ES2899895T3 - Procedimientos de tratamiento de calcificación tisular - Google Patents

Abstract

Ectonucleótido pirofosfatasa fosfodiesterasa (NPP1) soluble para su uso en un procedimiento para reducir la calcificación vascular, comprendiendo el procedimiento administrar a un sujeto con pirofosfato (PPi) plasmático por debajo de lo normal o fosfato (Pi) sérico por encima de lo normal, dos o más dosis de NPP1 soluble, en la que cada dosis contiene una cantidad de NPP1 soluble que es suficiente para lograr un aumento temporal del PPi plasmática en el sujeto, el aumento temporal del PPi plasmático se caracteriza por un nivel máximo de PPi plasmático que es al menos el 40 % del nivel plasmático normal de PPi y un retorno al nivel de referencia de PPi plasmático dentro de las 48 horas posteriores a la administración de la dosis; y en la que (a) el período de tiempo entre dosis es de al menos 2 días; (b) el nivel normal de PPi plasmático es de 2,63 ± 0,47 micromolar; y (c) el nivel normal de Pi sérico es de 1,5 ± 0,5 milimolar.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimientos de tratamiento de calcificación tisular

SOLICITUDES RELACIONADAS

[0001] Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de Estados Unidos Número 62/094.943, presentada el 19 de diciembre de 2014, la Solicitud Provisional de Estados Unidos Número 62/249.781, presentada el 2 de noviembre de 2015.

REFERENCIA AL LISTADO DE SECUENCIA PRESENTADA ELECTRÓNICAMENTE

[0002] El contenido del listado de secuencia presentada electrónicamente en el archivo de texto ASCII (Nombre: 081245-0208_ascii.txt; Tamaño: 88.556 bites; y Fecha de Creación: 15 de diciembre de 2015) presentada con la solicitud se incorpora en el presente documente por referencia en su totalidad.

ANTECEDENTES

[0003] La calificación vascular puede caracterizarse por la formación de cristales muy pequeños, dispersos, de hidroxiapatita (HA) y como depósitos calcificados grandes en tejido vascular, tales como arterias. (Amann, K. Clin JAm Soc Nephrol 2008, 3, 1599-605). El pirofosfato extracelular (PPi) es un inhibidor endógeno clave de la calcificación vascular debido a la inhibición de formación de HA. (Lomashvili, K. A. et al., JAm Soc Nephrol 2004, 15, 1392-1401; Fleisch, H. et al., Nature 1966, 212, 901-903).

[0004] La ectonucleótido pirofosfatasa pirofosforilasa (NPP1) es una ectoenzima que escinde el ATP para producir pirofosfato extracelular (PPi). El pirofosfato es un inhibidor potente de formación de hidroxiapatita y, bajo las condiciones normales, funciona inhibiendo la calcificación vascular.

[0005] La deficiencia de NPP1 en humanos da lugar a niveles de PPi circulantes reducidos y ha estado implicada en condiciones, tales como calcificación arterial y calcificación arterial generalizada de la infancia (GACI). (Rutsch, F. et al., Am J Pathol 2001,158, 543-554). Cuando se administra una dieta rica en fosfato, los ratones que tienen deficiencia de NPP1 (Enppl-/-) han reducido también los niveles de PPi y muestran un fenotipo similar a humanos con deficiencia en NPP1. (Harmey, D. et al., Am J Pathol 2004, 164, 1199-1209). La calcificación vascular es también una complicación bien reconocida y común en sujetos con enfermedad renal crónica (CKD) y enfermedad renal en etapa terminal (ESRD) y se asocia con morbilidad y mortalidad. (Giachelli, C. J Am Soc Nephrol 2004, 15, 2959-64; Raggi, P. et al., J Am Coll Cardiol 2002, 39, 695-701).

[0006] La deficiencia de ectonucleótido pirofosfatasa/fosfodiesterasa 1 (NPP1/ENPP1/PC-1) es una enfermedad rara causada por mutaciones en NPP1, una glicoproteína transmembrana de tipo II. NPP1 escinde una variedad de sustratos, que incluyen enlaces fosfodiéster de nucleótidos y azúcares de nucleótido y enlaces pirofosfato de nucleótidos y azúcares de nucleótido. La deficiencia de NPP1 se ha asociado con calcificación arterial idiopática infantil (IICA), resistencia a la insulina, raquitismo hipofosfatémico y osificación del ligamento longitudinal posterior de la columna.

[0007] IICA, un trastorno recesivo autosómico raro y casi siempre mortal, se caracteriza por una calcificación de la lámina elástica interna de arterias musculares y estenosis debido a la proliferación miointimal. Existen más de 160 casos de IICA que se han descrito en todo el mundo. Los síntomas de la enfermedad aparecen más a menudo al inicio de la infancia y la enfermedad es letal hacía los 6 meses de edad, generalmente debido a una cardiomiopatía isquémica y otras complicaciones de arteriopatía obstructiva que incluye estenosis de la arteria renal.

[0008] Aunque los defectos en la proteína NPP1 se han implicado en tales enfermedades serias como IICA, actualmente no existe tratamiento disponible para aquellos que están afectados por la enfermedad y otras enfermedades de calcificación causadas por la alta carga corporal total de calcio y fósforo debido al metabolismo óseo anormal, bajos niveles de inhibidores circulantes y producidos localmente de productores de fosfato; o excreción renal alterada.

[0009] Las opciones terapéuticas actuales para prevenir la calcificación vascular tienen eficacia limitada y efectos secundarios no deseados y/o inaceptables. Por ejemplo, se necesitan cantidades muy grandes de PPi exógeno para eficacia y otros inhibidores de la formación de hidroxiapatita inhiben la calcificación ósea y pueden conducir a osteomalacia. En particular, se descubrió que la administración directa de PPi exógeno previene calcificación en modelos de animales urémicos. (O'Neil, W. C. et al., Kidney Int 2011, 79, 512-517; Riser, B. L. et al., Nephrol Dial Transp 2011, 26, 3349-3357). Pero, esta estrategia requería altas dosis de PPi, debido a la semivida corta de PPi, y daba lugar a niveles suprafisiológicos en plasma de PPi que conducen a irritación local. Los bisfosfonatos, que son análogos no hidrolizables de PPi, se han utilizado para tratar la calcificación vascular, por ejemplo, en modelos de animales. (Fleisch, H. et al., Europ J Clin Invest 1970, 1 , 12-18; Price, P. A. et al., Arteriosclerosis Throm and Vas Bio 2001, 21, 817-824; Price, P. A. et al., Kidney Int 2006, 70, 1577-1583; Lomashvili, K. A. et al., Kidney Int 2009, 75, 617-625). Sin embargo, los bisfosfonatos inhiben también la formación ósea. Los bisfosfonatos pueden retrasar, pero no detener la calcificación en sujetos con GACI (Rutsch, F. et al., Circ Cardiovasc Genet 2008, 1, 133-140), y, como en animales, provocan osteomalacia. (Otero, J. E., et al., J Bone Miner Res 2013, 28, 419-430).

[0010] Braddock, D. et al., (WO 2014/126965A2) da a conocer composiciones y procedimientos para tratar la calcificación y osificación patológica mediante la administración de NPP1. Quinn, A. et al., (WO 2012/125182A1) da a conocer una proteína de fusión de NPP1 para tratar afecciones, que incluyen GACI, calcificación arterial, resistencia a la insulina, raquitismo hipofosfatémico y osificación del ligamento longitudinal posterior de la columna.

[0011] A pesar de considerables investigaciones en el sector, existe una necesidad continua de nuevas terapias para inhibir de manera eficaz la calcificación vascular, preferiblemente sin causar osteomalacia. También existe una necesidad de un medicamento eficaz y seguro para el tratamiento de IICA, calcificación vascular en enfermedad renal crónica (VCCKD), pseudoxantoma elástico (PXE), resistencia a la insulina, raquitismo hipofosfatémico y osificación del ligamento longitudinal posterior de la columna.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA

[0012] La presente divulgación se refiere a los usos de NPP1 soluble humana recombinante aislada que carece de dominios cistosólicos y transmembrana N-terminal y proteínas de fusión de la misma para el tratamiento de deficiencia de NPP1 u otros trastornos progresivos que se caracterizan por la acumulación de depósitos de calcio y otros minerales.

[0013] Las proteínas de la divulgación pueden utilizarse de manera sorprendente para restaurar la actividad de NPP1 en sangre y restaurar el nivel normal de pirofosfato en sujetos que tienen deficiencias en actividad de NPP1 o muestran acumulación de depósitos de calcio en los huesos, articulaciones, corazón, vasos sanguíneos, ojos y/o la piel.

[0014] Más específicamente, las proteínas NPP1 y las proteínas de fusión de NPP1 de la divulgación pueden utilizarse para tratar sujetos que tienen deficiencia de NPP1 u otras enfermedades o trastornos asociados con los niveles bajos de pirofosfato, que incluyen, pero no se limitan a, calcificación arterial idiopática infantil (IICA, también conocida como calcificación arterial general de la infancia), calcificación vascular en enfermedad renal crónica (VCCKD), pseudoxantoma elástica (PXE), resistencia a la insulina, raquitismo hipofosfatémico, calcificación de articulaciones, isquemia miocárdica y osificación del ligamento longitudinal posterior de la columna. Cualquier trastorno progresivo que se caracteriza por la acumulación de depósitos de calcio y otros minerales en tejidos arteriales y/o conectivos se encuentra dentro del alcance de la presente divulgación.

[0015] En algunos aspectos, la divulgación se refiere a un procedimiento de reducción de calcificación tisulares, preferiblemente calcificación vascular en un sujeto que lo necesita. El procedimiento comprende administrar a un sujeto con pirofosfato (PPi) bajo en plasma o fosfato inorgánico (Pi) elevado, dos o más dosis de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende una ectonucleótido pirofosfatasa fosfodiesterasa (NPP1) soluble. Cada dosis contiene una cantidad de NPP1 soluble que es suficiente para lograr un aumento temporal de PPi en plasma en el sujeto. El aumento temporal de PPi en plasma que se caracteriza por un nivel máximo de PPi que es como mínimo aproximadamente 40% del nivel normal de Ppi en plasma y un regreso al nivel de referencia de PPi en menos de aproximadamente 48 horas después de la administración de la dosis. El periodo de tiempo entre las dosis es de como mínimo 2 días.

[0016] El aumento temporal de PPi en plasma se mantiene durante como mínimo aproximadamente 4 horas, preferiblemente, como mínimo aproximadamente 6 horas, como mínimo aproximadamente 8 horas, como mínimo aproximadamente 10 horas o como mínimo aproximadamente 12 horas.

[0017] La calcificación tisular puede ser calcificación vascular, tal como calcificación venosa o arterial y la calcificación puede ser de la íntima o de la media.

[0018] El sujeto que necesita terapia puede tener deficiencia de NPP1, enfermedad renal crónica (CKD), enfermedad renal en etapa terminal (ESRD), calcificación arterial generalizada de la infancia (GACI), trastorno cardiovascular, diabetes mellitus II, aterosclerosis o pseudoxantoma elástico (PXE). Cuando el sujeto tiene PPi bajo en plasma, los niveles de pretratamiento de pirofosfato en plasma (PPi) en el sujeto son como mínimo de aproximadamente el 40% más bajos que los niveles normales de PPi en plasma y el sujeto es un ser humano. Cuando el sujeto tiene los niveles altos de Pi, los niveles de pretratamiento de Pi en el sujeto son típicamente como mínimo aproximadamente el 110% de los niveles normales de Pi en plasma.

[0019] La cantidad de sNPP1 administrada en cada dosis puede ser de aproximadamente 1,0 mg/kg a aproximadamente 5,0 mg/kg de NPP1 o de aproximadamente 1,0 mg/kg a aproximadamente 10,0 mg/kg de NPP1. El periodo de tiempo entre las dosis de NPP1 es como mínimo 2 días y puede ser más largo, por ejemplo, como mínimo 3 días, como mínimo 1 semana, 2 semanas o 1 mes. La sNPP1 puede administrarse utilizando cualquier vía adecuada, tal como vía intravenosa, subcutánea o intraperitoneal.

[0020] En aspectos preferidos, se administra una proteína de fusión de NPP1. Las proteínas de fusión preferidas comprenden un componente NPP1, una región Fc de una inmunoglobulina y opcionalmente una fracción de direccionamiento. Una fracción de direccionamiento preferida es Asp10. Las proteínas de fusión de NPP1 particularmente preferidas para la administración de acuerdo con los procedimientos divulgados en el presente documento tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12.

