DE19604858A1 - Verwendung von Interferon-gamma (IFN-gamma) zur Herstellung einer pharmazeutischen Präparation zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Erkrankungen, die mit einer Überexpression von Amyloid-Vorläuferprotein einhergehen - Google Patents

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Interferon­ gamma (IFN-γ) zur Herstellung von pharmazeutischen Präparationen oder Arzneimitteln zur Prophylaxe und/oder therapeutischen Behandlung von Erkrankungen, die durch eine Überexpression von Amyloid-Vorläuferprotein (APP) oder durch das Auftreten von Metaboliten oder Derivaten davon einhergehen oder durch sie bedingt oder verursacht werden.

Das APP Gen ist auf Chromosom 21 lokalisiert ist und es wird als transmembranes Protein in Zellen des Gehirns (neuronale Zellen) und anderen Geweben, beispielsweise in thyroidalen Zellen, exprimiert. Eine direkte Korrelation zwischen einer Überexpression von APP und der Bildung von Metaboliten und Derivaten davon und der Entstehung von Dysfunktionen des zentralen Nervensystems (ZNS), beispielsweise bei der Alzheimerschen Erkrankung und bei Patienten mit Trisomie 21 (Morbus Down) ist beschrieben, beispielsweise von Hsiao, K. K. et al., Neuron 15: 1203-1218, 1995. Derartige mit einer Dementia einhergehende Erkrankungen des ZNS sind beim Menschen weit verbreitet und sind bis heute nicht heilbar oder wirkungsvoll linderbar (Mohr, E., Can. J. Neurol. Sci. 22: 62-71, 1995).

Das Amyloid-Vorläuferprotein bzw. "amyloid precursor protein" (APP) ist ein 140-kDa Transmembranglykoprotein, welches eine Schlüsselrolle bei der Pathogenese verschiedener mit Dementia einhergehender Erkrankungen des Gehirns, beispielsweise der Alzheimerschen Erkrankung (Salkoe, D., Ann. Rev. Cell. Biol. 10: 373-403, 1994), oder bei anderen Formen der Dementia, beispielsweise beim Down-Syndrom (Trisomie 21), spielt. Die metabolische Spaltung nahe dem C-Terminus von APP führt zur Bildung von Fragmenten, welche das Amyloid-β-Peptid (Aβ) enthalten. Dieses Peptid, welches in seiner löslichen Form in vielen Körperflüssigkeiten einschließlich dem Blut und der cerebrospinalen Flüssigkeit zu finden ist (Seubert P., et al., Nature 359: 325- 327, 1992), kann aggregieren und den Kern der charakteristischen "senilen Plaques" im Gehirn von entsprechenden Patienten, beispielsweise solchen mit Alzheimerscher Erkrankung (Masters, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 4245- 4249, 1985), bilden.

Es wurde vorgeschlagen, durch medikamentöse Maßnahmen die Akkumulierung und Wirkung des APP bzw. von β-Amyloidpeptid zu kontrollieren bzw. die β- Peptidsythese zu inhibieren und damit Neuronen vor amyloid-induzierter Toxizität zu schützen. Ein anderer Vorschlag betrifft die Inhibierung des β- Secretase Biosynthesewegs, wobei nicht näher bezeichnete Verbindungen als Inhibitoren vorliegen sollen (Schehr, R. S., Bio/Technology 12: 140-144,1994). In der Publikation von Giacobini, E., Molec. Neurobiol. 9: 115-118, 1994, wird vorgeschlagen, den Cholinesteraseinhibitor Tetrahydroaminoacridin zu verwenden um die Bildung von APP und Fragmenten davon zu herabzusetzen. Nachteilig ist jedoch, daß Acridine hochmutagene Verbindungen sind und toxisch wirken.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, Mittel bereitzustellen, die eine therapeutische oder prophylaktische Behandlung von durch eine Überexpression von APP bedingten Erkrankungen ermöglichen, keine toxischen Wirkungen besitzen und über einen längeren Zeitraum ohne Nachteile für den betreffenden Patienten verwendet werden können.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß aus der Vielzahl der bekannten Cytokine das Interferon-gamma (IFN-γ) identifiziert werden konnte, welches wirkungsvoll die Bildung von APP und dessen Metabolite verhindert oder vermindert.

