DK174523B1 - Anvendelse af gamma-interferon til fremstilling af et lægemiddel til behandling af vasculær stenosis - Google Patents

Description

i DK 174523 B1

Den foreliggende opfindelse angår anvendelse af gamma-interferon til fremstilling af et lægemiddel til behandling af vaskulær stenosis fremkaldt af eksempelvis intimal hyperplasi, herunderbehandling af restenosis efter an-gioplastik og/eller vaskulær kirurgi. Opfindelsen er især rettet mod behand-5 lingen af arteriel stenosis efter angioplastik og/eller vaskulær kirurgi.

Fremskridt inden for den kardiovaskulære forskning har gjort det muligt at reducere forekomsten af hjerteanfald hos patienter, først og fremmest ved at reducere risikofaktorerne for atherosclerose, såsom hypercholesterolæmi, tobaksrygning og hypertension. Det er velkendt, at udviklingen af et hjertean-10 fald kan standses ved indgivelse af plasminogen-aktivator af vævstypen (t-PA), som opløser blodproppen i kranspulsåren. For nylig har kloningen og produktionen af t-PA ved rekombinant DNA-teknik gjort det muiigt at fremstille t-PA i ubegrænsede mængder.

Til modvirkning af hjerteanfald hos patienter, som har udviklet koronar athe-15 rosclerose, er der imidlertid kun kirurgiske metoder til rådighed. Man har udviklet flere vigtige nye teknikker til kirurgisk terapi. Nærmere bestemt har an-gioplastiske procedurer, hvorunder man anvender ballon-katetere og i den senere tid også laserstråler, gjort det muligt at behandle patienter med mindre svære symptomer, hvor koronar "bypass" kirurgi ikke er påkrævet, samt 20 patienter, hvis almentilstand er for dårlig til at kunne tåle egentlig kirurgi.

Alle manipulationer med de store blodkar, hvad enten der er tale om konventionel kirurgi eller angioplastiske procedurer, vanskeliggøres imidlertid af den hyppige forekomst af intimal hyperplasi, som fører til en fornyet forsnævring af arterien. Som et eksempel kan det nævnes, at omkring 30% af samtlige 25 patienter, som undergår perkutan transluminal koronar angioplastik på Sahl-gren's Hospital, Goteborg, Sverige, udvikler intimale læsioner, som giver anledning til iskæmiske symptomer.

Dette problem observeres også efter konventionel vaskulær kirurgi. Re-konstruktiv kirurgi i de arterier, som forsyner de nedre ekstremiteter med 30 blod, efterfølges af en tilbagevenden af de iskæmiske symptomer som følge af intimale læsioner i 50% af samtlige tilfælde (se Rutherford, R. (red.),

Vascular Surgery, kap. 58, 2. udgave, Saunders, 1984). Tilsvarende kan det anføres, at omkring 20% af alle patienter, som underkastes carotid endarte- 2 DK 174523 B1 riektomi, udvikler intimal hyperplasi. Lignende resultater er blevet rapporteret fra adskillige andre behandlingscentre. Desuden kan man ofte observere intimal hyperplasi i forbindelse med koronar "bypass" kirurgi. Postoperativ og "postangioplastisk" intimal hyperplasi er derfor i dag et væsentligt problem 5 inden for klinisk kardiologi, hjertekirurgi og vaskulær kirurgi.

For eksempel er det nødvendigt, at mange patienter med angina pectoris underkastes gentagne angioplastiske procedurer, og til sidst kan det være nødvendigt at foretage koronar "bypass" kirurgi. Det er klart, at hvis man kunne stoppe udviklingen af intimal hyperplasi, ville det være muligt at spare patien-10 terne for mange smerter og lidelser og ligeledes reducere behandlingsomkostningerne væsentligt.

De mekanismer, som ligger til grund for den intimale celleformering, er blevet studeret omhyggeligt af fagfolk inden for vaskulær biologien. Det er velkendt, at en mekanisk beskadigelse af arterien resulterer i, at mellemstore glatmu-15 skelceller ved migration trænger ind i intima. Når cellerne først befinder sig i intima, begynder de at formere sig, hvorved der opstår en intimal læsion, der varer ved i måneder {se Schwartz, S.M. Campbell, G.R. og Campbell, J.H.,

Circ. Res. 5£;427, 1986). En re-endothelialisering af overfladen synes at være af vigtighed for regression af læsionen, og såvel det involverede endothe-20 liale område som graden af beskadigelse af de sub-endotheliale strukturer er af betydning for læsionens udbredelse.

