DE69726281T2

DE69726281T2 - Hemmstoff für die gefässneubildung, der den gewebefaktor-inhibitor (tfpi) enthält

Info

Publication number: DE69726281T2
Application number: DE69726281T
Authority: DE
Inventors: Tsutornu Shimizumangoku 1-chome HAMURO; Yo Kikuchi-gun NAKAHARA; Sumiyo Kumamoto-shi TAKEMOTO; Seiji Kikuchi-gun MIYAMOTO
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 1996-03-25
Filing date: 1997-03-24
Publication date: 2004-08-26
Anticipated expiration: 2017-03-25
Also published as: WO1997035609A1; KR19990087825A; EP0914830A1; AU1944997A; KR100442758B1; EP0914830A4; US6060449A; CA2250008A1; ATE254472T1; AU706582B2; DE69726281D1; JP4129994B2; EP0914830B1

Description

FACHGEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mittel für die Hemmung des Wachstums des Gefässendothels und einen Inhibitor der durch das Wachstum der Gefässendothelzellen ausgelösten Gefässneubildung, das den Gewebefaktor-Inhibitor (TFPI) als wirksamen Bestandteil enthält. Im Besonderen betrifft die vorliegende Erfindung ein TFPI-enthaltendes Mittel zur Verwendung in der Vorbeugung und Behandlung von Gefässneubildungs-Erkrankungen durch die wirksame Hemmung der durch das Wachstum der Gefässendothelzellen ausgelösten Gefässneubildung.
FACHLICHER HINTERGRUND
Gefässneubildung ist das Wachstum neuer Blutgefässe, insbesondere der Kapillargefässe. Obwohl die Gefässneubildung ein bedeutender physiologischer Vorgang bei der Entwicklung von Embryonen oder beim Wachstum von Lebewesen ist, ist allgemein bekannt, daß Gefässneubildung gesunde Erwachsene meistens nachteilig beeinträchtigt und nur bei der Wundheilung oder beim Menstruationszyklus vorteilhaft ist. Im Fall maligner Tumoren, zum Beispiel, ist das Wachstum der Gefässendothelzellen oder die Gefässneubildung von Kapillargefässen wesentlich für die Entwicklung des Tumorgewebes. Dies rührt, wie angenommen wird, daher, daß die Tumorzellen einen für die Gefässneubildung erforderlichen Faktor herstellen und sekretieren, und als ein Ergebnis davon werden die Gefässendothelzellen zur Teilung und Ausbreitung auf den Ort des Tumors zu stimuliert. Demzufolge kann die Hemmung der Gefässneubildung ein Mittel zur Kontrolle des Wachstums maligner Tumore sein.
Zur Behandlung maligner Tumore ist die chirurgische Entfernung der Tumore durchgeführt worden. Wenn jedoch nur eine der Tumorzellen nicht entfernt wird, sondern nach der Entfernung des Tumors im betroffenen Gebiet verbleibt, erfolgt die Neuentstehung des Tumors. Darüberhinaus wird berichtet, daß die Zahl der während oder nach der chirurgischen Entfernung von Tumorgewebe mit weit entwickelter Gefässneubildung im Blutkreislauf erscheinenden Tumorzellen ansteigt, was ein erhöhtes Metastase-Risiko für andere Organe zur Folge hat [McCulloch P. et al., The Lancet 346 (1995), 1334]. Im Fall einer solchen chirurgischen Entfernung von Tumorgewebe gestattet die Verwendung eines Hemmstoffs für die Gefässneubildung, der die Gefässneubildung hemmen kann, die Verhinderung einer Neuentstehung des Primärtumors und des Wachstums metastasierender Tumorzellen und kann daher ein Mittel zur Behandlung maligner Tumore sein.
Über die Ausbreitung maligner Tumore hinaus gibt es verschiedene bekannte, durch Gefässneubildung hervorgerufene Erkrankungen, einschließlich der sogenannten Gefässneubildungs-Erkrankungen, wie etwa diabetische Retinopathie, retrolentale Fibroplasie, neovaskuläres Glaukom, Psoriasis, Angiofibrom, immune und nicht-immune Entzündung (einschließlich rheumatischer Arthritis), Ausbreitung von Kapillargefässen in arteriosklerotischen Plaques, Angiom und Karposi-Sarkom [Folkman J. et al., Science 235 (1987), 442]. Man kann sehr wohl davon ausgehen, daß die Hemmung der Gefässneubildung diese Erkrankungen behandeln könnte.
