JP2015063498A - 新規なポリペプチド及びその用途 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ポリペプチドは、E5活性を有するものであれば特に限定されないが、特定の配列で示されるアミノ酸配列からなり、(I)細胞保護活性を有し、かつ(II)プロテインCの活性化を促進する。ポリペプチドをコードするDNAを発現ベクターに組み込み、これを宿主細胞にトランスフェクトして調製された形質転換細胞より取得する。
【選択図】なし
Description
〔1〕配列番号1で示されるアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド。
〔2〕前記〔1〕に記載のポリペプチドを有効成分として含む医薬組成物。
〔3〕細胞障害の予防及び/又は治療のための前記〔2〕に記載の医薬組成物。
〔4〕血管内皮細胞障害の予防及び/又は治療のための前記〔2〕又は〔3〕に記載の医薬組成物。
〔5〕消化管上皮細胞障害、気管上皮細胞障害、又は肺胞上皮細胞障害の予防及び/又は治療のための前記〔2〕〜〔4〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔6〕表皮細胞障害の予防及び/又は治療のための前記〔2〕〜〔5〕に記載の医薬組成物。
配列番号1のアミノ酸配列をコードするDNA(具体的には、配列番号2の塩基配列よりなる)の人工合成をタカラバイオ株式会社に依頼し、C末にV5タグ及びHisタグが付加するようにpcDNA3.1/V5−Hisプラスミド(インビトロジェン)に挿入した。本プラスミドをサル腎臓(COS)細胞にトランスフェクションして、この形質転換細胞の培養液より、Hisタグ精製キット(MBL社)によりポリペプチド精製品を取得した。精製品はSDS−PAGEにより純度を確認し、ブラッドフォード法(Bio−Rad Laboratories)により蛋白質濃度を定量した。COS細胞により作製した蛋白質及びポリペプチドは、E5(配列番号1、実施例1)及び、E45(比較例1:非特許文献4に記載の方法により取得)であった。
E45(比較例1)、D123(比較例2)、及びE5(実施例1)の細胞保護活性を細胞死抑制活性にて評価した。細胞死抑制活性は、血管内皮細胞を用いた抗アポトーシス蛋白質Mcl−1発現誘導の測定にて評価した。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を専用培地(2%ウシ胎児血清含有EGM(endothelial cell growth medium)、Lonza)で培養し、培地中へ各ポリペプチドを17.45 fmolの濃度になるように添加して培養した。陰性対照として、ブランク(ペプチド無し)を用いた。培養は37℃、5%CO2インキュベーターにて行った。添加後、48時間後に培地を除き、細胞溶解液にてHUVECを溶解し、細胞抽出液を得た。細胞抽出液を5−15%SDS−PAGE後、イモビロン−Pメンブレン (Millipore)に転写し、抗Mcl−1抗体(Santa Cruz Biotechnology、sc-819)、及び抗GAPDH抗体(Abcam)によるウエスタンブロットを実施し、以下の手順に従いMcl−1量を定量した。
次いで、1%milk液で1000倍に希釈した2次抗体溶液を添加し、室温にて60分間インキュベートした後、洗浄液で計3回洗浄した。
ECLウェスタンブロッティング検出システム(GEヘルスケア・ジャパン)の添付のマニュアルに従い、基質溶液ECL液2種類を添加し、室温で通常1〜2分間インキュベートした後、LAS4000イメージアナライザー(FUJI FILM社)にて感光、現像を行った。Mcl−1蛋白質のバンドの強度をImageJソフトウェア(Wayne Rasband、NIH)にて定量化した。
次いで同じナイロン膜を用いて、抗GAPDH抗体にて同様の手順で染色後、GAPDH蛋白質のバンド強度を定量し、内部標準として用いた。
E5(実施例1)の細胞保護活性を、抗アポトーシス活性を測定することで調べた。
具体的には、免疫抑制剤であるサイクロスポリン(CsA)(Sigma Chemical)により誘発されるヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)のアポトーシス反応に対して、最終濃度を3ng/mLになるようにE5を添加し抗アポトーシス活性を測定した。
E5(実施例1)の血管内皮保護活性を血管透過性亢進抑制活性を測定することで調べた。血管透過性亢進に対するポリペプチドの影響は、vascular permeability assay kit(Millipore)を用いて、付属のプロトコールに準じて評価した。具体的には、HUVECをコラーゲンコートされたインサート上にコンフルエントになるまで培養し、24時間のスタベーション後、CsA、あるいはCsA+E5を添加し12時間培養した。FITC標識デキストランを上室に添加し、下室に出てきたFITCの蛍光強度を測定し血管内皮細胞透過性亢進活性とした。この結果を、図3に示す。
D123(比較例2)、及びE5(実施例1)の血管新生促進活性を調べた。陽性対照としてVEGF(Pepro Tech Inc社)を、陰性対照としてバッファーを用いた。