Formeringen af vaskulære glatmuskelceller kontrolleres sandsynligvis af vækstfaktorer, som enten cirkulerer i blodet, såsom insulin, eller frigives fra cellerne, såsom den blodplade-afledte vækstfaktor. Den sidstnævnte faktor 25 syntetiseres ikke blot af megakaryocytter, men også af monocytter og en-dothelialceller (se Ross, R., New Engl. J. Med. 314:488.1986 og Ross, R. og Raines, E.W., Bowen-Pope DF. Cell 1986:46:155-169), og dette tyder på, at inflammatoriske celler muligvis deltager i karvæggens vækstregulering.

Man ved endnu mindre om de vækstinhiberende faktorer for glatmuskelcel-30 ler. Når heparin administreres farmakologisk, inhiberer forbindelsen væksten af glatmuskulaturen (se Clowes, A.W. og Karnovsky, M.J., Nature 265:625, 1977), og man har foreslået, at endogene heparin-lignende substanser eventuelt er involveret i den fysiologiske vækstkontrol. Det skal imidlertid bemær 3 DK 174523 B1 kes, at alle patienter, som undergår angioplastisk og kirurgisk behandling, er under heparin-terapi, og alligevel udvikler de en signifikant intimal stenosis.

Immunocytokemiske studier, som er foretaget for nylig, og hvor man anvendte celletype-specifikke monoklonale antistoffer, har vist, at monocyt-afledte 5 makrophager er tilstede i stort antal i atherosclerotisk plaque (se Vedeler, C.A., Nyland, H. og Matre, R: In situ characterization of the foam cells in early human atherosclerotic lesions; Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. (C) 1984:92:133-137, Aqel, N.M., Ball, R.Y., Waldman, H. og Mitchinson, M.J.:

Monocytic origin of foam cells in human atherosclerotic plaques; Atheroscle-10 rosis 1984:52:265-271, Jonasson, L, Holm, J., Skalli, 0., Bondjers, G. og Hansson, G.K.: Regional accumulations of T cells, macrophages and smooth muscle cells in the human atherosclerotic plaque; Atherosclerosis 1986:6:131-140 og Gown, A.M., Tsukada, T. og Ross, R: Human atherosclerosis. II. Immunocytochemical analysis of the cellular composition of human 15 atherosclerotic lesions; Am. J. Pathol. 1986:125:191-207). Disse makrophager er imidlertid ikke de eneste celler, som bæres af blodet, og som kan findes i arterievæggen under patologiske omstændigheder. T-lymfocytter udgør 1/5 af cellepopulationen i den fibrøse kapsel i human atherosclerotisk plaque (se Jonasson et al, Atherosclerosis 1986:6:131-140), og de kan også obser-20 veres i eksperimentelle modeller af vaskulære skader (se Jonasson, L,

Holm, J. og Hansson, G.K.: Smooth muscle cells express la antigens during arterial response to injury; Lab. Invest. 1988:58:310-315).

Immunocytokemiske data antyder, at T-lymfocytter kan modulere vækst-egenskaberne og andre funktioner af glatmuskelceller. I atherosclerotiske 25 plaques, hvor T-lymfocytter forekommer i rigelige mængder, vil mange glatmuskelceller udtrykke klasse II "major histocompatibility complex" antigener (la-antigener). På den anden side mangler glatmuskelceller la-antigener i ik-ke-atherosclerotiske normale arterier (se Jonasson, L; Holm, J; Skalli, O.,

Gabbiani, G. og Hansson, G.K.: Expression of class II transplantation antigen 30 on vascular smooth muscle cells in human atherosclerosis; J. Clin. Invest. 1985:76:125-131, og Hansson, G.K. Jonasson, L., Holm, J. og Claesson-Welsh, L; Class II MHC antigen expression in the atherosclerotic plaque; smooth muscle cells express HLA-DR, HLA-DQ, and the invariant gamma chain; Clin. exp. Immunol. 1986:64:261 -268). Det er blevet eftervist, at la- 4 DK 174523 B1 antigener forekommer på glatmuskelceller under den arterielle respons til læsioner på rotter, men der er ikke noget tidligere materiale, der viser eller antyder en relation imellem la-antigener og vaskulær stenosis.

Disse antigener spiller en fundamental rolle ved præsentationen af fremmede 5 antigener for T-lymfocytterne. Deres ekspression, som skyldes makrophager, endothelialceller og flere andre celletyper, induceres af gamma-interferon, som udskilles af aktiverede T-lymfocytter (se Pober, J.S., Gimbrone, M.A.,

Cotran, R.S., Reiss, C.S., Burakoff, S.J., Fiers, W. og Ault, K.A.: la expression by vascular endothelium is inducrible by activated T cells and by human I0 gamma-interferon; J. Exp. Med. 1983:157: 1139-1353, og Unanue, E.R. og Allen, P.M.: Comment on the finding of la expression in non-lymphoid cells;

Lab. Invest. 1986:55:123-125).