Gelöst wurde die Aufgabe der vorliegenden Erfindung demzufolge dadurch, daß pharmazeutische Mittel bereitgestellt werden, welche IFN-γ als Wirkstoff enthalten und welche eine Bildung von APP und dessen Metaboliten in den betreffenden Zellen unterdrücken oder vermindern. Als ganz bevorzugte Mittel gelten solche, die als Wirkstoff human IFN-γ, insbesondere über rekombinantem Weg hergestelltes human IFN-γ enthalten.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher pharmazeutische Präparationen zur Prophylaxe und/oder Therapie von durch APP verursachte Erkrankungen gemäß Patentanspruch 1, die als Wirkstoff IFN-γ enthalten, gegebenenfalls zusätzlich mit den bekannten Hilfs- und Trägerstoffen.

Insbesondere richtet sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung von derartigen Präparationen und Arzneimitteln, zur Prophylaxe und Behandlung der Dementia beim Menschen. Ein ganz besonderer Aspekt der vorliegenden Erfindung liegt in der Prophylaxe und/oder therapeutischen Behandlung der Alzheimerschen Erkrankung oder bei Trisomie 21. Ganz bevorzugt ist die Verwendung von human IFN-γ für die genannten Zwecke, insbesondere von rekombiantem human IFN-γ.

Umfaßt werden aber auch Kombinationspräparationen, die als Wirkstoffe IFN-γ und mindestens einen weiteren Wirkstoff, welcher eine Verhinderung oder Verminderung der Bildung von APP oder Metaboliten und Derivaten davon fördert oder verursacht, enthalten.

Um überzeugende Daten hinsichtlich der Wirksamkeit von Stoffen zu erhalten, die den APP Metabolismus beeinflussen und auch einen möglichen positiven Effekt bei der APP abhängigen Dementia, beispielsweise der Alzheimerschen Erkrankung, aufzeigen, wurden in vitro Versuche an Zellen unternommen, die APP produzieren und prozessieren. Als Kandidaten solcher Zellen kommen beispielsweise thyroidale Zellen oder neuronale Zellen in Frage. In dem vorliegenden Fall wurden als Beispiel menschliche thyroidale Zellen ausgewählt, da das entsprechende Gewebe ohne weiteres und ohne Komplikationen chirurgisch vom lebenden Menschen in ausreichender Menge entnommen werden kann.

Es konnte nun gezeigt werden, daß kultivierte thyroidale Epithelzellen (TEC) große Mengen an APP produzieren. Zusätzlich zu den bekannten metabolischen Derivaten, wie den sekretierten APPs (130 kDa) und einem korrespondierenden nicht-amyloidogenen C-terminalen Fragment von ungefähr 10 kDa, wurde ein 41 kDa APP Metabolit in der Mehrzahl von Thyroidproben gefunden. Dieses Fragment war potentiell amyloidogen, da es sowohl mit verschiedenen C- terminalen APP Antikörpern als auch mit einem für das Amyloid β spezifischen monoklonalen Antikörper reagierte. Thyroide Zellen scheinen somit beide Wege für das Prozessieren von APP zu besitzen: sowohl den nicht-amyloidogenen sekretorischen Weg als auch den amyloidigenen endosomal/lysosomalen Weg. Diese Eigenschaft macht thyroide Zellen als Modell geeignet, die Regulation der APP Produktion und des APP Metabolismus zu untersuchen. Es konnte auch gezeigt werden, daß APP durch eine Thyroid-Rattenzellinie produziert wird (Graebert, K. et al., Eur. J. Cell Biol. 66: 39-46, 1995).

