KR20170095367A - 조직 석회화의 치료 방법 - Google Patents

조직 석회화의 치료 방법 Download PDF

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넬슨 샤
타예바 칸
김 리넷 아스큐
그레고리 그라보우스키
질리앙 쳉
더블유. 찰스 오닐
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알렉시온 파마슈티칼스, 인코오포레이티드
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Abstract

본 발명은 NPP1 결핍증, 또는 특발성 영아 동맥 석회화 (IIAC), 탄력섬유성가황색종, 만성 신장 질환에서 혈관 석회화 (VCCKD), 인슐린 저항성, 저인산혈성 구루병, 심근 허혈, 관절 석회화, 혈관양선조 및 척추의 후종인대 골화증과 같은 NPP1-관련 질환의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 가용성 NPP1을 투여하여 혈청 피로인산염 수준의 일시적인 증가를 생성함으로써 조직 석회화를 치료하는 방법을 제공한다.

Description

조직 석회화의 치료 방법{METHODS OF TREATING TISSUE CALCIFICATION}
관련 출원
본 출원은 2014년 12월 19일에 출원된 미국 가출원 번호 제 62/094,943호 및 2015년 11월 2일에 출원된 미국 가출원 번호 제 62/249,781호의 이익을 주장한다. 상기 출원의 전체 내용은 참조로 본 명세서에 포함된다.
전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조
출원서와 함께 출원된 ASCII 텍스트 파일 (이름: 081245-0208_ascii.txt; 크기: 88,556 bytes; 및 생성일: 2015년 12월 15일)로 전자적으로 제출된 서열 목록의 내용은 전체 참조로 본 명세서에 포함된다.
혈관 석회화는 매우 작고, 분산된 히드록시아파타이트(hydroxyapatite, HA)의 결정의 형성 및 동맥과 같은 혈관 조직에서의 큰 석회화된 침전물로 특징지어질 수 있다. (Amann, K. Clin J Am Soc Nephrol 2008, 3, 1599-605). 세포외 피로인산염(Extracellular pyrophosphate, PPi)은 HA 형성을 저해함으로써 혈관 석회화의 주요 내인성 저해제이다. (Lomashvili, K. A. et al., J Am Soc Nephrol 2004, 15, 1392-1401; Fleisch, H. et al., Nature 1966, 212, 901-903).
엑토뉴클레오티드 피로포스파타제 피로포스포릴라제 (Ectonucleotide pyrophosphatase pyrophosphorylase, NPP1)는 ATP를 절단하여 세포외 피로인산염 (PPi)을 생성하는 체외효소(ectoenzyme)이다. 피로인산염은 히드록시아파타이트 형성의 유력한 저해제이고, 정상 조건 하에서 혈관 석회화를 저해하는 작용을 한다.
인간에서 NPP1의 결핍은 순환 PPi 수준을 감소시키고, 동맥 석회화 및 영아의 일반 동맥 석회화 (generalized arterial calcification of infancy, GACI)와 같은 질병에 연루되어 있다. (Rutsch, F. et al., Am J Pathol 2001,158, 543-554). 고-인산염 식이가 제공될 때, NPP1이 결핍된 마우스 (Enpp1 -/-)도 PPi 수준을 감소시키고 NPP1 결핍 인간과 유사한 표현형을 나타낸다. (Harmey, D. et al., Am J Pathol 2004, 164, 1199-1209). 또한, 혈관 석회화는 만성 신장 질환 (CKD) 및 말기 신질환 (end-stage renal disease, ESRD) 피험자에서 잘 알려지고 흔한 합병증이며, 병적 상태(morbidity)와 사망률(mortality)의 증가와 관련이 있다. (Giachelli, C. J Am Soc Nephrol 2004, 15, 2959-64; Raggi, P. et al., J Am Coll Cardiol 2002, 39, 695-701).
엑토뉴클레오티드 피로포스파타제/포스포디에스터라제 1 (NPP1/ENPP1/PC-1) 결핍은 제 II 형 막횡단 당단백질인 NPP1의 돌연변이에 의해 야기되는 희귀 질환이다. NPP1은 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 당의 포스포디에스터 결합 및 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 당의 피로인산염 결합을 포함하는 다양한 기질을 절단한다. NPP1 결핍증은 특발성 영아 동맥 석회화(idiopathic infantile arterial calcification, IIAC), 인슐린 저항성, 저인산혈성 구루병(hypophosphatemic rickets), 및 척추의 후종인대 골화증(ossification of the posterior longitudinal ligament of the spine)과 연관되어 있다.
희귀한 상염색체 열성이며 대체로 치명적인 장애인 IIAC는, 근육동맥의 내탄력판의 석회화 및 근내막 증식(myointimal proliferation)으로 인한 협착증을 특징으로 한다. 전 세계적으로 보고된 IIAC는 160건 이상이다. 상기 질환의 증상은 영아 초기에 가장 자주 나타나며, 상기 질환은 일반적으로 허혈성 심근병증, 및 신장 동맥 협착증(renal artery stenosis)을 포함하는 폐쇄성 동맥병증의 기타 합병증으로 인해 생후 6개월까지 치명적이다.
NPP1 단백질의 결핍이 IIAC와 같은 심각한 질환과 연관되어 있을지라도, 비정상적인 골대사; 낮은 수준의 순환 및 국소적으로 생성된 인산염 생성자의 저해제; 또는 신장 배설 장애로 인한 칼슘과 인의 고 전신 부하량(high total body burden)에 의해 야기된 질환 및 기타 석회화 질환에 걸린 사람들에 대해 현재 이용 가능한 치료제가 없다.
혈관 석회화를 예방하기 위한 현재의 치료 방안은 효능이 제한적이고, 바람직하지 않은 및/또는 용인할 수 없는 부작용이 있다. 예를 들어, 매우 많은 양의 외인성 PPi가 효능을 위해 필요하고, 다른 저해제인 히드록시아파타이트 형성은 뼈의 석회화를 저해하고 골연화증(osteomalacia)을 유발할 수 있다. 특히, 외인성 PPi의 직접 투여는 요독증에 걸린 동물 모델에서 석회화를 예방하는 것으로 밝혀졌다. (O'Neil, W. C. et al., Kidney Int 2011, 79, 512-517; Riser, B. L. et al., Nephrol Dial Transp 2011, 26, 3349-3357). 그러나, 이 방법은 PPi의 짧은 반감기로 인해 고용량의 PPi를 필요로 하며, PPi의 초생리적 혈장 수준을 초래하여 국소 자극을 야기한다. PPi의 비-가수분해성 유사체인 비스포스포네이트는, 동물 모델에서 혈관 석회화를 치료하는데 사용되어 왔다. (Fleisch, H. et al., Europ J Clin Invest 1970, 1, 12-18; Price, P. A. et al., Arteriosclerosis Throm and Vas Bio 2001, 21, 817-824; Price, P. A. et al., Kidney Int 2006, 70, 1577-1583; Lomashvili, K. A. et al., Kidney Int 2009, 75, 617-625). 그러나, 비스포스포네이트는 골 형성도 저해한다. 비스포스포네이트는 GACI에 걸린 피험자에서 석회화를 지연시킬 수는 있지만 멈출 수는 없다. (Rutsch, F. et al., Circ Cardiovasc Genet 2008, 1, 133-140), and, as in animals, lead to osteomalacia. (Otero, J. E., et al., J Bone Miner Res 2013, 28, 419-430).
Braddock, D. et al., (WO 2014/126965A2)는 NPP1을 투여하여 병적 석회화 및 골화 치료용 조성물 및 방법을 기재하고 있다. Quinn, A. et al., (WO 2012/125182A1)은 GACI, 동맥 석회화, 인슐린 저항성, 저인산혈성 구루병, 및 척추의 후종인대 골화증을 포함하는 질병을 치료하기 위한 NPP1 융합 단백질을 기재하고 있다.
이 분야에서의 상당한 연구에도 불구하고, 바람직하게는 골연화증을 야기하지 않으면서, 혈관 석회화를 효과적으로 저해하기 위한 새로운 치료법에 대한 필요성이 요구되고 있다. 또한, IIAC, 만성 신장 질환에서 혈관 석회화 (VCCKD), 탄력섬유성가황색종(pseudoxanthoma elasticum, PXE), 인슐린 저항성, 저인산혈성 구루병, 및 척추의 후종인대 골화증의 치료를 위한 효과적이고 안전한 약제에 대한 필요성이 요구되고 있다.
본 발명은 NPP1-결핍증 또는 칼슘 및 다른 무기물의 침전물의 축적을 특징으로 하는 기타 진행성 장애의 치료를 위한 N-말단 세포질 및 막횡단 도메인 및 이의 융합 단백질이 결여된 분리된 재조합 인간 가용성 NPP1의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 단백질은 놀랍게도 NPP1 활성이 결핍되거나 또는 뼈, 관절, 심장, 혈관, 눈, 및/또는 피부에서 칼슘 침전물의 축적을 나타내는 피험자에서 혈액 NPP1 활성을 회복시키고 정상 수준의 피로인산염을 회복시키는데 사용될 수 있다.
더 상세하게는, 본 발명의 NPP1 단백질 및 NPP1 융합 단백질은 NPP1 결핍증 또는 특발성 영아 동맥 석회화 (IIAC, 영아에서 일반 동맥 석회화라고도 알려짐), 만성 신장 질환에서 혈관 석회화 (VCCKD), 탄력섬유성가황색종 (PXE), 인슐린 저항성, 저인산혈성 구루병, 관절 석회화, 심근 허혈 및 척추의 후종인대 골화증을 포함하나 이에 한정되지 않는 낮은 수준의 피로인산염과 관련된 기타 질환 또는 장애를 갖는 피험자를 치료하는데 사용될 수 있다. 동맥 및/또는 결합 조직에서 칼슘 및 다른 무기물의 침전물의 축적을 특징으로 하는 임의의 진행성 장애는 본 발명의 범위 내에 있다.
일 측면에서, 본 발명은 조직 석회화의 감소를 필요로 하는 피험자에서 조직 석회화, 바람직하게는 혈관 석회화를 감소시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 낮은 혈장 피로인산염 (PPi) 또는 상승된 무기 인산 (Pi)을 갖는 피험자에게, 가용성 엑토뉴클레오티드 피로포스파타제 포스포디에스터라제 (NPP1)를 포함하는 조성물의 치료적 유효량의 2회 이상의 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 각 용량은 피험자에서 혈장 PPi의 일시적인 증가를 달성하기에 충분한 가용성 NPP1의 양을 함유한다. 혈장 PPi의 일시적인 증가는 정상 혈장 PPi 수준의 적어도 약 40%인 피크 PPi 수준 및 용량의 투여 후 약 48시간 이내에 기준선 PPi 수준으로 되돌아감을 특징으로 한다. 투여 간격은 적어도 2일이다.
혈장 PPi의 일시적인 증가는 적어도 약 4시간, 바람직하게는 적어도 약 6시간, 적어도 약 8시간, 적어도 약 10시간 또는 적어도 약 12시간 동안 유지된다.
조직 석회화는 혈관 석회화, 예를 들어 정맥 또는 동맥 석회화일 수 있으며, 석회화는 내막(intimal) 또는 내측(medial)일 수 있다.
치료가 필요한 피험자는 NPP1 결핍증, 만성 신장 질환 (CKD), 말기 신질환 (ESRD), 영아의 일반 동맥 석회화 (GACI), 심혈관 장애, 제 II 형 당뇨병, 죽상 동맥 경화증 또는 탄력섬유성가황색종 (PXE)을 가질 수 있다. 피험자가 낮은 혈장 PPi를 갖는 경우, 피험자에서 혈장 피로인산염 (PPi)의 전처리 수준은 정상 혈장 PPi 수준보다 적어도 약 40% 낮으며, 피험자는 인간이다. 피험자가 높은 수준의 Pi를 갖는 경우, 피험자에서 Pi의 전처리 수준은 통상적으로 정상 혈장 Pi 수준의 적어도 약 110% 이다.
각 용량으로 투여되는 sNPP1의 양은 약 1.0 mg/kg 내지 약 5.0 mg/kg NPP1 또는 약 1.0 mg/kg 내지 약 10.0 mg/kg NPP1 일 수 있다. NPP1의 투여 간격은 적어도 2일이며, 예를 들어 적어도 3일, 적어도 1주, 2주 또는 1개월과 같이 더 길 수 있다.　 sNPP1은 임의의 적당한 방법, 예를 들어 정맥 내, 피하, 또는 복강 내로 투여될 수 있다.
바람직한 측면에서, NPP1 융합 단백질이 투여된다. 바람직한 융합 단백질은 면역글로불린 및 임의로 표적 부분(targeting moiety)의 Fc 영역 및 NPP1 성분을 포함한다. 바람직한 표적 부분은 Asp10 이다. 본 명세서에 개시된 방법에 따라 투여하기 위한 특히 바람직한 NPP1 융합 단백질은 서열번호:3, 서열번호:4, 서열번호:9, 서열번호:10, 서열번호:11 또는 서열번호:12의 아미노산을 가진다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기의 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사한 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 기재된다.
양, 시간 기간(temporal duration) 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 본 명세서에 사용된 "약"은, 특정 값으로부터 ± 20% 또는 ± 10%, 더 바람직하게는 ± 5%, 더욱 바람직하게는 ± 1%, 더욱 더 바람직하게는 ± 0.1%의 편차를 포함하는 것을 의미하므로, 이러한 편차는 개시된 방법을 수행하는데 적합하다.
용어 "변경된 PPi:Pi 비율"은 피험자의 유형 (예를 들어, 인간)에 대한 정상 PPi:Pi 비율보다 적어도 10% 또는 적어도 20% 높거나 또는 낮은 혈장 내 PPi 대 혈청 내 Pi의 비율을 나타낸다. 변경된 PPi:Pi 비율은 혈장 PPi의 정상 수준보다 낮거나 또는 혈청 Pi의 정상 수준보다 높기 때문에 나타날 수 있다. PPi:Pi 비율은 ([PPi]/[Pi])*1000으로 표시되며, 인간의 정상 비율은 약 1.75이다.
