DE69627161T2

DE69627161T2 - Verfahren zum nachweis oder zur überwachung der wirksamkeit der behandlung durch t-zellen vermittelter erkrankungen

Info

Publication number: DE69627161T2
Application number: DE69627161T
Authority: DE
Inventors: R. Irun COHEN; Dana Elias
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1995-07-05
Filing date: 1996-07-02
Publication date: 2004-02-19
Anticipated expiration: 2016-07-03
Also published as: IL114459A0; WO1997002052A1; EP0847281B1; JP2001520740A; DE69627161D1; JP3905126B2; EP0847281A4; ATE235922T1; EP0847281A1; AU6454396A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Endung betrifft Verfahren zur Behandlung von von T-Zellen vermittelten Krankheiten, etwa der Typ I-Diabetis, auch bekannt als insulinabhängige Diabetes mellitus (IDDM) und Verfahren zur Erkennung und/oder Beobachtung der Effektivität einer derartigen Behandlung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Typ I-Diabetes oder IDDM ist eine Autoimmunerkrankung, die durch T-Zellen verursacht wird, die die Insulin erzeugenden Zellen angreifen und zerstören, die in den Inselzellen der Bauchspeicheldrüse angeordnet sind (Castano und Eisenbarth, 1990). Der Autoimmunvorgang, der in IDDM kumuliert, beginnt und schreitet fort ohne Symptome. Die Krankheit zeigt sich klinisch erst, wenn der kumulative Verlust an β-Zellen die Kapazität der verbleibenden β-Zellen zur Erzeugung von Insulin übersteigt. Der Kollaps von Glukosehomeostase und klinischer IDDM treten wohl erst auf, nachdem 80–90% der β-Zellen durch das Immunsystem inaktiviert sind. Patienten, bei denen eine Erkrankung an IDDM erkannt ist, sind daher bereits in einem fortgeschrittenen Zustand der autoimmunen Zerstörung ihrer ß-Zellen. Die Diagnose von beginnender, vorklinischer Diabetes durch die Erkennung von immunologischen Markern von β-Zellen-Autoimmunität kann daher erst nach dem Beginn des autoimmunen Vorgangs erfolgen. Es ist daher eine therapeutische Anforderung, einen sicheren, spezifischen und effektiven Weg zum Ausschalten eines autoimmunen Prozesses, der bereits läuft, zu finden.
Die vorliegenden Erfinder haben diese Fragestellung früher durch Studieren der spontanen Diabetes, die sich in Mäusen des NOD-Stamms entwickelt, der als gutes Modell der humanen IDDM betrachtet wird (Castano und Eisenbarth, 1990), untersucht). Der spontane Autoimmunvorgang, der zur Diabetes in NOD-Mäusen fuhrt, ist erst als leichte Insulins zu erkennen, die in einem Alter von 1 Monat beginnt. Bei den meisten weiblichen Mäusen schreitet die Insulins voran zu einem penetrierenden Intra-Inselinfiltrat, das zu einer β-Zellen Zerstörung und zu einer offensichtlichen insulin-abhängigen Diabetes Mellitus (IDDM) führt, die sich in einem Alter von etwa 4–5 Monaten zeigt (Bach, 1991). Die Insulins tritt gemeinsam mit einer T-Zellen-Autoreaktivität und Autoantikörpern gegenüber einer Mehrzahl von Selbstantigenen auf (Harrison, 1992). Es wurde angenommen, dass eines der Antige das primäre Ziel für eine Insulins ist, die eine Autoimmunität gegenüber zusätzlichen, sekundären Selbst-Antigenen aktivieren könnte. Die T-Zellen-Antwort auf Glutaminsäure Decarboxylase (GAD) wurde als nachweisbar berichtet, bevor die T-Zellen-Antwort auf hsp60 und andere Antige antwortet (Kaufman et al., 1993; Tisch et al., 1993) und der Gabe von GAD durch intrathymische Injektion bei einem Alter von 3 Tagen (Kaufman et al., 1993) oder durch intravenöse Injektion bei einem Alter von 3 Wochen (Tisch et al., 1993). Dies zeigte eine Hemmung der Entwicklung von T-Zellenreaktivität auf andere Selbst-Antigenen einschließlich hsp60 und ist zur Verhinderung von Diabetes geeignet. Die Forscher schlossen daraus, dass eine Autoimmunität auf GAD das primäre Ereignis sein könnte, das zu Diabetes führen könnte. Eine Vielzahl von vermutlich „nicht-spezifischen" Manipulationen, die früher im Verlauf der Insulins angewendet werden, können die spätere Entwicklung von Diabetes verhindern oder verzögern (Bowman et al., 1994).
Neben dem GAD Antigen hat sich Autoimmunität gegenüber hsp60 als von funktionaler Bedeutung für die NOD Diabetes gezeigt (PCT Patentveröffentlichung Nr. WO 90/10449): T-Zellen, die auf das hsp60 Peptide p277 antworten, könnten Diabetes adoptiv transferieren, oder, wenn verdünnt, könnte Mäuse gegen Diabetes vakzinieren (Elfas et al., 1991); eine einmalige, subkutane Gabe von Peptid p277 in Öl entweder frühzeitig (Elfas et al., 1991) oder sehr spät in dein autoimmunen Prozess (Elias et al., 1 994) könnte die Krankheit hemmen.
T-Zellen vom CD4 „Helfer"-Typ wurden durch die charakteristischen Cytokine, die sie bei Aktivierung absondern, in zwei Gruppen geteilt (Mosmann et al., 1989). THI-Zellen sondern IL-2 ab, das eine T-Zellen Proliferation und Cytokine wie IFNγ, das eine Gewebsentzündung verursacht, induziert; TH2-Zellen dagegen sondern IL-4 und IL-10 ab. IL-4 unterstützt die Absonderung von Antikörpern bestimmter IgG Isotypen durch die ß-Zellen und unterdrückt die Produktion von TH1 entzündlichen Cytokinen (Banchereau et al., 1994). IL-10 hemmt indirekt die TH1-Aktivierung durch Beeinflussung der Antigen-Präsentation und der Erzeugung von entzündlichen Cytokinen durch Makrophagen (Moore et al., 1993).