Es wurden nun Versuche unternommen, um den Einfluß von verschiedenen Cytokinen auf solche Zellen zu untersuchen, die APP produzieren. Als ein Beispiel wurden thyroidale Zellen ausgewählt. Es konnte festgestellt werden, daß eine Vielzahl an verschiedenen Cytokinen in der Schilddrüse vorkommen. Als Beispiele wurden von den Cytokinen das Interleukin-1β (IL-1β), welches charakteristischerweise von infiltrierenden Monocyten gebildet wird, das Interferon-γ (IFN-γ), welches ein Hauptprodukt der T-Zellen ist und der Transforming Growth Factor β (TGFβ), ein durch thyroide Zellen konstitutiv sekretiertes Cytokin, ausgewählt.

IL-1β ist ein beschriebenes Cytokin und kann nach bekannten Methoden hergestellt werden. Beispielsweise nach March C. J. et al., Nature 315, 641 -, 1985 oder nach WO 92/13885.

Dem Fachmann ist IFN-γ aus der vielfältigen Literatur gut bekannt. Die Herstellung von IFN-γ kann beispielsweise gemäß der in den Publikation von Gray W. P. et al., Nature 295: 503-508, 1982, beschriebenen Verfahren hergestellt werden oder gemäß EP-S 0 077 670. Als weitere Bezugsquelle von IFN-γ kommt beispielsweise Bender+Co, Wien, Österreich, in Betracht. Umfaßt werden aber auch die bekannten Derivate, Allele und Analoga von IFN-γ, welche die bekannten funktionellen biologischen Eigenschaften von IFN-γ aufweisen, beispielsweise gemäß EP-A 0 161 504. Demzufolge kommen auch solche Polypeptide in Frage, die eine biologische Aktivität des IFN-γ-Typs aufweisen.

Auch das Cytokin TGFβ ist dem Fachmann aus der Literatur bekannt und es kann beispielsweise nach den in EP-A-0 200341, EP-A-0 268561 oder WO 89/12101 beschriebenen Verfahren hergestellt werden oder es kann kommerziell erhalten werden, beispielsweise von Calbiochem, Luzern, Schweiz.

Überraschenderweise konnte mit einem bestimmten Cytokin, dem IFN-γ, gezeigt werden, daß dieses die Bildung und den Metabolismus von APP in Zellen mit APP Expression und APP Metabolismus, insbesondere in neuronalen und extraneuronalen Zellen, stark beeinflußt.

Betreffend IFN-γ wurde nun gefunden, daß dieses Cytokin einen starken inhibitorischen Effekt für APP in kultivierten thyroidalen Zellen zeigte, da es sowohl den Anteil des vollständig glykosylierten maturen als auch des partiell glykosylierten immaturen zellulären Holoproteins dosisabhängig reduzierte (Fig. 1). IFN-γ beeinflußte auch die Bildung von APP Metaboliten. Es reduzierte die Menge an C-terminal verkürzten sekretierten APPs und verminderte die Bildung eines 41-kDa Metaboliten, von dem erkannt wurde, daß er thyroid­ spezifisch ist und von den gezeigt werden konnte, daß er die Amyloid-β Sequenz enthält (Fig. 1, untere Abbildung). IFN-γ übte seine inhibitorische Wirkung ab einer Konzentration von 30 U/ml aus (Fig. 1) und der Effekt trat 72 Stunden nach Gabe von IFN-γ ein. Ausschlußanfärbung mit Trypanblau zeigte, daß IFN-γ bei den verwendeten Konzentrationen nicht cytotoxisch war.

Zellanzahl und Gesamtprotein Konzentrationen waren vor und nach der IFN-γ Behandlung identisch.

Die Behandlung mit IL-1β bei einer Konzentration von 40 U/ml ergab eine deutlich erhöhte Produktion des amyloidogenen 41 kDa C-terminalen Fragments von APP (Tabelle 1). Dieser Effekt war nach 1 Stunde maximal. Auch niedrigere II-1β Konzentrationen zeigten noch eine signifikante Bildung des 41 kDa Metaboliten.

