WO2019027034A1 - 新規ポリペプチド及びその用途 - Google Patents

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WO2019027034A1
WO2019027034A1 PCT/JP2018/029183 JP2018029183W WO2019027034A1 WO 2019027034 A1 WO2019027034 A1 WO 2019027034A1 JP 2018029183 W JP2018029183 W JP 2018029183W WO 2019027034 A1 WO2019027034 A1 WO 2019027034A1
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chr
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隆之 池添
剛一 本田
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公立大学法人福島県立医科大学
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    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links

Definitions

  • the present invention relates to novel polypeptides and their uses.
  • Sepsis, ischemia / reperfusion injury, stroke, ischemic stroke, acute myocardial infarction, acute neurodegenerative disease, Alzheimer's disease, Down's syndrome, Huntington's disease, myotrophic lateral sclerosis, Parkinson's disease, pressure sore, wound, obstructive Cells are damaged by various diseases and treatments such as arterial disease, arteriosclerosis, hyperlipidemia, diabetes, obesity, organ transplantation, chemotherapy, immunosuppressive drugs, and radiation injury.
  • Thrombomodulin is known as one of the proteins having cytoprotective activity.
  • Thrombomodulin is known as a substance that specifically binds to thrombin and inhibits the blood coagulation activity of thrombin and at the same time significantly promotes the protein C activating ability of thrombin, and is known to have a potent blood coagulation inhibitory action. It is done. It is also known to prolong the clotting time by thrombin and to inhibit platelet aggregation by thrombin.
  • Protein C is a vitamin K-dependent protein that plays an important role in the blood coagulation and fibrinolytic system, and is activated by the action of thrombin to become activated protein C.
  • This activated protein C inactivates the active factor V of the blood coagulation system and active factor VIII in vivo, and is known to be involved in the production of a plasminogen activator having a thrombolytic action. (Non-Patent Document 1).
  • the mature thrombomodulin from which the signal peptide is cleaved has a N-terminal region from the N-terminal side of the mature polypeptide (D1, 1-226th: position indication when the signal peptide is considered to be 18 amino acid residues, the following The same, the region with six EGF-like structures (D2, 227-462), O-type glycosylation region (D3, 463-498), transmembrane region (D4, 499-521), and intracytoplasmic It consists of five areas (D5, 522-557).
  • the portion having the same protein C activation promoting activity as full-length thrombomodulin is a portion (E456) consisting mainly of the fourth, fifth, and sixth EGF-like structures from the N-terminal side among the regions having six EGF-like structures It is known (non-patent document 2).
  • the portion (E 45) consisting of the EGF-like structures from the N-terminal side to the 4th and 5th from the N-terminal side it is lower than full-length thrombomodulin, but the protein C activation promoting activity It is known that it has (nonpatent literature 3).
  • Soluble thrombomodulin (D123), consisting only of three regions, an N-terminal region, a region with six EGF-like structures and an O-type glycosylation region, is a phase III clinical trial for patients with hematologic malignancies and infections DIC. Tests have been conducted and shown to be superior in efficacy and safety to unfractionated heparin therapy and have clinical application as a universal intravascular blood coagulation (DIC) treatment. D123 is known to have cytoprotective activity (Non-patent Document 4).
  • D123 and E45 have been known to have cytoprotective activity and anticoagulant activity that binds to thrombin and promotes protein C activation, but when a substance having anticoagulant activity is administered to the body, It is known that there is a risk of side effects of bleeding.
  • activated protein C APC
  • Non-patent Document 5 an E5 polypeptide consisting of 40 amino acid residues was provided as a partial polypeptide of E45 (Patent Document 1).
  • This polypeptide (E5) has a cytoprotective activity equal to or higher than that of E45, and has an activity of promoting very little protein C activation, that is, a very low anticoagulant activity.
  • E5 is a polypeptide consisting of 40 amino acid residues having the following sequence and has three partial structures each having a loop structure, that is, E5-A consisting of 11 amino acid residues (herein referred to as “KAF04” Some), E5-B consisting of 11 amino acid residues (sometimes referred to herein as “KAF05”), and E5-C consisting of 19 amino acid residues (sometimes referred to herein as "KAF06”) It has been clarified that it consists of
  • the object of the present invention was to identify the partial structure responsible for the active expression of E5, and it is a partial polypeptide of E5, which has a strong cytoprotective action, and the protein C activation promoting action is sufficiently reduced. It is about providing a polypeptide.
  • Another object of the present invention is to identify an amino acid residue contributing to activity in the partial polypeptide of E5 having the above-mentioned characteristics, and to provide a mutant E5 partial polypeptide having similar activity.
  • the present inventors studied the relationship between the structure and activity of E5 in order to identify the partial structure responsible for the active expression of E5, and E5-C (sometimes called KAF06, TME5C) contributes to the activity of E5 I found that it was a partial structure.
  • E5-C sometimes called KAF06, TME5C
  • the present inventors further studied and found a polypeptide consisting of 18 amino acid residues excluding the N-terminal glutamate acid residue (E) of E5-C (herein, this polypeptide is referred to as “KAF12 It has been found that “a” is the smallest active unit contained in E5. Furthermore, the desired activity is preserved in a specific mutant polypeptide in which amino acid residues and loop structure are changed in this KAF12, and blood is It has been found that the anticoagulant effect can be sufficiently reduced The present invention has been completed based on the above findings.
  • the polypeptide represented by X 1 CPEGYILDDGX 2 ICTDIDE (wherein the amino acid residue is indicated by a single letter code, provided that the second cysteine residue from the N-terminus (C) and the 14th from the N-terminus) Cysteine residues (C) form an S—S bond and are linked to each other, and the S—S bond is CHR 1 —CHR 2 (R 1 and R 2 each independently represent a hydrogen atom, 1 to carbon atoms 4 may be substituted by a group represented by alkyl group, halogen atom, hydroxyl group or amino group); X 1 is absent or glutamic acid residue (E) or aspartic acid residue (D X 2 represents a phenylalanine residue, an alanine residue, or a tyrosine residue) or a salt thereof.
  • the second N-terminal cysteine residue (C) and the N-terminal 14th cysteine residue (C) form an S—S bond and are linked to each other as described above
  • a polypeptide or a salt thereof is provided.
  • a polypeptide represented by ECPEGYILDDGFICTDIDE (KAF06: wherein an amino acid residue is indicated by a single letter code, provided that the second cysteine residue from the N terminus (C) and the 14th cysteine residue from the N terminus (C And the salt thereof
  • a polypeptide represented by CPEGYILDDGFICTDIDE (KAF12: wherein an amino acid residue is indicated by a single letter code), provided that the N-terminal cysteine residue is The group (C) and the 13th N-terminal cysteine residue (C) are linked to each other by an S—S bond or a salt thereof is provided.
  • the polypeptide represented by ECPEGYILDDGAICTDIDE (KAF24) or a salt thereof, the polypeptide represented by ECPEGYILDDGYICTDIDE (KAF37) or a salt thereof, the polypeptide represented by CPEGYILDDGAICTDIDE (KAF124) or a salt thereof and a polypeptide (KAF137) represented by CPEGYILDDGYICTDIDE or a salt thereof, wherein the amino acid residue is indicated by a single letter code, and two cysteine residues (C) form an S-S- bond Together)).
  • a pharmaceutical composition comprising any of the above-mentioned polypeptides or salts thereof as an active ingredient; the above-mentioned pharmaceutical composition for the prevention and / or treatment of cell disorders; vascular endothelial cell disorders
  • the above-mentioned pharmaceutical composition for treatment is provided.
  • any of the above-described polypeptides or salts thereof for the production of the above-mentioned pharmaceutical composition; a method for preventing and / or treating cell damage, which is any of the above-mentioned polypeptides Or a method comprising the step of administering a salt thereof to a mammal including human; a method for preventing and / or treating a vascular endothelial cell disorder, wherein any one of the above-mentioned polypeptides or a salt thereof is administered to a mammal including human
  • the method comprising is provided
  • X 1 CPEGYILDDGX 2 A polypeptide represented by ICTDIDE (wherein the amino acid residue is indicated by a single letter code, provided that the second cysteine residue from the N terminus (C) and the 14th cysteine residue from the N terminus)
  • the group (C) forms an S—S bond and is bonded to each other, and the S—S bond is CHR 1 —CHR 2 (R 1 and R 2 each independently represent a hydrogen atom, alkyl having 1 to 4 carbon atoms Group represented by group, halogen atom, hydroxyl group or amino group) may be substituted;
  • X 1 is absent or indicates glutamic acid residue (E) or aspartic acid residue (D)
  • X 2 represents a phenylalanine residue, an alanine residue, or a tyrosine residue) or a salt thereof.
  • a polypeptide represented by ECPEGYILDDGFICTDIDE (wherein the amino acid residue is indicated by a single letter code, provided that the second cysteine residue from the N terminus (C) and the 14th cysteine residue from the N terminus (C) Are bonded to each other by forming an S—S bond, and the S—S bond is CHR 1 —CHR 2 (R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a halogen atom , A hydroxyl group, or an amino group)) or a salt thereof.
  • a polypeptide represented by CPEGYILDDGFICTDIDE (wherein the amino acid residue is indicated by a single letter code, provided that the N-terminal cysteine residue (C) and the thirteenth N-terminal cysteine residue (C) are S-
  • the S—S bond is CHR 1 —CHR 2 (R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a halogen atom, a hydroxyl group, or an amino group Or a salt thereof which may be substituted with a group represented by
  • polypeptides Any one of the following polypeptides: A polypeptide represented by ECPEGYILDDGAICTDIDE, a polypeptide represented by ECPEGYILDDGYICTDIDE, a polypeptide represented by CPEGYILDDGAICTDIDE, or a polypeptide represented by CPEGYILDDGYICTDIDE (wherein the amino acid residue is indicated by a single letter code, and two cysteine residues remain
  • the group (C) forms an S—S— bond and is bonded to each other, and the S—S bond is a CHR 1 —CHR 2 group (R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom, 1 to 4 carbon atoms Or a salt thereof which may be substituted with a group represented by alkyl group, halogen atom, hydroxyl group or amino group).
  • [6-6] The polypeptide or the salt thereof according to the above-mentioned [4], wherein the S—S bond is replaced with a group represented by CH 2 —CH 2 .
  • [6-9] The polypeptide or the salt thereof according to the above [6-6], which is a polypeptide represented by CPEGYILDDGAICTDIDE.
  • a pharmaceutical composition comprising the polypeptide of any one of [1] to [6] or a salt thereof as an active ingredient.
  • Prevention and / or treatment of one or more disorders selected from the group consisting of cytopathies, vascular endothelial cell disorders, gastrointestinal epithelial cell disorders, tracheal epithelial cell disorders, alveolar epithelial cell disorders, and epidermal cell disorders The pharmaceutical composition according to [7] above.
  • the polypeptide or a salt thereof provided by the present invention has excellent cytoprotective activity and has sufficiently reduced anticoagulant activity. Therefore, the pharmaceutical composition containing the above-mentioned polypeptide as an active ingredient can almost completely reduce the risk of bleeding while sufficiently exerting the desired medicinal effects.
  • FIG. 6 shows the Mcl-1 induced cytoprotective effect of the polypeptide of the present invention. It is the figure which showed the vascular permeability enhancement inhibitory effect of the polypeptide of this invention.
  • FIG. 5 is a diagram showing the pro-angiogenic activity of the polypeptide of the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram showing the pro-angiogenic activity of the polypeptide of the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram showing the prophosphorylation action of ERK, Akt and p38 of the polypeptide of the present invention. It is the figure which showed the result of having evaluated the cytoprotective effect of polypeptide of this invention by the mouse SOS model. It is the figure which showed the hepatic dysfunction inhibition effect of the polypeptide of this invention. It is the figure which showed the hepatic dysfunction inhibition effect of the polypeptide of this invention. It is the figure which showed the vascular endothelial cell injury inhibitory effect of polypeptide of this invention.
  • FIG. 6 shows prothrombin time and activated partial thromboplastin time of the polypeptide of the present invention.
  • the present invention provides a polypeptide represented by X 1 CPEGYILDDGX 2 ICTDIDE or a salt thereof.
  • amino acid residues are indicated by the commonly used single-letter code, A is an alanine residue, D is an aspartic acid residue, C is a cysteine residue, E is a glutamic acid residue, and G is a glycine residue A group, I is an isoleucine residue, L is a leucine residue, P is a phenylalanine residue, and T is a threonine residue.
  • the second cysteine residue (C) from the N-terminus and the 14th cysteine residue (C) from the N-terminus are linked to each other by forming an S—S bond.
  • the S—S bond is a group represented by CHR 1 —CHR 2 (R 1 and R 2 each independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a halogen atom, a hydroxyl group, or an amino group) It may be replaced.
  • the alkyl group include methyl group, ethyl group, n-propyl group and isopropyl group. It is preferred that both R 1 and R 2 are hydrogen atoms.
  • X 1 is absent or indicates a glutamic acid residue (E) or an aspartic acid residue (D)
  • X 2 is a phenylalanine residue (P), an alanine residue (A), or a tyrosine residue (Y) Show.
  • polypeptides of the present invention as a preferred polypeptide, the polypeptide represented by ECPEGYILDDGFICTDIDE (KAF06 polypeptide: second cysteine residue from the N terminus (C) and cysteine residue from the N terminus (C) Are linked to each other to form an S—S bond, and a polypeptide represented by CPEGYILDDGFICTDIDE (KAF12 polypeptide: N-terminal cysteine residue (C) and N-terminal cysteine residue (C) And the like) can be mentioned which are linked to each other by forming an S—S bond.
  • ECPEGYILDDGFICTDIDE KAF06 polypeptide: second cysteine residue from the N terminus (C) and cysteine residue from the N terminus (C)
  • CPEGYILDDGFICTDIDE KAF12 polypeptide: N-terminal cysteine residue (C) and N-terminal cysteine residue (C) And the like
  • the KAF06 polypeptide is a polypeptide corresponding to E5-C which is a partial structure of E5, and the KAF12 polypeptide is a polypeptide from which the glutamate residue (E) at the N-terminus of the KAF06 polypeptide has been removed.
  • Two cysteine residues (C) form an S—S bond and are linked to each other by crosslinking (shown below is a KAF06 polypeptide, and in the case of a KAF12 polypeptide, a glutamate residue (E) at the N-terminus) Does not exist).
  • polypeptide represented by ECPEGYILDDGAICTDIDE KAF24 polypeptide
  • polypeptide represented by ECPEGYILDDGYICTDIDE KAF37 polypeptide
  • polypeptide represented by CPEGYILDDGAICTDIDE KAF124 polypeptide
  • KAF137 polypeptide a table by CPEGYILDDGYICTDIDE And the polypeptide.
  • the two cysteine residues present in these polypeptides form SS bonds and are linked to one another by crosslinking.
  • the polypeptide of the present invention is not limited to the specific polypeptide described above.