본 명세서에 사용된 용어 "단편"은, NPP1 단백질과 관련하여, 전장 NPP1의 하위서열(subsequence)을 나타낸다. 단백질 또는 펩티드의 "단편"은 적어도 약 20 아미노산 길이; 예를 들어, 적어도 약 50 아미노산 길이; 적어도 약 100 아미노산 길이; 적어도 약 200 아미노산 길이; 적어도 약 300 아미노산 길이; 또는 적어도 약 400 아미노산 길이 (및 사이에 있는 모든 정수 값) 일 수 있다. 상기 단편은 4개의 아미노산 잔기 내지 전체 아미노산 서열 - 1개의 아미노산 크기의 범위일 수 있다. 따라서, "서열번호: 1의 아미노산 서열의 적어도 일부를 포함하는" 단백질은 전장 NPP1 및 이의 단편을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "높은 혈청 Pi"는 피험자의 유형 (예를 들어, 인간)에 대한 Pi의 정상 수준의 적어도 110%인 피험자의 혈청 내 무기 인산 (inorganic phosphate, Pi)의 수준을 나타낸다. 바람직하게는, 피험자의 혈청 내 Pi의 수준은 피험자의 유형에 대한 Pi의 정상 수준의 적어도 약 120%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200% 또는 적어도 약 300%일 수 있다. 인간의 정상 Pi 수준은 1.5 ± 0.5 밀리몰로 알려져 있다 (Rutsch, F. et al., Circ Cardiovasc Genet 1:133-140 (2008).).
"분리된" 또는 "정제된" 가용성 NPP1 단백질 또는 생물학적 활성 단편 또는 이의 융합 단백질은 세포 물질 또는 NPP1 단백질, 생물학적 활성 단편 또는 NPP1 융합 단백질이 유래된 세포 또는 조직 공급원으로부터의 다른 오염 단백질이 실질적으로 없거나 또는 화학적으로 합성될 때 화학 물질 전구체 또는 다른 화학 물질이 실질적으로 없다. 용어 "세포 물질이 실질적으로 없는"은 NPP1 단백질, 생물학적 활성 단편, 또는 NPP1 융합 단백질의 제제를 포함하며, 여기서 단백질은 분리되거나 또는 재조합적으로 제조된 세포의 세포 성분으로부터 분리된다. 일 실시예에서, 용어 "세포 물질이 실질적으로 없는"은 약 30% 미만 (건조 중량 기준)의 비-NPP1 단백질/단편/융합 단백질 (본 명세서에서 "오염 단백질"이라고도 함), 더 바람직하게는 약 20% 미만의 비-NPP1 단백질/단편/융합 단백질, 더욱 더 바람직하게는 약 10% 미만의 비-NPP1 단백질/단편/융합 단백질, 가장 바람직하게는 약 5% 미만의 비-NPP1 단백질/단편/융합 단백질을 갖는 NPP1 단백질, 생물학적 활성 단편 또는 NPP1 융합 단백질의 제제를 포함한다. NPP1 단백질, 융합 단백질, 또는 이의 생물학적 활성 단편이 재조합적으로 제조될 때, 또한 바람직하게는 배양 배지가 실질적으로 없다, 즉, 배양 배지는 약 20% 미만, 더 바람직하게는 약 10% 미만, 가장 바람직하게는 약 5% 미만의 부피의 단백질 제제를 나타낸다.
본 명세서에 사용된 용어 "낮은 혈장 PPi"는 피험자의 유형 (예를 들어, 인간)에 대한 PPi의 정상 수준의 50% 이하인 피험자의 혈장 내 피로인산염 (PPi)의 수준을 나타낸다. 바람직하게는, 피험자의 혈장 내 PPi의 수준은 피험자 유형에 대한 PPi의 정상 수준의 약 40% 이하, 약 30% 이하, 약 20% 이하 또는 약 10% 이하이다. 인간에 대한 정상 PPi 수준은 2.63 ± 0.47 밀리몰로 알려져 있다. (O'Neill et al., Nephrol Dial Transplant 2010, 25, 187-191). 피로인산염은 적당한 알려진 방법, 예를 들어 우리딘-디포스포글루코오스 (uridine-diphosphoglucose, UDPG) 방법을 이용하여 효소적으로 정량화될 수 있다. (Ryan, L. M. et al., Arthritis Rheum 1979, 22, 886-91).
범위: 본 명세서 전체에 걸쳐, 본 발명의 다양한 측면이 범위 형식(range format)으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 설명은 단지 편의상 및 간결하게 하기 위한 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안된다. 따라서, 범위의 설명은 가능한 모든 하위 범위(subranges)와 그 범위 내의 개별 수치를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 설명은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하위 범위와, 그 범위 내의 개별 수치, 예를 들어, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
본 명세서에 사용된 용어 "피험자"는 포유류 및 비-포유류를 포함한다. 포유류의 예는 인간, 침팬지, 유인원, 원숭이, 소, 말, 양, 염소, 돼지, 토끼, 개, 고양이, 랫트, 마우스, 기니아 피그 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 비-포유류의 예는 새, 어류 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용된 용어 "치료적 유효량"은 이러한 양을 투여받지 않은 상응하는 피험자와 비교하여 질환, 장애, 또는 부작용의 향상된 치료, 치유, 예방, 또는 개선, 또는 질환 또는 장애의 진행 속도의 감소를 야기하는 약제 (예를 들어, sNPP1 단백질)의 비독성이나 충분한 양을 나타낸다. 또한 상기 용어는 정상적인 생리 작용을 향상시키는데 효과적인 양을 이의 범위 내에 포함한다.
용어 "치료하는"은 질환 또는 장애를 치료, 치유, 완화, 경감, 변경, 구제, 개선, 예방, 향상, 또는 영향을 미치게 할 목적으로, 피험자에게 본 발명의 NPP1 단백질, 단편 및 융합 단백질의 적용 또는 투여, 또는 NPP1-관련 질환 또는 장애 또는 낮은 수준의 혈액 피로인산염과 관련된 기타 질환 또는 장애, 또는 칼슘 및 다른 무기물의 침전물의 축적 (무기질화)을 특징으로 하는 다른 진행성 장애를 갖는 피험자에게 본 발명의 NPP1 단백질, 단편 및 융합 단백질의 적용 또는 투여를 포함한다. 용어 "치료하는"은 감소(abatement); 차도(remission); 증상의 감소 또는 상처, 병소 또는 질병을 피험자에게 보다 견딜수 있게 하는 것; 퇴보 또는 쇠퇴의 속도를 늦추는 것; 퇴보의 마지막 지점을 덜 쇠약하게 하는 것; 또는 피험자의 육체적 또는 정신적 웰빙을 향상시키는 것;과 같은 객관적인 또는 주관적인 매개변수를 포함하여, 상처, 병소 또는 질병의 치료 또는 개선에 성공했음을 나타낸다. 치료는 치료적 또는 예방적일 수 있다. 증상의 치료 또는 개선은 신체 검사의 결과를 포함하여, 객관적인 또는 주관적인 매개변수를 기반으로 할 수 있다.
치료 방법
본 발명은 NPP1-관련 질환 및 장애의 치료를 위한 N-말단 부분 (즉, 세포질 및 막횡단 도메인이 결여된) 및 이의 융합 단백질이 결여된 분리된 재조합 인간 가용성 NPP1 ("sNPP1")의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 단백질은 놀랍게도 in vivo에서 NPP1 활성을 증가시키고, 피험자에서 정상 수준의 혈액 피로인산염 (PPi)을 증가시키거나 또는 회복시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 단백질은 관절, 신장, 심장 (예를 들어, 대동맥), 동맥, 혈관, 또는 척추의 후종인대에서 칼슘 침전물의 축적을 예방하는데도 사용될 수 있다.
피험자는 낮은 수준의 피로인산염과 관련된 질환 또는 장애를 앓고 있거나, 또는 탄성 섬유에서 칼슘 및 다른 무기물의 침전물의 축적 (무기질화)을 특징으로 하는 진행성 장애를 앓고 있는, 낮은 수준의 피로인산염을 나타내는 NPP1 활성의 결핍 (NPP1 결핍증)을 갖는 인간 환자일 수 있다. 무기질화는 심장, 동맥, 혈관, 신장, 척추 인대, 피부, 눈 및 소화관에서 발생할 수 있다.
더 상세하게는, 본 발명의 NPP1 단백질 및 NPP1 융합 단백질은 특발성 영아 동맥 석회화 (IIAC), 인슐린 저항성, 저인산혈성 구루병 및 척추의 후종인대 골화증을 포함하나 이에 한정되지 않는 NPP1-관련 질환 또는 장애, 또는 만성 신장 질환에서 혈관 석회화 (VCCKD), 심근 허혈, 관절 석회화, 혈관양선조(angioid streaks), 및 탄력섬유성가황색종 (PXE)과 같은 기타 질환을 갖는 피험자를 치료하는데 사용될 수 있다.
가용성 NPP1 단백질, 단편 및 이의 NPP1 융합 단백질은 피험자에서 다양한 질병을 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 석회화 구조를 감소 및/또는 제거, 및/또는 포유류, 예를 들어, 인간 환자와 같은 피험자에서 석회화 구조가 형성되는 것을 예방함으로써 향상될 수 있는 질병의 치료는 본 발명의 범위 내에 있다.
특히 유용한 일 실시예에서, 치료될 질병은 일반 동맥 석회화이다 (영아의 특발성 동맥 석회화 및 영아의 동맥 매질 석회화라고도 알려짐).
다른 실시예에서, 탄력섬유성가황색종, 만성 신장 질환에서 혈관 석회화, 인슐린 저항성, 저인산혈성 구루병 또는 척추의 후종인대 골화증과 같은 질병은 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 치료될 수도 있다.
일반적으로, 피험자에 투여되는 융합 단백질의 투여량은 수령인의 연령, 건강 및 체중, 동시 치료의 유형, 치료 빈도 등과 같은 알려진 인자에 따라 변할 것이다. 통상적으로, 활성 성분(즉, 융합 단백질)의 투여량은 체중의 킬로그램 당 약 0.0001 내지 약 50 밀리그램일 수 있다. 정확한 투여량, 투여 빈도 및 치료 기간은 치료용 단백질의 투여 분야에서 숙련된 의사에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예는 치료적 유효량의 분리된 가용성 NPP1 단백질 (sNPP1), 생물학적 활성 단편, 또는 NPP1 융합 단백질을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는 NPP1-관련 질환 또는 기타 석회화 질환의 치료 방법을 포함한다. 본 명세서에 정의된 바와 같이, 단백질의 치료적 유효량 (즉, 유효 용량)은 약 0.001 내지 50 mg/kg 체중의 범위이다. 당업자는 질환의 중증도, 이전 치료, 피험자의 일반 건강 및/또는 연령, 및 존재하는 기타 질환을 포함하나 이에 한정되지 않는 특정 인자가 피험자를 효과적으로 치료하는데 필요한 용량에 영향을 미칠 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 치료적 유효량의 단백질로 피험자의 치료는 단일 치료를 포함할 수 있거나, 또는 바람직하게는 일련의 치료를 포함할 수 있다. 또한, 치료에 사용되는 단백질의 유효량은 특정 치료 과정 동안 증가 또는 감소할 수 있음을 이해할 것이다.
본 명세서에 정의된 바와 같이, 단백질 또는 폴리펩티드의 치료적 유효량 (즉, 유효 용량)은 약 0.001 내지 50 mg/kg 체중, 바람직하게는 약 0.01 내지 25 mg/kg 체중, 더 바람직하게는 약 0.1 내지 20 mg/kg 체중, 더욱 더 바람직하게는 약 1 내지 10 mg/kg, 2 내지 9 mg/kg, 3 내지 8 mg/kg, 4 내지 7 mg/kg, 또는 5 내지 6 mg/kg 체중의 범위이다. 당업자는 질환 또는 장애의 중증도, 이전 치료, 피험자의 일반 건강 및/또는 연령, 및 존재하는 기타 질환을 포함하나 이에 한정되지 않는 특정 인자가 피험자를 효과적으로 치료하는데 필요한 용량에 영향을 미칠 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 치료적 유효량의 단백질, 폴리펩티드, 또는 항체로 피험자의 치료는 단일 치료를 포함할 수 있거나, 또는 바람직하게는 일련의 치료를 포함할 수 있다.
바람직한 예에서, 약 0.1 내지 20 mg/kg 체중의 범위 내이며, 1주에 1회, 1주에 2회, 약 10일에 한번, 약 12일에 한번, 약 14일에 한번, 약 17일에 한번, 약 20일에 한번, 약 25일에 한번, 또는 약 30일에 한번이다. 또한, 치료에 사용되는 가용성 sNPP1 단백질, 생물학적 활성 단편 또는 이의 융합 단백질의 유효량은 특정 치료 과정 동안 증가 또는 감소할 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명은 의학 분야의 의사에 의해 결정된 기간 동안 5일마다 1회 및 30일마다 1회 사이에 환자에게 투여되는 sNPP1, 생물학적 활성 단편 또는 이의 융합 단백질의 치료적 유효량을 제공한다. 일 실시예에서, 시간 주기는 환자의 수명의 나머지일 것이다. 일 실시예에서, 투여 빈도는 5일마다 1회 및 25일마다 1회 사이이다. 일 실시예에서, 투여 빈도는 5일마다 1회 및 21일마다 1회 사이이다. 또 다른 실시예에서, 투여 빈도는 7일마다 1회 및 14일마다 1회 사이이다. sNPP1, 생물학적 활성 단편 또는 이의 융합 단백질은 5일마다 1회, 6일마다 1회, 7일마다 1회, 8일마다 1회, 9일마다 1회, 10일마다 1회, 11일마다 1회, 12일마다 1회, 13일마다 1회, 또는 14일마다 1회 투여될 수 있다. 일 실시예에서, sNPP1, 생물학적 활성 단편 또는 이의 융합 단백질은 약 매주 투여된다. 다른 실시예에서, sNPP1, 생물학적 활성 단편 또는 이의 융합 단백질은 약 격주로 투여된다. 일 실시예에서, 투여 빈도는 약 30일에 1회이다.
일 실시예에서, 환자는 2세 미만이다. 일 실시예에서, 약 0.1 mg, 약 0.2 mg, 약 0.3 mg, 약 0.4 mg, 약 0.5 mg, 약 1 mg, 약 2 mg, 약 3 mg, 약 5 mg, 약 10 mg, 약 15 mg, 약 20 mg, 약 25 mg, 약 30 mg, 약 35 mg, 약 40 mg, 또는 약 45 mg의 sNPP1, 생물학적 활성 단편 또는 융합 단백질이 NPP1-결핍증 또는 기타 석회화 질환에 걸린 환자에게 투여된다. 일 실시예에서, 약 0.5 내지 약 30 mg, 약 0.5 내지 약 20 mg, 약 0.5 내지 약 10 mg, 또는 약 0.5 내지 약 5 mg이 환자에게 투여된다.
