KR100442758B1 - 조직인자응고계억제제함유혈관신생저해제 - Google Patents

조직인자응고계억제제함유혈관신생저해제 Download PDF

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Abstract

조직 인자 응고계 억제제(TFPI)를 유효 성분으로 포함하는, 혈관 내피 세포의 증식에 의해 야기되는 혈관 신생의 저해제가 제공된다. 본 발명의 TFPI 함유 저해제는 혈관 내피 세포의 증식에 의해 야기되는 혈관 신생을 효과적으로 저해할 수 있으므로 혈관 신생에 따른 병태인 악성 종양 등의 예방·치료제로서 지극히 유효하다.

Description

조직 인자 응고계 억제제 함유 혈관 신생 저해제
혈관 신생이란 새로운 혈관, 특히 모세혈관의 성장이다. 이 혈관 신생은 발육중의 태아 및 성장 과정의 생체에 있어서는 중요한 생리적 현상이지만, 건강한 성인에서의 혈관신생은 반대로 생체에 있어서 대부분 해로운 영향을 미치며, 상처의 치유 및 월경 주기에 관해서만 이로운 것으로 널리 알려져 있다. 예를 들어, 악성 종양의 경우, 혈관 내피 세포의 증식 및 모세 혈관의 신생은 종양 조직의 발생에 필수적이다. 이는 종양 세포가 혈관 신생에 필요한 증식 인자를 생성, 분비하고, 그 결과, 혈관 내피 세포가 자극되어 종양으로 분열, 성장하기 때문이라고 생각되고 있다. 따라서, 혈관 신생을 저해하는 것은 악성 종양의 성장을 제어하는 하나의 수단이 될 수 있다.
악성 종양의 치료법으로서 종양의 외과적 적출이 행하여지지만, 하나라도 종양의 제거에 실패하여 적출후에 종양 세포가 환부에 잔존한 경우에는 재발을 야기한다. 더욱이, 혈관 신생이 고도로 진행한 종양 조직의 외과적 적출술중·후에는, 혈중에 유출하는 종양 세포가 증가하는 것이 보고되었는데 이는 다른 기관으로의 전이의 위험성을 의미한다[참조문헌: McCulloch. P. et al., The Lancet, 346, p1334(1995)], 이와 같은 종양 조직의 외과적 적출의 경우에 혈관 신생을 억제할 수 있는 혈관 신생 저해제를 사용하면 원발소에서의 재발 및 전이된 종양 세포의 증식을 방지하는 것이 가능해져서, 악성 종양에 대한 치료법의 한 수단이 될 수 있다.
악성 종양의 성장외에도, 혈관 신생이 원인이 되는 질환으로서는 다양한 질환이 알려져 있으며, 예를 들어, 당뇨병성 망막증, 수정체후방 섬유 증식, 혈관 신생성 녹내장, 건선, 섬유성 혈관종, 면역 및 비면역성 염증(류마티스성 관절염을 포함함), 아테롬성 동맥 경화증 플라크 안에서의 모세 혈관의 증식, 혈관종, 카포시육종 등의 일반적으로 혈관 신생병(angiogenic diseases) 등을 포함한다 [참조: Folkman, J. et al., Science, 235, p442(1987)]. 혈관 신생을 저해함으로써 이들 질환의 치료가 기대된다.