  • the polypeptides of the invention may be in the form of a salt.
  • the form of the salt is not particularly limited, and may be either an acid addition salt or a base addition salt, and any salt form can be selected.
  • the polypeptide of the present invention has a cytoprotective activity and a reduced activation promoting effect of protein C.
  • the polypeptide of the present invention is characterized in that the desired pharmacological action and side effects are almost completely separated, since it has cytoprotective activity and the protein C activation promoting action is sufficiently reduced. is there. Therefore, the polypeptide of the present invention can fully suppress the anticoagulant action of blood while strongly exerting a cytoprotective action such as cell death inhibitory activity, and thus almost completely avoids bleeding side effects.
  • the desired treatment can be performed.
  • the cytoprotective activity includes, for example, one or more activities selected from the group consisting of cell death inhibitory activity, cell permeability enhanced inhibitory activity, angiogenesis promoting activity, cell proliferation promoting activity, and cell function maintenance activity. But not limited thereto.
  • the cytoprotective activity is not particularly limited as long as it has at least one of the above, but it is preferable to have two or more activities, and it is preferable to have all the activities.
  • Cell death inhibitory activity can be confirmed by measuring the anti-apoptotic activity of cells.
  • Apoptosis has been regarded as active cell death that actively removes unwanted cells and damaged cells caused by physiological and pathological factors, but is also involved in cell death associated with various pathological conditions, and It has become clear that cell damage is caused. Therefore, suppressing apoptosis is effective to suppress cell death and to inhibit the development of cell damage. Since the signal transduction pathway involved in apoptosis is composed of many molecules such as apoptosis promoting molecule and suppression molecule, it can not generally suppress all apoptotic activities at one time.
  • the anti-apoptotic activity is an activity that suppresses apoptosis induced when cells and the like are treated with a substance that causes apoptosis, and exhibits an inhibitory activity of an apoptosis promoting molecule and an increasing activity of an apoptosis inhibitory molecule.
  • it is a kind of anti-apoptotic molecule against human umbilical vein endothelium, that is, a kind of anti-apoptotic protein by the test method described in Non-patent Document 4.
  • the anti-apoptotic activity is not particularly limited as long as it exhibits an effect of preventing cell death, but the expression induction of Mcl-1 is preferably twice or more compared to the expression in cells without stimulation. And 5 times or more is more preferable, and 8 times or more is more preferable.
  • the cell permeabilization inhibitory activity can be confirmed by measuring the suppression activity to the cell permeabilization caused by stimulating a specific cell with various starters.
  • Cell permeability enhancement refers to inflammation as a biological defense reaction against tissue damage caused by various stimuli from the outside world, and in addition to mechanical causes, cytokines and chemical mediators induced by tissue damage and inflammatory reaction, etc. Shows that the barrier mechanism between cells is broken and that the junction between cells opens up so that substances can easily pass between cells.
  • white blood cells which are one of the cellular components, adhere to the cells, flatten their shape and infiltrate through the interstices of the cells.
  • the white blood cells take in bacteria and foreign substances that have invaded into the tissue by phagocytosis, and digest and decompose them to detoxify, and remove necrotic cells.
  • phagocytosis phagocytosis
  • cell hyperpermeability disappears, and at the same time, cell repair also starts and returns to the original normal state.
  • tissue damage occurs repeatedly or in case of inflammation due to autoimmune abnormality
  • new inflammation starts at the same time as tissue repair, so inflammation continuously occurs, resulting in chronic inflammation and dysfunction.
  • Endothelial cells for which cell hyperpermeability is a particular problem are endothelial cells and epithelial cells.
  • the endothelium consists of a thin layer of endothelial cells.
  • the layer of endothelial cells forms, inter alia, a barrier between the blood and the outer wall of the blood vessel, as well as the inner surface of the blood vessel, such as veins and capillaries.
  • Endothelial cells line the entire vasculature, from the large blood vessels to the smallest capillaries.
  • Epithelial cells form a monolayer or multi-layered cell layer covering all internal and external body surfaces of human and animal organs. Epithelial cells, in close proximity to one another, are rich in cell adhesion.
  • Epithelial cells can be distinguished apically to the lateral, external or lumen, and basolateral. Furthermore, epithelial cells have an adhesion complex (binding complex) consisting of a closed zone (tight junction), an adhesive zone (adhesive junction), and a desmosome (adhesion patch), which on the other hand show a physicochemical barrier. On the other hand, adjacent epithelial cells are linked to each other.
  • binding complex binding complex consisting of a closed zone (tight junction), an adhesive zone (adhesive junction), and a desmosome (adhesion patch), which on the other hand show a physicochemical barrier.
  • adjacent epithelial cells are linked to each other.
  • Angiogenesis promoting activity can be confirmed using a general angiogenesis evaluation method.
  • vascular diseases such as the heart and the brain account for the majority of causes of death, and reduction in mortality due to vascular diseases and improvement in the quality of life of survivors are considered as one of the important themes of medical treatment.
  • angiogenesis therapy for patients with severe chronic lower extremity ischemia such as obstructive arteriosclerosis (arteriosclerosis obliterans; ASO) as a serious disease is actively performed as a treatment model.
  • ASO obstructive arteriosclerosis
  • the angiogenesis promoting activity is confirmed both in vitro and in vivo by the test method described in Non-Patent Document 4, for example, as described in Example (5) of JP-A-2015-63498. be able to.
  • the promoting activity of luminal formation of cultured vascular endothelial cells can be evaluated by the length of lumen and the number of branch points.
  • the hemoglobin content in the gel can be evaluated by mouse Matrigel subcutaneous transplantation.
  • the cell growth promoting activity can be confirmed by a general method of measuring cell accelerating activity.
  • the cells to be evaluated are preferably, but not limited to, endothelial cells and epithelial cells.
  • the cell growth promoting activity can be confirmed by the test method described in Non-Patent Document 4, for example, as described in Example (7) of JP-A-2015-63498.
  • the cell function maintenance activity can be confirmed by a general method that a specific cell function is maintained.
  • a specific cell function is maintained.
  • the function of vascular endothelial cells can be evaluated by NO production promoting activity (Non-patent Document 4).
  • the action of promoting activation of protein C in the polypeptide of the present invention is described, for example, in JP-A-64-6219, as described in Example (9) of JP-A-2015-63498. It can be easily confirmed by measuring the amount of activity of the action promoting protein C activation and the presence or absence thereof by the test method clearly described in various known documents including the official gazette.
  • the action to promote the activation of protein C, that is, the anticoagulant action is preferably 1/10 or less, more preferably 1/100 or less, and more preferably 1/1000 or less of the anticoagulant activity of D123. It is more preferable to be present, and it is particularly preferable to be below the detection limit. In another embodiment, it is preferred that there be no anticoagulant effect.
  • the polypeptide in this embodiment is selected from the group consisting of cell death inhibitory activity, cell permeability enhanced inhibitory activity, angiogenesis promoting activity, cell proliferation promoting activity, and cell function maintenance activity as cytoprotective activity. It is preferable to have the above activity, it is more preferable to have 2 or more activities, and it is particularly preferable to have all the activities.
  • the polypeptide of the present invention can be produced by chemical synthesis or by genetic engineering using a microorganism such as E. coli. It is preferable to use a host-vector system suitable for microorganisms such as E. coli in the genetic engineering process and the polypeptide production process.
  • the isolation and purification method of the culture supernatant obtained as described above or the polypeptide from the culture may be carried out according to a known method (for example, Takeo Horio, Basic Experiment for Proteins and Enzymes, 1981) it can.
  • a known method for example, Takeo Horio, Basic Experiment for Proteins and Enzymes, 1981
  • affinity chromatography utilizing specific affinity to a polypeptide is also mentioned as a preferred example.
  • the polypeptide can be purified using a His tag purification kit (eg, manufactured by MBL).
  • the degree of purification can be selected according to the purpose of use, etc.
  • the results of electrophoresis, preferably SDS-PAGE can be obtained as a single band, or the results of gel filtration HPLC or reverse phase HPLC of isolated and purified products are single. It is preferable to purify to the peak of, but it is not required to obtain a single band.
  • the polypeptide in this embodiment is selected from the group consisting of cell death inhibitory activity, cell permeability enhanced inhibitory activity, angiogenesis promoting activity, cell proliferation promoting activity, and cell function maintenance activity as cytoprotective activity.
  • a sugar chain or polyethylene glycol (PEG) chain may be added as long as it has the above activity.
  • D-form amino acid may be contained in at least a part of the amino acids constituting the polypeptide. These may be preferable in terms of high in vivo stability.
  • the sugar chain is capable of binding to the N-terminal, C-terminal or an amino acid between them, but is preferably linked to the N-terminal or C-terminal in order not to inhibit the activity of the polypeptide.
  • the number of sugar chains to be added is preferably one or two, and is preferably one.
  • the sugar chain is preferably monosaccharide to tetrasaccharide, and more preferably disaccharide or trisaccharide.
  • the sugar chain can be linked to the free amino group or carboxyl group of the polypeptide directly or through a spacer structure such as a methylene chain having about 1 to 10 carbon atoms.
  • PEG chain addition in a polypeptide can be performed by a known method (Ulbricht K et. Al. Clin Nephrol. 2006 Mar; 65 (3): 180-90).
  • the PEG chain can be linked to the N-terminus, C-terminus or an amino acid between them, and usually, one or two PEG chains are linked to free amino group or carboxyl group on the polypeptide.
  • the molecular weight of the PEG chain is not particularly limited, but usually about 3000 to about 7000, preferably about 5000.
  • Making at least a part of the amino acids constituting the polypeptide into the D form can be performed by a known method (Brenneman DE et. Al. J Pharmacol Exp Ther. 2004 Jun; 309 (3): 1190-7).
  • some of the amino acids that constitute the polypeptide may be D-form, it may be preferable that all of the amino acids that constitute the polypeptide be D-form amino acids so as not to inhibit the activity of the polypeptide as much as possible. .
  • polypeptide in the present embodiment can also be easily produced by conventional methods such as chemical synthesis using a commercially available peptide synthesizer. Also, the above-mentioned stabilization modification can be easily carried out by known methods as described in the above-mentioned respective documents.
  • the polypeptide according to one aspect of the present invention in which the SS bond formed by two cysteine residues in the polypeptide of the present invention is replaced with a group represented by CHR 1 -CHR 2 is, for example, )
  • the compound or a compound in which the amino group or the carboxyl group in the formula (I) is appropriately protected
  • the compounds of formula (I) can be manufactured by known methods or based on the common general knowledge of the person skilled in the art.
  • a compound (2,7-diaminosuberic acid) in which both R 1 and R 2 are hydrogen atoms can be produced by a known method (Mori Hiroshi, Japan Chemical Journal, Vol. 82, No. 10, 1961) Can be manufactured by
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising the above polypeptide of the present invention as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition in the present embodiment has a cytoprotective action, and improves the cell damage caused by hypoxia, physical factors (such as trauma, heat, radiation, etc.), infection, toxin, or inflammation. Can be used to
  • Cell damage is defined as exposure to external factors or internal factors beyond the limit of adaptation (reversibility) and leading to cell death. That is, inflammation is induced as a bioprotective reaction against tissue damage caused by various stimuli from the outside world and the autologous inflammatory factor that accompanies it, and cytokines and cytokines induced by tissue damage and inflammation It refers to a condition in which the barrier mechanism between cells is broken by chemical mediators and the like, cell permeability is enhanced, and cell death such as apoptosis is induced to cause cell dysfunction.
  • Examples of cell disorders include sepsis, ischemia / reperfusion injury, stroke, ischemic stroke, acute myocardial infarction, acute neurodegenerative disease, Alzheimer's disease, Down's syndrome, Huntington's disease, muscle atrophy lateral sclerosis, Parkinson's disease, hemorrhoids
  • Examples include disorders that the cells receive due to various diseases and treatments, such as wounds, obstructive arterial disease, arteriosclerosis, hyperlipidemia, diabetes, obesity, organ transplantation, chemotherapy, immunosuppressants, and radiation disorders.
  • the pharmaceutical composition according to the present embodiment can prevent and / or treat these cell disorders by having a cytoprotective action.
  • the prevention and / or treatment of a cell disorder also includes the prevention and / or treatment of a disease caused by a cell disorder.
  • the cell damage in the present embodiment is not particularly limited as long as it is a cell damage caused by hypoxia, physical factors (such as trauma, heat, radiation, etc.), infection, toxin, or anti-inflammation, etc.
  • Epidermal cell disorders, gastrointestinal epithelial cell disorders, tracheal epithelial cell disorders, or alveolar epithelial cell disorders are exemplified.
  • vascular endothelial cells are activated by factors such as hypertension, hyperglycemia, dyslipidemia, smoking, insulin resistance, inflammatory cytokines, thereby enhancing vascular endothelial cell permeability and causing harm in blood. It can not prevent substances from entering blood vessels, and it can not maintain the homeostasis of blood vessels by participating in signal transduction and immune responses of various cells, tissues, and organs. Increased vascular permeability causes swelling and swelling of the blood vessels due to dilation of blood vessels, accompanied by fever and pain caused by pyrogens and pain-causing agents.
  • vascular endothelial cell injury diseases resulting from vascular endothelial cell injury include sepsis, ischemia / reperfusion injury, stroke, ischemic stroke, acute myocardial infarction, obstructive arterial disease, arteriosclerosis, hyperlipidemia, diabetes, sinus occlusion syndrome Hemolytic uremic syndrome, thrombotic microangiopathy, disseminated intravascular coagulation, systemic capillary leak syndrome are exemplified.
  • the pharmaceutical composition in the present embodiment can be used for the prevention and / or treatment of these diseases.
  • epidermis On the surface of the skin is the epidermis, which is mainly formed of epidermal cells, and plays a role as a barrier to protect the body from water retention in the body and bacteria and stimuli in the external world.
  • Epidermal cell injury is affected by physical factors (such as trauma, heat, external force, radiation, etc.), stress, neuropeptides, histamine, infection, etc., and so-called barrier functions such as increased skin permeability and decreased infection protection ability Impaired, the ability to retain water in the stratum corneum is impaired, and it is easy for an external stimulus, bacteria, and allergens to enter, which further induces inflammation, resulting in skin dysfunction. Microcirculatory failure of skin tissue may lead to cell necrosis.
  • Examples of diseases caused by epidermal cell disorders include lupus and atopic dermatitis.
  • the pharmaceutical composition in the present embodiment can be used for the prevention and / or treatment of these diseases.
  • Gastrointestinal epithelial cell injury refers to immune reactions, drugs, toxins, and radiation, which increase the permeability of the gut epithelial cells and damage the gut barrier, thereby preventing foreign matter and enteric bacteria from invading them. A state in which immune system cells react and cause inflammation.
  • diseases caused by gastrointestinal epithelial cell disorders include radiation disorders and inflammatory bowel diseases.
