KR19990028640A

KR19990028640A - 당뇨병의 치료를 위해 사람 열 쇼크 단백질 60으로부터 유래된신규한 펩티드들, 조성물들, 방법들 및 장치들

Info

Publication number: KR19990028640A
Application number: KR1019970709962A
Authority: KR
Inventors: 알. 코헨 이런; 다나 엘리아스; 리브카 아불라피아; 자나 복코바
Original assignee: 파울리나 벤-아미, 야곱 코헨; 예다 리서치 앤드 디벨럽먼트 캄파니 리미티드
Priority date: 1995-06-30
Filing date: 1996-07-01
Publication date: 1999-04-15
Also published as: CZ295110B6; ES2239770T3; NO976094D0; EP0845943B1; AU6484596A; CN1193889A; IL122757A0; US6682897B1; EP0845943A4; IL122757A; KR100454554B1; CN1102598C; MX9800191A; UY24270A1; AU710882B2; DK0845943T3; WO1997001959A1; EP0845943A1; AR003446A1; NO976094L

Abstract

사람 60 kDa 열 쇼크 단백질(hsp60)의 에피토프들인 신규한 펩티드들은 인슐린-의존성 당뇨병(IDDM)의 진단 및 치료에 사용된다. 상기 펩티드들을 함유하는 약학적 조성물들 및 IDDM의 진단에 사용되는 장치들도 개시된다.

Description

당뇨병의 치료를 위해 사람 열 쇼크 단백질 60으로부터 유래된 신규한 펩티드들, 조성물들, 방법들 및 장치들

타입 Ⅰ 당뇨병, 즉 IDDM은 췌장의 섬(islet)들에 위치한 인슐린-생성 β-세포들을 공격하고 파괴하는 T 세포들에 의하여 유발되는 자가면역 질병이다(Castano and Eisenbarth, 1990). IDDM에서 절정에 달하는 자가면역 과정은 증상이 없이 시작되고 진행된다. 이 질병은 축적된 β-세포들 손실이 잔존하는 β-세포들의 인슐린 공급 능력을 압도할 때에서야 비로소 임상적으로 드러난다. 심지어, 포도당 항상성의 파괴와 임상적인 IDDM은, 80∼90 %의 β-세포들이 면역 시스템에 의하여 비활성화된 후에서야 발생한다고 여겨지고 있다. 따라서, IDDM을 앓고 있는 것으로 판단될 수 있는 환자들은 그들의 β-세포들이 자가면역 파괴의 진전된 단계에 있는 것임에 틀림없다. 더욱이, 오직 자가면역 과정이 시작된 후에야만 β-세포 자가면역의 면역학적 표지들을 통해 검출함으로써, 초기의, 증상발현전의 당뇨병을 진단할 수 있다. 그러므로, 치료학적 측면에서 이미 상당히 진행한 자가면역을 중지시키기 위해, 안전하고 특이적이고도 효과적인 방법이 연구되어 왔다.

본 발명자들은, 사람의 IDDM의 충실한 모델이라고 여겨지는 NOD 계통의 쥐들에서 발생하는 자발적인 당뇨병(Castano and Eisenbarth, 1990)을 연구하여 이러한 문제에 관하여 조사하여 왔다. NOD 쥐들은 약 4주 정도의 나이에 인슐린 염이 발생하고, 그것은 섬주위(peri-islet)의 가벼운 주변-섬(peri-islet) 침윤물로서 시작해서 심각한 섬내(intra-islet)의 염증으로 진전한다. 인슐린 결핍의 증거인, 과혈당증은 우리의 콜로니에서 약 14 내지 17주된 암컷들에서 시작되었다. 35 내지 40주 나이까지, 거의 모든 암컷 NOD 쥐들은 심각한 당뇨병으로 진전되었으며 인슐린 치료가 없을 때 대부분이 죽었다. 수컷 NOD 쥐들은 질병의 발생이 더 낮았으나, 그 이유는 명확하지 않다. NOD 쥐들의 당뇨병은 자가 면역 T 세포들에 의하여 유발되는 것으로 밝혀졌다(Bendelac et al., 1987).

다양한 항원들에 대한 T 세포 반응성과 자기항체들이 NOD 쥐들뿐만 아니라, 사람의 IDDM 환자들에서 검출되었고(Elias, 1994), 가능성 있는 표적 항원들 중에서 임의적인 하나에 대한 면역성이, 질병의 중요한 원인인지는 명확하지 않다. 치료의 문제는 유발의 문제 그 이상의 것이다.

NOD 쥐들에서의 자가면역 과정의 개시는, 당뇨병이 발병하기 전에, 제한된 식이 요법, 바이러스성 감염들, 또는 면역 시스템의 비-특이적인 자극과 같은 다양한 처리에 의하여 예방될 수 있다는 것이 증명되었다(Bowman et al., 1994). 또한, NOD 당뇨병은 당뇨병전증 쥐들에서 항원 글루타믹 산 디카르복실라아제(GAD)에 대한 면역관용을 유발함으로써도 예방될 수 있다(Kaufman et al., 1993; Tisch et al., 1993).

NOD 암컷 쥐들에서 자발적으로 발생되는 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM)은 다양한 자기-항원에 대한 면역 반응성과 관련이 있다(Bach, 1994). 이러한 항원들 중에서 포유류 60kDa 열 쇼크 단백질(hsp 60) 분자의 서열로부터 유래된 p277펩티들가 주목할 만하다. 이것은 사람 hsp60 분자에 있어서 잔기 437-460에 해당한다(Elias et al 1991, 이스라엘 특허번호. 94241, PCT 특허 공개 WO90/10449). 사람 p277 펩티드는 다을과 같은 서열을 갖는다:

Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp (서열번호 1의 a.a. 437-460)

당뇨병전증의 NOD 쥐는 hsp60에 대해 그리고 p277 펩티드의 사람(2) 또는 쥐(3) 변이체에 대해 자발적인 당뇨병유발성 T 세포 반응들을 나타낸다. 쥐 및 사람 펩티드들은 1개의 아미노산 차이가 있고, 면역학적으로 교차-반응성이 있다(3). C57BL/6와 같은, 비-당뇨병 경향 계통의 어떤 쥐들은, 외래 면역원성 캐리어 분자에 공유결합된 p227로 면역되면, 순간적인 과혈당증 및 인슐린염을 나타낸다(4). 그리고 C57BL/KsJ 계통의 쥐들은, 자가면역 당뇨병을 유발하는 β-세포 독소 스트렙토조신(STZ)을 매우 작은량으로 처리된 후에는 hsp60에 대해 그리고 p277에 대해 자발적인 T-세포 반응을 일으킨다(5).

펩티드 p277 는, 상기 질병의 발현에 관여될 뿐만아니라, 자가면역 과정을 치유하는데 기능적인 것으로 보인다: 불완전한 프로인트 보조액(incomplete Freund adjuvant:IFA; 광유)에 있는 p277를 피하에 투여하면, 진전된 인슐린염을 가진, 젊은 NOD 쥐(2)나 12-17주된 NOD 쥐(6, 7)에서는 질병 진전이 저지된다. p277의 사람(6, 7) 및 쥐 변이체(3) 모두는 효과적이다. 쥐 hsp60 유전자를 MHC 클라스 Ⅱ 프로모터 상에 트랜스진한 NOD 쥐들은 p277에 대한 그들의 자발적인 T-세포 증식성 반응을 감소-조절하는 것을 볼 수 있으며, 상당한 비율의 쥐들은 당뇨병의 진전이 없었다(8).

더욱이, p277을 C57BL/KsJ 쥐에 투여하면, 초기 매우 작은 복용량의 STZ를 받은 쥐들에서 자가면역 당뇨병의 진전이 주춤하게 된다; 이러한 쥐들을 GAD65분자 펩티드로 처리하는 것은 비효과적이다(9).

위치 6과 11의 시스테인 잔기 중 어느 하나 또는 양쪽 모두가 발린 잔기로 치환된 p277 펩티드 변이체들은 각각 p277(Val⁶), p277(Val¹¹), p277(Val⁶-Val¹¹)로 명명되고, 상응하는 이스라엘 특허출원 번호.112094에 기재되어 있으며, 당뇨병 치료에 p277만큼 활성적이다.

본 발명의 목적은 IDDM의 진단 및 치료에 유용한, 사람 hsp60의 부가적인 펩티드들을 제공하는 것이다.

본 발명은 사람 60kDa 열 쇼크 단백질(hsp 60)의 에피토프인 신규한 펩티드들과, 인슐린-의존성 당뇨병(IDDM)의 진단 및 치료를 위해 상기 펩티드들을 포함하는 약학적 조성물들에 관한 것이다.

도1은 사람 hsp60 분자의 전체 서열상에서 본원에서 언급되는 펩티드들의 위치들을 나타낸다.

도2는 사람 hsp60펩티드인 p12, p32, p277(Val⁶-Val¹¹) 및 p278에 대한 NOD 쥐 T-세포 증식을 나타낸다.