[0021] Basándose en la divulgación contenida en el presente documento, la presente invención proporciona una ectonucleótido pirofosfatasa fosfodiesterasa (NPP1) soluble para su uso en un procedimiento para reducir la calcificación vascular, comprendiendo el procedimiento administrar a un sujeto con pirofosfato (PPi) en plasma inferior a lo normal o fosfato (Pi) en suero superior a lo normal, dos o más dosis de NPP1 soluble, en donde cada dosis contiene una cantidad de NPP1 soluble que es suficiente para lograr un aumento temporal de PPi en plasma en el sujeto, el aumento temporal de PPi en plasma que se caracteriza por un nivel máximo de PPi en plasma que es como mínimo 40% del nivel normal de PPi en plasma y un regreso al nivel de referencia de PPi en plasma dentro de las 48 horas después de la administración de la dosis; y en donde (a) el periodo de tiempo entre las dosis es de como mínimo 2 días; (b) el nivel normal de PPi en plasma es 2,63 ± 0,47 micromolar; y (c) el nivel normal de Pi en suero es 1,5 ± 0,5 milimolar. Las realizaciones particulares de la invención se establecen en las reivindicaciones adjuntas. Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0022]

La Figura 1 es la secuencia de aminoácido de proteína NPP1 de tipo salvaje (SEQ ID NO: 1). Las regiones citosólicas y transmembrana están subrayadas. Los sitios potenciales de N-glicosilación están en negrita. El motivo de aminoácido "PSCAKE" (SEQ ID NO: 17) en negrita es el comienzo de una NPP1 soluble que incluye la región rica en cisteína.

La Figura 2 es la secuencia de aminoácidos de una sNPP1 que contiene la región rica en cisteína, región catalítica y región c-terminal (SEQ ID NO: 2).

La Figura 3 es la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión sNPP1-Fc (SEQ ID NO: 3).

La Figura 4 es la secuencia de aminoácidos de sNPP1-Fc-D10 (SEQ ID NO: 4). La secuencia Fc está subrayada. La fracción de direccionamiento D10 (SEQ ID NO: 18) está en negrita.

La Figura 5 muestra niveles de pirofosfato en sangre en ratones de tipo salvaje después de la administración de sNPP1-Fc o sNPP1-Fc- D10 por vía intravenosa (1 hora después de la inyección) y subcutánea (4 horas después de la inyección).

La Figura 6 muestra prevención de calcificación aórtica en ratones Enppl(-/-) con un tratamiento de sNPP1-Fc-D10. Los ratones Enppl(-/-) se trataron por vía subcutánea con un vehículo o 6 mg/kg de sNPP1-Fc-D10 cada dos días durante un periodo de 21 días. Los niveles de calcio aórtico se muestran para machos y hebras.

La Figura 7 muestra niveles de PPi en sangre y actividad enzimática en los ratones Enppl(-/-) tratados con 6 mg/kg de sNPP1-Fc-D10 por vía intravenosa. Se recogió plasma en puntos de tiempo de 0, 4, 24, 48 y 72 horas y se analizó la actividad de NPP1 (discontinua) y niveles de PPi (continua). Se determinó que el nivel de PPi de tipo salvaje fue de 2,18 |jM (los datos no se muestran). Las líneas discontinuas de la parte superior hacía la parte inferior muestran los niveles de PPi para ratones de tipo salvaje, asj Enppl(+/-) heterocigotos y Enppl(-/-) homocigotos (Li et. al, 2013). Los perfiles para sNPP1-Fc eran similares a los de sNPPl-Fc-D10.

La Figura 8 muestra supervivencia aumentada de ratones machos Enpplasj homozigotos tratados con 5 mg/kg de sNPP1-Fc en comparación con los ratones tratados con vehículo. Los ratones de tipo salvaje y Enpplasj se sometieron a una dieta rica en fósforo, baja en magnesio, desde el nacimiento. Se administró el vehículo o sNPP1-Fc (5 mg/kg) por vía subcutánea cada dos días comenzando desde el día 14 de edad. Las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier mostraron que >50% de ratones asj murieron antes de 6 semanas y todos los animales murieron hacía 9 semanas. En comparación, el 50% de animales tratados con sNPP1-Fc sobrevivieron pasadas 7 semanas y aun estaban vivos a las 9 semanas.

Las Figuras 9A y 9B muestran el porcentaje de aumento de peso corporal de los ratones machos Enpplasj tratados con 5 mg/kg de sNPP1- Fc (Figura 9B) en comparación con los ratones tratados con el vehículo (Figura 9A). Los ratones de tipo salvaje y Enpplasj se sometieron a una dieta rica en fósforo, baja en magnesio, desde el nacimiento. El vehículo o sNPP1-Fc (5 mg/kg) se inyectó por vía subcutánea cada dos días empezando a los 14 días de edad. El porcentaje de aumento de peso corporal para los ratones de tipo salvaje (linea continua) y Enpplasj (círculos) se mostró desde dos hasta nueve semanas de edad. Todos los animales Enpplasj murieron (círculo abierto) en el grupo del vehículo a las nueve semanas (panel superior). En comparación, los cinco ratones Enpplasjestaban vivos (círculo negro) y cinco murieron (circulo blanco) en el grupo de tratamiento con sNPP1-Fc al final de las nueve semanas.

Las Figuras 10A-10C son fotografías de los ratones de tipo salvaje (Figura 10A, parte superior), Enpplasj tratados con el vehículo (Figura 10B, en el medio), Enpplasj tratados con sNPP1-Fc (5 mg/Kg) (Figura 10C, parte inferior).

La Figura 11 muestra los niveles del factor de crecimiento de fibroblastos 23 en ratones de tipo salvaje tratados con el vehículo, Enpplasj/asj tratados con el vehículo y Enpplas/asj tratados con sNPP1-Fc (5 mg/Kg).

Las Figuras 12A-12H son las secuencias de aminoácidos de compuestos, compañeros de fusión y proteínas de fusión de NPP1 soluble. La Figura 12A muestra las secuencias de aminoácidos de una NPP1 soluble que contiene aminoácidos desde 107 hasta 925 de SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 5). La Figura 12B muestra las secuencias de aminoácidos de una NPP1 soluble que contiene aminoácidos desde 187 hasta 925 de SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 6). La Figura 12C muestra la secuencia de aminoácidos de la región Fc de IgG1 humana que incluye la región bisagra (SEQ ID NO: 7). La Figura 12D muestra la secuencia de aminoácidos de Fc de IgG1 humana que incluye una región bisagra parcial (SEQ ID NO: 8). La Figura 12E muestra la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión de NPP1-Fc (SEQ ID NO: 9). El componente NPP1 contiene SEQ ID NO: 5 y la secuencia Fc incluye la región bisagra. La Figura 12F muestra la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión de NPP1-Fc (SEQ ID NO: 10). La NPP1 soluble contiene SEQ ID NO: 5 y la secuencia Fc incluye la región bisagra parcial. La Figura 12G muestra la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión de NPP1-Fc (SEQ ID NO: 11). La NPP1 soluble contiene SEQ ID NO: 6 y la secuencia de Fc incluye la región bisagra. La Figura 12H muestra la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión de NPP1-Fc (Se Q ID NO: 12). La NPP1 soluble contiene SEQ ID NO: 6 y la secuencia de Fc incluye la región bisagra parcial.

Las Figuras 13A-13C son autoradiogramas de cromatogramas de capa fina que representan la actividad de NPP1 recombinante in vitro e in vivo. La Figura 13A: 100 nM de ATP incubado con 130 ug/ml de sNPP1-Fc-D10 durante una hora a 37°C. La Figura 13B: 100 nM de ATP incubado con plasma de ratones de tipo salvaje (WT), ratones Enppl-1- y ratones Enppl-1- 2 horas después de la inyección IV de NPP1 recombinante (6 mg/kg). La Figura 13C: 100 nM de ATP incubado con aorta de ratones de tipo salvaje (WT), ratones Enppl-/- y ratones Enppl-/- 2 horas después de la inyección IV de NPP1 recombinante (6 mg/kg). Pi: ortofosfato; ATP: Adenosina trifosfato; PPi: pirofosfato.

Las Figuras 14A y 14B son histogramas que muestran la evolución con el tiempo de la actividad de NPP1 en plasma (Figura 14A, parte superior) y concentración de pirofosfato en plasma (Figura 14B, parte inferior) en ratones Enppl(-/-) después de la inyección subcutánea de NPP1 recombinante (5 mg/kg).

La Figura 15 es un diagrama de dispersión que representa la relación entre la actividad de NPP1 en plasma y pirofosfato en plasma (PPi) para ratones Enppl(-/-) a diferentes tiempos después de la inyección subcutánea de NPP1 recombinante (5 mg/kg) (círculos) y para ratones de tipo salvaje (cuadrados).

Las Figuras 16A-16C son histogramas que representan la síntesis de pirofosfato en sangre humana. La Figura 16A: Sangre o plasma heparinizado obtenido a partir de la misma muestra de sangre. La Figura 16B: Células de sangre centrifugadas con (todas las células) o sin eliminar la capa leucocitaria (eritrocitos), suspendidas en solución salina tamponada con HEPES. La Figura 16C: Leucocitos o plaquetas aislados, suspendidos en solución salina tamponada con HEPES. Las muestras se incubaron a 37°C durante 2 horas con o sin NPP1 recombinante (145 ug/ml).

La Figura 17 es un histograma que representa el efecto de NPP1 recombinante sobre la calcificación aórtica en ratones Enppl(-/-). Se inyectó la NPP1 recombinante (6 mg/kg) por vía subcutánea cada 48 horas en ratones alimentados con una dieta rica en fosfato. Cada barra representa un único animal con edad en semanas indicada en la parte inferior. M: pareja macho; F: pareja hembra. La línea discontinua indica el contenido promedio de calcio de aortas de miembros de la camada de tipo salvaje.

La Figura 18 es un histograma que representa el efecto de NPP1 recombinante sobre la calcificación aórtica en ratas urémicas con insuficiencia renal. Se inyectó sNPP1-Fc-D10 o control (5 mg/kg) por vía subcutánea, 5 dosis por semana durante 21 días en ratas urémicas alimentadas con una dieta rica en adenina. Cada barra representa un único animal de aproximadamente 4 meses de edad.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Definiciones

[0023] A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta divulgación (incluyendo la invención). Aunque se puede utilizar cualquier procedimiento y material similar o equivalente a aquellos descritos en el presente documento en la práctica o prueba de la presente divulgación e invención, se describen los procedimientos y los materiales preferidos.

[0024] "Aproximadamente", tal como se usa el término en el presente documento, cuando se refiere a un valor que se puede medir, tal como una cantidad, una duración temporal y similares, pretende abarcar variaciones de ± 20% o ± 10%, más preferiblemente ± 5%, incluso más preferiblemente ± 1%, y aun más preferiblemente ± 0,1% del valor especificado, ya que tales variaciones son apropiadas para realizar los procedimientos descritos.

[0025] El término "proporción de PPi:Pi alterada" hace referencia a una proporción de PPi en plasma con respecto a Pi en suero que es como mínimo 10% o como mínimo 20% superior o inferior a la proporción de PPi:Pi normal para este tipo de sujeto (por ejemplo, un ser humano). Una proporción de PPi:Pi alterada puede estar presente debido a los niveles más bajos de lo normal de PPi en plasma o los niveles más altos de lo normal de Pi en suero. La proporción de PPi:Pi se expresa como ([PPi]/[Pi])*1000, y la proporción normal de un ser humano es aproximadamente 1,75.

[0026] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "fragmento", con referencia las proteínas NPP1, se refiere a una subsecuencia de NPP1 de longitud completa. Un “fragmento” de una proteína o un péptido puede ser de como mínimo 20 aminoácidos de longitud; por ejemplo, como mínimo aproximadamente 50 aminoácidos de longitud; como mínimo aproximadamente 100 aminoácidos de longitud; como mínimo aproximadamente 200 aminoácidos de longitud; como mínimo aproximadamente 300 aminoácidos de longitud; o como mínimo aproximadamente 400 aminoácidos de longitud (y cualquier valor entero intermedio). Los fragmentos pueden variar en tamaño desde cuatro residuos de aminoácidos hasta la secuencia de aminoácidos completa menos un aminoácido. Por lo tanto, una proteína “que comprende como mínimo una parte de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1” abarca la NPP1 de longitud entera y los fragmentos de la misma.

[0027] El término "Pi alto en suero", tal como se utiliza en el presente documento, hace referencia a un nivel de fosfato inorgánico (Pi) en el suero de un sujeto que es como mínimo 110% del nivel normal de Pi para este tipo de sujeto (por ejemplo, un ser humano). Preferiblemente, el nivel de Pi en el suero del sujeto es como mínimo aproximadamente 120%, como mínimo aproximadamente 150%, como mínimo aproximadamente 200% o como mínimo aproximadamente 300% del nivel normal de Pi para este tipo del sujeto. Se informa que los niveles normales de Pi para un ser humano son 1,5 ± 0,5 milimolar (Rutsch, F. et al., Circ Cardiovasc Genet 1:133-140 (2008)).