  • Abnormal expression of a protein important for cell junctions has been observed in the digestive tract epithelium of patients with inflammatory bowel disease, and the digestive tract barrier becomes loose to increase permeability and the severity of inflammatory bowel disease It is reported to be correlated with the degree.
  • the pharmaceutical composition in the present embodiment can be used for the prevention and / or treatment of these diseases.
  • the airway epithelial cells function as a selective permeation barrier by being mutually linked by tight junctions present near the luminal side, and contribute to the maintenance of airway epithelial permeability homeostasis.
  • Increased airway epithelial permeability is found in tissue injury models in many lung diseases. Examples of diseases caused by airway epithelial cell disorders include allergic diseases such as bronchial asthma.
  • Asthma is considered to be chronic inflammation of the airway accompanied by activation of eosinophils, mast cells, lymphocytes, etc. and airway mucous membrane disorder.
  • the pharmaceutical composition in this embodiment can be used for the prevention and / or treatment of these diseases.
  • the inside of the alveoli is covered by alveolar epithelial cells.
  • alveolar epithelial cell damage when the alveolar epithelial cells are damaged by bacterial or viral infection, chemical substances, drugs, hyperoxia or inflammatory reaction and the permeability is enhanced, the edema fluid rich in protein components is intact in the alveoli. Leak into the alveolar wall to form a hyaline membrane, and the alveoli covered with the hyaline membrane are states in which oxygen and carbon dioxide can not be exchanged properly.
  • a condition in which the alveoli are covered by the hyaline membrane in a wide area of the lung is called diffuse alveolar injury.
  • Examples of diseases caused by alveolar epithelial cell disorders include acute lung injury, acute respiratory distress syndrome (ARDS), and pneumonia.
  • the pharmaceutical composition in the present embodiment can be used for the prevention and / or treatment of these diseases.
  • the pharmaceutical composition in the present embodiment can contain a carrier.
  • a carrier that can be used, a water-soluble carrier is preferable, and generally, an isotonic agent, a buffering agent, a thickener, a surfactant, a preservative, a preservative, a pain-free agent, which is acceptable as a pharmaceutical additive, Preferred are agents, pH adjusters and the like.
  • it can be prepared by adding sucrose, glycerin, etc., and other inorganic salt pH adjusters as additives.
  • amino acids, salts, carbohydrates, surfactants, albumin, gelatin and the like may be added as disclosed in JP-A-1-62219 and JP-A-6-321805.
  • the pharmaceutical composition in the present embodiment may contain other pharmaceutical components in combination in addition to the polypeptide of the present embodiment.
  • Other pharmaceutical ingredients include, for example, immunosuppressants, drugs for treating hematologic malignancies, and the like.
  • the method of adding the carrier and other pharmaceutical ingredients is not particularly limited, but in one aspect, the pharmaceutical composition of the present embodiment containing at least one selected from an immunosuppressant and a therapeutic agent for hematologic malignancy is lyophilized.
  • a method of manufacturing as a preparation as usually performed, for example, after mixing a solution containing at least one selected from an immunosuppressant and a therapeutic agent for hematologic malignancy and a polypeptide-containing solution, addition of a carrier etc.
  • At least one selected from an immunosuppressive agent or a therapeutic agent for hematologic malignancies in which additives are mixed and lyophilized, and additives such as a carrier are previously dissolved in water, distilled water for injection, or a suitable buffer solution After mixing, the solution is prepared by a method of adding and mixing the polypeptide-containing solution, and the method of lyophilizing can be mentioned.
  • the pharmaceutical composition in the present embodiment is formed by combining each of the pharmaceutical ingredients, it is preferable to manufacture each medicine by adding a carrier by an appropriate manufacturing method.
  • the pharmaceutical composition in the present embodiment may be provided in the form of an injection solution, or may be provided in a form in which a lyophilised preparation is dissolved and used at the time of use.
  • a solution containing 0.01 to 10 mg of the polypeptide of the present embodiment, water for injection, and further additives is filled in an ampule or vial for aqueous solution injection. It can be prepared as a pharmaceutical preparation. Also exemplified is a method of freezing and drying under reduced pressure to prepare a lyophilized preparation.
  • the pharmaceutical composition in the present embodiment is preferably administered by a parenteral administration method such as intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration and the like. It is also possible to administer by oral administration, rectal administration, intranasal administration, sublingual administration, pulmonary administration, transdermal administration.
  • the pharmaceutical composition in the present embodiment is a combination of each pharmaceutical component, it is preferable to administer each pharmaceutical component by an appropriate administration method.
  • intravenous administration there may be mentioned a method of administering a desired amount at one time (rapid intravenous administration) or intravenous infusion.
  • the method of administering the desired amount at one time is preferred in that the administration time is short.
  • the dose of the pharmaceutical composition in this embodiment varies depending on the patient's age, body weight, degree of disease, administration route and the like, generally 0.01 to 100 mg per adult per day is divided into 1 to 3 times Administration is illustrated.
  • the administration period is generally from several days to 2 months on a daily basis, but depending on the condition of the patient, the daily dose and the administration period can be increased or decreased.
  • the administration interval can be once every 2 to 14 days, preferably once every 2 to 7 days, more preferably once every 3 to 5 days.
  • JP-A-2015-63498 discloses a method for confirming the cytoprotective activity and the activation promoting effect of protein C with respect to E5 polypeptide, and a use and a production method of a pharmaceutical composition containing E5 polypeptide as an active ingredient, etc. Are disclosed and can be used to practice the polypeptides of the invention.
  • the entire disclosure of JP-A-2015-63498 is incorporated by reference as the disclosure of the present specification.
  • the vascular endothelial protective activity of the polypeptides KAF06, KAF12, KAF24, and KAF37 of the present invention was examined by measuring the cell death inhibitory activity. Specifically, each of the polypeptides was added to the cell death of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) induced by the immunosuppressant FK506 (10 ⁇ g / mL) to measure the cell death inhibitory activity.
  • HUVEC human umbilical vein endothelial cells
  • HUVECs were cultured in a dedicated medium (EGM (endothelial cell growth medium) containing 2% fetal calf serum, Lonza), detached with trypsin / EDTA, suspended in the dedicated medium, and seeded at 5 ⁇ 10 3 cells in 96 well plates. After addition of each polypeptide to a final concentration of 500 nM, the culture was carried out at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator. FK506 was added to a final concentration of 10 ⁇ g / mL and cultured for another 24 hours. After adding bromodeoxyuridine (10 ⁇ mol / L / well) and culturing for 4 hours, the bromodeoxyuridine incorporated into cells was measured. The measurement was carried out using a cell proliferation ELISA, BrdU color development kit (Roche) according to the attached protocol.
  • cell growth promoting activity of polypeptide The cell growth promoting activity of the polypeptides KAF06, KAF12, KAF24 and KAF37 of the present invention was measured. Specifically, HUVEC (5 ⁇ 10 3 cells) were each treated in the presence of each polypeptide at a final concentration of 500 nM. The cells were cultured in a 96-well plate for 24 hours using the same dedicated medium as above. Furthermore, after bromodeoxyuridine (10 ⁇ mol / L / well) was added and cultured for 4 hours, bromodeoxyuridine incorporated into cells was measured. The measurement was carried out using a cell proliferation ELISA, BrdU color development kit (Roche) according to the attached protocol.
  • the polypeptides KAF06, KAF12, KAF24, and KAF37 of the present invention are all proliferating cells of 1.46, 1.20, 1.43, and 1.49, respectively. A promoting action was observed. The results are shown in FIG.
  • the cytoprotective activity of the polypeptide KAF06 of the present invention was examined by measuring anti-apoptotic activity. Specifically, anti-apoptotic activity was measured by adding KAF06 to a final concentration of 500 nM with respect to the apoptotic response of HUVEC induced by FK506. HUVEC mentioned above 2. After culturing in the same dedicated medium as above, the cells were detached with trypsin / EDTA and suspended in PBS. The cell suspension was aliquoted into 12-well culture plates (Sumilon) at a concentration of 2 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • FK506 (10 ⁇ g / mL) or FK506 + KAF06 (500 nM) was added and exposed for 36 hours. Measurement of apoptotic cells was performed according to the attached protocol using an annexin V apoptosis detection kit (BioVision).
  • Apoptotic cells were detected by FACS after staining with annexin V and PI (propidium iodide).
  • Annexin V-positive cells are referred to as early apoptotic cells (early apoptosis), and cells positive for both annexin V and PI are referred to as late apoptotic cells (late apoptosis).
  • the polypeptide KAF06 of the present invention suppresses apoptosis by 3.1% and 12.1%, respectively, against the proportion of early apoptotic cells 7.8% and late apoptotic cells 28.5% induced by FK506. It turned out that it has an effect. The results are shown in FIG.
  • Cell death inhibitory activity of polypeptide (anti-apoptotic protein induction activity)
  • the cytoprotective activity of the polypeptide KAF06 of the present invention was evaluated by the cell death inhibitory activity.
  • Cell death inhibitory activity was evaluated by measuring the induction of anti-apoptotic protein Mcl-1 expression using vascular endothelial cells. HUVEC mentioned above 2.
  • the culture was performed using the same dedicated medium as above, and cultured with KAF06 added to the medium to a concentration of 500 nM. Blank (no peptide) was used as a negative control. After 48 hours after the addition, the medium was removed, and HUVECs were dissolved in a cell lysate to obtain a cell extract.
  • the transferred Immobilon-P membrane was blocked with 1% milk for 2 minutes at room temperature.
  • Anti-Mcl-1 antibody was diluted 1000-fold with 1% milk and incubated overnight at 4 ° C. with a nylon membrane at room temperature. After the incubation was completed, the plate was washed a total of 3 times with a washing solution (composition: PBS + 0.1% tween 20). Then, a secondary antibody solution diluted 1000-fold with 1% milk solution was added, incubated at room temperature for 60 minutes, and then washed a total of three times with a washing solution.
  • ECL Western Blotting Detection System GE Healthcare Japan
  • 2 kinds of substrate solution ECL solution are added, incubated for 1 to 2 minutes normally at room temperature, then exposed to LAS 4000 image analyzer (FUJI FILM) , Developed.
  • the intensity of the Mcl-1 protein band was quantified with ImageJ software (Wayne Rasband, NIH).
  • the vascular endothelial protective activity of the polypeptide was examined by measuring the vascular hyperpermeability inhibitory activity.
  • the effect of the polypeptide on vascular hyperpermeability was evaluated using the vascular permeability assay kit (Millipore) according to the attached protocol. Specifically, HUVECs were cultured until they became confluent on collagen-coated inserts, and after 24 hours of starvation, FK506 (10 ⁇ g / mL) or FK506 + KAF06 (500 nM) was added and cultured for 12 hours.
  • FITC-labeled dextran was added to the upper chamber, and the fluorescence intensity of FITC that came out to the lower chamber was measured to be vascular endothelial cell permeability enhancing activity.
  • the fluorescence intensity which came out to the lower chamber showed that vascular permeability enhancement was 3.38, when only FK506 was added.
  • KAF06 was simultaneously added, a decrease of 2.15 was observed, and it was confirmed that KAF06 suppressed the vascular permeability enhancement by FK506. The results are shown in FIG.
  • Angiogenesis promoting activity of polypeptide The pro-angiogenic activity of the polypeptides KAF06 and KAF12 of the present invention was examined.
  • VEGF Pepro Tech Inc
  • buffer was used as a negative control.
  • the angiogenesis promoting activity was evaluated by in vitro vascular endothelial lumen formation and in vivo Matrigel subcutaneous transplantation using a mouse. Specifically, human umbilical cord endothelial cells (2.5 ⁇ 10 4 cells / well) were seeded on growth factor-reduced Matrigel (BD Bioscience) using a 24-well culture plate (Sumilon).
  • the in vivo angiogenesis promoting activity was evaluated by Matrigel subcutaneous transplantation.
  • Growth factor reduced Matrigel 0.3 mL containing 40 U / mL heparin is mixed with KAF06 (500 nM), or VEGF (0.5 nM) as a positive control, in C57BL6 mice (6 weeks old female) It was administered subcutaneously to the back. A control was used without mixing anything. Four days later, Matrigel was removed to quantify hemoglobin content.
  • HUVECs were dissolved in a cell lysate to obtain a cell extract.
  • the cell extract was subjected to 5-15% SDS-PAGE, and then transferred to Immobilon-P membrane (Millipore), as described in 5. above.
  • the phosphorylation of each protein was detected with a specific antibody in the same manner as in.
  • the antibodies used are shown below: Anti-phosphorylated ERK antibody (Cell Signaling Technology, 9101); Anti-phospho-Akt antibody (Ser 473) (Cell Signaling Technology, 9271); Anti-phosphorylated p38 antibody (Tyr180 / 182) (Cell Signaling Technology, 9216); Anti-ERK antibody (Cell Signaling Technology, 9102); Anti-Akt antibody (Ser 473) (Cell Signaling Technology, 9272); Anti-p38 antibody (Cell Signaling Technology, 9212);
  • the relative band intensities of KAF06 when the band intensity of each phosphorylated protein in the control is 1, the phosphorylated ERK is 3.9, the phosphorylated Akt is 3.4, and the phosphorylated p38 is 2.7
  • the polypeptide KAF06 of the present invention was found to have an ERK, Akt, and p38 phosphorylation promoting action. The results are shown in FIG.
  • Anticoagulant Activity of Polypeptide The anticoagulant activity of the polypeptide KAF06 of the present invention and E5 (Comparative Example 1) was examined. Anticoagulant activity was evaluated by protein C activation promoting activity and thrombin addition coagulation time (TCT). The protein C activation promoting activity was evaluated by reacting E5 or KAF06 with protein C and thrombin, and then measuring the activated protein C produced by measuring the absorbance at 405 nm with a synthetic substrate S-2366.
  • polypeptide KAF06 of the present invention and E5 (comparative example 1) to 75 ⁇ L of 20 mM calcium chloride solution and mixing, 25 ⁇ L of 40 NIHU / mL thrombin solution and then 25 ⁇ L of 15 ⁇ g / mL protein C solution Added and incubated at 37 ° C for 10 minutes. After adding antithrombin III and incubating at 37 ° C. for 10 minutes to stop the reaction, the substrate solution was added and incubated at 37 ° C. for 10 minutes. After the reaction was stopped, the absorbance at 405 nm was measured, and the protein C activation promoting activity of the polypeptide KAF06 of the present invention, as well as E5 was determined from the calibration curve using D123.
  • the specific activities of D123 and E5 and the polypeptide KAF06 of the present invention were 2.8 ⁇ 10 11 U / mol, 6.7 ⁇ 10 6 U / mol and 0 U / mol, respectively.
  • the polypeptide KAF06 of the present invention did not show protein C activation promoting activity.
  • TCT was measured using a thrombin solution such that the clotting time was about 10 seconds when added to human normal pool plasma.
