DE19604858A1 - Verwendung von Interferon-gamma (IFN-gamma) zur Herstellung einer pharmazeutischen Präparation zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Erkrankungen, die mit einer Überexpression von Amyloid-Vorläuferprotein einhergehen - Google Patents
Verwendung von Interferon-gamma (IFN-gamma) zur Herstellung einer pharmazeutischen Präparation zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Erkrankungen, die mit einer Überexpression von Amyloid-Vorläuferprotein einhergehenInfo
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Description
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Interferon
gamma (IFN-γ) zur Herstellung von pharmazeutischen Präparationen oder
Arzneimitteln zur Prophylaxe und/oder therapeutischen Behandlung von
Erkrankungen, die durch eine Überexpression von Amyloid-Vorläuferprotein
(APP) oder durch das Auftreten von Metaboliten oder Derivaten davon
einhergehen oder durch sie bedingt oder verursacht werden.
Das APP Gen ist auf Chromosom 21 lokalisiert ist und es wird als
transmembranes Protein in Zellen des Gehirns (neuronale Zellen) und anderen
Geweben, beispielsweise in thyroidalen Zellen, exprimiert. Eine direkte
Korrelation zwischen einer Überexpression von APP und der Bildung von
Metaboliten und Derivaten davon und der Entstehung von Dysfunktionen des
zentralen Nervensystems (ZNS), beispielsweise bei der Alzheimerschen
Erkrankung und bei Patienten mit Trisomie 21 (Morbus Down) ist beschrieben,
beispielsweise von Hsiao, K. K. et al., Neuron 15: 1203-1218, 1995. Derartige
mit einer Dementia einhergehende Erkrankungen des ZNS sind beim Menschen
weit verbreitet und sind bis heute nicht heilbar oder wirkungsvoll linderbar
(Mohr, E., Can. J. Neurol. Sci. 22: 62-71, 1995).
Das Amyloid-Vorläuferprotein bzw. "amyloid precursor protein" (APP) ist ein
140-kDa Transmembranglykoprotein, welches eine Schlüsselrolle bei der
Pathogenese verschiedener mit Dementia einhergehender Erkrankungen des
Gehirns, beispielsweise der Alzheimerschen Erkrankung (Salkoe, D., Ann. Rev.
Cell. Biol. 10: 373-403, 1994), oder bei anderen Formen der Dementia,
beispielsweise beim Down-Syndrom (Trisomie 21), spielt. Die metabolische
Spaltung nahe dem C-Terminus von APP führt zur Bildung von Fragmenten,
welche das Amyloid-β-Peptid (Aβ) enthalten. Dieses Peptid, welches in seiner
löslichen Form in vielen Körperflüssigkeiten einschließlich dem Blut und der
cerebrospinalen Flüssigkeit zu finden ist (Seubert P., et al., Nature 359: 325-
327, 1992), kann aggregieren und den Kern der charakteristischen "senilen
Plaques" im Gehirn von entsprechenden Patienten, beispielsweise solchen mit
Alzheimerscher Erkrankung (Masters, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 4245-
4249, 1985), bilden.
Es wurde vorgeschlagen, durch medikamentöse Maßnahmen die Akkumulierung
und Wirkung des APP bzw. von β-Amyloidpeptid zu kontrollieren bzw. die β-
Peptidsythese zu inhibieren und damit Neuronen vor amyloid-induzierter
Toxizität zu schützen. Ein anderer Vorschlag betrifft die Inhibierung des β-
Secretase Biosynthesewegs, wobei nicht näher bezeichnete Verbindungen als
Inhibitoren vorliegen sollen (Schehr, R. S., Bio/Technology 12: 140-144,1994).
In der Publikation von Giacobini, E., Molec. Neurobiol. 9: 115-118, 1994, wird
vorgeschlagen, den Cholinesteraseinhibitor Tetrahydroaminoacridin zu
verwenden um die Bildung von APP und Fragmenten davon zu herabzusetzen.
