JPH09503387A - クローン化されたグルタミン酸デカルボキシラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 GAD関連自己免疫疾患の改善において有用な単離ポリペプチド並びにこれらのポリペプチドの診断的及び治療的使用方法について開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 クローン化されたグルタミン酸デカルボキシラーゼ 本出願は、1990年９月21日に出願された米国逐次番号第07／586,536号の一部 継続出願である1991年６月18日に出願された米国逐次番号第07／716,909号の一 部継続出願である。 発明の背景 本発明は、National Institutes of Healthからの認可NS22256により支援され た。米国政府は本発明に一定の権利をもつ。 １．発明の分野 本発明は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ₆₅(GAD₆₅)ポリペプチド並びに自 己免疫疾患におけるGAD₆₅ポリペプチドの診断的及び治療的使用方法に関する。 ２．背景技術の説明 インスリン依存性真性糖尿病（IDDM；Ｉ型糖尿病）は、最も一般的な代謝疾患 である。米国内では、IDDMは、凡そ300〜400人に１人を襲っており、そして疫学 的研究は、その発病率が増加していることを示唆している。これらの疾患は、膵 臓のインスリン産生β−細胞の自己免疫破壊から生じる。より特に、その開始前 段階は、リンパ球が膵臓の島に浸潤し、そしてそのβ−細胞を選択的に破壊する という“インスリン炎(inslitis)”を特徴とする。インスリン炎は、臨床徴候の 開始前長年にわたり存在することができる。。高血糖症の典型的なIDDMの顕出は 、インスリン産生β−細胞の少なくと も80％が失われた後にのみ現われる。その残りのβ−細胞は、次の数年間の間に 破壊される。 インスリン治療は、ほとんどのIDDM患者が通常に生きることを可能にするけれ ども、この代替は不完全であり、そして代謝恒単生を完全には修復しない。従っ て、眼、腎臓、心臓、及び他の臓器の機能不全をもたらす重篤な合併症は、イン スリン治療を経験するIDDM患者に一般的である。このために、β細胞破壊の開始 とインスリン代替の現実の要求（すなわち、β−細胞の80％が破壊されている） との間の、潜伏期間を延長し、そして（例えば、自己免疫過程を妨害するための 免疫抑制剤及び持続性低血糖症の効果のよりよい制御を達成するためのインスリ ンの投与を通じて）進行を防ぐことが切望される。それ故、β−細胞破壊の開始 を決定する診断テストは、臨床医が、免疫抑制剤を投与し(Silverstein，et al. ，New England Journal of Medicine，319：599-604，1988)又はインスリン治療 を予防する(Keller，et al.，Lancet，341：927，1993)ことを許容して、上記潜 伏期間を延長し、そしてこれ故、インスリン代替副作用の開始を有意に遅らせる であろう。 多くのIDDM患者は、64KD分子(Baekkeskov，et al.，J.Clin-Inrest.，79：926 -934，1987；Atkinson，et al.，Lancet 335：1357-1360，1990)に対する、島細 胞細胞質(ICA)分子又は島細胞表面（ICSA）分子(Bottazzo，et al，Lancet,１； 668-672，1980)に対する、又はインスリン(Palmer，et al.，Science，222：113 7-1139,1983；Atkinson，et al.，Diabetes，35：894-898，1986)に対する、抗 体を含む血清をもつ。Atkinsonと共同研究者ら(Alkinsom，et al.，Lancet，335 ： 1357-1360，1990)は、ヒト血清中の64KD分子に対する抗体の存在が、IDDM徴候 の開始が最終的に生じるであろう最も初期のそして最も信頼できる指標であるよ うだということを立 証した。 最近、Baekkeskovと共同研究者らは、64KD分子とグルタミン酸デカルボキシラ ーゼ(GAD)がいくつかの抗原性エピトープを共通にもち、そしてそれ故それらが 同一又はひじょうに類似した分子であることができるということを確立した。こ の同定は重要な発見であるけれども、IDDMを予言するための診断ツールとしての この情報の使用は、GADの分子生物学の知識が知られていなければ、かなりやっ かいであり、そして限定されたものである。Kaufman，et al.,(J,Clin.Inrest. ，89：283，1992)による研究は、64KD分子が無傷のGAD₆₅であったことを確立し た。結論として、大量のGAD₆₅又はGAD分子であって、その両方が容易に精製され ることができるGAD₆₅分子又はGAD₆₅の断片に抗原として実質的に同一であるもの のクローニング及びその後の製造が、IDDMを予言するためにデザインされた診断 キット並びに有効な治療的モダリティーの開発を可能にするであろう。本発明は 、これらの結果を達成するための手段を提供する。 発明の要約 本発明は、組換えDNA技術が真核GAD₆₅ポリペプチドを作るために使用されるこ とができるであろうということ、そしてGAD₆₅ポリペプチドが自己免疫疾患をも つ患者の診断及び治療において使用されることができるであろうという発見から 生じた。特に関連するものはGAD−関連自己免疫失調、例えばインスリン依存性 真性糖尿病（IDDM）又はきついヒト疾患（stiffman disease）をもつ、又はもつ 危険のある、患者の診断及び治療における真核GAD₆₅ポリペプチドの使用である 。 本発明の主要な利点は、他の真核非GAD₆₅ポリペプチドからそれ を分離するとき天然真核GAD₆₅ポリペプチドの単離に関連する問題を回避しなが ら、それが、天然源から精製されたものに一致する真核GAD₆₅ポリペプチドの直 ちに使用できる源を本分野に提供するということである。他の真核非GAD₆₅ポリ ペプチドのこの非存在は、それが、GAD₆₅ポリペプチドと特異的に反応する抗体 だけを検出するであろうテスト・システムの開発を許容するという点に異議があ る。 宿主細胞内で真核GAD₆₅ポリペプチドを提供する他の利点は、そうすることに よって、天然源から今日実施可能な状態で利用されることができるよりもより大 量のポリペプチドを得ることができるということである。結果として、IDDMのよ うな自己免疫疾患をもつ患者をより正確に分類し、そして治療するために本発明 に係るポリペプチドを使用することが可能であるだけでなく、診断システム及び 医薬組成物における使用のために商業的に有用な量のGADポリペプチドを今日提 供することもできる。 図面の説明 図１−GAD₆₅及びGAD₆₇特異的cDNAプローブを得るためのクローニング戦略。 図２−ラットGAD₆₅のためのDNA配列及び対応アミノ酸配列。 図３−ヒトGAD₆₅のためのDNA配列及び対応アミノ酸配列。 図４−ラットGAD₆₅とヒトGAD₆₅アミノ酸配列の比較。 図５−GAD₆₅とGAD₆₇のcDNAは異なるサイズのRNAにハイブリダイズする。 図６−GAD₆₅とGAD₆₇に特異的なcDNAプローブとハイブリダイズさせたサザン・ ブロット。 図７−GAD₆₅とGAD₆₇の免疫学的同一性。 図８−β細胞抗原に対するNODマウスの増殖性Ｔ細胞応答。 図９−強化クローナル・サイズ（ａ）と細胞表面マーカー（ｂ）及びIFN γ分 泌によりTh1 細胞をプライムしたときのNODマウスのGAD特異的Ｔ細胞応答の特徴 付け。 図10−GAD分子内のＴ−細胞自己免疫性の分子内の広がり。 図11−GAD₆₅による免疫感作後のIDDMの開始の遅れ。 発明の詳細な説明 本発明は、Ｔ−細胞認識を遮断するためにMHCレセプターに結合するポリペプ チドのための、及びグルタミン酸デカルボキシラーゼ₆₅(GAD₆₅)に自己抗体を結 合させるための１以上のエプトープのための、一次構造の一部又は全部を有する ポリペプチドの生産を可能にする組換えDNA手順による遺伝子材料の操作に関す る。これらのポリペプチドは、それと反応性の自己抗体の免疫学的検出に高く有 用である。なぜなら、このような抗体は自己免疫疾患、例えば、インスリン依存 性真性糖尿病及び“きついヒト”症候群の前診断及び指標であるからである。こ れらのポリペプチドは、医薬、例えばGAD機能を変更するもののスクリーニング の目的をもって、そしてGAD₆₅を検出するためにその後、診断に使用されること ができるポリクローナル及びモノクローナル抗体の生成のために、使用されるこ ともできる。 DNAベクター内へのスプライシングのための真核GAD₆₅ポリペプチドをコードす る特定DNA配列の開発は、さまざまな技術を使用して達成されることができる。 例えば、使用されることができる他の方法は、（1）真核細胞のゲノムDNAからの ２本鎖DNA配列の単離；（２）着目のポリペプチドのために必要なコドンを提供 するためのDNA配列の化学的製造；及び（３）真核ドナー細胞から単離された mRNAの逆転写による２本鎖DNA配列のインビトロにおける合成、を含む。後者の 場合においては、mRNAの２本鎖DNA相補物で最終的に形成され、これは一般的にc DNAといわれる。 DNA配列の製造は、所望のポリペプチド生成物のアミノ酸残基の全体配列が公 知のときに、しばしば選択される方法である。所望のアミノ酸残基の全体配列が 知られていないとき、DNA配列の直接的な製造は不可能であり、そしてその選択 される方法はcDNA配列の形成である。 着目のcDNA配列を単離するための標準的な手順の中に、高レベルの遺伝子発現 をもつドナー細胞内に豊富にあるmRANの逆転写から得られるプラスミド担持、cD NAライブラリーの形成がある。ポリメラーゼ連鎖反応技術と共に使用されるとき 、稀な発現生成物さえもクローン化されることができる。ポリペプチドのアミノ 酸配列のかなりの部分が知られているような場合には、標的cDNA内に存在すると 推定される配列を倍化するRNAプローブ配列又は標識された１本鎖又は２本鎖Ｄ ＮＡの製造が、１本鎖形態に変性されたcDNAのクローン化コピー上で行われるDN A／DNAハイブリダイゼーション手順において使用されることができる（Jay，et al.，Nucleic Acid Research，11：2325，1983）。 ハイブリダイゼーション手順は、各々が、潜在的に、変性２本鎖DNAの不均一 混合物を含むハイブリダイゼーション・サンプル中の特定DNA配列の完全相補物 である、標識された混合合成オリゴヌクレオチド・プローブの使用による組換え クローンのスクリーニングに有用である。このようなスクリーンニングのために 、ハイブリダイゼーションは、好ましくは、１本鎖DNA又は変性２本鎖DNAのいず れかの上た行われる。これらの手順は、着目のポリペプチドに関してきわめて少 量のmRNA配列が存在する源から得られるcDNAフロー ンの検出において特に有用である。換言すれば、非特異的結合の回避に向けられ たストリンジエントなハイブリダイゼーション条件を使用することにより、例え ば、その完全相補物である混合物中のその単一プローブへの標的DNAのハイブリ ダイゼーションによる特定cDNAクローンのオートラジオグラフィーによる可視化 を可能にすることができる(Wallace，et al.，Nucleic Acid Research，９：879 ，1986)。 さらに、GAD cDNAライブラリーは、さまざまなcDNAを卵母細胞内に注入し、そ のcDNA遺伝子生成物の発現が生じるのに十分な時間を許容し、そして例えば、GA D₆₅ポリペプチドに特異的な抗体を使用することにより、又はその発現生成物が 病因Ｔ−細胞を刺激する能力を測定することにより所望けのcDNA発現生成物の存 在についてテストすることによって、スクリーニングされることができる。 あるいは、cDNAライブラリーは、GAD₆₅に対する抗体を使用して少なくとも１ のエピトープをもつGAD₆₅ペプチドについて間接的にスクリーニングされること ができる（chang and Gottlieb，J.Veurosci.,８：2123，1988）。このような抗 体は、ポリクローナル又はモノクローナルのいずれかで得られ、そしてGAD₆₅ cD NAの存在を示す発現生成物を検出するこめに使用されることができる。好ましい のは、GAD₆₅のＮ−末端部分の最初の100アミノ酸内にあるエピトープに向けられ た抗体である。 組換え手順における使用のために特定のDNA配列を顕出される上述の３つの方 法の中で、ゲノムDNA単離物の使用は最も一般的でない。これは、イントロンの 存在のために哺乳類方法の酸生成発現を得ることが望ましいときには特に本当で ある。 本発明は、GAD₆₅に対する抗体のこめの少なくとも１のエピトープ又はＴ−細 胞認識のための少なくとも１の決定基をもつ、一次構 造コンホメーション、すなわちアミノ酸残基の連続配列の一部又は全部をもつGA D₆₅の新規のポリペプチドを提供する。GADに対すくに自己抗体を検出するために 無傷のGADよりもむしろ本発明に係るポリペプチド断片を使用することができる 。用語“ポリペプチド”は、GADポリペプチドに適用れれるとき、GADに対する自 己抗体のためのエピトープをもついずれかのアミノ酸配列を含み又は下細胞MHC レセプターに結合する。従って、本発明に包含されるGADのポリペプチド断片は 、生物学的活性、例えばGADに対する自己抗体を誘導しそして／又はこれに結合 し、下細胞MHCレセプター（特に、病因Ｔ−細胞レセプター）に結合する等の能 力を有する。 本発明のDNA配列の微生物発現から又は他の合成技術、例えば固相ペプチド合 成から生じるポリペプチドは、その天然細胞環境内又は血漿又は尿の如き細胞外 液中のGADとその他の方法で会合することができるであろう他の真核ポリペプチ ド又は他の汚染物との会合からの遊離によりさらに特徴付けられることができる 。 本発明者らによる研究は、GAD₆₅とGAD₆₇が別々の遺伝子によりコードされてお り、そして例えば、共通ゲノム配列の転写後又は翻訳後修飾により作られないと いうことを明白に確立する。GAD₆₅とGAD₆₇が異なる遺伝子によりコードされてい るということを証明する証拠は、(_a )GAD₆₅とGAD₆₇ cDNAの間の正確に同一な最 も大きな連続配列が長さにおいてたった17ヌクレオヂドであり、（ｂ）GAD₆₅とG AD₆₇からのcDNAが低ストリンジエント条件（2.0×SSC，0.01％SDS、23℃）下、 互いに交差ハイブリダイズせず、又は互いのmRNAと交差ハイブリダイズせず、そ して（ｃ）GAD₆₅とGAD₆₇ cDNAが、それぞれGAD₆₇とGAD₆₅をコードする単離ゲノ ム・クローンと交差ハイブリダイズしない、ということを含む。 用語“宿主”は、原核生物だけでなく、酵母、糸状菌、植物及び 動物細胞、並びに昆虫細胞であって真核GAD₆₅のイントロン不合DNA配列を複製し 、そして発現することができるものの如き真核細胞を含む。しかしながら、原核 生物はスクリーニング目的のための宿主生物として好ましく、一方、真核細胞、 特に昆虫細胞は、発現のために好ましい。 用語“原核生物”は、GAD₆₅の発現のための遺伝子により形質転換され又はト ランスフエクトされることができる全てのバクテリアを含む。原核生物宿主は、 ブラム陰性並びにグラム陽性バクテリア、例えば、大腸菌（E.coli）、S.typhim urium 、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）及びバチルス・サブチ リス(Bacillus subtilis)を含むことができる。 GAD₆₅ポリペプチドをコードする組換えDNA分子は、当業者に一般的に知られた 技術の中のいずれかを使用して宿主を形質転換し又はトランスフェクトするため に使用されることができる。特に好ましいのは、それぞれ、原核生物形質転換又 は、トランスフェクションの目的のためのGAD₆₅ コーディング配列を含むプラス ミド又はウイルスの使用である。あるいは、着目のDNAを含むリポソームを宿主 内での発現を得るために使用されることができる(Zhu，et al.，Science，261： 209，1993)。 融合されて作用可能な状態で結合された遺伝子を調製し、そしてバクテリア内 でそれらを発現するための方法は、本分野においてよく知られている（Maniatis ，et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Monual，Cold Spring Harbor Labo ratory,Cold Spring Harbor，NY，1989）。この中に記載された遺伝子構築物と 方法は、原核生物宿主内でのGAD₆₅の発現のために使用されることができる。 