  • TCT was measured with an automatic blood coagulation measurement device KC10A (Heinrich Amelung GmbH) according to the attached manual. The prolongation rate of the clotting time of control D123, E5 or KAF06-added plasma to TCT of non-test substance-added plasma was calculated.
  • a sample cup containing steel balls is set in KC10A, 100 ⁇ L each of human normal plasma is added, and the mixture is incubated at 37 ° C. for 1 minute.
  • Add 100 ⁇ l of thrombin solution to the sample cup and measure the clotting time.
  • the TCT prolongation rate of D123 is 132.4% at 50 nM and 554.7% at 500 nM
  • the TCT elongation rate of E5 is 113.4% at 500 nM, 206.4% at 5000 nM
  • TCT extension of KAF06 The rates were 99.6% for 500 nM and 104.9% for 5000 nM.
  • TCT prolongation was not observed at all in KAF06 of the present invention.
  • KAF06 showed no anticoagulant effect on protein C activation promoting activity and TCT prolongation rate.
  • SOS Mouse Hepatic Sinus Occlusion Syndrome
  • BMT + PBS bone marrow transplantation treatment group with PBS administration
  • BMT + KAF06 bone marrow transplantation treatment group with this peptide KAF06 administration
  • Serum aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) on Day 7, 14, 20 were measured.
  • the SOS score of Day 7, 14, 20 was calculated.
  • SOS score is a method that improves the report of DeLeve et al. Under the blind in the result of histopathology result (hematoxylin-eosin staining, immunohistological staining using pan-endothelial cell monoclonal antibody (MECA-32), Masson staining) of liver slice fragments It was evaluated based on
  • Thrombomodulin concentration was measured using a Cloud-Clone ELISA kit. As a result, the onset of SOS was observed in the BMT + PBS group relative to the normal control group, but the SOS onset was suppressed in the BMT + KAF06 group.
  • Prothrombin time and activated partial thromboplastin time For the measurement of prothrombin time (PT), E5, soluble thrombomodulin (D123), or 100 ⁇ L of 200 ⁇ L of PT reagent (Sysmex) in the presence or absence of KAF06 (10 ⁇ L each) Mixed with plasma.
  • PT prothrombin time
  • activated partial thromboplastin time As measurement of activated partial thromboplastin time (ATPP), 100 ⁇ L of APTT reagent (Sysmex) was mixed with 100 ⁇ L of human plasma in the presence or absence of E5, D123, or KAF06 (10 ⁇ L each). The mixture was incubated for 120 seconds before adding 100 ⁇ L of CaCl 2 . The clotting time was measured with
  • D123 extended PT and APTT by about 200% and 165% at 500 nM, respectively.
  • PT and APTT were extended by more than 400% and 900%, respectively.
  • E5 5000 nM
  • PT and APTT 137% and 225%, respectively.
  • KAF06 5000 nM
  • the polypeptide provided by the present invention is useful as an active ingredient of a drug that avoids the risk of bleeding as a side effect because it has excellent cytoprotective activity and exhibits substantially no anticoagulant activity.

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Abstract

強い細胞保護作用を有し、かつ血液抗凝固作用が十分に軽減された下記ポリペプチド又はその塩：Ｘ１ＣＰＥＧＹＩＬＤＤＧＸ２ＩＣＴＤＩＤＥ（Ｎ末端から２番目及び１４番目のシステイン残基（Ｃ）はＳ－Ｓ結合を形成して互いに結合しており、該Ｓ－Ｓ結合はＣＨＲ１－ＣＨＲ２（Ｒ１及びＲ２は水素原子、炭素数１～４のアルキル基、ハロゲン原子、水酸基、又はアミノ基を示す）で表される基で置き換えられていてもよく；Ｘ１は存在しないか、又はグルタミン酸残基（Ｅ）若しくはアスパラギン酸残基（Ｄ）を示し；Ｘ２はフェニルアラニン残基、アラニン残基、又はチロシン残基を示す）

Description

新規ポリペプチド及びその用途
　本発明は新規なポリペプチド及びその用途に関する。
　敗血症、虚血／再灌流障害、卒中、虚血性発作、急性心筋梗塞、急性神経変性疾患、アルツハイマー病、ダウン症症候群、ハンチントン病、筋委縮性側索硬化症、パーキンソン病、褥瘡、創傷、閉塞性動脈疾患、動脈硬化症、高脂血症、糖尿病、肥満、臓器移植、化学療法、免疫抑制薬、及び放射線障害等、種々の疾患や処置により細胞は傷害を受ける。これらの疾患や処置による傷害の治療においては抗アポトーシス活性を一つの機序とする細胞保護活性を有する物質が有効である。細胞保護活性を有する蛋白質の一つとして、トロンボモジュリンが知られている。
　本来トロンボモジュリンは、トロンビンと特異的に結合しトロンビンの血液凝固活性を阻害すると同時にトロンビンのプロテインＣ活性化能を著しく促進する作用を有する物質として知られ、強力な血液凝固阻害作用を有することが知られている。トロンビンによる凝固時間を延長することや、トロンビンによる血小板凝集を抑制することも知られている。プロテインＣは、血液凝固線溶系において重要な役割を演じているビタミンＫ依存性の蛋白質であり、トロンビンの作用により活性化され、活性化プロテインＣとなる。この活性化プロテインＣは、生体内で血液凝固系因子の活性型第Ｖ因子、及び活性型第ＶＩＩＩ因子を失活させ、また血栓溶解作用を有するプラスミノゲンアクチベータの産生に関与していることが知られている（非特許文献１）。
　シグナルペプチドが切断されたマチュアなトロンボモジュリンは、そのマチュアなポリペプチドのＮ末端側よりＮ末端領域（Ｄ１、１－２２６番目：シグナルペプチドが１８アミノ酸残基であると考えた場合の位置表示、以下同じ）、６つのＥＧＦ様構造をもつ領域（Ｄ２、２２７－４６２番目）、Ｏ型糖鎖付加領域（Ｄ３、４６３－４９８番目）、膜貫通領域（Ｄ４、４９９－５２１番目）、そして細胞質内領域（Ｄ５、５２２－５５７番目）の５つの領域から構成されている。全長のトロンボモジュリンと同じプロテインＣ活性化促進活性を有する部分は、６つのＥＧＦ様構造を持つ領域のうち、主としてＮ末端側から４、５、６番目のＥＧＦ様構造からなる部分（Ｅ４５６）であることが知られている（非特許文献２）。また、６つのＥＧＦ様構造を持つ領域のうち、Ｎ末端側から４、５番目のＥＧＦ様構造からなる部分（Ｅ４５）では、全長のトロンボモジュリンよりは低下しているが、プロテインＣ活性化促進活性を有していることが知られている（非特許文献３）。
　Ｎ末端領域と６つのＥＧＦ様構造をもつ領域とＯ型糖鎖付加領域の３つの領域のみからなる可溶性トロンボモジュリン（Ｄ１２３）は、造血器悪性腫瘍ならびに感染症ＤＩＣ患者を対象とした第三相臨床試験が実施され、未分画ヘパリン治療に対して、有効性と安全性の点で勝ることが示され、汎発性血管内血液凝固症（ＤＩＣ）治療薬として臨床応用されている。Ｄ１２３は細胞保護活性を有することが知られている（非特許文献４）。
　Ｄ１２３やＥ４５は、細胞保護作用を有するとともに、トロンビンと結合しプロテインＣ活性化を促進する抗凝固作用も有することが知られていたが、抗凝固作用を有する物質を生体内へ投与した場合、出血の副作用のリスクがあることが知られている。例えば、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）は、高い出血リスクを有しており、市場からの撤退を余儀なくされている（非特許文献５）。この出血の副作用のリスクを回避し、細胞保護作用を有すると同時に抗凝固作用を軽減すべく、Ｅ４５の部分ポリペプチドとして４０アミノ酸残基からなるＥ５ポリペプチドが提供された（特許文献１）。このポリペプチド（Ｅ５）はＥ４５と同等以上の細胞保護作用を有し、かつ非常に少ないプロテインＣ活性化を促進する作用、すなわち非常に少ない抗凝固作用を有している。
特開２０１５－６３４９８号公報
鈴木宏治、医学のあゆみ　１９８３；１２５：９０１ Ｚｕｓｈｉ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　１９８９；２６４：１０３５１－１０３５３ Ｈａｙａｓｈｉ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　１９９０；２６５：２０１５６－２０１５９ Ｉｋｅｚｏｅ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ　Ｔｈｒｏｍｂ　Ｖａｓｃ　Ｂｉｏｌ　２０１２；３２：２２５９－２２７０ Ｍａｒｔｉ-Ｃａｒｖａｊａｌ ＡＪ ｅｔ.ａｌ Ｃｏｃｈｒａｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ ＳｙｓｔＲｅｖ.２０１２ ； （１２）：ＣＤ００４３８８
　Ｅ５は以下の配列を有する４０アミノ酸残基からなるポリペプチドであり、それぞれループ構造を有する３つの部分構造、すなわち１１アミノ酸残基からなるＥ５－Ａ（本明細書において「ＫＡＦ０４」と呼ぶ場合がある）、１１アミノ酸残基からなるＥ５－Ｂ（本明細書において「ＫＡＦ０５」と呼ぶ場合もある）、及び１９アミノ酸残基からなるＥ５－Ｃ（本明細書において「ＫＡＦ０６」と呼ばれる場合もある）からなることが明らかにされている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　しかしながら、従来、Ｅ５の活性発現を担う部分構造は特定されていない。Ｅ５の活性発現を担う部分構造を特定することができれば、強い細胞保護作用を有し、かつプロテインＣ活性化促進作用が十分に軽減されたポリペプチドを提供できる可能性がある。
　従って、本発明の課題は、Ｅ５の活性発現を担う部分構造を特定し、Ｅ５の部分ポリペプチドであって、強い細胞保護作用を有し、かつプロテインＣ活性化促進作用が十分に軽減されたポリペプチドを提供することにある。
　また、本発明の別の課題は、上記の特徴を有するＥ５の部分ポリペプチドにおいて、活性に寄与するアミノ酸残基を特定し、同様の活性を有する変異Ｅ５部分ポリペプチドを提供することにある。
　本発明者らは、Ｅ５の活性発現を担う部分構造を特定するためにＥ５の構造と活性との相間を研究し、Ｅ５－Ｃ（ＫＡＦ０６、ＴＭＥ５Ｃと呼ばれる場合もある）がＥ５の活性に寄与する部分構造であることを突き止めた。本発明者らはさらに研究を行い、Ｅ５－ＣのＮ末端のグルタミン酸酸残基（Ｅ）を除いた１８アミノ酸残基からなるポリペプチド（本明細書においてこのポリペプチドを「ＫＡＦ１２と呼ぶ場合がある」がＥ５に含まれる最小の活性単位であることを見いだした。さらに、このＫＡＦ１２においてアミノ酸残基やループ構造を変化させた特定の変異ポリペプチドにおいて所望の活性が保存されており、かつ血液抗凝固作用を十分に低減できることを見いだした。本発明は上記の知見に基づいて完成されたものである。