Die Inkubation von thyroidalen epithelialen Zellen mit TGFβ in Konzentrationen von 1 und 10 ng/ml für 72 Stunden bei 37°C (RPMI, supplementiert mit 5% fetalem Kälberserum) zeigte ebenfalls, wenn auch einen geringeren inhibitorischen Effekt auf den APP Metabolismus. APPs und der 41 kDa Metabolit erniedrigte sich bis zu 20%. In der folgenden Tabelle 1 werden die Veränderungen bei der Bildung von APP und seiner Metaboliten in Thyroidzellen bei der Behandlung mit IFN-γ, IL-1β und TGFβ gezeigt. Die dargestellten Ergebnisse zeigen die Wirkung jedes der Cytokine zum Zeitpunkt und bei der Dosis ihrer maximalen Effekte. Die Werte wurden mittels densitometrischen Scanning der Western Blots erhalten und repräsentieren die relativen prozentualen Veränderungen im Vergleich zu nicht-behandelten Kontrollen (x± SEM, n=5, p vs Kontrolle, ** p<0.01, *p<0.05).

Tabelle 1

Anhand der erhaltenen Ergebnisse konnte überraschenderweise nachgewiesen werden, daß ein bestimmtes Cytokin die Produktion und den Metabolismus von APP regulieren konnte. Am Beispiel der thyroidalen Zellen wurde gezeigt, daß IFN-γ einen starken inhibitorischen Einfluß auf alle untersuchten Parameter besitzt, wohingegen IL-β selektiv den amyloidogenen Wegs des APP Abbaus stimulierte. Die Stimulierung der Synthese von amyloidogenen APP Metaboliten in thyroidalen epithelialen Zellen könnte daher von pathologischer Bedeutung sein. Ein zellzerstörender Effekt durch amyloidogene APP Metaboliten, wie er in neuronalen Zellen nachgewiesen werden konnte (Yanker B. A. et al., Science Z45: 417-420, 1989), erscheint daher wahrscheinlich.

Legenden:
Fig. 1: Inhibierung der APP Synthese und des Metabolismus. Thyroidale epitheliale Zellen wurden mit Konzentrationen von 0 (Bahn 1), 30 (Bahn 2), 300 (Bahn 3) und 3000 (Bahn 4) U/ml rekombinantes human IFN-γ für 72 Stunden bei 37°C in RPMI wie beschrieben kultiviert. Zelluläre Extrakte wurden durch Western Blotting analysiert wie in den Beispielen beschrieben. Die APP Banden wurden mit dem monoklonalen Antikörper 22C11 (A) und C8 Antiserum (B) dedektiert. Eine Bande von 145 kDa repräsentiert das mature Holoprotein, wohingegen eine Doppelbande bei 117/115 kDa mit dem immaturen APP korrespondiert. Eine 41 kDa Bande (B) repräsentiert ein thyroid-spezifisches amyloidogenes Abbauprodukt von APP.

Die vorliegende Erfindung offenbart daher in überraschender Weise und erstmalig, daß INF-γ als ein erstes Cytokin identifiziert werden konnte, welches die Bildung von APP und seiner amyloidogenen Metaboliten effektiv supprimiert. Da die Ablagerung dieser Stoffe im Gehirnzellen, insbesondere in neuronalen Zellen, als kausaler Auslöser der Alzheimer Erkrankung bzw. der Alzheimer Demenz betrachtet werden muß, wird erfindungsgemäß ein therapeutisches und prognostisches Mittel zur Behandlung dieser Erkrankung beim Menschen bereitgestellt.

