KR0137017B1

KR0137017B1 - 감마-인터페론을 이용한 혈관 협착증의 치료방법

Info

Publication number: KR0137017B1
Application number: KR1019900701144A
Authority: KR
Inventors: 한슨 괴란; 홀름. 잔; 조나슨 레나
Original assignee: 스티븐 레인즈; 지넨테크 인코포레이티드
Priority date: 1988-09-30
Filing date: 1989-09-27
Publication date: 1998-04-25
Also published as: HU206988B; AU4305189A; DK174523B1; US5208019A; SE8803472A; DD288094A5; DK56291A; SE462364B; CA1338722C; ATE86869T1; WO1990003189A1; KR900701308A; IE63874B1; PT91863A; EP0367735B1; DE68905438T2; PH26293A; SE8803472D0; PT91863B; AU623181B2

Abstract

내용없음

Description

[발명의 명칭]

감마-인터페론을 이용한 혈관 협착증의 치료방법

[도면의 간단한 설명]

제 1도는 평활근 배양 세포 증식에 미치는 여러 농도의가마-인터페론의 효과를 나타내는 그래프이다.

제 2도는 평활근 배양 세포의 성장 유도에 미치는 여러 농도의 감마-인터페론의 효과를 나타내는 그래프이다.

제 3도는 평활근 세포 주기 중 G₁기를 나타내는 그래프이다.

제 4도는 세포 주기중 초기에 일어나는 평활근 세포 복제에 미치는 감마-인터페론의 효과를 나타내는 그래프이다.

제 5도는 여러 가지 감마-인터페론 농도에서 평활근 세포내 I-A 발현에 미치는 감마-인터페론의 효과를 나타내는 그래프이다.

제 6도는 평활근 세포내의 I-A발현에 미치는 시간에 따른 감마-인터페론의 효과를 나타내는 그래프이다.

제 7도는 평활근 세포 증식의 억제를 위해 사용되는 감마-인터페론 제제중의 내독소 오염으로 인한 손실을 나타내는 그래프이다.

제 8도는 각각 평활근 세포를 발현시키는 I-A 및 I-A 네거티브의 복제 정도를 나타내는 다이어그램이다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 혈관 형성술 및/또는 혈관 수술에 따른 재협착증의 치료를 포함하여, 예를 들어 동맥 내막성 과형성에 의한 혈관 협착증 치료용 약제를 제조하기 위한 감마-인터페론의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 특히 혈관 형성술 및/또는 혈관 수술에 동맥협착증의 치료에 관한 것이다.

[발명의 배경]

심장 혈관에 관한 연구에 있어서의 진보는 과콜레스테린 혈증, 흡연, 고혈압증과 같은 아테롬성 동맥경화증에 대한 위험 요인을 감소시킴으로써, 대체로 환자의 심장마비 발병율을 감소시키는 것을 가능케 하였다. 심장 마비의 발병은 관상 동맥내 혈전을 용해시키는 조직 타입의 플라즈미노겐 활성인자(plasminogen activator, t-PA)를 투여함으로써 저지할 수 있음이 알려져 있다. 최근, 재조합 DNA 기술에 의한 t-PA의 클로닝 및 생성은 t-PA를 무제한양으로 생성하는 것을 가능케 하였다.

그러나, 관상 아테롬성 동맥경화증을 앓고 있는 환자의 심장마비를 방지하는데는 수술이 유일한 방법이다. 여러 가지 중요한 새 기술이 수술치료를 위해 개발되었다. 특히, 발룬 카테테르(ballon catheter) 및 보다 최근에는 레이저를 이용한 혈관 형성술 과정은 심하지 않은 증상을 갖지만 관상 보조 수술이 보장되지 않은 환자, 및 또한 전신상태가 너무나 허약하여 대수술을 받지 못하는 환자의 치료를 가능케 하였다.

그러나, 주혈관에 대한 모든 조작 즉, 통상의 수술 또는 혈관 형성술의 과정은 동맥의 재협착증을 유발시키는 동맥 내막성 과형성의 빈번한 발생에 의해 방해받는다. 예컨대, 사알그렌 병원(Sahlgren's Hospital, Gothenb, urg Sweden)에 있는 경피 경구경 (transluminal)관상혈관 형성술을 한 모든 환자의 약 30%에게서 허혈 증상을 일으키는 동맥 내막성 병변이 발생했다.

또한 통상의 혈관 수술후에 문제가 발생한다. 하지에 피를 공급해주는 동맥의 복구 수술후에는 모든 환자의 50%에 동맥내막성병변으로 인한 허혈 증상이 재발된다.(참조 문헌: Rutherford R(ed). Vascular Surgery. Ch. 58.2nd ed., Saunders, 1984). 유사하게, 경동맥 혈관 내막 절제술을 시행한 모든 환자중 약 20%의 환자가 동맥 내막성 과형성을 앓게 된다. 유사한 결과가 여러 다른 진료 센터로부터 보고되었다. 또한 동맥 내막성 과형성은 관상 보조 수술과 관련하여 자주 관찰된다. 그러므로, 수술후 및 혈관 형성술후의 동맥 내막성 과형성은 그러므로, 오늘날 임상 심장학, 심장 수술 및 혈관 수술에 있어 주요한 문제이다.

예컨대, 협심증을 앓고 있는 많은 환자들은 반복되는 혈관 형성술 과정을 거쳐야 할 것이며 경우에 따라서는 관상 보조 수술을 수행해야만 할 지도 모른다. 어떤 약제가 동맥 내막성 과형성의 발생을 저지시킬 수 있는 경우, 많은 고통과 아픔으로부터 환자를 구하고 또한 실질적으로 치료 비용을 절감시키는 것이 가능하다는 것은 분명하다.