　すなわち、本発明により、Ｘ１ＣＰＥＧＹＩＬＤＤＧＸ２ＩＣＴＤＩＤＥで表されるポリペプチド（式中、アミノ酸残基は一文字表記により示し、ただし、Ｎ末端から２番目のシステイン残基（Ｃ）とＮ末端から１４番目のシステイン残基（Ｃ）はＳ－Ｓ結合を形成して互いに結合しており、該Ｓ－Ｓ結合はＣＨＲ１－ＣＨＲ２（Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１～４のアルキル基、ハロゲン原子、水酸基、又はアミノ基を示す）で表される基で置き換えられていてもよく；Ｘ１は存在しないか、又はグルタミン酸残基（Ｅ）若しくはアスパラギン酸残基（Ｄ）を示し；Ｘ２はフェニルアラニン残基、アラニン残基、又はチロシン残基を示す）又はその塩が提供される。
　本発明の好ましい態様によれば、Ｎ末端から２番目のシステイン残基（Ｃ）とＮ末端から１４番目のシステイン残基（Ｃ）はＳ－Ｓ結合を形成して互いに結合している上記のポリペプチド又はその塩が提供される。また、ＥＣＰＥＧＹＩＬＤＤＧＦＩＣＴＤＩＤＥで表されるポリペプチド（ＫＡＦ０６：式中、アミノ酸残基は一文字表記により示し、ただし、Ｎ末端から２番目のシステイン残基（Ｃ）とＮ末端から１４番目のシステイン残基（Ｃ）はＳ－Ｓ結合を形成して互いに結合している）又はその塩、及びＣＰＥＧＹＩＬＤＤＧＦＩＣＴＤＩＤＥで表されるポリペプチド（ＫＡＦ１２：式中、アミノ酸残基は一文字表記により示し、ただし、Ｎ末端のシステイン残基（Ｃ）とＮ末端から１３番目のシステイン残基（Ｃ）はＳ－Ｓ結合により互いに結合している）又はその塩が提供される。
　本発明の別の好ましい態様により、ＥＣＰＥＧＹＩＬＤＤＧＡＩＣＴＤＩＤＥで表されるポリペプチド（ＫＡＦ２４）又はその塩、ＥＣＰＥＧＹＩＬＤＤＧＹＩＣＴＤＩＤＥで表されるポリペプチド（ＫＡＦ３７）又はその塩、ＣＰＥＧＹＩＬＤＤＧＡＩＣＴＤＩＤＥで表されるポリペプチド（ＫＡＦ１２４）又はその塩、及びＣＰＥＧＹＩＬＤＤＧＹＩＣＴＤＩＤＥで表されるポリペプチド（ＫＡＦ１３７）又はその塩が提供される（式中、アミノ酸残基は一文字表記により示し、２個のシステイン残基（Ｃ）はＳ－Ｓ－結合を形成して互いに結合している）。
　別の観点からは、本発明により、上記のいずれかのポリペプチド又はその塩を有効成分として含む医薬組成物；細胞障害の予防及び／又は治療のための上記医薬組成物；血管内皮細胞障害の予防及び／又は治療のための上記医薬組成物；消化管上皮細胞障害、気管上皮細胞障害、又は肺胞上皮細胞障害の予防及び／又は治療のための上記医薬組成物；表皮細胞障害の予防及び／又は治療のための上記医薬組成物が提供される。
　さらに別の観点からは、上記の医薬組成物の製造のための上記のいずれかのポリペプチド又はその塩の使用；細胞障害の予防及び／又は治療方法であって、上記のいずれかのポリペプチド又はその塩をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法；血管内皮細胞障害の予防及び／又は治療方法であって、上記のいずれかのポリペプチド又はその塩をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法；消化管上皮細胞障害、気管上皮細胞障害、又は肺胞上皮細胞障害の予防及び／又は治療方法であって、上記のいずれかのポリペプチド又はその塩をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法；及び表皮細胞障害の予防及び／又は治療方法であって、上記のいずれかのポリペプチド又はその塩をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法が提供される。
　本発明としては、具体的には以下のものが挙げられる。もちろん、これらに限定されるものではない。
〔１〕Ｘ１ＣＰＥＧＹＩＬＤＤＧＸ２ＩＣＴＤＩＤＥで表されるポリペプチド（式中、アミノ酸残基は一文字表記により示し、ただし、Ｎ末端から２番目のシステイン残基（Ｃ）とＮ末端から１４番目のシステイン残基（Ｃ）はＳ－Ｓ結合を形成して互いに結合しており、該Ｓ－Ｓ結合はＣＨＲ１－ＣＨＲ２（Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１～４のアルキル基、ハロゲン原子、水酸基、又はアミノ基を示す）で表される基で置き換えられていてもよく；Ｘ１は存在しないか、又はグルタミン酸残基（Ｅ）若しくはアスパラギン酸残基（Ｄ）を示し；Ｘ２はフェニルアラニン残基、アラニン残基、又はチロシン残基を示す）又はその塩。
〔１－２〕Ｒ１及びＲ２がいずれも水素原子である前記〔１〕に記載のポリペプチド又はその塩。
〔２〕ＥＣＰＥＧＹＩＬＤＤＧＦＩＣＴＤＩＤＥで表されるポリペプチド（式中、アミノ酸残基は一文字表記により示し、ただし、Ｎ末端から２番目のシステイン残基（Ｃ）とＮ末端から１４番目のシステイン残基（Ｃ）はＳ－Ｓ結合を形成して互いに結合しており、該Ｓ－Ｓ結合はＣＨＲ１－ＣＨＲ２（Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１～４のアルキル基、ハロゲン原子、水酸基、又はアミノ基を示す）で表される基で置き換えられていてもよい）又はその塩。
〔３〕ＣＰＥＧＹＩＬＤＤＧＦＩＣＴＤＩＤＥで表されるポリペプチド（式中、アミノ酸残基は一文字表記により示し、ただし、Ｎ末端のシステイン残基（Ｃ）とＮ末端から１３番目のシステイン残基（Ｃ）はＳ－Ｓ結合により互いに結合しており、該Ｓ－Ｓ結合はＣＨＲ１－ＣＨＲ２（Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１～４のアルキル基、ハロゲン原子、水酸基、又はアミノ基を示す）で表される基で置き換えられていてもよい）又はその塩。
〔４〕下記のいずれかのポリペプチド：
ＥＣＰＥＧＹＩＬＤＤＧＡＩＣＴＤＩＤＥで表されるポリペプチド、ＥＣＰＥＧＹＩＬＤＤＧＹＩＣＴＤＩＤＥで表されるポリペプチド、ＣＰＥＧＹＩＬＤＤＧＡＩＣＴＤＩＤＥで表されるポリペプチド、又はＣＰＥＧＹＩＬＤＤＧＹＩＣＴＤＩＤＥで表されるポリペプチド（式中、アミノ酸残基は一文字表記により示し、２個のシステイン残基（Ｃ）はＳ－Ｓ－結合を形成して互いに結合しており、該Ｓ－Ｓ結合はＣＨＲ１－ＣＨＲ２（Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１～４のアルキル基、ハロゲン原子、水酸基、又はアミノ基を示す）で表される基で置き換えられていてもよい）あるいはその塩。
〔５〕該Ｓ－Ｓ結合がＣＨＲ１－ＣＨＲ２で表される基で置き換えられていない前記〔１〕ないし〔４〕のいずれか１項に記載のポリペプチド又はその塩。
〔６〕該Ｓ－Ｓ結合がＣＨＲ１－ＣＨＲ２で表される基で置き換えられている前記〔１〕ないし〔４〕のいずれか１項に記載のポリペプチド又はその塩。
〔６－２〕該Ｓ－Ｓ結合がＣＨ２－ＣＨ２で表される基で置き換えられている前記〔１〕ないし〔４〕のいずれか１項に記載のポリペプチド又はその塩。
〔６－３〕該Ｓ－Ｓ結合がＣＨ２－ＣＨ２で表される基で置き換えられている前記〔１〕に記載のポリペプチド又はその塩。
〔６－４〕該Ｓ－Ｓ結合がＣＨ２－ＣＨ２で表される基で置き換えられている前記〔２〕に記載のポリペプチド又はその塩。
〔６－５〕該Ｓ－Ｓ結合がＣＨ２－ＣＨ２で表される基で置き換えられている前記〔３〕に記載のポリペプチド又はその塩。
〔６－６〕該Ｓ－Ｓ結合がＣＨ２－ＣＨ２で表される基で置き換えられている前記〔４〕に記載のポリペプチド又はその塩。
〔６－７〕ＥＣＰＥＧＹＩＬＤＤＧＡＩＣＴＤＩＤＥで表されるポリペプチドである前記〔６－６〕に記載のポリペプチド又はその塩。
〔６－８〕ＥＣＰＥＧＹＩＬＤＤＧＹＩＣＴＤＩＤＥで表されるポリペプチドである前記〔６－６〕に記載のポリペプチド又はその塩。
〔６－９〕ＣＰＥＧＹＩＬＤＤＧＡＩＣＴＤＩＤＥで表されるポリペプチドである前記〔６－６〕に記載のポリペプチド又はその塩。
〔６－１０〕ＣＰＥＧＹＩＬＤＤＧＹＩＣＴＤＩＤＥで表されるポリペプチドである前記〔６－６〕に記載のポリペプチド又はその塩。
〔７〕前記〔１〕ないし〔６〕のいずれか１項に記載のポリペプチド又はその塩を有効成分として含む医薬組成物。
〔８〕細胞障害、血管内皮細胞障害、消化管上皮細胞障害、気管上皮細胞障害、肺胞上皮細胞障害、及び表皮細胞障害からなる群から選ばれる１又は２以上の障害の予防及び／又は治療のため前記〔７〕に記載の医薬組成物。
  本発明により提供されるポリペプチド又はその塩は、優れた細胞保護活性を有し、かつ抗凝固作用が十分に軽減されている。従って、上記ポリペプチドを有効成分として含む医薬組成物は、所望の薬効を十分に発揮しつつ、出血のリスクをほぼ完全に低減することができる。
本発明のポリペプチドの細胞死抑制作用を示した図である。 本発明のポリペプチドの細胞増殖促進作用を示した図である。 本発明のポリペプチドのアポトーシス抑制作用を示した図である。 本発明のポリペプチドのＭｃｌ－１誘導による細胞保護作用を示した図である。 本発明のポリペプチドの血管透過性亢進抑制作用を示した図である。 本発明のポリペプチドの血管新生促進作用を示した図である。 本発明のポリペプチドの血管新生促進作用を示した図である。 本発明のポリペプチドのＥＲＫ、Ａｋｔ、及びｐ３８のリン酸化促進作用を示した図である。 本発明のポリペプチドの細胞保護作用をマウスＳＯＳモデルで評価した結果を示した図である。 本発明のポリペプチドの肝機能障害抑制作用を示した図である。 本発明のポリペプチドの肝機能障害抑制作用を示した図である。 本発明のポリペプチドの血管内皮細胞障害抑制作用を示した図である。 本発明のポリペプチドのプロトロンビン時間及び活性化部分トロンボプラスチン時間を示した図である。
　本発明により、Ｘ１ＣＰＥＧＹＩＬＤＤＧＸ２ＩＣＴＤＩＤＥで表されるポリペプチド又はその塩が提供される。式中、アミノ酸残基は一般的に使用されている一文字表記により示してあり、Ａはアラニン残基、Ｄはアスパラギン酸残基、Ｃはシステイン残基、Ｅはグルタミン酸残基、Ｇはグリシン残基、Ｉはイソロイシン残基、Ｌはロイシン残基、Ｐはフェニルアラニン残基、及びＴはトレオニン残基を示す。
　上記のポリペプチドにおいて、Ｎ末端から２番目のシステイン残基（Ｃ）とＮ末端から１４番目のシステイン残基（Ｃ）はＳ－Ｓ結合を形成して互いに結合している。このＳ－Ｓ結合はＣＨＲ１－ＣＨＲ２（Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１～４のアルキル基、ハロゲン原子、水酸基、又はアミノ基を示す）で表される基で置き換えられていてもよい。アルキル基としては、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基などを挙げることができる。Ｒ１及びＲ２がともに水素原子であることが好ましい。Ｘ１は存在しないか、又はグルタミン酸残基（Ｅ）若しくはアスパラギン酸残基（Ｄ）を示し、Ｘ２はフェニルアラニン残基（Ｐ）、アラニン残基（Ａ）、又はチロシン残基（Ｙ）を示す。
　本発明のポリペプチドのうち、好ましいポリペプチドとして、ＥＣＰＥＧＹＩＬＤＤＧＦＩＣＴＤＩＤＥで表されるポリペプチド（ＫＡＦ０６ポリペプチド：Ｎ末端から２番目のシステイン残基（Ｃ）とＮ末端から１４番目のシステイン残基（Ｃ）はＳ－Ｓ結合を形成して互いに結合している）、及びＣＰＥＧＹＩＬＤＤＧＦＩＣＴＤＩＤＥで表されるポリペプチド（ＫＡＦ１２ポリペプチド：Ｎ末端のシステイン残基（Ｃ）とＮ末端から１３番目のシステイン残基（Ｃ）はＳ－Ｓ結合を形成して互いに結合している）を挙げることができる。
　ＫＡＦ０６ポリペプチドは、Ｅ５の部分構造であるＥ５－Ｃに相当するポリペプチドであり、ＫＡＦ１２ポリペプチドは、ＫＡＦ０６ポリペプチドのＮ末端のグルタミン酸残基（Ｅ）を除いたポリペプチドである。２個のシステイン残基（Ｃ）はＳ－Ｓ結合を形成して架橋により互いに結合している（下記に示すのはＫＡＦ０６ポリペプチドであり、ＫＡＦ１２ポリペプチドではＮ末端のグルタミン酸残基（Ｅ）が存在しない）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　別の好ましいポリペプチドとして、ＥＣＰＥＧＹＩＬＤＤＧＡＩＣＴＤＩＤＥで表されるポリペプチド（ＫＡＦ２４ポリペプチド）、ＥＣＰＥＧＹＩＬＤＤＧＹＩＣＴＤＩＤＥで表されるポリペプチド（ＫＡＦ３７ポリペプチド）、ＣＰＥＧＹＩＬＤＤＧＡＩＣＴＤＩＤＥで表されるポリペプチド（ＫＡＦ１２４ポリペプチド）、及びＣＰＥＧＹＩＬＤＤＧＹＩＣＴＤＩＤＥで表されるポリペプチド（ＫＡＦ１３７ポリペプチド）を挙げることができる。これらのポリペプチド中に存在する２個のシステイン残基はＳ－Ｓ結合を形成して架橋により互いに結合している。もっとも、本発明のポリペプチドは上記に説明した特定のポリペプチドに限定されることはない。
　本発明のポリペプチドは塩の形態であってもよい。塩の形態は特に限定されず、酸付加塩又は塩基付加塩のいずれであってもよく、任意の塩の形態を選択することができる。医薬組成物の有効成分として本発明のポリペプチドを用いる場合には、生理的に許容される塩を選択することが望ましい。
  本発明のポリペプチドは、細胞保護活性を有し、かつプロテインＣの活性化促進作用が軽減されている。本発明のポリペプチドは、細胞保護活性を有しつつ、かつプロテインＣ活性化促進作用が十分に軽減されていることから、所望の薬理作用と副作用とがほぼ完全に分離されているという特徴がある。従って、本発明のポリペプチドでは、細胞死抑制活性などの細胞保護作用を強力に発揮しつつ、血液の抗凝固作用をほぼ完全に抑制できることから、出血性の副作用をほぼ完全に回避しつつ、所望の治療を行うことができる。
　細胞保護活性としては、例えば、細胞死抑制活性、細胞透過性亢進抑制活性、血管新生促進活性、細胞増殖促進活性、及び細胞機能維持活性からなる群から選ばれる１又は２以上の活性を挙げることができるが、これらに限定されることはない。細胞保護活性としては、上記の少なくとも一つを有していれば特に限定されないが、２以上の活性を有していることが好ましく、全ての活性を有していることが好ましい。
　細胞死抑制活性は、細胞の抗アポトーシス活性を測定することにより確認することができる。アポトーシスとは生理的、病理的要因により生じた不要な細胞や障害細胞などを積極的に除去する能動的細胞死とされてきたが、種々の病態に伴う細胞死にも関与しており、アポトーシスにより細胞障害が引き起こされることが明らかとなってきている。従って、アポトーシスを抑制することは、細胞死を抑制し、細胞障害の進展を阻害するために有効である。アポトーシスに関わるシグナル伝達経路は、アポトーシス促進分子や抑制分子等多くの分子からなることから、一般的には、一度に全てのアポトーシス活性を抑制できるわけではない。