혈관 신생의 기전에 있어서는 혈관 내피 세포의 증식이 대단히 중요하다는 것이 확인되었다. 즉, 혈관 신생은 (i) 우선 단백질 분해 효소의 작용에 의해 기존 혈관의 기저막의 융해가 생겨, 혈관 내피 세포가 국소적으로 파괴된 부분으로부터 혈관밖으로 방출되고, (ii) 이 방출된 내피 세포가 혈관외 영역으로 이동하고, 여기서 내피 세포가 세포분열을 통해 증식하고, (iii) 증식 후, 점차로 혈관 내피 세포가 관상 구조로 분화하여 새로운 혈관을 형성한 후, (iv) 마지막으로 새로운 혈관이 접합되어 혈관 신생에 이르는 기전으로 일어난다[참조: Folkman, J. et al., J. Bio1. Chem., 267, p 10931 (1992)]. 이러한 혈관 신생의 촉진 인자로서는, 펩티드성 물질인 산성 섬유아세포 증식 인자(acidic Fibroblast Growth Factor; aFGF) 및 염기성 섬유아세포 증식 인자(basic Fibroblast Growth Factor; bFGF)가 알려져 있으며, 이들 인자는 혈관 내피 세포의 방출 및 증식을 촉진함으로써 혈관 신생을 야기한다. 최근에, 혈관 내피 세포에 대하여 특이적인 증식 인자인 혈관 내피 세포 증식 인자/혈관 투과성 인자(VEGF/VPF)가 새로운 혈관 신생 촉진 인자로서 밝혀졌다 [참조: Ferrara, N. et al., J. Clin. Invest., 84, p 1470 (1989)].
혈관 내피 세포의 증식 억제를 나타내는 몇 개의 화합물이 알려져 있다. 그중 하나는 프로타민으로서, 이것은 정자중에만 존재하는 분자량 4,300의 단백질로, 염기성 아미노산인 아르기닌을 풍부하게 포함하고 있다. 지금까지의 실험으로 프로타민은 그의 헤파린 결합 능력에 근거하여 종양의 혈관 신생을 저해함으로써 종양의 성장을 억제하는 것으로 확인되었다 [참조: Taylor. S. et al., Nature, 297, p307(1982)]. 그러나, 프로타민은 인간에 대해서 항원성을 보이기 때문에 2회째 이후의 투여시에 아나필락시 반응을 야기하는 것이 알려져 있어, 이 독성들 때문에 빈번히 인간에게 사용하는 것은 곤란하다. 따라서, 혈관 내피 세포 증식 및 혈관 신생의 저해제로서 유효하고 또한 인간에 대하여 무독성인 물질의 연구·탐색을 지금까지 행하고 있지만, 유효한 혈관 신생 저해 작용과 인간에서 안전성을 겸비한화합물은 아직 발견되지 않고 있는 실정이다.
본 발명은 조직 인자 응고계 억제제(Tissue Factor Pathway Inhibitor; TFPI)를 유효 성분으로서 함유하는 혈관 내피 세포의 증식 억제제 및 혈관 내피 세포의 증식에 의해 야기되는 혈관신생의 저해제에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 혈관 내피 세포의 증식에 의해 야기되는 혈관 신생을 효과적으로 저해함으로써 혈관 신생 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 TFPI 함유 제제에 관한 것이다.
도 1은 TFPI의 혈관 내피 세포 증식에 대한 억제 효과를 나타낸다.
도 2는 전장형(full-length) TFPI(TFPI+C) 및 C 말단 영역 결손형 TFPI(TFPI-C)의 혈관 내피 세포 증식에 대한 억제 효과를 나타낸다.
도 3은 증식을 정지시킨 혈관 내피 세포에 대한 TFPI의 작용을 나타낸다.
본 발명자들은 혈관 내피 세포의 증식 및 혈관 신생을 억제함으로써 악성 종양을 비롯한 여러가지의 혈관 신생병을 예방 또는 치료할 수 있는 약제를 발견하기 위해서 배양한 인간의 혈관 내피 세포를 사용하여 그 증식을 억제하는 작용을 갖는 물질을 검색한 결과, 조직 인자 응고계 억제제(이하, 「TFPI」라 한다)가 혈관 내피 세포의 증식을 지극히 효과적으로 억제하는 완전히 새로운 작용을 갖는 것을 발견하고, 이 발견에 기초하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 즉, 본 발명은 TFPI를 유효 성분으로서 포함하는 혈관 내피 세포의 증식 억제제 및 혈관 내피 세포의 증식에 의해 야기되는 혈관 신생의 저해제에 관한 것이다. 상기 약제 또는 억제제를 유효량 투여함으로써, 악성 종양 혹은 그 밖의 혈관 신생병을 효과적으로 예방 혹은 치료할 수가 있다. 인간 TFPI는 인간 생체내에 원래 존재하는 것이므로 이것을 외부로부터 투여하였다고 하더라도 항원성을 나타내지 않고 안전하게 사용할 수 있다. 인간 TFPI와 실질적인 상동성을 갖는 다른 포유 동물 유래의 TFPI도 또한 인간 TFPI와 같이 항원성을 나타내지 않고 안전하게 사용할 수 있다. 또한, TFPI는병적인 신생 혈관의 진행 방지 뿐만아니라, 이미 형성된 신생 혈관에 대하여도 작용하여 그 퇴축을 촉진할 수 있다.