Es ist bestätigt worden, daß das Wachstum der Endothelzellen der Blutgefässe sehr bedeutend für den Mechnismus der Gefässneubildung ist. Das heißt, die Gefässneubildung erfolgt nach folgendem Mechanismus: (i) die Basalmembran existierender Blutgefässe wird zunächst durch die Einwirkung eines proteolytischen Enzyms abgebaut, und danach werden die Endothelzellen aus der örtlich zerstörten Membran freigesetzt, (ii) die freigesetzten Endothelzellen wandern in den extravaskulären Bereich, wo sie sich durch Zellteilung vermehren, (iii) nach der Vermehrung differenzieren sie sich schrittweise zu einer röhrenartigen Struktur, und ein neues Blutgefäss wird dann gebildet, und (iv) schließlich wird das neue Blutgefäss zusammengefügt, um die Gefässneubildung abzuschliessen [Folkman J. et al., J. Biol. Chem. 267 (1992), 10931]. Als die Gefässneubildung begünstigende Faktoren gibt es bekannte peptidische Verbindungen, den sauren Fibroblasten-Wachstumsfaktor (aFGF) und den basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), die die Gefässneubildung durch Beschleunigung der Freisetzung und des Wachstums der Gefässendothelzellen auslösen. Vor kurzem wurde ein vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor/vaskulärer Permeabilitätsfaktor (VEGF/VPF), ein für Gefässendothelzellen spezifischer Wachstumsfaktor, als neuer, die Gefässneubildung begünstigender Faktor, gefunden [Ferrara N. et al., J. Clin. Invest. 84 (1989), 1470].
Es gibt einige bekannte Verbindungen, die wachstumshemmende Wirkung auf Gefässendothelzellen aufweisen. Darunter ist Protamin, ein Protein mit einem Molekulargewicht von 4300, daß nur in Sperma vorkommt und reich an der basischen Aminosäure Arginin ist. Die bislang durchgeführten Versuche bestätigen, daß Protamin das Wachstum von Tumoren durch Hemmung der Gefässneubildung durch seine Heparin-bindende Eigenschaft hemmt [Taylor S. et al., Nature 297 (1982), 307]. Es ist jedoch bekannt, daß Protamin im Menschen antigen ist und eine anaphylaktische Reaktion bei und nach der zweiten Verabreichung auslöst. Aufgrund dieser Toxizität ist es schwierig, Protamin häufig für Menschen zu verwenden. Demzufolge gibt es ausgiebig untersuchte Verbindungen, die als Hemmstoffe für das Wachstums von Gefässendothelzellen und die Gefässneubildung wirksam, aber nicht toxisch im Menschen sind. Bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind jedoch noch keine Verbindungen entdeckt worden, die sowohl wirksame Aktivität zur Hemmung der Gefässneubildung als auch Sicherheit für den Menschen aufweisen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine hemmende Aktivität von TFPI auf das Wachstum von Gefässendothelzellen.
2 zeigt eine hemmende Aktivität von Volllängen-TFPI (TFPI + C) und C-terminal verkürztem TFPI (TFPI – C) auf das Wachstum von Gefässendothelzellen.
3 zeigt eine Wirkung von TFPI auf Wachstums-gehemmte Gefässendothelzellen.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegenden Erfinder haben nach Verbindungen gesucht, die eine Aktivität zur Hemmung des Wachstums gezüchteter menschlicher Gefässendothelzellen haben, um ein Mittel zu finden, daß in der Lage ist, verschiedene Gefässneubildungs-Erkrankungen, wie etwa maligne Tumore, durch Hemmung des Wachstums der Gefässendothelzellen und der Gefässneubildung zu behandeln. Als Ergebnis haben die vorliegenden Erfinder entdeckt, daß der Gewebefaktor-Inhibitor (hier im Folgenden "TFPI" genannt) eine ganz neue Aktivität besitzt, um sehr wirksam das Wachstum der Gefässendothelzellen zu hemmen und haben so die vorliegende Erfindung auf der Grundlage dieser Entdeckung vervollständigt. Das heißt, die vorliegende Erfindung betrifft ein Mittel zur Hemmung des Wachstums des Gefässendothels und einen Inhibitor der durch das Wachstum der Gefässendothelzellen ausgelösten Gefässneubildung, das TFPI als wirksamen Bestandteil enthält. Die Verabreichung einer wirksamen Menge dieses Mittels oder Inhibitors kann maligne Tumore oder andere Gefässneubildungs-Erkrankungen wirksam verhindern oder behandeln. Da menschlicher TFPI im menschlichen Körper vorkommt, kann er sicher, ohne Antigenizität aufzuweisen, verwendet werden, sogar wenn er äußerlich verabreicht wird. Aus anderen Säugetieren gewonnene TFPIs, die eine weitgehende Homologie zu menschlichem TFPI haben, können ebenfalls sicher, ohne Antigenizität aufzuweisen, verwendet werden. Weiterhin kann TFPI nicht nur die anomale Entwicklung der Gefässneubildung verhindern, sondern kann auch die Rückbildung bereits gebildeter Blutgefässe begünstigen.