Nachteilig ist jedoch, daß Acridine hochmutagene Verbindungen sind und
toxisch wirken.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, Mittel bereitzustellen, die eine
therapeutische oder prophylaktische Behandlung von durch eine Überexpression
von APP bedingten Erkrankungen ermöglichen, keine toxischen Wirkungen
besitzen und über einen längeren Zeitraum ohne Nachteile für den betreffenden
Patienten verwendet werden können.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß aus der Vielzahl der bekannten
Cytokine das Interferon-gamma (IFN-γ) identifiziert werden konnte, welches
wirkungsvoll die Bildung von APP und dessen Metabolite verhindert oder
vermindert.
Gelöst wurde die Aufgabe der vorliegenden Erfindung demzufolge dadurch, daß
pharmazeutische Mittel bereitgestellt werden, welche IFN-γ als Wirkstoff
enthalten und welche eine Bildung von APP und dessen Metaboliten in den
betreffenden Zellen unterdrücken oder vermindern. Als ganz bevorzugte Mittel
gelten solche, die als Wirkstoff human IFN-γ, insbesondere über rekombinantem
Weg hergestelltes human IFN-γ enthalten.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher pharmazeutische
Präparationen zur Prophylaxe und/oder Therapie von durch APP verursachte
Erkrankungen gemäß Patentanspruch 1, die als Wirkstoff IFN-γ enthalten,
gegebenenfalls zusätzlich mit den bekannten Hilfs- und Trägerstoffen.
Insbesondere richtet sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung von
derartigen Präparationen und Arzneimitteln, zur Prophylaxe und Behandlung der
Dementia beim Menschen. Ein ganz besonderer Aspekt der vorliegenden
Erfindung liegt in der Prophylaxe und/oder therapeutischen Behandlung der
Alzheimerschen Erkrankung oder bei Trisomie 21. Ganz bevorzugt ist die
Verwendung von human IFN-γ für die genannten Zwecke, insbesondere von
rekombiantem human IFN-γ.
Umfaßt werden aber auch Kombinationspräparationen, die als Wirkstoffe IFN-γ
und mindestens einen weiteren Wirkstoff, welcher eine Verhinderung oder
Verminderung der Bildung von APP oder Metaboliten und Derivaten davon
fördert oder verursacht, enthalten.
Um überzeugende Daten hinsichtlich der Wirksamkeit von Stoffen zu erhalten,
die den APP Metabolismus beeinflussen und auch einen möglichen positiven
Effekt bei der APP abhängigen Dementia, beispielsweise der Alzheimerschen
Erkrankung, aufzeigen, wurden in vitro Versuche an Zellen unternommen, die
APP produzieren und prozessieren. Als Kandidaten solcher Zellen kommen
beispielsweise thyroidale Zellen oder neuronale Zellen in Frage. In dem
vorliegenden Fall wurden als Beispiel menschliche thyroidale Zellen ausgewählt,
da das entsprechende Gewebe ohne weiteres und ohne Komplikationen
chirurgisch vom lebenden Menschen in ausreichender Menge entnommen
werden kann.
Es konnte nun gezeigt werden, daß kultivierte thyroidale Epithelzellen (TEC)
große Mengen an APP produzieren. Zusätzlich zu den bekannten metabolischen
Derivaten, wie den sekretierten APPs (130 kDa) und einem korrespondierenden
nicht-amyloidogenen C-terminalen Fragment von ungefähr 10 kDa, wurde ein 41
kDa APP Metabolit in der Mehrzahl von Thyroidproben gefunden. Dieses
Fragment war potentiell amyloidogen, da es sowohl mit verschiedenen C-
terminalen APP Antikörpern als auch mit einem für das Amyloid β spezifischen
monoklonalen Antikörper reagierte. Thyroide Zellen scheinen somit beide Wege
für das Prozessieren von APP zu besitzen: sowohl den nicht-amyloidogenen
sekretorischen Weg als auch den amyloidigenen endosomal/lysosomalen Weg.
Diese Eigenschaft macht thyroide Zellen als Modell geeignet, die Regulation der
APP Produktion und des APP Metabolismus zu untersuchen. Es konnte auch
gezeigt werden, daß APP durch eine Thyroid-Rattenzellinie produziert wird
(Graebert, K. et al., Eur. J. Cell Biol. 66: 39-46, 1995).