TFPI는 외인성 혈액 응고 반응을 저해하는 기능을 가지는 것으로 알려져 있는 생체내에 존재하는 당단백질이다 [참조: Broze, G.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 84, p 1886 (1987)]. TFPI는 몇 개의 도메인으로 구성되어, 아미노 말단으로부터 순서대로, 산성 아미노산이 풍부한 영역(이하, 「N 말단 영역」이라 한다), 일반적으로 쿠니쯔 영역(Kunitz domain)으로 불리는 3 개의 구조 영역(아미노 말단으로부터 순서대로 「쿠니쯔 1」, 「쿠니쯔 2」 및 「쿠니쯔 3」이라고 한다), 및 C 말단에서 염기성 아미노산이 풍부한 27 아미노산으로 이루어지는 영역(이하, 「C 말단 영역」이라고 한다)으로 이루어 진다. 쿠니쯔 1 영역은 혈액 응고 인자 중 하나인 활성화 제 VII 인자와 결합하여 그의 프로테아제 활성을 중화시키는 반면, 쿠니쯔 2 영역은 혈액 응고 인자 중 다른 하나인 활성화 제 X 인자와 결합하여 그의 프로테아제 활성을 중화시킨다. 이들 작용은 초기 단계에서 혈액 응고 반응의 효율적인 억제에 함께 관여하는 것으로 믿어진다. N 말단 영역이 중요한 생리적인 작용을 나타내는지는 알려져 있지 않지만, C 말단 영역은 음전하를 갖는 글리코사미노글리칸, 그 중에서도 헤파린에 강하게 결합하는 것으로 알려져 있다. 인간 TFPI는 276개의 아미노산 잔기로 이루어지고, 분자량은 약 42,000이다.
TFPI의 아미노산 서열에 있어서는, 인간 [참조: Wun, T.-C. et al., J. Bio1. Chem., 263, p 6001 (1988)], 원숭이 [참조: Kamei. S. et al., J. Biochem., 115, p 705 (1994)] (인간 TFPI와의 상동성은 94%), 토끼 [참조:Wesselschmidt, R. L. et al. Nuc. Acids Res., 18, p 6440 (1990); Warn-Cramer, B.J. et al., Nuc. Acids Res., 20, p 3548 (1992)] (인간 TFPI와의 상동성은 72%), 쥐 [Enjyoji. K. et al., J. Biochem., 111, p 681 (1992)](인간 TFPI와의 상동성은 56%) 등이 보고되어 있다.
본 발명의 혈관 내피 세포 증식 억제제 및 혈관 신생 저해제의 유효 성분으로서 사용하는 TFPI는 인간을 포함한 포유 동물의 혈액 또는 배양 세포로부터 얻어지는 천연의 TFPI 및 유전자 재조합 기술에 의해서 제조되는 인간을 포함하는 포유 동물 유래의 유전자 재조합 TFPI의 어느 것이라도 좋다. 또한, 혈관 내피 세포의 증식 억제 및 혈관 신생의 저해 작용을 갖는 한, 혈액 또는 배양 세포 유래의 천연 TFPI 또는 유전자 재조합 기술에 의해서 제조되는 재조합 TFPI와 동등한 생리학적 활성을 갖고, TFPI의 아미노산 서열중의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 유도체도 본 발명에 포함된다. 특히, 이하의 실시예에 기재된 바와 같이, TFPI의 구조중의 C 말단 영역의 27 아미노산 잔기가 완전히 결실된 C 말단 영역 결손형 TFPI (TFPI-C)도 또한 전장형 TFPI (TFPI+C)와 같이 유의한 혈관 내피 세포의 증식 억제 작용 및 혈관 신생 저해 작용을 나타내는 것을 알 수 있으며, 이러한 C 말단 영역 결손형 TFPI도 또한 본 발명에 있어서 TFPI로서 사용할 수 있다. 본 발명의 혈관 내피 세포 증식 억제제 및 혈관 신생 저해제는 인간에게 투여하는 것이므로, 유효 성분인 TFPI도 인간 유래인 것이 면역 응답을 회피하여 안전성을 확보하는 데 있어서 특히 바람직하다.