[0028] Una proteína NPP1 soluble "aislada" o "purificada" o un fragmento biológicamente activo o proteína de fusión de la misma está libre sustancialmente de material celular u otras proteínas contaminantes de la fuente de células o tejidos a partir de la cual se deriva la proteína NPP1, el fragmento biológicamente activo o proteína de fusión de NPP1, o sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas cunado se sintetiza químicamente. El lenguaje “sustancialmente libre de material celular” incluye las preparaciones de proteína NPP1, fragmento biológicamente activo o proteína de fusión de NPP1 en las cuales la proteína se separa de los componentes celulares de las células de las cuales se aísla o se produce de manera recombinante. En un caso, el lenguaje “sustancialmente libre de material celular” incluye las preparaciones de proteína NPP1, fragmento biológicamente activo o proteína de fusión de NPP1 que tienen menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de proteína/fragmento/proteína de fusión de no NPP1 (a lo que también se hace referencia como una “proteína contaminante”), más preferiblemente menos de aproximadamente 20% de proteína/fragmento/proteína de fusión de no NPP1, aun más preferiblemente menos de aproximadamente 10% de proteína/fragmento/proteína de fusión de no NPP1 y lo más preferiblemente menos de 5% de proteína/fragmento/proteína de fusión de no NPP1. Cuando la proteína NPP1, proteína de fusión o fragmento biológicamente activo de la misma se produce de manera recombinante, también está preferiblemente sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, más preferiblemente menos de aproximadamente 10% y lo más preferiblemente menos de aproximadamente 5% del volumen de la preparación de la proteína.

[0029] El término "Pi bajo en suero", tal como se utiliza en el presente documento, hace referencia a un nivel de pirofosfato (PPi) en el plasma de un sujeto que no supera el 50% del nivel normal de PPi para este tipo de sujeto (por ejemplo, un ser humano). Preferiblemente, el nivel de PPi en el plasma del sujeto no es superior a aproximadamente 40%, aproximadamente 30%, aproximadamente 20% o aproximadamente 10% del nivel normal de PPi para este tipo del sujeto. Se informa que los niveles normales de PPi para un ser humano son 2,63 ± 0,47 micromolar. (O'Neill et al., Nephrol Dial Transplant 2010, 25, 187-191). El pirofosfato puede cuantificarse enzimáticamente utilizando los procedimientos adecuados conocidos, tales como el procedimiento de uridina-difosfoglucosa (UDPG). (Ryan, L. M. et al., Arthritis Rheum 1979, 22, 886-91).

[0030] Intervalos: a lo largo de esta divulgación, se pueden presentar varios aspectos en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es meramente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la divulgación. Por consiguiente, se debe considerar que la descripción de un intervalo ha descrito específicamente todos los subintervalos posibles, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, se debe considerar que la descripción de un intervalo, tal como de 1 a 6, tiene subintervalos específicamente descritos, tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1,2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.

[0031] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "sujeto" abarca mamíferos y no mamíferos. Los ejemplos de mamíferos incluyen, pero no se limitan a, humanos, chimpancés, simios, monos, ganado, caballos, ovejas, cabras, cerdos, conejos, perros, gatos, ratas, ratones, cobayas y similares. Los ejemplos de no mamíferos incluyen, pero no se limitan a, pájaros, peces y similares.

[0032] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" hace referencia a una cantidad no tóxica, pero suficiente, de un agente (por ejemplo, proteínas sNPP1) que, en comparación con un sujeto correspondiente, que no ha recibido tal cantidad, da lugar a un tratamiento mejorado, curación, prevención o alivio de una enfermedad, trastorno o efecto secundario o una disminución en la velocidad de desarrollo de una enfermedad o un trastorno. El término incluye también dentro de su alcance cantidades eficaces para potenciar la función fisiológica normal.

[0033] El término "tratar" incluye la aplicación o la administración de las proteínas, los fragmentos y las proteínas de fusión de NPP1 de la divulgación a un sujeto, o la aplicación o la administración de las proteínas, los fragmentos y las proteínas de fusión de NPP1 de la divulgación a un sujeto, que tiene una enfermedad o un trastorno asociado a NPP1 u otra enfermedad o trastorno asociado con niveles bajos de pirofosfato en sangre u otro trastorno progresivo que se caracteriza por la acumulación de depósitos de calcio y otros minerales (mineralización), con el fin de curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, prevenir, mejorar o afectar la enfermedad o el trastorno. El término “tratar” se refiere a cualquier indicio de éxito en el tratamiento o mejora de una lesión, patología o condición que incluye cualquier parámetro objetivo o subjetivo, tal como reducción, remisión; disminución de síntomas o conversión de la lesión, patología o condición en más tolerable para el sujeto; reducción de la velocidad de degeneración o declive; conversión el punto final de degeneración en menos debilitante; o mejoría del bienestar físico o mental de sujeto. El tratamiento puede ser terapéutico o profiláctico. El tratamiento o la mejoría de síntomas pueden basarse en parámetros objetivos o subjetivos; que incluyen los resultados de un examen físico.

Procedimientos de Tratamiento

[0034] La presente divulgación se refiere a los usos de una NPP1 soluble humana recombinante aislada ("sNPP1"), que carece de un fragmento N-terminal (es decir, carece de dominios citosólicos y transmembrana) y proteínas de fusión de la misma para el tratamiento de enfermedades y trastornos asociados a NPP1. Las proteínas de la divulgación pueden utilizarse de manera sorprendente para aumentar la actividad de NPP1 in vivo y aumentar o restaurar el nivel normal de pirofosfato en sangre (PPi) en sujetos. Las proteínas de la divulgación pueden utilizarse también para prevenir la acumulación de depósitos de calcio en articulaciones, riñón, corazón (por ejemplo, aorta), arterias, vasos sanguíneos o ligamento longitudinal posterior de la columna.

[0035] El sujeto puede ser un paciente humano que tiene deficiencias en la actividad de NPP1 (deficiencia de NPP1) que muestra niveles bajos de pirofosfato, que padece una enfermedad o un trastorno asociado con los niveles bajos de pirofosfato o que padece un trastorno progresivo que se caracteriza por la acumulación de depósitos de calcio y otros minerales (mineralización) en fibras elásticas. La mineralización puede tener lugar en el corazón, las arterias, los vasos sanguíneos, el riñón, los ligamentos de la columna, la piel, los ojos y el tracto digestivo.

[0036] Más específicamente, las proteínas NPP1 y las proteínas de fusión de NPP1 de la divulgación pueden utilizarse para tratar sujetos que tienen enfermedades o trastornos asociados con NPP1, que incluyen, pero no se limitan a, calcificación arterial idiopática infantil (IIAC), resistencia a la insulina, raquitismo hipofosfatémico y osificación del ligamento longitudinal posterior de la columna u otras enfermedades, tales como calcificación vascular en enfermedad renal crónica (VCCKD), isquemia miocárdica, calcificación de articulaciones, vetas angioides, y pseudoxantoma elástico (PXE).

[0037] Las proteínas NPP1 solubles, fragmento y las proteínas de fusión de NPP1 de las mismas pueden utilizarse para tratar una amplia variedad de condiciones en un sujeto. Por ejemplo, el tratamiento de condiciones que se pueden mejorar reduciendo y/o eliminando una o más estructuras de calcificación y/o previniendo la formación de estructuras de calcificación en un sujeto, tal como un mamífero, por ejemplo, un paciente humano, está dentro del alcance de la divulgación.

[0038] En un caso particularmente útil, la condición a tratar es calcificación arterial generalizada (también conocida como calcificación arterial idiopática infantil y calcificación de la capa media arterial infantil).

[0039] En otros casos, las condiciones, tales como pseudoxantoma elástica, calcificación vascular en enfermedad renal crónica, resistencia a la insulina, raquitismo hipofosfatémico u osificación del ligamento longitudinal posterior de la columna pueden tratarse también utilizando los procedimientos descritos en el presente documento.

[0040] Generalmente, la dosificación de proteína de fusión administrada a un sujeto variará dependiendo de los factores conocidos, tales como edad, salud y peso del receptor, tipo de tratamiento simultáneo, frecuencia del tratamiento y similares. Normalmente, una dosificación de ingrediente activo (es decir, proteína de fusión) puede ser entre aproximadamente 0,0001 y aproximadamente 50 miligramos por kilogramo de peso corporal. La dosificación exacta, frecuencia de administración y periodo de tiempo de tratamiento pueden determinarse por un médico experto en la técnica de administración de proteínas terapéuticas.

[0041] Un caso preferido de la presente divulgación implica un procedimiento para tratar una enfermedad asociada a NPP1 u otras enfermedades de calcificación que incluye la etapa de administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de NPP1 soluble aislada (sNpPI), fragmento biológicamente activo o proteína de fusión de NPP1 a un sujeto. Tal como se define en el presente documento, una cantidad terapéuticamente eficaz de proteína (es decir, una dosificación eficaz) varía entre aproximadamente 0,001 y 50 mg/kg de peso corporal. El experto entenderá que ciertos factores pueden influir en la dosificación necesaria para el tratamiento eficaz de un sujeto, que incluyen, pero no se limitan a, la gravedad de la enfermedad, tratamientos anteriores, la salud general y/o la edad del sujeto y otras enfermedades actuales. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de proteína puede incluir un tratamiento único o, preferiblemente, puede incluir una serie de tratamientos. Se entenderá también que la dosificación eficaz de proteína utilizada para el tratamiento puede aumentarse o disminuirse a durante el transcurso de un tratamiento particular.

[0042] Tal como se define en el presente documento, una cantidad terapéuticamente eficaz de proteína o polipéptido (es decir, una dosificación eficaz) oscila entre aproximadamente 0,001 y 50 mg/kg de peso corporal, preferiblemente entre aproximadamente 0,01 y 25 mg/kg de peso corporal, más preferiblemente entre aproximadamente 0,1 y 20 mg/kg de peso corporal y aun más preferiblemente entre aproximadamente 1 y 10 mg/kg, entre 2 y 9 mg/kg, entre 3 y 8 mg/kg, entre 4 y 7 mg/kg, o entre 5 y 6 mg/kg de peso corporal. Un experto entenderá que ciertos factores pueden influir en la dosificación necesaria para el tratamiento eficaz de un sujeto, que incluyen, pero no se limitan a, la gravedad de la enfermedad o el trastorno, tratamientos anteriores, la salud general y/o la edad del sujeto y otras enfermedades actuales. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína, polipéptido o anticuerpo puede incluir un tratamiento único o, preferiblemente, puede incluir una serie de tratamientos.

[0043] En un ejemplo preferido, en el intervalo entre aproximadamente 0,1 y 20 mg/kg de peso corporal, una vez por semana, dos veces por semana, una vez aproximadamente cada 10 días, una vez aproximadamente cada 12 días, una vez aproximadamente cada 14 días, una vez aproximadamente cada 17 días, una vez aproximadamente cada 20 días, una vez aproximadamente cada 25 días o una vez aproximadamente cada 30 días. Se entenderá también que la dosificación eficaz de proteína sNPP1 soluble, fragmento biológicamente activo o proteína de fusión de la misma utilizada para el tratamiento puede aumentarse o disminuirse a lo largo de un tratamiento particular.

[0044] La divulgación contempla una dosis terapéuticamente eficaz de sNPP1, fragmento biológicamente activo o proteína de fusión de la misma para ser administrada a un paciente entre una vez cada 5 días y una vez cada 30 días durante un periodo de tiempo determinado por un médico experto en la técnica de ciencias médicas. En un caso, el periodo de tiempo será el resto de la vida útil del paciente. En un caso, la frecuencia de dosificación es entre una vez cada 5 días y una vez cada 25 días. En un caso, la frecuencia de dosificación es entre una vez cada 5 días y una vez cada 21 días. En otro caso, la frecuencia de dosificación es entre una vez cada 7 días y una vez cada 14 días. sNPP1, fragmento biológicamente activo o proteína de fusión de la misma pueden administrarse una vez cada 5 días, una vez cada 6 días, una vez cada 7 días, una vez cada 8 días, una vez cada 9 días, una vez cada 10 días, una vez cada 11 días, una vez cada 12 días, una vez cada 13 días o una vez cada 14 días. En algunos ejemplos, sNPP1, fragmento biológicamente activo o proteína de fusión de la misma se administran aproximadamente cada semana. En otros casos, sNPP1, fragmento biológicamente activo o proteína de fusión de la misma se administran aproximadamente cada dos semanas. En un caso, la frecuencia de dosificación es una vez cada 30 días.

[0045] En un caso, el paciente tiene menos de 2 años de edad. En algunos casos, se administran aproximadamente 0,1 mg, aproximadamente 0,2 mg, aproximadamente 0,3 mg, aproximadamente 0,4 mg, aproximadamente 0,5 mg, aproximadamente 1 mg, aproximadamente 2 mg, aproximadamente 3 mg, aproximadamente 5 mg, aproximadamente 10 mg, aproximadamente 15 mg, aproximadamente 20 mg, aproximadamente 25 mg, aproximadamente 30 mg, aproximadamente 35 mg, aproximadamente 40 mg o aproximadamente 45 mg de sNPP1, fragmento biológicamente activo o proteína de fusión al paciente con deficiencia de NPP1 u otra enfermedad de calcificación. En algunos casos, se administran desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 30 mg, desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 20 mg, desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 10 mg o desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 5 mg al paciente.