Es wurden nun Versuche unternommen, um den Einfluß von verschiedenen
Cytokinen auf solche Zellen zu untersuchen, die APP produzieren. Als ein
Beispiel wurden thyroidale Zellen ausgewählt. Es konnte festgestellt werden,
daß eine Vielzahl an verschiedenen Cytokinen in der Schilddrüse vorkommen.
Als Beispiele wurden von den Cytokinen das Interleukin-1β (IL-1β), welches
charakteristischerweise von infiltrierenden Monocyten gebildet wird, das
Interferon-γ (IFN-γ), welches ein Hauptprodukt der T-Zellen ist und der
Transforming Growth Factor β (TGFβ), ein durch thyroide Zellen konstitutiv
sekretiertes Cytokin, ausgewählt.
IL-1β ist ein beschriebenes Cytokin und kann nach bekannten Methoden
hergestellt werden. Beispielsweise nach March C. J. et al., Nature 315, 641 -,
1985 oder nach WO 92/13885.
Dem Fachmann ist IFN-γ aus der vielfältigen Literatur gut bekannt. Die
Herstellung von IFN-γ kann beispielsweise gemäß der in den Publikation von
Gray W. P. et al., Nature 295: 503-508, 1982, beschriebenen Verfahren
hergestellt werden oder gemäß EP-S 0 077 670. Als weitere Bezugsquelle von
IFN-γ kommt beispielsweise Bender+Co, Wien, Österreich, in Betracht. Umfaßt
werden aber auch die bekannten Derivate, Allele und Analoga von IFN-γ, welche
die bekannten funktionellen biologischen Eigenschaften von IFN-γ aufweisen,
beispielsweise gemäß EP-A 0 161 504. Demzufolge kommen auch solche
Polypeptide in Frage, die eine biologische Aktivität des IFN-γ-Typs aufweisen.
Auch das Cytokin TGFβ ist dem Fachmann aus der Literatur bekannt und es
kann beispielsweise nach den in EP-A-0 200341, EP-A-0 268561 oder WO
89/12101 beschriebenen Verfahren hergestellt werden oder es kann kommerziell
erhalten werden, beispielsweise von Calbiochem, Luzern, Schweiz.
Überraschenderweise konnte mit einem bestimmten Cytokin, dem IFN-γ, gezeigt
werden, daß dieses die Bildung und den Metabolismus von APP in Zellen mit
APP Expression und APP Metabolismus, insbesondere in neuronalen und
extraneuronalen Zellen, stark beeinflußt.
Betreffend IFN-γ wurde nun gefunden, daß dieses Cytokin einen starken
inhibitorischen Effekt für APP in kultivierten thyroidalen Zellen zeigte, da es
sowohl den Anteil des vollständig glykosylierten maturen als auch des partiell
glykosylierten immaturen zellulären Holoproteins dosisabhängig reduzierte
(Fig. 1). IFN-γ beeinflußte auch die Bildung von APP Metaboliten. Es reduzierte
die Menge an C-terminal verkürzten sekretierten APPs und verminderte die
Bildung eines 41-kDa Metaboliten, von dem erkannt wurde, daß er thyroid
spezifisch ist und von den gezeigt werden konnte, daß er die Amyloid-β
Sequenz enthält (Fig. 1, untere Abbildung). IFN-γ übte seine inhibitorische
Wirkung ab einer Konzentration von 30 U/ml aus (Fig. 1) und der Effekt trat 72
Stunden nach Gabe von IFN-γ ein. Ausschlußanfärbung mit Trypanblau zeigte,
daß IFN-γ bei den verwendeten Konzentrationen nicht cytotoxisch war.
Zellanzahl und Gesamtprotein Konzentrationen waren vor und nach der IFN-γ
Behandlung identisch.
Die Behandlung mit IL-1β bei einer Konzentration von 40 U/ml ergab eine
deutlich erhöhte Produktion des amyloidogenen 41 kDa C-terminalen Fragments
von APP (Tabelle 1). Dieser Effekt war nach 1 Stunde maximal. Auch niedrigere
II-1β Konzentrationen zeigten noch eine signifikante Bildung des 41 kDa
Metaboliten.