본 발명의 TFPI의 제조 방법은 특별히 한정되지 않지만, 인간 등의 포유 동물로부터 얻은 혈액 또는 배양 세포부터의 분리 정제, 및 유전자 재조합 기술에 의한 제조가 포함된다. 그러나, 혈액으로부터 TFPI를 분리 정제하는 경우는 혈액중의 TFPI 함량이 대단히 적고(약 100 ng/mL), 대량으로 제조하는 것이 곤란하기 때문에, 유전자 재조합 기술에 의해서 제조하는 것이 바람직하다.
본 발명의 혈관 내피 세포 증식 억제제 및 혈관 신생 저해제는 유효 성분으로서 TFPI를 함유하고, 치료 목적이나 실제의 징후에 따라서 제약학상 허용되는 적당한 담체 (젤라틴 스폰지 등)나 부형제(인간 혈청 알부민, 당류 등)를 함유한다. 구체적인 투여형으로서는 TFPI에 공지의 적당한 부형제(인간 혈청 알부민, 당류 등), 안정화제(아미노산 등) 및 완충제(구연산 등)를 혼합한 건조 제제를 주사용수를 이용하여 용해한 것이 바람직하지만, 이것에 한정되지 않는다. TFPI를 저장하기 위하여, 동결 건조법 등의 방법을 이용하여 건조한 상태로 밀봉 보존하는 것이 약효를 최대한 유지하기 위해서 바람직하다. 이 경우, 공지의 적당한 부형제 또는 안정화제와 혼합하여도 좋다.
본 발명의 TFPI 함유 제제의 투여 경로는 특히 한정되지 않지만, 예를 들어, TFPI를 적당한 멸균 수성 매체중에 용해시킨 액제를 수술중에 환부 조직 내부에 직접투여하거나, 환부의 표면 또는 그 주변에 도포하거나, 거환약 또는 연속적인 투여를 통하여 정맥내, 피하, 피내, 근육내로 주입하는 투여 방법 등을 들 수 있고, 점안법도 채용할 수 있다. 별법으로, 용해시키지 않고 TFPI의 분말을 환부에 직접 투여하는 방법도 선택할 수 있다. 더욱이, TFPI를 발현하기 위해 만들어진 유전자가 도입된 적당한 발현 벡터를 환부에 직접 가함으로써 TFPI를 환부에서 과잉 발현시키는 방법도 선택 가능하다. 또한, 항암제, 면역 억제제, 항염증제, 당뇨병 치료제, 항생 물질 등의 다른 약제와 병용하여도 좋다.
본 발명의 혈관 내피 세포 증식 억제제 및 혈관 신생 저해제의 유효 성분인 TFPI의 유효 투여량은 투여 경로 또는 투여 방법 등에 의해 다양할 수 있지만, 신생 혈관의 내부에 존재하는 혈액의 TFPI 농도가 5㎍/㎖에서 80㎍/㎖의 범위가 바람직하다.
이하, 본 발명의 이해를 깊게하기 위해서 실시예의 수단에 의해 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것이 아니다.