도3은 펩티드들에 대한 NOD 쥐의 T-세포 증식반응을 보여주는 그래프이다. 세 개의 NOD쥐들의 그룹들은 IFA안에서 25㎍의 양으로 쥐 p12, 쥐 p277, GAD-p35 및 MT-p278 각각과 함께 액침된다. 드레인닝(draining) 림프절을 10일 후에 제거하여, 농도 5, 10, 20, 50㎍/㎖에서 해당하는 펩티들에 대한 증식 반응을 분석하였다. 적절한 농도인 20㎍/㎖에서 자극이 보여진다. 다음과 같은 범위의 cpm이 대조군 배지들에서 얻어진다: 쥐 p12, 881; 쥐 p277, 1243; MT-p278, 698 및 GAD-p35, 1430. 펩티드 쥐 p38은 쥐 hsp60로 부터 유래된 펩티드(556-573)로서, 시험되는 펩티들과는 서열 일치성을 갖지 않으며 특이성에 대한 음성 대조군으로서의 역할을 한다. 이러한 결과들은 세 개의 수행된 실험들을 대표한다. 이러한 결과들은 세 개의 수행된 실험들을 표시한다. 각각의 분석이 3번 수행되었으며 이들의 SD치가 막대기에 의해서 표시된다. (보여지지는 않지만) 상기 펩티드들간에서는 어떠한 교차-반응도 없었다.

도4는 당뇨병에서 펩티드 투여의 효과를 보여주는 그래프이다. 10-20개의 NOD 쥐의 그룹들은 10주의 나이에서 IFA안에 있는 100㎍의 쥐 p12, p277, p35-GAD 또는 MT-p278로 또는 IFA 단독으로 처리되었다. 쥐들은 매달 방혈되어, 과혈당증 발병여부를 보았다. IFA 처리 대조군 그룹과 비교해 보면, p12와 p277로 처리된 쥐들은 P<0.05로 상당히 보호되었다.

도5는 펩티드 처리에 반응하는 IgG1, IgG2a 및 IgG2b 항체 이소타입들을 나타낸다. 도4의 사용부호의 설명과 같이, 쥐들이 처리되었다. 개별적인 시료들이 쥐 p12 A; p277 B; GAD-p35 C; 및 MT-p278 D에 따른 IgG1, IgG2a 및 IgG2b 이소타입 항체들에 대하여 분석되었다. 비슷한 결과들이 두 실험에서 얻어졌다. 그 결과는 각 그룹에 있는 10개의 쥐들에서의 405nm의 흡광도(OD)로 나타난다. 그룹 C 및 D에 비교하여 그룹 A 및 B에 있어서의 IgG1 및 IgG2b 항체들의 만연 정도는 P<0.001로 상당한 수준이다. 그룹 A와 B에 있어서 IgG2a 항체와 비교하여 IgG1과 IgG2b 항체의 수치간의 차이가 상당하다(P<0.001). (나타나 있지는 않지만) 항체들사이의 교차-반응은 전혀 없다.

도6은 항체들과 혈당간의 반대적인 상관관계를 보여준다. 도4의 사용부호의 설명과 같이, NOD 암컷 쥐들의 그룹은 p12로(10마리 쥐) 또는 IFA단독으로(9마리 쥐) 처리하였다. 항-p12 특이성 항체의 양(1:50으로 희석된 혈청에서 나이 7개월 때 측정된 ELISA O.D 유니트)이 나이 7개월 때 측정된 혈당 농도와 함께 좌표축에 그려졌다. 높은 항체들과 혈당사이의 상관관계 정도는 P<0.002이다.

도7은, IDDM 환자인 한 제공자의 리콜(recall) 항원들, hsp60 단백질 및 hsp60 합성 펩티드에 대한 T-세포 증식반응(S.I.)를 보여주는 그래프이다.

도8은, 건강한 제공자의 리콜 항원들, hsp60 단백질 및 hsp60 합성 펩티드에 대한 T-세포 증식반응(S.I.)를 보여주는 그래프이다.

도9는, 또다른 IDDM 환자 제공자의 리콜 항원들, hsp60 단백질 및 hsp60 합성 펩티드에 대한 T-세포 증식반응(S.I.)를 보여주는 그래프이다.

도10A와 10B는, 두명의 IDDM 환자인 제공자의 hsp60 합성 펩티드에 대한 T-세포 증식반응(S.I.)를 보여주는 그래프이다.

[발명의 요약]

사람 hsp60 분자의 단편 및 펩티드에 관한 연구에서, 뜻밖에도 IDDM환자들과NOD 쥐들이, IDDM의 진단 및 치료에 사용되는 또다른 hsp60 T-세포 에피토프들에 반응성을 보인다는 것을 알게 되었다. 이러한 에피토프들은, 단독으로 또는 p277이나 p277(Val⁶), p277(Val¹¹), p277(Val⁶-Val¹¹)로 부터 선택된 p277 변이체와 함께 접합되어서, 치료의 효능을 향상시킬 수 있다.

이러한 신규한 펩티드들이 표 1에 나타나 있다.

Hsp60 합성 펩티드들 및 그들의 서열

펩 티 드	서열번호 1의 잔기번호	아미노산 서열(1문자 코드)
p3	31-50	KFGADARALMLQGVDLLADA
p10	136-155	NPVEIRRGVMLAVDAVIAEL
p11	151-170	VIAELKKQSKPVTTPEEIAQ
p12	166-185	EEIAQVATISANGDKEIGNI
p14	195-214	RKGVITVKDGKTLNDELEII
p18	255-274	QSIVPALEIANAHRKPLVIIA
p20	286-305	LVLNRLKVGLQVVAVKAPGF
p24	346-365	GEVIVTKDDAMLLKGKGDKA
p29	421-440	VTDALNATRAAVEEGIVLGG
p30	436-455	IVLGGGCALLRCIPALDSLT
p32	466-485	EIIKRTLKIPAMTIAKNAGV
p35	511-530	VNMVEKGIIDPTKVVRTALL
p39	343-366	GKVGEVIVTKDDAM

p278(사람 hsp60 서열에서는 위치 458-474에 해당), p19(사람 hsp60 서열에서는 위치 271-290에 해당) 및 p21(사람 hsp60 서열에서는 위치 301-320에 해당)로 명명된 펩티드들을 포함하는, hsp 60의 다른 펩티드들은 효과적이지 않다고 보여졌다. p278의 아미노 말단은 효과적인 p277 펩티드와 3개의 잔기(NED)가 겹치고, p278의 카르복시 말단은 효과적인 p32와는 9개의 잔기(EIIKRTLKI)가 겹친다. 따라서, p32에서 남아있는 11개의 잔기(PAMTIAKNAGV)가 결정적이다.

따라서, 본 발명은 표 1에 나타나 있는 펩티드들 및 그들의 염들과 기능적인 유도체들에 관한 것이다.

나아가, 본 발명의 목적은 본 발명에 따른 펩티드들을 사용하여 IDDM의 초기 진단을 위한 방법들 및 장비들을 제공하는 것이다. IDDM 진전과정에서, 동물들은, 동물의 혈액 및 소변안에서 운반되는 hsp60 분자 또는 그들과 교차-상호작용하는 분자들을 발현한다. 그들은 또한 상기 분자들에 의해 특이적으로 유도되는 항체들 및 T-세포들을 발현한다. 따라서, hsp60(또는 그들과 교차-상호작용하는 분자들) 또는, 혈액이나 소변에서 이들에게 특이적인 항체들이나 T-세포들의 존재는, 베타 세포들이 완전이 파괴되어 환자가 일생 당뇨병에 걸리기 이전에, IDDM 과정을 검출하기 위한 측정법으로 사용된다.

환자에 있어서 IDDM의 존재 또는 초기 여부는, 본 발명에 따른 펩티드 p12나 p32를 항원으로 하여 사람 hsp60에 면역학적으로 반응하는 항체들이나 T 세포들이 존재하는지를 상기 환자의 혈액이나 소변에서 시험함으로써 진단될 수 있다.

따라서, 본 발명은 환자내에 IDDM의 존재 또는 초기를 진단하는 방법에 있어서, 상기 방법은 항-hsp60 항체들의 존재 또는 hsp60과 면역반응하는 T 세포의 존재에 관하여 상기 환자를 시험하되, 항-hsp60 항체들 또는 hsp60과 면역반응하는 T 세포가 존재한다는 것을 나타내는 결과가 IDDM의 존재 또는 초기에 대한 높은 확률을 표시하는 시험 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 환자내에 IDDM의 존재 또는 초기를 진단하기 위한 방법을 제공한다.

IDDM을 진단하는 방법에서, 환자는 항-hsp60 항체들이 존재하는지 여부에 대해 시험될 수 있으며, 이러한 시험 방법은 방사선면역측정법이나 ELISA 시험을 포함할 수 있다.