Interferoner af alfa- og beta-typen, som produceres af leukocytter, fi-broblaster og andre celletyper, vides at inhibere formeringen af bestemte cel-15 letyper. Som nævnt frigøres gamma-interferon af aktiverede T-lymfocytter, og gamma-interferon har ligeledes vist sig at inhibere formeringen af cellerne, når der sættes konditionerede medier eller oprensede præparationer til cellekulturer af forskellige typer, såsom brystkirtelceller og fibroblaster (se Rubin, B.Y. og Gupta, S.L.: Differential efficacies of human type I and type II interfe-20 rons as antiviral and antiproliferative agents; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1980: 77:5928-5932, Blalock, J.E., Georgiades, J.A., Langford, N.F. og Johnson, H.M.: Purified human immune interferon has more potent anticellu-lar activity than fibroblast or leukocyte interferon; Cell. Immunol.

1980:49:390-401, og Wahl, S.M. og Galtely, C.L.: Modulation of fibroblast 25 growth by a lymphokine of human T cell and continuous T cell line origin; J.

Immunol. 1983:130:1226-1230). Der har imidlertid været rejst tvivl om, hvorvidt denne effekt kunne skyldes kontaminering af præparationerne med lym-fotoxin (tumornekrosefaktor) og ikke en inhiberende virkning af gamma-interferon i sig selv.

30 Sammenfattende ville det være en fordel, om man var i stand til at behandle vaskulær stenosis og dermed beslægtede lidelser ved anvendelse af præparater, som inhiberer væksten af glatmuskelceller.

Det har nu overraskende vist sig, at gamma-interferon er en vigtig vækstinhi bitor for glatmuskelceller i intimale læsioner såve! som i atherosclerose. Den ne opdagelse danner basis for den foreliggende opfindelse.

5 DK 174523 B1

Ifølge et af aspekterne ved den foreliggende opfindelse anvender man gam-5 ma-interferon til fremstilling af et lægemiddel til behandling af vaskulær stenosis, der eksempelvis er fremkaldt af intimal hyperplasi.

Ved en af udførelsesformeme for dette aspekt af opfindelsen består behandlingen af vaskulær stenosis i en behandling af restenosis efter behandlingen af arteriel stenosis eller forsnævring.

10 I en foretrukken udførelsesform for dette aspekt af opfindelsen behandler man arteriel stenosis efter angioplastik og/eller vaskulær kirurgi.

Den anvendte kilde for gamma-interferon er ikke kritisk, idet der kan være tale om syntetisk, naturlig eller rekombinant gamma-interferon, som i det sidstnævnte tilfælde er produceret ved rekombinant-DNA-teknik.

15 Det omhandlede farmaceutiske præparat indgives fortrinsvis til patienterne ved parenteral administration, nærmere bestemt ved subkutan, intravenøs eller intramuskulær injektion.

De anvendte fortyndingsmidler og excipienser er sådanne, som anvendes konventionelt i farmacien, eksempelvis fysiologisk saltvand.

20 Opfindelsen illustreres nærmere under henvisning til tegningen, hvon fig. 1 er en grafisk afbildning, som viser indvirkningen af forskellige koncentrationer af gamma-interferon på formeringen af glatmuskelcellekulturer; fig. 2 er en grafisk afbildning, som viser indvirkningen af forskellige koncentrationer af gamma-interferon på induktionen af vækst i glatmuskelcellekultu-25 rer; fig. 3 er en grafisk afbildning, som viser varigheden af Gi-fasen af glatmu-skelcellernes cellecyklus; 6 DK 174523 B1 fig, 4 er en grafisk afbildning, som viser indvirkningen af gamma-interferon på replikationen af glatmuskelceller i en tidlig fase af cellernes cyklus; fig. 5 er en grafisk afbildning, som viser indvirkningen af gamma-interferon på l-A ekspression i glatmuskelceller ved forskellige gamma-interferon-5 koncentrationer; fig. 6 er en grafisk afbildning, som viser den tidsafhængige effekt af gammainterferon på l-A ekspression i glatmuskelceller; fig. 7 er en grafisk afbildning, som viser fraværet af endotoxin-kontaminering i præparationer af gamma-interferon anvendt til inhibering af glatmuskelceller-10 nes formering; og fig. 8 er et diagram, som viser graden af replikation af hhv. l-A udtrykkende og l-A negative glatmuskelceller.

Man har studeret effekten af rekombinant gamma-interferon på dyrkede arterielle glatmuskelceller, og det har vist sig, at dette lymfokin Inhiberer den cel-15 lulære formering. Denne effekt kan sammenlignes med en induktion af laantigener. Derfor har man studeret la-ekspressionen og cellereplikationen i det arterielle respons på skader frembragt i rotter, i hvis halspulsåre der er indført en ballon. På denne måde har man opnået bevis for, at der er en sammenhæng imellem la-ekspression og mangel på celleformering.