제조예
TFPI의 제조
다음의 실시예에서 사용된 TFPI는 가메이 등(Kamei et al., 일본 특허 공보 79774/1995호)이나 엔죠지 [Enjyogi, Biochem., 34, p5725 (1995)]의 방법에 따라, 항-TFPI 모노클로날 항체 (HTFPI-K9 (통산산업성 공업기술원 미생물공업기술연구소 기탁번호 제14467호))를 결합시킨 겔과 헤파린 겔(Pharmacia-LKB)에 의한 친화 크로마토그래피를 사용하여 인간 TFPI의 cDNA가 도입된 차이니즈 햄스터 난소 세포주의 배양 상층액으로부터 정제하였다. 배양 상층액은 전장형 TFPI(TFPI+C)와 C-말단 영역 결손형 TFPI(TFPI-C)를 포함한다. 이 두 타입의 TFPI는 헤파린 겔을 사용하여 친화 크로마토그래피시키고 염화나트륨의 농도 구배 용출을 행함으로써 분리 정제할 수 있다. 이 방법으로 얻어진 전장형 TFPI(TFPI+C) 및 TFPI의 C-말단의 27 아미노산 잔기가 결손된 C-말단 영역 결손 TFPI를 다음의 실시예에서 검토하였다.
실시예 1
전장형 TFPI의 인간 혈관 내피 세포의 증식에 대한 억제 효과
내피 세포는 구라보사(Kurabo Industries Ltd.)로부터 구입한 3 계대력의 인간 제대 정맥 혈관 내피 세포(HUVEC)를 사용하였다. 증식용 배지는 구라보사 제조 E-GM 배지(2% 소태아혈청, 10 ng/ml 인간 상피 성장 인자, 1㎍/㎖ 하이드로코르티손, 0.4% 소뇌 추출물, 10㎍/㎖ 헤파린, 및 항균제를 포함하는 변형 MCDB131 배지)를 사용하였다.
E-GM 배지에 현탁시킨 내피 세포를 2,500 세포/웰의 세포 밀도로 48 웰 배양 플레이트 (Iwaki Glass K.K. 제조)에 접종하여, 37℃의 CO2인큐베이터에서 배양시켰다. 접종 2일 후, 배양 배지를 각종 농도(0, 10, 20, 및 40㎍/㎖)의 전장형 TFPI(TFPI+C)를 포함하는 새로운 E-GM 배지로 교환하여, 이후 매 2일 마다 새로운 동배지로 배지 교환하면서 배양을 계속하였다. 배지량은 웰당 0.3㎖로 하였다. 접종 6일 후, 플레이트 상에 증식한 세포를 통상의 방법에 따라서 트립신/EDTA 용액을 처리하여 박리시킨 뒤, 코울터 카운터 (Coulter사 제조)를 사용하여 1 웰당 세포수를 계측하였다.
도 1은 각 군 3웰의 세포수의 평균치와 표준 편차를 그래프로 나타낸 것이다. TFPI의 첨가에 의해서 농도 의존적으로 내피 세포의 증식이 유의(스튜던트t 검정, 유효 수준 1%)하게 억제되었다.
실시예 2
전장형 TFPI 및 C 말단 영역 결손형 TFPI의 인간 혈관 내피 세포에 대한 증식 억제 효과
인간 혈관 내피 세포 증식에 대한 억제 효과를 전장형 TFPI(TFPI+C)의 헤파린 결합 영역인 C 말단 염기성 아미노산 서열(27 아미노산)이 결손된 C 말단 영역 결손형 TFPI(TFPI-C)에 대하여 검사하였다. 증식 배지인 E-GM 배지에 현탁시킨 내피 세포를 2,500 세포/웰의 세포 밀도로 48웰 배양 플레이트에 접종하여, 37℃의 CO2인큐베이터에서 배양하였다. 접종 2일 후, 배양 배지를 각종 농도(0, 5, 10, 20, 40, 및 80㎍/㎖)의 전장형 TFPI(TFPI+C), 또는 동 농도의 C 말단 영역 결손형 TFPI(TFPI-C)를 포함하는 새로운 E-GM 배지로 교환하였다. 이후 매 2일 마다 새로운 배지로 교환하면서 배양을 계속하였다. 배양 배지량은 웰당 0.3 ㎖로 하였다. 접종 6일 후, 플레이트 상에 증식된 세포를 통상적인 방법으로 트립신/EDTA 용액으로 처리하여 박리한 뒤, 코울터 카운터(Coulter사 제조)를 이용하여 1 웰 당 세포수를 계측하였다.