또한, 환자들은 hsp60과 면역반응하는 T세포가 존재하는지에 대해 시험될 수 있다. 이러한 측면의 한 실시예에서, 상기 시험 방법은 다음과 같은 단계들을 포함하는 T 세포 증식 시험을 포함한다:

(ⅰ) 상기 환자로부터 얻어진 혈액 샘플로부터 T 세포들을 함유하는 단핵 세포 분획을 준비하는 단계;

(ⅱ) 상기 단핵 세포 분획에 본 발명에 따른 펩티드로부터 선택되어진 항원을 첨가하는 단계;

(ⅲ) 적당한 배양 조건들에서 적당한 시간 동안 상기 항원의 존재하에 상기 세포 분획을 항온배양하는 단계;

(ⅳ) 상기 항온배양이 끝나기 전 적당한 시간에 표지된 뉴클레오타이드를 (ⅲ)의 배양된 세포 배지에 첨가하여 상기 표지된 뉴클레오타이드가 증식하는 T 세포들의 DNA안으로 합체될 수 있도록 하는 단계; 및

(ⅴ) 상기 T 세포들내로 합체되는 표지된 뉴클레오타이드의 양을 분석하여 증식하는 T 세포들의 양을 결정하는 단계.

상기 단계 (ⅳ)에서, 상기 표지된 뉴클레오타이드는 바람직하게는³H-타이미딘이다. 증식하는 T 세포의 양은 표준 방법들에 의하여 T 세포들의 자극 지수를 계산함으로써 결정된다.

본 발명의 이러한 측면의 또 다른 실시예에서, 상기 시험 방법은, 단계들 (ⅰ) 내지 (ⅲ)은 상기한 T 세포 증식 시험이고, 4번째 단계 (ⅳ)는 반응하는 림포사이트들에 의하여 배지로 분비되는, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNFα 또는 TNFβ와 같은 시토킨의 존재를 상업적으로 이용가능한 장비들을 사용하여 표준적인 방법들에 의하여 검출하는 것을 특징으로 하는 T-세포 시토킨 반응 시험을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드로부터 선택되어진 항원을 환자에게 피하로 주입하고, 검출될 만한 피부 반응(지연성 과민증: DTH)의 발생이 관찰되는 생체내 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 그러한 검정들을 수행하기 위한 장비들 뿐만 아니라, 그러한 검정들을 수행하기 위한 수단에 관한 것이다. 그 장비들은 본 발명을 실행하기 위하여 사용되는 다양한 검정들 중 임의의 하나를 수행하기 위하여 제조될 수 있다. 그러한 각 장비들은 단일의 검정 또는 고정된 수의 검정들을 수행하는데 필요한 모든 물질들을 포함한다. 예를 들어, 항-hsp60 항체들의 존재를 결정하기 위한 그러한 장비는 고체-상 고정된 본 발명의 펩티드와, 꼬리표가 붙은 항-사람 Fab와 같은, 검출될 수 있는 항-hsp60 항체들의 비-변화 영역을 인식할 수 있는 꼬리표가 붙은 항체를 포함할 수 있다. 그러한 장비는 또한, 장비의 사용을 위한 지침서와 장비의 물질들을 담는 용기들을 함유할 수 있다. 방사선 동위원소, 효소, 발색단 또는 형광단과 같은 임의의 통상적인 꼬리표 또는 표지가 사용될 수 있다. 전형적인 방사선 동위원소로는 요오드-125 또는 황-35가 있다. 이러한 목적을 위한 전형적인 효소는 양고추냉이 퍼옥시다아제, 양고추냉이-갈락토시다아제 및 알칼린 포스파타아제를 포함한다.

항-hsp60 항체들이 존재하는지에 대하여 시험함으로써 IDDM의 존재를 진단하기 위한 장비는 다음을 포함한다:

(ⅰ) 본 발명에 따른 펩티드들로부터 선택되어진 항원; 및

(ⅱ) 검출되는 상기 항-hsp60 항체들의 비-변화 영역을 인식할 수 있는 꼬리표가 달린 항체.

hsp60과 면역 반응하는 T 세포가 존재하는지를 시험함으로써 IDDM의 존재를 진단하기 위한 장비는 다음을 포함한다:

(ⅰ) 본 발명에 따른 펩티드들로부터 선택되어진 항원;

(ⅱ) 림포사이트들(T 세포들)의 배양을 위해 적당한 배지; 및

(ⅲ) T 세포 증식 시험을 위해 표지된 뉴클레오타이드, 또는 시토킨 시험을 위한 예를 들어, 인터페론-감마와 같은 시토킨 검정 장비.

생체내 시험을 위하여, 장비는 단지 주입에 적당한 형식의 본 발명에 따른 펩티드만을 포함한다.

본 발명은 또한 IDDM을 예방하고 치료하기 위한 수단에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항원 펩티드로 예방 접종하는 것은 상기 항원에 대한 자가면역의 특이적인 하향 조절을 제공할 수 있고, IDDM의 자가면역 과정에 대한 저항성을 효과적으로 생성한다. 감쇄된 또는 무발병성의 형태로, 또는 그들의 항원성을 증가하기 위하여 처리된 후에, 상기 항원들에 대하여 특이적인 T 세포들, 그들의 단편들 또는 활성적인 파편들을, 예방 접종하는 것도 동일하다. 만약 환자가 이미 증상발현전의 IDDM의 초기에 있는 것으로 밝혀졌을 때, 그러한 항원 또는 T 세포 (또는 분획)을 주입하는 것은 그러한 항원에 대한 자가면역을 하향 조절하며 따라서 심각하고 영구적인 손상이 있기 전에 자가면역 과정을 중지시킨다. 펩티드 p277로 NOD 쥐들을 처리하는 것에 관해 본 발명의 발명자들의 실험실에서 최근에 밝혀진 바와같이(Elias and Cohen, 1994), 상기 펩티드는 심지어 자가면역 반응이 상당히 진전한 후에도 그것을 중지시키는 치료제로 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 인슐린-의존성 당뇨병(IDDM)을 예방하거나 치료하기 위해 다음 같은 것들을 포함하는 조제를 제공한다: (a) 본 발명에 따른 펩티드와 면역학적으로 교차-상호반응하는 단백질이나 펩티드에 대한 특이성을 발달시켰으며, 상기 펩티드의 존재하에 항온배양됨으로써 활성화될 수 있는 T 세포들; (b) 방사선 조사되거나 그렇지 않으면 감쇄된 상기 T 세포들; (c) 유체정력학적 압력에 의한 처리, 화학적 교차-연결 시료로 처리 및/또는 세포골격의 교차-연결 시료로 처리된 상기 T 세포들; (d)(a), (b) 또는 (c)의 단편들, 또는 이로부터 떨어져 나온 표면 단백질들; 또는 (e) 상기 단백질, 또는 그들의 염, 기능적인 유도체, 전구체 또는 활성 분획들에 특이성을 가지는 (a)의 수용체의 변화 영역을 필수적으로 포함하는 펩티드.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 조제는 본 발명에 따른 상기 펩티드와 생체외적으로 접촉하여 특이성을 발달시킨 사람 T세포들을 포함한다.

본 발명은 또한 약학적으로 받아들여질 수 있는 캐리어 및, 활성 성분으로 유효량의 본 발명에 따른 펩티드, 그들의 염 또는 기능적인 유도체를 포함하는, IDDM의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 펩티드, 그의 염 또는 기능적인 유도체를 포함하는 약학적인 조성물, 또는 본 발명에 따른 상기 펩티드에 대하여 특이성을 발달시킨 T 세포들을 함유하는 조제를 환자에 주입하는 것을 포함하는 IDDM을 예방하고 치료하는 방법에 관한 것이다.

[발명의 상세한 설명]

"본 발명에 따른 펩티드" 또는 "펩티드 p12"나 "펩티드 p32"와 같이 개별적으로 명명되는 것들이 본원의 상세한 설명 및 청구의 범위에서 언급될 때마다, 당뇨병에 대하여 상기 펩티드의 생물학적 활성이 유지되는 한, 그들의 염들 및 기능적인 유도체들도 또한 의미된다.

본 발명에서 의미하는 본 발명에 따른 펩티드의 "염들"은 생리학적으로 받아들여질 수 있는 유기 및 무기 염들이다.

본원에서 사용되는 본 발명에 따른 "기능적인 유도체들"은, 본 발명의 기술분야에서 알려진 수단에 의하여 잔기들의 곁가지 또는 N- 또는 C-말단기들에 있는 작용기들로부터 만들어질 수 있으며, 약학적으로 받아들여질 수 있는 한, 즉, 상기 펩티드의 활성을 파괴하지 않고, 그것을 함유하는 약학적 조성물들에 독성을 부여하지 않으며, 그들의 항원적 성질에 반하지 않는, 그러한 유도체들을 포함한다.

이러한 유도체들은 예를 들어, 카르복실기들의 지방족 에스테르들, 암모니아, 또는 1차 또는 2차 아민들과의 반응에 의하여 생성되는 카르복실기들의 아미드들, 아실 부분들(예를 들어, 아카노일 또는 카르보사이클릭 아로일 기들)과의 반응에 의하여 형성된 아미노산 잔기들의 자유로운 아미노기들의 N-아실 유도체들 또는 아실 부분들과의 반응에 의하여 형성된 자유로운 히드록실기(예를 들어서 세릴 또는 쓰레오닐 잔기들의)의 O-아실 유도체들을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 펩티드는 약학적 조성물들, 특별히 IDDM의 경감과 처리를 위한 백신들에서 면역원으로서 사용될 수 있을 뿐만 아니라, IDDM을 진단하기 위한 진단적 조성물들에서 항원으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 기술분야에서 알려진 방식에 의하여 제조되는 이러한 약학적 및 진단학적 조성물들도 또한 본 발명의 일부분을 형성한다.