Es wurde jetzt durch die Versuche der Erfinder dieser Anmeldung erkannt, dass die erfolgreiche Behandlung des Autoimmunprozesses in IDDM durch die Gabe von Peptid p277 in Öl durch den Effekt dieser Behandlung bezüglich der Unterdrückung der Autoimmunität vom TH1-Typ gegenüber verschiedenen unterschiedlichen Antigen und stattdessen Aktivieren der p277-Autoimmunität in einer TH2-Mode verursacht wird. Eine Krankheit mit einem Spektrum von Autoreaktivitäten kann daher mit einem einzelnen Peptid ausgeschaltet werden, das dazu in der Lage ist, eine T-Zellen Cytokinverschiebung zu induzieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Effektivität der Behandlung von durch T-Zellen vermittelter Krankheit zu bestimmen oder zu beobachten durch Testen der Verschiebung von einer TH1-Zellen-Antwort auf eine TH2-Zellen-Antwort über die Zeit in einem geeigneten Tiermodell. Dies kann begleitet werden durch Erkennen einer Verschiebung in dem Antikörperisotyp von lgG2a zu 1gG1 und 1gG2b Isotyp-Antikörpern oder Erkennen einer Verschiebung von der Proliferation der Cytonkine von 1L-2 zu 1FNγ und IL-4 und IL 10.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine optimale Impfdosierung und einoptimales Regime durch Messen einer optimalen Verschiebung von TH1 T-Zellen Cytokinantwort auf eine TH2 T-Zellen Cytokinantwort zu schaffen
KURZE ERLÄUTERUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt Graphen, die zeigen, dass die T-Zellen-Proliferationsantwort auf GAD und hsp60 Peptiden durch eine p277 spezifisch reduziert wird. In dem rechten Feld wurden NOD-Mäuse mit Peptiden p277, das in mineralischem Öl emulgiert war, behandelt, in dem linken Feld wurden NOD-Mäuse mit phosphatgepuffertem Salz (JPBS), das in mineralischem Öl emulgiert war, behandelt. Die verschiedenen Säulen des Graphen zeigen die T-Zellen-Proliferationsantworten auf das T-Zell-Mitogen Con A (offene Säulen), p277 (vertikale Streifen), GADp34 (horizontale Streifen) und MT-p278 (gepunktete Säulen). Die Sternchen geben p<0,01 nach dem Student-T Tests an.
2 ist ein Graph, der zeigt, dass die Behandlung mit p277 Antikörper auf p277 induziert und Antikörper auf GAD, auf Insulin und auf intaktem hsp60 reduziert. Das rechte Feld zeigt die Ergebnisse der Behandlung von NOD-Mäusen mit p277 in Öl, das linke Feld ist eine Kontrolle, in der die NOD-Mäuse mit PBS-Öl behandelt wurde. Die Säulen zeigen die prozentuale Häufigkeit der Antikörper auf rekombinates GAD65 (auf gepunkteten Säulen), auf rekombinantes humanes hsp60 (schräge Streifen), auf bovines Insulin (offene Säulen) oder auf Peptid p277 (vertikale Streifen). Die Sternchen geben p < 0,01 durch den Chi-Quadrattest an.
3A und 3B sind Graphen, die die Antikörper-Isotypen vor und nach der p277 Therapie zeigen. 3A zeigt die Ergebnisse einer Probe für die Isotypen von Antikörpern von NOD-Mäusen auf intaktes hsp60 (kleine Kreise) oder GAD (offene Kreise) vor der Behandlung. Kontrollsera von BALB/c-Mäusen wird durch x angegeben. 3B zeigt die Ergebnisse einer Probe für die Isotypen von Antikörpern auf p277-Wochen nach der Behandlung bei kontrollbehandelten Mäusen (offene Kreise) oder p277-behandelten Mäusen (geschlossene Kreise). Die Säulen in jedem Experiment zeigen die Ergebnisse einer gleichen Anzahl von Mäusen, eine scheinbare Verringerung der Anzahl von Kreisen wird durch Überlagerung verursacht.
4A–4D sind Graphen, die das Cytokinprofil von T-Zellen vor und nach einer p277 Peptidetherapie zeigen. Gruppen von 10 NOD-Mäusen, die drei Monate alt waren, wurden mit p277 in Öl (geschlossene Balken) oder mit PBS in Öl (offene Balken) behandelt. Die Menge der spezifischen Cytokine, die nach einer Inkubation von Milzzellen von diesen Mäusen mit Con A, p277 oder MT p278 injiziert waren, sind gezeigt. 4A zeigt die Menge von IL-2, das 24 Stunden nach der Inkubation abgesondert wurde; 4B zeigt die Menge von IFNγ, das 48 Stunden nach der Inkubation abgesondert wurde, 4C zeigt die Menge von IL-10, das 48 Stunden nach der Inkubation abgesondert wurde und 4D zeigt die Menge von IL-4, das 24 Stunden nach der Inkubation abgesondert wurde. Ein Stern gibt p<0,01 nach dem Student T Test an.
5A–5B sind Graphen, die das Cytokinprofil von T-Zellen vor und nach einer p277/Intralipid-Peptid-Therapie zeigen. Gruppen von 10 NOD-Mäusen, die drei Monate alt waren, wurden mit p277 in Intralipid (geschlossene Balken) oder mit PBS in Intralipid (offene Balken) behandelt. Die Menge von IL-2, IFNγ, IL-4 und IL-10, das nach Inkubation von Milzzellen von diesen Mäusen mit p277 (5A) oder mit Con A (5B) induziert war, sind gezeigt Die Sternchen geben p < 0,01 an.
EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
NOD-Mäuse entwickeln spontan Diabetes vom Typ I, der durch autoimmune T-Zellen, die die insulinproduzierenden β-Zellen in den Inseln angreifen, verursacht wird. Der autoimmune Angriff ist begleitet von einer T-Zellen-Reaktivität gegenüber einer Mehrzahl von Selbst-Antigenen einschließlich eines Peptids vom 60 kDa Wärmeschockprotein (hsp60) und Peptiden der Glutaminsäure Decarboxylase (GAD). Die kürzlichen Untersuchungen der Erfinder haben gezeigt, dass die Peptide von hsp60, die als p277 bezeichnet werden, zum Stoppen oder Umkehren des autoimmunen Prozesses auch nach der Entwicklung fortgeschrittener Insulins und offenkundiger Diabetes verwendet werden können. Es wurde entdeckt, dass eine p277-Peptidbehandlung die spontane T-Zellen Proliferationsantwort auf Epitope sowohl des hsp60 und der GAD herabregelt und die Erzeugung von Autoantikörpern gegenüber hsp60, gegenüber GAD und gegenüber Insulin ausschaltet Das Stoppen des krankhaften Prozesses wird nicht von einer T-Zellen-Toleranz oder Anergie begleitet, sondern mit einer Verschiebung in den Cytokinen, die durch die autoimmune T-Zellenreaktivität gegenüber p277 von einem TH1-ähnlichen Profil (IL-2, IFNγ) zu einem TH2-ähnlichen Profil (IL-4, IL-10). Die Modulation ist immunologisch spezifisch, die spontane T-Zellen-Antwort der behandelten Mäuse auf ein bakterielles hsp60 Peptid verbleibt in dem TH1-Mode. Der diabelogene Vorgang, der durch eine Autoimmunität gegenüber verschiedenen Antigenen gekennzeichnet ist, kann unter Verwendung einer der Antigene, Peptid p277, behandelt werden.
Die Entdeckung, das eine Krankheit mit einem Spektrum von Autoreaktivitäten mit einem einzigen Peptid ausgeschaltet werden kann, das in der Lage ist, eine T-Zellen-Ccytokine Verschiebung zu bewirken, führt zu der vorliegenden Erfindung, die ein neues Werkzeug zum Finden von Peptiden führt, die in der Lage sind, destruktive Autoimmünität zu regulieren und dessen Prinzip eine breite Anwendung bei jeder autoimmunen Krankheit hat und jeder Krankheit, die durch eine T-Zellen-Aktivität und insbesondere eine TH1 Zellen-Aktivität vermittelt wurde.
Die Verfahren nach der vorliegenden Erfindung beinhalten alle das Erkennen von oder das Beobachten einer Verschiebung von einer TH1 T-Zellen-Antwort, die fast universell in organspezifischen autoimmunen Krankheiten erkannt worden ist, auf eine TH2 T-Zellen Cytokinantwort über eine Zeitdauer. Es ist wichtig, ob diese Cytokinverschiebung eine relative Zunahme in der TH2-Zellen-Antwort auf die vaccinierenden Peptide hat, oder ob Clone von antigenen Zellen vom TH1-Typ ihr Verhalten auf der clonalen Ebene ändern. Obwohl die Anmelder nicht auf eine besondere Theorie festgelegt werden wollen, wird angenommen, dass es wahrscheinlicher ist, dass die Antigene, die eine solche Verschiebung verursachen, die Produktion von TH2-Zellen nur induzieren und dass die durch derart predominierende TH2-Zellen erzeugten Cytokine eine Unterdrückung der existierenden TH1-Zellen verursachen, die den entzündlichen Angriff verursachen.
In jedem Fall wird jede Behandlungsmodalität, die eine solche Verschiebung in einem Tier, das unter einer autoimmunen Krankheit leidet, eine bevorzugte Behandlungsmodalität sein. Die Erkennung einer solchen Fähigkeit der Beobachtung des Effekts eines jeden solchen Peptids auf eine gegebene autoimmune Erkrankung kann durch die vorliegende Erfindung geeig net erreicht werden durch Anwenden der vorgeschlagenen Behandlungsmodalität bei einem Lebewesen mit einer autoimmunen Erkrankung oder einem durch T-Zellen vermittelten entzündlichen Zustand, vorzugsweise einem akzeptierten Untersuchungsverfahren einer menschlichen, autoimmunen Erkrankung und anschließendes Testen des behandelten Lebewesens in Bezug auf eine Verschiebung von einer TH1 T-Zellen-Antwort auf eine TH2 T-Zellen-Antwort.
Das Vorhandensein und das Ausmaß des TH1 → TH2 Verschiebung dient als Zeichen, dass die Behandlung effektiv war und eine nützliche Antwort induzierte. Mit anderen Worten, die TH → TH2 Verschiebung kann als ein Ersatzmarker der Antwort auf die Behandlung dienen. Das Fehlen einer Verschiebung kann das Erfordernis für eine zweite Behandlung anzeigen.
Beispiele von Markern einer solchen Antwortverschiebung schließen die Bestimmung der Antikörper-Antwort, die durch die T-Zellen induziert sind, oder eine Bestimmung der Cytokine, die durch die T-Zellen erzeugt worden sind, ein. Es ist beispielsweise bekannt, dass die T-Zellen vom TH1-Typ die Produktion von Antikörpern der IgG2a-Klasse induzieren, während Antikörper vom TH2-Typ die Produktion von Antikörpern der IgG1 und IgG2b-Klasse induzieren. Durch die Prüfung des Isotyps der Antikörper zu dein gegebenen Antigen vor und nach der Behandlung kann man so das Ausmaß der Verschiebung von einer TH1 T-Zellen-Antwort auf eine TH2 T-Zellen-Antwort beobachten.
Es ist bekannt, dass TH1 T-Zellen ähnlich IL-2 ausscheiden, was eine T-Zellen-Pproliferation und Cytokone wie IFNγ induziert, was eine Gewebsentzündung vermittelt. Dagegen sondern TH2-Zellen IL-4 ab, was es den β-Zellen hilft, Antikörper der IgG1 und der IgG2b-Klasse abzusondern und die Produktion von TH 1 Entzündungscytokinen zu unterdrücken, als auch IL-10, was indirekt die TH1 Aktivierung durch Wirken auf die Antigenpräsentation und die Erzeugung entzündlicher Cytokine durch Makrophagen verhindert. Entsprechend gibt die Messung des Cytokinprofils der T-Zellen behandelter Lebewesen eine Angabe über die Verschiebung von einer TH1 T-Zellen-Antwort auf eine TH2 T-Zellen-Antwort. Milzzellen von einem behandelten Lebewesen , beispielsweise, können daher entfernt und mit dem Antigen inkubiert werden, was es abgegeben hat, um die Sekretion von Cytokinen zu induzieren Die Cytokine, die in der Kultur aufliegen, können dann quantifiziert werden, beispielsweise durch ELISA unter Verwendung von üblichen ELISA-Protokollen für Cytokine.