일 실시예에서, 약 1 mg/kg의 sNPP1, 생물학적 활성 단편 또는 융합 단백질이 1주에 한번 환자에게 투여된다. 일 실시예에서, 약 2 mg/kg의 sNPP1, 생물학적 활성 단편 또는 융합 단백질이 1주에 한번 환자에게 투여된다. 일 실시예에서, 약 3 mg/kg의 sNPP1, 생물학적 활성 단편 또는 융합 단백질이 1주에 한번 환자에게 투여된다. 일 실시예에서, 약 4 mg/kg의 sNPP1, 생물학적 활성 단편 또는 융합 단백질이 1주에 한번 환자에게 투여된다. 일 실시예에서, 약 5 mg/kg의 sNPP1, 생물학적 활성 단편 또는 융합 단백질이 1주에 한번 환자에게 투여된다. 일 실시예에서, 약 6 mg/kg의 sNPP1, 생물학적 활성 단편 또는 융합 단백질이 1주에 한번 환자에게 투여된다. 일 실시예에서, 약 7 mg/kg의 sNPP1, 생물학적 활성 단편 또는 융합 단백질이 1주에 한번 환자에게 투여된다. 일 실시예에서, 약 8 mg/kg의 sNPP1, 생물학적 활성 단편 또는 융합 단백질이 1주에 한번 환자에게 투여된다. 일 실시예에서, 약 9 mg/kg의 sNPP1, 생물학적 활성 단편 또는 융합 단백질이 1주에 한번 환자에게 투여된다. 일 실시예에서, 약 10 mg/kg의 sNPP1, 생물학적 활성 단편 또는 융합 단백질이 1주에 한번 환자에게 투여된다.
일 실시예에서, 치료 전 환자의 혈액 PPi의 수준은 개개의 정상 인간에서 관찰된 PPi의 정상 수준의 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 또는 약 80%이다. 일 실시예에서, 치료 전 환자의 PPi의 수준은 개개의 정상 인간에서 관찰된 PPi의 정상 수준의 약 50% 이하이다. 일 실시예에서, 치료 전 환자의 PPi의 수준은 개개의 정상 인간에서 관찰된 PPi의 정상 수준의 약 40% 이하이다. 일 실시예에서, 치료 전 환자의 PPi의 수준은 개개의 정상 인간에서 관찰된 PPi의 정상 수준의 약 30% 이하이다. 일 실시예에서, 치료 전 환자의 PPi의 수준은 개개의 정상 인간에서 관찰된 PPi의 정상 수준의 약 20% 이하이다. 일 실시예에서, 치료 전 환자의 PPi의 수준은 개개의 정상 인간에서 관찰된 PPi의 정상 수준의 약 10% 이하이다. 일 실시예에서, 치료 전 환자의 PPi의 수준은 개개의 정상 인간에서 관찰된 PPi의 정상 수준의 약 5% 이하이다. 일 실시예에서, 환자는 치료 전에 측정 가능한 PPi를 나타내지 않는다.
sNPP1, 생물학적 활성 단편 또는 융합 단백질은 피하 주사, 근육 내 주사 및 정맥 내 주입 (IV) 또는 주사에 의해 투여될 수 있다.
일 실시예에서, sNPP1, 생물학적 활성 단편 또는 융합 단백질은 임의의 유용한 방법에 의해 IV 주입에 의해 정맥 내로 투여된다. 일 실시예에서, sNPP1, 생물학적 활성 단편 또는 융합 단백질은 말초 혈관을 통해 정맥 내 주입에 의해 투여될 수 있다. 다른 예에서, sNPP1, 생물학적 활성 단편 또는 융합 단백질은 말초 삽입 형 중심 카테터(peripherally inserted central catheter)를 통해 정맥 내 주입에 의해 투여될 수 있다.
다른 실시예에서, sNPP1, 생물학적 활성 단편 또는 융합 단백질은 IV 주사에 의해 정맥 내로 투여된다.
다른 실시예에서, sNPP1, 생물학적 활성 단편 또는 융합 단백질은 복강 내 주사를 통해 투여될 수 있다.
다른 실시예에서, sNPP1, 생물학적 활성 단편 또는 융합 단백질은 피하 주사에 의해 투여될 수 있다.
다른 실시예에서, sNPP1, 생물학적 활성 단편 또는 융합 단백질은 근육 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 실시예에서, sNPP1, 생물학적 활성 단편 또는 융합 단백질은 치료 용 단백질의 약학적으로 허용가능한 캡슐을 통해 투여된다. 예를 들어, 캡슐은 장용-코팅된 젤라틴 캡슐일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 방법은 본 발명의 가용성 NPP1 단백질 또는 NPP1 융합 단백질을 단독으로, 또는 다른 약제(들)와 병용하여 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 방법은 NPP1-결핍증 또는 기타 관련된 질환 또는 장애를 갖는 피험자에서 감소된 또는 비정상적인 NPP1 발현 또는 활성을 보충하기 위한 치료제로서 본 발명의 NPP1 단백질 또는 NPP1 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 분리된 sNPP1 단백질, 단편 및 융합 단백질은 약제 투여 전, 투여 후 또는 동시에 투여될 수 있거나 또는 다른 알려진 치료법과 함께 공동-투여될 수 있다. 본 발명의 분리된 sNPP1 단백질, 단편 및 융합 단백질과 다른 치료제의 공동-투여는 증가된 치료 효과를 가져오는 상이한 메카니즘을 통해 작용하는 두 가지 약제를 제공할 수 있다. 이러한 공동-투여는 약물에 대한 내성의 발달로 인한 문제를 해결할 수 있다.
특정 측면에서, 본 발명은 혈관 석회화의 감소를 필요로 하는 피험자에서 혈관 석회화를 감소시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 가용성 형태의 NPP1이 낮은 혈장 PPi 수준 (저해제 또는 조직 석회화) 또는 높은 혈청 Pi 수준을 갖는 동물에게 투여되어 상기 동물에서 혈장 PPi의 일시적인 증가를 야기하고, 혈장 PPi의 일시적인 증가가 동물의 혈관 석회화를 저해할 수 있다는 놀라운 결과에 근거한다. 혈장 PPi의 증가가 일시적이기 때문에, 치료법은 골 석회화를 저해하거나 또는 골연화증을 유발하지 않으면서, 혈관 석회화와 같은 바람직하지 않거나 또는 병적인 조직 석회화를 저해하도록 조정될 수 있다.
일반적인 용어로, 본 발명은 2회 이상의 용량의 가용성 NPP1 (sNPP1)을 피험자에게 투여함으로써, 조직 석회화 (예를 들어, 혈관 석회화)의 감소를 필요로 하는 환자에서 조직 석회화를 감소시키는 방법에 관한 것이다. 각 용량은, 바람직하게는 용량의 투여 후 약 48시간 이내에 기준선 PPi 수준으로 되돌아감과 함께, 피험자에서 혈장 PPi의 일시적인 증가를 달성하기에 충분한 가용성 NPP1의 양을 함유한다. 각 용량의 투여 간격은 일반적으로 적어도 2일이다.
이를 필요로 하는 피험자는 임의의 연령 및 성별일 수 있고, 바람직하게는 낮은 혈장 PPi 또는 높은 혈청 Pi를 가진다 (예를 들어, PPi:Pi 비율이 변경됨). 예를 들어, 낮은 혈장 PPi는 (NPP1 결핍 및 상염색체-열성 저인산혈성 구루병 (autosomal-recessive hypophosphatemic rickets)과 관련된) 활성 NPP1의 발현 감소 또는 효소 활성 감소를 야기하는 NPP1을 인코딩하는 유전자의 돌연변이, 및 (탄력섬유성가황색종과 관련된) 결핍 또는 비기능성 MRP6 단백질을 야기하는 MRP6을 인코딩하는 유전자의 돌연변이와 같은 선천성 NPP1 결핍증에 기인할 수 있다. 또한, 낮은 혈장 PPi 또는 높은 혈청 Pi는 만성 신장 질환, 말기 신질환/신부전, 당뇨병 및 기타 질병이 있는 환자에서 자주 보인다. 따라서, 치료가 필요한 피험자는 만성 신장 질환 (CKD), 말기 신질환 (ESRD), 영아의 일반 동맥 석회화 (GACI), 제 II 형 당뇨병, 상염색체-열성 저인산혈성 구루병, 심혈관 장애, 죽상 동맥 경화증 및/또는 탄력섬유성가황색종 (PXE)을 가질 수 있다. 피험자는 일반적으로 인간이지만, 임의의 다른 적당한 포유류 또는 비-포유류일수도 있다.
조직 석회화는 진행성 과정이며, 선천성 NPP1 결핍증을 갖고 태어난 개인들은 수년간 조직의 석회화를 나타낼 수 없다. 가능한 조기에 치료를 시작함으로써, 이러한 피험자에서 석회화를 감소시키거나 또는 최소화시킬 수 있다. 생식선 돌연변이에 의해 야기되지 않는 낮은 혈장 PPi 수준 또는 높은 혈청 Pi 수준을 갖는 (예를 들어, 변경된 혈장 PPi:Pi 비율을 갖는) 피험자에서, 치료는 가능한 빨리 (즉, 만성 신장 질환 (CKD) 또는 말기 신질환 (ESRD)과 같은 질병의 진단 직후) 시작되어야 한다. 특정 실시예에서, 치료받을 피험자는 1개월에서 24개월 사이, 1세 미만, 2세 미만, 3세 미만, 4세 미만, 또는 5세 미만일 수 있다.
피험자에게 투여되는 sNPP1의 각 용량은 혈장 PPi의 일시적인 증가를 달성하기에 충분한 sNPP1의 양을 함유한다. 바람직하게는, 일시적인 증가는 정상 혈장 PPi 수준의 적어도 약 40%, 정상 혈장 PPi 수준의 적어도 약 50%, 정상 혈장 PPi 수준의 적어도 약 60%, 정상 혈장 PPi 수준의 적어도 약 70%, 정상 혈장 PPi 수준의 적어도 약 80%, 정상 혈장 PPi 수준의 적어도 약 40% 내지 100%, 정상 혈장 PPi 수준의 적어도 약 50% 내지 100%, 정상 혈장 PPi 수준의 적어도 약 60% 내지 100%, 정상 혈장 PPi 수준의 적어도 약 70% 내지 100%, 정상 혈장 PPi 수준의 적어도 약 80% 내지 100%, 또는 정상 혈장 PPi 수준의 적어도 약 100% 내지 200%인 피크 PPi 수준을 특징으로 한다.
바람직하게는, sNPP1의 투여 후 혈장 PPi의 일시적인 증가는 적어도 약 4시간, 적어도 약 6시간, 적어도 약 8시간, 적어도 약 10시간 또는 적어도 약 12시간 동안 유지된다. 또한, 혈장 PPi의 일시적인 증가는 용량의 투여 후 약 48시간 이내, 용량의 투여 후 약 3일 이내 또는 용량의 투여 후 약 4일 이내에, 피험자의 기준선 PPi 수준으로 되돌아가는 것이 바람직하다.
치료 전 피험자의 낮은 혈장 PPi는 정상 피험자 (예를 들어, 인간)에서 관찰된 PPi의 정상 수준의 약 50% 이하, 바람직하게는 약 40% 이하이다. 일 측면에서, 치료 전 피험자의 PPi의 수준은 PPi의 정상 수준의 약 30% 이하이다. 다른 측면에서, 치료 전 피험자의 PPi의 수준은 PPi의 정상 수준의 약 20% 이하이다. 일부 다른 측면에서, 치료 전 피험자의 PPi의 수준은 PPi의 정상 수준의 약 10% 이하이다. 일 측면에서, 피험자는 치료 전에 측정 가능한 PPi를 가질 수 없다.
치료 전 피험자의 높은 혈청 Pi는 정상 피험자 (예를 들어, 인간)에서 관찰된 Pi의 정상 수준의 약 110% 이상, 바람직하게는 약 125% 이상이다. 일 측면에서, 치료 전 피험자의 Pi의 수준은 Pi의 정상 수준의 약 150% 이상이다. 다른 측면에서, 치료 전 피험자의 Pi의 수준은 Pi의 정상 수준의 약 200% 이상이다. 일부 다른 측면에서, 치료 전 피험자의 Pi의 수준은 Pi의 정상 수준의 약 300% 이상이다. 특정 이론에 얽매이지 않고, 혈청 PPi의 일시적인 증가의 유도는 상승된 혈장 Pi 수준을 보충할 수 있고 일시적으로 정상 또는 거의 정상적인 PPi:Pi 비율을 회복하여 혈청 Pi의 정상 수준보다 높은 수준으로 촉진되는 조직 석회화를 저해할 수 있다고 생각된다.
혈장 PPi의 일시적인 증가를 달성하기에 충분한 sNPP1의 양은, 혈장 PPi의 일시적인 증가를 일으킬 것으로 예상되는 용량을 투여하고, 일시적인 증가가 발생하는지 여부를 결정한 다음, 용량을 적절하게 조정하여 통상의 임상의에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 투여량은 사용된 특정 sNPP1, 피험자의 연령, 건강 및 체중, 약물에 대한 피험자의 민감성, 및 기타 관련 인자를 포함하여, 다수의 통상적인 인자에 의해 영향을 받을 것이다. 일반적으로, 각 용량으로 투여될 sNPP1의 양은 체중의 킬로그램 당 약 0.001 내지 약 50 밀리그램이며, 1 mg/kg 내지 5 mg/kg, 1 mg/kg 내지 10 mg/kg, 1 mg/kg 내지 20 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 또는 20 mg/kg이 바람직하다. 정확한 투여량, 투여 빈도 및 치료 기간은 치료용 단백질의 투여 분야에서 숙련된 의사에 의해 결정될 수 있다.
일부 바람직한 실시예에서, 각 용량은 체중 kg 당 약 1.0 mg 내지 약 5.0 mg sNPP1, 체중 kg 당 약 1.0 mg 내지 약 10.0 mg sNPP1 또는 체중 kg 당 약 1.0 mg 내지 약 20.0 mg sNPP1을 함유한다.
투여 간격은 피험자의 혈청 PPi 수준이 기저 수준으로 되돌아갈 수 있도록 선택되며, 적어도 2일 (48시간) 이나, 원하는 만큼 또는 표시된 만큼 길어질 수 있다. 예를 들어, 투여 간격은 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 10일, 12일, 2주, 3주 또는 약 1개월일 수 있다.
일반적으로, 낮은 혈장 PPi, 높은 혈청 Pi, 또는 NPP1 결핍증의 진단 후 가능한 빨리 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료를 개시하는 것이 바람직하다. 선천성 NPP1 결핍증을 갖고 태어난 피험자들은 수년간 조직의 석회화를 나타낼 수 없다. 가능한 조기에 치료를 시작함으로써, 이러한 피험자에서 석회화를 감소시키거나 또는 최소화시킬 수 있다. 생식선 돌연변이에 의해 야기되지 않는 낮은 혈장 PPi 수준 또는 높은 혈청 Pi 수준을 갖는 피험자에서, 치료는 만성 신장 질환 (CKD) 또는 말기 신질환 (ESRD)과 같은 질병의 진단 후에 가능한 빨리 시작되어야 한다.