동맥 내막 세포의 증식을 일으키는 메카니즘은 혈관 생물학자에 의해 자세히 연구되어 왔다. 동맥의 기게적 손상은 안쪽 평활근 세포를 동맥 내막으로 이동시키는 것으로 알려졌다. 일단, 동맥 내막내에서 세포가 증식하기 시작하면, 몇 달 동안 지속되는 동맥내막성 병변을 형성한다(참조 문헌: Schwartz SM, Campbell GR, Campbell JH. Virc Res 58:427, 1986). 표면의 재내피형성 작용은 병변의 퇴행에 중한 것으로 보이며, 포함된 내피 부위와 내피 하부 구조의 손상량 모두가 병변의 진행에 중요하다.

혈관 평활근 세포의 증식은 아마도 인슐린과 같이 혈액내에 순환하거나 혈소판-유도 증식 인자와 같이 세포로부터 방출된 성장인자에 의해 조절될 것이다. 후자의 인자는 거핵세포뿐 아니라 단핵세포와 내패 세포에 의해서도 합성되며(참조 문헌:Ross R, New Engl J Med 314:488, 1986 and Ross R, Raines EW, Bowen-Pope DF, Cell 1986 :46 : 155-169),이는 염증성 세포가 혈관벽의 증식 조절에 참여했을 수 있다는 것을 의미한다.

평활근 세포에 대한 성장 억제 인자에 관해서는 거의 알려져 있지 않다. 투여된 헤파린은 약리적으로 평활근의 증식을 억제시키며(참조 문헌: Clowes AW, Karnovsky MJ. Natrue 265 ; 625, 1977)이는 내인성 헤파린 유사 물질이 생리적 성장 조절에 관련될 수 있다는 것을 제시한다. 그러나 혈관 형성술과 수술 치료를 받은 모든 환자는 헤파린 치료를 받고 있으며 여전히 동맥 내막성 협착증을 앓고 있다는 것을 주목하여야 한다.

세포형 특이성의 단클론성 항체를 이용한 최근의 면역세포 화학적 연구는 단핵세포 유도 대식세포가 아테롬성 동맥경화증의 플라크(plaque)내에 다량 존재함을 보여준다 (참조 문헌 :Vedeler CA, Nyland H, Matre R ; Insitu characterization of the foam cells in early human atherosclerotic lesions Acta Pathol Microbiol Scand (C) 1984:92:133-137, Aqel NM, Ball RY, Waldman H, Mitchinson MJ: Monocytic origin of foam cells in human atherosclerotic plaques Atherosclerosis 1984:53:265-271, Jonasson L, Holm J, Skalli O, Bondjers G, Hansson GK: Regional accumulations of T cells, macrophages and smooth muscle cells in the human atherosclerotic plaque. Atherosclerosis 1986:6:131-140 and Gown AM, Tsukada T, Ross R: Human atherosclerosis II. Immunocytochemical analysis of the cellular composition of human atherosclerotic lesions. Am J Pathol 1986:125:191-207), 그러나 상기 대식 세포들은 병리 환경하에 있는 동백벽에서 발견될 수 있는 혈액에 포함된 세포만은 아니다. T 림프구는 인간 아테롬성 동맥경화증 플라크의 섬유성관내 세포수중 1/5을 구성하며(참조 문헌: Jonasson et al, Atherosclerosis 1986:6:131-140), 이들은 또한 혈관 손상의 실험 모델내에서도 관찰할 수 있다. (참조 문헌 Jonasson L, Holm J, Hansson GK: Smooth muscle cells express ia antigens during arterial response to injury. Lab invest 1988:58:310-315)

면역 세포 화학적 자료는 T림프구는 평활근 세포의 성장 특성 및 다른 기능을 조절할 수 있음을 제시해준다. T 림프구가 풍부한 아테롬성 등 맥경화성 플라크에서, 많은 평활근 세포는 분류 II주 조직 적합성 복합체 항원(Ia 항원)을 발현시킨다. 반면에, 평활근 세포는 비아테롬성 동맥경화성 정상 동맥내에 Ia항원이 부족하다. (참조 문헌: Jonasson L, Holm J, Skalli O, Gabbiani G, Hansson GK: Expression of class II transplantation antigen on vascular smooth muscle cells in human atherosclerosis J Clin invest 1985:76:125-131 and hansson GK, Jonasson L, Holm J, Claessson-Welsh L. Class II MHC antigen expression in the atherosclerotic plaque; smooth muscle cells express HLA-DR, HLA-DQ and the invariant gamma chain Clin exp Immunol 1986:64:216-268), Ia항원이 쥐에서의 손상에 대한 동맥 반응 동안 평활근 세포상에 나타나는 것으로 제시되었지만 Ia 항원과 혈관 협착증 사이의 관계를 나타내거나 제시하는 종래 작업은 없었다.

상기 항원은 외부 항원을 T 림프구에 제시하는데 기본적인 역할을 한다. 대식세포, 내피세포 및 여러 다른 세포형에 의한 이들의 발현은 활성화된 T 림프구에서 분비된 감미-인터페론에 의해 유도된다 (참조 문헌: Pober JS, Gimbrone MA, Cotran RS, Reiss CS Burakoff SJ, Fiers W, Ault KA: Ia expression by bascular endothelium is inducible by activated T cells and by human gamma-interferon J Exp Med 1983:157:1139-1353 and Unanue ER, Allen PM: Comment on the finding of la expression in non-lymphoid. Lab inves 1986:55:123-125)

백혈구, 섬유아세포 및 다른 세포형에 의해 생성된 알파 및 베타형 인터페론은 특정 세포형의 증식을 억제시키는 것으로 공지되어 있다. 감미-인터페론은 활성화된 T-림프구에 의해 방출되며, 또한, 조절된 배지 또는 정제한 제제가 유선 세포와 섬유 아세포와 같은 여러 유형의 세포에 첨가되는 경우에 증식을 억제시키는 것을 제시되어 있다. (참조 문헌: Rubin BY, Gupta SL: Differential efficacies of human type l and Type ll interferons as antiveral and antiproliferative agents. Proc Natl Aacd Sci USA 1980:77:5928-5932, Blalock JE, Georgiades JA, Langford NF, Johnson HM: Purified human immune interferon has more potent anticellular activity than fibroblast or leukocyte interferon. Cell lmmunol 1980:49:390-401 and Wahl SM, Galtely CL: Modulation of fibroblast growth by a lymphokine of human T cell and continuous T cell line orgin. J lmmunol 1983:130:1226-1230). 그러나 이러한 효과가 감마-인터페론 그 자체의 억제 효과보다는 오히려 림프성 독소[종양 괴사 인자{tumor necrosis factor)]를 포함하는 제제의 오염으로 인한 것인지 의문이다.