본 발명에 따른 치료학적 조성물은 구강으로, 또는 피하로, 근육내로, 정맥내로, 비강내로, 망막내와 같이 비경구적으로 투여될 수 있다.

본 발명은 아래의 실시예들과 도들에 의해 설명될 것이며, 본 발명은 이들에 의해 제한되지 않는다.

[물질들 및 방법들]

(ⅰ) 쥐들. NOD/Lt 계통의 동종 번식의 암컷 쥐들이 이스라엘 레보호트, 웨이즈만 인스티튜트 오브 사이언스의 동물 사육 센터 또는 ME, 바 하버, 잭슨 실험실로부터 공급되었다. 이러한 쥐들은 나이가 14 내지 17주가 될 때 사람에 있어서의 IDDM과 유사한 자가면역 당뇨병들을 자발적으로 발병하였다.

(ⅱ) 항원들. 펩티드들은 웨이즈만 인스티튜트 오브 사이언스의 유기화학부에서 N-α-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 합성에 대한 상기 회사의 지침서에 따라 지동화된 다중 펩티드 합성기(Abimed model AMS 422; Langenfeld, Germany)를 사용하여 합성되었다. 크루드한 생성물은 반정도-준비된 C8-컬럼상에서 역상 HPLC에 의해 정제되었다(Lichrosorb RP-8, 7㎜, 250x10㎜, Merck, Darmstadt, Germany). 물안의 0.1% 트리플루오로아세틱 산 및 물안의 75% 아세토니스릴(v/v)안의 0.1% 트리플루오로아세틱 산 사이에서 형성되는 선형상 농도구배에서 펩티드들을 용출하였다. 분석 역-상 HPLC 및 아미노산 분석에 의해서 정제된 단 하나의 펩티드 생성물을 얻었다. 펩티드 MT-p278은 마이코박테리아 hsp60의 서열로부터 유래된다(431-447). 펩티드 p277은 천연 서열 중 위치 6과 11에서 시스테인(C)대신 발린(V)으로 치환된 것이다. V에 의한 두 C잔기의 치환은 면역학적 활성에는 영향을 주지 않고 펩티드의 안정성을 크게 향상시켜준다: T-세포 및 항체 분석에 의하면 V-치환된 펩티드는 천연 펩티드와 완전하게 교차-반응한다. 기재되어 있지는 않지만, 사람 서열도 의도된다. 쥐 p12 및 쥐 p38 펩티드들은 쥐 hsp60 분자로부터 유래되고, 각각 그것의 168-188, 437-460 및 556-573 서열에 해당한다. 펩티드 GAD-p35는 GAD65분자로부터 유래된다(524-543). 본원에 사용되는 모든 펩티드들의 아미노산 서열은 표2에 나타나 있다.

합성펩티드들 및 그들의 서열

펩 티 드	서 열 번 호	아미노산 서열(한문자 코드)
p3	1 (31-50)	KFGADARALMLQGVDLLADA
p10	1 (136-155)	NPVEIRRGVMLAVDAVIAEL
p11	1 (151-170)	VIAELKKQSKPVTTPEEIAQ
p12	1 (166-185)	EEIAQVATISANGDKEIGNI
p14	1 (195-214)	RKGVITVKDGKTLNDELEII
p18	1 (255-274)	QSIVPALEIANAHRKPLVIIA
p20	1 (286-305)	LVLNRLKVGLQVVAVKAPGF
p24	1 (346-365)	GEVIVTKDDAMLLKGKGDKA
p29	1 (421-440)	VTDALNATRAAVEEGIVLGG
p30	1 (436-455)	IVLGGGCALLRCIPALDSLT
p32	1 (466-485)	EIIKRTLKIPAMTIAKNAGV
p35	1 (511-530)	VNMVEKGIIDPTKVVRTALL
p39	1 (343-366)	GKVGEVIVTKDDAM
p19	1 (271-290)	LVIIAEDVDGEALSTLVLNR
p21	1 (301-320)	KAPGFGDNRKNQLKDMAIAT
p278	1 (458-474)	NEDQKIGIEIIKRTLKI
p277(Val)	2	VLGGGVALLRVIPALDSLTPANED
mouse p12	3	EEIAQVATISANGDKDIGNI
MT- p278	4	EGDEATGANIVKVALEA
GAD-p35	5	SRLSKVAPVIKARMMEYGTT
mouse p38	6	PGMGAMGGMGGGMGGGMF

(ⅲ) 펩티드들에 대한 T-세포 증식.

쥐. 9주된 NOD 쥐 또는 다른 계통의 쥐들은, 0.1㎖ 인산염-완충액의 식염수(PBS)와 혼합되어 있으며 완전한 프로인트보조액(CFA; Difco, Detroit, MI)안에 25㎍의 펩티드를 함유하는 0.1㎖의 유탁액으로 족후부 패드에 면역시켰다. 드레인닝 슬와부의 림프절을 10일 후에 제거하고, 3개의 배양세포에 있는 림포사이트 현탄액은, 앞서 기재한 바와같이(Elias et al., 1991) [³H]-타이미딘의 합체를 사용하여, 다양한 펩티드들(5㎍/㎖)존재시 증식반응에 대한 시험이 실시되었다. 그 결과들은 자극 지수(SI): 테스트 펩티드가 없을 때의 대조군 배양세포의 평균 cpm에 대한, 테스트 펩티드가 있을 때의 평균 cpm의 비율로서 표시된다. 일반적인 오차는 항상 평균의 10%미만이다.

(ⅳ) 처리 및 검토. PBS에 있는 펩티드 100㎎을 동부피의 IFA에 에멀션시키고 난 후, (Elias and Cohen, 1995)에 기재된 바와 같이, 10주된 NOD 암컷 쥐에 피하로 주입하였다. 대조군 쥐들은 IFA에 에멀션된 동부피의 PBS를 받았다. 쥐들은, 혈당 감지기(MediSense. Inc., Waltham, MA)를 사용하여, 오전 10시에 비-절식된 혈당에 대해 매달 측정되었다. 11.1mmol/L보다 큰 혈당을 갖는 쥐들은 당뇨병에 걸린 것으로 간주되었다; 포도당의 이러한 농도는, 비-당뇨병 쥐에서 측정되는 평균 혈당 농도보다 3 표준편차 더 큰 것이다(Elias and Cohen, 1995). 췌장의 섬들에 대한 조직학적인 조사가 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 단면들 위에서 수행되었다. 그 단면들은 그룹들의 성질을 모르는 두 관측자들에 의하여 독립적으로 측정되었다. 카이 제곱 시험이 다양한 처리들 간의 통계학적 차이점들을 확인하는데 사용되었다.

(ⅴ) 혈청 항원들. 항체 반응을 탐지하기 위해 매달 쥐들의 피를 뽑았다. (Elias et al., 1991)에 기재된 바와 같이 ELISA 분석이 수행되었다. 간단히 말하자면, 항-펩티드 항체들을 검출하기 위해, 편평한 바닥의 긴 흡착판(Nunc, Roskilde, Denmark)이, 10㎎/㎖ 농도로 상온에서 2시간동안 PBS에 있는 펩티드 100㎖/well로 피복되었고, 그리고 나서 밤새도록 4℃에서 항온배양되었다. 펩티드를 가지고 항온배양한 후, 상기 판은 세척되고 37℃에서 2시간동안 PBS에 있는 7% BSA(시그마)를 가지고 억제시켰다. 혈청이 1:50으로 희석되어 37℃에서 2시간동안 첨가되고 난 후, 알칼린 포스파타제에 결합된 염소 항-쥐 IgG(감마 체인 Fc 특이적)[Jackson, Philadelphia, PA] 100㎖/well을 가지고 2시간동안 항온배양되었다. 세척후 상기 판은 기질, 다이에틸아민(시그마)과 함께 항온배양되며, 405㎚에서 ELISA 판독기로 판독되었다.

[제1실시예]

NOD 쥐들에 있어서 hap60 펩티드들인 p12, p13, p277(Val⁶-Val¹¹) 및 p278의 면역원성을 테스트하기 위하여, 상기 쥐들을 족후부 패드에 CFA안에 에멀션되어 있는 펩티드들로 면역시키고, 섹션 ⅲ(a)에 기재된 바와 같이, 10일 후에 드레인닝 림프절의 증식성 반응을 분석하였다. 도2에서 보듯이, 펩티드 p277(Val⁶-Val¹¹), p12 및 p13은 강한 면역원성을 가지는 반면, p278은 비-면역원적이다.