상기 방법은 PPi 대 Pi의 변경된 비율을 갖는 피험자를 포함하여, 낮은 혈장 PPi 또는 높은 혈청 Pi를 갖는 피험자에서 조직 석회화 (예를 들어, 혈관 석회화)를 감소시키는 효과적인 방법을 제공한다. 조직 석회화는 바람직하게는 동맥 석회화이나 정맥 석회화일 수도 있는 혈관 석회화이다. 혈관 석회화는 내막 또는 내측일 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료받을 피험자는 NPP1 결핍증, 영아의 특발성 동맥 석회화 및 영아의 동맥 매질 석회화라고도 알려진 일반 동맥 석회화 (GACI)를 가질 수 있다. 또한, 치료받을 피험자는 관상 동맥 질환 및/또는 죽상 동맥 경화증과 같은 심혈관 장애를 가질 수 있다. 치료받을 피험자는 만성 신장 질환 (CKD) 또는 말기 신질환 (ESRD)을 가질 수 있다. 치료받을 피험자는 당뇨병 (예를 들어, 제 II 형 당뇨병)을 가질 수 있다. 치료받을 피험자는 탄력섬유성가황색종(PXE)을 가질 수 있다.
sNPP1은 임의의 적당한 방법 또는 투여 경로, 예를 들어 비경구, 경구 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 정맥 내 주사 또는 주입, 피하 주사, 복강 내 주사, 또는 근육 내 주사와 같은 비경구 투여가 바람직하다.
원하는 경우, sNPP1은 하나 이상의 보조 치료제와 함께 투여될 수 있다. 병용 요법의 경우, sNPP1 및 하나 이상의 추가 치료제는 피험자의 개별적인 약리 활성에 상당한 중복이 있도록 투여된다. 따라서, 임의의 보조 치료제는 sNPP1의 투여 전에, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 병용 요법은 증가된 치료 효과를 가져오는 상이한 메카니즘을 통해 작용하는 두 가지 약제를 제공할 수 있다.
혈청 PPi의 일시적인 증가를 야기하는 것 외에, 본 명세서에 기재된 방법에 따른 sNPP1의 투여는 피험자의 특정 단백질의 수준을 변경할 수 있다고 생각된다. 예를 들어, 특정 이론에 얽매이지 않고, 본 명세서에 기재된 방법에 따른 sNPP1의 투여는 피험자에서 오스테오폰틴, 오스테오프로테게린 및 섬유아세포 성장 인자 23 (FGF-23)의 수준을 감소시킬 수 있다고 생각된다. 이러한 단백질의 수준은 혈장 PPi 및 혈청 Pi 수준 이외에도 치료 및 맞춤형 투여를 관찰하기 위해 사용될 수 있다.
sNPP1
본 발명은 NPP1의 생물학적 활성 NPP1 도메인인 가용성 NPP1을 사용한다 (즉, 피로포스파타제 및/또는 포스포디에스터라제 활성을 위한 자연적으로 발생하는 NPP1의 적어도 하나의 세포외 촉매 도메인을 함유하는 NPP1 성분). 본 발명의 가용성 NPP1 단백질은 적어도 피로포스파타제 및/또는 포스포디에스터라제 활성을 수행하는데 필수적인 NPP1 도메인을 포함한다.
일 실시예에서, 가용성 NPP1, 단편 및 이의 융합 단백질은 기능성 동종이량체(homodimers) 또는 단량체를 형성할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 가용성 NPP1 단백질 또는 이의 NPP1 융합 단백질은 in vivo에서 피로인산염 수준을 증가시키는 능력뿐만 아니라 피로포스파타제 활성을 분석할 수 있다.
본 발명의 바람직한 가용성 NPP1 단백질 및 NPP1 융합 단백질은 in vivo (예를 들어, 인간)에서 효소적으로 활성이다. 일 실시예에서, 가용성 단백질은 하기 서열과 적어도 60, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00001
임의의 바람직한 효소적으로 활성 형태의 가용성 NPP1이 본 명세서에 기재된 방법에서 사용될 수 있다. 효소적으로 활성인 sNPP1은 적당한 효소 분석법에서 PPi 수준을 증가시킬 수 있으며, 피로포스파타제 활성, 포스포디에스터라제 활성, 또는 피로포스파타제 및 포스포디에스터라제 활성을 분석할 수 있다. 일반적으로, sNPP1은 적어도 N-말단 세포질 및 자연적으로 발생하는 막횡단 NPP1의 막횡단 도메인이 결여된 NPP1 성분을 함유한다. 바람직한 측면에서, NPP1 성분은 자연적으로 발생하는 인간 NPP1의 시스테인-풍부 영역 (서열번호:1의 아미노산 99-204) 및 촉매 영역 (서열번호:1의 아미노산 205-591)을 함유한다. 일반적으로, NPP1 성분은 C-말단 영역 (서열번호:1의 아미노산 592 내지 925)도 포함하고, 서열번호:2의 아미노산 서열을 가진다. 그러나, C-말단 영역은 필요하다면 절단될 수 있다. 따라서, 바람직한 NPP1 성분은 인간 NPP1의 시스테인-풍부 영역 및 촉매 영역 (서열번호:1의 아미노산 99-591) 또는 인간 NPP1의 시스테인-풍부 영역, 촉매 영역 및 C-말단 영역 (서열번호:2)을 포함한다. 기타 바람직한 NPP1 성분은 시스테인-풍부 도메인의 일부만을 함유하고, 서열번호:1의 아미노산 107 내지 925의 서열 또는 서열번호:1의 아미노산 187 내지 925의 서열을 가진다.
NPP1의 시스테인 풍부 영역 (즉, 서열번호: 1의 아미노산 99 내지 204)은 sNPP1의 이량체화를 촉진시킬 수 있다. 융합 단백질을 포함하여, sNPP1은 기능적 동종이량체의 단량체 형태일 수 있다.
NPP1 성분의 아미노산 서열은 NPP1 성분이 효소적으로 활성인 경우, 자연적으로 발생하는 NPP1 서열의 변이체일 수 있다. NPP1 변이체는 효소적으로 활성이며, 인간 NPP1의 상응하는 부분과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 및 더 바람직하게는 적어도 96% 아미노산 서열 동일성을 가진다 (예를 들어, 시스테인-풍부 영역, 촉매 영역, C-말단 영역, 시스테인-풍부 영역 + 촉매 영역, 시스테인-풍부 영역 + 촉매 영역 + C-말단 영역의 길이에 걸쳐). 바람직한 NPP1 변이체는 (i) 서열번호:1의 아미노산 서열의 잔기 205-591, (ii) 서열번호:1의 아미노산 서열의 잔기 99-591, (iii) 서열번호:1의 아미노산 서열의 잔기 99-925, (iv) 서열번호:1의 아미노산 서열의 잔기 107-925, 또는 (v) 서열번호:1의 아미노산 서열의 잔기 187-925와 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 더 바람직하게는 적어도 97% 아미노산 서열 동일성을 가진다. 아미노산 변이에 적합한 위치는 NPP1 구조적 연구 및 NPP1의 질환-관련 돌연변이의 분석으로 잘 알려져 있다. 예를 들어, 하기 아미노산의 치환은 NPP1 효소 활성을 감소시키는 특정 질환-관련 돌연변이에서 발생하며, 이러한 위치에서 아미노산의 변이는 피해야 한다: Ser216, Gly242, Pro250, Gly266, Pro305, Arg349, Tyr371, Arg456, Tyr471, His500, Ser504, Tyr513, Asp538, Tyr570, Lys579, Gly586; Tyr659, Glu668, Cys726, Arg774, His777, Asn792, Asp804, Arg821, Arg888, and Tyr901. (참조, 예를 들어, Jansen, S. et al., Structure 20:1948-1959 (2012).)
일 실시예에서, 가용성 NPP1 단백질은 융합 파트너에 재조합적으로 융합되거나 또는 화학적으로 결합된 (예를 들어, 공유 결합, 이온 결합, 소수 결합 및 반 데르 발스 힘) 융합 단백질일 수 있다. 또 다른 실시예에서, 융합 단백질은 서열번호:3 또는 서열번호:4와 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성을 가진다.
2개의 아미노산 서열의 % 동일성을 결정하기 위해, 서열은 최적의 비교 목적으로 정렬된다 (예를 들어, 갭은 최적 정렬을 위한 제 1 및 제 2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 모두에 도입될 수 있고, 비-상동 서열은 비교 목적을 위해 무시될 수 있다.). 바람직한 실시예에서, 비교 목적을 위해 정렬된 기준 서열의 길이는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 더 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 60%, 및 더욱 더 바람직하게는 적어도 70%, 80%, 또는 90%의 기준 서열의 길이이다 (예를 들어, 서열번호:2의 sNPP1 아미노산 서열; 서열번호:1의 아미노산 107-925 또는 서열번호:1의 아미노산 187-925). 그 다음, 상응하는 아미노산 위치의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 제 1 서열의 위치가 제 2 서열의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유될 때, 분자는 그 위치에서 동일하다 (본 명세서에 사용된 바와 같이, 아미노산은 아미노산 또는 핵산과 동등하다. "상동성"). 2개의 서열 간의 % 동일성은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다.
서열의 비교 및 2개의 서열 간의 % 동일성의 결정은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 2개의 아미노산 서열 간의 % 동일성은 Blosum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 중 하나, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 중량, 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 중량을 이용한, GCG 소프트웨어 패키지 (www.gcg.com에서 이용 가능)의 GAP 프로그램에 통합된 니들만과 분쉬 (Needleman and Wunsch) (J Mol Biol 1970, 48, 444-453) 알고리즘을 이용하여 결정된다. 다른 실시예에서, 2개의 아미노산 간의 % 동일성은 PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 패널티를 이용한, ALIGN 프로그램 (버전 2.0 또는 2.0U)에 통합된 E. Meyers 및 W. Miller (CABIOS, 1989, 4, 11-17)의 알고리즘을 이용하여 결정된다.
sNPP1은 본 명세서에 기재된 바와 같은 NPP1 성분으로 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어질 수 있다. 대안적으로, sNPP1은 임의로 각각의 경우에 적당한 링커를 통해, 융합 파트너라고 불리는, NPP1 성분 및 하나 이상의 다른 폴리펩티드를 함유하는 융합 단백질의 형태, 또는 NPP1 성분 및 다른 분자 (예를 들어, PEG) 사이의 접합체의 형태일 수 있다. sNPP1이 융합 단백질의 형태인 경우, 각각의 융합 파트너는 바람직하게는 NPP1 성분의 C-말단에 위치한다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 시스테인-풍부 영역 및 촉매 영역을 함유하는 NPP1 성분을 함유하는 융합 단백질, 및 NPP1 성분의 C-말단에 위치하는 하나 이상의 융합 단백질은, 이들이 충분한 수준으로 발현될 수 있고 치료용 단백질로서 사용하기에 충분히 안정하기 때문에 NPP1 융합 단백질의 다른 구성보다 바람직하다고 생각된다.
임의의 적당한 융합 파트너는 융합 단백질에 포함될 수 있다. 유리하게는, 다수의 융합 파트너는 감소된 응집 및 면역원성, 용해도 증가, 발현 및/또는 안정성의 향상, 및 약동학(pharmacokinetic) 및/또는 약력학(pharmacodynamics) 성능의 향상과 같은 특정 이점을 제공할 수 있는 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다. 참조, 예를 들어, Strohl, W.R. BioDrugs 29:215-239 (2015). 예를 들어, 알부민, 알부민 단편 또는 알부민 변이체 (예를 들어, 인간 혈청 알부민 및 이의 단편 또는 변이체)가 융합 단백질에 혼입될 수 있고, 이러한 융합 단백질이 용이하게 정제되고 안정될 수 있으며, 향상된 혈장 반감기를 갖는 것으로 잘 알려져 있다. sNPP1 융합 단백질에 사용될 수 있는 적당한 알부민, 알부민 단편 및 알부민 변이체는 WO 2005/077042 A2 및 WO 03/076567 A2에 개시되어 있으며, 이들 각각은 전체 참조로 본 명세서에 포함된다. 또한, 인간 트랜스페린과의 융합은 반감기를 향상시키는 것으로 알려져 있다. 참조, 예를 들어, Kim BJ et al., J Pharmacol Expr Ther 334(3):682-692 (2010); 및 WO 2000/020746. 알부민 또는 트랜스페린에 결합하는 펩티드, 예를 들어 항체 또는 항체 단편이 사용될 수도 있다. 참조, 예를 들어, EP 0486525 B1, US 6,267,964 B1, WO 04/001064A2, WO 02/076489A1, WO 01/45746, WO 2006/004603, 및 WO 2008/028977. 유사하게, 면역글로불린 Fc 융합 단백질은 잘 알려져 있다. 참조, 예를 들어, Czajkowsky DM et al., EMBO Mol Med 4(10):1015-1028 (2012), U.S. Pat. No. 7,902,151; 및 U.S. Pat. No. 7,858,297, 그 전체 내용은 전체 참조로 본 명세서에 포함된다. 또한, 융합 단백질은 CTP 서열을 포함할 수 있다. (참조, Fares et al., Endocrinol 2010, 151, 4410-4417; Fares et al., Proc Natl Acad Sci 1992, 89, 4304-4308; and Furuhashi et al., Mol Endocrinol 1995, 9, 54-63). 바람직하게는, 융합 파트너는 면역글로불린의 Fc 이다 (예를 들어, Fc 또는 인간 IgG1). Fc는 인간 IgG1의 CH1, CH2 및 CH3, 및 원하는 경우 임의로 인간 IgG1 경첩 영역 (EPKSCDKTHTCPPCP (서열번호:13)) 또는 인간 IgG1 경첩 영역의 일부 (예를 들어, DKTHTCPPCP (서열번호:14) 또는 PKSCDKTHTCPPCP (서열번호:15))를 포함할 수 있다. 일부 융합 단백질에서, Fc는 원하는 경우 인간 IgG1의 CH2 및 CH3, 또는 인간 IgG2 또는 인간 IgG4의 Fc를 포함할 수 있다.
바람직하게는, sNPP1 융합 단백질은 NPP1 성분 및 융합 단백질, 가장 바람직하게는 면역 글로불린의 Fc (예를 들어, Fc 또는 인간 IgG1)의 반감기를 증가시키는 펩티드를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "융합 단백질의 반감기를 증가시키는 단백질"은 가용성 NPP1 또는 생물학적 활성 단편에 융합될 때, 가용성 NPP1 폴리펩티드 단독 또는 NPP1 생물학적 활성 단편 단독의 반감기에 비해, 가용성 NPP1 폴리펩티드 또는 생물학적 활성 단편의 반감기를 증가시키는 단백질을 나타낸다.