　抗アポトーシス活性とは、アポトーシスを惹起する物質で細胞等を処理したときに誘導されるアポトーシスを抑制する活性のことであり、アポトーシス促進分子の阻害活性やアポトーシス抑制分子の上昇活性を示す。例えば、特開２０１５－６３４９８号公報の実施例（２）に記載されているように、非特許文献４に記載された試験方法によりヒト臍帯静脈内皮に対するアポトーシス抑制分子、すなわち抗アポトーシス蛋白質の一種であるＭｃｌ-１の発現誘導の程度を調べることにより、又は同公報の実施例（３）に記載されているように、非特許文献４に記載された試験方法に従ってヒト臍帯静脈内皮細胞における免疫抑制剤誘発性アポトーシスの阻害の程度を調べることにより、抗アポトーシス活性を確認することができる。
　抗アポトーシス活性としては、細胞死を妨げる効果を示すものであれば特に限定されないが、Ｍｃｌ-１の発現誘導が無刺激の状態の細胞での発現に比して２倍以上であることが好ましく、５倍以上であることがより好ましく、８倍以上であることがさらに好ましい。
　細胞透過性亢進抑制活性は種々の惹起物質にて特定の細胞を刺激することで引き起こされた細胞透過性亢進に対する抑制活性を測定することにより確認することができる。細胞透過性亢進とは、外界からの様々な刺激によって引き起こされる組織障害に対して生体防御反応として炎症が惹起され、機械的原因に加えて組織障害及び炎症反応により誘導されるサイトカインやケミカルメディエーター等によって細胞間のバリア機構が破たんし、細胞同士の接合部が開くことにより物質が細胞間を通過しやすくなることを示す。透過性が亢進すると、細胞成分の一つである白血球が細胞に接着し、その形を扁平化させて細胞の間隙から浸潤する。白血球は、組織内に侵入してきた細菌や異物などを食作用によって細胞内に取り込み、消化分解して無毒化し、さらには壊死した細胞を除去させる。その結果、炎症が終焉に向かうとともに細胞透過性亢進も見られなくなり、同時に細胞修復も始まり元の正常な状態に戻る。しかしながら、組織障害が繰り返して生じる場合や、自己免疫異常による炎症の場合は、組織修復と同時に新たな炎症が始まるため、炎症が恒常的に続き、慢性炎症となり機能障害が引き起こされる。
　細胞透過性亢進が特に問題となる細胞は内皮細胞及び上皮細胞である。内皮は内皮細胞の薄層からなる。内皮細胞の層は、とりわけ、静脈や毛細血管などの血管の内部表面、及び血液と血管の外壁の間のバリア(関門)を形成する。内皮細胞は、大血管から最も小さい毛細血管までの全血管系の内側を被う。上皮細胞は、ヒト及び動物器官のすべての内部及び外部体表面を被う単層又は多層の細胞層を形成する。上皮細胞は、互いに近接して、細胞接着に富む。上皮細胞は、外側、外部又は内腔に向かう頂側、及び基底側に区別することができる。さらに、上皮細胞は、閉鎖帯 (密着結合)、接着帯 (接着結合)、及びデスモソーム (接着斑)からなる接着複合体(結合複合体)を有し、これは一方で物理化学的バリアを示し、他方で隣り合った上皮細胞を相互に連結させる。
　細胞透過性亢進抑制活性は、例えば、特開２０１５－６３４９８号公報の実施例（４）に記載されているように、非特許文献４に記載された試験方法によりヒト臍帯静脈内皮細胞における免疫抑制剤や炎症性サイトカインにより誘導される細胞透過性の亢進の阻害の程度を調べることにより確認することができる。細胞透過性亢進抑制活性としては、透過性亢進を抑制する効果を示すものであれば透過性亢進惹起物質や細胞の種類は特に限定されない。
　血管新生促進活性は、一般的な血管新生評価方法を用いて確認することができる。近年、心・脳などの血管障害が死因の過半を占めており、血管障害による死亡率の減少及び生存者のQOLの改善が医療の重要なテーマの一つとされている。特に重篤な疾患として閉塞性動脈硬化症(arteriosclerosis obliterans;ASO)などの重症慢性下肢虚血患者に対する血管新生療法が治療モデルとして盛んに行われている。血管新生促進活性は、例えば、特開２０１５－６３４９８号公報の実施例（５）に記載されているように、非特許文献４に記載された試験方法によりin vitroやin vivoの両方で確認することができる。in vitroでは、培養血管内皮細胞の管腔形成の促進活性を管腔の長さや分岐点の数で評価できる。in vivoでは、マウスマトリゲル皮下移植法にてゲル内のヘモグロビン含量で評価できる。
　細胞増殖促進活性は、一般的な細胞増速活性を測定する方法にて確認することができる。評価する細胞としては、特に限定されないが、内皮細胞及び上皮細胞であることが好ましい。細胞増殖促進活性は、例えば、特開２０１５－６３４９８号公報の実施例（７）に記載されているように、非特許文献４に記載された試験方法により確認することができる。
　細胞機能維持活性は、特定の細胞機能が維持されていることを一般的な方法にて確認することができる。例えば、特開２０１５－６３４９８号公報の実施例（６）に記載のように、血管内皮細胞の機能の場合はNO産生促進活性によって評価することができる（非特許文献４）。
　本発明のポリペプチドにおけるプロテインＣの活性化を促進する作用、すなわち抗凝固作用は、例えば、特開２０１５－６３４９８号公報の実施例（９）に記載のように、特開昭６４－６２１９号公報を初めとする各種の公知文献に明確に記載された試験方法により、プロテインＣの活性化を促進する作用の活性量やその有無を測定することにより容易に確認することができる。プロテインＣの活性化を促進する作用、すなわち抗凝固作用としては、Ｄ１２３が有する抗凝固活性の1/10以下であることが好ましく、1/100以下であることがより好ましく、1/1000以下であることがさらに好ましく、検出限界以下であることが特に好ましい。抗凝固作用が全く無いことが好ましい別の態様もある。
　本実施の形態におけるポリペプチドは、細胞保護活性として、細胞死抑制活性、細胞透過性亢進抑制活性、血管新生促進活性、細胞増殖促進活性、及び細胞機能維持活性からなる群から選ばれる１又は２以上の活性を有することが好ましく、２以上の活性を有していることがさらに好ましく、全ての活性を有していることが特に好ましい。
　本発明のポリペプチドは化学合成により、又は大腸菌などの微生物を用いた遺伝子組み換え操作により製造することができる。遺伝子操作の過程やポリペプチドの製造過程において、大腸菌等の微生物に適した宿主－ベクター系を使用することが好ましい。
　上記により取得された培養上清、又は培養物からのポリペプチドの単離精製方法は、公知の手法（例えば、堀尾武一編集、蛋白質・酵素の基礎実験法、１９８１）に準じて行うことができる。例えば、ポリペプチドと逆の電荷を持つ官能基を固定化したクロマトグラフィー担体と、ポリペプチドの間の相互作用を利用したイオン交換クロマトグラフィーや吸着クロマトグラフィーの使用も好ましい。また、ポリペプチドとの特異的親和性を利用したアフィニティークロマトグラフィーも好ましい例として挙げられる。
　また、Ｈｉｓタグを有する発現ベクターを使用した場合には、Ｈｉｓタグ精製キット（例えばＭＢＬ社製）を用いてポリペプチドを精製することができる。
　精製の程度は、使用目的等により選択でき、例えば電気泳動、好ましくはＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果が単一バンドとして得られるか、もしくは単離精製品のゲル濾過ＨＰＬＣ又は逆相ＨＰＬＣの結果が単一のピークになるまで純粋化することが好ましいが、単一のバンドを得ることを求めるものではない。
　本実施の形態におけるポリペプチドは、細胞保護活性として、細胞死抑制活性、細胞透過性亢進抑制活性、血管新生促進活性、細胞増殖促進活性、及び細胞機能維持活性からなる群から選ばれる１又は２以上の活性を有するものであれば、糖鎖やポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖が付加していてもよい。また、ポリペプチドを構成するアミノ酸の少なくとも一部にＤ体アミノ酸が含まれていてもよい。これらは、生体内での安定性が高い点で好ましい場合がある。
　ポリペプチドにおける糖鎖付加は、公知の方法により行うことができる（Sato M et.al. J Am Chem Soc. 2004 Nov 3;126(43):14013-22）。糖鎖はＮ末端、Ｃ末端又はそれらの間のアミノ酸に結合可能であるが、ポリペプチドの活性を阻害しないためにＮ末端又はＣ末端に結合することが好ましい。また、付加する糖鎖の個数は、１個又は２個が好ましく、１個が好ましい。糖鎖は、単糖から４糖が好ましく、さらには２糖又は３糖が好ましい。糖鎖は、ポリペプチドの遊離のアミノ基又はカルボキシル基に直接又は例えば炭素数１～１０程度のメチレン鎖等のスペーサー構造を介して結合することができる。
　ポリペプチドにおけるＰＥＧ鎖付加は、公知の方法により行うことができる（Ulbricht K et.al. Clin Nephrol. 2006 Mar;65(3):180-90）。ＰＥＧ鎖は、Ｎ末端、Ｃ末端又はそれらの間のアミノ酸に結合可能であり、通常、１個又は２個のＰＥＧ鎖が、ポリペプチド上の遊離のアミノ基やカルボキシル基に結合される。ＰＥＧ鎖の分子量は、特に限定されないが、通常3000～7000程度、好ましくは5000程度のものが用いられる。
　ポリペプチドを構成するアミノ酸の少なくとも一部をＤ体とすることは、公知の方法により行うことができる（Brenneman DE et.al. J Pharmacol Exp Ther. 2004 Jun;309(3):1190-7）。ポリペプチドを構成するアミノ酸の一部をＤ体としてもよいが、ポリペプチドの活性をできるだけ阻害しないようにするため、ポリペプチドを構成するアミノ酸の全てをＤ体アミノ酸とすることが好ましい場合がある。
　本実施の形態におけるポリペプチドは、市販のペプチド合成機を用いた化学合成等の常法によっても容易に製造することができる。また、上記安定化修飾も、上記各文献に記載されているような周知の方法により容易に行なうことができる。
　本発明のポリペプチドにおける２個のシステイン残基が形成するＳ－Ｓ結合が、ＣＨＲ１－ＣＨＲ２で表される基で置き換えられた本発明の一態様のポリペプチドは、例えば下記式（Ｉ）化合物（又は式（Ｉ）中のアミノ基もしくはカルボキシル基が適宜保護された化合物）を用い、本発明のポリペプチドとなるよう適宜必要なペプチドを化学合成により結合させることにより製造することができる。式（Ｉ）化合物は、公知の方法により又は当業者の技術常識に基づき製造することができる。例えば、式（Ｉ）中、Ｒ１及びＲ２がともに水素原子である化合物（２，７－ジアミノスベリン酸）は、公知の方法（森寛、日本化学雑誌、８２巻、１０号、１９６１年）により製造することができる。
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　本発明により、本発明の上記ポリペプチドを有効成分として含む医薬組成物が提供される。本実施の形態における医薬組成物は、細胞保護作用を有しており、低酸素、物理的因子（外傷、熱、放射線等）、感染、毒素、あるいは炎症反等によって惹起される細胞障害を改善するために用いることができる。
　細胞障害とは、適応の限界（可逆性）を超えた外的因子あるいは内的因子にさらされ、細胞の死に至るものと定義される。すなわち、外界からの様々な刺激によって引き起こされる組織障害やそれに伴って出てくる自己由来の起炎性因子に対して生体防御反応として炎症が惹起され、組織障害及び炎症反応により誘導されるサイトカインやケミカルメディエーター等によって細胞間のバリア機構が破たんし細胞透過性が亢進し、細胞がアポトーシス等の細胞死が誘導され、細胞機能障害が引き起こされる状態ことを言う。
　細胞障害としては、敗血症、虚血／再灌流障害、卒中、虚血性発作、急性心筋梗塞、急性神経変性疾患、アルツハイマー病、ダウン症症候群、ハンチントン病、筋委縮性側索硬化症、パーキンソン病、褥瘡、創傷、閉塞性動脈疾患、動脈硬化症、高脂血症、糖尿病、肥満、臓器移植、化学療法、免疫抑制薬、及び放射線障害等、種々の疾患や処置により細胞が受ける障害が挙げられる。本実施の形態による医薬組成物は、細胞保護作用を有することにより、これらの細胞障害を予防及び／又は治療することができる。なお、本明細書中において、細胞障害の予防及び／又は治療とは、細胞障害に起因する疾患の予防及び／又は治療も含む。
　本実施の形態における細胞障害は、低酸素、物理的因子（外傷、熱、放射線等）、感染、毒素、あるいは炎症反等によって惹起される細胞障害であれば特に限定されないが、血管内皮細胞障害、表皮細胞障害、消化管上皮細胞障害、気管上皮細胞障害、又は肺胞上皮細胞障害が例示される。
　血管内皮細胞障害は、高血圧、高血糖、脂質異常、喫煙、インスリン抵抗性、炎症性サイトカイン等の因子により血管内皮細胞が活性化され、それにより血管内皮細胞透過性が亢進し、血液中の有害物質が血管中に進入するのを防ぐことができなくなり、また、様々な細胞・組織・器官の情報伝達や免疫応答に関与することで血管の恒常性維持ができなくなる状態をいう。血管透過性が亢進し、血管が拡張するために発赤と浮腫による腫脹が起こり、それに伴い発熱物質や発痛物質による熱や痛みが生じる。
　血管内皮細胞障害に起因する疾患としては、敗血症、虚血／再灌流障害、卒中、虚血性発作、急性心筋梗塞、閉塞性動脈疾患、動脈硬化症、高脂血症、糖尿病、類洞閉塞症候群、溶血性尿毒症症候群、血栓性微小血管障害症、播種性血管内血液凝固症候群、全身性毛細管漏出症候群が例示される。本実施の形態における医薬組成物はこれら疾患の予防及び／又は治療に用いることができる。
　皮膚の表面には主に表皮細胞から形成される表皮があり、体内の水分保持や外界の細菌や刺激からからだを守るバリアの役割を果たしている。表皮細胞障害は、物理的因子（外傷、熱、外力、放射線等）やストレス、神経ペプチド、ヒスタミン、感染等により障害を受け、皮膚の透過性の亢進、感染防御能の低下といったいわゆるバリア機能が障害され、角質層における水分の保持機能が損なわれ、外界からの刺激物や細菌、アレルゲンが入りやすくなりさらに炎症が誘導され、皮膚の機能異常をきたした状態をいう。皮膚組織の微小循環不全から細胞壊死に至る場合もある。