Die Inkubation von thyroidalen epithelialen Zellen mit TGFβ in Konzentrationen
von 1 und 10 ng/ml für 72 Stunden bei 37°C (RPMI, supplementiert mit 5%
fetalem Kälberserum) zeigte ebenfalls, wenn auch einen geringeren
inhibitorischen Effekt auf den APP Metabolismus. APPs und der 41 kDa
Metabolit erniedrigte sich bis zu 20%. In der folgenden Tabelle 1 werden die
Veränderungen bei der Bildung von APP und seiner Metaboliten in Thyroidzellen
bei der Behandlung mit IFN-γ, IL-1β und TGFβ gezeigt. Die dargestellten
Ergebnisse zeigen die Wirkung jedes der Cytokine zum Zeitpunkt und bei der
Dosis ihrer maximalen Effekte. Die Werte wurden mittels densitometrischen
Scanning der Western Blots erhalten und repräsentieren die relativen
prozentualen Veränderungen im Vergleich zu nicht-behandelten Kontrollen (x±
SEM, n=5, p vs Kontrolle, ** p<0.01, *p<0.05).
Anhand der erhaltenen Ergebnisse konnte überraschenderweise nachgewiesen
werden, daß ein bestimmtes Cytokin die Produktion und den Metabolismus von
APP regulieren konnte. Am Beispiel der thyroidalen Zellen wurde gezeigt, daß
IFN-γ einen starken inhibitorischen Einfluß auf alle untersuchten Parameter
besitzt, wohingegen IL-β selektiv den amyloidogenen Wegs des APP Abbaus
stimulierte. Die Stimulierung der Synthese von amyloidogenen APP Metaboliten
in thyroidalen epithelialen Zellen könnte daher von pathologischer Bedeutung
sein. Ein zellzerstörender Effekt durch amyloidogene APP Metaboliten, wie er in
neuronalen Zellen nachgewiesen werden konnte (Yanker B. A. et al., Science
Z45: 417-420, 1989), erscheint daher wahrscheinlich.
Legenden:
Fig. 1: Inhibierung der APP Synthese und des Metabolismus. Thyroidale epitheliale Zellen wurden mit Konzentrationen von 0 (Bahn 1), 30 (Bahn 2), 300 (Bahn 3) und 3000 (Bahn 4) U/ml rekombinantes human IFN-γ für 72 Stunden bei 37°C in RPMI wie beschrieben kultiviert. Zelluläre Extrakte wurden durch Western Blotting analysiert wie in den Beispielen beschrieben. Die APP Banden wurden mit dem monoklonalen Antikörper 22C11 (A) und C8 Antiserum (B) dedektiert. Eine Bande von 145 kDa repräsentiert das mature Holoprotein, wohingegen eine Doppelbande bei 117/115 kDa mit dem immaturen APP korrespondiert. Eine 41 kDa Bande (B) repräsentiert ein thyroid-spezifisches amyloidogenes Abbauprodukt von APP.
Fig. 1: Inhibierung der APP Synthese und des Metabolismus. Thyroidale epitheliale Zellen wurden mit Konzentrationen von 0 (Bahn 1), 30 (Bahn 2), 300 (Bahn 3) und 3000 (Bahn 4) U/ml rekombinantes human IFN-γ für 72 Stunden bei 37°C in RPMI wie beschrieben kultiviert. Zelluläre Extrakte wurden durch Western Blotting analysiert wie in den Beispielen beschrieben. Die APP Banden wurden mit dem monoklonalen Antikörper 22C11 (A) und C8 Antiserum (B) dedektiert. Eine Bande von 145 kDa repräsentiert das mature Holoprotein, wohingegen eine Doppelbande bei 117/115 kDa mit dem immaturen APP korrespondiert. Eine 41 kDa Bande (B) repräsentiert ein thyroid-spezifisches amyloidogenes Abbauprodukt von APP.
Die vorliegende Erfindung offenbart daher in überraschender Weise und
erstmalig, daß INF-γ als ein erstes Cytokin identifiziert werden konnte, welches
die Bildung von APP und seiner amyloidogenen Metaboliten effektiv supprimiert.