일 실시예에서, NPP1 융합 단백질의 반감기는 NPP1 폴리펩티드 또는 생물학적 활성 단편 단독의 반감기에 비해 50% 증가된다. 다른 실시예에서, NPP1 융합 단백질의 반감기는 NPP1 폴리펩티드 또는 생물학적 활성 단편 단독의 반감기에 비해 60% 증가된다. 또 다른 실시예에서, NPP1 융합 단백질의 반감기는 NPP1 폴리펩티드 또는 생물학적 활성 단편 단독의 반감기에 비해 70% 증가된다. 또 다른 실시예에서, NPP1 융합 단백질의 반감기는 NPP1 폴리펩티드 또는 생물학적 활성 단편 단독의 반감기에 비해 80% 증가된다. 또 다른 실시예에서, NPP1 융합 단백질의 반감기는 NPP1 폴리펩티드 또는 생물학적 활성 단편 단독의 반감기에 비해 90% 증가된다.
또 다른 실시예에서, NPP1 융합 단백질의 반감기는 NPP1 폴리펩티드 또는 생물학적 활성 단편 단독의 반감기에 비해 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 또는 10배 증가된다. 단백질 또는 융합 단백질의 반감기를 결정하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Zhou et al., Determining Protein Half-Lives, Methods in Molecular Biology 2004, 284, 67-77은 단백질의 반감기를 시험하기 위한 수많은 방법을 개시한다. 원하는 경우, 융합 단백질은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 반감기를 연장하는 고분자 또는 다른 적당한 화합물에 접합될 수 있으며, NPP1 융합 단백질에 접합될 수 있다.
일 실시예에서, 융합 단백질의 반감기를 증가시키는 펩티드는 CTP 서열이다 (참조, Fares et al., 2010, Endocrinol ., 151(9):4410-4417; Fares et al., 1992, Proc. Natl . Acad . Sci, 89(10):4304-4308; and Furuhashi et al., 1995, Molec. Endocrinol., 9(1):54-63).
다른 실시예에서, 융합 단백질의 반감기를 증가시키는 펩티드는 Ig의 Fc 도메인이다.
또한, 융합 파트너는 융합 단백질을 임상적 또는 생물학적 중요성의 원하는 부위 (예를 들어, 석회화 부위)에 표적하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 뼈에 대해 높은 친화성을 갖는 펩티드는 미국 특허 제 7,323,542호에 기재되어 있으며, 그 전체 내용은 참조로 본 명세서에 포함된다. 석회화 부위에 표적하는 단백질을 증가시킬 수 있는 펩티드는 적어도 약 4개의 산성 아미노산, 예를 들어 글루탐산 또는 아스파르트산의 연속적인 스트레치를 함유할 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질을 석회화 부위에 표적하는 펩티드는 4 내지 20개의 연속적인 산성 아미노산, 예를 들어 글루탐산 및 아스파르트산으로부터 선택된 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속적인 아미노산을 포함할 것이다. 펩티드는 글루탐산 잔기만으로 이루어질 수 있거나, 또는 아스파르트산 잔기만으로 이루어질 수 있거나, 또는 글루탐산 잔기와 아스파르트산 잔기의 혼합물일 수 있다. 석회화의 부위에 표적하기 위한 특히 바람직한 부분은 Asp10 (서열번호:18)이다.
일 실시예에서, 본 발명의 NPP1 융합 단백질은 NPP1 폴리펩티드 및 산성 아미노산, 예를 들어 글루탐산 또는 아스파르트산의 연속적인 스트레치와 같은 석회화 부위에 표적하는 단백질을 증가시키는 부분을 포함한다.
융합 단백질에 사용하기에 적합한 펩티드 링커는 잘 알려져 있으며, 일반적으로 유연한 확장된 형태를 채택하고, NPP1 성분 또는 융합 파트너의 기능을 간섭하지 않는다. 펩티드 링커 서열은 임의의 조합으로 Gly, His, Asn 및 Ser 잔기를 함유할 수 있다. 유용한 펩티드 링커는 제한없이, 폴리-Gly, 폴리-His, 폴리-Asn 또는 폴리-Ser을 포함한다. Thr 및 Ala와 같은 다른 중성에 가까운 아미노산도 링커 서열에서 사용될 수 있다. 링커로서 유용하게 사용될 수 있는 아미노산 서열은 문헌 [Maratea et al., Gene 1985, 40, 39-46; Murphy et al., Proc Natl Acad Sci USA 1986, 83, 8258-8262; 미국 특허 제 4,935,233호 및 미국 특허 제 4,751,180호]에 개시된 것들을 포함한다. 다른 적당한 링커는 면역글로불린의 경첩 부위와 같은 자연적으로 발생하는 단백질로부터 얻어질 수 있다. 바람직한 합성 링커는 (Gly4Ser)n이고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 이다 (서열번호:19). 바람직하게는, n은 3 또는 4 이다. 예를 들어, 일 실시예에서 링커는 (Gly4Ser)3 (서열번호:16) 이고, 융합 단백질은 아미노산 서열 GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer (서열번호:16)를 갖는 링커를 포함한다. 일반적으로, 링커는 1 내지 약 50 아미노산 잔기 길이, 또는 1 내지 약 25 아미노산 길이이다. 종종, 링커는 약 8 내지 약 20 아미노산 길이이다.
바람직한 NPP1 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 NPP1 성분, 임의로 링커, 면역글로불린의 Fc 영역 (예를 들어, 임의로 경첩 또는 이의 일부를 포함하는 인간 IgG1 Fc), 임의로 제 2 링커, 및 임의로 표적 부분을 포함한다. 따라서, Fc 영역 및 임의의 표적 부분은 존재할 때 각각 NPP1 성분에 C-말단으로 위치한다. NPP1 성분은 바람직하게는 N-말단 세포질 및 막횡단 도메인이 결여된 NPP1의 시스테인-풍부 영역 및 촉매 도메인을 포함하고, 임의로 C-말단 영역을 함유한다.
바람직한 융합 단백질은, N-말단에서 C-말단으로, 인간 NPP1의 시스테인-풍부 도메인, 촉매 도메인 및 C-말단 영역을 포함하는 NPP1 성분; 및 인간 면역글로불린의 Fc 영역 (경첩 포함)을 포함한다. 바람직하게는, Fc 영역은 인간 IgG1로부터 유래한다. 특정 실시예에서, 융합 단백질은 서열번호:3과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진다. 이러한 유형의 바람직한 융합 단백질은 서열번호:3의 아미노산 서열을 가진다.
다른 바람직한 융합 단백질은, N-말단에서 C-말단으로, 인간 NPP1의 시스테인-풍부 도메인, 촉매 도메인 및 C-말단 영역을 포함하는 NPP1 성분; 링커 (예를 들어, (Gly4Ser)3 (서열번호:16)); 및 인간 면역글로불린의 Fc 영역 (경첩 포함)을 포함한다. 바람직하게는, Fc 영역은 인간 IgG1로부터 유래한다.
다른 바람직한 융합 단백질은, N-말단에서 C-말단으로, 인간 NPP1의 시스테인-풍부 도메인, 촉매 도메인 및 C-말단 영역을 포함하는 NPP1 성분; 인간 면역글로불린의 Fc 영역 (경첩 또는 이의 일부 포함); 및 융합 단백질을 석회화 부위에 표적하는 부분을 포함한다. 바람직하게는, Fc 영역은 인간 IgG1로부터 유래한다. 바람직하게는, 융합 단백질을 석회화 부위에 표적하는 부분은 Asp10 (서열번호:18) 이다. 더 바람직하게는, Fc 영역은 인간 IgG1로부터 유래하고, 융합 단백질을 석회화 부위에 표적하는 부분은 Asp10 (서열번호:18) 이다. 특정 실시예에서, 융합 단백질은 서열번호:4와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진다. 이러한 유형의 바람직한 융합 단백질은 서열번호:4의 아미노산 서열을 가진다.
또 다른 바람직한 융합 단백질은, N-말단에서 C-말단으로, 인간 NPP1의 시스테인-풍부 도메인, 촉매 도메인 및 C-말단 영역을 포함하는 NPP1 성분; 링커 (예를 들어, (Gly4Ser)3 (서열번호:16)); 인간 면역글로불린의 Fc 영역 (경첩 또는 이의 일부 포함); 및 융합 단백질을 석회화 부위에 표적하는 부분을 포함한다. 바람직하게는, Fc 영역은 인간 IgG1로부터 유래한다. 바람직하게는, 융합 단백질을 석회화 부위에 표적하는 부분은 Asp10 (서열번호:18) 이다. 더 바람직하게는, Fc 영역은 인간 IgG1로부터 유래하고, 융합 단백질을 석회화 부위에 표적하는 부분은 Asp10 (서열번호:18) 이다.
또 다른 바람직한 융합 단백질은, N-말단에서 C-말단으로, 인간 NPP1의 시스테인-풍부 도메인, 촉매 도메인 및 C-말단 영역의 일부를 포함하는 NPP1 성분; 임의로 링커 (예를 들어, (Gly4Ser)3 (서열번호:16)); 인간 면역글로불린의 Fc 영역 (경첩 또는 이의 일부 포함)을 포함한다. 바람직하게는, Fc 영역은 인간 IgG1로부터 유래한다. 특정 실시예에서, 융합 단백질은 서열번호:9, 서열번호:10, 서열번호:11, 또는 서열번호:12와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진다. 이러한 유형의 바람직한 융합 단백질은 서열번호:9, 서열번호:10, 서열번호:11, 또는 서열번호:12의 아미노산 서열을 가진다.
특히 바람직한 측면에서, 서열번호:3의 융합 단백질은 본 명세서에 기재된 방법에 따라 투여된다. 다른 특히 바람직한 측면에서, 서열번호:4의 융합 단백질은 본 명세서에 기재된 방법에 따라 투여된다. 다른 특히 바람직한 측면에서, 서열번호:9의 융합 단백질은 본 명세서에 기재된 방법에 따라 투여된다. 다른 특히 바람직한 측면에서, 서열번호:10의 융합 단백질은 본 명세서에 기재된 방법에 따라 투여된다. 다른 특히 바람직한 측면에서, 서열번호:11의 융합 단백질은 본 명세서에 기재된 방법에 따라 투여된다. 다른 특히 바람직한 측면에서, 서열번호:12의 융합 단백질은 본 명세서에 기재된 방법에 따라 투여된다.
본 발명의 융합 단백질은 당해 기술분야에서 잘 알려진 재조합 기술 또는 화학적 접합을 포함하는 표준 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 본 발명의 핵산 및 단백질을 분리하고 특성화하는데 유용한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 표준 분자 생물학 및 생화학적 매뉴얼을 참고하여 과도한 실험 없이 사용하기에 적합한 프로토콜을 선택할 수 있다. 참조, 예를 들어, Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor, 그 내용은 전체 참조로 본 명세서에 포함된다.
분리된 재조합 인간 sNPP1, 단편, 및 이의 융합 단백질은 제한 없이 세포 배양 (예를 들어, CHO 세포, COS 세포, HEK203), 대장균 (E. coli)과 같은 박테리아, 및 포유류 및 조류 (예를 들어, 닭, 메추라기, 오리 및 칠면조)를 포함하나 이에 한정되지 않는 형질전환 동물을 포함하는 임의의 유용한 단백질 발현 시스템에서 제조될 수 있다. 발현을 위해, sNPP1을 암호화하고 sNPP1의 서열과 프레임 내에서 (예를 들어, 인간 Ig 중쇄, NPP2, NPP4, NPP7 또는 인간 혈청 알부민으로부터의) 적당한 신호 서열을 포함하는 구조체는 적당한 발현 조절 요소에 작동가능하게 연결된다.
융합 단백질을 포함하는 sNPP1, 및 이의 생리적으로 허용가능한 염 형태는 일반적으로 본 명세서에 기재된 방법에 따라 투여하기 위한 약학 조성물로 제형화된다. 약학 조성물은 일반적으로 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 복합 분자를 포함하는 이러한 담체를 포함하는 조성물은, 잘 알려진 통상적인 방법에 의해 제형화되며 (참조, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 14th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA), 그 전체 내용은 참조로 본 명세서에 포함된다. 담체는 희석제를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 약학적 담체는 액체일 수 있고, 융합 단백질은 용액의 형태일 수 있다. 약학적 담체는 왁스, 지방, 또는 알콜일 수 있다. 다른 실시예에서, 약학적으로 허용가능한 담체는 분말, 동결 건조 분말, 또는 정제 형태의 고체일 수 있다. 일 실시예에서, 담체는 리포솜 또는 미세캡슐을 포함할 수 있다. 약학 조성물은 희석제로 재구성할 때 주사용 멸균 동결 건조 분말의 형태일 수 있다. 희석제는 주사용수, 주사용 정균수, 또는 멸균 염수일 수 있다. 동결 건조 분말은 융합 단백질의 용액을 동결 건조시켜 건조 형태의 단백질을 제조함으로써 제조될 수 있다. 당해 기술분야에 알려진 바와 같이, 동결 건조 단백질은 일반적으로 단백질의 액체 용액보다 증가된 안정성 및 긴 저장 기간을 가진다.
도 1은 야생형 NPP1 단백질의 아미노산 서열이다 (서열번호:1). 세포질 및 막횡단 영역은 밑줄을 그었다. 잠재적인 N-글리코실화 부위는 굵게 표시된다. 굵게 표시된 아미노산 모티프 "PSCAKE" (서열번호:17)은 시스테인 풍부 영역을 포함하는 가용성 NPP1의 시작이다.
도 2는 시스테인-풍부 영역, 촉매 영역 및 C-말단 영역을 함유하는 sNPP1의 아미노산 서열이다 (서열번호:2).
도 3은 sNPP1-Fc 융합 단백질의 아미노산 서열이다 (서열번호:3).
도 4는 sNPP1-Fc-D10의 아미노산 서열이다 (서열번호:4). Fc 서열은 밑줄을 그었다. D10 (서열번호:18) 표적 부분은 굵게 표시된다.
도 5는 sNPP1-Fc 또는 sNPP1-Fc-D10을 정맥 내 (주사 후 1시간) 및 피하 (주사 후 4시간) 투여한 후 야생형 마우스에서 혈액 내 피로인산염 수준을 나타낸다.
도 6은 sNPP1-Fc-D10으로 처리한 Enpp1(-/-) 마우스에서 대동맥 석회화의 예방을 나타낸다. Enpp1 (-/-) 마우스는 21일 동안 격일로 비히클 또는 6 mg/kg sNPP1-Fc-D10으로 피하로 처리하였다. 대동맥 칼슘 수준은 수컷과 암컷에 대해 나타낸다.