도 2는 전장형 TFPI(TFPI+C) 첨가군 및 C 말단 영역 결손형 TFPI(TFPI-C) 첨가군의 세포수의 평균치와 표준 편차를 그래프로 나타낸 것이다(각 군당 4 웰로 구성됨). 그 결과, 두 타입 모두의 TFPI는 농도 의존적으로 내피 세포의 증식을 유의성(스튜던트 t-검정, 유효 수준 1%)있게 억제하는 것이 판명되어, TFPI는 전장형이 아니더라도 내피 세포의 증식을 억제할 수 있는 것으로 나타났다.
실시예 3
증식을 정지시킨 혈관 내피 세포에 대한 TFPI의 효과
혈관 내피 세포를 증식 인자를 포함하지 않는 배양 배지(Kurabo Industries Ltd.제조, 기초 배지 HuMedia-EB에 2% 소태아 혈청 및 항균제를 첨가한 것)로 배양하여, 세포 증식이 생기지 않는 조건하에서의 TFPI의 효과를 검토하였다.
증식 인자를 첨가하지 않은 배지에 현탁시킨 내피 세포를 10,000 세포/웰의 세포 밀도로 48웰 배양 플레이트에 접종하여, 37℃의 CO2인큐베이터에서 배양하였다. 접종 2일 후, 배양 배지를 각종 농도(0, 5, 10, 20, 40, 및 80㎍/㎖)의 전장형 TFPI(TFPI+C), 또는 동 농도의 C 말단 영역 결손형 TFPI(TFPI-C)를 포함하는 동 배지로 교환하였다. 세포를 2일 더 배양한 후, 플레이트 상에 증식된 세포를 트립신/EDTA 용액으로 처리하여 박리한 뒤, 코울터 카운터를 이용하여 1 웰 당 세포수를 계측하였다.
도 3에 TFPI의 농도와 플레이트 상의 세포 수와의 관계를 나타내었다. 각 군은 4웰로 이루어지며, 세포 수는 그 평균치와 표준 편차로 나타냈다. 그 결과, 두 타입 모두의 TFPI는 농도 의존적으로 혈관내피 세포수의 증식을 유의성(스튜던트 t-검정, 유효 수준 1%)있게 감소시켰다.
이 결과로부터, TFPI는 내피 세포의 증식 억제 작용에 더하여 증식이 정지된 내피 세포에 대하여도 그 기능을 저해하는 것으로 판명되었다. 즉, TFPI는 병적인 신생 혈관의 진행 방지 뿐만아니라, 이미 형성된 신생 혈관에 대해서도 작용하여그 퇴축을 촉구하는 가능성이 나타났다.

Claims (5)

  1. 조직 인자 응고계 억제제를 유효 성분으로 포함하는 혈관 내피 세포의 증식에 의해 야기되는 혈관 신생병을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  2. 조직 인자 응고계 억제제를 유효 성분으로 포함하는 혈관 내피 세포의 증식에 의해 야기되는 혈관 신생의 저해제.
  3. 제2항에 있어서, 혈관 내피 세포의 증식에 의해 야기되는 혈관 신생병을 예방 또는 치료하기 위한 저해제.
  4. 제2항 또는 3항에 있어서, 혈관 신생병이 악성 종양, 당뇨병성 망막증, 수정체후방 섬유 증식, 혈관 신생성 녹내장, 건선, 섬유성 혈관종, 면역성 및 비면역성 염증, 아테롬성 동맥경화증 플라크 안에서의 모세혈관의 증식, 혈관종, 또는 카포시육종인 저해제.
  5. 제4항에 있어서, 면역성 및 비면역성 염증이 류마티스성 관절염인 저해제.
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