[제2실시예]

<p277(Val⁶-Val¹¹), p12 또는 p13으로 NOD 쥐들을 처리하기>

p277(Val⁶-Val¹¹)와 같이, p12 및 p13 펩티드들도 당뇨병의 진전을 억제할 수 있는지를 테스트하기 위해, p277(Val⁶-Val¹¹), p12 또는 p13 펩티드들(IFA현탄액 0.1㏄안에 있는 100㎍)을 잭슨 실험실, Bar-Harbor, ME.에서 제공된 10-12마리의 9주된 NOD/Lt 암컷 쥐들의 그룹들에 피하로 투여하였다. 지속적인 혈당 수준이 11.1mmol/l이상으로 결정되는 당뇨병은 나이가 25주될 때 시험된다. 대조군 쥐들은 처리되지 않거나 p278로 처리되었다.

표3에서 알 수 있듯이, p277(Val⁶-Val¹¹), p12 및 p13는 당뇨병을 치료하는데 효과적이고, 처리되지 않은 쥐들이나 p278-처리된 쥐들에서의 당뇨병 발병률은 90%인데 반해, p277(Val⁶-Val¹¹), p12 및 p13-처리된 쥐들의 발병률은 각각 10%, 20%, 30%임을 보여준다. 다른 한편, 대조군 p278 펩티드는 치료적 효과가 전혀 없었다.

hsp60 펩티드들의 치료학적 효과

펩티드	당뇨병(%)	치사율(%)	수용체 숫자
none	90	50	100
p278	90	45	100
p277(Val⁶-Val¹¹)	10^*	5^*	100
p12	20^*	10^*	10
p32	50^*	25^*	20

^*P<0.05

두 개 또는 세 개의 hsp60 에피토프 펩티드들의 조합은, 더 많은 T-세포 집단들이 상기 치료에 의해 영향을 받으므로, 단지 하나의 펩티드보다 더 효과적일 수 있다.

[제3실시예]

<최근에 진단된 IDDM 환자들은 hsp60, p277(Val⁶-Val¹¹), p12 및 p13에 대해 T-세포 증식성 반응을 보여준다.>

다양한 hsp60 펩티드들에 대한 T-세포 반응들을 결정하기 위해, 최근에 진단된 (2주-4개월) IDDM 환자들의 말초혈액으로부터 유래된 림포사이트들을 증식 분석하는 시험을 하였다. 10-20㎖의 혈액을 뽑아내어, 항-응고제로써 헤파린을 함유한 멸균 튜브에 넣은 후, PBS안에서 1:2 희석되었다. 림포프레프 층(lymphoprep lay) 위에 있는 혈액을 원심분리함으로써, 말초 단핵세포(PBMC)가 분리되었다. PBMC는, 다양한 항원의 존재(10㎍/㎖)하에서 6시간동안, 증식 계측으로써 [³H]-타이미딘의 합체을 사용하는 증식에 대한 시험이 3번 수행되었다. 시험되는 항원들은 사람 hsp60 또는 hsp60 펩티드인 p277(Val⁶-Val¹¹), p12, p13 및 대조군 펩티드 p278이다. T-세포 증식성 반응은 자극 지수(SI)[즉, T-세포의 펩티드-자극된 타이미딘 합체와 백그라운드(항원 미첨가) 타이미딘 합체사이의 비율]로 도식화된다.

결과는 하기 표 4에 요약되어 있다.

T-세포 증식성 반응(SI)

환 자	hsp60	p277(V)	p12	p32	p278
1	5.6	4.5	4.0	1.1	0.5
2	7.5	5.0	4.5	1.3	0.8
3	8.0	5.6	1.2	7.1	0.7
4	3.4	1.0	1.9	2.9	0.9
5	1.2	1.1	1.7	1.0	N.D.
6	6.7	1.3	5.2	4.5	N.D.
7	10.3	3.9	1.2	6.0	N.D.
8	1.3	1.2	1.5	1.1	N.D.

2.0보다 큰 자극 지수(SI)는 양성 반응으로 간주된다.

N.D.=결정되지 않음; p277(V)=p277(Val⁶-Val¹¹)

대부분의 환자들(6/8)은 hsp60에 반응하고, hsp60에 반응하는 6명 모두는 또한 세 개의 hsp60 펩티드들[즉, p12, p32 또는 p277(Val⁶-Val¹¹)] 중 적어도 하나에 반응하는 것처럼 보인다. 따라서, 상기 펩티드들 그룹에 대한 반응은 모든 hsp60 분자에 반응하는 개인들을 특성화할 수 있도록 할 수 있다.

[제4실시예]

<T-세포 증식성 반응들>

당뇨병-전증의 NOD 쥐들에 있어서, 쥐 p277 펩티드(Elias et al.,1991; Birk et al., 1996), 및 쥐 p277 서열을 함유하는 hsp60 분자 중 더 큰 단편들(Birk et al., 1996)에 대한 자발적인 T 세포반응들이 탐지되었다. 쥐 hsp60 분자상에서 또다른 T-세포 에피토프를 검출하기 위해, NOD 쥐들이 상기 hsp60 서열과 겹치는 펩티드들 풀에 액침되었고, 모든 쥐들이 쥐 p277과 쥐 p12 양쪽에 강력하게 반응한다는 사실을 알게 되었다(도 2). NOD 쥐들에 대한 면역원성을 갖는 다른 펩티드들은 MT-p278 펩티드(마이코박테리아 hsp60의 잔기 458-474)와 GAD-p35(GAD65 분자의 잔기 524-543)이다. 도 3에서 보듯이 MT-p278은 쥐 p277과 쥐 p12와 같은 강력한 면역원성을 갖는다; GAD-p35도 또한 비록 그 만큼을 덜하지만 면역원성이 있다.

3-16주된 암컷 NOD 쥐들에 대한 장기적인 연구는, 비록 쥐 p277 및 전체 쥐 hsp60에 대한 반응들은 나타나지만, (보여지진 않았지만)지라에 있어서의 쥐 p12에 대한 자발적인 반응은 나타나지 않는다는 것을 보여 주었다. 따라서, 쥐 hsp60 분자로부터 나온 p12와 p277, 당뇨병-관련된 GAD65 분자로부터나온 GAD-p35, 외래 면역원인 MT-p278로 이루어진 4개의 면역원성 펩티드들 중 오직 쥐 p277과 MT-p278에 대해서만 자발적인 반응이 탐지되었다.

<펩티드 처리>

쥐 p277에 효과적인 것으로 보이는 프로토콜에 따라(Elias et al., 1991; Elias and Cohen, 1994), 10-주된 암컷 NOD 쥐들 그룹은 IFA에 에멀션되어 있는 각각의 펩티드(100㎎)로 한번 피하에 주사되었다. 쥐들은 나이 8개월 때쯤 당뇨병 발생에 대하여 평하여졌다. 도 4는, 펩티드 쥐 p277과 쥐 p12는 모두 당뇨병 발생을 방해하는데 효과적이라는 것을(P<0.05) 보여준다. 반면, 펩티드 MT-p278이나 GAD-p35로 처리한 것은 IFA단독으로 처리한 것에 비해 전혀 다른 점이 없었다. 3개의 실험 모두는 본질적으로 같은 결과를 보여주었다.

<항체들>

쥐 펩티드 p277을 가지고 한 STZ-유도된 당뇨병의 성공적인 치료는 주로 IgG1과 IgG2b 이소타입들과 같은 항-펩티드 항원들의 출현과 관련이 있었다(Elias and Cohen, 1996). 따라서, 혈청 항체들에 관하여, 펩티드-처리된 NOD 쥐들이 검사되었다. 도 5를 보면, 당뇨병을 저지하는데 유력한 두 개의 펩티드인 쥐 p12와 p277는 또한 강한 IgG1과 IgG2b 이소타입의 항체값(P<0.001)을 유도하는데 효과적이었다. 펩티드 MT-p278 또는 GAD-p35로 처리된 쥐들은 강하게 반응하지 않았다; GAD-p35-처리된 쥐들은 어느 것도 특이성 있는 IgG1 항체들을 만들지 않았으며, MT-p278-처리된 10마리의 쥐들 중 오직 2마리만이 IgG1 이소타입의 항체를 만들었다. MT-p278 또는 GAD-p35로 처리된 쥐들은 상당히 더 낮은 값의 IgG2b 항체들을 만들었다(P<0.0001). 따라서, 당뇨병을 방해하는 효과는 주로 IgG1와 IgG2b의 항체반응을 유도하는 것과 관련이 있었다.

효과적인 치료적 반응과 항체의 적정량간의 관계는, 7개월된 개별적인 쥐들에 있어서 항체들의 농도에 대한 혈당의 농도를 비교함으로써 확인되었다. 도 6는, 높은 값의 항-쥐 p12 항체들을 갖는 쥐들이 더 낮은 혈당 농도를 갖는 경향이 있었음을 보여준다; 반대로, 쥐 p12에 대한 항체를 거의 만들지 못하는 쥐 p12-처리된 쥐들은 높은 혈당(P<0.002)을 갖는 경향이 있었다.

<토론>

이런 실시예에서 보여주는 결과들은, 펩티드 P277과 같이, 쥐 hsp60 분자의 펩티드 p12는, 뚜렷한 과혈당증을 발발하려는 쥐들을 치료하는데 있어서 효과적일 수 있음을 지적한다. p277에 대조를 이루어, 당뇨병-이전의 NOD 쥐들의 지라에 있어서 p12에 대한 자발적인 T-세포 증식성 반응은 관찰되지 않았다. 따라서, 말초에서 관찰될 수 있는 자발적인 항-펩티드 증식성 반응은, 펩티드가 당뇨병 자가 면역 과정을 방해하는데 있어서 필요하지 않다.