D123(比較例2)及びE5(実施例1)のNO産生促進活性及びeNOSリン酸化促進活性を調べた。
また、図5bに示されるように、E5は未添加のコントロールに比べCsA添加によるeNOS蛋白質のリン酸化(図5bのp−eNOS)低下を抑制した。その活性はD123より高かった。
D123(比較例2)及びE5(実施例1)のポリペプチドによる細胞増殖促進活性の測定を行った。
具体的には、HUVEC(5×103細胞)を、D123あるいはE5存在下で、上記2.と同様の専用培地を用いて96ウェルプレートにて24時間培養した。さらに、ブロモデオキシウリジン(10μmol/L/well)を添加し4時間培養後、細胞内に取り込まれたブロモデオキシウリジンを測定した。測定は、細胞増殖ELISA,BrdU発色キット(Roche)を用いて、添付のプロトコールに準じて実施した。
D123(比較例2)、及びE5(実施例1)のERK、Akt、JNK、p38、STAT5、S6K、4E−BP1のリン酸化に対する作用を評価した。
具体的には、HUVECを専用培地で培養後、無血清培地で3時間starvationした後、各検体を添加した。
抗リン酸化Akt抗体(Ser473)(Cell Signaling Technology, 9271);
抗リン酸化JNK抗体(Tyr183/185)(Cell Signaling Technology, 9251);
抗リン酸化p38抗体(Tyr180/182)(Cell Signaling Technology, 9216);
抗リン酸化STAT5抗体(Tyr694)(Cell Signaling Technology, 9351);
抗リン酸化S6K(Ser235/236)(Cell Signaling Technology, 4856);
抗リン酸化4E−BP1抗体(Thr37/46)(Cell Signaling Technology, 2855);
抗ERK抗体(Cell Signaling Technology, 9102);
抗Akt抗体(Ser473)(Cell Signaling Technology, 9272);
抗JNK抗体(Santa Cruz Biotechnology, sc-474);
抗p38抗体(Santa Cruz Biotechnology, sc-535G);
抗STAT5抗体(C−17)(Santa Cruz Biotechnology);
抗S6K(Cell Signaling Technology, 2217);
抗4E−BP1抗体(Cell Signaling Technology, 9644);及び
抗Bcl−2抗体(Santa Cruz Biotechnology, sc-509)。
結果を図7に示した。
E45(比較例1)及びE5(実施例1)の抗凝固活性を調べた。抗凝固活性は、プロテインC活性化促進活性によって評価した。具体的には、E45又はE5をプロテインC及びトロンビンと反応後、生成した活性化プロテインCを合成基質S−2366にて405nmの吸光度を測定することにより評価した。
配列番号2:配列番号1のアミノ酸配列をコードする塩基配列
Claims (6)
- 配列番号1で示されるアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド。
- 請求項1に記載のポリペプチドを有効成分として含む医薬組成物。
- 細胞障害の予防及び/又は治療のための請求項2に記載の医薬組成物。
- 血管内皮細胞障害の予防及び/又は治療のための請求項2又は3に記載の医薬組成物。
- 消化管上皮細胞障害、気管上皮細胞障害、又は肺胞上皮細胞障害の予防及び/又は治療のための請求項2又は3に記載の医薬組成物。
- 表皮細胞障害の予防及び/又は治療のための請求項2又は3に記載の医薬組成物。
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WO2019027034A1 (ja) * | 2017-08-04 | 2019-02-07 | 公立大学法人福島県立医科大学 | 新規ポリペプチド及びその用途 |
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2013
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Non-Patent Citations (2)
Title |
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ARTERIOSCLER. THROMB. VASC. BIOL., vol. 32, no. 9, JPN6017020489, 2012, pages 2259 - 2270 * |
PROTEIN SCIENCE, vol. 4, no. 10, JPN6017020488, 1995, pages 2129 - 2137 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019027034A1 (ja) * | 2017-08-04 | 2019-02-07 | 公立大学法人福島県立医科大学 | 新規ポリペプチド及びその用途 |
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