TFPI ist ein im lebenden Körper vorkommendes Glykoprotein, von dem bekannt ist, daß es eine die extrinsische Blutgerinnung hemmende Aktivität besitzt [Broze, G. J., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84 (1987), 1886]. TFPI besteht aus mehreren Domänen, einschließlich, in dieser Reihenfolge vom Amino-terminalen Ende, einer an einer sauren Aminosäure reichen Region (hier im Folgenden "N-terminale Region" genannt), drei Strukturregionen so genannter Kunitz-Domänen (hier im Folgenden "Kunitz 1", "Kunitz 2", und "Kunitz 3", in dieser Reihenfolge vom Amino-terminalen Ende, genannt), und einer Region von 27 Aminosäuren am C-terminalen Ende, die reich an einer basischen Aminosäure ist (hier im Folgenden "C-terminale Region" genannt). Die Kunitz 1-Region bindet an einen der Blutgerinnungsfaktoren, den aktivierten Faktor VII, um dessen Proteaseaktivität zu neutralisieren, wohingegen die Kunitz 2-Region an einen anderen Blutgerinnungsfaktor bindet, den aktivierten Faktor X, um dessen Proteaseaktivität zu neutralisieren. Es wird angenommen, daß diese Aktivitäten zusammen für eine wirksame Hemmung der Blutgerinnung zu einem frühen Zeitpunkt verantwortlich sind. Es ist noch nicht bekannt, ob die N-terminale Region irgendeine physiologisch bedeutsame Aktivität aufweist. Die C-terminale Region jedoch bindet bekanntermaßen stark an Glykosaminglykane mit negativer Ladung, besonders Heparin. Menschliches TFPI besteht aus 276 Aminosäureresten und hat ein Molekulargewicht von ungefähr 42,000.
Eine Aminosäuresequenz von TFPI wurde veröffentlicht für Mensch [Wun T. C. et al., J. Biol. Chem. 263 (1988), 6001], für Affe [Kamei et al., J. Biochem. 115 (1994), 705], mit einer Homologie zum Menschen von 94%, für Kaninchen [Wesselschmidt R. L. et al., Nuc. Acids Res. 18 (1990), 6440; Warn-Cramer B. J. et al., Nuc. Acids Res. 20 (1992), 3548], mit einer Homologie zu menschlichem TFPI von 72%, für Ratte [Enjyoji, K. et al., J. Biochem. 111 (1992), 681], mit einer Homologie zu menschlichem TFPI von 56%, und ähnliche.
Der als aktiver Bestandteil im Hemmstoff für das Wachstum von Gefässendothelzellen und im Hemmstoff für die Gefässneubildung der vorliegenden Erfindung verwendete TFPI kann entweder nativer TFPI aus Blut oder gezüchteten Zellen von Säugern, einschließlich Mensch, oder ein rekombinanter TFPI sein, der durch Verfahren der genetischen Rekombination aus Säugern, einschließlich Mensch, hergestellt wird. Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls ein Derivat von TFPI ein, das eine Deletion, Substitution, Insertion oder Addition einer oder mehrerer Aminosäurereste der Aminosäuresequenz von TFPI besitzt und eine vergleichbare physiologische Aktivität zu der von nativem TFPI, der aus Blut oder Zellkultur gewonnen wurde oder zu der eines rekombinaten TFPI hat, der durch Verfahren der genetischen Rekombination hergestellt wurde, soweit er eine Aktivität aufweist, die das Wachstum von Gefässendothelzellen hemmt oder eine Aktivität, die die Gefässneubildung hemmt. Insbesondere wurde, wie in den folgenden Beispielen beschrieben, gefunden, daß C-terminal verkürzter TFPI (TFPI – C), dem alle 27 Aminosäurereste der C-terminalen Region von TFPI fehlen, ebenso wie Volllängen-TFPI (TFPI + C), eine deutliche Aktivität aufweist, die das Wachstum von Gefässendothelzellen hemmt und eine deutliche Aktivität, die die Gefässneubildung hemmt, und daß dieser C-terminal verkürzte TFPI in der vorliegenden Erfindung ebenso wie TFPI verwendet werden kann. Da der Hemmstoff für das Wachstum von Gefässendothelzellen und der Hemmstoff für die Gefässneubildung der vorliegenden Endung am Menschen angewendet werden, wird der aktive Bestandteil TFPI bevor zugt aus Mensch gewonnen, um eine Immunantwort zu umgehen und Sicherheit zu gewährleisten.