Da die Ablagerung dieser Stoffe im Gehirnzellen, insbesondere in neuronalen
Zellen, als kausaler Auslöser der Alzheimer Erkrankung bzw. der Alzheimer
Demenz betrachtet werden muß, wird erfindungsgemäß ein therapeutisches und
prognostisches Mittel zur Behandlung dieser Erkrankung beim Menschen
bereitgestellt.
Arzneimittel bzw. pharmazeutische Präparationen oder Zubereitungsformen mit
Wirkstoff IFN-γ sind für andere Indikationen als die in der vorliegenden
Beschreibung genannten bekannt und können ohne weiteres für die
erfindungsgemäße Verwendung in analoger Weise angewandt werden. Die Dosis
richtet sich üblicherweise nach der Schwere und Art des Krankheitsbildes und
der Ansprechrate der verabreichten pharmazeutischen Präparation beim
Patienten. Allgemein kann von einer Dosierung zwischen 0.01 und 3-5 × 10⁷
U/mg (spezifische Aktivität) ausgegangen werden bzw. von einer zu
verabfolgenden Menge an Wirkstoff, beispielsweise von rekombinantem IFN-γ,
zwischen 1 bis 200 µg, vorzugsweise zwischen 10 bis 100 µg, bezogen auf m²
Körperoberfläche, wobei 100 µg mit 3 × 10⁶ IU (internationale Einheiten)
gleichgesetzt werden kann. Gebrauchsfertige Anwendungsformen kommen
beispielsweise in Analogie zu Imufor®Gamma Immuninterferon, Thomae, in
Betracht. Die Applikation kann als Einmalgabe oder als Mehrfachgabe, einmal
oder mehrmals pro Tag, über Stunden, Tage, Wochen oder Monate gegeben
werden, wobei die Mehrfachgabe bzw. Langzeittherapie bevorzugt ist. Die
Dauer der Behandlung ist abhängig von dem speziellen Krankheitsbild und dem
Grad oder Stadium der Erkrankung sowie dem Allgemeinzustand des Patienten.
Demzufolge liegt die Dauer der Behandlung, wie auch die Dosis, im Ermessen
des Fachmanns, insbesondere des mit der betreffenden Indikation vertrauten
und erfahrenen Arztes.
Als Hilfsstoffe kommen die üblicherweise verwendeten Stoffe in Betracht,
beispielsweise Kohlenhydrate (z. B. Mannitol), inerte Proteine, Wasser für
Injektionszwecke, Polyalkohole (z. B. Polysorbat 20).
Als Applikation kommen alle bekannten parenteralen Routen in Fragen,
insbesondere die systemische Applikation, beispielsweise die intravenöse,
intraarterielle, subcutane, intramuskuläre, peritoneale Gabe, beispielsweise über
Injektion mittels einer Spritze oder Perfusion mittels eines Katheters, aber auch
die lokale Applikation, beispielsweise die intrathekale Verabreichung, kommt in
Betracht. Die systemische Applikation wird jedoch als die bevorzugte
Verabreichungsart betrachtet, da es gilt, die Entstehung der in den Körperzellen
gebildeten APPs oder Metaboliten und Derivate gemäß der Erfindung zu
beeinflussen.
Ein erfindungsgemäße prophylaktische oder therapeutische Behandlung kann
vorteilhaft auch mit anderen Therapieformen bzw. Präparationen oder
Wirkstoffen kombiniert werden, insbesondere solchen, die eine Verhinderung
oder Hemmung der Bildung von APP oder Metaboliten und Derivaten davon
fördern oder verursachen. Insbesondere kommen in Betracht proteolytische
Enzyme, beispielsweise Inhibitoren der β- und γ-Sekretasen oder Wirkstoffe, die
die Bildung von Aβ inhibieren oder herabsetzen, beispielsweise wie sie in
Schenk, D.B. et al. J. Med. Chem. 38(21): 4141-4154, 1995, beschrieben sind.