요약하면, 평할근 세포의 성장을 억제하는 제제를 사용함으로서 혈관 협착증과 이와 관련된 질환을 치료할 수 있다면 유리할 것이다.

본 발명에 이르러 감마-인터페론이 아테롬성 동맥경화증 및 동맥 내막성 병변의 평활근 세포에 대한 중요한 성장 억제 인자라는 놀라운 사실이 밝혀졌으며 이는 본 발명의 기본을 형성한다.

본 발명의 한 양태는, 예컨대 동맥 내막성 과형성으로 유발되는 혈관 협착증의 치료용 약제를 제조하기 위해 감마-인터페론을 사용하는 방법을 제공한다.

발명의 본 양태의 한 구체예에 있어서, 혈관 협착증 치료는 동맥 협착증 또는 교합의 치료에 따른 재협착증의 치료이다.

발명의 본 양태에 대한 바람직한 구체에에 있어서, 혈관 협착증의 치료는 혈관 형성술 및/ 또는 혈관 수술에 따른 동맥 협착증의 치료이다.

본 발명의 또 다른 양태는 예컨대 동맥 내막성 과형성으로 유발되는 혈관 협착증의 치료에 감마-인터페론을 사용하는 방법으로서, 감마-인터페론을, 감마-인터페론을 포함하는 약제 형태로 치료 효과를 나타내기에 충분한양만큼 환자에게 투여하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 상기 양태에 대한 한 구체예에 있어서, 혈관 협착증의 치료는 동맥 협착증 또는 교합의 치료에 따른 재협착증의 치료이다.

본 발명의 상기 양태에 대한 바람직한 구체예에 있어서, 혈관 협착증의 치료는 혈관 형성술 및/또는 혈관 수술에 따른 동맥 협창증의 치료이다.

사용되는 가마-인터페론의 공급원은 중요하지 않으며, 합성, 천연 또는 재조합 DNA기술에 의해 생성된 재조합 감마-인터페론일 수 있다.

본 약제는 비경구적으로, 즉 피하, 정맥내 또는 근육내 주사에 의해 환자에게 투여됨이 바람직하다.

희석제와 부형제는 예컨대 생리 식영 용액과 같이 조제술에 통상적으로 사용한다.

배양된 동맥 평활근 세포에 미치는 재조합 감마-인터페론의 효과가 연구되었으며, 이 림포카인(Iymphokine)이 세포 증식을 억제한다는 것이 밝혀졌다. 이러한 효과는 Ia 항원의 유도와 병행된다. 그러므로 Ia 발현과 세포 복제는 부푼 쥐 경동맥에서의 손상에 대한 동맥 반응에서 연구되었다. Ia 발현과 증식의 역제와의 관계에 대한 증거가 수득되었다.

아테롬성 동맥 경화성 플라크를 형성하는 세포수를 확인하려는 노력이 이루어졌다. 따라서 세포형 특이성 항원에 대한 단클론성 항체는 동맥 내막 절제술 견본의 섹션에 적용되었다. 지질이 풍부한 중심부에 있는 대부분의 세포는 대식세포 항원에 대한 항체로 염색됨이 발견되었으며 섬유 캡의 많은 세포들은 항평활근 항체에 의해 종종 염색되었다. (참조 문헌: Jonasson L, Holm J, Skalli O, Bondjers G, Hansson GK. Arteriosclerosis 6:131, 1986). 또한 그리고 더 놀랍게도, 특히 섬유 캡 내에서 상당량의 T림프구가 관찰되었다. 이들 중 많은 것은 활성화 즉, HLA-DR, 핌-1 및 인터류킨-2 수용체의 발현을 표시한다 (참조 문헌: Jonasson L, Holm J, Skalli O, Gabbiani G, Hansson GK. J Clin Invest 76:125, 1985 and Hansson GK, Jonasson L, Holm J, Claesson-Welsh L. Clin exp Immunol 64:261, 1986.).

이런 T 세포가 풍부한 부분에 있는 많은 평활근 세포는 HLA-DR(la항원을 발현시키고, 그러한 항원은 정상적인 동맥벽의 평활근 세포상에서는 발견되지 않는다. HLA-DR 발현은 활성화된 T세포에 의해 감마-인터페론의 방출을 통해 유도된다. (참조 문헌: Pober JS et al. Nature 305:726, 1983 and Unanue ER, Allen PM. Lab Invest 55:123, 1983). 그러므로 아테롬성 동맥 경화증에서의 발견은 감마-인터페론이 아테롬성 동맥 경화성 플라크내 유전자 발현의 파라크린 조절과 관련되어 있음을 제시해 준다. 또한 아테롬성 동맥 경화성 플라크내 감마-인터페론의 존재에 대한 직접적인 면역 조직화학적 증거가 최근에 수득되었다.

[실험방법]

실험 동물 모델을 동맥 평활근 증식 및 유전자 발현을 조절하는데 있어서 T 림프구의 역할을 분석하는데 사용하였다. 바움가르트너(Baumgartner)에 의해 개발되고 클라우스(Clowes) 및 레이디(Reidy)에 의해 개선된 발룬 카테테르 모델이 상기 목적에 적합하다. 동맥 내막성 병변운 포가티(Fogarty) 발룬 카테테르에 의해 쥐 경동맥에 유도되며, 다른 유형의 백혈구의 침투 및 Ia 항원의 발현은 손상후 상이한 시점에서의 면역 조직화학 방법에 의해 분석한다.