[0046] En un caso, se administran aproximadamente 1 mg/kg de sNPP1, fragmento biológicamente activo o proteína de fusión al paciente una vez por semana. En un caso, se administran aproximadamente 2 mg/kg de sNPP1, fragmento biológicamente activo o proteína de fusión al paciente una vez por semana. En un caso, se administran aproximadamente 3 mg/kg de sNPP1, fragmento biológicamente activo o proteína de fusión al paciente una vez por semana. En un caso, se administran aproximadamente 4 mg/kg de sNPP1, fragmento biológicamente activo o proteína de fusión al paciente una vez por semana. En un caso, se administran aproximadamente 5 mg/kg de sNPP1, fragmento biológicamente activo o proteína de fusión al paciente una vez por semana. En un caso, se administran aproximadamente 6 mg/kg de sNPP1, fragmento biológicamente activo o proteína de fusión al paciente una vez por semana. En un caso, se administran aproximadamente 7 mg/kg de sNPP1, fragmento biológicamente activo o proteína de fusión al paciente una vez por semana. En un caso, se administran aproximadamente 8 mg/kg de sNPP1, fragmento biológicamente activo o proteína de fusión al paciente una vez por semana. En un caso, se administran aproximadamente 9 mg/kg de sNPP1, fragmento biológicamente activo o proteína de fusión al paciente una vez por semana. En un caso, se administran aproximadamente 10 mg/kg de sNPP1, fragmento biológicamente activo o proteína de fusión al paciente una vez por semana.

[0047] En algunos casos, el nivel de PPi en sangre en un paciente antes del tratamiento es de aproximadamente 1%, aproximadamente 2%, aproximadamente 3%, aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70% o aproximadamente 80% de los niveles normales de PPi observados en un individuo humano normal. En un caso, el nivel de PPi en un paciente antes del tratamiento es de aproximadamente 50% o inferior a los niveles normales de PPi observados en un individuo humano normal. En un caso, el nivel de PPi en un paciente antes del tratamiento es de aproximadamente 40% o inferior a los niveles normales de PPi observados en un individuo humano normal. En un caso, el nivel de PPi en un paciente antes del tratamiento es de aproximadamente 30% o inferior a los niveles normales de PPi observados en un individuo humano normal. En un caso, el nivel de PPi en un paciente antes del tratamiento es de aproximadamente 30% o inferior a los niveles normales de PPi observados en un individuo humano normal. En un caso, el nivel de PPi en un paciente antes del tratamiento es de aproximadamente 20% o inferior a los niveles normales de PPi observados en un individuo humano normal. En un caso, el nivel de PPi en un paciente antes del tratamiento es de aproximadamente 10% o inferior a los niveles normales de PPi observados en un individuo humano normal. En un caso, el nivel de PPi en un paciente antes del tratamiento es de aproximadamente 5% o inferior a los niveles normales de PPi observados en un individuo humano normal. En algunos casos, un paciente no muestra PPi medible antes del tratamiento.

[0048] La sNPP1, un fragmento biológicamente activo o proteína de fusión, pueden administrarse mediante, por ejemplo, inyecciones subcutáneas, inyecciones intramusculares e infusiones o inyecciones intravenosas (IV).

[0049] En un caso, la sNPP1, un fragmento biológicamente activo o proteína de fusión se administra por vía intravenosa mediante infusión IV utilizando cualquier procedimiento útil. En un ejemplo, sNPP1, fragmento biológicamente activo o proteína de fusión pueden administrarse mediante infusión intravenosa a través de una línea periférica. En otro ejemplo, sNPP1, fragmento biológicamente activo o proteína de fusión pueden administrarse mediante infusión intravenosa a través de un catéter central insertado periféricamente.

[0050] En otro caso, la sNPP1, un fragmento biológicamente activo o proteína de fusión se administra por vía intravenosa mediante inyección IV.

[0051] En otro caso, la sNPP1, un fragmento biológicamente activo o proteína de fusión pueden administrarse mediante inyección intraperitoneal.

[0052] En otro caso, la sNPP1, un fragmento biológicamente activo o proteína de fusión pueden administrarse mediante inyecciones subcutáneas.

[0053] En otro caso, sNPP1, fragmento biológicamente activo o proteína de fusión pueden administrarse mediante inyecciones intramusculares.

[0054] En otro caso adicional, sNPP1, fragmento biológicamente activo o proteína de fusión se administran utilizando una cápsula farmacéuticamente aceptable de la proteína terapéutica. Por ejemplo, la cápsula puede ser una cápsula de gelatina con recubrimiento entérico.

[0055] En un caso, el procedimiento implica administrar la proteína NPP1 soluble o la proteína de fusión de NPP1 de la divulgación solas o en combinación con otro(s) agente(s). En un caso, el procedimiento implica administrar una proteína de NPP1 o una proteína de fusión de NPP1 de la divulgación como terapia para compensar la expresión o la actividad disminuida o anormal de NPP1 en el sujeto que tiene una deficiencia de NPP1 u otra enfermedad o trastorno asociado.

[0056] En un caso, las proteínas, los fragmentos y las proteínas de fusión de sNPP1 aislados pueden administrarse antes, después y simultáneamente con el agente o pueden administrarse conjuntamente con otras terapias conocidas. La administración conjunta de las proteínas, los fragmentos y las proteínas de fusión de sNPP1 aislados de la presente divulgación con otros agentes terapéuticos puede proporcionar dos agentes que funcionan mediante mecanismos diferentes que producen un efecto terapéutico aumentado. Tal administración conjunta puede resolver problemas debidos al desarrollo de resistencia a los fármacos.

[0057] En aspectos particulares, la divulgación se refiere a un procedimiento de reducción de calcificación vascular en un sujeto que lo necesita. El procedimiento se basa en el descubrimiento sorprendente de que las formas solubles de NPP1 pueden administrarse a animales que tienen niveles de PPi bajos en plasma (un inhibidor de calcificación tisular) o niveles de Pi altos en suero para causar un aumento temporal de PPi en plasma de animales, y que el aumento temporal de PPi en plasma puede inhibir la calcificación vascular en el animal. Dado que el aumento de PPi en plasma es temporal, la terapia puede adaptarse para inhibir la calcificación tisular no deseada o patológica, tal como calcificación vascular, sin inhibir la calcificación ósea o inducir la osteomalacia.

[0058] En términos generales, la divulgación se refiere a un procedimiento para recudir la calcificación en tejido (por ejemplo, calcificación vascular) en un sujeto que lo necesita administrando al sujeto dos o más dosis de NPP1 soluble (sNPPI). Cada una de las dosis contiene una cantidad de NPP1 soluble que es suficiente para conseguir un aumento temporal de PPi en plasma del sujeto, preferiblemente con un regreso al nivel de referencia de PPi dentro de aproximadamente 48 horas después de la administración de la dosis. El periodo de tiempo entre la administración de cada dosis es generalmente como mínimo 2 días.

[0059] El sujeto que lo necesita puede ser de cualquier edad y género y, preferiblemente, tiene PPi bajo en plasma (inferior a nivel normal) o Pi alto en suero (superior a nivel normal) (por ejemplo, que da lugar a una proporción PPi:Pi alterada). PPi bajo en plasma puede ser consecuencia de, por ejemplo, deficiencia congénita de NPP1, tal como mutación en el gen que codifica NPP1 que provoca la expresión reducida de NPP1 activa o actividad enzimática reducida (asociada con deficiencia de NPP1 y raquitismo hipofosfatémico autosómico recesivo) y mutación en el gen que codifica MRP6 que conduce a una proteína MRP6 ausente o no funcional (asociada a pseudoxantoma elástico). PPi bajo en plasma o Pi alto en suero se observa de manera frecuente en pacientes con enfermedad renal crónica, enfermedad/insuficiencia renal en etapa terminal, diabetes mellitus y otras afecciones. Por consiguiente, el sujeto que necesita terapia puede tener enfermedad renal crónica (CKD), enfermedad renal en etapa terminal (ESRD), calcificación arterial generalizada de la infancia (GACI), diabetes mellitus II, raquitismo hipofosfatémico autosómico recesivo, un trastorno cardiovascular, aterosclerosis y/o pseudoxantoma elástico (PXE). Generalmente, el sujeto es un ser humano, pero puede ser cualquier otro mamífero o no mamífero adecuado.

[0060] La calcificación en tejidos es un proceso progresivo y los individuos que nacen con deficiencia congénita de NPP1 pueden no mostrar la calcificación en tejidos durante varios años. Al iniciar la terapia lo antes posible, es probable que la calcificación pueda reducirse y/o minimizarse en dichos sujetos. En sujetos con los niveles bajos de PPi en plasma que no están causados por la mutación de la línea germinal o con los niveles altos de Pi en suero (por ejemplo, con una proporción alterada de PPi:Pi en plasma), la terapia debería empezar tan pronto como sea posible (es decir, poco después del diagnóstico de las condiciones, tales como enfermedad renal crónica (CKD) o enfermedad renal en etapa terminal (ESRD)). En determinados casos, el sujeto a tratar puede tener entre 1 mes y 24 meses de edad, menor de 1 año de edad, menor de 2 años de edad, menor de 3 años de edad, menor de 4 años de edad o menor de 5 años de edad.

[0061] Cada dosis de sNPP1 que se administra al sujeto contiene una cantidad suficiente de sNPP1 para conseguir un aumento temporal de PPi en plasma. De acuerdo con la invención, el aumento temporal se caracteriza por un nivel máximo de PPi en plasma que es como mínimo 40% del nivel normal de PPi en plasma. Preferiblemente, el aumento temporal se caracteriza por un nivel máximo de PPi que es como mínimo aproximadamente 50% del nivel normal de PPi en plasma, como mínimo aproximadamente 60% del nivel normal de PPi en plasma, como mínimo aproximadamente 70% del nivel normal de PPi en plasma, como mínimo aproximadamente 80% del nivel normal de PPi en plasma, entre aproximadamente 40% y 100% del nivel normal de PPi en plasma, entre aproximadamente 50% y 100% del nivel normal de PPi en plasma, entre aproximadamente 60% y 100% del nivel normal de PPi en plasma, entre aproximadamente 70% y 100% del nivel normal de PPi en plasma, entre aproximadamente 80% y 100% del nivel normal de PPi en plasma o entre aproximadamente 100% y 200% del nivel normal de PPi en plasma.

[0062] Preferiblemente, el aumento temporal de PPi en plasma después de la administración de sNPP1 se mantiene durante como mínimo aproximadamente 4 horas, como mínimo aproximadamente 6 horas, como mínimo aproximadamente 8 horas, como mínimo aproximadamente 10 horas o como mínimo aproximadamente 12 horas. De acuerdo con la invención, el aumento temporal de PPi en plasma vuelve al nivel de referencia de PPi en el sujeto dentro de 48 horas después de la administración de la dosis.

[0063] El PPi bajo en plasma en un sujeto antes del tratamiento de acuerdo con la presente divulgación es aproximadamente 50% o inferior, preferiblemente 40% o inferior a los niveles normales de PPi observados en un sujeto normal (por ejemplo, un ser humano). En algunos aspectos, el nivel de PPi en un sujeto antes del tratamiento es aproximadamente 30% o inferior a los niveles normales de PPi. En otros aspectos, el nivel de PPi en un sujeto antes del tratamiento es aproximadamente 20% o inferior a los niveles normales de PPi. En algunos otros aspectos, el nivel de PPi en un sujeto antes del tratamiento es aproximadamente 10% o inferior a los niveles normales. En algunos aspectos, un sujeto puede no tener PPi medible antes del tratamiento.

[0064] El Pi alto en suero en un sujeto antes del tratamiento de acuerdo con la presente divulgación es aproximadamente del 110% o superior, preferiblemente del 125% o superior a los niveles normales de Pi observados en un sujeto normal (por ejemplo, un ser humano). En algunos aspectos, el nivel de Pi en un sujeto antes del tratamiento es de aproximadamente el 150% o superior a los niveles normales de PPi. En otros aspectos, el nivel de Pi en un sujeto antes del tratamiento es aproximadamente del 200% o superior a los niveles normales de PPi. En algunos otros aspectos, el nivel de Pi en un sujeto antes del tratamiento es aproximadamente del 300% o superior a los niveles normales. Aunque no se desea ceñirse a ninguna teoría particular, se cree que provocando un aumento temporal de PPi en suero se puede compensar los niveles elevados de Pi en plasma y restablecer temporalmente la proporción normal o casi normal de PPi:Pi, inhibiendo de este modo la calcificación en tejidos que se promueve por los niveles superiores a los normales de Pi en suero.

[0065] La cantidad suficiente de sNPP1 para lograr el aumento temporal de PPi en plasma puede determinarse fácilmente por un médico clínico experto, por ejemplo, administrando una dosis que se espera que produzca el aumento temporal de PPi en plasma, determinando si se produce el aumento temporal y, a continuación, realizando los ajustes apropiados para la dosis. La cantidad a administrar se influenciará por un número de factores convencionales, que incluyen la sNPP1 particular utilizada, la edad, la salud y el peso del sujeto, la sensibilidad del sujeto a los fármacos y otros factores de relevancia. Típicamente, la cantidad de sNPP1 a administrar en cada dosis es entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 50 miligramos por kilogramo de peso corporal, con preferencia de 1 mg/kg hasta 5 mg/kg, 1 mg/kg hasta 10 mg/kg, 1mg/kg hasta 20 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg o 20 mg/kg. La dosificación exacta, frecuencia de administración y periodo de tiempo de tratamiento pueden determinarse por un médico experto en la técnica de administración de proteínas terapéuticas.