一般的に、挿入された真核遺伝子配列の効率的な転写を容易にするプロモータ ー配列を含む発現ベクターが、その宿主との関係にお いて使用される。発現ベクターは、複製起点、プロモーター、及びターミネータ ー、並びに形質転換された細胞の表現型選択を提供することができる特定遺伝子 を含む。形質転換された原核宿主は、最適な細胞成長を達成するために、本分野 において公知の技術に従って醗酵槽内で増殖され、そして培養されることができ る。本発明に係るポリペプチドは、その後、成長培地：細胞溶解物、又は細胞膜 画分から単離されることができる。 発現された本発明に係るポリペプチドの単離と精製は、いずれかの便利な手段 、例えば調製用クロマトグラフィー分離及び免疫学的分離、例えばモノクローナ ル又はポリクローナル抗体の使用を含むものによることができる。 GAD₆₅のアミノ酸残基の配列を提供されることにより、本発明は、１以上のア ミノ酸残基の同一性又は位置に関して天然形態と異なり、そして天然ポリペプチ ド形態のエピトープのいくつか又は全てを共有するGAD₆₅のポリペプチド・アナ ログ又はその誘導体の宿主発現をコードするDNA配列の製造を提供する。 本発明に係る新規のDNA配列は、GAD₆₅に対する抗体と反応することができる１ 以上のエストープのための１次構造立体配置の中の少なくとも一部をもつポリペ プチドの原核又は真核宿主細胞内での発現の提供において有用な全ての配列を含 み、これらは、（ａ）図２又は３内に表されたようなDNA配列又はそれらの相補 鎖；（ｂ）（ａ）において定められてDNA配列又はそれらの断片にハイブリダイ ズするDNA配列；及び（ｃ）その遺伝子コードの縮重を除いて、上記（ａ）と（ ｂ）において定められたDNA配列にハイブリダイズするであろうDNA配列、により 包含される。特に、（ｂ）内に包含されるものは、GAD₆₅の対立遺伝子変異体形 態をコードするゲノムDNA配列である。パート（ｃ）は、特にGAD₆₅，GAD₆₅断片 、及び GAD₆₅アナログをコードするDNA配列の製造であって、そのDNA配列が非脊柱宿主 内でのmRNAの翻訳を容易にするコドンを取り込むことができるものと包含する。 本発明に係るcDNA配列は、本質的に、全体ヒト又はラットGAD₆₅分子をコード するので、これからのcDNAあるいはヒト又はラットGAD₆₅に対する自己抗体のた めの１種の数のエピトープをコードするであろう対応cDNA配列を調製し、サブク ローン化し、そして発現することが今日日常的に行われている。クローン化され たポリペプチド上このようなエピトープの存在は次に、例えばGAD₆₅に対する自 己抗体をもつ患者からの血清を使用して確認されることができる。このような小 さなペプチドの例は、（図３に示すような）GAD₆₅のＮ−末端からの最初の約100 アミノ酸である。このアミノ酸配列は、本質的にGAD₆₅にはない。 本発明に係る特定のペプチドの他の例は表７に示され、そして凡そGADのカル ボキシ末端の２／３、約224アミノ酸から約585アミノ酸までである。GADのカル ボキシ末端の２／３内で特に好ましいのは、約224アミノ酸から約398アミノ酸ま でのアミノ酸セグメントである。 本発明はさらに、本発明のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体並びに これらのモノクローナル抗体の診断的及び治療的使用に関する。この特異性は、 そのモノクローナル抗体、及び同様の特異性をもつ同様のモノクローナル抗体が 、このポリペプチド、又はこのポリペプチドを含んで成るアミノ酸が試料又は宿 主、例えばヒト内に存在するときに、本発明に係るポリペプチドに結合させるた めに使用されることを可能にする。 多数の技術が、不必要な実験に訴えずに本発明に係るモノクローナル抗体を産 生するために使用されることができる。かなりの程度 に、このようなモノクローナル抗体の生成物が、本発明に係るポリペプチドの高 く規定された性質のために、日常に供される。従って、本発明に係るポリペプチ ドが免疫感作及び／又はスクリーニングのために使用されるかのいずれにしても 、そのポリペプチド上のひじょうに限定された数の免疫原性決定基が、例えば、 可能性のあるクローン発現のレパートリーを限定することにより、本発明のモノ クローナル抗体を産生するセルラインの同定をかなり簡単にする。 本発明に係るモノクローナル抗体の発現のための、１のひじょうに有用なタイ プのセルラインは、そのハイブリドーマである。モノクローナル抗体を産生する ハイブリドーマの生産に使用される一般的な方法は、よくつ知られている(Kohle r and Milstein，Nature，256：495，1975)。得られたハイブリドーマを、次に 、本発明に係るポリペプチドに結合することができるモノクローナル抗体の産生 についてスクリーニングした。感作及び／又は免疫感作、細胞融合、腹水生産、 混合ハイブリドーマの選択、又はモノクローナル・ハイブリドーマのサブクロー ニングは、一般的に、本分野においてよく知られている。Koprowski，et al.,米 国特許第4,172,124号、Koprowski，et al.,米国特許第4,196,265号、又はDouill ard，J.Y．and Hoffman，T.，Basic Facts about Hybridome，in Compendium of Immunology，Vol．II，L．Schwartz，ed，(1981)（これらを引用により本明細 書中に取り込む）が注目されている。一般的に、精製されたペプチドは、連結橋 を通じての免疫原性タンパク質への合成ペプチドの一方向の付着、例えば、マレ イミドベンゾイル化(MB)-Keyhole limpetヘモシアニン(KLH)、を許容するそのＣ −末端において付着されたシステインをもつように修飾されることができる。他 の免疫原性抱合体、例えばアルブミンその他も使用されることができる。得られ た構造は、１分子のタンパク質に結合されたいく つかのペプチド構造をもつことができる。 合成ペプチドに対して免疫感作された宿主から得られた体細胞は、いずれかの 好適な免疫感作技術により得られることができる。宿主対象は、通常、上述のよ うなタンパク質抱合体の形態で、いずれかの好適な方法により、好ましくは、注 射により、腹腔内に、静脈中に、皮下により、又は足内パッドにより、その抗原 を投与することにより免疫感作される。アジュバントが、上記免疫感作プロトコ ールに含まれることができる。 タンパク質結合抗原による最初の免疫感作の後に、数週間の間隔で周期的に与 えられるいくつかのブースター注射が行われることができる。各々の宿主の血漿 中に含まれる抗体はその後、その免疫感作性の本発明に係るポリペプチドとのこ の反応性についてテストされることができる。最高の応答をもつ宿主は、ハイブ リドーマの生産において使用される抗体分泌体細胞のドナーとして通常、最も望 ましいものである。あるいは、高免疫感作(hyperimmunization)は、静脈及び／ 又は腹腔内経路によりペプチド−タンパク質抱合体の追加の量を反復注射するこ とにより行われることができる。 本発明に係るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの単離は、着目の モノクローナル抗体の初歩的な反応パターンの決定を許容する日常的なスクリー ニング技術を使用して達成されることができる。従って、テストされるモノクロ ーナル抗体が本発明に係るポリペプチドと結合する場合には、そのテストされる 抗体と本発明に係るハイブリドーマにより産生された抗体は等価である。 あるいは、本発明は、本発明に係る好ましいモノクローナル抗体の結合に特に 必要であるポリペプチド又はアミノ酸配列を教示するので、ポリペプチドに特異 的なモノクローナル抗体をその後に産生するハイブリドーマを生産するための免 疫感作の目的をもってこれ らのペプチドを今般使用することができる。このアプローチは、本ポリペプチド による免疫感作において提示された抗原決定基の数を限定することにより作られ たモノクローナル抗体のレパートリーを減少させるという追加の利点をもつ。こ の方法により産生されるモノクローナル抗体は、標準的な技術を使用して、例え ば、ポリペプチドをマイクロタイター・プレートに結合させて、そしてELISA検 定によりそのモノクローナル抗体の結合を計測することにより、特異性について スクリーニングされることができる。 不必要な実験によらず、モノクローナル抗体が本発明に係るモノクローナル抗 体と同一の特異性をもつかどうかを、前者が、後者が本発明に係るポリペプチド に結合することを防ぐかどうかを確かめることにより、決定することもできる。 テストされるモノクローナル抗体が、本発明に係るモノクローナル抗体による結 合における減少により示されるように、本発明に係るモノクローナル抗体と競合 する場合、２つのモノクローナル抗体は、同一の、又は密接に関連する、エピト ープに結合するようである。 モノクローナル抗体が本発明に係るモノクローナル抗体の特異性をもつかどう かを決定するためのさらに他の方法は、ポリペプチドは、それが通常反応性であ る本発明に係るポリペプチドと共に本発明に係るモノクローナル抗体を前インキ ュベートし、そして次に、シストされるモノクローナル抗体が抗原に結合するそ の能力において阻害されるかどうかを決定するために、そのテストされるモノク ローナル抗体を添加することである。テストされるモノクローナル抗体が阻害さ れる場合、十中八九、それは、本発明に係るモノクローナル抗体と同一の、又は 密接に関連するエピトープ特異性をもつ。 本発明に係るGAD₆₅は、それが液相中で使用され又は固相担体に 結合されることができる免疫検定における使用に特に合っている。さらに、これ らの検定において使用されるGAD₆₅は、さまざまな方法で検出可能に標識付けさ れることができる。 本発明に係るGAD₆₅を使用することができるイムノアッセイの例は、直接的又 は間接的形式のいずれかにおいて競合的及び非競合物イムノアッセイである。こ のようなイムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ(RIA)、サンドイッチ（ 免疫計測検定）及びウェスタン・ブロット検定である。本発明に係るGAD₆₅に結 合する抗体の検出は、生理学的にサンプルに対する免疫化学量論的検定を含む、 フォワード、リバース、又は同時モードのいずれかにおいて行われる免疫検定を 使用して行われることができる。使用されるGAD₆₅の濃度は、使用される検出可 能な標識の性質及び免疫検定のタイプに依存して変化するであろう。しかしなが ら、使用される免疫検定のタイプに拘らず、使用されたGAD₆₅の濃度は、日常的 な実験を使用して当業者に容易に決定されることができる。 本発明に係るGAD及びGAD断片は、多くの異なる担体に結合され、そしてポリペ プチドと特異的に反応する抗体の存在を検出するために使用されることができる 。あるいは、担体結合GAD及びGAD断片はGAD関連失調をもつ、又はもつ危険のあ る患者における自己抗体の体外吸収のために治療的に使用されることができる。 よく知られた担体の例は、ガラス、ポリスチレン、ポリビニル・クロライド、ポ リプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストイン、ナイロン、ア ミロース、中性及び修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、及びマ グネタイトを含む。担体の性質は本発明の目的のために可溶性又は不溶性のいず れかであることができる。当業者は、GAD₆₅に結合するための他の好適な担体の ことを知るであろうし、又は、日常的な実験を使用してこのことを確認する ことができるであろう。 当業者に多数の異なるラベル及びラベリング方法が知られている。本発明にお いて使用されることができるラベルへタイプの例は、酵素、ラジオアイソトープ 、コロイド状金属、蛍光化合物、化学発光化合物、及び生物発光化合物を含む。 あるいは、GAD酵素ドメインを含んで成る本発明に係るポリペプチドは、GAD酵 素活性を測定することによりGADに対する抗体を検出するために使用されること ができる。例えはGAD₆₅とGAD₆₅に対する抗体をもつ疑いのある試料は、GAD₆₅と それらの抗体との間に結合を生ぜしめるのに十分な条件下及び時間にわたりイン キュベートされることができる。。この反応生成物は、沈降され、そして次にGA D酵素活性についてテストされる。 本発明の目的のために、本発明のGAD₆₅に結合する抗体がさまざまな生物学的 液体及び組織中に存在することができる。GAD₆₅に対する抗体の検出可能な量を 含むいずれかのサンプルを使用することができる。通常、サンプルは、液体、例 えば尿、唾液、脳脊髄液、血液、血清その他、あるいは固体又は半固体、例えば 組織、糞その他である。 本発明の検定における使用のための材料は、理想的には、キットの調製に合っ ている。このようなキットは、密閉領域内と、１以上の容器手段、例えばバイア ル、チューブその他であってその容器手段の各々が、本発明において使用される であろう別個の要素の中の１を含んで成るものを受容するために区画化された担 体手段を含んで成る。例えば、これらの容器手段の中の１つは、担体に結合され たGAD₆₅を含んで成ることができる。第２容器は、凍結乾燥形態において又は溶 液体中に、可溶性の検出可能にラベルされた第２抗体を含んで成ることができる 。 さらに、これらの担体手段は、さまざまな所定量のGAD₆₅をそれらの各々が含 んで成る複数の容器を含むこともできる。これらの後者は次にら、GAD₆₅に対す る未知量の抗体を含むサンプルから得られた結果を補間されることができる標準 曲線を調製するために使用されることができる。 全てのユーザーが行わなければならないキットの使用においては、容器に、検 出されるべき測定可能であるが未知量のGAD₆₅に対する自己抗体、第１容器内に 存在する所定量の担体結合GAD₆₅、及び第２容器内に存在する所定量の検出可能 な標識付けされた第２抗体が添加される。あるいは、検出不可能に標識付けられ たGAD₆₅が、サンプル及び検出可能に標識付けされた第２抗体が添加される容器 に付着されて提供されることができる。インキュベーションのための適当な時間 の後、免疫複合体が形成され、そしてその上清液から分離され、そしてこの免疫 複合体又はその上清液が、例えば、放射線係数又は酵素基質の添加、及び顕色に より、検出される。 他の態様においては、本発明に係るGADポリペプチドを含んで成るキットが、 患者におけるGAD関連自己免疫疾患の段階を検出するために使用されることがで きる。本明細書中さらに示すように、出願人は、特定のGADペプチド又は断片が 自己免疫疾患におけるさまざまなレベルの進行に関連し、そして疾患進行のレベ ルが免疫細胞増殖応答、例えばその患者の病因Ｔ−細胞のものを探すことにより 確かめられることができることを発見した。 用語“改善する(amelioratas)”とは、治療を受けている患者における自己免 疫応答の有害効果の軽減を表す。用語“治療的に有効”とは、自己免疫応答に因 子疾患の原因を改善するために十分な量のGAD₆₅ポリペプチドが使用されること を意味する。 本発明に係る全体GAD₆₅を含む、GAD₆₅ポリペプチドは、GAD₆₅ に関連する自己免疫応答をもつ、又はもつ危険のある患者において治療的に使用 されることができる。このような治療は、例えば、GADに対する耐性を誘発するG AD₆₅ポリペプチドの投与により達成されることができる。このような投与は、非 標識及び標識GAD₆₅ポリペプチドを使用することができる。非標識GAD₆₅ポリペプ チドが有利に使用されるとき、それは、例えば、GAD65ポリペプチドが免疫応答 を刺激するにはあまりに小さいが自己免疫応答の継続を結合し、又は遮断するに は十分大きい断片にあるような形態にあるであろう。例えば、GAD₆₅は、エピト ープ−サイズのペプチド（典型的には長さ５−12アミノ酸）に酵素により消化さ れ、そしてそれにより、自己免疫疾患をもつ患者の、体液中又は免疫細胞の表面 上に存在するFab結合性部分に結合することができるであろう。あるいは、Ｔ− 細胞MHC レセプターに結合するための少なくとも１の決定基をもつペプチドが同 様に製造され又は化学的に合成されることができる。 あるいは、治療剤による標識された本発明に係るGAD₆₅ポリペプチドが、投与 されることができる。これらの剤は、本発明に係るGAD₆₅ポリペプチドに直接的 又は間接的にのいずれかにおいて結合されることができる。間接的カップリング の１例は、スペーサー部分の使用によるものである。これらのフペーサー分子は 、今度は、不溶性又は可溶性のいずれかであることができ(Diener，et al.，Sci ence，231：148，1986)、そしてその標的部位におけるGAD₆₅ポリペプチドからの 薬物放出を可能にするように選択されることができる。