微滴定板的每个孔中。然后加入100μl介质，该介质含有2倍所推荐的抗原浓度(参见下面的抗原和浓度表)。试验进行四份。4个孔是用无抗原的细胞和介质作为对照进行试验。将这些板在37℃下在5％CO₂ 湿润的孵化器中培养7天。在培养期的第6天，加入1μCi/孔的³H-胸(腺嘧啶脱氧核)苷。将培养液连续培养18小时，然后收取。细胞增殖是通过向DNA中掺入³H-胸(腺嘧啶脱氧核)苷进行检测的，这是用闪烁液体和β-计数器读出器确定的。试验过的一些抗原浓度破伤风类毒素(Connaught Lab，Inc，Pen.美国) 5g/ml白色的念株菌(Miles，wa.美国) 20μg/ml重组人hsp60(StressGen，加拿大) 2-5μg/ml人hsp60合成肽类 20μg/ml

增殖应答的测定是按照T细胞DNA中胸(腺嘧啶脱氧核)苷³H的掺入进行的(Elias et al.，1991)。在使用被试验的一些抗原，或作为对照的无抗原(仅用介质)培养的细胞之间比较了每分钟的放射性计数(CPM)。其增殖数值以刺激指数(S.I.)表示：有抗原的平均CPM除以无抗原的平均CPM。S.I.值大于或等于2者，便被认为是正阳性的。

这些结果表明，人hsp60或hsp60-肽反应性个体的比率在IDDM病人中(为84％)高于在健康人中的比率(30％)。Fisher精确试验的差别P值为0.0044，这是很显著的。

两个代表性IDDM病人和一个健康个人的增殖应答，即对hsp60合成肽类，和对各种回忆抗原反应产生的增殖应答，表示于图7，8及9。表5说明两个hsp60合成肽类(P19，P21)的个别例子，即没有IDDM病人对其反应和应答(也见图10A和10B)。

可以看出，每一个病人对回忆抗原(Candida，破伤风类毒素，或流感病毒)以及人hsp60蛋白质和各种人hsp60肽类有响应。对照人仅对对照回忆抗原有响应。

表1显示了至少一个IDDM病人有响应的hsp60合成肽类的序列。每一个这种肽对治疗IDDM具有潜在的治疗作用。

表5 IDDM病人对其没有响应的hsp60合成肽类及其序列肽类 SEQ ID No：1中的残基序号氨基酸序列(一字编码)P19 271-290 LVIIAEDVDGEALSTLVLNRP21 301-320 KAPGFGDNRKNQLKDMAIAT

上述一些具体实施例已充分揭示了本发明的一般性质，致使其他人能够，应用本领域熟知的知识(包括本文引用的参考文献内容)，容易地改变和/或将这些具体实施例适应于各种应用，无需作更多实验，但都不脱离本发明的一般概念。因此，这些适应和改变都应落在已揭示的这些实施例的等同含义和范围内，都是基于本发明的教导。很清楚，本发明说明书中的用语和术语是用于描述目的而不是用于限制，因而本说明书的一些术语和用语能被普通技术人员按照本发明的教导和结合以本技术领域的人的知识得到解释。

参考文献

Bach JF.(1994)Insulin-Dependent Diabetes Mellitusas an Autoimmune Disease. Endocrine Reviews 15：516-542.

Bendelac A，Carnaud C，Boitard C，Bach JF.(1987)Syngeneic transfer of autoimmune diabetes from diabetic NODice to healthy neonates.Requirement for both L3T4+ and Ly+-2+T cells. J Exp Med.166：823-32.

Birk OS，Elias D，Weiss AS，Rosen A，van-der Zee R，Walker MD，Cohen IR. (1996)NOD mouse diabetes：Theubiquitous mouse hsp60 is a beta-cell target antigen ofautoimmune T cells. J. Autoimmun.9：159-166.

Bowman MA，Leiter EH and Atkinson MA.(1994)Prevention of diabetes in the NOD mouse：implications fortherapeutic intervention in human disease. Immunology Today.15：115-20.

Castano L，Eisenbarth GS.(1990)Type-I diabetes：achronic autoimmune disease of human，mouse，and rat. Annu Rev Immunol.8：647-79.

Cohen IR.(1991)Autoimmunity to chaperonins in thepathogenesis of arthritis and diabetes. Annu Rev Immunol9：567-589.

Elias，Dana.(1994)The NOD mouse A model forautoimmune insulin-dependent diabetes. Autoimmune Disease Models， A Guidebook，pp 147-61.

Elias D，Cohen IR.(1995)Treatment of autoimmunediabetes and insulitis in NOD mice with heat shock protein 60peptide p277. Diabetes 44：1132-1138.

Elias D，Reshef T，Birk OS，van der Zee R，WalkerMD，Cohen IR.(1991)Vaccination against autoimmune mousediabetes with a T-cell epitope of the human 65 kDa heat shockprotein. Proc.Natl Acad Sci USA.88：3088-91.