소량이지만 유의량이 T 세포침투가 2주후 에 발견되었으며, 또한 동맥 내막내 평활근 세포는 Ia항원을 발현시키기 시작하였음이 발견되었다. 생체외에서, Ia 발현은 재조합된 감마-인터페론에 의해 유도될 수 있다. 이러한 발견은 감마-이터페론이 방출되어, 동맥 내막성 병변내 평활근 유전자 발현에 영향을 미침을 제시한다.

생체외에서, 감마-인터페론은 평활근 세포 증식에 대한 효율적인 억제인자이며, 따라서 이것은, 손상후 동맥 내막성 병변내 평활근 증식의 내인성 억제 인자로 작용할 수 있다고 여겨진다. 이러한 가설에 대한 간접적인 뒤받침은 병변내 평활근 세포복제의 분석에 의해 얻어진다. Ia -포지티브 평활근 세포는 손상 14일 후 24시간 퍼얼스동안³H -티미딘을 흡수하지 않는다는 사실이 발견되었다.

또 다른 셋트의 실험에서, 모든 복제하는 평활근 세포는 부풀림(ballooning)시기에 도입된 삼투 펌프를 통해³H-티미딘으로 표지된다. Ia에 대한 면역 조직 화학 염색법과³H자동 방사선 사진술의 혼합 방법에 의해, 희생 시기, 즉 부풀림 14일 후에 Ia를 발현시키는 세포는 Ia-네거티브 평활근 세포 보다 상당히 적은 수의 복제 주기를 수행함이 발견되었다. 이는 감마-인터페론이 동맥 내막성 과형성시 평활근 세포 복제의 내인성 억제인자라는 사실을 뒷받침해 준다. 상기 결과에 의해 고무되어, 손상에 대한 동맥 반응에 미치는 비경구적으로 투여된 감마-인터페론의 효과를 시험함으로써 연구를 계속하는 것이 결정되었다.

[재료 및 방법]

[세포배양]

쥐의 대동맥평활근세포(SMCs)를 콜라게나아제 분해에 의해 200-g스프라그-다우리(Sprague-Dawley) 수컷 쥐로부터 분리하고, 소태아 혈청 (FCS), 100 유니트/ml 페니실린 G, 100㎍/㎖ 스트렙토미신 및 50㎍/㎖ 아스코르브산이 부가된 RPMI-1640 배지에서 배양시켰다. 제 3내지 제 5의 통과 세포를 실험에 사용하고, 성장 분석을 위해 96-웰 마이크로타이터 플레이트(Nunc, Roskilde, Denmark)또는 DNA 합성 분석용 10-㎠ 페트리 접시에 이들을 플레이트시켰다.

[성장분석]

SMC를 지수적으로 성장시키거나 또는 0.5% FCS에 혈청 결핍 상태에서 48시간 후 10% FCS의 첨가에 의해 세포 주기중 갭 1(G₁)기에 진입되도록 유도시켰다. 배양액을 10% FCS와 함께 배지에 첨가한 재조합 마우스 감마-인터페론(Genentech. South San Francisco, Califonia)에 노출시켰다. 여러번, 이들을 0.1M 아세테이트 완충액(pH 3.1)중의 4%포름알데히드로 고정시키고, 아미도 블랙B로 인큐베이트시켜 세포 단백질을 염색시켰다. 결합되지 않은 염료는 증류수로 헹구어 제거하고, 염료 소비량을 EIA마이크 로타이터 광도계를 이용하여 620nm에서 측정하였다. 세포당 결합 염료는 배양액당 염료 흡광도(A₆₂₀유니트)를 배양액당 세포수로 나누어 계산하는데, 이는 병행 배양액내 트립신화된 세포를 혈구 계산법에 의해 결정되었다. 이러한 배양액 중에서 세포당 염료 흡광도는 거의 변하지 않으므로(2％), 세포수는 상기 배양액의 A₆₂₀흡광도를 A₆₂₀/세포계수로 나누어 추정할 수 있다. 감마-인터페론을 처리한 배양액과 처리하지 않은 배양액간의 A₆₂₀/세포에는 거의 차이가 없었다. 세포수 측정을 위한 미시적인 계수와 염료 결함 분석간의 상관계는 우수하다. (r=0.98).

[DNA합성]

DNA합성은 사실상 레인스(Raines) 및 로스(Ross)에 의해 기술된 바와 같이 측정된다. 간단히 말하자면, 상기에 설명한 바와 같이 SMC를 갭 0기(G₀)에서 동시 생성시킨 후, 혈청 첨가후 여러번 또는 동시에 부가된, 감마-인터페론의 존재 또는 부재하에서 10% FCS를 부가하여 세포 주기에 진입되도록 유도한다.³H-티미닌(10μCi/10㎠웰)을 FCS와 함께 첨가하고, 24시간 경과시 트립신화에 의해 세포를 회수하였다. 이들을 0.22-㎛밀리포어(millipore) 필터(Bedford, Massachusettes) 상에서 수집하고 트리클로로아세트산-불용성 방사능을 Insta-gel L에 용해시킨 후 섬광 계수기로 분석하였다.