　表皮細胞障害に起因する疾患としては、褥瘡、アトピー性皮膚炎が例示される。本実施の形態における医薬組成物はこれら疾患の予防及び／又は治療に用いることができる。
　消化管の場合、消化管の内側は消化管上皮細胞によって覆われており、消化管上皮細胞の内側には、マクロファージや樹状細胞、リンパ球といった免疫担当細胞が多数存在している。消化管上皮細胞障害とは、免疫反応、薬物、毒素、放射線照射により消化管上皮細胞透過性が亢進し消化管バリアが損傷すると、それによって侵入する外来異物や腸内細菌に対して、これらの免疫系細胞が反応し炎症を起こした状態をいう。
　消化管上皮細胞障害に起因する疾患としては、放射線障害、炎症性腸疾患が例示される。炎症性腸疾患の患者の消化管上皮において、細胞同士の接合に重要な蛋白質の発現異常が認められており、消化管バリアがルーズになって透過性が亢進することと炎症性腸疾患の重症度と相関することが報告されている。本実施の形態における医薬組成物はこれら疾患の予防及び／又は治療に用いることができる。
　気道上皮細胞は管腔側近傍に存在するタイトジャンクションで相互に結合することにより選択的透過障壁として機能し、気道上皮透過性の恒常性の維持に寄与している。気道上皮透過性の亢進は、多くの肺疾患における組織傷害モデルにおいて見られる。気道上皮細胞障害に起因する疾患としては、気管支喘息等アレルギー疾患が例示される。
　喘息は好酸球、マスト細胞、リンパ球などの活性化と気道粘膜障害を伴う気道の慢性炎症とされている。本実施の形態における医薬組成生物はこれらの疾患の予防及び／又は治療に用いることができる。
　肺の場合、肺胞の内側は肺胞上皮細胞によって覆われている。肺胞上皮細胞障害とは、細菌やウィルス感染、化学物質、薬物、高酸素や炎症反応により肺胞上皮細胞がダメージを受け透過性が亢進すると、タンパク成分に富む浮腫液がそのまま肺胞の中に漏出し肺胞の壁を覆って硝子膜を作り、硝子膜に覆われた肺胞は、酸素と炭酸ガスのやりとりをうまくできなくなってしまう状態をいう。肺の広い範囲で肺胞が硝子膜に覆われてしまう状態をびまん性肺胞傷害と呼ぶ。
　肺胞上皮細胞障害に起因する疾患としては、急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群 (ARDS)、肺炎が例示される。本実施の形態における医薬組成物はこれら疾患の予防及び／又は治療に用いることができる。
　本実施の形態における医薬組成物は、担体を含有することができる。用いることのできる担体としては、水溶性の担体が好ましく、通常は、医薬品の添加剤として許容できる、等張化剤、緩衝化剤、増粘剤、界面活性剤、保存剤、防腐剤、無痛化剤、ｐＨ調整剤などが好ましい。例えば、ショ糖、グリセリン等や、その他の無機塩のｐＨ調整剤等を添加剤として加えて調製することができる。さらに必要に応じて、特開平１－６２１９号公報及び特開平６－３２１８０５号公報に開示される通り、アミノ酸、塩類、糖質、界面活性剤、アルブミン、ゼラチン等を添加してもよい。本実施の形態における医薬組成物は、本実施の形態のポリペプチドに加えて、他の医薬成分を組み合わせて含んでもよい。他の医薬成分としては、例えば、免疫抑制剤、造血器悪性腫瘍治療薬等が挙げられる。
　担体及び他の医薬成分の添加方法は特に限定されないが、一態様において、免疫抑制剤及び造血器悪性腫瘍治療薬から選ばれる少なくとも１つを含有する本実施の形態の医薬組成物を、凍結乾燥製剤として製造する方法としては、通常行われるように、例えば、免疫抑制剤及び造血器悪性腫瘍治療薬から選ばれる少なくとも１つを含有する溶液とポリペプチド含有溶液を混合した後、担体等の添加物を添加混合し、凍結乾燥する方法や、あらかじめ担体等の添加物を水、注射用蒸留水あるいは適当な緩衝液に溶解した免疫抑制剤又は造血器悪性腫瘍治療薬から選ばれる少なくとも１つに混合した後、ポリペプチド含有溶液を添加混合にする方法にて溶液を調製し、凍結乾燥する方法が挙げられる。本実施の形態における医薬組成物が各医薬成分を組み合わせてなる場合には、各医薬は、適宜の製造方法により担体を添加して製造することが好ましい。本実施の形態における医薬組成物としては、注射液の形態で提供されても、また凍結乾燥製剤を使用時に溶解して使用する形態で提供されてもよい。
　製剤化工程においては、アンプル又はバイアルに、０．０１～１０ｍｇの本実施の形態におけるポリペプチド、注射用水、さらには、添加剤を含有する溶液を、例えば０．５～１０ｍＬ充填して水溶液注射用製剤として調製できる。また、凍結し減圧下のもとで乾燥して凍結乾燥製剤として調製する方法が例示される。
　本実施の形態における医薬組成物は、非経口投与法、例えば静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与などによって投与することが望ましい。また経口投与、直腸内投与、鼻内投与、舌下投与、経肺投与、経皮投与により投与することも可能である。
　本実施の形態における医薬組成物が各医薬成分を組み合わせてなる場合には、それぞれの医薬成分は、適宜の投与方法により投与することが好ましい。
　静脈内投与の場合、一度に所望の量を投与する方法（静脈内急速投与）又は点滴静脈内投与が挙げられる。一度に所望の量を投与する方法（静脈内急速投与）は投与時間が短い点で好ましい。
　本実施の形態における医薬組成物の投与量は、患者の年齢、体重、疾患の程度、投与経路などによっても異なるが、一般的には成人１日当たり０．０１～１００ｍｇを１～３回に分けて投与することが例示される。投与期間は数日～２カ月の連日投与が一般的であるが、患者の症状により１日投与量、投与期間共に増減することができる。また、投与間隔は、２日から１４日に１回、好ましくは２日から７日に１回、さらに好ましくは３日から５日に１回にとすることも可能である。
　なお、特開２０１５－６３４９８号公報には、Ｅ５ポリペプチドに関して、細胞保護活性及びプロテインＣの活性化促進作用の確認方法、並びにＥ５ポリペプチドを有効成分とする医薬組成物の用途及び製造方法などが開示されており、本発明のポリペプチドを実施するにあたり参酌することができる。特開２０１５－６３４９８号公報の開示の全てを参照により本明細書の開示として含める。
  以下、実施例及び試験例により本発明を具体的に説明するが、本発明は何らこれらによって限定されるものではない。以下の実施例の各方法は、特開２０１５－６３４９８号公報の実施例に準じて行うことができる。
１．ポリペプチドの作製
　ＫＡＦ０６、ＫＡＦ１２、ＫＡＦ２４、及びＫＡＦ３７は化学合成にて取得した。
２．ポリペプチドの細胞死抑制活性
　本発明のポリペプチドＫＡＦ０６、ＫＡＦ１２、ＫＡＦ２４、及びＫＡＦ３７の血管内皮保護活性を、細胞死抑制活性を測定することで調べた。
　具体的には、免疫抑制剤であるＦＫ５０６（１０μｇ／ｍL）により誘導されるヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の細胞死に対して、各ポリペプチドを添加し細胞死抑制活性を測定した。
　ＨＵＶＥＣを専用培地（２％ウシ胎児血清含有ＥＧＭ(endothelial cell growth medium)、Ｌｏｎｚａ）で培養後、トリプシン／ＥＤＴＡで剥離し専用培地に懸濁し、５×１０３細胞づつ９６ウェルプレートに播種した。最終濃度５００ｎＭになるように各ポリペプチドを添加後、培養は３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターにて行った。最終濃度１０μｇ／ｍＬとなるようにＦＫ５０６を添加し、さらに２４時間培養した。ブロモデオキシウリジン（１０μｍｏｌ／Ｌ／ｗｅｌｌ）を添加し４時間培養後、細胞内に取り込まれたブロモデオキシウリジンを測定した。測定は、細胞増殖ELISA,BrdU発色キット（Roche）を用いて、添付のプロトコールに準じて実施した。
　その結果、ＦＫ５０６無添加時の対照を１、ＦＫ５０６のみ添加時を０とした場合、本発明のポリペプチドＫＡＦ０６、ＫＡＦ１２、ＫＡＦ２４、及びＫＡＦ３７はそれぞれ、０．３４、０．８９、０．２８、０．２６と細胞死抑制作用が認められた。結果を図１に示す。
３．ポリペプチドの細胞増殖促進活性
　本発明のポリペプチドＫＡＦ０６、ＫＡＦ１２、ＫＡＦ２４、及びＫＡＦ３７による細胞増殖促進活性の測定を行った。
　具体的には、ＨＵＶＥＣ（５×１０3細胞）を、各ポリペプチド最終濃度５００ｎＭ存在下で、上記２．と同様の専用培地を用いて９６ウェルプレートにて２４時間培養した。さらに、ブロモデオキシウリジン（１０μｍｏｌ／Ｌ／ｗｅｌｌ）を添加し４時間培養後、細胞内に取り込まれたブロモデオキシウリジンを測定した。測定は、細胞増殖ELISA,BrdU発色キット（Roche）を用いて、添付のプロトコールに準じて実施した。
　その結果、無添加時の対照を１とした場合、本発明のポリペプチドＫＡＦ０６、ＫＡＦ１２、ＫＡＦ２４、及びＫＡＦ３７はそれぞれ、１．４６、１．２０、１．４３、１．４９といずれも細胞増殖促進作用が認められた。結果を図２に示す。
４．ポリペプチドの細胞死抑制活性（抗アポトーシス活性）
　本発明のポリペプチドＫＡＦ０６の細胞保護活性を、抗アポトーシス活性を測定することで調べた。
　具体的には、ＦＫ５０６により誘発されるＨＵＶＥＣのアポトーシス反応に対して、最終濃度を５００ｎＭになるようにＫＡＦ０６を添加し抗アポトーシス活性を測定した。
　ＨＵＶＥＣを上記２．と同様の専用培地にて培養後、トリプシン／ＥＤＴＡで剥離し、ＰＢＳに懸濁した。細胞懸濁液を２×１０5細胞／ｍLになるように１２ウェル培養プレート（Sumilon社）に１ｍLずつ分注した。ＦＫ５０６（１０μｇ／ｍＬ）、あるいはＦＫ５０６＋ＫＡＦ０６（５００ｎＭ）を添加し、３６時間曝露させた。アポトーシス細胞の測定は、アネキシンＶアポトーシス検出キット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を用いて、付属のプロトコールに準じて実施した。
　アポトーシス細胞は、アネキシンＶとＰＩ（プロピジウムアイオダイド）染色後、ＦＡＣＳにて検出した。アネキシンＶ陽性細胞を初期アポトーシス細胞（early apoptosis）、アネキシンＶとＰＩの両者が陽性である細胞を後期アポトーシス細胞（late apoptosis）と表し、その両方を合わせてアポトーシス細胞とした。
　その結果、本発明のポリペプチドＫＡＦ０６は、ＦＫ５０６によって誘導される初期アポトーシス細胞割合７．８％、後期アポトーシス細胞割合２８．５％に対して、それぞれ３．１％、１２．１％とアポトーシス抑制作用を有することがわかった。結果を図３に示す。
５．ポリペプチドの細胞死抑制活性（抗アポトーシス蛋白質誘導活性）
　本発明のポリペプチドＫＡＦ０６の細胞保護活性を細胞死抑制活性にて評価した。細胞死抑制活性は、血管内皮細胞を用いた抗アポトーシス蛋白質Ｍｃｌ－１発現誘導の測定にて評価した。ＨＵＶＥＣを上記２．と同様の専用培地を用いて培養し、培地中へＫＡＦ０６を５００ｎＭの濃度になるように添加して培養した。陰性対照として、ブランク（ペプチド無し）を用いた。添加後、４８時間後に培地を除き、細胞溶解液にてＨＵＶＥＣを溶解し、細胞抽出液を得た。細胞抽出液を５－１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、イモビロン－Ｐメンブレン (Millipore）に転写し、抗Ｍｃｌ－１抗体（Santa Cruz Biotechnology、sc-819）、及び抗ＧＡＰＤＨ抗体（Abcam）によるウエスタンブロットを実施し、以下の手順に従いＭｃｌ－１量を定量した。
　転写したイモビロン－Ｐメンブレンを室温にて１％ｍｉｌｋにて２分ブロッキングした。抗Ｍｃｌ－１抗体を１％ｍｉｌｋ液で１０００倍に希釈し、ナイロン膜と室温にて４℃にて終夜インキュベートした。インキュベート終了後、洗浄液（組成：ＰＢＳ＋０．１％ｔｗｅｅｎ２０）で計３回洗浄した。
　次いで、１％ｍｉｌｋ液で１０００倍に希釈した２次抗体溶液を添加し、室温にて６０分間インキュベートした後、洗浄液で計３回洗浄した。
　ＥＣＬウェスタンブロッティング検出システム（ＧＥヘルスケア・ジャパン）の添付のマニュアルに従い、基質溶液ＥＣＬ液２種類を添加し、室温で通常１～２分間インキュベートした後、ＬＡＳ４０００イメージアナライザー（ＦＵＪＩ  ＦＩＬＭ社）にて感光、現像を行った。Ｍｃｌ－１蛋白質のバンドの強度をＩｍａｇｅＪソフトウェア（Wayne Rasband、NIH）にて定量化した。
　次いで、同じナイロン膜を用いて、抗ＧＡＰＤＨ抗体にて同様の手順で染色後、ＧＡＰＤＨ蛋白質のバンド強度を定量し、内部標準として用いた。
　その結果、対照におけるＭｃｌ－１誘導活性を１とした場合のＫＡＦ０６の相対Ｍｃｌ－１誘導活性は２．６であった。本発明のポリペプチドＫＡＦ０６は、Ｍｃｌ－１誘導活性、すなわち細胞保護活性を有していることが確認された。結果を図４に示す。
６．ポリペプチドの血管内皮保護活性
　本発明のポリペプチドＫＡＦ０６の血管内皮保護活性を血管透過性亢進抑制活性を測定することで調べた。血管透過性亢進に対するポリペプチドの影響は、ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Millipore）を用いて、付属のプロトコールに準じて評価した。具体的には、ＨＵＶＥＣをコラーゲンコートされたインサート上にコンフルエントになるまで培養し、２４時間のスタベーション後、ＦＫ５０６（１０μｇ／ｍＬ）、あるいはＦＫ５０６＋ＫＡＦ０６（５００ｎＭ）を添加し１２時間培養した。ＦＩＴＣ標識デキストランを上室に添加し、下室に出てきたＦＩＴＣの蛍光強度を測定し血管内皮細胞透過性亢進活性とした。
　その結果、下室に出てきた蛍光強度は、無添加時の対照を１とした場合、ＦＫ５０６のみ添加した場合、３．３８と血管透過性亢進が認められた。ＫＡＦ０６を同時に添加した場合、２．１５と低下が認められ、ＫＡＦ０６はＦＫ５０６による血管透過性亢進を抑制することが確認された。結果を図５に示す。
７．ポリペプチドの血管新生促進活性 
　本発明のポリペプチドＫＡＦ０６、およびＫＡＦ１２の血管新生促進活性を調べた。陽性対照としてＶＥＧＦ（Pepro Tech Inc社）を、陰性対照としてバッファーを用いた。