Elias D.and Cohen IR.(1994)Peptide therapy fordiabetes in NOd mice. The Lancet.343：704-706.

Elias D，Cohen IR. (1996)The hsp60 peptide p277arrests the autoimmune diabetes induced by the toxinstreptozocin. Diabetes(in press).

Katz JD，Benoist C，Mathis D.(1995)T helper cellsubsets in insulin-dependent diabetes. Science 268：1185-1188.

Kaufman DL，Clare-Salzler M，Tian J，Forsthuber T，Ting GSP，Robinson P，Atkinson MA，Sercarz EE，Tobin AJ，Lehmann PV.(1993)Spontaneous loss of T-cell tolerance toglutamic acid decarboxylase in murine insulin-dependentdiabetes. Nature.366：69-72.

Liblau RS，Singer SM，McDevitt HO.(1995)Th1 andTh2 CD4+ T cells in the pathogenesis of organ-specificautoimmune diseases. Immunol Today 16：34-38.

Mossman TRR，Coffman RL.(1989)TH1 and TH2 cells：Different patterns of lymphokine secretion lead to differentfunctional properties. Annu Rev Immunol 9：145-173.

Tisch R，Yang XD，Singer SM，Liblav RS，Fuggar L，McDevitt HO.(1993)Immune response to glutamic aciddecarboxylase correlates with insulitis in non-obese diabeticmice. Nature.366：72-75.

序列表(1)总信息：

(i)申请人：

(A)名称：耶达研究与发展有限公司

(B)街道：P.O.B Box 95

(C)城市：Rehovot

(E)国家：Israel

(F)邮编：76100

(G)电话：972-8-9470617

(H)传真：972-8-9470739

(A)姓名：Irun R.COHEN

(B)街道：H Hankin Street

(C)城市：Rehovot

(E)国家：Israel

(F)邮编：76354

(A)姓名：Dana ELIAS

(B)街道：57 Derech Yavne

(C)城市：Rehovot

(E)国家：Israel

(F)邮编：78344

(A)姓名：Rivka ABULAFIA

(B)街道：31/11 Weizmann Street

(C)城市：Yahud

(E)国家：Israel

(F)邮编：56000

(A)姓名：Jana BOCKOVA c/o Ms.Joan Fraser，

NYS/Pediatrics，SUNY Health Scienees Center

(B)街道：11th Floor，Room 040

(C)城市：Stony Brook

(D)洲：N.Y.

(E)国家：USA

(F)邮编：11794(ii)发明名称：用于治疗糖尿病的由人热激蛋白60衍生的新型肽类、

其组合物、制法及试剂盒(iii)序列数目：6(iV)计算机可读形式

(A)介质类型：软盘

(B)计算机IBM PC兼容

(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：Patent In Release #1.0，Version #1.30(EPO)(Vi)在先申请资料

(A)申请号：IL 114407

(B)申请日：1995年6月30日(2)SEQ ID NO：1的资料：(i)序列特征

(A)长度：573氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(Xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Met Leu Arg Leu Pro Thr Val Phe Arg Gln Met Arg Pro Val Ser Arg1 5 10 15Val Leu Ala Pro His Leu Thr Arg Ala Tyr Ala Lys Asp Val Lys Phe

20 25 30Gly Ala Asp Ala Arg Ala Leu Met Leu GlnGly Val Asp Leu Leu Ala

35 40 45Asp Ala Val Ala Val Thr Met Gly Pro Lys Gly Arg Thr Val Ile Ile

50 55 60Glu Gln Gly Trp Gly Ser Pro Lys Val Thr Lys Asp Gly Val Thr Val65 70 75 80Ala Lys Ser Ile Asp Leu Lys Asp Lys Tyr Lys Asn Ile Gly Ala Lys

85 90 95Leu Val Gln Asp Val Ala Asn Asn Thr Asn Glu Glu Ala Gly Asp Gly

100 105 110Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Arg Ser Ile Ala Lys Glu Gly Phe

115 120 125Glu Lys Ile Ser Lys Gly Ala Asn Pro Val Glu Ile Arg Arg Gly Val

130 135 140Met Leu Ala Val Asp Ala Val Ile Ala Glu Leu Lys Lys Gln Ser Lys145 150 155 160Pro Val Thr Thr Pro Glu Glu Ile Ala Gln Val Ala Thr Ile Ser Ala

165 170 175Asn Gly Asp Lys Glu Ile Gly Asn Ile Ile Ser Asp Ala Met Lys Lys

180 185 190Val Gly Arg Lys Gly Val Ile Thr Val Lys Asp Gly Lys Thr Leu Asn

195 200 205Asp Glu Leu Glu Ile Ile Glu Gly Met Lys Phe Asp Arg Gly Tyr Ile

210 215 220Ser Pro Tyr Phe Ile Asn Thr Ser Lys Gly Gln Lys Cys Glu Phe Gln225 230 235 240Asp Ala Tyr Val Leu Leu Ser Glu Lys Lys Ile Ser Ser Ile Gln Ser