Arzneimittel bzw. pharmazeutische Präparationen oder Zubereitungsformen mit Wirkstoff IFN-γ sind für andere Indikationen als die in der vorliegenden Beschreibung genannten bekannt und können ohne weiteres für die erfindungsgemäße Verwendung in analoger Weise angewandt werden. Die Dosis richtet sich üblicherweise nach der Schwere und Art des Krankheitsbildes und der Ansprechrate der verabreichten pharmazeutischen Präparation beim Patienten. Allgemein kann von einer Dosierung zwischen 0.01 und 3-5 × 10⁷ U/mg (spezifische Aktivität) ausgegangen werden bzw. von einer zu verabfolgenden Menge an Wirkstoff, beispielsweise von rekombinantem IFN-γ, zwischen 1 bis 200 µg, vorzugsweise zwischen 10 bis 100 µg, bezogen auf m² Körperoberfläche, wobei 100 µg mit 3 × 10⁶ IU (internationale Einheiten) gleichgesetzt werden kann. Gebrauchsfertige Anwendungsformen kommen beispielsweise in Analogie zu Imufor®Gamma Immuninterferon, Thomae, in Betracht. Die Applikation kann als Einmalgabe oder als Mehrfachgabe, einmal oder mehrmals pro Tag, über Stunden, Tage, Wochen oder Monate gegeben werden, wobei die Mehrfachgabe bzw. Langzeittherapie bevorzugt ist. Die Dauer der Behandlung ist abhängig von dem speziellen Krankheitsbild und dem Grad oder Stadium der Erkrankung sowie dem Allgemeinzustand des Patienten. Demzufolge liegt die Dauer der Behandlung, wie auch die Dosis, im Ermessen des Fachmanns, insbesondere des mit der betreffenden Indikation vertrauten und erfahrenen Arztes.

Als Hilfsstoffe kommen die üblicherweise verwendeten Stoffe in Betracht, beispielsweise Kohlenhydrate (z. B. Mannitol), inerte Proteine, Wasser für Injektionszwecke, Polyalkohole (z. B. Polysorbat 20).

Als Applikation kommen alle bekannten parenteralen Routen in Fragen, insbesondere die systemische Applikation, beispielsweise die intravenöse, intraarterielle, subcutane, intramuskuläre, peritoneale Gabe, beispielsweise über Injektion mittels einer Spritze oder Perfusion mittels eines Katheters, aber auch die lokale Applikation, beispielsweise die intrathekale Verabreichung, kommt in Betracht. Die systemische Applikation wird jedoch als die bevorzugte Verabreichungsart betrachtet, da es gilt, die Entstehung der in den Körperzellen gebildeten APPs oder Metaboliten und Derivate gemäß der Erfindung zu beeinflussen.

Ein erfindungsgemäße prophylaktische oder therapeutische Behandlung kann vorteilhaft auch mit anderen Therapieformen bzw. Präparationen oder Wirkstoffen kombiniert werden, insbesondere solchen, die eine Verhinderung oder Hemmung der Bildung von APP oder Metaboliten und Derivaten davon fördern oder verursachen. Insbesondere kommen in Betracht proteolytische Enzyme, beispielsweise Inhibitoren der β- und γ-Sekretasen oder Wirkstoffe, die die Bildung von Aβ inhibieren oder herabsetzen, beispielsweise wie sie in Schenk, D.B. et al. J. Med. Chem. 38(21): 4141-4154, 1995, beschrieben sind.

Bei einer solchen Kombinationstherapie können die einzelnen Wirkstoffe gleichzeitig oder sequentiell über die jeweils geeignete Route, vorzugsweise systemisch (beispielsweise i.v., i.a., i.m.), aber auch lokal (beispielsweise intrathekal), appliziert werden.

Demzufolge werden auch Kombinationspräparationen für die erfindungsgemäße prophylaktische oder therapeutische Behandlung mitumfaßt, welche IFN-γ in Kombination mit mindestens einem weiteren Wirkstoff, welcher eine Verhinderung oder Verminderung der Bildung von APP oder Metaboliten und Derivaten davon fördert oder verursacht, enthalten.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern. Betreffend die Unterschiede bei den erhaltenen Ergebnissen wurden für alle Signifikanzbestimmungen der t-Test für gepaarte Mittelwerte angewendet.

Beispiel 1 Gewinnung von Gewebeproben

Thyroidgewebe wurde dadurch gewonnen, daß bei 25 Patienten (15 weibliche, 10 männliche Personen im Alter zwischen 28 und 69 Jahren) mit multimodularem nicht-toxischem Kropf eine Thyroidectomy durchgeführt wurde. Vor dem chirurgischen Eingriff waren die Patienten unbehandelt und wiesen eine normale Thyroidhormon Konzentration auf. Die APP Produktion war in den Kröpfen identisch mit solchen von normalem thyroiden Gewebe.