[0066] En algunos casos preferidos, cada dosis contiene desde aproximadamente 1,0 mg hasta aproximadamente 5,0 mg de sNPP1 por kg de peso corporal, desde aproximadamente1,0 mg hasta aproximadamente 10,0 mg de sNPP1 por kg de peso corporal o desde aproximadamente 1,0 mg hasta aproximadamente 20,0 mg de sNPP1 por kg de peso corporal.

[0067] El periodo de tiempo entre las dosis se selecciona para permitir que los niveles de PPi en suero del sujeto vuelvan a los niveles de referencia y es como mínimo 2 (48 horas) días, pero puede ser superior, según se desee o se indique. Por ejemplo, el periodo de tiempo entre las dosis puede ser de 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, una semana, 10 días, 12 días, dos semanas, tres semanas o aproximadamente 1 mes.

[0068] En general, se desea iniciar la terapia de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento tan pronto como sea posible después del diagnóstico de PPi bajo en plasma, Pi alto en suero o deficiencia de NPP1. Los sujetos que nacen con deficiencia congénita de NPP1 pueden no mostrar la calcificación en tejidos durante varios años. Al iniciar la terapia lo antes posible, es probable que la calcificación pueda reducirse y/o minimizarse en dichos sujetos. En sujetos con los niveles bajos de PPi en plasma que no están causados por la mutación en la línea germinal o con Pi alto en suero, la terapia debería empezar tan pronto como sea posible después del diagnóstico de las afecciones, tales como enfermedad renal crónica (CKD) o enfermedad renal en etapa terminal (ESRD).

[0069] El procedimiento proporciona una manera eficaz de reducir la calcificación en tejidos (por ejemplo, calcificación vascular) en un sujeto con PPi bajo en plasma o con Pi alto en suero, que incluye aquellos con una proporción alterada de PPi con respecto a Pi. La calcificación en tejidos de acuerdo con la invención es una calcificación vascular, que es preferiblemente calcificación arterial, pero puede ser también calcificación venosa. La calcificación vascular puede ser de la íntima o de la media. El sujeto a tratar de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento puede tener deficiencia de NPP1, calcificación arterial generalizada (GACI), también conocida como calcificación arterial idiopática infantil y calcificación arterial de la media infantil. El sujeto a tratar puede tener también un trastorno cardiovascular, tal como enfermedad de arteria coronaria y/o aterosclerosis. El sujeto a tratar puede tener enfermedad renal crónica (CKD) o enfermedad renal en etapa terminal (ESRD). El sujeto a tratar puede tener diabetes mellitus (por ejemplo, diabetes del tipo II). El sujeto a tratar puede tener pseudoxantoma elástico (PXE).

[0070] La sNPP1 puede administrarse utilizando cualquier procedimiento o vía de administración adecuados, tal como por la vía parenteral, oral o por inhalación. Se prefiere la administración parenteral, tal como inyección o infusión intravenosa, inyección subcutánea, inyecciones intraperitoneales o inyecciones intramusculares.

[0071] Si se desea, se puede administrar la sNPP1 con uno o más agentes coterapéuticos. Para la coterapia se administran la sNPP1 y uno o más agentes terapéuticos adicionales, de tal modo que exista una superposición sustancial en sus actividades farmacológicos individuales en el sujeto. Por consiguiente, cualquier agente coterapéutico puede administrarse antes, simultáneamente o posteriormente a la administración de sNPP1. La coterapia puede proporcionar dos agentes que funcionan utilizando mecanismos diferentes que producen un efecto terapéutico aumentado.

[0072] Además de causar un aumento temporal de PPi en suero, se cree que la administración de sNPP1 de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento, puede alterar los niveles de determinadas proteínas en el sujeto. Por ejemplo, aunque no se desea ceñirse a ninguna teoría particular, se cree que la administración de sNPP1 de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento puede disminuir los niveles de osteopontina, osteoprotegerina y factor de crecimiento de fibroblastos 23 (FGF-23) en el sujeto. Por tanto, pueden utilizarse también los niveles de estas proteínas, además de los niveles de PPi en plasma y Pi en suero, para monitorizar la terapia y la dosificación adaptada.

sNPPI

[0073] La presente divulgación utiliza la NPP1 soluble que contiene un dominio de NPP1 biológicamente activo de NPP1 (es decir, componentes de NPP1 que contienen como mínimo un dominio catalítico extracelular de NPP1 de origen natural para la actividad de pirofosfatasa y/o fosfodiesterasa). Las proteínas de NPP1 solubles de la divulgación comprenden como mínimo el dominio de NPP1 esencial para realizar la actividad de pirofosfatasa y/o fosfodiesterasa.

[0074] En un caso, la NPP1 soluble, el fragmento y las proteínas de fusión de la misma pueden formar homodímeros o monómeros funcionales. En un caso preferido, se puede evaluar una proteína de NPP1 soluble o una proteína de fusión de NPP1 de la misma para actividad de pirofosfatasa, así como también la capacidad de aumentar los niveles de pirofosfato in vivo.

[0075] Las proteínas de NPP1 solubles y las proteínas de fusión de NPP1 preferidas de la divulgación son enzimáticamente activas in vivo (por ejemplo, humanas). En un caso, la proteína soluble comprende la secuencia de aminoácidos que tiene como mínimo 60, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% de identidad de secuencia con la siguiente secuencia:

PS C AKE VKS CKGRCFERTF GN CRCD AACVELGNCCLD Y QET CIEPEHIWT CNKFRCG

EKRLTRSLCACSDDCKDKGDCCINYSSVCQGEKSWVEEPCESINEPQCPAGFETPPTL

LFSLDGFRAEYLHTWGGLLPVISKLKKCGTYTKNMRPVYPTKTFPNHYSIVTGLYPES

HGIIDNKMYDPKMNASFSLKSKEKFNPEWYKGEPIWVTAKYQGLKSGTFFWPGSDV

EIN GIFPDIYKMYN GS VPFEERIL AVLQ WLQLPKDERPHF YTL YLEEPD S S GHS YGP V S

SEVIKALQRVDGMVGMLMDGLKELNLHRCLNLILISDHGMEQGSCKKYIYLNKYLG

D VKNIKYIY GP A ARLRPSD VPDKYY SFNYEGIARNLS CREPN QHFKE YLKHFLPKRLH

F AKSDRIEPLTF YLDPQ W QL ALNPSERKYCGS GFHGSDNVT SNMQ ALF V GY GPGFKH

GIEADTFENIEVYNLMCDLLNLTPAPNNGTHGSLNHLLKNPVYTPKHPKEVHPLVQCP

FTRNPRDNLGCS CNPSILPIEDFQTQFNLTVAEEKIIKHETLPY GRPRVLQKENTICLLS

QHQFMS GY S QDILMPLWTS YTVDRND SF S TEDF SN CL Y QDFRIPLSP VHKCSF YKNNT

KVS YGFLSPPQLNKN S S GIY SE ALLTTNIVPMY Q SF Q VIWRYFHD TLLRKY AEERN GV

NWSGPVFDFDYDGRCDSLENLRQKRRVIRNQEILIPTHFFIVLTSCKDTSQTPLHCEN

LDTLAFILPHRTDNSESCVHGKHDSSWVEELLMLHRARITDVEHITGLSFYQQRKEPV

SDILKLKTHLPTF S QED

(SEQ ID NO:2)

[0076] Cualquier forma enzimáticamente activa deseada de NPP1 soluble puede utilizarse en los procedimientos descritos en el presente documento. La sNPP1 enzimáticamente activa puede aumentar los niveles de PPi en ensayos enzimáticos adecuados, y puede evaluarse la actividad de pirofosfatasa, la actividad de fosfodiesterasa o la actividad de pirofosfatasa y fosfodiesterasa. Típicamente, la sNPP1 contiene como mínimo un componente de NPP1 que carece de los dominios citosólicos y transmembrana N-terminal de NPP1 transmembrana de origen natural. En aspectos preferidos, el componente de NPP1 contiene la región rica en cisteína (aminoácidos 99-204 de SEQ ID NO: 1) y la región catalítica (aminoácidos 205-591 de SEQ ID NO: 1) de NPP1 humana de origen natural. Típicamente, el componente de NPP1 también incluye la región C-terminal (aminoácidos 592 a 925 de SEQ ID NO: 1), y tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Sin embargo, la región C-terminal puede truncarse, si se desea. Por consiguiente, los componentes preferidos de NPP1 incluyen la región rica en cisteína y la región catalítica de NPP1 humana (aminoácidos 99-591 de SEQ ID NO: 1) o la región rica en cisteína, la región catalítica y la región C-terminal de NPP1 humana (SEQ ID NO: 2). Otros componentes preferidos de NPP1 contienen únicamente una parte del dominio rico en cisteína y tiene la secuencia de aminoácidos 107 a 925 de SEQ ID NO: 1 o aminoácidos 187 a 925 de SEQ ID NO: 1.

[0077] La región rica en cisteína de NPP1 (es decir, aminoácidos 99 hasta 204 de SEQ ID NO: 1) puede facilitar la dimerización de la sNPP1. La sNPP1 que incluye proteínas de fusión puede estar en forma de un monómero de homodímero funcional.

[0078] La secuencia de aminoácidos del componente de NPP1 puede ser una variante de la secuencia de NPP1 de origen natural siempre y cuando el componente de NPP1 es enzimáticamente activo. Las variantes de NPP1 son enzimáticamente activas y tienen como mínimo 80%, como mínimo 85%, como mínimo 90%, como mínimo 95% y más preferiblemente como mínimo 96% de la identidad de secuencia de aminoácidos con la parte correspondiente de NPP1 humana (por ejemplo, a lo largo de la región rica en cisteína, la región catalítica, la región c-terminal, la región rica en cisteína más la región catalítica más la región c- terminal. Los variantes de NPP1 preferidas tienen como mínimo 90%, preferiblemente como mínimo 95%, más preferiblemente como mínimo 97% de la identidad de secuencia de aminoácidos con (i) la secuencia de aminoácidos de residuos 205-591 de SEQ ID NO: 1, (ii) la secuencia de aminoácidos de residuos 99-591 de SEQ ID NO: 1, (iii) la secuencia de aminoácidos de residuos 99-925 de SEQ ID NO: 1, (iv) la secuencia de aminoácidos de residuos 107-925 de SEQ ID NO: 1 o (v) la secuencia de aminoácidos de residuos 187-925 de SEQ ID NO: 1. Las posiciones adecuadas para las variaciones de aminoácidos se conocen bien de los estudios estructurales de NPP1 y los análisis de mutaciones asociadas a la enfermedad en NPP1. Por ejemplo, la sustitución de los siguientes aminoácidos tiene lugar en determinadas mutaciones asociadas a enfermedades que reducen la actividad enzimática de NPP1, y las variaciones de los aminoácidos en estas posiciones deberían evitarse: Ser216, Gly242, Pro250, Gly266, Pro305, Arg349, Tyr371, Arg456, Tyr471, His500, Ser504, Tyr513, Asp538, Tyr570, Lys579, Gly586; Tyr659, Glu668, Cys726, Arg774, His777, Asn792, Asp804, Arg821, Arg888 y Tyr901. (Véanse, por ejemplo, Jansen, S. et al., Structure 20:1948-1959 (2012).)

[0079] En un caso, la proteína de NPP1 soluble puede ser una proteína de fusión fusionada de manera recombinante o unida químicamente (por ejemplo, enlace covalente, enlace iónico, enlace hidrófobo y fuerza de Van der Waals) a un compañero de fusión. En otro caso, la proteína de fusión tiene como mínimo 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 98 o 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.

[0080] Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos, las secuencias se alinean con el propósito de una comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o ambas de una primera y segunda secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos para el alineamiento óptimo y las secuencias no homólogas pueden ignorarse con fines de comparación). En un caso preferido, la longitud de una secuencia de referencia alineada con fines de comparación es de como mínimo 30%, preferiblemente como mínimo 40%, más preferiblemente como mínimo 50%, incluso más preferiblemente como mínimo 60% y aun más preferiblemente como mínimo 70%, 80% o 90% de la longitud de la secuencia de referencia (por ejemplo, secuencia de aminoácidos de sNPP1 de SEQ ID NO: 2; aminoácidos 107-925 de SEQ ID NO: 1 o aminoácidos 187-925 de SEQ ID NO: 1). A continuación, se comparan los residuos de aminoácidos o nucleótidos en posiciones de aminoácidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en aquella posición (tal como se utiliza en el presente documento aminoácido es equivalente a “homología” de aminoácido o ácido nucleico). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que se necesitan introducir para el alineamiento óptimo de las dos secuencias).

[0081] La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se pueden lograr utilizando un algoritmo matemático. En un caso preferido, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J Mol Biol 1970, 48, 444-453) que se ha incorporado al programa GAP del paquete de software GCG (disponible en www.gcg.com), utilizando una matriz Blosum 62 o una matriz PAM250, y un peso del hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y un peso de la longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6. En otro caso, el porcentaje de identidad entre dos aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CABiOs , 1989, 4, 11-17) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0 o 2.0U), utilizando una tabla de pesos de residuos PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4.