Bei einer solchen Kombinationstherapie können die einzelnen Wirkstoffe
gleichzeitig oder sequentiell über die jeweils geeignete Route, vorzugsweise
systemisch (beispielsweise i.v., i.a., i.m.), aber auch lokal (beispielsweise
intrathekal), appliziert werden.
Demzufolge werden auch Kombinationspräparationen für die erfindungsgemäße
prophylaktische oder therapeutische Behandlung mitumfaßt, welche IFN-γ in
Kombination mit mindestens einem weiteren Wirkstoff, welcher eine
Verhinderung oder Verminderung der Bildung von APP oder Metaboliten und
Derivaten davon fördert oder verursacht, enthalten.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern. Betreffend die
Unterschiede bei den erhaltenen Ergebnissen wurden für alle
Signifikanzbestimmungen der t-Test für gepaarte Mittelwerte angewendet.
Thyroidgewebe wurde dadurch gewonnen, daß bei 25 Patienten (15 weibliche,
10 männliche Personen im Alter zwischen 28 und 69 Jahren) mit
multimodularem nicht-toxischem Kropf eine Thyroidectomy durchgeführt wurde.
Vor dem chirurgischen Eingriff waren die Patienten unbehandelt und wiesen eine
normale Thyroidhormon Konzentration auf. Die APP Produktion war in den
Kröpfen identisch mit solchen von normalem thyroiden Gewebe.
Thyroidale epitheliale Zellen (TEC) wurden nach dem Verfahren von Schmitt, T.
L. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 80(12): 3513-3519, 1995, gereinigt. Zu
diesem Zweck wurden die Gewebeproben in 1-2-mm³ Stücke geschnitten und
mit 5 mg/ml Collagenase (Typ IV, Sigma, Deisendorf, Deutschland) in RPMI
1640 Medium, enthaltend 10% fetales Kälberserum und 1%
Penicillin/Streptomycin, bei 37°C für 3 Stunden dispergiert. Alle Reagenzien für
die Zellkulturen waren von GIBCO (Paisley, UK). Die erhaltene Zellsuspension
wurde durch ein Nylonnetz mit 200-µm Maschen filtriert. Die roten Blutzellen
wurden mit einem Ammoniumchlorid-Puffer (0.82% NH₄Cl und 0.1% KHCO₃)
lysiert. Die verbliebenen Zellen wurden gewaschen und in RPMI 1640,
supplementiert mit 10% fetalem Kälberserum und 1% P/S, in 75-cm²
Kulturflaschen (Costar, Cambridge, MA, USA) bei 37°C in 5% CO₂ und 95%
Feuchtigkeit für 24 Stunden inkubiert. Nicht-adhärente Zellen wurden
anschließend durch gründliches Waschen mit Medium entfernt. Die erhaltene
adhärente Zellpopulation bestand aus <95% TEC. 1 × 10⁶ Zellen davon wurden
in 75 cm² Gewebekulturflaschen in RPMI-Medium mit 5% fetalem Kälberserum
ausgebracht und mit folgenden Cytokinkonzentrationen stimuliert: 30, 300 und
3000 U/ml rekombinantes IFNγ (Bender+Co, Wien, Österreich), 10 und 40 U/ml
rekombinantes IL-2 (Innogenetics, Antwerpen, Belgien) und 1 und 10 ng/ml
natürliches TGFβ (Calbiochem, Luzern, Schweiz). TGFβ wurde in serumfreiem
RPMI hinzugefügt, die anderen Cytokine in mit 5% fetalem Kälberserum
supplementierten RPMI. Die Zellen wurden danach für 1, 4 oder 72 Stunden
inkubiert (37°C), um die Kurz- und Langzeiteffekte zu untersuchen. Nach der
jeweiligen Inkubation wurden die TEC geerntet, gezählt und wie oben
angegeben in 0.82% NH₄Cl und 0.1% KHCO₃ lysiert.
Für Immunblotting-Experimente wurde der monoklonale Antikörper (mAB)
22C11 (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland), welcher spezifisch ist
für ein Epitop am N-Terminus von APP, in einer Konzentration von 3 µg/ml und
ein Antiserum, welches spezifisch ist für den C-Terminus von APP, verwendet.