Ein Verfahren zur Herstellung von TFPI der vorliegenden Erfindung ist nicht im Besonderen eingeschränkt, sondern schließt eine Isolierung und Reinigung aus Blut oder gezüchteten, aus Säugern, wie dem Menschen, gewonnen Zellen und die Herstellung durch Verfahren der genetischen Rekombination ein. TFPI wird jedoch bevorzugt durch Verfahren der genetischen Rekombination hergestellt, da es aufgrund einer ziemlich niedrigen TFPI-Menge im Blut (ungefähr 100 ng/mL) schwierig ist, eine große Menge TFPI durch Isolierung und Reinigung von TFPI aus Blut herzustellen.
Der Hemmstoff für das Wachstum von Gefässendothelzellen und der Hemmstoff für die Gefässneubildung der vorliegendenden Erfindung enthält TFPI als aktiven Bestandteil und einen geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Träger (Gelatineschwamm und ähnliche) oder einen Excipient (humanes Serumalbumin, Zucker, und ähnliche), in Abhängigkeit des Behandlungsgegenstands oder der aktuellen Indikation. Eine spezifische Form der Verabreichung enthält bevorzugt, ist aber nicht beschränkt auf, eine Lösung, die durch Auflösen einer Trockenformulierung, die ein Gemisch aus TFPI, einem geeigneten, bekannten Excipient (humanes Serumalbumin, Zucker, usw.), einem Stabilisator (einer Aminosäure, usw.) und einem Puffer (Citronensäure, usw.) enthält, in Wasser zur Injektion hergestellt wird. Zur Aufbewahrung wird TFPI bevorzugt versiegelt in getrocknetem Zustand durch Lyophilisierung, usw. gelagert, so daß die Wirksamkeit von TFPI auf bestmögliche Weise erhalten bleibt. In diesem Fall kann TFPI in einem Gemisch zusammen mit einem geeigneten bekannten Excipient oder Stabilisator gelagert werden.
Die Art der Anwendung des TFPI-enthaltenden Mittels der vorliegenden Erfindung ist nicht im Besonderen eingeschränkt. Zum Beispiel kann TFPI durch direktes Einbringen von in einem geeigneten sterilen wäßrigen Medium gelösten TFPI in das betroffene Gewebe während der Operation durch Auftragen der Lösung auf die Oberfläche oder die Umgebung der betroffenen Stelle, oder durch intravenöse, subkutane, intradermale oder intramuskuläre Injektion der Lösung durch einmalige Injektion oder kontinuierliche Verabreichung angewendet werden. TFPI kann auch mit Augentropfen verabreicht werden. In einer Alternative kann ungelöstes TFPI-Pulver direkt an der betroffenen Stelle angewendet werden. Darüberhinaus kann TFPI ebenfalls durch die direkte Einführung eines geeigneten Expressionsvektors, in dem ein zur Expression von TFPI konstruiertes Gen enthalten ist, in das betroffene Gewebe angewendet werden, in dem TFPI überexprimiert wird. TFPI kann auch in Kombination mit anderen Medikamenten, wie etwa einem Mittel gegen Krebs, einem Immunsuppressor, einem Mittel gegen Entzündung, einem Mittel zur Behandlung von Diabetes mellitus, einem Antibiotikum, usw., angewendet werden.
Die wirksame Menge des aktiven Bestandteils TFPI des Hemmstoffs für das Wachstum von Gefässendothelzellen und des Hemmstoff für die Gefässneubildung der vorliegendenden Erfindung kann in Abhängigkeit von der Art und Weise der Anwendung variieren, bewegt sich aber bevorzugt in einem Rahmen, der ausreichend ist, um einen TFPI-Blutspiegel im Bereich von 5 μg/ml bis 80 μg/ml während der Gefäßneubildung zu liefern.