도 7은 6 mg/kg sNPP1-Fc-D10으로 정맥 내 처리된 Enpp1 (-/-) 마우스에서 혈액 PPi 및 효소 활성 수준을 나타낸다. 0, 4, 24, 48 및 72 시간의 시점에서 혈장을 모으고, NPP1 활성 (파선) 및 PPi 수준 (실선)에 대해 분석하였다. 야생형 PPi 수준은 2.18 μM로 측정되었다 (자료는 나타내지 않음). 파선은 위에서 아래로 야생형, 이형 접합(heterozygous) Enpp1(+/-) 및 동형 접합(homozygous) Enpp1(-/-) asj 마우스에 대한 PPi 수준을 나타낸다 (Li et. al, 2013). sNPP1-Fc의 프로파일은 sNPP1-Fc-D10의 프로파일과 유사하였다.
도 8은 비히클 처리된 마우스에 비해 5 mg/kg sNPP1-Fc로 처리된 Enpp1 asj 동형 접합 마우스의 생존율 증가를 나타낸다. 야생형 마우스와 Enpp1 asj 마우스는 출생시부터 높은 인, 낮은 마그네슘 식이를 제공받았다. 비히클 또는 sNPP1-Fc (5 mg/kg)를 14일령에 시작하여 격일로 피하 투여하였다. 카플란-마이어 생존 곡선 (Kaplan-Meier survival curves)은 >50%의 asj 마우스가 6주 전에 사망하였고, 모든 동물이 9주까지 사망한 것으로 나타났다. 이와 비교하여, 50%의 sNPP1-Fc 처리된 동물은 7주 이상 생존하였으며, 9주에도 여전히 살아있었다.
도 9A 및 9B는 비히클 처리된 마우스 (도 9A)에 비해 5 mg/kg sNPP1-Fc (도 9B)로 처리된 Enpp1 asj 수컷 마우스의 증가된 % 체중 증가를 나타낸다. 야생형 마우스와 Enpp1 asj 마우스는 출생시부터 높은 인, 낮은 마그네슘 식이를 제공받았다. 비히클 또는 sNPP1-Fc (5 mg/kg)를 14일령에 시작하여 격일로 피하 주사하였다. 야생형 마우스 (실선)와 Enpp1 asj 마우스 (원)에 대한 % 체중 증가를 2주령에서 9주령까지 플롯팅하였다. 9주째에 비히클 군 (상부 패널)에서는 모든 Enpp1 asj 동물이 사망하였다 (열린 원). 이와 비교하여, 9주 말에 sNPP1-Fc 처리군에서는 5마리의 Enpp1 asj 마우스가 살아있었고 (실선), 5마리는 사망하였다 (열린 원).
도 10A-10C는 야생형 마우스 (도 10A, 위), 비히클 처리된 Enpp1 asj 마우스 (도 10B, 중간), sNPP1-Fc (5 mg/kg) 처리된 Enpp1 asj 마우스 (도 10C, 아래)의 사진이다.
도 11은 비히클 처리된 야생형 마우스, 비히클 처리된 Enpp1 asj / asj 마우스, 및 sNPP1-Fc (5 mg/kg) 처리된 Enpp1 asj / asj 마우스에서 섬유아세포 성장 인자 23의 수준을 나타낸다.
도 12A-12H는 가용성 NPP1 화합물, 융합 파트너 및 융합 단백질의 아미노산 서열이다. 도 12A는 서열번호:1의 107 내지 925의 아미노산을 함유하는 가용성 NPP1의 아미노산 서열을 나타낸다 (서열번호:5). 도 12B는 서열번호:1의 187 내지 925의 아미노산을 함유하는 가용성 NPP1의 아미노산 서열을 나타낸다 (서열번호:6). 도 12C는 경첩 영역(hinge region)을 포함하는 인간 IgG1의 Fc 영역의 아미노산 서열을 나타낸다 (서열번호:7). 도 12D는 부분 경첩 영역을 포함하는 인간 IgG1의 Fc의 아미노산 서열을 나타낸다 (서열번호:8). 도 12E는 NPP1-Fc 융합 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다 (서열번호:9). NPP1 성분은 서열번호:5를 함유하고, Fc 서열은 경첩 영역을 포함한다. 도 12F는 NPP1-Fc 융합 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다 (서열번호:10). 가용성 NPP1은 서열번호:5를 함유하고, Fc 서열은 부분 경첩 영역을 포함한다. 도 12G는 NPP1-Fc 융합 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다 (서열번호:11). 가용성 NPP1은 서열번호:6을 함유하고, Fc 서열은 경첩 영역을 포함한다. 도 12H는 NPP1-Fc 융합 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다 (서열번호:12). 가용성 NPP1은 서열번호:6을 함유하고, Fc 서열은 부분 경첩 영역을 포함한다.
도 13A-13C는 in vitro 및 in vivo에서 재조합 NPP1의 활성을 나타내는 박층 크로마토그램의 자동방사선사진(autoradiogram)이다. 도 13A: 37℃에서 1시간 동안 130 ug/ml sNPP1-Fc-D10과 함께 배양된 100 nM ATP. 도 13B: 재조합 NPP1 (6 mg/kg)의 IV 주사 후 2시간 동안 야생형 마우스 (WT), Enpp1 -/- 마우스, 및 Enpp1 -/- 마우스의 혈장과 함께 배양된 100 nM ATP. 도 13C: 재조합 NPP1 (6 mg/kg)의 IV 주사 후 2시간 동안 야생형 마우스 (WT), Enpp1 -/- 마우스, 및 Enpp1 -/- 마우스의 대동맥과 함께 배양된 100 nM ATP. Pi: 오르토인산염; ATP: 아데노신 삼인산염; PPi: 피로인산염.
도 14A 및 14B는 재조합 NPP1 (5 mg/kg)의 피하 주사 후 Enpp1(-/-) 마우스에서 혈장 NPP1 활성 (도 14A, 위) 및 혈장 피로인산염 농도 (도 14B, 아래)의 시간 경과를 나타내는 히스토그램이다.
도 15는 여러 번에 걸쳐 재조합 NPP1 (5 mg/kg)의 피하 주사 후 Enpp1(-/-) 마우스 (원) 및 야생형 마우스 (정사각형)에 대한 혈장 NPP1 활성 및 혈장 피로인산염 (PPi) 사이의 관계를 나타내는 산점도(scatter-plot)이다.
도 16A-16C는 인간 혈액 내 피로인산염의 합성을 나타내는 히스토그램이다. 도 16A: 동일한 혈액 시료로부터 얻은 헤파린 첨가 혈액(Heparinized blood) 또는 혈장. 도 16B: HEPES-완충 식염수에 부유된 (모든 세포)와 함께 또는 제거된 연막(buffy coat) (적혈구) 없이 원심분리된 혈액 세포. 도 16C: HEPES-완충 식염수에 부유된 분리된 백혈구 또는 혈소판. 시료를 재조합 NPP1 (145 ug/ml)과 함께 또는 없이 2시간 동안 37℃에서 배양하였다.
도 17은 Enpp1(-/-) 마우스에서 재조합 NPP1이 대동맥 석회화에 미치는 영향을 나타내는 히스토그램이다. 높은 인산염 식이(high phosphate diet)를 공급받은 마우스에서 48시간 마다 재조합 NPP1을 피하로 주사하였다 (6 mg/kg). 각 막대는 아래 주어진 몇 주령의 단일 동물을 나타낸다. M: 수컷 쌍; F: 암컷 쌍. 파선은 야생형 한배 새끼(littermates)의 대동맥의 평균 칼슘 함량을 나타낸다.
도 18은 신부전을 앓고 있는 요독증에 걸린 랫트에서 재조합 NPP1이 대동맥 석회화에 미치는 영향을 나타내는 히스토그램이다. 높은 아데닌 식이를 공급받은 요독증에 걸린 랫트에서 sNPP1-Fc-D10 또는 대조군을 21일 동안 주 5회 피하로 주사하였다 (5 mg/kg). 각 막대는 약 4개월령의 단일 동물을 나타낸다.
실시예
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다. 실시예는 단지 예시적인 목적을 위한 것일 뿐 의도된 것이 아니며, 본 발명을 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
방법
동물:
6주령 야생형 수컷 C57Bl/6J 마우스를 사용하였다. 이들 마우스의 평균 체중은 21-22 g 범위였다. 마우스에게 sNPP1-Fc [1.04 mg/ml] 또는 sNPP1-Fc-D10 [1.03 mg/ml]을 5 mg/kg의 농도로 피하 (SC) 주사 또는 정맥 내 (IV) 주사로 투여하였다.
ID 약물/경로 시간 (h)
1 치료 안함 0
2 치료 안함 0
3 sNPP1-Fc/ IV 1
4 sNPP1-Fc/ IV 1
5 sNPP1-FcD10/ IV 1
6 sNPP1-FcD10/ IV 1
7 sNPP1-Fc/ SC 4
8 sNPP1-Fc/ SC 4
9 sNPP1-FcD10/ SC 4
10 sNPP1-FcD10/ SC 4
NPP1이 결여된 마우스의 2개의 상이한 균주가 사용되었다. Enpp1 -/- 마우스는 이전에 [Lomashvili, K. A. et al., Kidney Int 2014, 85, 1351-1356]에서 기재되었다. 동맥 석회화를 촉진시키기 위하여, 전술한 바와 같이 중성 pH를 가져오는 비율로 NaH2PO4와 Na2HPO4의 혼합물을 사용하여 1.5% 인산염 (최종 인 함량 : 2%)을 식이에 보충하였다. (O'Neill, W. C. et al., Kidney Int 2011, 79, 512-517).
만성 신장 질환 (CKD) 모델: 야생형 스프라그 돌리 랫트(sprague dawley rats)를 CKD 모델 연구에 사용하였다. 랫트는 0.25-0.75% 아데닌 및 높은 수준의 인 (일반 사료에서의 0.4%에 비해 0.75-0.9% 인)을 함유한 식이를 제공받았다. 과량의 식이 아데닌은 정상 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 회수 경로를 포화시키고 대신에 2,8-디히드록시아데닌으로 대사되며, 이의 낮은 용해도 때문에 신장 세관 (kidney tubules)에서 침전하고 결정을 형성한다. 이 결정은 신장에서 관상 손상 (tubular injury), 염증, 폐색 및 섬유화를 야기하고, 인간 CKD와 일치하는 표현형을 유도한다. 결과로 초래된 신장 손상과 신부전은 비정상적으로 높은 혈청 Pi 수준을 야기하는 인산염 배출 장애 및 연조직의 일반 석회화와 같은 무기질 대사 장애를 야기한다. 식이에서 높은 수준의 인은 동맥 석회화를 가속화한다. 높은 아데닌 식이를 하는 랫트는 요독증, 고인산혈증(hyperphosphatemia), 이차적인 부갑상선기능항진증(secondary hyperparathyroidism), 신장골이영양증(renal osteodystrophy), 및 혈관 석회화를 일으킨다.
혈장 제조:
혈액을 심장 천자로 모으고, 즉시 혼합하였다 (9:1 (부피:부피)의 혈액 대 110 mM 시트르산 용액). 혈청 수집은 혈소판으로부터 과량의 피로인산염 (PPi)을 방출하고, EDTA 응고 저해는 분석을 방해할 수 있다. 시트르산 처리된 혈액 (citrated blood)의 튜브를 몇 분 동안 흔든 다음, 10-15분 동안 2,000xg에서 회전시켰다. 혈장의 상층을 모으고 (100-300 μl), 약 200 μl를 10 kDa 센트리콘 (centricon)에 가하였다. 그 다음, 이 튜브를 10분 동안 12,000xg에서 회전시켜 혈장을 탈단백질화하였다. 회전 후, 관류액을 새 튜브에 모았다. 혈장 및 탈단백질화된 시료는 분석할 때까지 -20℃에서 동결시켰다.
형광 PPi 분석:
이 분석법은 PPi 농도에 비례하여 의존하는 형광 강도를 갖는 형광성 PPi 센서를 사용한다. 10 kDa 여과된 시료 (4 μl)를 46 μl의 분석 완충액에 가하였다. PPi 센서 저장 용액 (200X)을 분석 완충액으로 희석하고, 이의 50 μl를 시료에 가하였다. 실온에서 20분 동안 배양한 후, 검정색 고체 96-웰 플레이트를 형광에 대해 판독하였다 (Ex/Em=316/456 nm).
분석:
NPP1 활성은 전술한 바와 같이 측정하였다. (Villa-Bellosta, R. et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol 2011, 301, H61-H68). 간략하게는, 혈장을 200 nM ATP 및 1.5 uCi [32P] ATP/ml를 함유하는 20 부피의 생리적 완충액에 37℃에서 10분 동안 가하였다. 그 다음, 반응물을 폴리에틸렌이민 셀룰로오스상의 박층 크로마토그래피로 분리하고, 생성된 PPi의 양을 자가방사선사진의 농도 계측기 (densitometry of autoradiograms)로 측정하였다. 혈장 PPi는 30 kD 차단 여과기 (cut-off filter)를 통해 새롭게 여과된 혈장 및 UDP-글루코오스 피로포스포릴라제에 의한 PPi 및 UDP-글루코오스의 UTP 및 글루코오스-1-인산으로의 전환에 기초한 효소 분석법을 이용하여, 전술한 바와 같이 측정하였다 (Lomashvili, K. A. et al., Kidney Int 2014, 85, 1351-1356). 사용된 모든 물은 히드록시아파타이트로 전처리하여 오염된 PPi를 제거하였다. 대동맥 칼슘은 전술한 바와 같이 건조된 대동맥의 HCl 산 추출물에서 비색계로 측정하였다. (Lomashvili, K. A. et al., Kidney Int 2014, 85, 1351-1356). 칼슘 함량은 건조 중량으로 표준화하였고, 석회화의 감소 분율(fractional reductions)은 정상 마우스 대동맥의 칼슘 함량을 뺀 후 결정하였다.
혈액 세포 분획화:
백혈구와 혈소판을 준비하기 위하여, 새로 채취한 헤파린화된 인간 혈액을 실온에서 15분 동안 250g에서 원심분리하였다. 혈장을 제거하고 12분 동안 2200g에서 원심분리하여 혈소판을 얻었다. 첫 번째 원심분리로부터의 펠렛을 생리 식염수로 원래의 혈액량으로 재-현탁시키고, 4배 부피의 용해 완충액 (155 mmol/L 염화암모늄; 10 mmol/L 중탄산나트륨; 0.1 mmol/L EDTA, pH 7.4)을 5-10분 동안 얼음에 가하였다. 이것을 원심분리 및 상청액의 제거 후에 반복하여, 최종 원심분리 후에 정제된 백혈구를 수득하였다.