Modalitäten für die Behandlung jeder autoimmunen Erkrankung oder anderer T-Zellen vermittelter Erkrankungen oder Zustände können in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung erkannt oder beobachtet werden, wobei die Krankheiten IDD, Multiple Sklerose, schwere Myasthenie, Scleroderma, Polymyositis, Transplantat/Wirt-Erkrankungen, Transplantationsabstoßungen, Basedow-Krankheit, Addison-Krankheit, autoimmune Uveoretinitis, autoimmune Thyroiditis, Pemphigus vulgaris, rheumatische Arthritis, Ankylose Spondylitis, T-Zellen vermittelte allergische Antwort usw. sind. Eine solche Krankheit ist jedoch eine, die TH1-Zellen vermittelt ist.
Bekannte und akzeptierte Tiermodelle für viele derartige Erkrankungen sind gut verfügbar. Diese schließen beispielsweise NOD-Mäuse als Diabetesmodell, Mäuse mit experimentell induzierter autoimmuner Encephalomyelitis (EAE) als ein Multiples Sklerose Model, Mäuse mit experimenteller autoimmuner Thyroiditis (ETA) als ein Modell für autoimmune Thyroditis, Mäuse mit adjuvanter Arthritis (AA) als Model für rheumatische Arthritis usw., ein Vaccine, die die erwarteten Auto-Antigene beinhalten, müssen in einem tolerogenen Träger gegeben werden, um eine weitere Verschlimmerung des autoimmunen Prozesses zu vermeiden. Derartige Träger schließen mineralische Ölträger wie den inkompletten Freund'schen Adjuvant (IFA) oder kompletten Freund'schen Adjuvant (CFA) ein. IFA ist eine Emulsion eines mineralischen Öls, CFA ist eine Präparation eines mineralischen Öls, das verschiedene Mengen abgetöteter Mycobakterien beinhaltet. 1FA und CFA dürfen jedoch für Menschen nicht verwendet werden, da das mineralisch Öl nicht metabolisiert werden kann und von dem Körper nicht zersetzt werden kann. Es hat sich kürzlich gezeigt, dass bestimmte Fettemulsionen, die seit vielen Jahren zur intravenösen Ernährung von menschlichen Patienten eingesetzt worden sind, auch als Vehikel für eine Peptidtherapie unter Verwendung von Peptiden der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Zwei Beispiele derartiger Emulsionen sind die käuflich erhältlichen Fettemulsionen, die als Intralepid oder Lipofundin bekannt sind. „Intralipid" ist eine registrierte Marke der Fa. Kabi Pharmacia, Schweden, für eine Fettemulsion für intravenöse Ernährung, beschrieben in dem US-Patent 3,169,094 „Lipofundin" ist eine eingetragene Marke der Fa. B. Braun, Melsungen, Deutschland. Beide beinhalten Sojabohnenöl als Fett (100 bis 2008 in 1.000 ml destilliertem Wassers 10% bzw. 20%). Eidotterphosphorlipide werden als Emulgator in Intralipid (12 g/l destilliertes Wasser) und Eidotterlezithin in Lipofundin (12 g/l destilliertes Wasser) verwendet. Die Isotonizität ergibt sich aus der Zugabe von Glycerol (25 g/l) sowohl in Intralipid und Lipofundin.
Es wird angenommen, dass diese Vehikel tatsächlich biologisch aktive Träger sind, die bei der Komplexbildung den mutmaßlichen Auto-Antigenen den TH1 → TH2-Drift der autoimmunen T-Zellen fördern Es ist daher bevorzugt, solche Vehikel bei dem Prüfen für auf mögliche Auto-Antigene für die Verwendung am Menschen zu verwenden Ein solches Vehikel ist vorzugsweise eine Fettemulsion mit 10–20% Triclyceriden, pflanzlichen und/oder tieri schen Ursprungs, 1,2–2,4% Phospholipiden pflanzlichen oder tierischen Ursprungs, 2,25–4,5 %igem Osmo-Regulator, 0–0,5% Antioxidant und steriles Wasser auf 100%. Als ein solches Vehikel ist besonders bevorzugt Intralipid oder Lipofundin. Die Verwendung derartiger Vehikel wird in einer israelischen Patentanmeldung (identifiziert durch das Aktenzeichen des Anmelders 9523), die an demselben Tag wie die ursprüngliche israelische Anmeldung der vorliegenden Erfindung (identifiziert durch das Aktenzeichen des Anmelders 9536) desselben Anmelders (Übernehmers) der vorliegenden Erfindung.
Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung ist jedoch unabhängig von dem bestimmten verwendeten Adjuvant und jeder Antigen-Adjuvant-Komplex kann mittels der vorliegenden Erfindung geprüft. werden.
Wenn die T-Zellen-Antwort auf das Auto-Antigen in einem experimentellen Tiermodell von einer TH1 auf eine TH2-Antwort verschoben wird, wie es mittels des Tests nach der vorliegenden Erfindung bestimmt wird, hat man eine potentiell nützliche Modalität für die Behandlung der entsprechenden menschlichen Erkrankung identifiziert.
Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung kann weiter als ein Raster für tolerogene Adjuvante, die den biologischen Effekt der Vermittlung einer TH1 → TH2-Verschiebung haben, genutzt werden, wenn es in Kombination mit oder komplext mit einem Antigen gegeben wird, das durch die entzündlichen TH1-Zellen erkannt worden sind gemeinsam mit der Pathogenese der Erkrankung oder dem zu behandelnden Zustand Es ist jedoch bekannt, dass bei einer Kombination von p277 mit einem geeigneten Adjuvant eine TH1 → TH2-Verschiebung durch die Mittel, die in den vorliegenden Beispielen offenbart sind, erkannt werden kann. Um andere Adjuvante für die Möglichkeit einer Vermittlung einer derartigen TH1 → TH2-Verschiebung in Kombination mit p277 zu finden, können die vorgeschlagenen Adjuvante das mineralische Öl oder das Intralipid in den vorliegenden Beispielen ersetzen und das Vorhandensein einer TH1 → TH2-Verschiebung gemessen werden. Wenn eine solche Verschiebung gefunden wird, kann das Adjuvant als ein biologisch aktives tolerogenes Adjuvant klassifiziert werden, das in Kombination mit einem Antigen verwendet werden, das durch die TH1-Zellen, das mit der Pathogenese jeder TH1-vermittelten Krankheit zugehörig ist, in einem Impfstoff für die Behandlung von Patienten, die an einer solchen Krankheit leiden. Ein jedes solches Adjuvant, das unter Verwendung des Verfahrens nach der vorliegenden Erfindung gefunden wird, wird als Teil der vorliegenden Erfindung betrachtet. Ein weiteres Anti gen, das dafür bekannt ist, eine TH1 → TH2-Verschiebung zu vermitteln, wenn es mit einem mineralischen Öl oder einem Intralipid gegeben wird, kann auch für den Zweck dieses Tests verwendet werden.