펩티드 p277이 NOD 당뇨병을 조절할 수 있는 유일의 hsp60 펩티드는 아니라는 연구결과는 중요하다. NOD 당뇨병에 있어서 hsp60의 관여는, hsp60의 p277 펩티드 및 β-세포들에 더 특이성을 갖는 미지의 분자사이의 모사에 의해 발생한다고 추측할 수 있었다(Cohen, 1991). 그러나, hsp60의 두 개의 다른 단편인 p277과 p12 모두가 미지의 제안된 β-세포 분자의 단편을 모사할 가능성은 크지 않다. 펩티드 치료에 있어서 p12의 효과를 통해, 당뇨병에 기능적인 hsp60-유사한 분자는 hsp60 그 자체라는 결론이 지지된다(Birk et al., 1996).

MT-p278과 GAD-p35가 당뇨병의 발생을 저지 못한다는 것은 자기-항원 또는 자발적인 T-세포 증식 항원 어느 것도 자가면역 과정을 억제하지 못한다는 것을 지적해준다. 흥미롭게도, 비록 MT-p278이 T-세포에 강한 면역원성을 가짐에도 불구하고(공개되지 않은 관찰결과), MT-p278는 높은 값의 항체를 유도하지 못하거나 방어하지 못했다. 그러나, 어떤 특이성을 갖는 항체들의 유도가 NOD 당뇨병에 반드시 영향을 주는 것은 아니다; BSA로 NOD 쥐들을 처리하면 높은 값의 항체뿐만아니라 T세포 반응을 유도하지만(표시되어 있지 않음), 당뇨병의 발병에는 영향을 주지 않는다(Elias and Cohen. 1994). GAD-p35는 다른 펩티드만큼 T 세포에 대한 강한 면역원성을 나타내지는 않았다(도3). NOD 쥐들은 그들의 펩티드에 대한 자발적인 T 세포 반응을 나타낸다고 알려졌다(Kaufman et al., 1989).

결국, 상기 펩티들에 특이성을 갖는 항체들의 유도와 효과적인 치료와의 관련은, p12과 p277의 치료적 효과가, IL-4의 생산에 의해 조절되는 항체인 특이성 IgG1 항체의 유도를 도와주는 Th1-타입 T 세포들의 활성화와 관련있음을 암시한다(Mossman and Coffman, 1993). 상기 T 세포는, β-세포를 손상시키는 것으로 생각되는 Th1 T 세포를 억제할 수 있다(Katz et al., 1995; Liblau et al., 1995). 게다가, NOD 당뇨병의 p277 펩티드 치료는, 지라에서 IL-4와 IL-10 생산하는 T 세포들의 폭발적 생산 및, 지라와 섬들(islets)에서 INF-γ생산하는 T 세포의 감퇴와 관련이 있다고 밝혀졌다(공개되지 않은 관찰결과). 펩티드 치료에 반응하여 Th2 이소타입을 포함하는 펩티드-특이적인 항체의 출현은 유익한 반응의 지표로 나타난다.

[제5실시예-IDDM 환자가 T-세포 반응을 나타낼 수 있도록 하는 부가적인 펩티드들]

최근에 진단된(IDDM 진단하고 1-16주 후) 26명의 IDDM환자들을 병적에 넣었다. 환자들의 연령 범위는 5-60세였다. 환자들에게서, 사람 hsp60에 대한, 그리고 사람 hsp60 단백질 서열의 분획들로써 표 1 및 5에 나타난 사람 hsp60 합성 펩티드들에 대한 그들의 말초 혈액 T-세포 증식성 반응을 스크린하였다.

또한 파상풍 유독소, 간디다 알비칸스 및 인플루엔자와 같은 표준 리콜 항원들에 대한 환자들의 T-세포들의 증식성 반응이 분석되었고, 만일 자극 지수(S.I.)가 2이상이면 상기 반응은 양성으로 점수를 메겼다(하기 참조).

증식은 하기 프로토콜을 이용하여 분석되었다:

<세포 준비 및 세포 증식 프로토콜>

10IU/㎖의 헤파린으로 추가된 50 ㎖의 말초 혈액을, IDDM 환자로부터 또는 건강한 대조군으로부터 뽑았다. 2부피의 PBS(칼슘- 및 마그네슘-없음)가 첨가되었다. 혈액-PBS 시료는 10㎖ 파이펫을 사용하여 혼합되었다. 1부피의 10㎖ 피콜(Picoll)을 혈액혼합물의 아래에 깔고, 상온(R.T.) 20-24℃에서 30분동안 2,000rpm에서 원심분리하였다(제동-정지). 들소가죽안에 있는 말초혈액 T-세포들을 10㎖ 파이펫을 사용하여 수확하고, 새로운 50㎖ 테스트 튜브에 옮겼다. 1부피의 30-40㎖ PBS(칼슘- 및 마그네슘-없음)를 상기 수확된 T-세포에 첨가하였다. 그리고 나서 이것을 혼합시킨후, R.T.에서 20분간 1,000rpm에서 원심분리하였다(제동-작동).

상청액을 빨아내고, 압착결정된 세포들을 AIM-V 혈청이 없는 배양배지(GIBCO, USA)에 다시 현탁시켰다. 배양배지는 1% 파이루베이트나트륨, 1% L-글루타민(각각 200mM), 1% 페니실린/스트렙토마이신(10,000 U/㎖ /10,000 ㎎/㎖) 및 2% 헤퍼스(Hepes)를 첨가한 AIM-V를 함유한다. 또는, 혈액은행의 10% AB 혈청을 첨가한 RPMI가 사용되었다. 그리고 나서, 세포 혼합물을 R.T.에서 10분동안 2,000rpm에서 원심분리하였다(제동-작동). 상청액을 다시 뽑아내고, 압착결정된 세포들을 더 작은 부피의 신선한 AIM-V(10-20㎖)안에 재현탁시켰다. 상기 세포들을 재현탁시키고 그 숫자를 세었다. 세포 숫자 세기 및 생존력 분석은 트리판 블루(trypan blue)를 사용하여 수행되었다. 이 단게에 혈구계와 광현미경이 사용되었다.

세포 농도를 AIM-V 배지에서 2x10⁶cells/㎖이 되도록 적정시켰다. 1부피의 100㎕의 웰(well)당 세포들을 96-웰 미량역가 플래이트의 각 웰에 옮겼다. 그리고나서, 추천되는 항원 농도의 2-배(하기 항원 및 농도에 대한 목록 참조)를 함유하는 100㎕의 배지를 첨가하였다. 분석이 4번 거듭되어 수행되었다. 대조군으로 항원이 없는 세포들 및 배지를 가지고 4개의 웰이 분석되었다. 상기 플래이트들은 5% CO₂로 적셔진 항온배양기 안에서 7일동안 배양되었다. 상기 배양기간중 6일째되는 날에, 1μCi/well의³H-타이미딘이 첨가되었다. 18시간동안 배양을 계속하고 나서, 수확하였다. 세포 증식은, 섬광액체와 베타 카운터 판독기를 사용하여 DNA로의³H-타이미딘의 합체 정도로 분석하였다.

테스트된 항원	농 도
파상풍 유독소 (Connaught Lab. Inc. Pen. USA)	5 g/㎖
칸디다 알비칸스 (Miles, WA. USA)	20 ㎍/㎖
재조합 사람 hsp60 (StressGen, Canada)	2-5 ㎍/㎖
사람 hap60 합성 펩티드들	20 ㎍/㎖

증식성 반응이 T 세포들의 DNA에 합체되는³H-타이미딘에 의해서 측정되었다(Elias et al., 1991). 테스트된 항원과 함께 배양된 세포들과 대조군으로써 항원이 없이(배지만 있음) 배양된 세포들 사이에서 1분당 방사성 카운트(CPM)가 비교되었다. 증식 수치들은 자극 지수 수치(S.I.)( 항원이 있는 것의 평균 CPM / 항원이 없는 평균 CPM)로 표시되었다. S.I.지수가 2이상이면 양성인 것으로 간주되었다.

결과들은, 사람 hsp60 또는 hsp60-펩티드에 반응하는 개체들의 발생빈도에 있어서 IDDM 환자(84%)가 건강한 사람들(90%)보다 더 높음을 보여주었다. 차이에 대한 피셔 이그잭트 테스트(Fisher Exact Test) p 값이 0.0044인데 이는 매우 현저한 것이다.

사람 hsp60 단백질에 대한, 사람 hsp60 합성 펩티드에 대한, 그리고, 다양한 리콜 항원들에 대한, 두명의 대표적인 IDDM 환자와 한명의 건강한 사람의 증식성 반응들이 도 7, 8, 9에 나타나 있다. 표5는, 어떤 IDDM환자도 반응하지 않은, hsp60 합성 펩티드들에 대한 두 예(p19, p20)를 보여주고 있다(도 10A 및 10B 참조).