245 250 255Ile Val Pro Ala Leu Glu Ile Ala Asn Ala His Arg Lys Pro Leu Val

260 265 270Ile Ile Ala Glu Asp Val Asp Gly Glu Ala Leu Ser Thr Leu Val Leu

275 280 285Asn Arg Leu Lys Val Gly Leu Gln Val Val Ala Val Lys Ala Pro Gly290 295 300Phe Gly Asp Asn Arg Lys Asn Gln Leu Lys Asp Met Ala Ile Ala Thr305 310 315 320Gly Gly Ala Val Phe Gly Glu Glu Gly Leu Thr Leu Asn Leu Glu Asp

325 330 335Val Gln Pro His Asp Leu Gly Lys Val Gly Glu Val Ile Val Thr Lys

340 345 350Asp Asp Ala Met Leu Leu Lys Gly Lys Gly Asp Lys Ala Gln Ile Glu

355 360 365Lys Arg Ile Gln Glu Ile Ile Glu Gln Leu Asp Val Thr Thr Ser Glu

370 375 380Tyr Glu Lys Glu Lys Leu Asn Glu Arg Leu Ala Lys Leu Ser Asp Gly385 390 395 400Val Ala Val Leu Lys Val Gly Gly Thr Sar Asp Val Glu Val Asn Glu

405 410 415Lys Lys Asp Arg Val Thr Asp Ala Leu Asn Ala Thr Arg Ala Ala Val

420 425 430Glu Glu Gly Ile Val Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Cys Ile

435 440 445Pro Ala Leu Asp Ser Leu Thr Pro Ala Asn Glu Asp Gln Lys Ile Gly

450 455 460Ile Glu Ile Ile Lys Arg Thr Leu Lys Ile Pro Ala Met Thr Ile Ala465 470 475 480Lys Asn Ala Gly Val Glu Gly Ser Leu Ile Val Glu Lys Ile Met Gln

485 490 495Ser Ser Ser Glu Val Gly Tyr Asp Ala Mat Ala Gly Asp Phe Val Asn

500 505 510Met Val Glu Lys Gly Ile Ile Asp Pro Thr Lys Val Val Arg Thr Ala

515 520 525Leu Leu Asp Ala Ala Gly Val Ala Ser Leu Leu Thr Thr Ala Glu Val

530 535 540Val Val Thr Glu Ile Pro Lys Glu Glu Lys Asp Pro Gly Met Gly Ala545 550 555 560Met Gly Gly Met Gly Gly Gly Met Gly Gly Gly Met Phe

565 570(2)SEQ ID NO：2的资料：(i)序列特征

(A)长度：24氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：肽(Xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Val Leu Gly Gly Gly Val Ala Lau Leu Arg Val Ile Pro Ala Leu Asp1 5 10 15Ser Leu Thr Pro Ala Asn Glu Asp

20(2)SEQ ID NO：3的资料：(i)序列特征

(A)长度：20氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：肽(XI)序列描述：SEQ ID NO：3：Glu Glu Ile Ala Gln Val Ala Thr Ile Ser Ala Asn Gly Asp Lys Asp1 5 10 15Ile Gly Asn Ile

20(2)SEQ ID NO：4的资料：(i)序列特征

(A)长度：17氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：肽(Xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

Glu Gly Asp Glu Ala Thr Gly Ala Asn Ile Val Lys Val Ala Leu Glu

1 5 10 15

Ala(2)SEQ ID NO：5的资料：(i)序列特征

(A)长度：20氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：肽(Xi)序列描述：SEQ ID NO：5：

Ser Arg Leu Ser Lys Val Ala Pro Val Ile Lys Ala Arg Met Met Glu

1 5 10 15

Tyr Gly Thr Thr

20(2)SEQ ID NO：6的资料：(i)序列特征

(A)长度：18氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：肽(Xi)序列描述：SEQ ID NO：6：

Pro Gly Met Gly Ala Met Gly Gly Met Gly Gly Gly Met Gly Gly Gly

1 5 10 15

Met Phe

Claims

1.一种肽，其选自SEQ ID NO：1中的残基序号31-50、136-155、151-170、166-185、195-214、255-274、286-305、346-365、421-440、436-455、466-485、511-530和343-346的肽，及其盐类和其功能衍生物。

2.如权利要求1所述的肽，其为SEQ ID NO：1中的残基序号166-185的肽。

3.如权利要求1所述的肽，其为SEQ ID NO：1中的残基序号466-485的肽。

4.一种医药组合物，包含一种如权利要求1所述的肽及一种药物学上可接受的载体。

5.如权利要求4所述的医药组合物，其中所说的肽是权利要求2所述的肽。

6.如权利要求4所述的医药组合物，其中所说的肽是权利要求3所述的肽。

7.如权利要求1所述的肽在制备用于预防和治疗胰岛素依赖性糖尿病的医药组合物中的用途。

8.如权利要求7所述的用途，其中所说的肽是权利要求2所述的肽。

9.如权利要求7所述的用途，其中所说的肽是权利要求3所述的肽。