　血管新生促進活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管内皮管腔形成、及びマウスを用いたｉｎ  ｖｉｖｏマトリゲル皮下移植法にて評価した。具体的には、２４ウェル培養プレート（Sumilon社）を用いて、ヒト臍帯内皮細胞（２．５×１０4細胞／ｗｅｌｌ）を、増殖因子を減量したマトリゲル（BD Bioscience）に播種した。
　各ポリペプチド（５００ｎＭ）、又は陽性対照としてＶＥＧＦ（０．５ｎＭ）を添加し、８時間培養した。バッファーを添加したものを陰性対照とした。管腔形成は４０倍の倍率で光学倒立顕微鏡にて観察し、ランダムに選んだ５視野の管腔長さをＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Wayne Rasband）にて計測し、陰性対照に対する割合として示した。管腔の長さで定量化した結果、ＶＥＧＦは、３１７％、ＫＡＦ０６およびＫＡＦ１２はそれぞれ３３０％、１６９％と血管新生促進活性が認められた。結果を図６に示す。
　ｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生促進活性は、マトリゲル皮下移植法にて評価した。４０Ｕ／ｍＬのヘパリンを含む、増殖因子を低減させたマトリゲル（０．３ｍＬ）に、ＫＡＦ０６（５００ｎＭ）、又は陽性対照としてＶＥＧＦ（０．５ｎＭ）を混合し、Ｃ５７ＢＬ６マウス（６週齢雌）の背部皮下へ投与した。何も混合しないものを対照とした。４日後、マトリゲルを摘出してヘモグロビン含量を定量した。
　その結果、本発明のポリペプチドＫＡＦ０６、又はＶＥＧＦを混合した場合、マトリゲルはそれぞれ６６６ｇ／ｄＬ、８２４ｇ／ｄＬと高いヘモグロビン含量を示し、顕著な血管新生を促進する活性が認められた。結果を図７に示す。
　このように、ＶＥＧＦ同様、本発明のポリペプチドＫＡＦ０６を混合した場合、マトリゲルは高いヘモグロビン含量を示し、顕著な血管新生を促進する活性が認められた。
８．ポリペプチドによるＥＲＫ、Ａｋｔ、及びｐ３８のリン酸化促進活性
　本発明のポリペプチドＫＡＦ０６のＥＲＫ、Ａｋｔ、及びｐ３８のリン酸化に対する作用を評価した。
　具体的には、ＨＵＶＥＣを専用培地で培養後、無血清培地で３時間starvationした後、ＫＡＦ０６（５００ｎＭ）を添加した。陰性対照として、ブランク（ペプチド無し）を用いた。
　添加後、４８時間後に培地を除き、細胞溶解液にてＨＵＶＥＣを溶解し、細胞抽出液を得た。細胞抽出液を５－１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、イモビロン－Ｐメンブレン (Millipore）に転写し、上記５．と同様の方法にて各蛋白質のリン酸化を特異的抗体にて検出した。
　用いた抗体を以下に示す：
抗リン酸化ＥＲＫ抗体（Cell Signaling Technology, 9101）；
抗リン酸化Ａｋｔ抗体（Ｓｅｒ４７３）（Cell Signaling Technology, 9271）；
抗リン酸化ｐ３８抗体（Ｔｙｒ１８０／１８２）（Cell Signaling Technology, 9216）；
抗ＥＲＫ抗体（Cell Signaling Technology, 9102）；
抗Ａｋｔ抗体（Ｓｅｒ４７３）（Cell Signaling Technology, 9272）；
抗ｐ３８抗体（Cell Signaling Technology, 9212）；
　その結果、対照における各リン酸化蛋白質のバンド強度を１とした場合のＫＡＦ０６の相対バンド強度は、リン酸化ＥＲＫは３．９、リン酸化Ａｋｔは３．４、リン酸化ｐ３８は２．７と、本発明のポリペプチドＫＡＦ０６にはＥＲＫ、Ａｋｔ、及びｐ３８のリン酸化促進作用が認められた。結果を図８に示す。
９．ポリペプチドの抗凝固活性
　本発明のポリペプチドＫＡＦ０６、並びにＥ５（比較例１）の抗凝固活性を調べた。抗凝固活性は、プロテインＣ活性化促進活性とトロンビン添加凝固時間（ＴＣＴ）によって評価した。
　プロテインＣ活性化促進活性は、Ｅ５又はＫＡＦ０６をプロテインＣ及びトロンビンと反応後、生成した活性化プロテインＣを合成基質Ｓ－２３６６にて４０５ｎｍの吸光度を測定することにより評価した。
　２０ｍＭ塩化カルシウム溶液７５μＬに、検量線用のコントロールＤ１２３、本発明のポリペプチドＫＡＦ０６、並びにＥ５（比較例１）を２５μＬ添加し混合後、４０ＮＩＨＵ／ｍＬトロンビン溶液２５μＬ、次いで１５μｇ／ｍＬプロテインＣ溶液２５μＬ添加、３７℃１０分インキュベートした。アンチトロンビンＩＩＩを添加し３７℃１０分インキュベートし反応を停止させた後、基質溶液を添加し、３７℃１０分インキュベートした。反応を停止後、４０５ｎｍ吸光度を測定し、Ｄ１２３を用いた検量線から、本発明のポリペプチドＫＡＦ０６、並びにＥ５のプロテインＣ活性化促進活性を求めた。
　その結果、Ｄ１２３、Ｅ５並びに本発明のポリペプチドＫＡＦ０６の比活性は、それぞれ２．８×１０１１Ｕ／ｍｏｌ、６．７×１０６Ｕ／ｍｏｌ、０Ｕ／ｍｏｌであった。本発明のポリペプチドＫＡＦ０６にはプロテインＣ活性化促進活性が認められなかった。
　ＴＣＴは、ヒト正常プール血漿に添加した時の凝固時間が約１０秒となるようなトロンビン溶液を用いて測定した。ＴＣＴは、自動血液凝固測定装置ＫＣ１０Ａ（Heinrich Amelung GmbH社）にて添付のマニュアルに基づき測定した。被験物質非添加血漿のＴＣＴに対するコントロールＤ１２３，Ｅ５又はＫＡＦ０６添加血漿の凝固時間の延長率を算出した。
　具体的には、スチールボールを入れたサンプルカップをＫＣ１０Ａにセットし、ヒト正常血漿を１００μＬずつ添加し、３７℃で１分間保温する。サンプルカップに、バッファーのみ、Ｄ１２３（血漿中濃度５０、５００ｎＭ）、ＫＡＦ０６（血漿中濃度５００、５０００ｎＭ）、並びにＥ５（血漿中濃度５００、５０００ｎＭ）を２０μＬ添加し、３７℃でさらに２分間保温する。トロンビン溶液をサンプルカップに１００μＬずつ添加し凝固時間を測定する。
　その結果、Ｄ１２３のＴＣＴ延長率は５０ｎＭが１３２．４％、５００ｎＭが５５４．７％に対して、Ｅ５のＴＣＴ延長率は５００ｎＭが１１３．４％、５０００ｎＭが２０６．４％、ＫＡＦ０６のＴＣＴ延長率は５００ｎＭが９９．６％、５０００ｎＭが１０４．９％であった。本発明のＫＡＦ０６にはＴＣＴ延長は全く認められなかった。
　プロテインＣ活性化促進活性とＴＣＴ延長率において、ＫＡＦ０６は全く抗凝固作用が認められなかった。
１０．マウス肝類洞閉塞症候群（ＳＯＳ）モデル
　本発明のポリペプチドＫＡＦ０６の細胞保護作用を、マウスＳＯＳモデルで評価した。
　レシピエントマウスとして、Ｃ５７ＢＬ６マウスを、骨髄移植処置無し群（正常コントロール）、ＰＢＳ投与有の骨髄移植処置群（ＢＭＴ＋ＰＢＳ）、及び本ペプチドＫＡＦ０６投与有の骨髄移植処置群（ＢＭＴ＋ＫＡＦ０６）の3群に無作為に振り分けた。骨髄移植前処置として、骨髄移植7日前から4日前までブスルファン（２５ｍｇ／ｋｇ／日、4日間）腹腔内投与後、骨髄移植3日前から2日前までシクロフォスファミド（１００ｍｇ／ｋｇ／日、2日間）腹腔内投与した。移植当日、ＢＡＬＢ／Ｃドナーマウスから採取した骨髄細胞（５×１０６細胞／マウス）を各レシピエントマウスの静脈内へ投与した。移植当日をＤａｙ０とした。コントロールのＰＢＳまたは本発明のポリペプチドＫＡＦ０６（５００μｇ／ｋｇ）は、骨髄移植７日前からＤａｙ１３まで１日１回、隔日投与した。
　Ｄａｙ７，１４，２０の血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）とアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）を測定した。
　Ｄａｙ７，１４，２０のＳＯＳスコアを算出した。ＳＯＳスコアは、肝臓スライス断片の組織染色結果（ヘマトキシリンーエオジン染色、pan-endothelial cell monoclonal antibody (MECA-32)を用いた免疫組織染色、マッソン染色）をブラインド下でＤｅＬｅｖｅらの報告を改良した方法に基づき評価した。
　血管内皮細胞障害は、血漿中可溶性トロンボモジュリン濃度にて評価した。トロンボモジュリン濃度は、Cloud-Clone社ＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。
　その結果、正常コントロール群に対してＢＭＴ＋ＰＢＳ群でＳＯＳの発症が認められたが、ＢＭＴ＋ＫＡＦ０６群ではＳＯＳ発症が抑制された。
　具体的には、ＢＭＴ＋ＰＢＳ群では移植後３０日目で１６匹中９匹が死亡したのに対して、ＢＭＴ＋ＫＡＦ０６投与群では、１６匹全例生存した。結果を図９に示す。
　Ｄａｙ７，１４，２０のＡＳＴは、ＢＭＴ＋ＰＢＳ群では２１４、１２３、７４Ｕ／Ｌに対して、ＢＭＴ＋ＫＦ０６投与群では７８、７５、６４Ｕ／Ｌと低下していた。Ｄａｙ７，１４，２０のＡＬＴは、ＢＭＴ＋ＰＢＳ群では１２７、４１、３０Ｕ／Ｌに対して、ＢＭＴ＋ＫＦ０６投与群では３８、２４、２３Ｕ／Ｌと低下していた。すなわち、ＢＭＴ＋ＰＢＳ群で認められた肝機能障害はＢＭＴ＋ＫＦ０６投与群で抑制されていた。結果を図１０に示す。
　Ｄａｙ７、１４、２０のＳＯＳスコアは、ＢＭＴ＋ＰＢＳ群では１２．７、９．０、９．３に対して、ＢＭＴ＋ＫＡＦ０６投与群では５．７、４．７、４．０と低下していた。結果を図１１に示す。
　Ｄａｙ７、１４、２０の血漿検体の可溶性トロンボモジュリン濃度は、ＢＭＴ＋ＰＢＳ群では５９．６５、３４．３６、２０．９２ｎｇ／ｍＬに対して、ＢＭＴ＋ＫＡＦ０６群では２４．１４、２０．１９、１５．３７ｎｇ／ｍＬと低下が認められ、ＫＡＦ０６の血管内皮細胞障害抑制作用が確認できた。結果を図１２に示す。
１１．プロトロンビン時間及び活性化部分トロンボプラスチン時間
　プロトロンビン時間（ＰＴ）の測定では、Ｅ５、可溶性トロンボモジュリン（Ｄ１２３）、又はＫＡＦ０６（各１０μL）の存在下又は非存在下で２００μLのＰＴ試薬（Ｓｙｓｍｅｘ）を１００μLのヒト血漿と混合した。活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＴＰＰ）の測定では、Ｅ５、Ｄ１２３、又はＫＡＦ０６（各１０μL）の存在下又は非存在下で１００μLのＡＰＴＴ試薬（Ｓｙｓｍｅｘ）を１００μLのヒト血漿と混合した。混合物を１２０秒間インキュベートした後に１００μLのＣａＣｌ２を加えた。凝固時間をＫＣｌデルタ凝固計（Ｔｃｏａｇ，Ｂｒａｙ）で測定した。
　Ｄ１２３は５００ｎＭでＰＴ及びＡＰＴＴをそれぞれ約２００％及び１６５％延長させた。かなり高濃度のＤ１２３（５０００ｎＭ）ではＰＴ及びＡＰＴＴがそれぞれ４００％及び９００％以上延長した。Ｅ５（５０００ｎＭ）でもＰＴ及びＡＰＴＴをそれぞれ１３７％及び２２５％延長したことは興味深い。ＫＡＦ０６の最高濃度（５０００ｎＭ）ではＰＴ又はＡＰＴＴのいずれも延長しなかったことは注目に値する。結果を図１３に示す。
  本発明により提供されるポリペプチドは、優れた細胞保護活性を有し、かつ実質的に抗凝固活性を示さないことから、副作用としての出血リスクを回避した医薬の有効成分として有用である。

Claims (8)

  1. Ｘ１ＣＰＥＧＹＩＬＤＤＧＸ２ＩＣＴＤＩＤＥで表されるポリペプチド（式中、アミノ酸残基は一文字表記により示し、ただし、Ｎ末端から２番目のシステイン残基（Ｃ）とＮ末端から１４番目のシステイン残基（Ｃ）はＳ－Ｓ結合を形成して互いに結合しており、該Ｓ－Ｓ結合はＣＨＲ１－ＣＨＲ２（Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１～４のアルキル基、ハロゲン原子、水酸基、又はアミノ基を示す）で表される基で置き換えられていてもよく；Ｘ１は存在しないか、又はグルタミン酸残基（Ｅ）若しくはアスパラギン酸残基（Ｄ）を示し；Ｘ２はフェニルアラニン残基、アラニン残基、又はチロシン残基を示す）又はその塩。
  2. ＥＣＰＥＧＹＩＬＤＤＧＦＩＣＴＤＩＤＥで表されるポリペプチド（式中、アミノ酸残基は一文字表記により示し、ただし、Ｎ末端から２番目のシステイン残基（Ｃ）とＮ末端から１４番目のシステイン残基（Ｃ）はＳ－Ｓ結合を形成して互いに結合しており、該Ｓ－Ｓ結合はＣＨＲ１－ＣＨＲ２（Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１～４のアルキル基、ハロゲン原子、水酸基、又はアミノ基を示す）で表される基で置き換えられていてもよい）又はその塩。
  3. ＣＰＥＧＹＩＬＤＤＧＦＩＣＴＤＩＤＥで表されるポリペプチド（式中、アミノ酸残基は一文字表記により示し、ただし、Ｎ末端のシステイン残基（Ｃ）とＮ末端から１３番目のシステイン残基（Ｃ）はＳ－Ｓ結合により互いに結合しており、該Ｓ－Ｓ結合はＣＨＲ１－ＣＨＲ２（Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１～４のアルキル基、ハロゲン原子、水酸基、又はアミノ基を示す）で表される基で置き換えられていてもよい）又はその塩。
  4. 下記のいずれかのポリペプチド：
    ＥＣＰＥＧＹＩＬＤＤＧＡＩＣＴＤＩＤＥで表されるポリペプチド、ＥＣＰＥＧＹＩＬＤＤＧＹＩＣＴＤＩＤＥで表されるポリペプチド、ＣＰＥＧＹＩＬＤＤＧＡＩＣＴＤＩＤＥで表されるポリペプチド、又はＣＰＥＧＹＩＬＤＤＧＹＩＣＴＤＩＤＥで表されるポリペプチド（式中、アミノ酸残基は一文字表記により示し、２個のシステイン残基（Ｃ）はＳ－Ｓ－結合を形成して互いに結合しており、該Ｓ－Ｓ結合はＣＨＲ１－ＣＨＲ２（Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１～４のアルキル基、ハロゲン原子、水酸基、又はアミノ基を示す）で表される基で置き換えられていてもよい）あるいはその塩。
  5. 該Ｓ－Ｓ結合がＣＨＲ１－ＣＨＲ２で表される基で置き換えられていない請求項１ないし４のいずれか１項に記載のポリペプチド又はその塩。
  6. 該Ｓ－Ｓ結合がＣＨＲ１－ＣＨＲ２で表される基で置き換えられている請求項１ないし４のいずれか１項に記載のポリペプチド又はその塩。
  7. 請求項１ないし６のいずれか１項に記載のポリペプチド又はその塩を有効成分として含む医薬組成物。
  8. 細胞障害、血管内皮細胞障害、消化管上皮細胞障害、気管上皮細胞障害、肺胞上皮細胞障害、及び表皮細胞障害からなる群から選ばれる１又は２以上の障害の予防及び／又は治療のため請求項７に記載の医薬組成物。

     
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