免疫治療のための本発明 に係るGAD₆₅ポリペプチドに結合されることができる治療剤の例は、薬物、ラジ オアイソトープ、レクチン、及び毒素である。 本発明に係るGAD₆₅ポリペプチドに結合されることができる薬物 は、マイトマチシンＣ、ダウノルビシン(daunorubicin)、及びビンブラスチン(v inblastine)のような薬物と伝統的には言われる化合物を含む。 免疫治療のための本発明に係るジオアイソトープ抱合GAD₆₅ポリペプチドの使 用においては、特定のアイソトープが、白血球分散並びに安定性及び放射のよう な要因に依存して他のものより好ましくあることができる。自己免疫応答に依存 して、いくつかのエミッター（emitters）が他のものより好ましくあることがで きる。一般的に、αとβ粒子放射性ラジオアイソトープが免疫治療において好ま しい。好ましいのは、短レンジ、高エネルギーαエミッター、例えば²¹²βｉで ある。治療目的のために本発明に係るGAD₆₅ポリペプチドに結合することができ るラジオアイソトープの例は、¹²⁵Ｉ，¹³¹Ｉ，⁹⁰Ｙ，⁶⁷Cu，²¹²Bi，²¹¹At，²¹²P b，⁴⁷Sc，¹⁰⁹Pd及び¹⁸⁸Reである。 レクチンは通常植物材料から単離されるタンパク質であり、特定の糖部分に結 合する。多くのレクチンは、細胞を凝集され、そしてリンパ球を刺激することも できる。しかしながら、リシンは免疫治療に使用されている毒性レクチンである 。これは、毒性効果の部位特異的デリバリーを可能にするため抗体分子に、毒性 の原因であるリシンのα−ペプチド鎖を結合することにより達成される。 毒素は、十分な投与量においてしばしばち致死性である。植物、動物、又は微 生物により作られた毒性物質である。ジフテリア（Diphtheria）毒素は、治療的 に使用されることができるコリネバクテリウム・ジフテリア（Corynebacterium diphtheria ）により作られる物質であるこの毒素は、適当な条件下で分離される ことができるαとβサブユニットから成る。毒性Ａ成分は、GAD₆₅ポリペプチド に結合され、そしてGAD₆₅ポリペプチドためのレセプターを発現す る白血球への部位特異的デリバリーのために使用されることができる。 本発明に係るGAD₆₅ポリペプチドに結合されることができる他の治療剤、並び にエクスビボ及びインビボ治療プロトコールは、当業者により知られており、又 は容易に確かめられることができる。 本発明は、上記疾患をもつか、又はもつ危険のある患者における疾患過程を改 善するために治療的に投与され、又はそれを同定するために診断的に使用される ことができるポリペプチドにも関する。各種アミノ酸を表すために使用される慣 用の１文字コードは以下のようである： 本発明に係るポリペプチド配列は、ヒトGAD₆₅、ヒトGAD₆₇、及びピコルナウイ ルス、コクサッキー・ウイルスのＰ２−ｃタンパク質のアミノ酸配列を比較する ことにより同定された。このＰ２−Ｃポリヌクレオチドは、ウイルス膜結合複製 錯体において役割を演じる。これらの分析は、GAD₆₅分子とコクサッキー・ウイ ルスの両方の間の広い配列類似性の存在を確立した。GAD₆₅とＰ２−Ｃポリペプ チドの６つの連続アミノ酸残基のエア・ポリペプチドは、アミノ酸配列において 同一である。事実、このポリペプチド内の24アミノ酸の中で、１９が同一であり 又は保存されている。さらに、この領域に高い抗原性を付与するであろうプロリ ン残基の存在及び高い電荷密度も存在する。 表２中、実線は同一アミノ酸を囲み、一方、点線は類似の電荷、極性、又は疎 水性をもつアミノ酸残基を囲む。 この共通ポリペプチド領域の発見は糖尿病の沈降における“分子擬態(mimicry )”のための疫学的役割をサポートする。従って、IDDMに遺伝的になり易い患者 がコクサッキー・ウイルスにより感染される場合、その免疫は、その患者のβ− 細胞内の類似のGAD配列に応答する。この免疫学的応答は、そのβ−細胞の最終 的な破壊及びIDDMのその後の提示をもたらす抗原的に類似のGADポリペプチドに より維持される。 現在、IDDMにおける膵臓β−細胞の破壊は細胞の自己免疫応答により仲介され ると信じられている。本明細書中に記載するように、本発明に係るポリペプチド はGADに対する自己免疫応答を改善することができる。自己免疫疾患の複雑さの ために、本発明に係るポリペプチドがこのような疾患う改善するために使用され ることを許容するであろう多くの可能性のある治療もダリティーを具現化するこ とができる。１の態様においては、本発明に係るポリペプチドは、抗原提示細胞 (APC)の表面上に自己抗原を提示する特異的なＴの細胞とセプター(TCR)又はMMC レセプターによる認識を遮断するために使用されることができる。このような認 識の阻害は、例えば、次にMMCレセプターの抗原裂片(antigen-cleft)内に提示さ れる自己免疫抗原を置き替えることができる本発明に係るポリペプチドを患者に 提供することにより、生じることができる。しかしながら、特定の理論に結び付 けられることを欲しないけれども、本発明に係るポリペプチドは、たぶん、GAD 特異的病因Ｔ−細胞の表面上の適当なTCRと直接的に相互作用することにより免 疫寛容を生じる状態を誘発し又は回復するために働くと信じられている。TCRと の直接的相互作用のこの後者の治療的アプローチは、実施例によりサポート され、そして自己免疫応答の制御が、好ましくは可溶性の高濃度のポリペプチド の使用による高−領域耐性の誘導を通じて達成されることができるということを 示唆している。他の可能性のある機構は、本発明に係るポリペプチドが、Ｔ−細 胞MHC レセプターへの結合により病因Ｔ細胞をエネルギー化し、それにより適当 な同時刺激シグナルを防止するという役割を演じることができる。 あるいは、本発明に係るポリペプチドは、自己認識を回復し、そしてこれによ り自己免疫疾患を改善するためにＴ−サプレッサー細胞集団を刺激するために使 用されることができるであろう。Ｔ−サプレッサー細胞集団の刺激は、例えば、 MHC IIレセプターの裂片(clcft)内に在る時差免疫抗原上に存在するエピトープ に特異的な１の可変領域及び、CD8⁺レセプター上に存在するエピトープに特異的 な第２の可変領域をもつ２−特異的抗体の使用により、達成されることができる であろう。本発明に係るポリペプチドに特異的な抗体の産生は、２以上のエピト ープについての特異性をもつ２−特異的抗体の調製と同様に、当業者にとって日 常的なことである。 本発明に係るポリペプチド・アナログであって、同時刺激性シグナルの欠如の ために、Ｔ細胞内においてアネルギーを誘導し又は一定レベルの抗原抗示におい て自己抗原の認識について競合するであろうものがデザインされることができる 。MMC分子は単一のペプチド結合性部位を含むので、疾患関連MHC分子との高いア フィニティーをもって結合するであろうが疾患原因性のＴ−ヘルパー細胞を活性 化しないであろうポリペプチドをデザインすることができる。このようなポリペ プチドは、自己抗原認識のための拮抗物質として作用する。本発明においては、 この機構のためのサポートは、実施例、特に実施例７にある。このようなアプロ ーチについての先例は、 マウス・リゾチーム・ポリペプチド、その自体非免疫原性であるいは、ニワトリ −卵白リゾチームからの免疫原生ポリペプチドとのMHC結合について競合し、そ してそれによりそのポリペプチドによるＴ細胞活性化を減少させることができる という観察から生じ(Adorini，et al.，Nature，334：623-625，1988)、そして Ｔ細胞、自己抗原とMHC間の複合体の形成を遮断するためのＴ−細胞レセプター ・ペプチドを使用して研究する(Howell，et al.，Science,246：668，1989)。同 様に、有効なポリペプチド・アナログをスクリーニングするためのこのような治 療アプローチは、実験的自己免疫脳脊髄炎(EAE)の如き自己免疫疾患において使 用されてきた(Wraith，et al.，Cell，59：248，1989；Urban，et al.，Cell，5 9 ：257，1989)。 本発明に係るポリペプチド内のアミノ酸残基を表すために使用される１文字記 号は本分野において一般的に使用される記号である。本発明に係るペプチドは、 中性アミノ酸配列だけでなく、アナログ、化学的誘導体、又はそれらの塩である ペプチドも含む。 用語“アナログ”又は“存在性異体”とは、本明細書中に提供するポリペプチ ドに実質的に同一のアミノ酸配列をもついずれかのポリペブチドであって、その 中で１以上のアミノ酸が商業的に類似のアミノ酸により置換されているものをい う。例えば、１の極性アミノ酸、例えばグリシン又はセリンが、他の極性アミノ 酸を置換することができ；又は１の酸性アミノ酸、例えばアスパラギン酸が他の 酸性アミノ酸、例えばグルタミン酸を置換することができ；又は塩基性アミノ酸 、例えばリシン、アルギニン、又はヒスチジンが他の塩基性アミノ酸を置換する ことができ；又は非極性アミノ酸、例えばアクニン、ロイシン、又はイソロイシ ンか他の非極性アミノ酸を置換することができる。 用語“アナログ”又は“保存性異体”は、本発明に係るポリペプチドから１以 上のアミノ酸が欠失され又は付加されているが未だそのようなペプチドに実質的 なアミノ酸相同性を保持しているいずれかのポリペプチドをも意味する。実質的 な配列相同性は、70％を上廻る、好ましくは少なくとも約80％、そしてより好ま しくは約90％のいずれかの相同性である。用語“断片”は：少なくともアミノ酸 残基をもつ本明細書中に同定されたポリペプチドのいずれかのより短い異体をも 意味し、ここで、その断片は生物学的活性を有し、又は刺激性ポリペプチド断片 又は実質的に全体長の分子によるＴ−細胞の刺激を阻害することができる断片で ある。 用語“化学的誘導体”は、本発明に係るポリペプチドから誘導されたいずれか のポリペプチドであって、１以上のアミノ酸が、そのポリペプチド内に存在する アミノ酸残基の官能性側基の反応により化学的に誘導体化されているものを意味 する。従って、“化学的誘導体”は１以上の化学的段階により本明細書中に同定 する配列又はポリペプチドから誘導されたポリペプチドである。このような誘導 体分子は、例えば遊離のアミノ基がアミン・ヒドロクロリド、Ｐ−トルエン・ス ルホアミド、ベンゾキシカルボアミド、Ｔ−ブチルオキシカルボアミド、チオウ レタン−型誘導体、トリフルオロアセチルアミド、クロロアセアミド（choroace amide）、又はホルムアミドを形成するように誘導化されたような分子を含む。 遊離のカルボキシル基は、塩、メチル及びエチル・エステル又は他のタイプのエ ステル又はヒドラジドを形成するように誘導体化されることができる。遊離のヒ ドロキシル基は、Ｏ−アシル又はＯ−アルキル誘導体を形成するように誘導体化 されることができる。ヒスチジンのイミダゾール窒素はＮ−im−ベンジルヒスチ ジンを形成するように誘導体化されることができる。化学的誘導体として、20の 標準アミノ酸 の１以上の天然アミノ酸誘導体を含むようなポリペプチドも含む。例えば、４− ヒドロキシプロリンが、プロリンを置換することができ；５−ヒドロキシルリシ ンが、リシンを置換することができ；ア−メチルヒスチジンがヒスチジンを置換 することができ；ホモセリシンがセリンを置換することができ、そしてオルニチ ンがリシンを置換することができる。 本発明は、表２と表９に表された図示ポリペプチドに限定されず、その代わり 、本発明の範囲内にあるポリペプチドはエクサシキー・ウイルスＰ２−Ｃのアミ ノ酸28とアミノ酸50の間の領域、又はGAD₆₅のアミノ酸250とアミノ酸273の間の 領域、又はGAD₆₇のアミノ酸258とアミノ酸281の間の領域、並びにGAD₆₅のアミノ 酸78とアミノ酸97の間の領域、又はアミノ酸247とアミノ酸266間の、又はアミノ 酸335とアミノ酸356の間の、又はアミノ酸479とアミノ酸498の間の、アミノ酸50 9とアミノ酸528の間の、又はアミノ酸524とアミノ酸543の間の、又はアミノ酸53 9とアミノ酸556の間の、又はアミノ酸564とアミノ酸583の間の領域、から外に延 び、又はこれより少ないものを含んで成ることができる。但し、所定のポリペプ チドの実質的部分が、その領域、又はセグメント又はそれらの組合せからのアミ ノ酸配列を特徴とし、そして本ポリペプチドは、自己免疫疾患に対して所望の免 疫学的又は生物学的活性を示す。さらに、本発明に係るポリペプチドは、表２と 表９中に示すようなポリペプチドよりも長さにおいてより長く又は短い、又はそ れらのセグメント又は組合せを含んで成るものを含む。但し、このようなポリペ プチドは、表２と表９に図示されるアミノ酸の間の領域から実質的に成り、そし て免疫学的又は生物学的活性を示す。本発明に係るポリペプチドの全ては、上記 自己免疫疾患を刺激間又は増強してはならない。 従って、本発明に係るポリペプチド内のいずれか１のポリペプチド特定の選択 は、不当な実験を含まない。このような選択は、多数のポリペプチドを採り、そ して自己免疫疾患を改善することにおけるそれらの免疫学的及び生物学的活性に ついて又は抗体の検出についてそれらをテストすることにより行われることがで きる。 NODマウスは、糖尿病を改善し又は防止することができる本発明に係るポリペ プチドをスクリーニングするための優れた、そしてよく特徴付けされたモデルを 代表する。実施例７は、生物学的活性をもつ候補ポリペプチドの日常的スクリー ニングのための許容される手順を説明する。 本発明に係るポリペプチドは、固体支持体上での合成を含む、公知のポリペプ チド合成方法を使用する組換え技術又は慣用の合成により調製されることができ る。好適な固相合成技術の例は、Merriweather（J.Am.Chem.Soc.，85：2149，19 63）により記載されたものである。他のポリペプチド合成技術、例えばBodanszk y，et al.，Peptide Syuthesis，John Wiley & Sons，2d ed.，1976、並びに当 業者に知られた他の文献中に見られる。ポリペプチド合成技術の要約は、Stewar t，et al.，Solid Phase Peptide Syuthesis，Pierce Chemical Company，Inc. ，Rockford，III.，1984中に見られる。溶液方法によるポリペプチドの合成も、 例えば、The Proteins，Vol．II，3d ed.，Neurath，et al.，eds.，105，Acade mic Press，New York，NY,1976中に記載されたように使用されることができる。 このような合成における使用に適当な保護基は、上記文献並びにJ.McOmie，Prot ective Groups in Organic Chemistry，Plenum Press，New York，NY，1973中に 見られる。 本発明に係るポリペプチドは、所望のポリペプチドをコードするDNA配列によ り形質転換された適当な宿主内で調製されることもで きる。例えば、ポリペプチドはそのポリペプチドをコードするDNA配列により形 質転換され、そしてそれを発現する適当な宿主の醗酵により調製されることがで きる。あるいは、本発明に係るポリペプチドのいくつかをコードするDNA配列は 共に連結され、そしてそれらの配列が次に、適当な宿主が上記自己免疫疾患に関 連するポリペプチドの発現を許容するようにするために使用されることができる 。 本発明に係るGADポリペプチドの投与のための投薬レンジは、その自己免疫応 答の徴候又は細胞破壊が軽減されるのに十分な量である。投与量は、有害な副作 用、例えば不所望の交差反応、アナフィラキシー反応その他を引き起こす程多量 であってはならない。一般的に投与量は、その患者における年齢、症状、性別、 及び疾患の程度に伴って変化するであろうし、そして当業者により決定されるこ とができる。投与量は、いずれかの反対徴候（counterindications）の事件にお ける個々の内科医により調整されることができる。投与量は、１〜数日間にわた り、１日当り１回以上の投薬において、約0.1mg／m²〜約2000mg／m²、好ましく は約0.1mg／m²〜約500mg／m²／投薬に変化することができる。 本発明に係るGADポリペプチドは、一定時間にわたる注射又は段階的灌流によ り非経口的に投与されることができる。本発明に係るGADポリペプチドは、静脈 内、腹腔内、筋中、皮下、腔内、経皮、鼻腔内、又は腸内に投与されることがで きる。 非経口投与のための調製物は、滅菌水性又は非水性溶液、懸濁液、及びエマル ジョンを含む。非水性溶媒の例は、プロピレン・グリコール、ポリエチレン・グ リコール、植物油、例えばオリーブ油、及び注射可能な有機エステル、例えばオ レイン酸エチルである。水性担体は、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョ ン又は懸濁液 であって、生理食塩水及び緩衝化媒質を含むものを含む。