통계 분석:
연속 변수는 스튜던트의 t-검정에 의해 결정된 차이와 함께 평균 ± 표준 오차로 표시된다. 대동맥 칼슘 함량은 로그 변환 후에 분석하였다.
실시예 I
배경: sNPP1의 변이체를 투여한 야생형 마우스의 PPi 수준이 증가하는지 여부를 결정하기 위해 실험을 수행하였다. 이를 위해, 단일 정맥 주사 요법으로 1시간을 선택하였고, 단일 피하 주사 요법으로 4시간을 선택하였다. PPi 수준의 평가는 abcam PPi 형광 분석으로 결정하였다.
결과: 1분 판독 (9 총 판독)의 미가공 자료(raw data)를 평균 내고 %의 정상 혈장 (WT)으로 변환하였다.
Figure pct00002
도 5에 나타난 바와 같이, 야생형 마우스에서 sNPP1 단백질 변이체 (5 mg/kg)의 정맥 주사 또는 피하 주사는 정상 혈장 수준 이상의 PPi 농도의 증가를 나타낸다. 도 5는 sNPP1-Fc 또는 sNPP1-Fc-D10을 정맥 내 (주사 후 1시간) 및 피하 (주사 후 4시간) 투여한 후 야생형 마우스에서 혈액 내 피로인산염 수준을 나타낸다.
실시예 II
Enpp1(-/-) 녹-아웃 마우스는 21일 동안 격일로 비히클 또는 6 mg/kg sNPP1-Fc-D10으로 피하로 처리하였다. 대동맥 칼슘 수준은 수컷과 암컷에 대해 나타낸다. 도 6은 sNPP1-Fc-D10으로 처리한 Enpp1(-/-) 마우스에서 대동맥 석회화의 효과적인 예방을 나타낸다.
실시예 III
Enpp1(-/-) 녹-아웃 마우스는 6 mg/kg sNPP1-Fc-D10으로 정맥 내 처리하여 혈액 PPi 및 효소 활성 수준을 측정하였다. 도 7에 나타난 바와 같이, 0, 4, 24, 48 및 72 시간의 시점에서 혈장을 모으고, NPP1 활성 (파선) 및 PPi 수준 (실선)에 대해 분석하였다. 야생형 PPi 수준은 2.18 μM로 측정되었다 (자료는 나타내지 않음). 파선은 위에서 아래로 야생형, 이형 접합 Enpp1(+/-) 및 동형 접합 Enpp1(-/-) 마우스에 대한 PPi 수준을 나타낸다 (Li et. al, 2013). sNPP1-Fc의 프로파일은 sNPP1-Fc-D10의 프로파일과 유사하였다.
실시예 IV
야생형 마우스와 Enpp1 asj 마우스는 출생시부터 높은 인, 낮은 마그네슘 식이를 제공받았다. 비히클 또는 sNPP1-Fc (5 mg/kg)를 14일령에 시작하여 격일로 피하 투여하였다. 카플란-마이어 생존 곡선은 >50%의 asj 마우스가 6주 전에 사망하였고, 모든 동물이 9주까지 사망한 것으로 나타났다. 이와 비교하여, 50%의 sNPP1-Fc 처리된 동물은 7주 이상 생존하였으며, 9주에도 여전히 살아있었다. 도 8은 비히클 처리된 마우스에 비해 5 mg/kg sNPP1-Fc로 처리된 Enpp1 asj 동형 접합 수컷 마우스의 생존율 증가를 나타낸다.
실시예 V
야생형 마우스와 Enpp1 asj 마우스는 출생시부터 높은 인, 낮은 마그네슘 식이를 제공받았고, 비히클 또는 sNPP1-Fc (5 mg/kg)를 14일령에 시작하여 격일로 피하로 처리하여 성장률을 측정하였다. 도 9A 및 9B에 나타난 바와 같이, 야생형 마우스 (실선)와 Enpp1 asj 마우스 (원)에 대한 % 체중 증가를 2주령에서 9주령까지 플롯팅하였다. 도 9A 및 9B는 비히클 처리된 마우스에 비해 5 mg/kg sNPP1-Fc로 처리된 Enpp1 asj 수컷 마우스의 증가된 % 체중 증가를 나타낸다. 9주째에 비히클 군 (상부 패널)에서는 모든 Enpp1 asj 동물이 사망하였다 (열린 원). 이와 비교하여, 9주 말에 sNPP1-Fc 처리군에서는 5마리의 Enpp1 asj 마우스가 살아있었고 (실선), 5마리는 사망하였다 (열린 원). 도 10A-10C는 야생형 마우스 (도 10A, 위), 비히클 처리된 Enpp1 asj 마우스 (도 10B, 중간), sNPP1-Fc (5 mg/kg) 처리된 Enpp1 asj 마우스 (도 10C, 아래)의 사진을 나타낸다.
실시예 VI
인산염 대사를 위한 바이오마커인 FGF-23 (섬유아세포 성장 인자 23)은 야생형 수컷 마우스 및 Enpp1 asj 수컷 마우스에서 측정되었다. 야생형 마우스와 Enpp1 asj 마우스는 출생시부터 높은 인, 낮은 마그네슘 식이 (TD.00442, Harlan)를 제공받았다. 비히클 또는 sNPP1-Fc (5 mg/kg)를 18일령에 시작하여 격일로 피하 투여하였다. 모든 혈청은 투여 후 24시간에 모았고, 마우스 FGF-23 ELISA 키트를 이용하여 분석하였다 (Kainos Laboratories Inc., Tokyo, Japan). FGF-23 수준은 Enpp1 +/+ - 비히클 (검은색 실선), Enpp1 asj / asj - 비히클 (검은색 점선), 및 Enpp1 asj / asj - sNPP1-Fc-D10 (회색 실선) 마우스에서 치료 시작 전 및 치료 과정 중에, 기준선 (0일)에서 측정되었다.
FGF-23 수준은 질환 진행 과정 중에 Enpp1 asj / asj 마우스에서 상승하였다 (9 일 (27일된)까지). 그러나, 5 mg/kg의 sNPP1-Fc-D10으로 처리된 Enpp1 asj / asj 마우스는 처리 17일째에 비히클 처리군에 비해 감소된 수준의 FGF-23을 나타내었다. *, 일원 분산 분석 (one-way ANOVA) 또는 스튜던트의 t-검정에 의해 p<0.05. 도 11은 비히클 처리된 Enpp1 asj / asj 마우스 (중간), 및 sNPP1-Fc (5 mg/kg) 처리된 Enpp1 asj 마우스 (아래)에서 섬유아세포 성장 인자의 수준을 나타낸다.
실시예 VII. In vitro 및 in vivo 활성
도 13A에 나타난 바와 같이, 재조합 sNPP1-Fc-D10은 in vitro에서 PPi를 오르토인산염으로 가수분해시키지 않고 ATP를 PPi로 완전히 가수분해시켰다.
혈장 내 효소 활성은 도 13B에 나타내었다. ATP의 약 1/3 이상이 10분 내에 7.6 ± 1.0 nmol/h/ml의 활성에 상응하는 PPi로 전환된, 상당한 활성이 야생형 마우스의 혈장에 있었다. 나머지는 뉴클레오티드 트리포스파타제를 통해 오르토인산염으로 전환되었다. Enpp1 -/- 마우스의 혈장은 [32P] ATP를 오염시키는 PPi를 나타내는 소량의 PPi와 함께, 본질적으로 NPP1이 없었다. 활성은 NPP1 (5 mg/kg)의 정맥 주사 후 2시간째에 10.3 ± 0.3 nmol/h/ml로 현저하게 증가하였으며, 이는 야생형 마우스에서의 2.39 ± 0.37 μM의 수준에 비해, 0.07 ± 0.02 내지 1.00 ± 0.14 μM의 혈장 PPi의 증가를 수반하였다.
도 13C에 나타난 바와 같이, 야생형 또는 Enpp1 -/- 마우스의 대동맥에서는 NPP1 활성이 검출되지 않았고 NPP1 주사 후 증가하지 않았다. 재조합 NPP1의 투여 후에도 간에서 활성이 검출되지 않았다.
Enpp1 -/- 마우스에 5 mg/kg의 피하 주사 후 혈장 NPP1 활성 및 PPi 농도의 시간 경과를 도 14에 나타내었다. NPP1 활성 및 PPi 농도는 주사 후 12시간에 야생형 한배 새끼에서 각각 195% 및 41%인 수준으로 최고치에 달하였다. 수준은 급속히 감소하였고, 24시간 후에 본질적으로 감지할 수 없었다.
도 15에 나타난 바와 같이, sNPP1-Fc-D10 (5 mg/kg)의 피하 주사는 혈장 PPi 수준 및 혈장 NPP1 활성 사이의 상관 관계를 나타낸다. 혈장 PPi와 혈장 NPP1의 상관 관계는 PPi가 혈액순환에서 생성되었음을 암시하였다. 이것은 새로운 인간 혈액을 재조합 NPP1과 함께 배양한 다음 혈장에서 PPi를 측정함으로써 확인되었다. 마우스에서 얻을 수 있는 혈액의 한정된 양 때문에, 인간의 혈액이 사용되었다. 혈액에 첨가된 NPP1의 양은 마우스에서 주사 후 달성된 것과 유사한 수준을 가져오도록 계산되었다.
도 16A는 재조합 NPP1의 투여가 2시간 동안 전혈에 첨가될 때 혈장 PPi를 증가시키지만 혈장 단독으로 첨가될 때는 증가시키지 않음을 나타내며, 이는 세포 요건(cellular requirement)을 나타낸다. 적혈구 대 다른 세포의 역할을 조사하기 위해, 혈액을 원심분리하고, 남아있는 연막과 함께 또는 없이 혈장을 제거하였다. 그 다음, HEPES-완충 식염수를 가하여 원래의 적혈구 용적률(hematocrit)을 회복시켰다. 도 16B에 나타난 바와 같이, 연막이 유지될 때만 생성이 발생하고, 이는 백혈구 또는 혈소판은 필요하지만 적혈구는 요구되지 않음을 나타낸다. 도 16C에 나타난 바와 같이, HEPES-완충 식염수에서 분리된 백혈구 또는 혈소판의 배양은, 둘 다 PPi를 방출하거나 또는 생성하였으나, 외인성 NPP1에 대한 반응에서 합성은 백혈구에서만 일어남을 나타내었다.
실시예 VIII. 치료 모델
A. NPP1 결핍증
재조합 NPP1이 대동맥 석회화에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 도 17에 나타난 바와 같이, 노화된 Enpp1 -/- 마우스는 높은 인산염 식이를 제공받았고, 비히클 또는 sNPP1-Fc-D10 (6 mg/kg)을 격일로 피하로 처리하였다. 각각 처리된 마우스는 동일한 부피의 비히클 단독을 투여받은 동일한 성별 및 유사한 연령의 마우스와 쌍을 이뤘다. 18일 후에, 비히클-처리된 마우스에서 평균 대동맥 칼슘 함량이 61 ± 30 nmol/mg 이었으며, 재조합 NPP1으로 처리된 마우스에서 평균 대동맥 칼슘 함량은 8.8 ± 1.0 nmol/mg 이었다 (p = 0.016). 야생형 한배 새끼에서 함량은 6.3 ± 3.4 nmol/mg 이었다 (n=16). 대조 대동맥 8명 중 6명 (80 ± 37 nmol/mg) 및 대동맥 1명 (15 nmol/mg)에서만 함량이 증가하였다 (야생형 한배 새끼보다 2 표준 편차). 대조 대동맥에 석회화가 있었던 쌍 내에서, 이것은 석회화의 91 ± 2% 감소를 나타내었다.
시간이 지남에 따라 여러 번 주사한 후에 NPP1이 축적되는지 여부를 확인하기 위하여, 희생 (주사 후 24시간)시 측정된 혈장 NPP1 활성 및 PPi가 모두 검출되지 않았다. 별도의 Enpp1 -/- 마우스 세트에서, 격일로 재조합 NPP1을 3회 주사한 후에 대동맥 NPP1 활성을 검출할 수 없었다.
B. 만성 신장 질환
이 실시예는 요독증에 걸린 랫트 모델에서 만성 신장 질환 (CKD)의 치료에 있어서 sNPP1-Fc-D10의 효능을 개시한다. 신부전을 앓고 있는 요독증에 걸린 랫트에서 재조합 NPP1이 대동맥 석회화에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 도 18에 나타난 바와 같이, 요독증에 걸린 랫트는 높은 아데닌 식이를 제공받았고, 대조군 또는 sNPP1-Fc-D10 (5 mg/kg)을 주 5회 피하로 주사하였다. 치료 21일 후, 평균 대동맥 칼슘 함량은 대조-처리된 랫트에서 25.7 ± 4.9 nmol/mg 및 재조합 NPP1로 처리된 랫트에서 7.0 ± 1.0 nmol/mg 이었다 (p = 0.0068). 정상 대동맥 칼슘 함량은 5 nmol/mg 이었다.
실시예 VII 및 VIII은 엑토뉴클레오티드 피로인산염 피로포스포릴라제 결핍증 및 만성 신장 질환의 모델에서 sNPP1의 활성 및 sNPP1의 효과적인 사용을 나타낸다. 이들 실시예들은 PPi의 일시적인 증가가 혈관 석회화 및 NPP1 결핍증의 효과적인 치료에 충분하다는 것을 나타낸다.