[la 발현의 효소-결합 면역분석]

96-웰 마이크로타이터 플레이트(Nunc)내 SMC는 하기 설명된 바와같이 감마-인터페론에 노출시켰다. 그후 세포를 PBS(포스페이트 완충 염수(phosphate-buttered saline), 150 mM NaCl, 15mM 포스페이트 완충액, pH 7.2)로 세 번 헹구고, 100mM 포스페이트나트륨 완충액 (pH 7.2)중의 1% 포름알데히드로 4℃에서 15분간 고정시켰다. 이들을 PBS로 세 번 헹구고, 0.1%소혈청 알부민(BSA; RIA grade, Sigma Chemical, St. Louis, Missouri)을 갖는 PBS중의 100mM 글리신과 37℃에서 30분간 반응시켰다. 세포를 PBS로 두 번 헹군 후, 0.1% PBS를 함유하는 PBS 중의 0.5％말의 표준 혈청으로 37℃에서 60분간 사전 인큐베이트시키고 0.05% 트윈-20을 포함하는 PBS로 세 번 헹군 다음, I-A 항원과 I-E 항원을 각각 검출하는 단클론성 항체 OX6 및 OX17(Seralab, Crawle Down, Sussex, UK)로 격자형 적정에 의해 결정된 최적 희석액에서 37℃로 60분간 인큐베이트시켰다. 여분의 항체를 PBS/트윈으로 세 번 헹굼으로써 씻어내고 세포는, 알칼리성-포스파타아제-표지된, 흡착 정제되고 PBS/BSA 중에서 1:1000으로 희석된 염소 항마우스 면역 글로불린 G항체(Jackson Lab, Avondale, Pennsylvania)로 30분간 인큐베이트시켰다. PBS/트윈으로 세척한 후, 견본을 10% 디에탄올아민중의 1mg/ml p-니트로페닐포스페이트 기질, 0.5mM MgCl₂를 함유하는 기질용액 (pH 9.8)중에 37℃에서 60분간 인큐베이트시켰다. 2M NaOH를 부가하여 반응을 중단시키고 마이크로타이터 광도계로 405nm에서의 흡광도를 측정한다.

[동물실험 I]

15마리의 5개월 된 스프라그-다우리(Sprague-Dawley) 쥐에 전에 설명한 바와 같이 경동맥 손상을 입혔다. 간단히 말하면, 마비된 쥐에 좌측 외부 경동맥을 통해 포가티 2F 발룬 카테테르를 꽂았다. 발룬을 일반 경동맥의 인접부에서 팽창시키고 카테테르를 경동맥 분기를 향해 수축시켰다. 상기 과정을 세 번 반복 실시하고 난 후 카테테르를 제거하면 외부 경동맥과 표면 상처가 폐쇄되었다. 이 과정은 상처 부위의 모든 내피세포를 제거하고 안쪽 평활근 세포를 약간 손상시키는 것으로 제시되었다.³H-티미닌(6.7 Ci/mmol; New England Nuclear, Boston, Massachusetts)을 복강내 삼투 미니펌프를 통해 수술일로부터 다섯 마리의 쥐에 지속적으로 주입하였다 (참조문헌: Clowes AW, Schwartz SM: Significance of quiescent smmoth muscle migration in the injured rat carotid artery. Circ Res 1985:56:139-145). 다른 열마리의 쥐에도 14일째 날에 24시간 동안 세 번³H-티미닌을 주입하였다 (참조문헌: Jonasson L, Holm J, Hansson GK: Smooth muscle cells express la antigens during arterial response to injury, Lab Invest 1988:58:310-315).

수술후 14일째 날에, 쥐를 마취시키고, 경동맥을 포스페이트 완충액 (pH 7.2) 중의 1% 포름알데히드로 관류시켜 고정시켰다. 손상된 좌측 경동맥과 손상되지 않은 우측 경동맥을 함유하는 분절을 질소 액체로 스냅 동결시키고 8㎛ 박편을 저온 마이크로톰(cryostat microtome) 상에서 절단시켰다. la항원 I-A는 마우스 항쥐 단클론성 항체 OX6로 인큐베이트시킨후 비오틴화된 말 항마우스 면역글로불린 G 및 비오틴-아비딘-알칼리성 포스파타아제 복합체(Vector, Burlingame, California)로 인큐베이트시킴으로써 가시화된다. 그후 박편을 포름알데히드로 고정시키고 NTB2 핵 추적 에멀션(Kodak, Rochester, New York)에 침지시켰다. 2주후 이들을 전개시키고, 헤마톡실린으로 염색하고, 광현미경으로 조사하였다. 각 동물에 있어서, 200개의 세포를 동맥 내막 비후의 해당 부위에서 계수하고, la-포지티브 및³H-티미딘-포지티브 세포의 비율을 결정하였다.

평균값을 스튜던트의 t검정(student's t test)과 비교하고; 다수 비교의 경우에 있어서, 쉐페(Schefe)의 보정을 아미타지(Armitage)에 의해 설명된 바와같이 사용하였다 (참조문헌: Armitage P: Statistical Methods in ]Medical Research Oxford, England, Blackwell, 1971). p0.05에서 유의차가 나타나는 것을 생각된다. 휘귀선은 최소 제곱법에 의해 결정되었다.

[결과]

지수적으로 성장하는 쥐 평활근 세포의 증식은 배양 배지내 재조합 감마-인터페론의 존재에 의해 억제되었다. 제 1도와 관련하여, 그래프는 평활근의 증식이 감마-인터페론에 의해 억제됨을 나타낸다. 96-웰 마이크로타이터 플레이트내에서 지수적으로 성장하는 동맥 평활근 세포를 배양 배지내의 상이한 용량의 재조합된 쥐의 감마-인터페론(감마-IFN)에 노출시켰다. A,B,C,D 및 E는 각각 0,1,10,50 및 100 유니트(u)/ml의 감마-인터페론 농도에 해당된다. 유의한 억제는 10 유니트/ml로는 처리 4일후 및 50 또는 100 유니트/ml로는 인터페론 첨가 2일후에 이루어졌다. 평탄역에 도달하는 경우인 50유니트/ml까지는 감마-인터페론의 용량과 증식 억제간의 투여량 반응의 상관관계가 존재한다.