非経口媒体は、塩化ナ トリウム溶液、Ringer′sデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、 乳酸化Ringer′s液、又は固定油を含む。静脈内媒体は、液体及び栄養補給物、 電解質補給物（例えば、Ringer′sデキストロースに基づくもの）その他を含む 。保存剤及び他の添加物、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、及び不活 性気体その他が存在することもできる。 本発明は、本発明に係るGAD₆₅ポリペプチドを含んで成る薬物又は医薬組成物 の製造方法であって、その薬物がGAD₆₅に対する自己免疫応答の治療のために使 用されるような方法にも関する。 以上の開示は、一般的に本発明について説明するものである。より完全な理解 は説明の目的のために本明細書中に提供され、そして本発明の範囲を限定するこ とを意図しない以下の特性の実施例を参照することにより得られることができる 。実施例１ GAD₆₅のクローニング及び発現 Ａ．組換DNA手順 GAD₆₅とGAD₆₇に特異的なcDNAプローブを得るために、全RNAを、Chirgmin，et al．(Biochemistry，18：5294，1979)の方法を使用するグアニジン・イソチオシ アネート−セシウム・グラジエントにより成熟ラット脳から抽出した。ポリ（Ａ ）RNAを、Bethesda Research Laboratories(BRL)によるプロトコールを使用して 、オリゴdTセルロース±で精製した。第１ストランド合成を、示唆された条件を 用いて、MMLV−逆転写酵素(BRL)を使用して行った。但し、ポリｄ(N₆)-mers(Pha rmacia)をプライマーとして使用した。このcDNA-RNA混合物を65℃において15分 間熱失活させ、そして−20℃において保存した。PCRのために、このサンプルの １／50をその100 μｌ反応物に添加した。縮重オリゴヌクレオチドを、（cDNAからの）ネコ(Kobay ashi，et al.，J.Neurosci.，７：2768,1987)及び（ペプチドからの）ラット（C hang and Gottlieb，J.Neurosci.，８：2123，1988）GAD（図１）の下線共通ア ミノ酸配列をコードするように合成した（Applied Biosystems）。各々の縮重オ リゴヌクレオチドの５′−末端配列は、S_st ＩとHindIII（５′オリゴ）又はS_st ＩとS_st II（３′−末端オリゴ）のいずれかにより認識されたDNA配列の１のス トランドを含んでいた。これらのプライマーは、Gould,et al．（Proc.Natl.Aca d.Sci.，USA，86：1934，1989）により記載されたような縮重cDNA銭型のポリメ ラーゼ連鎖反応による選択的増幅のために使用された。PCR生成物を、HindIII／ S_st Ｉ ２重消化Bluescript SKベクター（Stratagene）内にサブクローン化し、 DH５(BRL)内に形質転換し、そして標準的な方法によりプレートした（Maniatis ，et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab oratory，Cold Spring Harbor，NY，1989）。 コロニー・ハイブリダイゼーションを、ネコGAD₆₇に特異的な５′−³²Ｐ末端 標識オリゴヌクレオチドを用いて行った（Kobayashi,et al.，J.Neurosci.,７： 2768，1987）。オリゴヌクレオチドの末端標識付け、ハイブリダイゼーション条 件、及び洗浄条件を、記載されたように行った(Wallace，et al.，in Guide to Molecular Clouing Techniques；Berger，et al.，Eds．in Methods of Enzymol ogy；Abelson，et al.，Eds．Academic Press，Inc.，San Diego,432-442，1987 )。但し、そのニトロセルロース・フィルターを15分間50℃において洗浄した。 このハイブリダイゼーションにおいて陽性と陰性であったコロニーを個々に拾い 上げ、そしてTerrific Broth（Tartof、et al.，Focus,９：12，1987）中で一夜 増殖させた 。DNAを一沸騰法を使用して単離し（Maniatis，et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY ，1989）、そして鋳型を0.2 Ｎ NaOHにより変性させ、そしてSephacyl Ｓ400ス パン・カラム(Pharmacia)により精製した。変性した２本鎖鋳型の配列決定は、 Ｔ７−配列決定キット(Pharmacia)を用いて連鎖停止法（Sanger，et al.,Proc.N atl.Acad.Sci.，USA，74：5463，1977）により行った。 図１中に示すように、PCR−生成ラットGAD₆₅とGAD₆₇とDNAを、標準的な技術（ Manictis，et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Ha rbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1989）により、S.Heinemaun(Salk Institute)により提供されたラムダZAP(Stratagee)ラット海馬ライブラリーをス クリーニングするためのプローブとして使用した。2400ヌクレオチドGAD₆₅ cDNA （最大クローン）をStratageneにより記載されたように“一撃(zapping)”によ り単離し、そしてサブクローン化した。既に手もとにある3.2kbラットGAD₆₇ cDN Aクローンよりも小さなラットGAD₆₇ cDNAが得られたとき、より大きなcDNAを配 列決定した。ExoIII欠失(Henikoff，Gene，28：351，1984)をGAD65とGAD₆₇につ いて両方向において作り、そして鋳型を先に記載したように調製し、そして配列 決定した。アンカーPCR(Auchored PCR)(Frohman，et al.，Proc，Natl.Acad.Sci .，USA，85：8998，1988)を、そのライブラリー・スクリーニング内で単離され た元のcDNAクローン内で提示されていないGAD₆₅とGAD₆₇ mRNAの残りの５′−末 端をクローン化するために行った。これらのクローンの配列決定は、GAD₆₅とGAD₆₇ mRNAのいずれもその元のcDNAクローンの先にデザインされた開始コドンと共 にフレーム内にさらなる開始コドン(ANG_s)のいずれをも含まないということを表 した。実施例２ クローン化GAD₆₅の特徴付け Ａ．ノーザン・ブロット・ハイブリダイゼーション ２つのPCR−誘導cDNAプローブを、GAD₆₇とGAD₆₅ cDNAが２つの異なるmRNAから 得られたかどうかを決定するために、ラット脳RNAを含むノーザン・プロットに ハイブリダイズした。RNAを実施例１に記載したように抽出した。ポリ（Ａ）RMA をホルムアルデヒド中電気泳動により分離し、そしてBiotrans(2CN)膜上に転写 し、そしてハイブリダイゼーションをWell，et al.(J.Neurosci.，16：311,1986 )により記載されたように行った。但し、100μｌ／mlのポリ（Ａ）を添加した。 プローブをFeinbergとVogelstein(Anal．Biochem．，132：６，1983)のオリゴラ ベリング手順により約10⁹dpm／μｇに標識付けした。同一結果をGAD₆₅とGAD₆₇ c DNAの全体長クローンを用いてその後に得た。 図５中に示すように、レーン１と２は、ラット小脳から抽出された１μｇのポ リ（Ａ）選択RNAを含む。レーン１は、ネコGAD₆₇（Kobayashi,et al.，J.Neuros ci.，７：2768，1987）のラット同種物(cognate)のためのcDNAプローブにハイブ リダイズし、そしてレーン２は（GAD₆₅に対応する）ラット・ペプチド配列のた めのcDNAプローブを用いて行われた。 ラット・ペプチド配列のためのcDNAプローブは5.7KbRNAにハイブリダイズされ 、一方、ネコGAD₆₇ cDNAのラット同種物のためのcDNAプローブは、３．７KbRNA にハイブリダイズした。これは、GAD₆₅とGAD₆₇が同一のmRNAから誘導されないこ とを立証する。 Ｂ．GAD₆₇とGAD₆₅のゲノム・ハイブリダイゼーション GAD₆₇とGAD₆₅が別個の遺伝子から生じるという可能性を調査するために、GAD_{6 7} とGAD₆₅の両方のcDNAをゲノムDNAを含むDNAブ ロットにハイブリダイズさせた。 サザン・ブロットのために、ゲノムDNAを記載されたようにラット肝から抽出 した(Kaiser，et al.，in DNA Cloning，vol.I，A Practical Approach，D.M.Gl over ed.，IRL Press，Oxford，pp．38-40，1985)。DNA（10μｇ／サンプル）を 供給者（BRL,Gaithersburg，MD）により推奨された条件を使用してE₁₀RIとHindI IIにより完全に消化した。DNA断片を、0.8％アガロース中で16時間1.5V／cmにお いて電気泳動をにより分離した。次にDNAを、Gatti，et al.(Biotechniques,２ ：148，1984)に記載されたようにZeta-Probe膜(Bio-Rad)に転写し、ハイブリダ イズし、そして洗浄した。但し、５μｇ／mlのCarnation乾燥乳がDanhardt′s溶 液の代わりに用いられた。サザン・プロットのためのプローブを、上記実施例１ 中に記載したように標識付けした。 図６中に示すように、HindIIIとE₁₀RＩにより消化されたゲノムDNAは、それぞ れレーン１と３とレーン２と４にある。GAD₆₇ cDNAはレーン１と２にハイブリダ イズされ、一方、GAD₆₅ cDNAはレーン３と４にハイブリダイズされた。ゲルの側 に添う数字は、キロベースにおけるDNA断片サイズである。 このデータは、この２つのcDNAが異なるサイズのゲノム断片にハイブリダイズ することを示している。さらに、GAD₆₅とGAD₆₇ cDNAの同一ヌクレオチド配列の 最大連続伸長は長さがたった17ヌクレオチド・ベースである。従って、GAD₆₇とG AD₆₅は２つの別個の遺伝子によりコードされている。 Ｃ．GAD₆₇とGAD₆₅の酵素比較 GAD₆₇とGAD₆₅の活性に対するPLPの効果を比較する研究を行った。その比較に おいて、両方のcDNAをバクテリア内でのそれらの発現を許容するベクター内にサ ブクローン化した(Studier，et al., J.Mol.Biol.，189：113，1986)。“融合しない(fusionless)”GAD₆₅とGAD₆₇の過 剰発現を、GAD₆₅ cDNAをpET-8c 9NcoＩ部位内に、そしてGAD₆₇ cDNAをpET-5cベ クターのNhe Ｉ部位内にサブクローニングすることにより達成した(Studier，et al.，J.Mol.Biol.,189：113，1986)。 両cDNAのフレーム内サブクローニングを矯正するための互換性付着末端を得る ために、選択的増幅をその混合物中200μＭ dNTPsと1.5mM MgCl₂を含む、United States Biochemical(USB)により示唆された条件を使用し、そしてAmpliTAQ(USB )の不義(infidelity)を減少させるための20サイクルを伴う55℃におけるアニー リングすることにより行った。GAD₆₅とGAD₆₇に特異的なプライマーは、それぞれ 、Nco ＩとSpe Ｉ認識部位の１のDNAストランドを含んでいた。GAD₆₇のコード領 域内にNhe Ｉ制限部位があるので、（NheＩと互換性である)SpeＩを使用した。 PCR生成物をそれらの対応pETベクター内にサブクローン化し、DH５内に形質転 換し、そして記載されたようにプレートした(Maniatis，et al.，Molecular Clo ning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Ha rbor,NY，1989)。コロニーを拾い上げ、そして50μｇ／mlアンピシリンを含むLB ブロス中で一夜増殖させた。正しい方向をもつサブクローンを過剰発現のために BL21(DE3)株(Studier，et al.，J.Mol.Biol.，189：113，1986)内に形質転換し た。ネガティブ・コントロールとして、挿入物を全く含まないpET-8cベクターを 形質転換し、そしてその後に導入した。単一コロニーを拾い上げ、培養し、１mM イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクト−ピラノシド（IPTG）により誘導し、そし て記載されたようにSDS-PAGEゲル上で分析した（Sambrook，et al.，Molecular ．Cloning a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laborat ory Press，Cold Spring Harbor，17.15-17.16，1989）。 GAD活性を計測するために、我々は、１mM IPTGを用いてOD₆₀₀-0.5においてバ クテリアの10mlカルチャーを誘導した。インキュベーションの２時間後、バクテ リアを回転沈降させ、そして１mlのホモジェナイジング・バッファー(１mlフエ ニルメチルスルホニル・フルオリド（PMSF）、１ml２−アミノエチルイソチオウ ロニウム・ブロミド(AET)、及び60mMリン酸カリウム、pH7.1)中に再懸濁し、そ して音波処理した。音波処理後、細胞死骸を遠心分離により除去し、そしてタン パク質濃度を上清中で計測した（Bradford，Anal.Bio chem.，72：248，1986） （上清を−70℃においてアリコートにおいて保存した。）。脳ホモジェネートを 記載されたように調製した(Legay，et al.，J.Neurochem.，46：1478，1986)。G AD活性を、0.2mMPLPの存在又は非存在を伴って、そしてそのインキュベーション 混合物中20μｌの脳ホモジェネート又はバクテリア溶解物を用いて、記載された ように(Krieger，et al.，J.Neurochem.，33：299,1984)計測した。バクテリア 溶解物中の¹⁴CO₂の生産は、インキュベーション時間とタンパク質濃度に関して 線形であった。 表３中に示すように、GAD₆₅又はGAD₆₇を含むバクテリア溶解物は、〔１−¹⁴Ｃ 〕−グルタメートの、GABAと¹⁴CO₂への変換を触媒 する。 PLPは、GAD₆₇よりもGAD₆₅の酵素活性を刺激する。このより大きな刺激は、た ぶん、Martinと共同研究者(Martin，Cell.Mol.Nearobiol.，７：237，1987)によ り提案された失活サイクルを通じてのGAD₆₅のより速いサイクリングを反映して いる。このより速いサイクリングは、GAD₆₅がインビボにおいて存在するアポーG ADのプールにより大きく寄与するということを示唆する（Miller,et al.，Brain Res.Bull.,５（Suppl-2）：89，1980）。従って、インビボにおいては、PLPは 、GAD₆₇活性よりも良好にGAD₆₅活性を調節するようである。 バクテリア溶解物中のGAD₆₅活性は、ラット黒質から調製されたミナプトソー ム内にあるGAD活性の５倍のPLP刺激に類似する（Miller，et al.，J.Neurochem. ，33：533,1979）。GADの両方が、粗ラット脳ホモジェネート中のGAD活性よりも 、バクテリアにおいて添加されたPLPにより依存するので、バクテリア溶解物の 内因PLP濃度はラット脳ホモジェネートよりも低いことができる。 Ｄ．GAD₆₅とGAD₆₇の免疫学的同定 ラット脳ホモジェネート及びバクテリア溶解物を先に記載したように抽出した 。等容量のローデイング・バッファーを記載されたように各サンプルに添加した （Harlow，et al.，Autibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor La boratory，Cold Spring Harbor，NY，1988）。タンパク質をSDS中10％アクリル アミド・ゲル中の電気泳動により分離し、そしてニトロセルロースに電気泳動的 に転写した（Harlow，et al.，Autibodies，A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1988）。