균등물
본 발명은 이의 예시적인 실시예를 참조하여 구체적으로 나타내고 기재되었지만, 첨부된 청구범위에 포함되는 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부 사항의 다양한 변화가 이루어질 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> ALEXION PHARMACEUTICALS, INC. <120> METHODS OF TREATING TISSUE CALCIFICATION <130> 081245-0208 <140> <141> <150> 62/249,781 <151> 2015-11-02 <150> 62/094,943 <151> 2014-12-19 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 925 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Arg Asp Gly Cys Ala Gly Gly Gly Ser Arg Gly Gly Glu Gly 1 5 10 15 Gly Arg Ala Pro Arg Glu Gly Pro Ala Gly Asn Gly Arg Asp Arg Gly 20 25 30 Arg Ser His Ala Ala Glu Ala Pro Gly Asp Pro Gln Ala Ala Ala Ser 35 40 45 Leu Leu Ala Pro Met Asp Val Gly Glu Glu Pro Leu Glu Lys Ala Ala 50 55 60 Arg Ala Arg Thr Ala Lys Asp Pro Asn Thr Tyr Lys Val Leu Ser Leu 65 70 75 80 Val Leu Ser Val Cys Val Leu Thr Thr Ile Leu Gly Cys Ile Phe Gly 85 90 95 Leu Lys Pro Ser Cys Ala Lys Glu Val Lys Ser Cys Lys Gly Arg Cys 100 105 110 Phe Glu Arg Thr Phe Gly Asn Cys Arg Cys Asp Ala Ala Cys Val Glu 115 120 125 Leu Gly Asn Cys Cys Leu Asp Tyr Gln Glu Thr Cys Ile Glu Pro Glu 130 135 140 His Ile Trp Thr Cys Asn Lys Phe Arg Cys 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 18 Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp 1 5 10 <210> 19 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(50) <223> This sequence may encompass 1-10 repeating "Gly Gly Gly Gly Ser" units wherein some positions may be absent <400> 19 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser 50

Claims (59)

  1. 낮은 혈장 피로인산염 (PPi) 또는 높은 혈청 인산염 (Pi)을 갖는 피험자에게, 가용성 엑토뉴클레오티드 피로포스파타제 포스포디에스터라제 (NPP1)를 2회 이상의 용량을 투여하는 단계를 포함하며,
    각 용량은 피험자에서 혈장 PPi의 일시적인 증가를 달성하기에 충분한 가용성 NPP1의 양을 함유하고, 혈장 PPi의 일시적인 증가는 정상 혈장 PPi 수준의 적어도 40%인 피크 PPi 수준 및 용량의 투여 후 48시간 이내에 기준선 PPi 수준으로 되돌아감을 특징으로 하고,
    투여 간격은 적어도 2일인 것을 특징으로 하는, 혈관 석회화를 감소시키는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 혈장 PPi의 일시적인 증가는 정상 혈장 PPi 수준의 적어도 40%의 PPi 수준을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 혈장 PPi의 일시적인 증가는 정상 혈장 PPi 수준의 40% 내지 100%의 PPi 수준을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 혈장 PPi의 일시적인 증가는 적어도 4시간 동안 유지되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  5. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 혈장 PPi의 일시적인 증가는 적어도 6시간, 적어도 8시간, 적어도 10시간 또는 적어도 12시간 동안 유지되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관 석회화는 동맥 석회화인 것을 특징으로 하는, 방법.
  7. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관 석회화는 내막(intimal) 석회화인 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험자는 NPP1 결핍증을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험자는 만성 신장 질환 (CKD) 또는 말기 신질환 (ESRD)을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  10. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험자는 영아의 일반 동맥 석회화 (GACI)를 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  11. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험자는 심혈관 장애를 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  12. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험자는 제 II 형 당뇨병을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  13. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험자는 죽상 동맥 경화증을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  14. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험자는 탄력섬유성가황색종 (PXE)을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 피험자에서 혈장 피로인산염 (PPi)의 전처리 수준은 정상 혈장 PPi 수준보다 적어도 40% 낮은 것을 특징으로 하는, 방법.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 피험자는 인간인 것을 특징으로 하는, 방법.
  17. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 각 용량은 1.0 mg/kg 내지 5.0 mg/kg NPP1을 함유하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  18. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 각 용량은 1.0 mg/kg 내지 10.0 mg/kg NPP1을 함유하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  19. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NPP1 용량의 투여 간격은 적어도 3일인 것을 특징으로 하는, 방법.
  20. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NPP1 용량의 투여 간격은 적어도 1주, 2주 또는 1개월인 것을 특징으로 하는, 방법.
  21. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 투여는 정맥 내, 피하, 또는 복강 내인 것을 특징으로 하는, 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 투여는 정맥 내인 것을 특징으로 하는, 방법.
  23. 제 21항에 있어서, 투여는 피하인 것을 특징으로 하는, 방법.
  24. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, NPP1은 분리된 재조합 인간 sNPP1, 단편 또는 이의 융합 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  25. 제 24항에 있어서, sNPP1은 융합 단백질인 것을 특징으로 하는, 방법.
  26. 제 25항에 있어서, 융합 단백질은 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  27. 제 25항 또는 제 26항에 있어서, 융합 단백질은 표적 부분(targeting moiety)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 상기 표적 부분은 적어도 8개의 연속적인 아스파르트산 또는 글루탐산 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  29. 제 1항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, sNPP1은 서열번호:3, 서열번호:4, 서열번호:9, 서열번호:10, 서열번호:11 또는 서열번호:12인 것을 특징으로 하는, 방법.
  30. 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 피험자는 상승된 무기 인산 및 정상보다 적어도 10% 높거나 또는 낮은 PPi 대 Pi의 비율을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  31. 혈관 석회화 감소용 약제의 제조를 위한 가용성 엑토뉴클레오티드 피로포스파타제 포스포디에스터라제 (NPP1)의 용도로서,
    상기 약제는 2회 이상의 용량으로 투여되고, 각 용량은 피험자에서 혈장 PPi의 일시적인 증가를 달성하기에 충분한 가용성 NPP1의 양을 함유하고, 혈장 PPi의 일시적인 증가는 정상 혈장 PPi 수준의 적어도 40%인 피크 PPi 수준 및 용량의 투여 후 48시간 이내에 기준선 PPi 수준으로 되돌아감을 특징으로 하고,
    투여 간격은 적어도 2일인 것을 특징으로 하는, 가용성 엑토뉴클레오티드 피로포스파타제 포스포디에스터라제 (NPP1)의 용도.
  32. 혈관 석회화 감소를 위한 가용성 엑토뉴클레오티드 피로포스파타제 포스포디에스터라제 (NPP1)의 용도로서,
    상기 NPP1은 2회 이상의 용량으로 투여되고, 각 용량은 피험자에서 혈장 PPi의 일시적인 증가를 달성하기에 충분한 가용성 NPP1의 양을 함유하고, 혈장 PPi의 일시적인 증가는 정상 혈장 PPi 수준의 적어도 40%인 피크 PPi 수준 및 용량의 투여 후 48시간 이내에 기준선 PPi 수준으로 되돌아감을 특징으로 하고,
    투여 간격은 적어도 2일인 것을 특징으로 하는, 가용성 엑토뉴클레오티드 피로포스파타제 포스포디에스터라제 (NPP1)의 용도.
  33. 분리된 재조합 인간 sNPP1, 단편 또는 이의 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물의 치료적 유효량을, 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, NPP1 결핍증 또는 NPP1-관련 질환을 갖는 피험자의 치료 방법.
  34. 제 33항에 있어서, NPP1 결핍증 또는 NPP1-관련 질환은 특발성 영아 동맥 석회화 (IIAC), 인슐린 저항성, 저인산혈성 구루병, 척추의 후종인대 골화증, 만성 신장 질환에서 혈관 석회화 (VCCKD), 심근 허혈, 관절 석회화, 혈관양선조(angioid streaks), 및 탄력섬유성가황색종 (PXE)으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환인 것을 특징으로 하는, 방법.
  35. 제 34항에 있어서, NPP1 결핍증 또는 NPP1-관련 질환은 동맥 석회화, 인슐린 저항성, 저인산혈성 구루병, 심근 허혈, 관절 석회화, 또는 척추의 후종인대 골화증인 것을 특징으로 하는, 방법.
  36. 제 34항에 있어서, NPP1 결핍증 또는 NPP1-관련 질환은 만성 신장 질환에서 혈관 석회화인 것을 특징으로 하는, 방법.
  37. 제 34항에 있어서, NPP1 결핍증 또는 NPP1-관련 질환은 탄력섬유성가황색종인 것을 특징으로 하는, 방법.
  38. 제 34항에 있어서, 상기 NPP1 결핍증 또는 NPP1-관련 질환은 특발성 영아 동맥 석회화인 것을 특징으로 하는, 방법.
  39. 제 33항에 있어서, 치료는 동맥의 석회화를 예방하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  40. 제 34항에 있어서, 치료는 대동맥의 석회화를 예방하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  41. 제 33항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험자는 인간 환자인 것을 특징으로 하는, 방법.
  42. 제 33항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 있어서, 약학 조성물은 0.10 mg/kg 내지 50 mg/kg의 양으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  43. 제 42항에 있어서, 상기 양은 0.5 mg/kg인 것을 특징으로 하는, 방법.
  44. 제 42항에 있어서, 상기 양은 1 mg/kg인 것을 특징으로 하는, 방법.
  45. 제 42항에 있어서, 상기 양은 5.0 mg/kg인 것을 특징으로 하는, 방법.
  46. 제 42항에 있어서, 상기 양은 6.0 mg/kg인 것을 특징으로 하는, 방법.
  47. 제 42항에 있어서, 상기 양은 10 mg/kg인 것을 특징으로 하는, 방법.
  48. 제 42항에 있어서, 상기 양은 15 mg/kg인 것을 특징으로 하는, 방법.
  49. 제 42항에 있어서, 상기 양은 20 mg/kg인 것을 특징으로 하는, 방법.
  50. 제 33항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 투여는 매주인 것을 특징으로 하는, 방법.
  51. 제 33항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 투여는 격주인 것을 특징으로 하는, 방법.
  52. 제 33항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 투여는 매달인 것을 특징으로 하는, 방법.
  53. 제 33항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 투여는 정맥 내, 피하, 척추강 내 또는 복강 내인 것을 특징으로 하는, 방법.
  54. 제 33항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 투여는 정맥 내인 것을 특징으로 하는, 방법.
  55. 제 33항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 투여는 피하인 것을 특징으로 하는, 방법.
  56. 제 33항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 투여는 피험자의 PPi의 혈액 수준을 표준화하는데 충분한 것을 특징으로 하는, 방법.
  57. 제 33항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 투여는 피험자의 침범된 조직의 석회화를 예방하는데 충분한 것을 특징으로 하는, 방법.
  58. NPP1 결핍증 또는 NPP1-관련 질환의 치료용 약제의 제조를 위한, 분리된 재조합 인간 sNPP1, 단편 또는 이의 융합 단백질의 용도.
  59. NPP1 결핍증 또는 NPP1-관련 질환의 치료를 위한, 분리된 재조합 인간 sNPP1, 단편 또는 이의 융합 단백질의 용도.
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014126965A2 (en) * 2013-02-13 2014-08-21 Yale University Compositions and methods for treating pathological calcification and ossification
EP3967755B1 (en) * 2014-12-19 2024-03-27 Inozyme Pharma, Inc. Soluble npp1 for use in a method for treating pseudoxanthoma elasticum
RU2021129201A (ru) 2015-05-19 2021-11-09 Йейл Юниверсити Композиции для лечения патологических состояний кальцификации и способы их применения
WO2017218786A1 (en) 2016-06-16 2017-12-21 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating myointimal proliferation
AU2017306549A1 (en) 2016-08-05 2019-02-21 Yale University Compositions and methods for stroke prevention in pediatric sickle cell anemia patients
CA3096821A1 (en) * 2017-09-27 2019-04-04 Inozyme Pharma, Inc. Methods of improving cardiovascular function and treating cardiovascular disease using a recombinant ectonucleotide pyrophosphatase phosphodiesterase (npp1)
CA3099266A1 (en) * 2018-05-08 2019-11-14 Yale University Compositions and methods for reducing progression of nephrolithiasis
WO2020047520A1 (en) * 2018-08-31 2020-03-05 Yale University Enpp1 polypeptides and methods of using same
AU2020207967A1 (en) * 2019-01-18 2021-07-29 Inozyme Pharma, Inc. Treatment of diseases involving deficiency of ENPP1 or ENPP3
BR112022024958A2 (pt) * 2020-06-09 2022-12-27 Inozyme Pharma Inc Proteínas enpp1 solúveis e usos das mesmas
AU2021383830A1 (en) * 2020-11-19 2023-06-22 Inozyme Pharma, Inc. Treatment of enpp1 deficiency and abcc6 deficiency

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
SE509359C2 (sv) 1989-08-01 1999-01-18 Cemu Bioteknik Ab Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel
US6267964B1 (en) 1989-08-01 2001-07-31 Affibody Technology Sweden Ab Stabilized protein or peptide conjugates able to bond albumin having extended biological half-lives
ATE319825T1 (de) 1997-11-07 2006-03-15 Trillium Therapeutics Inc Verfahren und zusammensetzungen zur immunomodulation
US6272859B1 (en) 1998-10-02 2001-08-14 Caterpillar Inc. Device for controlling a variable geometry turbocharger
AU784285B2 (en) 1999-12-24 2006-03-02 Genentech Inc. Methods and compositions for prolonging elimination half-times of bioactive compounds
DE60140349D1 (de) 2000-02-23 2009-12-17 Pxe Internat Inc Methoden und zusammensetzungen zur diagnose und behandlung von pseudoxanthoma elasticum und ähnlichen zuständen
EP1377306A1 (en) 2001-03-09 2004-01-07 Dyax Corp. Serum albumin binding moieties
US7858297B2 (en) 2001-12-18 2010-12-28 Centre National De La Recherche Scientifique Cnrs Chemokine-binding protein and methods of use
AU2003213246A1 (en) 2002-02-21 2003-09-09 University Of Virginia Patent Foundation Bone targeting peptides
AU2003210806A1 (en) 2002-03-05 2003-09-22 Eli Lilly And Company Heterologous g-csf fusion proteins
WO2004001064A2 (en) 2002-06-21 2003-12-31 Dyax Corporation Serum protein-associated target-specific ligands and identification method therefor
PL1729795T3 (pl) 2004-02-09 2016-08-31 Human Genome Sciences Inc Białka fuzyjne albuminy
US20050287284A1 (en) 2004-06-28 2005-12-29 Shukla Triveni P Processed meats comprising dietary fiber gel
US20090142347A1 (en) 2004-09-29 2009-06-04 The Burnham Institute For Medical Research Tissue-Nonspecific Alkaline Phosphatase (TNAP): a Therapeutic Target for Arterial Calcification
AU2007293614A1 (en) 2006-09-08 2008-03-13 Ablynx N.V. Serum albumin binding proteins with long half-lives
US8846603B2 (en) 2010-03-12 2014-09-30 Synageva Biopharma Corp. NPP1 fusion proteins
SG193024A1 (en) * 2011-03-11 2013-10-30 Synageva Biopharma Corp Npp1 fusion proteins
WO2014126965A2 (en) * 2013-02-13 2014-08-21 Yale University Compositions and methods for treating pathological calcification and ossification
EP3967755B1 (en) 2014-12-19 2024-03-27 Inozyme Pharma, Inc. Soluble npp1 for use in a method for treating pseudoxanthoma elasticum
RU2021129201A (ru) 2015-05-19 2021-11-09 Йейл Юниверсити Композиции для лечения патологических состояний кальцификации и способы их применения
CA3005142A1 (en) 2015-11-20 2017-05-26 Yale University Compositions for treating ectopic calcification disorders, and methods using same

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