Die Verschiebung sollte über eine geeignete Zeitdauer gemessen werden, beispielsweise 2–12 Wochen nach der Gabe des Vaccins. Die Effizienz der Behandlung kann über eine längere Zeitdauer durch periodisches Testen auf die relative TH1 → TH2-Cyrokinantwort beobachtet werden.
Besondere Techniken zum Prüfen der Isotype von Antikörpern und zum Prüfen des Vorhandenseins verschiedener Cytokine sind nicht an sich ein neuer Teil der vorliegenden Erfindung. Der Fachmann kennt die verschiedenen Art und Weisen des Prüfens auf Antikörper-Isotypen für die verschiedenen Cytokine, die durch TH 1 fand TH2 T-Zellen erzeugt werden. Jede derartige Technik kann natürliche für die vorliegende Erfindung zum Erkennen einer TH 1 → TH2-Verschiebung verwendet werden. Die hier dargelegten Beispiele offenbaren illustrativ Verfahren, um dies zu tun, sie sollen jedoch die vorliegende Erfindung nicht einschränken. Beispielsweise können, statt Milzzellen zu verwenden, peripher zirkulierende T-Zellen von einem Patienten gewonnen werden und auf die Cytokinantwort getestet werden.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Besondere Reduktion der spontanen T-Zellen proliferativen Antwort auf GAD und hsp60-Peptiden durch eine p277-Therapie
Das vorliegende Experiment wurde durchgeführt, um den immunologischen Mechanismus zu bestimmen, der mit der Behandlung des autoimmunen Vorgangs durch eine p277-Therapie verbunden ist. 133 weibliche NOD/Lt Mäuse mit einem Alter von 12 Wochen mit vorgeschrittener Insulitis (Elfas et al., 1994) wurden entweder mit p277 in mineralischem 01 (IFA, veräußert von Difco, Detroit, MI) (81 Mäuse) emulgiert oder mit einem phosphatgepufferten Kontrollsalz (PBS) in mineralischem Öl (52 Mäuse) wie von Elias et al., 1994 beschrieben emulgiert, behandelt. Fast alle der in der Kontrolle behandelten Mäuse entwickelten eine Diabetes (92%) und die meisten starben an unkontrollierter Hyperglykämie (80%) in einem Alter von 25 Wochen (Elfas et al., 1994). Dagegen entwickelten nur 28% der mit p277 behandelten Mäuse eine Diabetes und nur 17% starben (p < 0,01). Milzzellen wurden von parallelen Gruppen von Mäusen in einem Alter von 17 Wochen gewonnen und untersucht (5 Wochen nach Behandlung) auf ihre T-Zellen proliferative Antworten geprüft in vitro auf Peptid p277 von hsp60 (10 μg/ml) auf Peptid p34 von GAD (Kaufmann et al., 1993) (10 μg/ml) oder auf Peptid MT-p278 von mycobakteriellem hsp60 (l0 μ/ml) unter Verwendung einer Standardprobe (Elfas et al., 1991). Die NOD-Mäuse der Untersuchung der Erfinder zeigten eine spontane T-Zellen-Reaktivität auf Peptid MT-p278, so dass diese Peptide als eine bequeme auf T-Zellen spezifische Kontrolle bilden T-Zellen-Kulturen wurden auch aktiviert mit dein T-Zellen-Mitogen Con A (1,25 μg/ml).
Die Peptide wurden durch Standard Fmoc unter Verwendung eines automatisierten ABIMED-Synthesizers (Deutschland) synthetisiert wie beschrieben (Elfas et al., 1994). Die Peptide wurden durch Umkehrphasen HPLC gereinigt und ihre Zusammensetzungen wurden durch Aminosäureanalysen bestätigt. Die Sequenz des GAD Peptids 34 (Residuen 509–528; GADp34) war Ile-Pro-Pro-Ser-Leu-Arg-Thr-Leu-Glu-Asp-Asn-Glu-Glu-Arg-Met-Ser-Arg-Leu-Ser-Lys-(SEQ ID NO; 1) (Kaufmann et al., 1993). Die Sequenz von MT-p278 war Glu-Gly-Asp-Glu-Ala-Thr-Gly-Ala-Asn-lie-Val-Lys-Val-Ala-Leu-Glu-Ala (SEQ ID NO: 2). Die Sequenz von p277, die in allen Experimenten verwendet worden sind, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben worden sind, war Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Val-Ala-Leu-Leu-Arg-ValIle-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp (SEQ ID NO: 3). Dieses Peptid ist im wesentlichen an den Positionen 6 und 11 mit Valin (Val) am Ort des Cysteins (Cys) in der nativen Sequenz. Ein Ersatz der beiden Cys-Residuen durch Val vergrößert erheblich die Stabilität des Peptids, ohne die immunologische Aktivität zu beeinträchtigen. Das durch Val substituierte Peptid ist vollständig kreuzaktiv mit dem nativen Peptid durch T-Zellen und Antikörper-Proben, beide Peptide haben denselben therapeutischen Effekt bei Diabetes. Siehe die israelische Anmeldung 112,091, eingereicht am 21. Dezember 2994 und eine zweite israelische Anmeldung, die durch das Aktenzeichen 9451A der Anmelder identifiziert wird, die eingereicht worden ist an demselben Tag wie die Einreichung der ursprünglichen israelischen Anmeldung der vorliegenden Erfindung (identifiziert durch das Aktenzeichen des Anmelders 9536). Alle Effekte, die in diesem Papier gezeigt worden sind, wurden mit einer Variante von p277 wiederholt.