未反応部位を、１時間4 2℃において２％ウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、１％ゼラチン、及び１％Trito n−Ｘ−100を含むホスフ ェート・バッファー生理食塩水(PBS)によりブロックした。洗浄後、ニトロセル ロース・フィルターを次に３つのセクションに切断し、そして以下の１次抗体と 共にインキュベートした：レーン１〜４、GAD₆₇とGAD₆₅の両方を認識する、Oert el，et al．（Neuroscience，６：2689，1981）の抗血清の１／2000希釈；レー ン５−８、GAD₆₇だけを認識する、Ｋ−２抗血清の１／2000希釈；レーン９−12 、GAD₆₅に特異的である、GAD−６モノクローナル抗体の１／2000希釈(Chang，et al.，J.Neurosci.，８：2123,1988)。全てのフィルターを十分に洗浄し、そし て適当な２次抗体をインキュベートし、そして洗浄した。結合抗体を¹²⁵Ｉ−標 識プロテインＡ及びオートラジオグラフィーを用いて検出した。各レーンは以下 のものを含んでいた：レーン１〜５、及び９はBL21(DE3)＋pET−GAD₆₇；レーン ２，６、及び10はBL21(DE3)＋pET−GAD₆₅；レーン３，７、及び11は、ラット脳 ホモジェネート；そしてレーン４，８、及び12はBL21(DE3)＋pET-8c。 バクテリアにより生産されたGAD₆₅とGAD₆₇の免疫ブロットは、GAD₆₅が脳抽出 物中のより小さなGADに実際に一致し、そしてGAD₆₇がそのより大きな形態に一致 すること（図７）を立証した。先の研究は、ネコGAD₆₇とマウスGAD₆₇について、 より大きなGADとのGAD₆₇の一致を立証している(Katarova，et al.，Eur.J.Neuro sci.，２：190，1990；235，1987)。（Oertel，et al.Neuroscience，６：2689 ，1981の抗血清により検出されるような）バクテリアにより生産されたGAD₆₅とG AD₆₇の移動度は、ラット脳ホモジェネートにおいて見られた免疫反応性２重縁に 同一である。 ラット脳内のGADのより小さな分子量形態とより大きな分子量形態はこれ故、 抗原性及びサイズにおいて、それぞれ、GAD₆₅とGAD₆₇とcDNAの生成物に同一であ る。従って、ラット脳内の２つのGAD はGAD₆₅とGAD₆₇である。これらのデータから、Tapia(Bayon，etal.，J．Neuroch em.，29：519，1977)による報告されたPLP-依存性とPLP-非依存性GADの分子同一 性がそれぞれGAD₆₅とGAD₆₇であるということも結論された。Martinと共同研究者 (Spink，et al.，Brain Res.，421：235，1987)はラット脳GADの４つの速度的に 異なる形態の存在について報告した。しかしながら、これらの形態の（本明細書 中に使用した抗血清を用いた）免疫ブロッティング実験は報告されていなかった 。 Ｅ．脳組織内のRNAにおけるGAD₆₅とGAD₆₇の分布 in situハイブリダイゼーションを使用して小脳内のRIVAにおけるGAD₆₅とGAD_{6 7} の分布を測定するための実験を行った。 GAD₆₅とGAD₆₇ cDNAからのそれぞれ3.2kbと2.3Kbの転写物を、Wuenschell，et al．（Proc，Natl，Acad.Sci.,USA，83：6193，1986）の手順に従って³⁵Ｓによ り放射標識付けした。200塩基対の加水分解断片をラット小脳の冠状切片にハイ ブリダイズさせた。動物をハロタン(halothane)下で麻酔し、そして断頭した。 脳をドライ・アイス中で速やかに冷凍し、そして冠状の凍結切片（12μｍ）を、 新たに調製したホスフェート−バッファー生理食塩水(PBS; 130mM Nacl，10mMリ ン酸Na，pH7.0)中４％ホルムアルデヒド中で30分間固定した。この組織を等級エ タノール溶液を通して脱水し、そして−70℃において保存した。 組織透過性を増加させるために、その切片を以下の前処理に供した：等級エタ ノール溶液を通しての再水和（95％、85％、70％、50％、及び30％エタノール中 各々５分間）PBS（５分間）；0.02N HCl（10分間）；PBS（５分間）；DBS中0.01 ％Triton N-101（１分間）；PBS（２×５分間）；１μｇ／mlプロティナーゼＫ （7.5分間）；及びPBS中（プロテイィーゼＫを阻害するための）グリシン（３× ５分間）。プロティナーゼＫを使用前に37℃において30分間消化した。切片を次 に50％ホルムアミド、750mM NaCl、25mM EDTA、0.2％ SDS、0.02％ BSA、0.002 ％ Ficoll、0.02％ポリビニルピロリドン、250μｇ／ml酵母tRNA、250μｇ／ml ポリＡ、及び25mM PPES(pH6.8)中37℃においてインキュベートした。 ハイブリダイゼーションのために、100mM DTT、10％硫酸デキストラン、及び センス又はアンチセンス³⁵S-RNAを前ハイブリダイゼーション溶液に添加した。 約３ng（10⁶cpm）のプローブ（センス又はアンチセンス）を含むハイブリダイゼ ーション溶液のアリュート（50μｌ）をスライド上に添加した。各スライドにカ バーガラスをかけ、そして50℃において16時間インキュベートし、その後、シリ コーン化カバーガラスを４×SCC(１×SCC−150mM NaCl、60mMクエン酸Na，pH7.0 )中での簡単な洗浄により取り外した。 次に切片を37℃において20分間リボヌクレアーゼＡ（0.5M NaCl、10mMチオ硫 酸Na，１mM EDTA，10mMトリスHCl，pH8.0中50μｇ／ml）により処理し、そして ２×SCC，10mMチオ硫酸Na中室温において２時間、55℃において30分間濯いだ。 切片をエタノール中で脱水し、キシレン中で脱脂し、Kodak NTB2エマルジョンに よりコートし、そして４℃において10日間露出させた。このエマルジョンをKoda k D19により顕色し、そしてその組織をクレジル・バイオレット(cresyl violet) により対比染色した。 オートラジオグラフの粒を反射偏光を使用して検出し、そして粒の数、密度、 nd細胞領域を、Analytic Imaging Concepts画像アナライザー・システムを用い て測定した。その低いバックグラウンド・レベルにより、“標識された”細胞を 規定するための基準は５以上のクラスター粒の存在に基づいた。GAD標識細胞は 、その脳の全体に散乱していることが発見され、個々の細胞上の粒の数の計測が 可能であった。細胞と、粒によりカバーされた領域の境界は、細胞当りの粒の数 の計算を許容した。この分析を、その染色細胞と重ねられた粒を同時に可視化す るために反射偏光と透過光の両方を使用して、高倍率（800倍）において行った 。数は、“ｎ”細胞の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍである。 全てのニューロン・タイプにおいて、GAD₆₇mRNAレベルはより大きい。 in-situ ハイブリダイゼーションによる観察は、小脳におけるPLP依存対独立G AD活性の比がテストされた脳領域内で最低のものの中の１であるという先の発見 （Nitsch，J.Neurochem.，34：822，1980;Denner，et al.，J.Neurochem.，44： 957，1985；Itoh，et al.，Neurochem．Res．６：1283，1981）と矛盾しない。 さらに、表３に示すように、GAD₆₇ mRNAについての量のオーダーは、プルキーニ ュ（Purkinje）＞ゴルジ(Golgi)II＞バスケット（Basket）＞星型（Stellate） 細胞であり；反対に、GAD₆₅ mRNAについては、この順番は、ゴルジII＞プルキー ニュ＞バスケット＞星型細胞である。 GAD₆₅とGAD₆₇ mRNAの発現は、従って、ニューロンのクラスの中で異なる。全G AD活性に対する各々の寄与は、今度は、GABA生産がどのように調節されるかに影 響を及ぼす。例えば、黒質は、PLP-依 存対PLP-独立GAD活性の最高比の中の１を含む(Nitsch，J.Neurochem.，34：822 ，1980)。GABA代謝の阻害剤の局所的注射による黒質内のGABA濃度の増加は、発 病羅病率（seizure susceptibility）の減少において特に有効である（Gale，Fe d．Proc.，44：2414，1985）。PLP-アンタゴニストによる誘導された発病と経験 るす実験動物はそれ故、黒質内の特に神経末端におけるGAD₆₅の阻害のために発 病の拡大を阻止することができないかもしれない。 Ｆ．GAD₆₅とGAD₆₇の亜細胞の位置 GAD₆₅とGAD₆₇の分布を、Ｓ₂とシナプトソームの亜細胞画分において評価した 。Ｓ₂は、脳内の全ての細胞の細胞質から成る高速上清であり、一方、シナプト ソーム画分は主として神経末端から成る(Gray，et al.，J.Anat.，Lond，96：79 ，1962)。これらの研究のために、全ラット脳分画をBooth and Clark(Booth，et al.，Biochem，J.,176：365，1978)により記載されたように行った。タンパク 質濃度を、Schaffner and Weissman(Schaffner，et al.，Anal.Biochem．56：50 2，1973)により測定した。サンプルを記載されたように(Kaizer，et al.，DNA C loning，Vol．１，A Practical Approach,D.M.Glonered．(IRL Press，Oxford， 1985，pp.38-40))調製し、そしてGAD-６モノクローナル抗体とＫ−２抗血清を使 用して上述のように行った。等量のタンパク質（16μｇ）を各々レーンに添加し た。オートラジオグラフィーは、Ｋ−２抗血清とGAD-６モノクローナル抗体の両 方を用いて、1,3,１０，３０，１００μｇのタンパク質濃度をもつ抗体に対して 結合する増加する量の¹²⁵Ｉ−プロテインＡの線形応答を示した（データを図示 せず）。 これらの結果は、GAD₆₇が両画分中に等量において存在したことを示した。上 記Ｓ₂画分はブリア（並びに他の非ニューロン）及びニューロン細胞を含むので 、GAD₆₇の濃度は、神経末端内よりもニ ューロン細胞体内でより大きくかければならない。これに反し、GAD₆₅の濃度は 、Ｓ₂中よりもシナプトソーム内でより高かった。これらの亜細胞画分実験は、G AD₆₅とは異なり、GAD₆₇のより大きな画分が神経末端内よりもニューロンの細胞 体内に存在するということを示唆している。従って、免疫組織化学と同様に亜細 胞画分は、GAD₆₅とGAD₆₇が異なる亜細胞分布をもつことを示す。 GABA合成と分解の阻害剤を使用するインビボにおける実験は、ニューロン細胞 体内のGABAプールがその神経末端内のものと異なるということを示唆した（Iada rola，et al.，Mol.Cell．Biochem.，39：305,1981）。GAD₆₇により作られたGAB Aは、細胞の代謝において（例えばGABAシャントにおいて、そして２つの細胞の 樹状突起間のシナプスにおいてより関連されることができる。嗅球（olfactoryb wlb）内の粒状細胞の樹状突起：僧帽弁の（mitral）樹状突起による２つの細胞 の樹状突起間のシナプスを形成し（Shepard，Physiol．Rev.，52：864，1972)、 そしてたぶんGABAを放出するもの（McLenan，Brain Res.,29：177-184,1971）は 、Ｋ−２抗血清により強く標識される。本明細書中には示さないけれども、それ はまた嗅球内でGAD₆₅ mRNAレベルよりもより大きなGAD₆₇が見い出された（２− ３倍）。この分布は、嗅球内のほとんどのGAD活性がＳ₂とＰ₁（粗核ペレット） 内に存在し、そしてシナプトソーム内に存在しないという報告された発見(Quinn ,et al.，J.Neurochem.，35：583，1980)と矛盾しない。 GAD₆₅とGAD₆₇の異なる亜細胞分布は、細胞骨格のつなぎ止め(anchoring)から 又はいくつかの未知のタンパク質標的化機構から生じることができるであろう。 いくつかの骨格タンパク質は、GAD₆₅とGAD₆₇に似た分布をもつ。例えば、培養さ れた交感ニューロンにおいて、Peng，et al.CJ.Cell.Blol.，102：252，1986)、 はタウ (tau)の84％が軸索内にあり、一方、MAP-２の100％が細胞体及び樹状突起内にあ る。さらに、43kdタンパク質、細胞骨格タンパク質は、下にある膜細胞骨格にそ のアセチルコリン・レセプターをつなぎ止めると教示されている(Flucher，et a l.，Neuron,３：163,1989)。実施例３ 臨床試料中のGAD自己抗体の検出 Ａ．材料と方法 １．患者試料。４群の個体からの血清をAtkinsonと共同研究者(Atkinson，et al.，Lancet，335：1357-1360，1980)により先の研究から選択した。これらの群 は：（１）群、University Florida,Diabetes Clinicsに言及されている確立さ れたNational Diabetes Data Group（NDDG）基準(Gleichman，et al.，Diabetes ，36：578-584，1987)に従って診断された１の新たな開始IDA患者；（２）群、 自己免疫疾患のいずれの知られた家族病歴をもたない５つのランダムに選ばれた 島細胞細胞質抗体(ICA)陰性非糖尿病対照；（３）群、IDDのそれらの書類となっ た臨床開始３〜667日前に採取された血清をもつ13患者；（４）群、非糖尿病対 照及び親族、及びIDDのそれらの開始前に研究された者；並びに（５）群、IDDM についての危険にある３人の患者であるが開始が未だ生じていない者、から成る 。この後者の群は、IDD発端者（probands）の5000以上の一親等及び（4813人が 学童であった）一般集団からの8200個体の前進予想ICAスクリーニングを通じて 確認された。 ２．島細胞自己抗体。ICAは、血液型Ｏの低温切断膵臓上の間接蛍光により検 定された(Atkinson，et al.，Lancet，335：1357-1360，1990)。全ての結果は、 各バッチ内に対照陰性及び陽性血清を伴って、コードされたサンプルについて翻 訳された。ICA陽性の程 度を、ICAの標準化のためのImmunology Diabetes Workshop(IDW)により確立され たガイドラインを用いて分析した(Gleichmam，et al.，Diabetes，36：578-584 ，1987)。全ての陽性血清を終点希釈により滴定し、そしてJnvenile Diabetes F oundation(JDF)単位を、80単位の国際JDF標準に先に換算された標準血清の参照 により測定した。本明細書中に報告された研究において、陽性ICA結果を10以上 のJDF単位複製タイターにより規定した。 ３．HLA DR タイプ分け。HLA DRタイプ分けを、DRトレー（One Lamda Labora tories，Los Angels，CA）を使用して、Van Rood and Von Leuwen(Nature，262 ： 795-797，1976)により記載された方法から改良されたように行った。 ４．ヒト島細胞。ヒト島細胞を、死体膵臓から単離し、そして前に記載したよ うに(Ricordi,et al.，Diabetes,37：413-420，1988)インビトロにおいて維持し た。この島細胞をインビトロにおいて(95％空気／５％CO₂)³⁵Ｓメチオニン(Amer sham，Arlington Heights，IL)により代謝標識付けした。 ５．島細胞抽出及び免疫沈降。 島細胞を，以下の修正を伴ってAtkinson，et al.，(Lancet,335：1357-1360， 1990)により先に記載したように抽出した。免疫沈降研究のために、島細胞溶解 物を、各1000島について、対照、IDD血清（100μｌ）、又はGAA-６（Chang，et al.，J.Neuro，８：2123-2130，1988）（トリス・バッファー99μｌ中１μｌ）( Atklnson，et al.，Lancet，335：1357-1360，1990)のいずれかと共にインキュ ベーション（２時間、４℃）することにより２回前清澄化した。次に免疫複合体 を過剰のプロテインＡセファロースCL−４Ｂ(Pharmacia，NJ)に吸収させた（１ 時間、４℃）。非結合（前清澄化）溶解物を含む1000の島細胞を代表するアリコ ート容量を次に、IDD又は 対照血清（25μｌ）、又はGAD-６（Chang，et al.，J.Neuro，８：2123-2130，1 988）（25μｌトリス・バッファー中１μｌ）のいずれかとインキュベートした （12時間、４℃）。