[0082] La sNPP1 puede consistir en o consistir esencialmente en un componente de NPP1, tal como se describe en el presente documento. Alternativamente, la sNPP1 puede estar en forma de una proteína de fusión que contiene un componente de sNPP1 y uno o más de otros polipéptidos, a los que se hace referencia como compañeros de fusión, opcionalmente, a través de un enlazador adecuado en cada caso o en forma de un conjugado entre un componente de NPP1 y otra molécula (por ejemplo, PEG). Cuando la sNPP1 está en forma de una proteína de fusión, cada compañero de fusión se encuentra preferiblemente en el extremo c-terminal con respecto al componente de NPP1. Aunque no se desea ceñirse a ninguna teoría particular, se cree que las proteínas de fusión que contienen un componente de NPP1 que contiene la región rica en cisteína y la región catalítica, y una o más proteínas de fusión que se encuentran en el extremo c-terminal con respecto al componente de NPP1, son preferidas sobre otras configuraciones de proteínas de fusión de NPP1 debido a que pueden expresarse en suficientes niveles y son suficientemente estables para ser utilizadas como proteínas terapéuticas.

[0083] Se puede incluir cualquier compañero de fusión adecuado en la proteína de fusión. Ventajosamente, se conocen bien en la técnica un conjunto de compañeros de fusión que pueden proporcionar determinadas ventajas, tales como agregación reducida e inmunogenicidad, solubilidad aumentada, expresión y/o estabilidad mejorada y comportamiento farmacocinético y/o farmacodinámico mejorado. Véanse, por ejemplo, Strohl, W.R. BioDrugs 29:215-239 (2015). Por ejemplo, se conoce bien que la albúmina, fragmentos de albúmina o variantes de albúmina (por ejemplo, albumina de suero humano y fragmentos o variantes de la misma) pueden incorporarse a proteínas de fusión y que tales proteínas de fusión pueden purificarse fácilmente, pueden ser estables y tener una semivida en plasma mejorada. La albumina, los fragmentos de albumina y las variantes de albumina adecuadas que pueden utilizarse en las proteínas de fusión de sNPP1 se dan a conocer, por ejemplo, en los documentos WO 2005/077042A2 y WO 03/076567A2. Se conoce que las fusiones con transferrina humana mejoran la semivida. Véanse, por ejemplo, Kim BJ et al., J Pharmacol Expr Ther 334(3):682-692 (2010); y WO 2000/020746. Se pueden utilizar también péptidos que se unen a albumina o transferrina, tales como anticuerpos o fragmentos de anticuerpos. Véanse, por ejemplo, los documentos EP 0486525 B1, US 6,267,964 B1, WO 04/001064A2, WO 02/076489A1, WO 01/45746, WO 2006/004603 y WO 2008/028977. De manera similar, se conocen bien proteínas de fusión de Fc de inmunoglobulina. Véanse, por ejemplo, Czajkowsky DM et al., EMBO Mol Med 4(10):1015-1028 (2012), la Patente de Estados Unidos Número 7.902.151; y la Patente de Estados Unidos Número 7.858.297. La proteína de fusión puede incluir también una secuencia de CTP (ver también, Fares et al., Endocrinol 2010, 151, 4410-4417; Fares et al., Proc Natl Acad Sci 1992, 89, 4304-4308; y Furuhashi et al., Mol Endocrinol 1995, 9, 54-63). Preferiblemente, el compañero de fusión es el Fc de una inmunoglobulina (por ejemplo, Fc o IgG1 humana). El Fc puede incluir CH1, CH2 y c H3 de IgG1 humana, y, opcionalmente, la región bisagra de IgG1 humana (EPKs Cd - KTHTCPPCP (SEQ ID NO: 13)) o una parte de la región bisagra de IgG1 humana (por ejemplo, DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 14) o PKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 15)), si se desea. En algunas proteínas de fusión, el Fc puede incluir CH2 y CH3 de IgG1 humana o el Fc de IgG2 humana o IgG4 humana, si se desea.

[0084] Preferiblemente, la proteína de fusión de sNPP1 comprende un componente de NPP1 y un péptido que aumenta la semivida de la proteína de fusión, más preferiblemente el Fc de una inmunoglobulina (por ejemplo, Fc o IgG1 humana). Tal como se utiliza en el presente documento, una “proteína que aumenta la semivida de la proteína de fusión” hace referencia a una proteína que, cuando se fusiona con una NPP1 soluble o un fragmento biológicamente activo, aumenta la semivida del polipéptido NPP1 soluble o el fragmento biológicamente activo en comparación con la semivida del polipéptido NPP1 soluble, solo o el fragmento biológicamente activo de NPP1, solo.

[0085] En un caso, la semivida de la proteína de fusión de NPP1 aumenta un 50% en comparación con la semivida del polipéptido NPP1 o el fragmento biológicamente activo, solo. En otro caso, la semivida de la proteína de fusión de NPP1 aumenta un 60% en comparación con la semivida del polipéptido NPP1 o el fragmento biológicamente activo, solo. En otro caso, la semivida de la proteína de fusión de NPP1 aumenta un 70% en comparación con la semivida del polipéptido NPP1 o el fragmento biológicamente activo, solo. En otro caso, la semivida de la proteína de fusión de NPP1 aumenta un 80% en comparación con la semivida del polipéptido NPP1 o el fragmento biológicamente activo, solo. En otro caso, la semivida de la proteína de fusión de NPP1 aumenta un 90% en comparación con la semivida del polipéptido NPP1 o el fragmento biológicamente activo, solo.

[0086] En otro caso, la semivida de la proteína de fusión de NPP1 aumenta 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces en comparación con la semivida del polipéptido de NPP1 o el fragmento biológicamente activo, por sí solo. Se conocen bien en la técnica los procedimientos para determinar la semivida de una proteína o una proteína de fusión. Por ejemplo, Zhou et al., Determining Protein Half-Lives, Methods in Molecular Biology 2004, 284, 67-77 da a conocer numerosos procedimientos para poner a prueba la semivida de una proteína. Si se desea, la proteína de fusión puede conjugarse con los polímeros u otros compuestos adecuados que alargan la semivida, tales como polietilenglicol (PEG), pueden conjugarse con las proteínas de fusión de NPP1.

[0087] En un caso, el péptido que aumenta la semivida de la proteína de fusión es una secuencia de CTP (véanse también, Fares et al., 2010, Endocrinol., 151(9):4410-4417; Fares et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci, 89(10):4304-4308; y Furuhashi et al., 1995, Molec. Endocrinol., 9(1):54-63).

[0088] En otro caso, el péptido que aumenta la semivida de la proteína de fusión es un dominio Fc de una Ig.

[0089] Los compañeros de fusión también pueden seleccionarse para dirigir la proteína de fusión a sitios deseados de importancia clínica o biológica (por ejemplo, sitio de calcificación). Por ejemplo, los péptidos que tienen alta afinidad con el hueso se describen en la Patente de Estados Unidos Número 7.323.542. Los péptidos que pueden aumentar el direccionamiento de proteínas a sitios de calcificación pueden contener un tramo consecutivo de como mínimo aproximadamente 4 aminoácidos ácidos, por ejemplo, ácidos glutámicos o ácidos aspárticos. Típicamente, el péptido que dirige la proteína de fusión a los sitios de calcificación comprenderá entre 4 y 20 aminoácidos ácidos consecutivos, por ejemplo, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos consecutivos seleccionados de ácido glutámico y ácido aspártico. El péptido puede consistir únicamente en residuos de ácido glutámico, únicamente en residuos de ácido aspártico o ser una mezcla de residuos de ácido glutámico y ácido aspártico. Una fracción particularmente preferida para direccionamiento a sitios de calcificación es Asp-iü (SEQ ID NO: 18).

[0090] En un caso, la proteína de fusión de NPP1 de la divulgación comprende un polipéptido de NPP1 y una fracción que aumenta el direccionamiento de proteínas a sitios de fusión, tal como un tramo consecutivo de aminoácidos ácidos, por ejemplo, ácidos glutámicos o ácidos aspárticos.

[0091] Los enlazadores de péptido adecuados para su uso en proteínas de fusión se conocen bien y adoptan típicamente una conformación extendida flexible y no interfieren con la función del componente de NPP1 o los compañeros de fusión. Las secuencias de enlazadores de péptidos pueden contener residuos de Gly, His, Asn y Ser en cualquier combinación. Los enlazadores de péptidos útiles incluyen, sin limitación, poli-Gly, poli-His, poli-Asn o poli-Ser. Otros aminoácidos casi neutros, tales como Thr y Ala, pueden utilizarse también en la secuencia de enlazador. Las secuencias de aminoácidos que pueden emplearse útilmente como enlazadores incluyen aquellas divulgadas en Maratea et al., Gene 1985, 40, 39-46; Murphy et al., Proc Natl Acad Sci USA 1986, 83, 8258-8262; la Patente de Estados Unidos Número 4.935.233 y la Patente de Estados Unidos Número 4.751.180. Otros enlazadores adecuados pueden obtenerse a partir de las proteínas de origen natural, tales como la región bisagra de una inmunoglobulina. Un enlazador sintético preferido es (Gly4Ser)n, en el que n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 (SEQ ID NO: 19). Preferiblemente, n es 3 o 4. Por ejemplo, en algunos casos el enlazador es (Gly4Ser)3 (SEQ ID NO: 16) y la proteína de fusión incluye un enlazador con la secuencia de aminoácidos GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer (SEQ ID NO: 16). Típicamente, el enlazador tiene de 1 a aproximadamente 50 residuos de aminoácidos de longitud, o de 1 a aproximadamente 25 aminoácidos de longitud. A menudo, el enlazador es entre aproximadamente 8 y aproximadamente 20 aminoácidos de longitud.

[0092] Las proteínas de fusión de NPP1 preferidas comprenden un componente de NPP1 desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal, opcionalmente, un enlazador, una región Fc de una inmunoglobulina (por ejemplo, Fc de IgG1 humana opcionalmente, que incluye una bisagra o una fracción de la misma), opcionalmente, un segundo enlazador y, opcionalmente, una fracción de direccionamiento. Por lo tanto, la región Fc y la fracción de direccionamiento opcional, cuando están presentes, cada una se encuentra en el extremo C-terminal del componente de NPP1. El componente de NPP1 comprende preferiblemente la región rica en cisteína y el dominio catalítico de NPP1, carece de dominios citosólicos y transmembrana del extremo N-terminal y, opcionalmente, contiene la región C-terminal.

[0093] Una proteína de fusión preferida comprende, desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal, un componente de NPP1 que comprende el dominio rico en cisteína, el dominio catalítico y la región C-terminal de NPP1 humana; y la región Fc, que incluye bisagra, de una inmunoglobulina humana. Preferiblemente, la región Fc es de IgG1 humana. En casos particulares, la proteína de fusión tiene como mínimo 80%, como mínimo 85%, como mínimo 90%, como mínimo 91%, como mínimo 92%, como mínimo 93%, como mínimo 94%, como mínimo 95%, como mínimo 96%, como mínimo 97%, como mínimo 98% o como mínimo 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3. Una proteína de fusión preferida de este tipo tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

[0094] Otra proteína de fusión preferida comprende, desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal, un componente de NPP1 que comprende el dominio rico en cisteína, el dominio catalítico y la región C-terminal de NPP1 humana; un enlazador (por ejemplo, (Gly4Ser)3 (SEQ ID NO: 16)); y la región Fc, que incluye bisagra, de una inmunoglobulina humana. Preferiblemente, la región Fc es de IgG1 humana.

[0095] Otra proteína de fusión preferida comprende, del extremo N-terminal al extremo C-terminal, un componente de NPP1 que comprende el dominio rico en cisteína, el dominio catalítico y la región C-terminal de NPP1 humana; la región Fc, que incluye bisagra o una parte de la misma, de una inmunoglobulina humana; y una fracción que dirige la proteína de fusión a sitios de calcificación. Preferiblemente, la región Fc es de IgG1 humana. Preferiblemente, la fracción que dirige la proteína de fusión a sitios de calcificación es Asp-iü (SEQ ID NO: 18). Más preferiblemente, la región Fc es de IgG1 humana y la fracción que dirige la proteína de fusión a sitios de calcificación es Asp-io (SEQ ID NO: 18). En casos particulares, la proteína de fusión tiene como mínimo 80%, como mínimo 85%, como mínimo 90%, como mínimo 91%, como mínimo 92%, como mínimo 93%, como mínimo 94%, como mínimo 95%, como mínimo 96%, como mínimo 97%, como mínimo 98% o como mínimo 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 4. Una proteína de fusión preferida de este tipo tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

[0096] Otra proteína de fusión preferida comprende, desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal, un componente de NPP1 que comprende el dominio rico en cisteína, el dominio catalítico y la región C-terminal de NPP1 humana; un enlazador (por ejemplo, (Gly4Ser)3 (SEQ ID NO: 16)); la región Fc, que incluye bisagra o una parte de la misma, de una inmunoglobulina humana; y una fracción de direccionamiento de la proteína de fusión a sitios de calcificación. Preferiblemente, la región Fc es de IgG1 humana. Preferiblemente, la fracción de direccionamiento de la proteína de fusión a sitios de calcificación es Asp-i0 (SEQ ID NO: 18). Más preferiblemente, la región Fc es de IgG1 humana y la fracción de direccionamiento de la proteína de fusión a sitios de calcificación es Asp-i0 (SEQ ID NO: 18).