성장 억제는 세포를 처음에 혈청 결핍에 의해 성정 억제시킨 후, FCS의 첨가에 의해 세포 주기에 진입하도록 할 경우 보다 더 뚜렷하게 나타난다. 이는 감마-인터페론에 의해 평활근 배양 억제가 일어남과 동시에 성장 유도가 일어남을 나타내는 제2도에 의해 설명된다. A,B,C,D 및 E는 제 1도에서의 A-E와 동일한 감마-인터페론 농도에 상응한다. 이 경우에 있어서 배지내 10 유니트/ml 감마-인터페론은 50% 성장 억제 결과를 나타내고 노출 9일후 1유니트/ml 정도의 유의한 억제가 이루어졌다. 유의한 억제는 10 유니트/ml로 4일 후에 이루어지며 최대 억제는 50유니트/ml로 도달하였다.

평활근 세포 복제에 대한 감마-인터페론의 효과는 또한 세포주기로의 진입 동안 및 후 동시 발생하는 세포에 의해 흡수된³H-티미딘을 분석함으로써 증명되었다(제 3도 참조). 우선, 세포주기중 G₁기를 측정하였다. 10㎠ 페트리 접시내의 세포를 혈청 결핍에 의해 성장 지지시킨 후 10% 소 태아 혈청을 첨가하여 0시에 세포 주기로의 진입을 유도하였다.³H-티미딘을 소타아 혈청과 함께 첨가한 후, 여러시점에서 세포를 회수하고 3배의 배양액을 섬광계수하여 트리클로로아세트산-불용성 방사능을 측정하였다. 혈청 첨가로부터³H-티미딘 흡수 개시까지의 시간(즉, 제 3도에서 곡선의 반곡점)을 측정하였다. G₁기는 약 20시간이었다.

제 4도와 관련하여, 이 그래프는 혈청과 함께 감마-인터페론을 첨가할 때³H-티미딘의 흡수가 70% 감소함을 나타낸다. 감마-인터페론은 세포 주기중 초기 G₁기에 작용함으로써 평활근 세포 복제를 억제하였다. 10㎠페트리 접시내의 세포는 성장 저지되며, 그 후 FCS의 첨가에 의해 세포주기로의 진입이 유도된다. 이들을 이후 지속적으로³H-티미딘에 노출시켰다. 감마-인터페론을 FCS와 함께, 또는 3,6,9,12 또는 15시간 후에 첨가하였다. 24시간 후 모든 세포를 회수하고 4배의 배양액을 섬광 계수하여 트리클로로아세트산-불용성 방사능을 측정한다. X축은 FCS 첨가로부터 감마-인터페론 첨가까지의 시간을 나타내며, 0시간이란 FCS와 감마-인터페론을 동시에 공급받은 배양액을 의미하고, 15시간이란 FCS 첨가 15시간후 감마-인터페론을 공급받은 배양액을 의미한다. y축상에서, 100%는 감마-인터페론에 전혀 노출되지 않은 배양액내³H-방사능을 나타내며 감마-인터페론처리 배양액내 방사능은 상기값(평균±SD)의 백분율로 나타낸다. 그러나 혈청 검가후 9시간 이상 감마-인터페론의 첨가를 지체한다면, 억제 효과는 나타나지 않는다(제 4도 참조). 그러므로 자료는 감마-인터페론이 혈관 평활근 세포의 세포 주기중 G₀에서 G₁로의 전이 단계또는 G₁기 동안의 초기 단계를 차단시킴으로써 작용함을 제시한다.

감마-인터페론은 내피세포와 섬유아세포를 포함한 많은 표적 세포에 의한 la 항원의 발현을 유도한다. 아테롬성 동맥경화성 동맥에 있는 평활근 세포는 상기 항원을 발현시키는 것이 관찰되었으며 (참조문헌 : Jonasson L, Holm J, Skalli O, Gabbiani G, Hansson GK; Expression of class II trasplantation antigen on vascular smooth muscle cells in human atherosclerosis, J Clin Invest 1985:76:125-131), 아테롬성 동맥경화성 플라크내 활성화된 T림프구의 존재는 T림프구에서 방출된 감마-인터페론이 상기 항원의 발현을 유도한다는 것을 제시해준다 (참조문헌: Jonasson L, Holm J, Skalli O, Gabbiani G, Hansson GK; Expression of class II trasplantation antigen on vascular smooth muscle cells in human atherosclerosis, J Clin Invest 1985:76:125-131 and Hansson GK, Jonasson L, Holm J, Claesson-Welsh L; Class II MHC antigen expression in the atherosclerotic plaque; smooth muscle cells express HLA-DR, HLA-DQ, and the invariant gamma chain, Clin Exp Immunol 1986:64:261-268). 이러한 가능성은 배양된 평활근 세포를 감마-인터페론에 노출시킴으로써 시험되었다.

제 5도는 감마-인터페론(감마-IFN)이 투여량 의존 방식으로 평활근 세포상에 세포 표면 I-A 발현을 유도함을 나타낸다. 96-웰 마이크로타이터 플레이트내 세포는 다양한 농도의 재조합 쥐 감마-인터페론으로 3일간 처리한 후, 효소 결합 면역 분석 기술에 의해 I-A 발현을 분석하였다. 각 배양액내 전체 I-A 값(405nm에서의 흡광도 유니트)을 염료 결합에 의해 측정된 바와 같은 배양액당 세포수로 나누어 세포당 I-A발현을 계산하였다. 배양액당 평균(n=16)이 제시되어 있고, 변이계수는 항상 2% 미만이다.

제 6도에서는 시간 경과에 따른 감마-인터페론 유도 평활근 I-A 발현에 대해 설명되어 있다. 96-웰 마이크로타이터 플레이트내 세포(n=16)는 감마-인터페론(감마-IFN스팀(stim); 100유니트/ml)으로 처리하고 감마-인터페론(A)의 첨가후 여러 시점에서 세포 표면 I-A 발현을 효소 결합 면역 분석에 의해 분석하였다. 세포당 I-A 발현은 웰당 I-A 발현(A₄₀₅유니트)을 웰당 세포수로 나누어 계산하였다. 대조치(B)는 비자극된 세포로부터 얻어진다. 표준편차는 평균치의 2% 이하이다. 감마-인터페론에 40시간 노출시킨 후 유도를 검출할 수 있었으며, 자극 60시간 후 평탄역에 도달한다. I-A 발현 유도의 시간 프레임과 감마-인터페론에 의한 성장 억제는 분명히 평행을 이룬다.