Beispiel 2 Zellreinigung und Kultivierung der Zellen

Thyroidale epitheliale Zellen (TEC) wurden nach dem Verfahren von Schmitt, T. L. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 80(12): 3513-3519, 1995, gereinigt. Zu diesem Zweck wurden die Gewebeproben in 1-2-mm³ Stücke geschnitten und mit 5 mg/ml Collagenase (Typ IV, Sigma, Deisendorf, Deutschland) in RPMI 1640 Medium, enthaltend 10% fetales Kälberserum und 1% Penicillin/Streptomycin, bei 37°C für 3 Stunden dispergiert. Alle Reagenzien für die Zellkulturen waren von GIBCO (Paisley, UK). Die erhaltene Zellsuspension wurde durch ein Nylonnetz mit 200-µm Maschen filtriert. Die roten Blutzellen wurden mit einem Ammoniumchlorid-Puffer (0.82% NH₄Cl und 0.1% KHCO₃) lysiert. Die verbliebenen Zellen wurden gewaschen und in RPMI 1640, supplementiert mit 10% fetalem Kälberserum und 1% P/S, in 75-cm² Kulturflaschen (Costar, Cambridge, MA, USA) bei 37°C in 5% CO₂ und 95% Feuchtigkeit für 24 Stunden inkubiert. Nicht-adhärente Zellen wurden anschließend durch gründliches Waschen mit Medium entfernt. Die erhaltene adhärente Zellpopulation bestand aus <95% TEC. 1 × 10⁶ Zellen davon wurden in 75 cm² Gewebekulturflaschen in RPMI-Medium mit 5% fetalem Kälberserum ausgebracht und mit folgenden Cytokinkonzentrationen stimuliert: 30, 300 und 3000 U/ml rekombinantes IFNγ (Bender+Co, Wien, Österreich), 10 und 40 U/ml rekombinantes IL-2 (Innogenetics, Antwerpen, Belgien) und 1 und 10 ng/ml natürliches TGFβ (Calbiochem, Luzern, Schweiz). TGFβ wurde in serumfreiem RPMI hinzugefügt, die anderen Cytokine in mit 5% fetalem Kälberserum supplementierten RPMI. Die Zellen wurden danach für 1, 4 oder 72 Stunden inkubiert (37°C), um die Kurz- und Langzeiteffekte zu untersuchen. Nach der jeweiligen Inkubation wurden die TEC geerntet, gezählt und wie oben angegeben in 0.82% NH₄Cl und 0.1% KHCO₃ lysiert.

Beispiel 3 Antikörper

Für Immunblotting-Experimente wurde der monoklonale Antikörper (mAB) 22C11 (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland), welcher spezifisch ist für ein Epitop am N-Terminus von APP, in einer Konzentration von 3 µg/ml und ein Antiserum, welches spezifisch ist für den C-Terminus von APP, verwendet. In dem hier vorliegenden Fall wurde das Antiserum C8 verwendet, welches von Brigham and Woman′s Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, USA, erhalten wurde. Dieses Aniserum erkennt spezifisch den C-Terminus von APP, nämlich die C-terminalen Positionen 732-751 (Podlinsky, M. B. et al., Am. J. Pathol. 138(6):1423-1435, 1991), insbesondere die Aminosäuresequenz K M Q Q N G Y E N P T Y K F F E Q M Q N (Ponte, P. et al. Nature 331: 525-527, 1988). Es reagiert typischerweise mit dem 41-kDa APP Fragment thyroidaler epithelialer Zellen. Dieses Fragment enthält die Amyloid β Sequenz, da diese auch mit dem von Kim, K. et al. Neurosci. Res. Commun. 2 : 121-130, 1988, beschriebenen monoklonalen Antikörpern reagiert, welche spezifisch β-Amyloid erkennen. Aber auch andere derartig für den C-Terminus von APP spezifische Antiseren können für diesen Zweck ohne weiteres verwendet werden. Zum Zwecke des Immunblottings wurde das Antiserum in einer Verdünnung 1/1000 verwendet.