プロテインＡセファロースCL−４Ｂとの他のインキュベーシ ョン（１時間、４℃）の後、その複合体を次に、0.1％SDS、1.0％TritonＸ−114 、及び２mM EDTAを含む50mM Tris HCl(pH7.4)により５回洗浄し、そして次に２ 段蒸留水中で再び１回洗浄した。このプロテインＡセファロースCL−４Ｂを次に Laemmli サンプル・バッファー(Laemmli，Nature,227：680-685，1970)中で沸騰 させ、そしてサンプルをSDS-PAGEとEnhance(New England Nuclear)を使用した蛍 光ラジオグラフィー（Kodak,Ｘ−omat AR5）に供した。あるいは、オートラジオ グラフをBETAGEN(Boston，MA)アナライザーにより分析した。64KA陽性と陰性血 清の両方を各々の検定において使用して検定間対照として役立たせた。すべての 蛍光ラジオグラフを、分析し、そして既知の検定間対照との比較の後、陽性又は 陰性として等級付けした。陽性血清サンプルを、サンプルが低強度64,000Ｍ_T バ ンドの免疫沈降をもたらすときに１に、中程度の強度バンドが観察される場合に ２に、そして免疫沈降されたタンパク質の強度が高かった場合に３に、指定した 。同様の等級付け手順を、免疫沈降された³⁵Ｓ−GAD₆₅と³⁵Ｓ−GAD₆₇に対応する バンドの強度のために使用した。 ６．免疫沈降。³⁵Ｓ−GAD₆₅又は³⁵Ｓ−GAD₆₇を含むバクテリア溶解物及びヒト 脳ホモジェネートからのGADの免疫沈降を、ヒト島細胞抽出物の免疫沈降研究に おいて先に記載したように行った。 ７．GAD検定。ヒト脳ホモジェネートを、ヒト島細胞において先に記載したよ うな患者血清と共にインキュベートした。吸収及び洗浄の後、プロテインＡアガ ロース・スラリーを３等容量にアリコートし、そしてGAD活性を記載されたよう に（Krieger，et al.，Neu rochem，33：299，1984)計測した。簡単に言えば、プロテインＡアガロース・バ ンドを、所定のインキュベーション混合物(Krieger,et al.，J.Neurochem，33： 299，1984)中（１−¹⁴Ｃ）−グルタメート（Amersham）と共にインキュベートし 、そして¹⁴CO₂の生産を、液体シンチレーション・カウンターにより定量した。 ８． ³⁵Ｓ−GAD₆₅と³⁵Ｓ−GAD₆₇の生産。ラットGAD₆₅とGAD₆₇ cDNAを先に記載 したようにバクテリア発現系内にサブクローン化した。³⁵Ｓ−GADの標識付けを 、TRAN³⁵Ｓ−ラベル(ICN)により15分間IPTG誘導バクテリア（最小培地中で増殖 させたもの）をパルス標識することにより行った。次にカルチャーを回転沈降さ せ、そして１mlのホモジェナイジング・バッファー(１mMフェニルメチルスルホ ニル・フルオリド(PMSF)、１mM２−アミノエチルイソチオウロニウム・ブロミド (AET)及び60mMリン酸カリウム、pH7.1)中で音波処理した。音波処理後、細胞死 骸を遠心分離により除去し、そしてタンパク質濃度を上清中で計測した(Bradfor d,Anal.Biochem.,72：248，1986)（上清を−70℃においてアリコート中で保存し た）。 Ｂ．IDDM試料の免疫反応性 IDDMをもつ患者からの血清を、ヒト脳ホモジェネードからGADを沈降させる能 力についてテストした。 表５中に示すように、IDDMについての危険のある又はIDDM患者の（５の中の） ４の血清は、対照患者からの血清よりも有意により大きな量の、ヒト脳抽出物の 酵素的に活性なGADに結合した。さらに、患者の中の１からの血清を、前−IDDM 期間から採取し、これ故、GADに対する自己抗体がIDDM徴候の開始前に存在する （以下のＣ参 照）。 さらなる実験（結果を示さず）は、２人のIDDMの危険のある患者の血清（DA、 DC）が組換えにより作られた³⁵Ｓ−GAD₆₅を免疫沈降させ、一方、組換えにより 作られた³⁵Ｓ−GAD₆₇は、患者DAの血清によってのみ認識され（そして³⁵Ｓ−GAD₆₅ よりもより小さな程度であった）。 患者DA血清を使用した追加の研究は、ヒト膵臓島細胞中で作られた特定のポリ ペプチドを認識する抗体の存在を示した。結合ポリペプチドの電気泳動分析は、 ヒトIDDM(Baekkeskov，et al.，Nature，298：167-169，1982)において、そして 動物モデル(Baekkeskov，et al.,Science，224：1348-1350，1984；Atkinson，e t al.,Diabetes，37：1587-1590，1988)において他により先に示されたような、 64KD成分に対する自己抗体の存在を立証した。GAD₆₅を認識するがGAD₆₇を認識し ないGAD-６モノクローナルによる、又はバクテリアにより作られたGAD₆₅による 、これらの血清の前吸収は、これらの血清が、この64KD膵臓ポリペプチドを認識 する能力を取り去った。この64KD自己抗原に対する自己抗体により認識されたエ ピトープはこれ故GAD₆₅内に存在し、これはこの64KD自己抗原が実際にGAD₆₅であ ることを示している。GAD₆₅の予想値を調査するために、IDDMの臨床的表われの 開始前に患者から採取された血清をGAD₆₅に対する自己抗体についてテストした 。 表６に示すように、12試料の中の９（75％）は³⁵Ｓ−GAD₆₅と免疫反応性であ った。さらに、これらの条件下、２患者（JAとVC）はGAD₆₅はGAD₆₇に免疫反応性 であったが、GAD₆₅に対してはそうではなかった。それ故、組合せにおいて、GAD₆₅ とGAD₆₇に対する自己抗体は、これらの患者血清の12の中の11（91％）中に存 在した。この発見は、GAD₆₅に対する自己抗体がGAD₆₇に対する自己抗体よりもよ り一般的であるけれども、検定における組換えGAD(GAD₆₅とGAD₆₇)の両方の使用 がIDDMのより大きな予言可能性を許容するであろうということを示唆する。これ らの血清の先のテスト(Atkinson，et al.，Langet，355：1357-1360，1990)は、 12の中の11、又は92％が、(ヒト膵臓島細胞から³⁵Ｓ−64KD分子と免疫反応した ことを立証した。64KD分子に対する検出可能な自己抗体を含むが、GAD₆₅に対す るものを含まない血清は、その64KD分子について最低のタイター(又は“１”)を 含む血清であった。 従って、得られた偽陰性は本検定において感受性を欠くことによるものであっ た。さらに、本検定は、64Kについて陰性であった１の患者（BR）においてIDDM を予言した。 これらの結果は、ヒト膵臓のβ−細胞内で同定された64KD分子がサイズ及び抗 原性においてラットGAD₆₅に同一であることを示す。さらに、IDDMの開始前に患 者から採取された血清はGAD₆₅に対する自己抗体を含む。従って、GAD₆₅組換え分 子は、IDDMを予言するための診断ツールとしてかなりの用途をもつ。内科医が実 際の徴候に先立ってIDDMを診断する能力は、インスリン治療が必要とされる前の 時間のより大きな延長をもたらすことができる。このような免疫検定の感度は、 膵臓のβ−細胞内に存在するGAD形態を提示するヒト起源の組換えGAD₆₅の使用に よりよくなるであろう。実施例４ ポリペプチドに対する免疫増殖応答 ポリペプチドを自動機器(Applied Biosystems)及び標準的な条件を使用して合 成した。これらのポリペプチドを次に、脾臓リンパ球及び島浸潤Ｔリンパ球（II TL_s）を刺激するそれらの相対能力を比較するためにテストした。この研究にお いて、GAD₆₅コア配列から及びポリオ・ウイルスの相同領域から得られるポリペ プチドを比較した。適当な細胞を、５×10⁴の照射脾臓細胞の存在中その対応の ポリペプチドと共に５日間培養した。³Ｈ−チミジンを、培養の最後の16時間に わたり添加した。 これらの研究において、ポリオ又はGAD₆₅ポリペプチドのいずれかに晒された 脾臓リンパ球のカルチャーの増殖活性における有意差は全くなかった。しかしな がら、両ポリペプチドがその培地対照内にあるものよりも高いＴ細胞応答を刺激 した。この脾臓細胞集団における増殖における差異の欠如は、GADポリペプチド 特異的Ｔ細胞のより低い頻度に因るものであることができる。 IITL集団は、同一のやり方で評価されたとき、細胞増殖における顕著な差異を 示した。この系においては、GAD₆₅ポリペプチドに対する応答は、その培養基又 はポリペプチドのいずれかのものよりも９倍大きなものであった。このデータは 、GAD₆₅がIITL集団におけ るＴ細胞応答のために重要な抗原であるということを示唆する。このデータは、 分子擬態が、糖尿病の病因において役割を演じることを示唆する。実施例５ GADはNODマウスの脾臓細胞の増殖を誘導する β細胞抗原(BCA)に対する増殖性Ｔ−細胞応答は、所定の年代順において非肥 満糖尿病(NOD)マウス・モデルにおいて自発的に発達する。このNODマウス実験モ デルは、ヒトにおけるIDDMの研究のために利用できる最も類似するインビボにお ける系と考えられる。本実施例は、GAD及び他のペプチドに晒されたとき新生か ら５月齢までの雌NODマウスからの脾臓細胞の抗原誘導芽体形成に対する研究に ついて記載している。 テストされたBCA_sは、GADの２つの形態の中の１(Kaufman，et al.，Science，232： 1138-1140，1986；Erlander，et al.，Neuron，７：91-100，1991；Kaufma n，et al.，Trends in Pharm，Sci．(印刷中))、64K自己抗原として先に知られ ているGAD₆₅(Baekkeskov，et al.，Nature，298：167-169，1981；Baekkeskov， et al.，Nature，347：151-156，1996)、カルボキシペプチダーゼＨ(CPH)(Casta no，et al.，J.Clin．Endoctrinol．Metab.，73：1197-1201，1991)、インスリ ン(Palmer，Predicting IDDM，Diabetes Reviews,１：104-115，1993)及びNOD Ｔ−細胞により認識された免疫優性決定基であることが示されているhspのペプ チド(Elias,Poc.Natl.Acad.Sci.,88：3088-3091、1991)を含んでいた。GADは、 特にGADに対する自己抗体がこの疾患の天然の病歴において初期に生じるために 、IDDMにおける開始標的抗原のための良好な候補である(Baekkeskov，前掲；Atk inson，et al.，Lancet，335：1357-1360，1990；Kaufman，et al.，J.Clin.Inv est.，89：283-29 2，1992)。さらに、遍在するhspとは異なり、GADは、β−細胞並びに免疫学的に 特権を与えられた中枢神経系(CNS)及び生殖腺内で主に発現される。対照抗原と して、ニワトリ卵白リゾチーム(HEL)、ヒト血清アルブミン(HSA)、大腸菌(E.col i.)β−ガラクトシダーゼ(β−gal)及びネズミ・ミエリン塩基性タンパク質(MBP )を含む無関係なプロトタイプの外来及び自己抗原を使用した。 NOD（Taconic farms）及びBALB／ｃマウス（Jackson Laboratories）を特定の 病原不含条件下で維持した。これらのマウスを所定の年齢で殺し、そしてその脾 臓を抗原に対するそれらの増殖性リコール応答についてエクスビボにおいて直接 的にテストした。脾臓細胞の単一細胞懸濁液を、３連培養において10μｇ／ml抗 原（又は７μＭペプチド）を含むか又は含まない２mMグルタミンを補った200μ ｌの無血清HL−１培地(Ventrex)中96ウェル・マイクロタイター・プレート内の ウェル当り１×10⁶細胞においてプレートした。この72時間の培養期間の最後の1 6時間の間、１μCi〔³Ｈ〕−チミジンをウェル当りに添加した。標識の取り込み を液体シンチレーション計数により計測した。 ヒトGAD₆₅(Bu，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，89：2115-2119,1992)と大腸菌 （E.coli）β−gal(対照)の両方を、金属アフィンティー・クロマトグラフィー によるそれらの速いアフィニティーを許容するヘキサヒスチジン・タブに基づい て組換えバクテリアから精製した(Hochuli，et al.，Bio／Technology，６：132 1-1325，1988)。ウシCPHはL.Frickerの好意によるものであり(Albert Einstein Col.Med.)、そしてヒト・インスリンをEl:Lillyから購入した。 図８に示すように、増殖性Ｔ−細胞応答は対照抗原に対していずれの時間点に おいても検出されなかったけれども、GADに対する応 答が、そのコロニーにおけるインスリン炎の開始と同時に生じて、NODマウスに おいて４週齢において生じた。GADにより誘導された芽体形成は、次の４週間に わたり増加し、そして次に16週までにバックグラウンド・レベルに下降した。６ 週齢において、抗−GAD反応性のピーク付近で、hspに対するＴ−細胞応答は15週 まで現れ、そして増加し、そして次に同様に下降した（図８）。テストされた全 てのNODマウスにおいて、hsp反応性は、抗−GAD応答に先行され、これは、前の 反応性が自己免疫過程の間に２次的な事件として顕出したことを示唆する。同様 に、４週齢においてはCPHに対する応答が全く検出されなかったので、強い抗−C PH応答が８週までに観察された。いくつかのマウスにおいては、インスリンに対 する弱い応答が12週において観察され、これは、145週齢においてより優勢にな った（図８及び表８）。抗原の中のいずれも、インスリン炎又はIDDMをその両方 が顕出しない、齢適合対照BALB／ｃ又は（NOD×BALB／ｃ）Ｆ，マウスからのＴ −細胞における増殖を誘導しなかった。Ｔ−細胞反応性は、その後、他のBCA_sま で上昇し、これは、その自己免疫応答の分子間多様化と矛盾しない。従って、GA Dに対する自己免疫応答は、テストされた自己抗原の中で最初に生じたものであ った。この点において、GADに対する免疫寛容化（tolerization）は、他のBCA_s とインスリン炎に対する自己免疫の拡散を防がなければならない。これが上記ケ ースでない場合には、GADに対する免疫寛容化は、これらの他の抗原に対する応 答に対し全く効果をもたないはずである。 芽体形成は、抗原−特異的CD4＋Ｔ−細胞の相対的クローン・サイズの近似を 提供する(Corradin，et al.，J.Immunol.，119：1048-1053，1977)。図８中のデ ータは、“自発的に”GAD反応性Ｔ−細胞がインスリン炎の開始と同時に生じる クローン増加を経験する ことを示す。これらの図は、内因性プライミング事件と矛盾しない。実施例６ GADによる耐性の誘導 本実施例は誘導されGADに対する耐性がIDDMを改善することができるというこ とを示す研究について記載する。 １．これらの実験において、雌NODマウスに、PBS中、50μｇのGAD、β−ガラ クトシダーゼ、マイコバクテリアのhsp65(m-hsp)又は0.1μｇの免疫優性hspペプ チド(hsp-p)を、３週齢において静脈内に注射した。12週齢において、マウスを 、インスリン炎及び自己抗原反応性Ｔ−細胞について検査した。この齢において 、両徴候か非処理NODマウスにおいて確立される。膵臓組織切片をインスリンに ついての免疫ペルオキシダーゼ技術により染色し、そしてヘマトキシリンにより 対比染色した。インスリン炎を各膵臓からの５つの中断組織切片上の54〜87島を 検査することによりブラインドのやり方で等級付けした。さまざまな抗原により 誘導された増殖性脾臓Ｔ−細胞応答を実施例４において先に記載したように行っ た。表８中のデータを３連培養において取り込まれた平均〔³Ｈ〕−チミジン標 識(cpm)として表す。 GAD処理マウスの75％は、その対照のいずれも除き、（完全な免疫寛容を示す ）GAD又は他のβCA_sに対するＴ−細胞反応性を全く示さなかった。これらのマウ スはまた全くインスリン炎をもたなかった。(等級0.0)。未知のβCAに特異的で あり、抗−GAD応答に先行する島内に他のエフェクターＴ細胞集団が存在した場 合、、この集団によるサイトカインの放出は、βCA_sとインスリン炎に対する促 進されたＴ−細胞応答をもつはずである(Sarretrick，et al.,Nature，346：844 ，1990; Heath，et al.，Nature，359：547，1992)。GAD−処理マウスの25パー セントが、弱く残ったGAD反応性（約３のSI）により証明されるように、GADに対 して完全に寛容とされず、そしてひじょうに限定された周辺−インスリン炎を示 した。これに反し、hsp抗原の両方に対する免疫寛容化は完全であったけれども 、これらの処理は、他のβCA_sに対するＴ細胞応答又はインスリン炎の顕出を減 少させたが、妨がなかった。