Die T-Zellenantwort wurde durch den Einbau von [³H]-Thymidin detektiert, das in die Behältnisse in Vierfach-Kulturen für wenigstens 18 Stunden einer 3-Tage-Kultur zugegeben wurde. Der Stimulationsindex (SI) wurde als das Verhältnis der mittleren cpm des Antigenbeinhaltenden Gefäßes zu dem Kontrollgefäß, das ohne Antigene oder Con A kultiviert worden war, berechnet. Die Standardabweichung von der Haupt cpm war immer geringer als 10%. Hintergrund cpm betrug in Abwesenheit von Antigenen 800–1500 cpm.
Die in 1 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die zum Vergleich dienenden NOD-Mäuse, die mit der Emulsion von PBS in Öl injiziert worden waren, spontan eine Reaktivität auf alle 3 Peptide und Con A zeigten. Unbehandelte Vergleichsmäuse manifestierten ähnliche spontane T-Zellen-Reaktivitäten (nicht gezeigt), im Gegensatz dazu zeigten die mit p277 behandelten Mäuse eine spezifische Abnahme (p < 0,01) in ihrer autoimmunen T-Zellen-proliferativen Antwort auf hsp60 und GAD Peptide; die Vergleichsantworten auf MT-278 und Con A blieben intakt. Die Behandlung mit dem hsp60 Peptid p277, die das Fortschreiten der Diabetes beendete, war mit einer spezifischen Zunahme in der T-Zellen-Antwort sowohl der hsp60 und der GAD Peptide. Diese Zunahme ist autoreaktiv, sie schließt jedoch nicht aus, dass sie auf Grund der T-Zellen Toleranz oder Anergy gegenüber anderen Mechanismen beruht.
BEISPIEL 2
Induktion von Antikörpern gegenüber p277 und Reduktion der Antikörper gegenüber GAD Insulin und intaktem hsp60 nach Behandlung mit p277
Zusätzlich zur T-Zellen-Reaktivität ist die Entwicklung von Diabetes in NOD Mäusen begleitet mit dem spontanen Auftreten von Antikörpern gegenüber Selbstantigenen wie hsp60 (Elias et al., 1990), GAD (Tisch et al., 1993) und Insulin (Elfas et al , 1990). Dieses Beispiel untersucht die Effekte der p277-Behandlung auf das Auftreten solcher Antikörper.
Gruppen von 10 NOD-Mäusen, 3 Monate alt, wurden mit p277 in Öl oder mit PBS in Öl behandelt, wie in dem Beispiel 1 beschrieben. 5 Wochen später wurden die Mäuse einzelnen ausgeblutet und ihr Serum wurde in einer Lösung 1 : 50 auf Antikörper auf rekombinantes GAD 65 (Kaufmann et al., 1993), auf rekombinantes humanes hsp60 (Elfas et al., 1991), auf bovines Insulin (Sigma) oder auf Peptid p277 in einem ELISA-Test wie beschrieben (Elfas et al., 1991) untersucht. Kurz gesagt, 10 μg der verschiedenen Antigene wurden auf Probenplatten aufgebracht (Maxisorp Nunc Platten wurden verwendet, da sie zum Binden von p277 geeignet waren) und wurden mit dem Testserum inkubiert Die Bindung von Antikörpern zu dem adhärenten Antigenen wurde unter Verwendung von Alkalin Phosphat konjugiertem Anti-Maus IgG + IgM (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) erkannt. Ein signifikanter Betrag an Antikörpern wurde als eine OD 405 nm Lesung größer als 0,251 definiert, was 3 SD über der mittleren ELISA-Lesung liegt, die in dem Serum von 10 normalen BALB/c Mäusen ist. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt, sie geben an, dass die Mäuse positiv gegenüber Antikörpern von verschiedenen Antigene sind. Ein Beispiel von tatsächlichen OD 405 nm Lesungen kann in 3 betrachtet werden.
2 zeigt das Auftreten von Mäusen mit diesen Antikörpern in der Vergleichsgruppen und der mit p277 behandelten Gruppe. Es zeigt sich, dass die Vergleichsgruppe von NOD-Mäusen ein hohes Auftreten von Antikörpern gegenüber GAD (80%) und gegenüber hsp60 (90%) manifestierte, ein moderates Auftreten von Anti-Insulin Antikörpern (50%) wurde beobachtet; es waren keine Antikörper gegenüber Peptid p277 vorhanden. Entsprechende Ergebnisse wurden in der unbehandelten Vergleichsgruppe (nicht gezeigt) gewonnen. Im Gegensatz dazu zeigten die mit p277 behandelten Mäuse eine signifikante Reduktion in dem Auftreten von Antikörpern gegenüber GAD, hsp60 und Insulin (p < 0,01). Die p277-Peptid Therapie des autoimmunen diabelogenen Prozesses wurde markiert durch einen spezifischen Abfall in der spontanen T-Zellen-Proliferation gerichtet auf hsp60 und GAD-Peptiden und durch das Fehlen von Antikörpern gegenüber GAD, hsp60 und Insulinmolekülen. Eine T-Zellen-Toleranz oder Anergie von p277 kann jedoch nicht für die Autoimmunität verantwortlich sein, da die mit p277 behandelten Mäuse einen deutlichen Anstieg auf 60% in dem Auftreten von Antikörpern gegenüber p277 (p>0,01) zeigten. Die Begleitung einer p277 Therapie mit einer Änderung in der Reaktivität gegenüber p277 von einer T-Zellen-Proliferation gegen Antikörper legt nahe, dass der therapeutische Effekt von einer Verschiebung in den prädominanten Cytokinen, die von den autoimmunen Zellen in den behandelten Mäusen ergeben kann, abhängt.
BEISPIEL 3
Analyse von Isotopen gegenüber Antikörpern die vor und nach der p277-Therapie erzeugt wurden
Die Möglichkeit einer Verschiebung von einem TH1-artigen zu einem TH2-artigen Verhalten wurde durch die Analyse der Isotypen der Antikörper gestützt, die vor und nach der p277-Therapie erzeugt wurden. 3 zeigt, dass die spontanen Antikörper, die gegenüber GAD und intaktem hsp60 vor der Behandlung mit p277 auftraten, der IgG2a-Klasse angehörten, Antikörper, die von T-Zellen vom Typ TH1, das IFNγ, absondern (Snapper und Mond, 1993). Diese IgG2a Antikörper verschwanden innerhalb von 3 Wochen nach der Behandlung mit p277. Im Gegensatz dazu zeigte die Analyse der Antikörper Isotypen der Anti-p277-Antikörper, die nach der Behandlung auftraten, ausschließlich solche der IgG 1 und IgG2B-Klassen abhängig von TH1 T-Zellen, die IL-4 erzeugen (Snapper und Mond, 1993) und möglicherweise TGFβ (Snapper et al., 1993). Es wurden keine IgG2a Antikörper von Typ TH 1 durch die p277-Therapie erzeugt (3B).