각각의 환자들은 리콜 항원들(칸디다, 파상풍, 또는 인플루엔자)에, 사람 hsp60 단백질에, 그리고 다양한 사람 hsp60 펩티드들에 반응하였음을 볼 수 있다. 대조군 사람은 오직 대조군 리콜 항원에만 반응하였다.

적어도 한 명의 IDDM환자가 반응하였던 hsp60 합성 펩티드들의 서열들이 표 1에 나타나 있다. 이들 펩티드 각각은 IDDM을 치료하는데 있어서 치료 잠재력을 갖는다.

IDDM 환자들이 반응하지 않은 Hsp60 합성 펩티드들 및 그들의 서열

펩 티 드	서열번호 1의 잔기 번호	아미노산 서열 (1문자 코드)
p19	271-290	LVIIAEDVDGEALSTLVLNR
p21	301-320	KAPGFGDNRKNQLKDMAIAT

앞서 설명된 본 발명의 실시예들은 본 발명의 일반적인 본질을 완전히 나타내는 것으로서, 본 발명의 분야의 기술(여기에서 언급된 참조들을 포함하여)을 적용하여, 본 발명의 일반적인 개념에 벗어나지 않고, 과도한 실험을 수행하지 않으면서, 그러한 실시예들을 용이하게 적용시키거나 수정할 수 있다. 따라서, 그러한 적용들과 수정들은, 본 발명에 제시된 가르침에 기초한, 개시된 실시예들의 의미 및 그 균등 범위에 있다. 여기에서 본 발명을 설명하기 위하여 사용되는 어구 또는 용어는 제한적이지 않고, 본 명세서의 그러한 용어 또는 어구는, 본 분야에서의 통상적인 지식과 여기에서 제시된 가르침 및 안내를 고려하여 이해된다.

참조문헌들

Bach JF. (1994) 자가면역 질병으로써 인슐린-의존적 진성당뇨병. Endicrine Reviews 15:516-542.

Bendelac A, Carnaud C, Boitard C, Bach JF.(1987) 당뇨병적 NOD 쥐들로부터 건강한 신생아들로의 자가면역 당뇨병의 동계 전이. L3T4+ 및 Ly+-2+ T 세포들에 대한 필요물. J Exp Med, 166:823-32.

Birk OS, Elias D, Weiss AS, Rosen A, van-der Zee R, Walder MD, Cohen IR.(1996) NOD 쥐 당뇨병들: 편재하는 쥐 hsp60은 자가면역 T세포들의 베타-세포 표적 항원이다. J. Autoimmun. 9:159-166

Bowman MA, Leiter EH and Atkinson MA. (1994) NOD 쥐들에서의 당뇨병의 예방: 사람의 질병에서 치료학적 조정에 관한 암시들. Immunoloqy Today, 15:115-20.

Castano L, Eisenbarth GS. (1990) 타입-Ⅰ 당뇨병들: 사람, 마우스, 및 쥐의 만성적인 자가면역 질병. Annu Rev Immunol, 8:647-79.

Cohen IR. (1991) 관절염 및 당뇨병의 병인론에 있어서 샤프롱에 대한 자가면역성. Annu Rev Immunol 9:567-589.

Elias, Dana. (1994) NOD 쥐: 자가면역 인슐린-의존형 당뇨병의 모델. Autoimmune Disease Models, A Guidebook, pp 147-61.

Elias D, Cohen IR. (1995) 열 쇼크 단백질 60 펩티드 p277을 갖는 NOD쥐에 있어서 자가면역 당뇨병 및 인슐린염의 치료. Diabetes 44:1132-1138.

Elias D, Reshef T, Birk OS, van der Zee R, Walker MD, Cohen IR. (1991) 사람의 65kDa 열 쇼크 단백질의 T-세포 에피토프를 사용하는 자가면역 쥐 당뇨병에 대하여 예방접종. Proc Natl Acad Sci USA, 88:3088-91.

Elias D, and Cohen IR. (1994) NOD 쥐들에서 당뇨병에 관한 펩티드 치료법. The Lancet, 343:704-06.

Elias D. and Cohen IR. (1996) hsp60 펩티드 p277은 독소 스트렙토조신에 의해 유도되는 자가면역 당뇨병을 억제한다. Diabetes (in press)

Katz JD, Benoist C, Mathis D. (1995) T 헬퍼 세포는 인슐린-의존적 당뇨병의 일부분이다. Science 266:1185-1188.

Kaufman DL, Clare-Salzer M, Tian J, Forsthuber T, Ting GSP, Robinson P, Atkinson MA, Sercarz EE, Tobin AJ, Lehman PV. (1993) 쥐의 인슐린-의존 당뇨병에서의 글루타믹산 디카르복실라아제에 대한 T-세포 저항성의 자발적인 손실. Nature, 366:69-72.

Liblau RS. Singer SM, McDevitt HO. (1995) 기관-특이성을 갖는 자가면역 질병의 병인론에 있어서 Th1 및 Th2 CD4+ T 세포. Immunol Today 16:34-38.

Mossman TRR, Coffman RL. (1989) TH1 및 TH2 세포들: 다른 패턴의 림포카인 분비는 다른 기능적 성질을 유도한다. Annu Rev Immunol 9:145-173.

Tisch R, Yang XD, Singer SM, Liblav RS, Fuggar L, McDevitt HO. (1993) 비-비만 당뇨병적 쥐에서 인슐린염과 상관관계가 있는 글루타믹산 데카르복실라아제에 대한 면역 반응. Nature, 366:72-75.

<서열 리스트>

(1) 일반정보:

(i) 출원인:

(A) 이름: 웨이즈만 인스티튜트 오프 사이언스에 있는 예다 리서치 앤 디벨롭프먼트 코 엘티디.

(B) 스트리트: 사서함 95

(C) 도시: 레호보트

(E) 국가: 이스라엘

(F) 우편번호(ZIP): 76 100

(G) 전화: 972-8-9470617

(H) 텔레팩스: 972-8-9470739

(A) 이름: 이런 R. 코헨

(B) 스트리트: 11 핸킨 스트리트

(C) 도시: 레호보트

(E) 국가: 이스라엘

(F) 우편번호(ZIP): 76354

(A) 이름: 다나 엘리아스

(B) 스트리트: 57 데레히 야브엔

(C) 도시: 레호보트

(E) 국가: 이스라엘

(F) 우편번호(ZIP): 78344

(A) 이름: 리브카 아불라피아

(B) 스트리트: 31/11 웨즈만 스트리트

(C) 도시: 야후드

(E) 국가: 이스라엘

(F) 우편번호(ZIP): 56000

(A) 이름: 자나 복코바 c/o Ms. 조안 프래이저, NYS/페디아트릭스, 서니 헬스 사이언스 센터

(B) 스트리트: 11 층, 방번호 040

(C) 도시: 스토니 브루크

(D) 주: N. Y.

(E) 국가: 미국

(F) 우편번호(ZIP): 11794

(ii) 발명의 명칭: 당뇨병의 치료를 위해 사람 열 쇼크 단백질 60에서 유래된 신규한 펩티드들, 조성물들, 방법들 및 장치들

(iii) 서열수: 6

(iv) 읽기 가능한 컴퓨터 형식:

(A) 매체 타입: 프로피 디스크

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환 기종

(C) 운영체계: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, 버전 #1.30 (EPO)

(vi) 우선권 출원 데이터:

(A) 출원번호: IL 114407

(B) 출원일: 1995년 6월 30일

(2) 서열번호 1에 대한 정보:

(i) 서열 특성

(A) 길이: 573개 아미노산

(B) 서열의 형: 아미노산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: 단백질

(xi) 서열: 서열번호 1

(2) 서열번호 2에 대한 정보:

(i) 서열 특성

(A) 길이: 24개 아미노산

(B) 서열의 형: 아미노산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: 펩티드

(xi) 서열: 서열번호 2

(2) 서열번호 3에 대한 정보:

(i) 서열 특성

(A) 길이: 20개 아미노산

(B) 서열의 형: 아미노산

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: 펩티드

(xi) 서열: 서열번호 3

(2) 서열번호 4에 대한 정보:

(i) 서열 특성

(A) 길이: 17개 아미노산

(B) 서열의 형: 아미노산

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: 펩티드

(xi) 서열: 서열번호 4

(2) 서열번호 5에 대한 정보:

(i) 서열 특성

(A) 길이: 20개 아미노산

(B) 서열의 형: 아미노산

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: 펩티드

(xi) 서열: 서열번호 5

(2) 서열번호 6에 대한 정보:

(i) 서열 특성

(A) 길이: 18개 아미노산

(B) 서열의 형: 아미노산

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: 펩티드

(xi) 서열: 서열번호 6

Claims

표 1에 나타나 있는 펩티드들로부터 선택된 펩티드 및 그들의 염들 및 기능성 유도체들
제1항에 있어서, 본원에서 p12로 명명된 것임을 특징으로 하는 펩티드.
제1항에 있어서, 본원에서 p32로 명명된 것임을 특징으로 하는 펩티드.
인슐린-의존성 당뇨병(이하에서 IDDM이라 함)의 진단을 위한 제1항에 따른 펩티드의 용법.
환자내 IDDM의 존재 또는 초기 진단하기 위한 방법으로서, 사람 hsp60과 면역학적으로 반응성있는 항체들 또는 T 세포들의 존재에 관하여, 제1항에 따른 펩티드를 항원으로서 사용하여 환자의 혈액 또는 소변을 시험하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 환자내 IDDM의 존재 또는 초기를 진단하기 위한 방법.
제5항에 있어서, 상기 방법은 항-hsp60 항체들의 존재 또는 hsp60과 면역반응하는 T 세포의 존재에 관하여 상기 환자를 시험하되, 항-hsp60 항체들 또는 hsp60과 면역반응하는 T 세포가 존재한다는 것을 나타내는 결과가 IDDM의 존재 또는 초기에 대한 높은 확률을 표시하는 시험 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 환자내에 IDDM의 존재 또는 초기를 진단하기 위한 방법.
제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 환자는 항-hsP60 항체들의 존재에 대하여 시험되는 것임을 특징으로 하는 환자내 IDDM의 존재 또는 초기를 진단하기 위한 방법.
제7항에 있어서, 상기 시험 방법은 방사선면역검정을 포함하는 것임을 특징으로 하는 환자내 IDDM의 존재 또는 초기를 진단하기 위한 방법.
제7항에 있어서, 상기 시험 방법은 ELISA 시험을 포함하는 것임을 특징으로 하는 환자내 IDDM의 존재 또는 초기를 진단하기 위한 방법.
제5항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법에 따라서, 항-hsp60 항체들이 존재하는지를 시험함에 의하여 IDDM의 존재를 진단하기 위한 장비에 있어서,

(ⅰ) 제1항에서의 서열들 중 한 펩티드인 항원; 및

(ⅱ) 검출을 위하여 상기 항-hsp60 항체들의 비-변화 영역을 인식할 수 있는 꼬리표가 달린 항체를 포함하는 것임을 특징으로 하는 항-hsp60 항체들이 존재하는지를 시험함에 의하여 IDDM의 존재를 진단하기 위한 장비
제10항에 있어서, 상기 항원은 제2항에 따른 펩티드인 것임을 특징으로 하는 IDDM의 존재를 진단하기 위한 장비.
제10항에 있어서, 상기 항원은 제3항에 따른 펩티드인 것임을 특징으로 하는 IDDM의 존재를 진단하기 위한 장비.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원은 고체상에 고정되는 것임을 특징으로 하는 IDDM의 존재를 진단하기 위한 장비.
제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장비는 IDDM의 진단시 상기 장비의 사용법에 관한 지침서를 더 포함하는 것임을 특징으로 하는 IDDM의 존재를 진단하기 위한 장비.
제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 꼬리표는 방사선 동위원소, 효소, 발색단 또는 형광단으로 이루어진 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 IDDM의 존재를 진단하기 위한 장비.
제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 환자는 hsp60과 면역반응하는 T 세포의 존재에 대하여 시험되는 것임을 특징으로 하는 환자내에 IDDM의 존재 또는 초기를 진단하기 위한 방법.
제16항에 있어서, 상기 시험 방법은 다음과 같은 단계들을 포함하는 T 세포 증식 시험을 포함하는 것임을 특징으로 하는 환자내 IDDM의 존재 또는 초기를 진단하기 위한 방법:

(ⅰ) 상기 환자로부터 얻어진 혈액 샘플로부터 T 세포들을 함유하는 단핵 세포 분획을 준비하는 단계;

(ⅱ) 상기 단핵 세포 분획에 제1항에 따른 펩티드로부터 선택되어진 항원을 첨가하는 단계;

(ⅲ) 상기 항원의 존재하에 적당한 시간 동안 적당한 배양 조건에서 상기 세포 분획을 항온 배양하는 단계;

(ⅳ) 상기 항온 배양 시간이 끝나기 전에 (ⅲ)의 항온 배양된 세포 배지에 표지된 뉴클레오타이드를 첨가하여 표지된 뉴클레오타이드가 증식하는 T 세포들의 DNA내로 합체되도록 하는 단계; 및

(ⅴ) 상기 T 세포들내로 합체된 표지된 뉴클레오타이드의 양을 분석함에 의하여 증식하는 T 세포들의 양을 결정하는 단계.
제5항, 제6항 및 제17항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라서, hsp60과 면역반응하는 T 세포가 존재하는지를 시험함에 의하여 IDDM의 존재를 진단하기 위한 장비에 있어서,

(ⅰ) 제1항에 따른 펩티드로부터 선택된 항원;

(ⅱ) 표지된 뉴클레오타이드; 및

(ⅲ) 림포사이트의 배양을 위한 적당한 배지:

을 포함하는 것임을 특징으로 hsp60과 면역반응하는 T 세포가 존재하는지를 시험함에 의하여 IDDM의 존재를 진단하기 위한 장비.
제18항에 있어서, 상기 장비는 IDDM의 진단시 상기 장비의 사용법에 관한 지침서들을 더 포함하는 것임을 특징으로 IDDM의 존재를 진단하기 위한 장비.
제16항에 있어서, 상기 시험 방법은 다음의 단계들을 포함하는 T 세포 시토킨 반응 시험을 포함하는 것임을 특징으로 하는 환자내 IDDM의 존재 또는 초기를 진단하기 위한 방법:

(ⅰ) 상기 환자로부터 얻어지는 혈액 샘플로부터 T 세포들을 함유하는 단핵 세포 분획을 준비하는 단계;

(ⅱ) 상기 단핵 세포 분획에 제1항에 따른 펩티드로부터 선택되어진 항원을 첨가하는 단계;

(ⅲ) 상기 항원의 존재하에 적당한 시간 동안 적당한 배양 조건에서 상기 세포 분획을 항온 배양하는 단계; 및

(ⅳ) 반응하는 림포사이트들에 의하여 배지로 분비되는 시토킨의 존재를 측정하는 단계.
제20항에 있어서, 상기 시토킨은 IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNFα 또는 TNFβ인 것임을 특징으로 하는 환자내 IDDM의 존재 또는 초기를 진단하기 위한 방법.
제5항, 제6항, 제20항 및 제21항 중 어느 한 항의 방법에 따라서 hsp60과 면역반응하는 T 세포가 존재하는지를 시험함에 의하여 IDDM의 존재를 진단하기 위한 장비에 있어서:

(ⅰ) 제1항에 따른 펩티드로부터 선택된 항원;

(ⅱ) 림포사이트들의 배양을 위한 적당한 배지; 및

(ⅲ) 반응하는 림포사이트들에 의해 배지로 분비되는 시토킨의 존재를 측정하기 위한 검정 도구를 포함하는 것임을 특징으로 하는 IDDM의 존재를 진단하기 위한 장비.
제22항에 있어서, 상기 장비는 IDDM의 진단에 상기 장비를 사용하기 위한 지침서를 더 포함하는 것임을 특징으로 하는 IDDM의 존재를 진단하기 위한 장비.
제16항에 있어서, 제1항에 따른 펩티드로부터 선택되어진 항원은 환자에게 피하로 주입되고 감지할 수 있는 피부 반응의 발생이 관측되는 것임을 특징으로 하는 환자내 IDDM의 존재 또는 초기를 진단하기 위한 방법.
IDDM을 예방하고 치료하기 위한 조제에 있어서,

(a) 제1항에 따른 펩티드와 면역학적으로 교차-반응성을 갖는 단백질 또는 펩티드에 대하여 특이성을 보이고, 상기 펩티드의 존재하에 항온 배양됨에 의하여 활성화되는 T 세포들;

(b) 방사선 조사되거나 그렇지 않으면 감쇄된 상기 T 세포들;

(c) 유체정력학적 압력에 의한 압력처리, 화학적 교차-연결 시료로의 처리 및/또는 세포골격적 교차-연결 시료에 의한 처리를 받은 상기 T 세포들;

(d) (a), (b) 또는 (c)로부터 떨어져 나온 단편들 또는 표면 단백질; 또는

(e) 상기 단백질, 또는 그들의 염, 기능적인 유도체, 전구체 또는 활성적인 분획에 특이적인 (a)의 수용체의 변화 영역을 필수적으로 가지는 펩티드를 포함하는 것임을 특징으로 하는 IDDM을 예방하고 치료하기 위한 조제.
제25항에 있어서, 상기 (a)의 T 세포들은 사람 T 세포들이고, 상기 T 세포들의 특이성은 상기 펩티드와의 생체외 접촉에 의하여 발달된 것임을 특징으로 하는 IDDM을 예방하고 치료하기 위한 조제.
제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 T 세포들은 생체외에서 제1항에 따른 펩티드에 대한 특이성을 발달시킨 것임을 특징으로 하는 IDDM을 예방하고 치료하기 위한 조제.
제1항에 따른 펩티드 및 약학적으로 받아들여질 수 있는 캐리어를 포함하는 약학적 조성물.
제28항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 IDDM을 예방하거나 치료하기 위한 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 펩티드는 제2항에 따른 펩티드인 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 펩티드는 제3항에 따른 펩티드인 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
IDDM의 치료를 위한 약학적 조성물의 제조를 위하여 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 펩티드의 용법.