従って、GAD−反応性Ｔ細胞の失活はβ細胞自己免 疫を妨害しないけれども、２次的な要素が増幅カスケードから取り除かれる場合 に予想されるであろうように、hsp免疫寛容化は部分的にそれを減少させただけ であった。 糖尿病指標に対するGAD免疫寛容化の効果を検査する進行中の実験においては 、GAD処理マウスの全て（ｎ＝17、目下37週齢）は正常なグルコース・レベルを もち、一方、対照抗原を受容するマウスの70％は19週齢までに高血糖症に発達し た。５匹のGAD処理マウスを30週齢に殺した。全てが検出可能なβCA反応性Ｔ細 胞を含んでいなかった。これらの５匹の動物の中で、４のマウスが完全にインス リン炎にかかっておらず、そして１がひじょうに限定された周辺−インスリン炎 を示した。これらのデータは、GAD反応性Ｔ−細胞の失活がインスリン炎と糖尿 病の長期間の顕出を妨ぐということを示 す。 ２．第２セットの実験において、新生雌NODマウスに、腹腔中に、ペプチド11 を含むIFA、ペプチド34と35の混合物プラスIFA、又はIFA単独を注射し、そして1 2週齢において、それらのマウスを実施例6.1におけるようにインスリン炎及び自 己抗原反応性Ｔ−細胞について検査した。各種抗原により誘導された増殖性脾臓 −細胞応答を実施例４におけるように行い、そして表８Ｂ中のデータを３連培養 において取り込まれた平均〔³Ｈ〕−チミジン・ラベル(cpm)として表す。 表８Ｂ中のデータは、対照ペプチド11による免疫寛容がGAD又はGADペプチド17 ，34又は35に対する自己抗体応答を妨害しなかったことを示す。また、hspペプ チドに対する応答もペプチド11による免疫寛容により妨害されなかった。IFA単 独は、免疫応答の抑制においていくぶん有効であった。これに反し、ペプチド34 と35の混合物による免疫寛容は、テストされた全ての種：β−gal，GAD，GADペ プチド17，34及び35、並びにhspペプチドに対する脾臓細胞増殖の自己免疫応答 を抑制した。さらに、GADペプチド34とて35に対する免疫寛容は、かなり、イン スリン炎を減少させるが、前GAD₆₅と同様にそれを完全に妨害しない。 ３．第３セットの実験においては、雌NODマウスに静脈内に３週齢において、 ペプチド11（対照）、ペプチド34と35の混合物プラスIFA、又はHELペプチドを注 射し、そして12週齢に、実施例6.1におけるようにインスリン炎と自己抗原反応 性Ｔ−細胞について検査した。さまざまな抗原により誘導された増殖性脾臓Ｔ− 細胞応答を実施例４におけるように行い、そして表８Ｃ中のデータを３連培養に おいて取り込まれた平均〔³Ｈ〕−チミジン標識(cpm)として表す。 表８Ｃ中のデータは、対照ペプチド11による免疫寛容が、GAD,GADペプチド17 ，34又は３５あるいはhspに対する自己抗体応答を妨害しなかった。但し、この 応答は実施例6.2におけるものと同様に大きくはなかった。hspペプチドに対する 応答はペプチド11による免疫感作により全く妨害されなかった。これに反し、ペ プチド34と35の混合物プラスIFAによる免疫感作は、テストされた全ての種：β −gal,GAD，GADペプチド17，34及び35、並びにhspペプチドに対する脾臓細胞増 殖の自己免疫応答を抑制した。実施例７ GAD-反応性Ｔ−細胞の特徴付け 本実施例は、休止／ナイーブなリンパ球から活性化／記憶リンパ球を区別する 追加の特性についてのGAD−反応性Ｔ−細胞に対する研究について記載する。 一連の実験において、γインターフェロン(IFNγ)を、GAD又は対照抗原HELとM BPによる挑戦後６−９週齢マウスの脾臓細胞の培養上清(CSN)中のELISAにより計 測した。さらに、抗原特異的IFNγ−産生細胞の頻度をELISAスポット技術(T.Tag uchi，et al.，J.Immunol.，145：68-77，1990)により測定した。10³脾臓細胞中 の抗原誘 導、スポット形成細胞(SFC)の頻度を図９（ａ）に表す。値を５匹の 個々の雌NODマウスからの平均＋SEMであり、各々が抗原と共に又はこれを伴わず に３連培養においてテストした。これらは、３つの別個の実験の代表である。 これらの実験の実施において、新たに単離された脾臓細胞を実施例４に記載し たように抗原と共に又はこれを伴わずに培養した。cSNを48時間後に採取し、そ してINFγの濃度をELISA(Macy，et al.，FASEB J.，3003-3009，1988)により測 定した。INFγ特異的モノクローナル抗体(mAB)Ｒ４−6A2(Pharmingen)をその捕 獲試薬とし て使用し、そしてビオチン化mAb×MG1.2(Pharmingen、これもIFNγに特異的であ る)を、結合リンホカインの検出のためにストレプトアビジン−アルカリ性ホス ファターセ(Zymed)とｐ−ニトロフェノールと共に使用した。組換えネズミ IFN γ(Pharmingen)を標準として使用した。抗原−特異的IFN γ−産生細胞の検出の ためのELISAスポット検定を記載されたように(Taguchi，et al.，J.Immunol.，1 45： 68-71，1990)行った。抗原と共に又は伴わずに脾臓細胞を24時間前活性化培 養した後、細胞を、mAb Ｒ４−６Ａ２により前コートされた96ウェル・マイクロ タイター・プレート(Millipore)に逐次希釈により移した。24時間後、これらの 細胞を除去し、そしてIFNγスポットを、ニトロブルー・テトラゾリウム−ブロ モクロロインドールイル・ホスフェート基質(Sigma)と共にXMG 1.2-ビオチンを 使用して可視化した。スポットを肉眼によりカウントし、そして抗原特異的細胞 の頻度を、抗原によるものと抗原によらずに見えるスポットの数の間の差から測 定した。 図９（ａ）に示すように、６−９週齢のNODマウスからの新たに単離されたＴ −細胞をGAD又は対照抗原により挑戦させたとき、高濃度のIFNγがGADを含むカ ルチャー中でのみ検出された。これはそのGAD特異的Ｔ−細胞がインビボにおい て前活性化されていたことを示唆する。なぜなら、前活性化Ｔ−細胞(Th1)だけ が抗原認識後48時間以内にINFγを作り出すからである（Ehlers，et al.，J.Exp .Med.，173：25-36 1991; Croft，et al.，J.Exp.Med.,176：1431、1437，1992 ）。これに反し、齢適合BALB／ｃマウスからのＴ−細胞は、INFγ生産によりGAD に又は対照抗原に応答しなかった（データを示さず）。 GAD−特異的Ｔ−細胞の頻度を直接的に計測するためのELISAスポット検定の結 果は、６−９週齢のNODマウスにおいては、対照抗 原に反応性のＴ−細胞は脾臓内の10⁵細胞中約１を構成するけれども、GAD−反応 性Ｔ−細胞の頻度は約２オーダー大きい大きさであり、10⁵細胞当り90-291細胞 のレンジにあった(図９(ａ))、これは、これらの細胞がインビボにおいてクロー ン増加していたという増殖検定（図８）により得られたデータを確認するもので あった。 他の一連の実験においては、GAD特異的Ｔ−細胞を、細胞表面マーカーＬ−セ レクチンの発現について特徴付けした。なぜなら、ネズミＴ−細胞がＬ−セレク チン⁺（L-sel⁺）からＬ−セレクチン-（L-sel^-）表現型へ活性化の間に変換する からである(Bradley,et al.，J.Immunol.，148：324-331，1992)。 これらの研究を行うために、３〜４の齢適合マウスからのプールされた脾臓細 胞を、接着性マクロファージ及びＢ細胞を除去するためにヤギ−抗−マウスIg(Z ymed)によりコートされたプレート上で洗った。次に、CD８⁺細胞をmAb 58.6-72( ATcc)によりコートし、そしてヤギ−抗−ラットIg(Zymed)によりコートされたプ レート上で洗う(Panning)ことにより除去した。非−接着性CD４＋細胞画分を抗 −Ｌ−セレクチンmAb MEL-14(ATcc)により標識し、そしてヤギ−抗−ラットIgコ ートされたプレート上で洗った。接着性（CD４＋Ｌ−sel⁺）と非−接着性（CD４ ＋Ｌ−sel^-）画分の両方をサンプル採取した。この細胞画分の純度をFACS分析に より評価した；細胞は＞90％CD４＋であり、そしてＬ−sel^-又はＬ−sel⁺表現型 について＞95％が強化されていた。これらの精製細胞画分を、抗原と共に又はこ れを伴わずに96ウェル、マイクロタイター・プレート内のウェル当り２×10⁵細 胞においてそれらを接種することによりGAD反応性についてテストした。３週齢N ODマウスの照射(3000rad)、非分離脾臓細胞を、抗原提示細胞の源としてウェル 当り５×10⁵細胞において添加した。３連培養の上清を48時間後に採取し、そ してそれらのIFNγ含量をELISAにより測定した。 この研究の結果は、２−３週齢までに、GAD反応性Ｔ−細胞がＬ−sel⁺又はＬ −sel^-集団のいずれかにおいて検出されることができないことを示し、これは、 この時点において低頻度の抗原反応性前駆体と矛盾しない。しかしながら、６週 齢までに、高レベルのIFNγが、CD４＋細胞のＬ−sel^-（Ｌ−sel⁺でない）再集 団においてGADにより（対照抗原によらない）誘導された（図９(ｂ)）。 GAD反応性Ｔ−細胞のクローン・サイズにおける増加、それらのIFNγの産生及 びそれらのＬ−sel^-表現型は、潜在的に病因性である(Ando，et al.，Cell Immu nol.，124：132-143，1989)Th1 型Ｔ−細胞応答がNOD顕出の初期においてインビ ボにおいてGADに自発的にプライムされるいう証拠の３つの独立した線である。実施例８ GAD特異的Ｔ−細胞決定基認識の特徴付け 抗−GAD Ｔ−細胞応答の良い特異性は、長さ20〜23アミノ酸（aa）であり、そ して５aa重複をもつ全体GAD₆₅(Bu，et al.，Proc.Natl-Acad.Sci.，89：2115-21 19，1992)配列にわたる38ペプチド（そのＮ−末端から順番に番号付けされた） の１セットを使用してマッピングされた（図10）。 上記GADペプチドに対する（実施例４に記載したような）増殖性応答について ４（図10ａ）、５（図10ｂ）及び７（図10ｃ）週齢NODマウスからの脾臓細胞に ついてテストした。ペプチドは７μＭにおいてカルチャー中に存在し、そして上 記標識が５日間の培養の最後の16時間の間に添加された。これらのペプチドを標 準的なFmoc化学を使用して合成し、そして逆相HPLC(Advancd Chemtech)により精 製した。刺激性ペプチドの配列を以下の表９に示す。 ネズミとヒトGAD₆₅はアミノ酸レベルにおいて95％同一であり(555／585)そし てそれらのＮ−末端付近で相違のほとんどをもって98％保存されている。上記刺 激性ペプチド配列内の下線アミノ酸はネズミGAD₆₅内で保存的に置換されている 。別々の実験において、キー・ペプチド(＃17と＃34)のネズミ形態がテストされ 、そして同様の結果を作り出した。 図10に示すように、刺激インデックス＞３の引き金を引いたペプチドを黒棒と して示した。これらのペプチドは、＜３又は＞16週齢のNO Dマウスから、又は 対照（BALB／ｃ×NOD）F1マウス（データを図示せず）からのＴ−細胞内での増 殖を誘導しなかった。これらのデータは、各々の齢群において２回テストされた ３−６の個々のマウスから、平均S1±計算された標準誤差として表される。個々 のマウスにおけるペプチド誘導芽体形成に特徴的な結果を表６に示す。４週齢に おける、第１の検出可能な応答は、GADのカルボキシ−末端領域に拘束され、そ して２つの隣接ペプチドに関連した（aa509-528と524-543、それぞれペプチド＃ 34と＃35、図10ａ）。５週齢において、コクサッキーウイルスとの配列類似性を もつ領域（ Kaufman，et al.，J.Clin.Invest.，89：283-292，1992)（図10ｂ）を含む追加 の決定基（aa 247-266，ペプチド＃17）に対する応答が規則的に記録された。次 の２週間の間、ペプチド＃17（aa 247-266）に対する応答が増加し、そしてＴ− 細胞自己免疫性がそのカルボキシ末端において２つの追加のペプチドにー広がっ た（aa 479-498と539-558：それぞれペプチド＃32と＃36、図10ｃ）。その後、G ADペプチドに対する反応性が下降し（データを図示せず）全体タンパク質に対す る応答の損失に平行した（図８）。βCA_sに対する開始Ｔ−細胞応答がNODマウス 内でなぜ衰えるのかは不明である。可能性のある説明は：ａ）免疫調節機械：ｂ ）内因性抗原による連続刺激のための応答の喪失；及びｃ）“非専門(nonprofes sioral)”抗原提示細胞、例えばβ細胞自体それらの自己抗原の認識による特定 のＴ−細胞におけるアネルギーの誘導(Markman,et al.，Nature，336：476-479 ，1988)。 この天然自己免疫疾患において観察されたプラインされた自己反応性Ｔ−細胞 レパートリーの段階的多様化は、CNSタンパク質の中で分子内及び分子間の両方 で自己反応性が広がる場合に実験的に誘導されたCNSに対する自己免疫性におい て最近観察されたＴ−細胞認識におけるシフトに平行する(Lehmann，et al.，Na ture，358：155-157，1992; Perry，et al.，J.Neuroimmu-nol.，33：７-15，19 91; Watanabe，et al.，Nature，305：150-153，1983; Liebert，et al.，J.Neu roimmunol.，17：103-118，1988)。明らかに、標的臓器内での自己抗原特異的Ｔ −細胞の第１の波によるリンホカインの分泌は、抗原提示のアップーレギュレー ションをもたらし、そして追加の自己反応性Ｔ−細胞のプライミシグに好ましい 微小環境を創出する(Lehman，et al.，Immunol.Today，14：203-208，1993; Sar vetnick，et al.,Nature，346：844-847，1990；Heath，e t al.，Natune，359：547-549，1992)。hsp反応性CD４＋Ｔ−細胞はIDDMを誘導 することができるので(Elias，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，87：1576-1580,1 990：ELias,，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci 88：3088-3091，1991)、他のβCA_s に反応性のＴ−細胞と一緒に、その活性化されたＴ−細胞プール中へのそれらの 回復は、たぶん、最終的にβ細胞破壊を導く増幅性カスケードを反映する。 簡単に言えば、上記データは、NODマウスにおけるIDDNの発病において決定的 な標的抗原としてGADを確立する。これらの結果は、Ｔ−細胞が、その疾患が進 行するとき分子内と分子間の両方においてβCA_sに対するＴ−細胞応答が多様化 することを示す、これは、ダイナミックな自己免疫レパートリーと矛盾しない(L emaun，et al.，Immunol，Today，14：203-206，1993)。しかしながら、初期自 己反応性Ｔ−細胞集団による妨害は、プライムされたレパートリーへの追加自己 抗原の回復を妨ぐことができ、それにより、最終的にβ細胞破壊を導く自己免疫 応答のカスケードを中断する。同様の自己免疫進行も、ヒトIDDMの発達の間に生 じる傾向があるので(Palmer，J.P.，Predicting IDDM，Diabetes Review，１：1 4-115，1993；Atkinson，et al.，Lancet，339：458-459，1992)、これさらの発 見は、ペプチド−ベースの免疫治療剤がヒトIDDMの予言及び改善において有用で あろう。実施例９ GAD断片との自己抗体反応性 本実施例は、ヒト患者の血清中のIDDM自己抗体によるヒトGAD₆₅ポリペプチド 内のエピトープの認識におけるバラツキを調査する研究について記載する。 ヒトGAD₆₅ cDNAの一部をポリメラーゼ連鎖反応(PCR; Saiki，et al.,Sience，239： 487，1988)により増幅して３つのポリペプチ ドのセグメント；アミノ酸残基１−224(セグメントＡ)：224-398(セグメントＢ) ；及び398-585(セグメントＣ)をコードするDNAセグメントを作り出した。各々の 構築物がＴ₇プロモーター、翻訳開始のためのコンセンサス配列及び開始×４オ ニン・コドンをも含んでいた(Korak，M.，J.Cell Biol.，108:229，1989)。次に 各PCR生成物を、供給者(Amersham Corp.，Arlington Heights，IL)により推奨さ れた条件を使用して、Ｔ₇ RNAポリメラーゼを用いてインビトロにおいて転写し 、そして³⁵Ｓ−メチオニンの存在中ウサギ網状赤血球無細胞系内でインビトロに おいて翻訳した。