In dem hier vorliegenden Fall wurde das Antiserum C8 verwendet, welches von
Brigham and Woman′s Hospital, Harvard Medical School, Boston,
Massachusetts, USA, erhalten wurde. Dieses Aniserum erkennt spezifisch den
C-Terminus von APP, nämlich die C-terminalen Positionen 732-751 (Podlinsky,
M. B. et al., Am. J. Pathol. 138(6):1423-1435, 1991), insbesondere die
Aminosäuresequenz K M Q Q N G Y E N P T Y K F F E Q M Q N (Ponte, P. et al.
Nature 331: 525-527, 1988). Es reagiert typischerweise mit dem 41-kDa APP
Fragment thyroidaler epithelialer Zellen. Dieses Fragment enthält die Amyloid β
Sequenz, da diese auch mit dem von Kim, K. et al. Neurosci. Res. Commun.
2 : 121-130, 1988, beschriebenen monoklonalen Antikörpern reagiert, welche
spezifisch β-Amyloid erkennen. Aber auch andere derartig für den C-Terminus
von APP spezifische Antiseren können für diesen Zweck ohne weiteres
verwendet werden. Zum Zwecke des Immunblottings wurde das Antiserum in
einer Verdünnung 1/1000 verwendet.
Die Gelektrophorese und das Immunoblotting wurden im wesentlichen nach der
Methode von Schmitt, T. L. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 80(12): 3513-
3519, 1995, durchgeführt. Hierzu wurden die Proteinextrakte in
Natriumdodecylsulfat (SDS) Lysispuffer bis zum Kochen erhitzt. Danach wurden
70 µg Protein pro Tasche auf die Gele aufgetragen und ein konstanter Strom von
25 mA angelegt. Gele mit 8.5%, 10% oder 12.5% Polyacrylamid wurden,
abhängig von den benutzen Antikörpern, für die Elektrophorese benutzt. Die
Gele wurden über Nacht bei 95 mA auf 0.2-µm Nitrozellulosefilter (Schleicher
und Schuell, Dassel, Deutschland) in einem Tris-Glycinpuffer, pH 8.3, enthaltend
20% (vol/vol) Methanol, geblottet. Die Nitrozellulosefilter wurden anschließend
in 4% Milchpulver für 2 Stunden geblockt und mit den APP Antikörpern für 2
Stunden inkubiert. Für die Analyse der zellulären Proteine wurde auf jeder
Gelbahn 30 µ zelluläres Protein aufgetragen. Die Volumina der auf den Gelen
verwendeten Überstände wurden korrigiert hinsichtlich Zellzahl pro Kultur und
lagen im Bereich zwischen 50 und 90 µl. Die Filter wurden gewaschen und mit
Meerrettich Peroxidase-gekoppelten sekundären Antikörpern markiert und unter
Verwendung einer Chemolumineszenz-Dedektionsystems gemäß den
Anwendungsempfehlungen des Herstellers (ECL System, Amersham, Wien,
Österreich) entwickelt. Die erhaltenen Banden wurden auf Röntgenfilm
festgehalten und densitometrisch mittels des Scanpack Systems (Biometra,
Göttingen, Deutschland) bestimmt. Cytokin behandelte Proben und
unbehandelte Kontrollen wurden immer auf dem selben Blot verglichen. Um
gleiche Proteinauftragungen sicherzustellen, wurden die Filter anschließend mit
Amidoschwarz oder Indiafarbstoff gefärbt.
Fig. 1 zeigt das Ergebnis eines solchen Westernblottings, wodurch die
inhibitorische Wirkung von IFNγ illustriert wird.
Claims (8)
1. Verwendung eines Polypeptides mit der biologischen Aktivität des
Interferon-gamma (IFN-γ)-Typs zur Herstellung einer pharmazeutischen
Präparation zur Prophylaxe und/oder therapeutischen Behandlung von
durch Amyloid-Vorläuferprotein (APP) oder durch Metaboliten oder
Derivaten davon verursachte Erkrankungen des Gehirns.
2. Verwendung eines Polypeptides gemäß Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß das Polypeptid Interferon-gamma (IFN-γ) ist.