[0097] Otra proteína de fusión preferida comprende, desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal, un componente de NPP1 que comprende una parte del dominio rico en cisteína, el dominio catalítico y la región C-terminal de NPP1 humana; opcionalmente, un enlazador (por ejemplo, (Gly4Ser)3 (SEQ ID NO: 16)); la región Fc, que incluye bisagra o una parte de la misma, de una inmunoglobulina humana. Preferiblemente, la región Fc es de IgG1 humana. En casos particulares, la proteína de fusión tiene como mínimo 80%, como mínimo 85%, como mínimo 90%, como mínimo 91%, como mínimo 92%, como mínimo 93%, como mínimo 94%, como mínimo 95%, como mínimo 96%, como mínimo 97%, como mínimo 98% o como mínimo 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12. La proteína de fusión preferida de este tipo tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12.

[0098] En aspectos particularmente preferidos de la divulgación, una proteína de fusión de SEQ ID NO: 3 se administra de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento. En otros aspectos particularmente preferidos, una proteína de fusión de SEQ ID NO: 4 se administra de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento. En otros aspectos particularmente preferidos, una proteína de fusión de SEQ ID NO: 9 se administra de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento. En otros aspectos particularmente preferidos, una proteína de fusión de SEQ ID NO: 10 se administra de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento. En otros aspectos particularmente preferidos, una proteína de fusión de SEQ ID NO: 11 se administra de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento. En otros aspectos particularmente preferidos, una proteína de fusión de SEQ ID NO: 12 se administra de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento.

[0099] Las proteínas de fusión de la presente divulgación pueden prepararse utilizando procedimientos estándar, que incluyen técnicas recombinantes o conjugación química bien conocidos en la técnica. Las técnicas útiles para aislar y caracterizar los ácidos nucleicos y las proteínas de la presente divulgación se conocen bien por los expertos en la técnica y biología molecular estándar y se pueden consultar los manuales bioquímicos para seleccionar los protocolos para el uso sin experimentación indebida. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a Edición, Cold Spring Harbor.

[0100] La sNPP1 humana recombinante aislada, el fragmento y las proteínas de fusión de la misma, pueden producirse en cualquier sistema de expresión de proteínas útil que incluye, sin limitación, cultivo celular (por ejemplo, células CHO, células COS, HEK203), bacterias, tales como Escherichia coli (E. coli) y animales transgénicos, que incluyen, pero no se limitan a, mamíferos y aves (por ejemplo, pollos, codorniz, pato y pavo). Para la expresión, una construcción que codifica la sNPP1 e incluye una secuencia de señal adecuada (por ejemplo, cadena pesada de Ig humana, NPP2, NPP4, NPP7 o albúmina humana en suero, por ejemplo) en marco con la secuencia de la sNPP1 y unida de manera operativa a elementos de control de expresión adecuados.

[0101] La sNPP1, que incluye las proteínas de fusión y las formas de sales fisiológicamente aceptables de la misma, se formulan típicamente en una composición farmacéutica para la administración de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento. Las composiciones farmacéuticas incluyen típicamente un portador o un excipiente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones que comprenden tales portadores, que incluyen moléculas compuestas, se formulan utilizando procedimientos bien conocidos (véanse, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 14a edición, Mack Publishing Co., Easton, PA). El portador puede comprender un diluyente. En un caso, el portador farmacéutico puede ser un líquido y la proteína de fusión puede estar en forma de una solución. El portador farmacéutico puede ser cera, grasa o alcohol. En otro caso, el portador farmacéuticamente aceptable puede ser un sólido en forma de un polvo, un polvo liofilizado o un comprimido. En un caso, el portador puede comprender un liposoma o una microcápsula. Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de un polvo liofilizado estéril para inyección después de reconstrucción con un diluyente. El diluyente puede ser agua para inyección, agua bacteriostática para inyección o solución salina estéril. El polvo liofilizado puede producirse mediante liofilización de una solución de la proteína de fusión para producir la proteína en forma seca. Tal como se conoce en la técnica, la proteína liofilizada ha aumentado de manera general la estabilidad y una vida útil más larga que una solución líquida de la proteína.

EJEMPLOS

[0102] La presente divulgación se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos. Los ejemplos tienen solamente propósitos ilustrativos y ni pretenden, ni deben interpretarse, como limitantes de la invención de algún modo.

Procedimientos

Animales:

[0103] Se utilizaron ratones C57B1/6J machos de tipo salvaje de seis semanas de edad. El peso promedio de estos ratones oscilaba entre 21 y 22 g. A los ratones se les administró una dosis de sNPP1-Fc [1,04 mg/ml] o sNPP1-Fc-D10 [1,03 mg/ml] utilizando inyección subcutánea (SC) o intravenosa (IV) con una concentración de 5 mg/kg. Tabla 1.

[0104] Se utilizaron dos cepas diferentes de ratones que carecían de NPP1. Los ratones Enppl-1- se describieron previamente en Lomashvili, K. A. et al., Kidney Int 2014, 85, 1351-1356. Para acelerar la calcificación arterial, la dieta se suplementó con 1,5% de fosfato (contenido final de fósforo: 2%) utilizando una mezcla de NaH2PO4 y Na2HPO4 en proporciones para producir un pH neutro, tal como se describió previamente. (O'Neill, W. C. et al., Kidney Int 2011, 79, 512-517).

[0105] Modelo de enfermedad renal crónica (CKD): Se utilizaron ratas sprague dawley de tipo salvaje en estudios de modelos de CKD. Las ratas se alimentaron con una dieta que contenía 0,25-0,75% de adenina y altos niveles de fósforo (0,75-0,9% de fósforo frente a 0,4% en la comida normal). El exceso de adenina en la dieta satura el mecanismo natural de adenina fosforribosiltransferasa normal y en cambio se metaboliza a 2,8-dihidroxiadenina, que precipita y forma cristales en los túbulos renales debido a su baja solubilidad. Estos cristales causan lesión tubular, inflamación, obstrucción y fibrosis en los riñones y conducen a un fenotipo consistente con CKD humana. El daño renal y la insuficiencia renal resultantes conducen a una excreción alterada de fosfato lo que da lugar a los niveles altos de Pi en suero y un metabolismo mineral desordenado, tal como calcificación generalizada de tejidos blandos. El nivel alto de fósforo en la dieta acelera la calcificación arterial. Las ratas con la dieta alta en adenina desarrollan uremia, hiperfosfatemia, hiperparatiroidismo secundario, osteodistrofia renal y calcificación vascular.

Preparación de Plasma:

[0106] Se recogió sangre mediante punción cardíaca y se mezcló de manera inmediata (9:1 vol:vol de sangre con respecto a una solución 110 mM de ácido cítrico). La recogida de suero da lugar a una liberación de exceso de pirofosfato (PPi) de las plaquetas y la inhibición por EDTA de la coagulación puede interferir con el ensayo. Los tubos con sangre citratada se oscilaron durante varios minutos y a continuación se centrifugaron a 2.000 xg durante 10-15 minutos. La capa superior de plasma se recogió (100-300 j l ) y se añadieron aproximadamente 200 j l a una unidad centricon de 10 kDa. A continuación, estos tubos se centrifugaron a 12.000 xg durante 10 minutos para desproteinizar el plasma. Después de la centrifugación, se recogió el líquido no retenido en un tubo nuevo. El plasma y las muestras desproteinizadas se congelan a -20° C hasta el análisis.

Ensayo fluorométrico de PPi:

[0107] Este ensayo emplea un sensor de PPi fluorogénico que tiene su intensidad de fluorescencia proporcionalmente dependiente de la concentración de PPi. Se añadieron muestras filtradas de 10 kDa (4 |jl) a 46 |jl de tampón de ensayo. La solución madre del sensor de PPi (200X) se diluyó en tampón de ensayo y se añadieron 50 j l de ésta a la muestra. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 20 min, se leyó la fluorescencia de la placa de 96 pocillos de color negro (Ex/Em = 316/456 nm).

Ensayos:

[0108] La actividad de NPP1 se midió como se ha descrito previamente. (Villa-Bellosta, R. et al., Am J Physio1Heart Circ Physiol 2011, 301, H61-H68). Brevemente, se añadió plasma a 20 volúmenes de tampón fisiológico que contenía ATP 200 nM y 1,5 uCi [32P] ATP/ml durante 10 minutos a 37° C. A continuación, la mezcla de reacción se separó mediante cromatografía en capa fina sobre celulosa de polietilenimina y se determinó la cantidad de PPi producida mediante densitometría de autorradiogramas. El PPi plasmático se midió como se ha descrito anteriormente (Lomashvili, KA et al., Kidney Int 2014, 85, 1351-1356), utilizando plasma recién filtrado a través de un filtro de corte de 30 kD y un ensayo enzimático basado en la conversión de PPi y UDP-glucosa en UTP y glucosa-1-fosfato por la UDPglucosa pirofosforilasa. Toda el agua utilizada se pretrató con hidroxiapatita para eliminar el PPi contaminante. El calcio aórtico se midió calorimétricamente en extractos de ácido HCl de aortas secas, tal como se ha descrito previamente. (Lomashvili, KA y col., Kidney Int 2014, 85, 1351-1356). El contenido de calcio se normalizó al peso seco y se determinaron las reducciones fraccionales en la calcificación después de restar el contenido de calcio de las aortas normales de ratón.

Fraccionamiento de células sanguíneas:

[0109] Para preparar los leucocitos y plaquetas, recién extraídas, se centrifugó sangre humana heparinizada a 250 g durante 15 minutos a temperatura ambiente. El plasma se extrajo y se centrifugó a 2200 g durante 12 minutos para obtener plaquetas. El sedimento de la primera centrifugación se resuspendió en solución salina normal hasta el volumen de sangre original y se añadieron 4 volúmenes de tampón de lisis (155 mmol/l de cloruro de amonio; 10 mmol/l de bicarbonato de sodio; 0,1 mmol/l de EDTA, pH 7,4) en hielo durante 5-10 minutos. Esto se repitió después de la centrifugación y la extracciñón del sobrenadante, produciendo leucocitos purificados después de una centrifugación final.

Análisis estadístico:

[0110] Las variables continuas se expresan como media ± error estándar con las diferencias determinadas mediante la prueba t de Student. El contenido de calcio aórtico se analizó después de la transformación logarítmica.

Ejemplo I

[0111] Antecedentes: El experimento se realizó para determinar si hay un aumento en los niveles de PPi de ratones de tipo salvaje que se dosificaron con variantes de sNPP1. Para ello, se seleccionó un punto de tiempo de 1 hora para una única terapia de inyección intravenosa y un punto de tiempo de 4 horas para una única terapia de inyección subcutánea. La estimación de los niveles de PPi se determinó mediante el ensayo fluorométrico de PPi abcam.

[0112] Resultados: Los datos en bruto de las lecturas de 1 min (9 lecturas en total) se promediaron y se convirtieron en % de plasma normal (WT). Tabla 2

[0113] La inyección intravenosa y subcutánea de las variantes de proteína de sNPPI (5 mg/kg) en los ratones de tipo salvaje muestra un aumento de concentración de PPi por encima de los niveles normales de plasma, tal como se muestra en la Figura 5. La Figura 5 muestra niveles de pirofosfato en sangre en ratones de tipo salvaje después de la administración de sNPP1-Fc o sNPP1-Fc-D10 por vía intravenosa (1 hora después de la inyección) y subcutánea (4 horas después de la inyección).

Ejemplo II

[0114] Los ratones knock-out de Enppl(-/-) se trataron por vía subcutánea con un vehículo o 6 mg/kg de sNPP1-Fc-D10 cada dos días durante un periodo de 21 días. Los niveles de calcio aórtico se muestran para machos y hembras. La Figura 6 muestra prevención eficaz de calcificación aórtica en ratones Enppl(-/-) con un tratamiento con sNPP1-Fc-D10.

Ejemplo III

[0115] Los ratones knock-out de Enppl(-/-) se trataron con 6 mg/kg de sNPP1-Fc-D10 por vía intravenosa para determinar los niveles de PPi en sangre y actividad enzimática. Tal como se muestra en la Figura 7, se recogió plasma en puntos de tiempo de 0, 4, 24, 48 y 72 horas y se analizó la actividad de NPP1 (discontinua) y niveles de PPi (continua). Se determinó que el nivel de PPi de tipo salvaje era 2,18 pM (los datos no se muestran). Las líneas discontinuas de la parte superior hacía la parte inferior muestran los niveles de PPi para ratones de tipo salvaje, Enppl(+/-) heterocigotos y Enppl(-/-) homocigotos (Li et. al, 2013). Los perfiles para sNPP1-Fc fueron similares a aquellos de sNPP1-Fc-D10.

Ejemplo IV

[0116] Los ratones de tipo salvaje y Enpplasj se sometieron a una dieta rica en fósforo, baja en magnesio, desde el nacimiento. Se administró el vehículo o sNPP1-Fc (5 mg/kg) por vía subcutánea cada dos días comenzando desde el día 14 de edad. Las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier muestran que >50% de ratones asj murieron antes de 6 semanas y todos los animales murieron antes de 9 semanas. En comparación, el 50% de animales tratados con sNPP1-Fc sobrevivieron pasadas 7 semanas y aun estaban vivas a 9 semanas. La Figura 8 muestra supervivencia aumentada de ratones machos homozigotos Enpplasj tratados con 5 mg/kg de sNPP1-Fc en comparación con los ratones tratados con vehículo.