Beispiel 4 Gelelektrophorese und Immunoblotting

Die Gelektrophorese und das Immunoblotting wurden im wesentlichen nach der Methode von Schmitt, T. L. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 80(12): 3513- 3519, 1995, durchgeführt. Hierzu wurden die Proteinextrakte in Natriumdodecylsulfat (SDS) Lysispuffer bis zum Kochen erhitzt. Danach wurden 70 µg Protein pro Tasche auf die Gele aufgetragen und ein konstanter Strom von 25 mA angelegt. Gele mit 8.5%, 10% oder 12.5% Polyacrylamid wurden, abhängig von den benutzen Antikörpern, für die Elektrophorese benutzt. Die Gele wurden über Nacht bei 95 mA auf 0.2-µm Nitrozellulosefilter (Schleicher und Schuell, Dassel, Deutschland) in einem Tris-Glycinpuffer, pH 8.3, enthaltend 20% (vol/vol) Methanol, geblottet. Die Nitrozellulosefilter wurden anschließend in 4% Milchpulver für 2 Stunden geblockt und mit den APP Antikörpern für 2 Stunden inkubiert. Für die Analyse der zellulären Proteine wurde auf jeder Gelbahn 30 µ zelluläres Protein aufgetragen. Die Volumina der auf den Gelen verwendeten Überstände wurden korrigiert hinsichtlich Zellzahl pro Kultur und lagen im Bereich zwischen 50 und 90 µl. Die Filter wurden gewaschen und mit Meerrettich Peroxidase-gekoppelten sekundären Antikörpern markiert und unter Verwendung einer Chemolumineszenz-Dedektionsystems gemäß den Anwendungsempfehlungen des Herstellers (ECL System, Amersham, Wien, Österreich) entwickelt. Die erhaltenen Banden wurden auf Röntgenfilm festgehalten und densitometrisch mittels des Scanpack Systems (Biometra, Göttingen, Deutschland) bestimmt. Cytokin behandelte Proben und unbehandelte Kontrollen wurden immer auf dem selben Blot verglichen. Um gleiche Proteinauftragungen sicherzustellen, wurden die Filter anschließend mit Amidoschwarz oder Indiafarbstoff gefärbt.

Fig. 1 zeigt das Ergebnis eines solchen Westernblottings, wodurch die inhibitorische Wirkung von IFNγ illustriert wird.

Claims (8)

1. Verwendung eines Polypeptides mit der biologischen Aktivität des Interferon-gamma (IFN-γ)-Typs zur Herstellung einer pharmazeutischen Präparation zur Prophylaxe und/oder therapeutischen Behandlung von durch Amyloid-Vorläuferprotein (APP) oder durch Metaboliten oder Derivaten davon verursachte Erkrankungen des Gehirns.

2. Verwendung eines Polypeptides gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid Interferon-gamma (IFN-γ) ist.

3. Verwendung eines Polypeptides gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das IFN-γ humanes IFN-γ ist.

4. Verwendung eines Polypeptides gemäß Ansprüchen 1 bis 3 zur Herstellung einer pharmazeutischen Präparation zur Behandlung der Dementia.

5. Verwendung eines Polypeptides gemäß Ansprüchen 1 bis 3 zur Herstellung einer pharmazeutischen Präparation zur Behandlung der Alzheimerschen Erkrankung.

6. Verwendung eines Polypeptides gemäß Ansprüchen 1 bis 3 zur Herstellung einer pharmazeutischen Präparation zur Behandlung von Patienten mit Trisomie 21 (Morbus Down).

7. Verwendung eines Polypeptides gemäß Ansprüchen 1 bis 6 zur Herstellung einer pharmazeutischen Präparation, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Präparation zur parenteralen Applikation geeignet ist.

8. Verwendung eines Polypeptides gemäß Ansprüchen 1 bis 7 zur Herstellung einer pharmazeutischen Präparation in Kombination mit mindestens einem weiteren Wirkstoff, welcher eine Verhinderung oder Verminderung der Bildung von APP oder Metaboliten und Derivaten davon fördert oder verursacht.