3. Verwendung eines Polypeptides gemäß Anspruch 2, dadurch
gekennzeichnet, daß das IFN-γ humanes IFN-γ ist.
4. Verwendung eines Polypeptides gemäß Ansprüchen 1 bis 3 zur
Herstellung einer pharmazeutischen Präparation zur Behandlung der
Dementia.
5. Verwendung eines Polypeptides gemäß Ansprüchen 1 bis 3 zur
Herstellung einer pharmazeutischen Präparation zur Behandlung der
Alzheimerschen Erkrankung.
6. Verwendung eines Polypeptides gemäß Ansprüchen 1 bis 3 zur
Herstellung einer pharmazeutischen Präparation zur Behandlung von
Patienten mit Trisomie 21 (Morbus Down).
7. Verwendung eines Polypeptides gemäß Ansprüchen 1 bis 6 zur
Herstellung einer pharmazeutischen Präparation, dadurch
gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Präparation zur parenteralen
Applikation geeignet ist.
8. Verwendung eines Polypeptides gemäß Ansprüchen 1 bis 7 zur
Herstellung einer pharmazeutischen Präparation in Kombination mit
mindestens einem weiteren Wirkstoff, welcher eine Verhinderung oder
Verminderung der Bildung von APP oder Metaboliten und Derivaten davon
fördert oder verursacht.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1996104858 DE19604858A1 (de) | 1996-02-10 | 1996-02-10 | Verwendung von Interferon-gamma (IFN-gamma) zur Herstellung einer pharmazeutischen Präparation zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Erkrankungen, die mit einer Überexpression von Amyloid-Vorläuferprotein einhergehen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1996104858 DE19604858A1 (de) | 1996-02-10 | 1996-02-10 | Verwendung von Interferon-gamma (IFN-gamma) zur Herstellung einer pharmazeutischen Präparation zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Erkrankungen, die mit einer Überexpression von Amyloid-Vorläuferprotein einhergehen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE19604858A1 true DE19604858A1 (de) | 1997-08-14 |
Family
ID=7785022
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE1996104858 Withdrawn DE19604858A1 (de) | 1996-02-10 | 1996-02-10 | Verwendung von Interferon-gamma (IFN-gamma) zur Herstellung einer pharmazeutischen Präparation zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Erkrankungen, die mit einer Überexpression von Amyloid-Vorläuferprotein einhergehen |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE19604858A1 (de) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995015177A2 (en) * | 1993-12-02 | 1995-06-08 | President And Fellows Of Harvard College | Improved efficacy of alpha-helical cytokines |
| WO1996017072A2 (en) * | 1994-11-30 | 1996-06-06 | Chiron Viagene, Inc. | Recombinant alphavirus vectors |
-
1996
- 1996-02-10 DE DE1996104858 patent/DE19604858A1/de not_active Withdrawn
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995015177A2 (en) * | 1993-12-02 | 1995-06-08 | President And Fellows Of Harvard College | Improved efficacy of alpha-helical cytokines |
| WO1996017072A2 (en) * | 1994-11-30 | 1996-06-06 | Chiron Viagene, Inc. | Recombinant alphavirus vectors |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Chemical Abstr. 117:5772 * |
| EPSTEIN, Lois B. et al.: The biology and pro- perties of interferon-gamma: an overview, studies of production by T lymphocyte subsets, and ana- lysis of peptide synthesis and antiviral effects in trisomy 21 and diploid human fibroblasts. In: Biol. Interferon Syst., Proc. Int. Meet. (1981), 247-56. Editor(s): De Maeyer, Edward, Galasso, George, Schellekens, Huub., Amsterdam: CA, medlineWPI Elsevier North-Holland Biomed. Press * |
| Medline-Referat 8801 6453 * |
| MURPHY, Marianne et al.: A role for tumor necrosisfactor-alpha and interferon-gamma in the regula- tion of interleukin-4-induced human thymocyte pro-liferation in vitro. Heightened sensitivity in theDown syndrome (trisomy 21). In: Pediatr. Res. (1992), 32 (3), 269-76 ISSN: 0031-3998 * |
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