Ejemplo V

[0117] Los ratones de tipo salvaje y Enpplasj se sometieron a una dieta rica en fósforo, baja en magnesio, desde el nacimiento y se trataron con un vehículo o sNPP1-Fc (5 mg/kg) por vía subcutánea cada dos días empezando a los 14 días de edad para determinar las tasas de crecimiento. Tal como se muestra en las Figuras 9A y 9B, el porcentaje de aumento de peso corporal para los ratones de tipo salvaje (linea continua) y Enpplasj (círculos) se representó desde dos hasta nueve semanas de edad. Las Figuras 9A y 9B muestran el porcentaje de aumento de peso corporal de los ratones machos Enpplasj tratados con 5 mg/kg de sNPP1- Fc en comparación con los ratones tratados con el vehículo. Todos los animales Enpplasj murieron (círculo abierto) en el grupo del vehículo a las nueve semanas (panel superior). En comparación, los cinco ratones Enpplasj estaban vivos (círculo continuo) y cinco murieron (circulo abierto) en el grupo de tratamiento con sNPP1-Fc al final de las nueve semanas. Las Figuras 10A-10C muestran imágenes de los ratones de tipo salvaje (Figura 10A, parte superior), Enpplasj tratados con el vehículo (Figura 10B, en el medio), Enpplasj tratados con sNPP1-Fc (5 mg/Kg) (Figura 10C, parte inferior).

Ejemplo VI

[0118] Se midió FGF-23 (factor de crecimiento de fibroblasto 23), un biomarcador de metabolismo de fosfato, en ratones machos de tipo salvaje y Enpplasj. Los ratones de tipo salvaje y Enpplasj se sometieron a una dieta rica en fósforo, baja en magnesio (TD.00442, Harlan) desde el nacimiento. Se administró el vehículo o sNPP1-Fc-D10 (5 mg/kg) por vía subcutánea cada dos días comenzando a los 18 días de edad. Se recogió todo el suero 24 horas después de la dosificación y se analizó utilizando un kit de ELISA para FGF-23 de ratón (Kainos Laboratories Inc., Tokyo, Japón). Se midieron los niveles de FGF-23 sobre el nivel de referencia (día 0), antes de comenzar el tratamiento y durante el tratamiento en ratones Enppl+/+- Vehículo (negro sólido), Enpplasj/asj- Vehículo (puntos negros), y Enpplasj/asj - sNPP1-Fc-D10 (gris sólido).

[0119] Los niveles de FGF-23 fueron elevados en ratones Enpplasj/asj durante el transcurso de la progresión de la enfermedad (hacia el día 9 [27 días de edad]). Sin embargo, los ratones Enpplasj/asj tratados con 5 mg/kg de sNPP1-Fc-D10 mostraron un nivel disminuido de FGF-23 en comparación con el grupo tratado con el vehículo hacia el día 17 de tratamiento. *, p<0,05 utilizando ANOVA de una vía o prueba t de estudiante. La Figura 11 muestra los niveles de factor de crecimiento de fibroblasto en ratones Enpplasj(en el medio) tratados con un vehículo y Enpplasj (parte inferior) tratados con sNPP1-Fc (5mg/Kg).

Ejemplo VII La actividad in vitro e in vivo

[0120] sNPP1-Fc-D10 recombinante hidrolizó completamente ATP a PPi in vitro sin hidrólisis del PPi a ortofosfato, tal como se muestra en la Figura 13A.

[0121] La actividad enzimática en plasma se muestra en la Figura 13B. La actividad sustancial estaba presente en el plasma de ratones de tipo salvaje, con ligeramente más de un tercio del ATP convertido en PPi en 10 minutos correspondiente a una actividad de 7,6 ± 1,0 nmol/h/ml. El resto se convirtió en ortofosfato mediante nucleótido trifosfatasas. El plasma de los ratones Enppl-1- estaba esencialmente privado de NPP1, con la pequeña cantidad de PPi que representaba PPi que contaminaba el [32P] ATP. La actividad aumentó notablemente hasta 10,3 ± 0,3 nmol/h/ml dos horas después de la inyección intravenosa de NPP1 (5 mg/kg) y esto fue acompañado por un aumento de PPi en plasma desde 0,07 ± 0,02 hasta 1,00 ± 0,14 uM, en comparación con un nivel de 2,39 ± 0,37 uM en ratones de tipo salvaje.

[0122] La actividad de NPP1 no se detectó en aortas de ratones de tipo salvaje ni de ratones Enppl-1- y no aumentó después de la inyección de NPP1, tal como se muestra en la Figura 13C. Tampoco se detectó la actividad en el hígado después de la administración de NPP1 recombinante.

[0123] La evolución con el tiempo de la actividad de NPP1 en plasma y la concentración de PPi después de la inyección subcutánea de 5 mg/kg en ratones Enppl-1- se muestra en la Figura 14. La actividad de NPP1 y la concentración de PPi alcanzaron su máximo 12 horas después de la inyección en los niveles que eran 195% y 41%, respectivamente, de aquellos en miembros de la camada de tipo salvaje. Los niveles disminuyeron rápidamente y fueron esencialmente no detectables después de las 24 horas.

[0124] La inyección subcutánea de sNPP1-Fc-D10 (5 mg/kg) muestra una correlación entre los niveles de PPi en plasma y la actividad de NPP1 en plasma, tal como se muestra en la Figura 15. La correlación de PPi en plasma con NPP1 en plasma sugirió que el PPi se generaba en la circulación. Esto se examinó incubando sangre humana fresca con NPP1 recombinante y a continuación midiendo el PPi en el plasma. Se utilizó la sangre humana debido a la cantidad limitada sangre obtenible de ratones. La cantidad de NPP1 que se añadió a la sangre se calculó con el objetivo de producir niveles similares a aquellos alcanzados después de la inyección en ratones.

[0125] La Figura 16A muestra que la administración de NPP1 recombinante aumentó el PPi en plasma cuando se añade a sangre entera durante 2 horas, pero no cuando se añade a plasma solo, indicando una necesidad celular. Para examinar la función de eritrocitos frente a otras células, la sangre se centrifugó y el plasma se eliminó con o sin la capa leucocitaria restante. A continuación, se añadió una solución salina con tampón HEPES para recuperar el hematocrito original. Tal como se muestra en la Figura 16B, la producción se realizó únicamente cuando se retenía la capa leucocitaria, indicando una necesidad de leucocitos y plaquetas, pero no de eritrocitos. La incubación de leucocitos o plaquetas aislados en la solución salina con tampón HEPES indicó que ambos liberaban o producían PPi, pero que la síntesis en respuesta a NPP1 exógena tuvo lugar solamente con los leucocitos, tal como se muestra en la Figura 16C.

Ejemplo VIII Modelos Terapéuticos

A. Deficiencia de NPP1

[0126] Se administró una dieta rica en fosfato a ratones Enppl-/- viejos y se trataron con un vehículo o sNPP1-Fc-D10 (6 mg/kg) por vía subcutánea cada dos días, tal como se muestra en la Figura 17 para determinar el efecto de NPP1 recombinante sobre la calcificación arterial. Cada ratón tratado se emparejó con un ratón del mismo género y edad similar que recibió el mismo volumen de vehículo solo. Después de 18 días, el promedio de contenido de calcio en aorta fue de 61 ± 30 nmol/mg en los ratones tratados con el vehículo y de 8,8 ± 1,0 nmol/mg en los ratones tratados con NPP1 recombinante (p=0,016). El contenido en los miembros de la misma camada de tipo salvaje fue de 6,3 ± 3,4 nmol/mg (n=16). El contenido estaba elevado (dos desviaciones estándar sobre los miembros de la misma camada) en 6 de 8 aortas de control (80 ± 37 nmol/mg) y solamente en una aorta tratada (15 nmol/mg). En las parejas en las que la calcificación estaba presente en aortas de control, esto representaba una disminución de 91 ± 2% en calcificación.

[0127] Para determinar si existe alguna acumulación de NPP1 después de múltiples inyecciones con el tiempo, la actividad de NPP1 en plasma y PPi, se midieron en el sacrificio (24 horas después de inyección), y ambos fueron indetectables. En un conjunto separado de ratones Enppl-/-, la actividad de NPP1 en aorta fue indetectable después de 3 inyecciones de NPP1 recombinante cada dos días.

B. Enfermedad Renal Crónica

[0128] Este ejemplo da a conocer la eficacia de sNPP1-Fc-D10 en el tratamiento de enfermedad renal crónica (CKD) en los modelos de ratas urémicas. Para determinar el efecto de NPP1 recombinante sobre la calcificación arterial en ratas urémicas con insuficiencia renal, las ratas urémicas fueran alimentadas con una dieta alta en adenina e inyectadas por vía subcutánea con control o sNPP1-Fc-D10 (5 mg/kg), 5 dosis por semana, tal como se muestra en

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Ectonucleótido pirofosfatasa fosfodiesterasa (NPP1) soluble para su uso en un procedimiento para reducir la calcificación vascular, comprendiendo el procedimiento administrar a un sujeto con pirofosfato (PPi) plasmático por debajo de lo normal o fosfato (Pi) sérico por encima de lo normal, dos o más dosis de NPP1 soluble, en la que cada dosis contiene una cantidad de NPP1 soluble que es suficiente para lograr un aumento temporal del PPi plasmática en el sujeto, el aumento temporal del PPi plasmático se caracteriza por un nivel máximo de PPi plasmático que es al menos el 40 % del nivel plasmático normal de PPi y un retorno al nivel de referencia de PPi plasmático dentro de las 48 horas posteriores a la administración de la dosis; y en la que (a) el período de tiempo entre dosis es de al menos 2 días; (b) el nivel normal de PPi plasmático es de 2,63 ± 0,47 micromolar; y (c) el nivel normal de Pi sérico es de 1,5 ± 0,5 milimolar.

2. NPP1 soluble para su uso, según la reivindicación 1, en la que el aumento temporal del PPi plasmático se caracteriza por un nivel de PPi entre el 40 % y el 100 % del nivel plasmático normal de PPi.

3. NPP1 soluble para su uso, según la reivindicación 2, en la que el aumento temporal del PPi plasmático se mantiene durante al menos 4 horas, opcionalmente en la que el aumento temporal del PPi plasmático se mantiene durante al menos 6 horas, al menos 8 horas, al menos 10 horas o al menos 12 horas.

4. NPP1 soluble para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la calcificación vascular es una calcificación arterial o en la que la calcificación vascular es una calcificación de la íntima.

5. NPP1 soluble para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que dicho sujeto tiene deficiencia de NPP1.

6. NPP1 soluble para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el sujeto tiene enfermedad renal crónica (CKD) o enfermedad renal en etapa terminal (ESRD), o en la que el sujeto tiene calcificación arterial generalizada de la infancia (GACI), o en la que el sujeto tiene un trastorno cardiovascular, o en la que el sujeto tiene diabetes mellitus II, o en la que el sujeto tiene aterosclerosis, o en la que el sujeto tiene pseudoxantoma elástico (PXE).

7. NPP1 soluble para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que los niveles de pretratamiento de pirofosfato (PPi) plasmático en el sujeto son al menos un 40 % más bajos que los niveles plasmáticos normales de PPi.

8. NPP1 soluble para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que el sujeto es un ser humano.

9. NPP1 soluble para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que cada dosis contiene de 1,0 mg/kg a 5,0 mg/kg de NPP1, o en la que cada dosis contiene de 1,0 mg/kg a 10,0 mg/kg de NPP1.

10. NPP1 soluble para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que el período de tiempo entre dichas dosis de NPP1 es de al menos 3 días, opcionalmente en la que el período de tiempo entre dichas dosis de NPP1 es de al menos 1 semana, 2 semanas o 1 mes.

11. NPP1 soluble para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en la que la administración es intravenosa, subcutánea o intraperitoneal, opcionalmente en la que la administración es intravenosa o en la que la administración es subcutánea.

12. NPP1 soluble para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en la que la NPP1 comprende una sNPP1 humana recombinante aislada, un fragmento o una proteína de fusión de la misma.

13. NPP1 soluble para su uso, según la reivindicación 12, en la que la sNPP1 es una proteína de fusión que comprende un componente NPP1 y uno o más compañeros de fusión, en la que cada compañero de fusión está ubicada a nivel del extremo c-terminal del componente NPP1, opcionalmente en la que un compañero de fusión es una región Fc de una inmunoglobulina, y/o en la que un compañero de fusión es una fracción de direccionamiento, en la que dicha fracción de direccionamiento comprende opcionalmente al menos ocho residuos consecutivos de ácido aspártico o ácido glutámico.

14. NPP1 soluble para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la sNPP1 es SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12.

15. NPP1 soluble para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la NPP1 soluble tiene actividad pirofosfatasa o actividad fosfodiesterasa.

16. NPP1 soluble para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la NPP1 soluble tiene actividad pirofosfatasa y actividad fosfodiesterasa.