Die vorliegende Erfindung wird hier im Folgenden genauer durch Beispiele erläutert, so daß die vorliegende Erfindung besser verstanden wird, ist aber nicht auf diese Beispiele beschränkt.
Herstellungs-Beispiel
Herstellung von TFPI
Das in den folgenden Beispielen verwendete TFPI wurde aus dem Kulturüberstand einer Ovarialzelllinie aus Chinesischem Hamster, in die humane TFPI-cDNA eingeführt wurde, durch Affinitätschromatographie mit einem monoklonalen Anti-TFPI-Antikörper (HTFPI-K9; BIKOKEN KINKI 14467)-Gelkonjugat und Heparingel, wie bei Kamei et al. (Japanische Patent-Veröffentlichung Nr. 79774/1995) oder Enjyoji [Biochem. 34 (1995), 5725] beschrieben, gereinigt. Der Kulturüberstand enthält sowohl Volllängen-TFPI (TFPI + C) als auch C-terminal verkürzten TFPI (TFPI – C). Beide TFPI-Formen können durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Heparingel mit einer NaCl-Gradienten-Elution gereinigt werden. Der so erhaltene Volllängen-TFPI (TFPI + C) und der C-terminal verkürzte TFPI (TFPI – C), dem die 27 C-terminalen Aminosäurereste von TFPI fehlen, wurden in den folgenden Beispielen untersucht.
Beispiel 1
Hemmende Wirkung von Volllängen-TFPI auf das Wachstum von humanen Gefässendothelzellen
Als Endothelzellen wurden Endothelzellen aus humaner Nabelschnurvene (HUVEC) von KURABO INDUSTRIES LTD bezogen und in der dritten Passage verwendet. Als Nährmedium wurde E-GM Medium (modifiziertes MCDB131 Medium mit 2% fötalem Kälberserum, 10 ng/ml humanem epidermalem Wachstumsfaktor, 1 μg/ml Hydrocortison, 0,4% Extrakt aus Kälberhirn, 10 μg/ml Heparin, und einem antibakteriellen Mittel; hergestellt von KURABO INDUSTRIES LTD) verwendet.
Die in E-GM Medium suspendierten Endothelzellen wurden mit einer Zelldichte von 2500 Zellen/Well in einer 48-Well Kulturplatte (hergestellt von Iwaki Glass K. K.) angeimpft und bei 37°C in einem CO₂-Inkubator inkubiert. Zwei Tage nach Animpfen wurde das Nährmedium durch frisches E-GM Medium mit Volllängen-TFPI (TFPI + C) in verschiedenen Konzentrationen (0, 10, 20 und 40 μg/ml) ersetzt. Danach wurde die Züchtung weitergeführt, wobei das Medium alle 2 Tage durch frisches ersetzt wurde. Pro Well wurden 0,3 ml Nährmedium verwendet. Sechs Tage nach Animpfen wurden die auf der Platte gewachsenen Zellen durch Behandlung mit einer Trypsin/EDTA-Lösung auf herkömmliche Weise abgelöst und die Zellzahl pro Well mit einem Coulter-Zähler (hergestellt von Coulter) bestimmt.
1 ist ein Graph, der Mittelwert und Standardabweichung einer Zellzählung zeigt, wobei jede Gruppe aus 3 Wells besteht. Die Zugabe von TFPI hemmte das Wachstum der Gefässendothelzellen signifikant (Students t-Test, Signifikanzschwelle 1%) in Konzentrationsabhängiger Weise.
Beispiel 2
Hemmende Wirkung von Volllängen-TFPI und C-terminal verkürztem TFPI auf das Wachstum von humanen Gefässendothelzellen
Die hemmende Wirkung auf das Wachstum von humanen Gefässendothelzellen wurde für C-terminal verkürzten TFPI (TFPI – C) untersucht, dem die Heparin-bindende Region des Volllängen-TFPI (TFPI + C), die C-terminale basische Aminosäuresequenz (27 Aminosäuren), fehlt.