BEISPIEL 4
Messung des Cytokinprofils vor und nach der Peptid p277-Therapie
Um den Gedanken einer Cytokinumschaltung zu bestätigen, wurden Cytokine geprüft, die durch T-Zellen, die auf die p277 und die MT-p278 Peptide in den p277 behandelten Mäusen und den Vergleichsmäusen reaktiv sind erzeugt wurden. Gruppen von 10 NOD Mäusen, 3 Monate alt, wurden mit p277 in Öl oder mit PBS in Öl (siehe Beispiel 1) geprüft. Drei Wochen später wurde die Milz der Mäuse entfernt und die Milzzellen wurden gepoolt. Die Milzzellen wurden dreifach mit Con A, p277 oder MT-p278 über 24h (zur IL-2 und IL-4-Absonderung) oder über 48h (für IL-10 und IFNγ Absonderung inkubiert). Das Vorhandensein der Cytokine auf der Oberfläche der Kultur wurde durch ELISA quantifiziert unter Verwendung von Pharmingen-gepaarten Antikörpern entsprechend dem Pharmingen-Cytokin-ELISA-Protokoll. Pharmingen-rekombinante Mäusecytokine wurden als Standard für die Eichkurven verwendet. Flachbodige 96-well Mikrotiter-Platten wurden mit Ratten-Anti-Maus-Cytokin mAbs über 18h bei 4°C beschichtet und die supernatanten oder rekombinanten der kultivierten Mäusecytokine wurden für 18h bei 4°C zugegeben. Die Platten wurden abgewaschen und biotinylisiertes Ratten-Anti-Maus-Cytokin mAbs wurde über 45 min bei Raumtemperatur zugegeben, dann gründlich gewaschen und Avidin-Alkalin-Phosphatase wurde 30 min zugegeben. Die Platten wurden gewaschen, ein Chromogensubstrat wurde zugegeben und Beispiele wurden bei 405 nm in einem ELISA-Laser gelesen. Die Konzentrationen der Cytokine sind als mittlere Einheiten/ml abgeleitet von Kalibrationskurven unter Verwendung rekombinanter Cytokine als Standards gezeigt. Die Ergebnisse sind in den 4A-4D gezeigt.
4A und 4B zeigen, dass die Milzzellen der Vergleichsmäuse sowohl IL-2 und IFNγ bei Inkubation entweder mit p277, MT-p278 oder dem T-Zellen Mitogen Con A sekretierten. Im Gegensatz dazuerzeugten die p277 behandelten Mäuse signifikant weniger (p<0,01) Il-2 und IFNγ in Antwort auf eine Inkubation mit Peptid p277. Diese Reduktion der TH1-Cytokine war spezifisch, die p277 behandelten Mäuse behielten ihre IL-2 und ihre TNFγ Cytokinantwort auf MT-p278 bei. 4C und 4D zeigen die Mengen von IL-10 und IL-4, die in den Milzzellen der Maus erzeugt wurden. Die Vergleichsmäuse erzeugten sehr wenig Il-4 in Antwort auf p277, MT-p278 oder Con A und nur eine kleine Menge an Il-10 in Antwort auf p277. Dagegen war eine signifikante Erhöhung in Il-10 und Il-4 in Antwort nur auf p277 und nur in den p277 behandelten Mäusen (p<0,01). Eine Zunahme in IL-2 und IFNγ gekoppelt mit einer Erhöhung in Il-l0 und IL-4 bestätigt die Verschiebung von TH1-artigem Verhalten zu einem TH2-artigem Verhalten. Eine solche Verschiebung könnte sowohl den Abfall an TH-Zellen-Proliferation auf p277 und das Auftreten von IgG1 und IgG2b Antikörpern auf p277 erklären. Der nützliche Effekt von einer p277-Peptidbehandlung wird daher nicht durch die Inaktivierung der autoimmunen Antwort verursacht, sondern durch Aktivieren der Autoimmunität in verschiedener Cytokinmoden des Verhaltens (Cohen, 1995, Liblau et al., 1995)
BEISPIEL 5
Peptid-Therapie der Typ I Diabetes unter Verwendung von p277 in Lipidemulsionen
Weibliche NOD-Mäuse wurden mit 100 μg Peptid p277 pro Maus subkutan in 0,1 ml von:

(i) Phosphatgepuffertem Salin (PBS); und
(ii) einer 10%igen Lipidemulsion bestehend aus 10% Sojabohnenöl, 1,2% Eiphospholipiden und 2,25% Glycerol (Intralipid, Kabi Pharmacia AB, Schweden) behandelt.

Das Auftreten von Diabetes in dem Alter von 9 Monaten und die Produktion von Anti-p277 Antikörpern war die Folge. Diabetes wurde als persistente Hyperglykämie diagnostiziert, Blutglucosewerte über 200 mg/dl wurden wenigstens zweimal in wöchentlichen Abständen mit einem Beckmann Glucoseanalysator II gemessen. Eine erfolgreiche Peptidbehandlung wurde durch die Beibehaltung einer normalen Blutglucosekonzentration (weniger als 200 mg/dl), der Remission einer Intra-Inselentzündung der Bauchspeicheldrüseninseln (Insulins) und der Induktion von Antikörpern zu den therapeutischen Peptiden als ein Indikator der Immunantwort vom TH2-Typ geprüft. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Aus der Tabelle 1 ergibt sich, dass die Behandlung mit p277, gegeben in Intralipid, bei der Reduzierung des Auftretens von Diabetes und des Eintritts des Todes wirksam war Dagegen war eine Behandlung gegeben in PBS unwirksam.