各テスト血清（30μｌ）を得られた³⁵Ｓ標識−ポリペプチドと 共にインキュベートした。結合したポリペプチドをPASにより単離し、そして12 ％ポリアクリルアミド中のSDS-PAGE及びオートラジオグラフィーにより分析した 。 表10に示すように、試料のいずれもGADのアミノ末端１／３（セグメントＡ） に対する検出可能レベルの抗体をもっていた。一方、９患者（41％）が中央の１ ／３（セグメントＢ）と反応性の抗体をもち、そして６患者（27％）がGADのカ ルボキシ末端１／３（セグメントＣ）に対する抗体をもっていた。実施例10 GADエピトープ認識パターンによる初期IDDMの予言 IDDM妨害治療の増加傾向及びIDDM関連合併症の防止における管理されたグルコ ース恒常性の（最近知られた）利点は、臨床的なIDDMの開始前及び（その10％が 最終的にIDDMに変換する）NIDDM患者におけるβ細胞自己免疫性の初期の検出を 最終的なゴールにする。GADに対する自己抗体は、分子として定められたIDDM関 連自己抗原の中で切迫したIDDMの初期かつ最も信頼できるマーカーを提供するこ とができる。GADペプチドがIDDM関連自己抗体に結合するかどうかを決定するた めに、以下の研究を行った。 ヒトGAD₆₅分子にわたる１セットのペプチド（長さ20〜23アミノ酸、５aa重複 ）を、危険にある、前 ^-IDDM及びIDDMをもつ（健康対照に対するもの）ほとんど の個体からの血清が、その分子の全体に分散されたGAD₆₅線状エピトープを別々 に認識する抗体を実際に作り出すかどうかを決定するために合成した。 患者血清とほとんどの対照血清は、先の研究（Kaufman，et al.,J.Clin.Inves tigation,前掲）において使用れれたものであった。全てのサンプルをコードし 、そしてブランドのやり方でテストした。ペプチドを、自動機器（Applied Bios ystems，Foster，City，CA）と標準的な条件を使用して合成した。ペプチドを20 μｇ／mlにおいて60mM重炭酸（炭酸水素）ナトリウム・バッファー(pH9.6)中に 溶解し、そして各々ａ100μｌを96ウェルNunc-Immuno Plateの２ 連ウェルに添加した。ペプチドを４℃において一夜結合の供した。次にプレート をPBs＋0.1％Tween 20（洗浄バッファー）により３回洗浄し、その後プレートを 37℃におょて0.5時間、又は室温において一夜重炭酸ナトリウム・バッファー中 ３％BSAにより前吸収した。次にプレートを上記洗浄バッファーで５回洗浄した 。PBS＋0.1％Tween 20と１％BSA中の１／300希釈における血清100μｌを各ウェ ルに添加し、そして抗体を37℃において１時間結合に供した。プレートを洗浄バ ッファーにより５回洗浄した。HRP−ヤギ抗−ヒトIgG(BRL，Gaithersberg，MD) の１／600希釈100μｌを各ウェルに添加し、そして37℃において１時間結合に供 した。次にプレートを７回洗浄し、そして100μｌの基質バッファーを室温にお いて30分間各ウェルに添加した。色顕色をELISAプレート・リーダー(ICNP Biome dicals，Costc Mesa，CA)を使用して410nmにおいて計測した。陽性血清を以下の ように定めた： サンプルのOD₄₁₀／陰性対照≧3.0。 表11に示すデータは、多数のGADペプチドが、対照血清によらず64K陽性である と先に示された患者により認識されたということを確立する。各患者は、GADエ ピトープ認識の異なるパターンを示した。ペプチド20，21及び25は、それぞれ、 ６／８の患者により認識され、そして13対照の中の１により認識されたペプチド 25を除き、いずれの対照によっても認識されなかった。これらのペプチドの中の ２（＃20と21）に対する免疫反応性に基づき、その患者の中の７／８（88％）が GAD自己抗体をもつものとして同定されることができたが、対照の中のいずれも 同定されることができなかった。ペプチド３，６，22，25と37はそれぞれ、患者 の中のたった25−37％により認識されたが（その対照血清の中のいずれによって も認識されず）、一緒になっし、その患者の75％がこれらの中の少なくとも１ を認識した。ペプチド５，９と24は、対照と患者血清の両方による免疫反応性に ついてしばしば陽性であった。 この感受性のレベルは、脳又は組換え生物から精製された全体GAD₆₅を使用し た最良の現在利用可能な検定に匹敵する。骨の折れる抗原精製を除いて、ペプチ ド・ベースの自己抗体スクリーニングは、PCRベースのHLAタイプ分けと一緒にな って、IDDMへの進行又は喪失及びその関連合併症に関連するエピトープ認識パタ ーンを明らかにすることができる。高危険にあると決定された個体は次に治療的 介入を考慮されることができるであろう。 自己抗体により認識されるGADペプチドが実施例６におけるNOD GAD反応性Ｔ細 胞により認識されたものと異なっていたということにも注目しなければならい。 実施例11 GAD免疫感作がIDDMからのNODマウスを保護する GAD₆₅をコードするcDNA_sの利用可能性は、GAD特異的Ｔ−細胞を妨害するよう にデザインされた新たな介在的治療におけるこの分子のテストを許容する。８週 齢、この時Ｔ細胞が多数のｂ細胞抗原に応答し、そしてインスリン炎が既に十分 に確立されている、においてNODマウスを保護するGAD₆₅免疫感作の能力を調べる ためにテストを行った。GAD免疫治療がこの段階において有効であった場合、自 己免疫過程が既に確立されているヒトにおける治療のための約束を保つであろう 。 方法抗原 IPTG誘導性Ｔ７発現ベクターをヒトGAD₆₅と大腸菌（E.Coli）ｂガラクトシダ ーゼ(β−gal)の両方を発現するために使用した。IPTG誘導組換え大腸菌（E.Col i ）においては、GADとβgalは全バクテリア・タンパク質の約10−20％を構成す る。しかしながら、GADのほとんど全ては封入体内にあり、これは、約80％GADで ある材料を得るために単離され、そして十分に洗浄されることができた。次に、 上記サブクローニング工程の間にGADに付着されたヘキサーヒスチジン“タグ(ta g)”に基づいてGADとβ−galのアフィニティー精製を行った。これらの余分のヒ スチジン残基は、金属アフィニティー・クロマトグラフィー（Hochuli，et al. ，Bio Technology,６：1321-1325，1988）によるGADの速いアフィニティー精製( Novagen)を許容する。この封入体材料は、６Ｍグアニジン・ヒドロクロリド（GH CL）、10mmβ−メルカプトエタノール及び１％TritonＸ−100中に可溶化される 。カラムに結合した後、このカラムをホスヘェート・バッファー中GHCLと８Ｍウ レアにより十分に洗浄した。 中央ピークのGAD画分だけをその後の研究のために使用した。ヒトGAD₆₅はネズミ GAD₆₅と96％のアミノ酸配列同一性を共有し、このアミノ酸の相違のほとんどは 保存的置換である。 GAD調製物は、免疫学的に検出可能な汚染物を含まないようであった。重層さ れた銀染色ゲル上にもバクテリア汚染物をも含まないようであった。national r eference laboratoryによる分析は、＜0.06ngＬPS／μｇGADを発見した。ヒトGA D₆₅は、＜４又は＞16週齢のNOD又は対照BALB／ｃ又は（NOD／BALB／ｃ）Ｆ１脾 臓細胞においてＴ細胞増殖を誘導しなかった。合成GADペプチドを使用した結果 （図10）は、全体組換えGAD使用したデータ（図８）に正確に平行である。IDDM に関連しない本明細書中の別の場所に記載する他の抗原（例えば、ベータ・ガラ クトシダーゼ）はNOD Ｔ細胞応答を誘導しなかった。GADによるマウス免疫感作 後、我々は、同一の金属アフィニティー・クロマトグラヤィー手順により組換え 大腸菌（E.coli）から精製された他のタンパク質を用いたリコール実験において 交差反の反応性Ｔ細胞応答を検出することができなかった。GADとβ−galのアミ ノ酸配列分析は、各々、単一の予想されたアミノ酸ＢＮ−末端配列を与えた。GA D調製物、脾臓、PBMC(Atkinson,et al.，中に存在する、許容される内毒素、熱 ショック・タンパク質、又は他の汚染物がある場合、疾患特異的でない増殖応答 が予想されるであろう。 ブリーダー・マウスをTaconic Farmsから購入し、そして特定の病原体不含条 件下で飼養した。雌NODマウスだけをこの研究のために使用した。このコロニー 内の無関係雌内のIDDM開始の平均齢は22週であった。インスリン炎は一般的に４ 週齢に始まることが観察される。GAD，HSP,CHPに対するＴ細胞応答は６週齢まで 見い出された。雌マウス内のIDDMの徴候は１年齢までに70−90％である。免疫感作 ８週齢において、25μｇGAD又は対照β−galを、100μｌの不完全Freundsアジ ュバント(IFS)中で、腹腔内（Ip）注射した。連続的な抗原提示の要求があるこ とができるので(Ramsdell，et al.,Science，257：1130-1133，1992)、マウスを ６週間ごとに再び処理した。尿中グルコース・レベルを週に２回モニターした。 尿中に正常値を超えるグルコーを観察した後、血中グルコース・レベルを週に２ 回モニターした。300mg／mlの２回の連続した血中グルコース・レベルの読みをI DDMの開始と考え、この後、マウスを殺し、そして脾臓細胞増殖の証拠について 実施例６に先に記載したように脾臓細胞をテストした。 ８週齢NODマウスの免疫感作は、対照β−gal免疫化マウスに比べてIDDMの開始 における明らかな遅延を作り出した（図11）。GAD免疫化マウスの中の２（白丸 ）が凡そ正常な開始齢（20週）においてIDDMを顕出したけれども、他の８のGAD 免疫化マウスは、36週齢まで高血糖病の徴候を全く示さなかった。このGAD処理 マウスの中の４が37と40週齢の間にIDDMを顕出した。GAD処理マウスの中の４は 目下（52週齢において）、疾患にかかっていない。これに反し、β−gal注射マ ウス（黒丸）のほとんどは、22週齢までに高血糖症をもち、そして６／10が27週 齢までにIDDMを顕出した。52週齢において、β−gal処理マウスの中の２が疾患 にかかっていない。本実験は、GAD免疫感作が、β細胞自己免疫が既に有意に進 行しているNODマウスの糖尿病を有意に遅延化し（＜0.02）又は防止することを 示す。 β細胞自己免疫は既に８週齢においてよく確立され、そして循環自己抗体に基 づいてIDDMについての危険にあると決定される個体内にもある傾向がある。この 保護の機構は明らかでないけれども、GA Dの周期的な注射は、この疾患の誘導に対するかなりの緩和効果をもつ。 本発明をこれまで十分に記載してきたが、本発明の範囲から逸脱せずに多くの 変更及び修正が行われることができるということが当業者に明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/88 9358−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/564 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/564 9284−4Ｃ Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ // Ａ６１Ｋ 39/395 9284−4Ｃ Ｎ 9051−4Ｃ 37/02 ＡＢＡ (72)発明者 コーフマン，ダニエル エル. アメリカ合衆国，カリフォルニア 90404, サンタ モニカ，センティネラ 1453，ア パートメント シー (72)発明者 クレアーサルツラー，マイケル ジェイ. アメリカ合衆国，フロリダ 32606，ゲイ ンスビル，ノース ウエスト トゥエンテ ィフォース レーン 62112

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 から成る群から選ばれたアミノ酸配列から本質的に成るポリペプチド。 ２．請求項１に記載のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列。 ３．DNAである、請求項２に記載のポリヌクレオチド。 ４．患者試料中のGADについする自己抗体の検出方法であって、その試料をGAD 断片と接触させ、そして自己抗体がその断片に結合するかどかを決定することを 含んで成る方法。 ５．断片が、長さ少なくとも約16アミノ酸のポリペプチドであり、そしてGAD のアミノ酸約224〜アミノ酸585のアミノ酸配列から選ばれる、請求項４に記載の 方法。 ６．断片が、請求項１に記載のポリペプチドである、請求項４に記載の方法。 ７．試料が血液である請求項４に記載の方法。 ８．ペプチドが検出可能な状態で標識付けれれている、請求項４に記載の方法 。 ９．検出可能な標識が、ラジオアイソトープ、蛍光化合物、コロイド状金属、 化学発光化合物、生物発光化合物、リン光化合物、及び酵素から成る群から選ば れる、請求項８に記載の方法。 10．ペプチドが、固相に結合されている、請求項４に記載の方法。 11．請求項１に記載のペプチドに対するモノクローナル抗体。 12．請求項９に記載のモノクローナル抗体を産生することができるハイブリド ーマ・セルライン。 13．請求項２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。 14．請求項２に記載のポリヌクレオチドにより形質転換された宿主細胞。 15．GAD関連自己免疫疾患をもつ又はもつ危険のある患者においてその疾患を 改善する方法であって、その患者に治療的有効量の、全体GAD₆₅又は治療的に有 効なその断片を投与することを含んで成る方法。 16．治療的に有効な断片が、長さ少なくとも約16のアミノ酸のポリペプチドで あり、そしてGAD₆₅のアミノ酸約224〜アミノ酸約585のアミノ酸配列から選ばれ るる、請求項15に記載の方法。 17．治療的に有効な断片が から成る群から選ばれる、請求項15に記載の方法。 18．治療的に有効な断片が から成る群から選ばれる、請求項15に記載の方法。 19．失調がIDDMである、請求項16に記載の方法。 20．失調がきついヒト疾患(stiff man disease)である、請求項16に記載の方 法。 21．投与が経腸である、請求項16に記載の方法。 22．経腸投与が経口である、請求項21に記載の方法。 23．投与が非経口である、請求項15又は16に記載の方法。 24．非経口投与が，皮下、筋中、腹腔内、腔内、経皮、経鼻、又は静脈注射に よる、請求項23に記載の方法。 25．投与が、約0.01mg／kg／投与量〜約2000mg／kg／投与量の投 与量におけるものである、請求項15に記載の方法。 26．ポリペプチドが治療的に標識付けれれている、請求項15に記載の方法。 27．治療的標識が、ラジオアイソトープ、薬物、レクチン、及び毒素から成る 群から選ばれる、請求項26に記載の方法。 28．患者においてGAD関連自己免疫失調の状態を検出する方法であって、その 患者のＴ−細胞を請求項１に記載の少なくとも１のポリペプチドに接触させ、そ してそのペプチドに対するそのＴ−細胞の応答を検出することを含んで成る方法 。 29．Ｔ−細胞の応答が刺激である、請求項26に記載の方法。 30．刺激が放射標識付けされたヌクレオチドの細胞取り込みにより計測される 、請求項27に記載の方法。 31．ヌクレオチドが³Ｈチミジンである、請求項30に記載の方法。 32．請求項１に記載のポリペプチドに対する抗体を、このような抗体を含む疑 いのある試料中で検出するのに有用なキットであって、請求項１に記載のポリペ プチドを含む容器を含んで成る１以上の容器をその内に閉じた領域内に受容する ように区画化された担体手段を含んで成るようなキット。 33．患者の試料中でGAD関連失調の状態を測定するのに有用なキットであって 、請求項１に記載のポリペプチドを含む容器を含んで成る１以上の容器をその内 に閉じた領域内に受容するように区画化された担体手段を含んで成るようなキッ ト。 34．GAD関連自己免疫失調をもつ又はもつ危険のある患者においてその失調を 検出ための方法であって、その患者に診断的に有効な量の、GAD₆₅の診断的に有 効な断片を投与することを含んで成るような方法。 35．診断的に有効な断片が、長さ少なくとも約16アミノ酸のポリペプチドであ り、そしてGAD₆₅のアミノ酸約34〜573のアミノ酸配列から選ばれている、請求項 34に記載の方法。 36．診断的に有効な断片が、 から成る群から選ばれる、請求項35に記載の方法。 37．失調がIDDMである、請求項35に記載の方法。 38．失調がきついヒト疾患(stiff man disease)である、請求項35に記載の方 法。