제 7도와 관련하여, 그래프는 감마-인터페론과 함께 첨가된 폴리믹신 B에 의한 내독소 억제는 결과에 영향을 미치지 않으므로, 성장 및 I-A 발현에 대한 감마-인터페론의 효과는 내독소의 오염으로 인한 것이 아니라는 사실을 제시한다. 성장 동시 발생 세포를 폴리믹신 B(50㎍/ml)를 첨가하거나(B), 첨가하지 않고서(A), 여러 농도의 재조합 감마-인터페론으로 인큐베이트시켰다. 96-웰 마이크로타이터 플레이트내 16개의 병행 배양액의 평균이 제시되어 있고; 변이 계수는 2% 미만이다. Pm은 폴리믹신 B에 관한 것이다. 마우스 감마-인터페론(Genentech사 제품)으로 얻어지는 성장 및 Ia 발현에 대한 효과는 재조합 쥐의 감마-인터페론(Holland Biotechnology사 제품)으로 얻어진 효과와 동일하다. 이와는 대조적으로, 사람 감마-인터페론은 쥐 세포내 Ia 발현을 유도하지 않는다.

세포증식의 억제 및 I-A 항원의 발현을 동시 유도하는 감마-인터페론의 생체외 관찰은, 성장 억제 및 I-A 발현은 생체내에서도 관련된 현상이라는 가설에 대한 시험을 촉구시켰다. 따라서, 쥐의 경동맥내 평활근 증식은 발룬 카테테르 손상에 의해 유도되며, 손상 시기 이후 모든 복제 세포는 삼투펌프를 통해 지속적으로 공급된³H-티미딘으로 표지된다. 세포 복제 및 I-A 발현은 동맥 내막의 비후는 완료되었지만 증식은 아직도 계속되고 있는 시기인 손상후 14일에 분석한다. 그 결과는 하기 표 1에 제시되어 있다.

[ 표 1]

³H-티미딘 표지 기간인 14일 동안 증식성 동맥 내막의 병변내 세포 복제 및 Ia 발현

세포총수의 백분율 값. 괄호내의 값은 평균±SD임

동맥내막의 평활근 세포 중 81.9%는³H-티미딘 포지티브이며, 이는 상기 세포들이 적어도 한 주기의 세포복제를 거쳤다는 것을 나타낸다. 면역 세포 화학에 의해 검출될 수 있는 I-A는 10.9%의 세포에서 발현되었다. 모든 동맥내막의 평활근 세포의 대부분은³H-티미딘으로 표지되는데, I-A 포지티브 세포의 1/8만이 3H-티미딘 포지티브을 나타낸다.³H-티미딘-네거티브 평활근 세포 중 절반 이상이 I-A 포지티브이다.

또한 DNA 복제와 I-A 발현간의 상관 관계는 동물을 죽이기 전에 즉시 24시간 퍼얼스로³H-티미딘을 주입함으로서 수술후 14일 동안 분석하였다. 이 경우에 있어서, 25.5%의 세포는³H-티미딘 포지티브이지만 이들 세포중 어느것도 I-A를 발현시키지 않았다. 이들 결과는 표 II에 제시되어 있다.

[표 2]

³H-티미딘 표지 기간인 24시간 동안 증식성 동맥 내막의 병변내 세포 복제 및 Ia 발현

세포총수의 백분율 값. 괄호내의 값은 평균±SD임

DNA 복제와 I-A 발현간의 역관계는 I-A 발현을 유도하는 메카니즘이 또한 증식을 억제함을 나타낸다. 이러한 이론은 14일 삼투 펌프 섭생법으로 표지된 쥐로부터 얻은 자동방사선 사진(autoradiogram)의 상세한 분석에 의해 뒷받침된다. 제 8도와 관련하여, I-A를 발현시키는 평활근 세포는 손상에 대한 반응 동안 신동맥 내막(neointima)내 I-A 네거티브 평활근 세포보다 더 적게 복제를 수행한다. 동맥 손상은 쥐의 경동맥 부풀림에 의해 이루어지며, 복제 세포는 14일간 삼투 펌프를 통해 지속적으로 주입된³H-티미딘에 의해 표지된다. I-A 발현은 면역 세포 화학방법에 의해 측정되며³H-티미딘 흡수는 같은 섹션의 자동방사선 사진술에 의해 측정된다. I-A 포지티브 및 I-A 네거티브 세포에 대한 은입자의 수를 4개의 병변에서 계수하였다(병변당 50 I-A 포지티브 세포 및 50 I-A 네거티브 세포). 동물간 유의한 차이가 없으므로, 모든 5개의 병변으로부터의 자료는 통계적 분석에 공동으로 이용한다. I-A 포지티브 세포와 I-A 네거티브 세포간의 은입자 차이는 p 0.01로 상이하며 평균±SD가 도면에 나타나 있다.³H-티미딘 표지된, 증식 세포수에 있어서, 핵당 은-입자의 평균수는 I-A 포지티브세포와 비교하는 경우 I-A 네거티브 세포내에서 거의 두배가 많다. 각 증식주기가 더해짐에 따라 세포내에 더 많은³H-티미딘의 축적이 예상되며 세포당 입자수는 세포당 방사능과 밀접하게 관련되어 있다. 그러므로 I-A 포지티브 평활근 세포와 I-A 네거티브 평활근 세포간의 차이는, I-A 포지티브 세포가 I-A를 발현시키지 않는 평활근 세포보다 더 적은 DNA 합성 주기를 수행함을 의미한다(상기 유형 분석에 대한 언급에 있어서 하기 참조 문헌; Clowes AW, Schwartz SM: Significance of quiescent smooth muscle migration in the injured rat carotid artery. Circ Res 1985:56-139-145).