BEISPIEL 6
Peptide 277/Intralipid-Therapie induziert eine spezifisches Umschalten in dem Cytokinprofil
Um zu bestätigen, dass ein TH1 → TH2-Cytokineumschalten mit p277 auftritt bei einer Verwendung von Intralipid als ein Adjuvant, wurden die Cykline, die durch die auf p277 reaktiven T-Zellen erzeugt wurden, in dem p277/Intralipid behandelt und Vergleichsmäuse wurden geprüft. Concanavalin von 10 NOD Mäusen, 3 Monate alt, wurden mit p27 in Intralipid oder mit PBS in Intralipid behandelt (siehe Beispiel 1).
Fünf Wochen später wurde die Milz der Mäuse entfernt und die Milzzellen wurden gepoolt. Die Milzzellen wurden mit Con A, p277 oder MT-p278 über 24h (zur IL-2 und IL-4-Absonderung) oder über 48h (für IL-10 und IFNγ Absonderung inkubier). Das Vorhandensein der Cytokine auf der Oberfläche der Kultur wurde durch ELISA quantifiziert unter Verwendung von Pharmingen-gepaarten Antikörpern entsprechend dein Pharmingen-Cytokin-ELISA-Protokoll. Pharmingen-rekombinante Mäusecytokine wurden als Standard für die Eichkurven verwendet. Flachbodige 96-well Mikrotiter-Platten wurden mit Ratten-Anti-Maus-Cytokin mAbs über 18h bei 4°C beschichtet und die supernatanten oder rekombinanten der kultivierten Mäusecytokine wurden für 18h bei 4°C zugegeben. Die Platten wurden abgewaschen und biotinylisiertes Ratten-Anti-Maus-Cytokin mAbs wurde über 45 min bei Raumtemperatur zugegeben, dann gründlich gewaschen und Avidin-Alkalin-Phosphatase wurde 30 min zugegeben. Die Platten wurden gewaschen, ein Chromogensubstrat wurde zugegeben und Beispiele wurden bei 405 nm in einem ELISA-Leser gelesen. Die Ergebnisse sind in den 5A–5B gezeigt.
5A zeigt, dass die Milzzellen der Vergleichsmäuse sowohl IL-2 und IFNγ bei Inkubation entweder mit p277, MT-p278 oder dem T-Zellen Mitogen Con A sekretierten. Im Gegensatz dazu erzeugten die p277 behandelten Mäuse signifikant weniger (p<0,01) Il-2 und IFNγ in Antwort auf eine Inkubation mit Peptid p277. Diese Reduktion der TH1-Cytokine war spezifisch, die p277 behandelten Mäuse behielten ihre IL-2 und ihre TNFγ Cytokinantwort auf Con A ( 5B). 5A und 5B zeigen die Mengen von IL-10 und IL-4, die in den Milzzellen der Maus erzeugt wurden. Die Vergleichsmäuse erzeugten sehr wenig Il-4 in Antwort auf p277, MT-p278 oder Con A. Dagegen war eine signifikante Erhöhung in Il-10 und Il-4 in Antwort nur auf p277 und nur in den p277 behandelten Mäusen (p<0,01). Eine Zunahme in IL-2 und IFNγ gekoppelt mit einer Erhöhung in IL-10 und IL-4 bestätigt die Verschiebung von TH1-artigem Verhalten zu einem TH2-artigem Verhalten.
LITERATURVERZEICHNIS
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24. Weiner, N. L. et al. Annu. Rev. Immunol. 12, 809–837 (1994).
25 Cohen, I. R. Immunol. Today, 13, 490–494 (1992).
SEQUENZLISTING
(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN
(i) ANMELDER

(A) NAME: YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT CO. LTD.
(B) STRASSE: P.O. Box 95
(C) STADT: Rehovot
(E) LAND: Israel
(F) POSTLEITZAHL (ZIP): 76100
(G) TELEFON: 01 1-972-8-470617
(H) TELEFAX: 01 1-972-8-40739
(A) NAME: Irun COHEN
(B) STRASSE: 11 Hankin Street
(C) STADT: Rehovot
(E) LAND: Israel
(F) POSTLEITZAHL. (ZIP) 76354
(A) NAME: Dana ELIAS
(B) STRASSE: 57 Derech Yavna
(C) STADT: Rehovot
(E) LAND: Israel
(F) POSTLEITZAHL (ZIP) 78344

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN

(A) LENGTH. 20 Aminosäuren
(B) TYPE: Aminosäuren
(C) STRANDEDNESS: einzel
(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Peptide
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:

(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANG: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) MOLEKÜLART: Peptide
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:

(A) LÄNGE: 24 Amonosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANG: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) MOLEKÜLTYP: Peptide
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3

Claims

Verfahren zum Nachweis oder zur Überwachung der Wirksamkeit einer Behandlung von einer T-Zellenvermittelten Krankheit bei dem eine Verschiebung von einer TH1-Zellenantwort vor der Behandlung zu einer TH2-Zellenantwort nach der Behandlung nachgewiesen wird, wobei mit einem Vakzin behandelt wird, das ein Peptid des hsp60-Autoantigens in einem tolerogenen Träger umfasst und der Nachweisschritt folgendes aufweist: Messen der Eigenschaft der T-Zellenantwort von T-Zellen in einer Probe von dem Tier, das behandelt werden soll vor der Behandlung; Messen der Eigenschaft der T-Zellenantwort auf das Autoantigen nach der Behandlung und Bestimmen, ob eine Verschiebung von einer TH1-T-Zellenantwort vor der Behandlung zu einer TH1-7-Zellenantwort nach der Behandlung erfolgt ist, wobei das positive Auffinden dieser Verschiebung die Wahrscheinlichkeit einer effektiven Behandlung anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Krankheit Insulin abhängigem Diabetes mellitus (DDM) ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das Autoantigen p277 oder Varianten davon darstellt.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin das Autoantigen demjenigen entspricht, das in SEQ ID Nr. 3 beschrieben ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Stufe, bei der die Eigenschaft der T-Zellenantwort gemessen wird, das Aufsuchen des Isotyps der Antikörper, die hergestellt werden, umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Stufe, bei der die Natur der T-Zellenantwort bestimmt wird, das Messen der Cytokinantwort auf die in vito Inkubation der T-Zellen mit dem Antigen umfasst.