Die in E-GM Medium suspendierten Endothelzellen wurden mit einer Zelldichte von 2500 Zellen/Well in einer 48-Well Kulturplatte angeimpft und bei 37°C in einem CO₂-Inkubator inkubiert. Zwei Tage nach Animpfen wurde das Nährmedium durch frisches E-GM Medium mit Volllängen-TFPI (TFPI + C) oder C-terminal verkürztem TFPI (TFPI – C) in verschiedenen Konzentrationen (0, 5, 10, 20, 40 und 80 μg/ml) ersetzt. Danach wurde die Züchtung weitergeführt, wobei das Medium alle 2 Tage durch frisches ersetzt wurde. Pro Well wurden 0,3 ml Nährmedium verwendet. Sechs Tage nach Animpfen wurden die auf der Platte gewachsenen Zellen durch Behandlung mit einer Trypsin/EDTA-Lösung auf herkömmliche Weise abgelöst und die Zellzahl pro Well mit einem Coulter-Zähler (hergestellt von Coulter) bestimmt.
2 ist ein Graph, der Mittelwert und Standardabweichung einer Zellzählung der Gruppen zeigt, denen Volllängen-TFPI (TFPI + C) oder C-terminal verkürzter TFPI (TFPI – C) zugegeben wurde (jede Gruppe besteht aus 4 Wells). Als Ergebnis wurde gefunden, daß beide TFPI-Formen das Wachstum der Gefässendothelzellen signifikant (Students t-Test, Signifikanzschwelle 1%) in Konzentrations-abhängiger Weise hemmen, und daher sogar ein verkürzter TFPI das Wachstum der Endothelzellen hemmen konnte.
Beispiel 3
Wirkung von TFPI auf Wachstums-gehemmte Gefässendothelzellen
Die Gefässendothelzellen wurden auf einem Nährmedium ohne Wachstumsfaktor gezüchtet [ein Basal Medium, HuMedia-EB (hergestellt von KURABO INDUSTRIES LTD), supplementiert mit 2% fötalem Kälberserum und einem antibakteriellen Mittel] und die Wirkung von TFPI unter Bedingungen, bei denen kein Zellwachstum auftritt, wurde untersucht.
Die im Medium ohne zugesetzten Wachstumsfaktor suspendierten Endothelzellen wurden mit einer Zelldichte von 10000 Zellen/Well in einer 48-Well Kulturplatte angeimpft und bei 37°C in einem CO₂-Inkubator inkubiert. Zwei Tage nach Animpfen wurde das Nährmedium durch frisches E-GM Medium mit Volllängen-TFPI (TFPI + C) oder C- terminal verkürztem TFPI (TFPI – C) in verschiedenen Konzentrationen (0, 5, 10, 20, 40 und 80 μg/ml) ersetzt. Danach wurden die Zellen für weitere 2 Tage gezüchtet und, nachdem die auf der Platte gewachsenen Zellen durch Behandlung mit einer Trypsin/EDTA-Lösung abgelöst worden waren, die Zellzahl pro Well mit einem Coulter-Zähler bestimmt.
3 zeigt einen Zusammenhang zwischen der TFPI-Konzentration und der Zellzahl auf der Platte, wobei jede Gruppe aus 4 Wells besteht und die Zellzahl als Mittelwert mit Standardabweichung angezeigt wurde. Als Ergebnis hemmten beide TFPI-Formen das Wachstum der Gefässendothelzellen signifikant (Students t-Test, Signifikanzschwelle 1%) in Konzentrations-abhängiger Weise.
Diese Ergebnisse belegen, daß TFPI nicht nur daß Wachstum von Endothelzellen hemmt, sondern auch die Funktion der Wachstums-gehemmten Endothelzellen blockiert. Das heißt, es wurde gezeigt, daß TFPI nicht nur die anomale Entwicklung der Gefässneubildung verhindern konnte, sondern möglicherweise auch die Rückbildung neu gebildeter Gefässe begünstigen könnte.

Claims

Verwendung von TFPI oder eines Derivates von TFPI, der/das eine Deletion, Substitution, Insertion oder Addition einer oder mehrerer Aminosäurereste in der Aminosäuresequenz von TFPI und die physiologische Aktivität besitzt, die der von nativem TFPI entspricht, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Verhinderung und Behandlung von bösartigen Tumoren, diabetischer Retinopathie, retrolentaler Fibroplasie, neovaskulärem Glaukom, Psoriasis, Angiofibrom, immuner und nichtimmuner Entzündung wie rheumatischer Arthritis, Ausbreitung von Kapillargefäßen in Arterioskleroseplaques, Angioma oder Kaposi-Sarkom.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Derivat von TFPI ein am C-Terminus deletierter TFPI (TFPI – C) ist, dem 27 Aminosäurereste der C-terminalen Region von TFPI komplett fehlen.