[동물실험 II]

8마리의 400g 스프라그-다우리 수컷 쥐를 포함하는 생체내 시험 실험을 수행하였다. 이전에 설명한 것과 같이 포가티 2F 발룬 카테테르를 사용하여 일반 경동맥에서 동맥내막성 병변을 일으킨다. 쥐중에서 4마리에 재조합 쥐 감마-인터페론을 7일간 매일 200,000 U s.c.를 주입하고 다른 4마리에 같은 부피의 부형제(염화나트륨 용액)을 주입하였다.

부풀림 14일 후 모든 쥐를 희생시켰고, 포스페이트 완충액 중의 1% 파라포름알데히드로 관류시켜 고정시켰다. 작동(좌측) 및 비작동(우측) 경동맥을 OCT 배지에 넣고 n-헥산/질소 액체로 스냅 돌결시켰다. 10㎛ 저온조 박편을 매 100㎛에서 절단시키고, 신동맥 내막에 의해 점유된 부위는 점-추출법을 이용한 체형 측정에 의해 측정하였다. 결과를 표 III에 요약하였다.

[표 3]

감마-인터페론 처리한 쥐 및 대조용 쥐의 신동맥 내막

n은 쥐의 숫자이고 a는 평방 마이크로 미터 단위의 단멱적이다.

스튜던트의 t 검정에 의한 통계분석.

감마-인터페론 처리는 동맥내막 비후의 발생을 유의하게 억제함이 분명하며, 이러한 억제는 감마-인터페론 처리중지 후 1주일 지속됨은 주목할 만하다. 이러한 사실은, 안쪽 세포가 복제와 손상후 중요 시점에서의 이동을 담당한다는 가설을 뒷받침해준다. 상기 시점에서 증식의 억제는 병변의 크기를 지속적으로 감소시키는 것으로 보인다.

상기 실험은 분명하게 평활근 세포 복제에 대한 감마-인터페론의 억제효과를 나타낸다.

따라서, 감마-인터페론은, 예컨대 동맥 내막 과형성으로 인한 혈관 협착증 치료 및 바람직한 구현에 있어서, 혈관 수술 및/또는 혈관 형성술에 따른 동맥 협착증의 치료에 이용할 수 있다. 감마-인터페론은 상기 인터페론을 함유하는 약제의 형태로 치료효과를 얻기에 충분한 양만큼 환자에게 투여되어야 한다. 특별한 환자에게 요구되는 투여량과 치료 기간은 의사의 지시에 따라 결정될 것이다. 투여량은 케라티노사이트(keratinocyte)와 같은 표적 세포상에 분류 II-MHC 항원의 발현을 유도하기에 충분해야 한다.

본원에서 감마-인터페론은 유럽 공고 제 77 670호에 발표된 바와 같은 천연 감마-인터페론의 서열 및 모든 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 본원에서 설명된 방법에 의해 협착증을 억제시킬 수 있는 이들의 다른 변형체 또는 다른 동물로부터의 세포를 이용한 이들의 유사물질로 규정된다. 상기 변형체의 예는 대립형질 또는 아미노산 잔기가 결실, 삽입 또는 치환되는 위치 직접 변이 유발 방법(site directed mutagenesis)의 생성물이다(예컨대, 유럽 공고 제 146 354호를 참조한다). 수의학 치료에 있어서는, 치료받을 동물중과 동종이거나 상기 동물내에서 활성인 감마-인터페론을 사용해야 한다. 인체 치료에서는, 유럽특허 제 77 670호에 제시된 서열의 desCysTyrCys 변형체를 사용해야 하며, 마지막 4잔기가 있는 C말단 변형체는 임의적으로 해독후 과정에서 결실된다. 천연 서열을 갖는 감마-인터페론은 공지의 방법을 이용하여 천연 공급원으로부터 정제하여 수득할 수 있다. 동일한 분자 또는 이들의 변형체도 또한 공지의 방법에 의해 재조합 공급원으로부터 수득할 수 있다.

통상적인 제형물은 pH 5.0에서 ml당 주사용 물 1g에 대해 감마-인터페론(20×10f6) 1.0 또는 0.2mg/ml, 숙신산 0.27mg/ml, 디소듐숙시네이트헥사히드레이트 0.73mg/ml, 만니톨 40mg/ml, 폴리소르베이트20 0.1mg/ml qs를 함유한다. 이러한 수성 제형물은 임상 의학자에 의해 결정된 바와 같은 인체내 최대 허용량 미만의 치료 투여량만큼 투여한다. 감마-인터페론은 또한 재구성된 동결건조된 제제로부터 투여될 수 있다.

감마-인터페론은 치료 투여량을 동맥 내막성 손상 부위에 투여할 수 있는 통상의 경로, 예컨대 정맥 내 또는 폐내 경료(EP 257 956)를 통해 투여한다. 투여는 또한 치료 수준을 유지하기에 충분한 침제나 거환을 지속적으로 투여함으로써 이루어질 수 있다. 감마-인터페론은 가능하다면 적어도 협착증에 이르는 사건의 과정에서 사용하여야 하며 이후 혈관계의 적합한 치료가 이루어지기에 충분한 시간동안, 통상적으로 임상의학자에 의해 결정된 바와 같은 약 3 내지 10일간 계속 사용된다.

Claims

혈관 협착증 치료용 약제의 제조를 위한 감마-인터페론의 사용 방법.
제 1항에 있어서, 혈관 협착증이 동맥 협착증 또는 교합의 치료에 따른 재협착증임을 특징으로 하는, 감마-인터페론의 사용 방법.
제 2항에 있어서, 재협착증이 혈관 형성술 또는 혈관 수술에 따른 동맥 협착증임을 특징으로 하는, 감마-인터페론의 사용 방법.