20 Man har gjort forsøg på at identificere de cellepopulationer, som danner den atherosclerotiske plaque. Monoklonale antistoffertil celletype-specifikke antigener blev derfor påført på udsnit af endarterektomi-prøver. De fleste celler i den lipid-rige kerneregion viste sig at blive farvet med antistoffer til ma-krophag-antigener, og mange af cellerne i den fibrøse kapsel blev ofte farvet 25 af anti-glatmuskelcelle-antistoffer (se Jonasson, L, Holm, J., Skalli, O., Bond-jers, G. og Hansson, G.K., Arteriosclerosis 6:131,1986). I tilslutning hertil (og mere overraskende) kunne man observere betydelige mængder af T-lymfocytter, i særdeleshed i den fibrøse kapsel. Mange af disse T-lymfocytter viste tegn på aktivering, dvs. ekspression af HLA-DR, VLA-I og interleukln-2-30 receptor (se f.eks. Jonasson, L, Holm, J., Skalli, O., Gabbiani, G. og Hans- son, G.K., J. Clin. Invest. 76:125,1985 og Hansson, G.K., Jonasson, L,

Holm, J. og Claesson-Welsh, L, Clin. exp. Immunol. £4:261, 1986).

DK 174523 B1 7

Mange glatmuskelceller i disse T-celle-rige områder viste sig at udtrykke HLA-DR (la-antigener), hvorimod sådanne antigener aldrig blev fundet på 5 glatmuskelceller i den normale arterievæg. HLA-DR-ekspression induceres af aktiverede T-celler via en frigivelse af gamma-interferon (se Pober, J.S. et al,

Nature 30£:726, 1983 og Unanue, E.R. og Allen, P.M., Lab. Invest. 5£:123, 1983). De resultater, som man har fundet ved atherosclerosis, antyder derfor, at gamma-interferon er involveret i en parakrin regulering af gen-IO ekspressionen i den atherosclerotiske plaque. Endvidere har man for nylig opnået direkte immunohistokemiske beviser for tilstedeværelsen af gammainterferon i den atherosclerotiske plaque.

Man benyttede en eksperimentel dyremodel til analyse af T-lymfocytters rolle med hensyn til at regulere arteriel glatmuskelformering og gen-ekspression.

15 Til dette formål anvendte man den ballon-kateter-model, som er udviklet af Baumgartner og forbedret af Clowes og Reidy. Man inducerede intimale læsioner i halspulsåren hos rotter ved hjælp af et Fogarty ballon-kateter, hvorefter man ved immunohistokemi analyserede infiltrationen af forskellige typer af leukocytter og ekspressionen af la-antigener på forskellige tidspunkter efter 20 frembringelse af læsionen.

I løbet af to uger fandt man en lille, men signifikant mængde T-celle-infiltration, og det viste sig ligeledes, at glatmuskelcellerne i intima begyndte at udtrykke la-antigener, la-ekspressionen kunne induceres in vitro ved hjælp af rekombinant gamma-interferon. Disse resultater tyder på, at der frigøres 25 gamma-interferon, som påvirker glatmuskel-gen-ekspression i de intimale læsioner.

In vitro er gamma-interferon en effektiv inhibitor for glatmuskelcelleformering, og det må derfor formodes, at gamma-interferon kan tjene som endogen inhibitor for glatmuskelcelleformering i den intimale læsion efter skade. Man 30 har opnået indirekte støtte for denne hypotese ved analyse af glatmuskelcel-lereplikation i læsionen. Det viste sig, at la-positive glatmuskelceller ikke optog 3H-thymidin i løbet af en 24-timers puls 14 dage efter skade.

8 DK 174523 B1 I en anden forsøgsrække blev alle replikerende glatmuskelceller mærket med 3H-thymidin via en osmotisk pumpe indført samtidig med ballon-kateteret.

Ved kombineret 3H-autoradiografi og immunohistokemisk farvning for la viste det sig, at de celler, som udtrykte la på aflivningstidspunktet, dvs. 14 dage 5 efter indføring af ballon-kateteret, havde undergået signifikant færre replika-tions-cykler end de la-negative glatmuskelceller. Denne opdagelse understøttede den formodning, at gamma-interferon er en endogen inhibitor for glatmuskelcellernes replikation ved intimal hyperplasi. Opmuntret af disse resultater besluttede man at fortsætte arbejdet ved at teste indvirkningen af pa-10 renteralt administreret gamma-interferon på det arterielle respons på læsionen.

Materialer oa metoder Celledyrknino

Glatte aorta-muskelceller fra rotter (SMC’er) blev isoleret fra hanrotter af 15 stammen Sprague-Dawley, der vejede 200 g, ved collagenase-digestion, og cellerne blev dyrket i RPMI-1640 medium suppleret med kalvefosterserum (FCS), 100 enheder/ml penicillin G, 100 pg/ml streptomycin og 50 pg/ml ascorbinsyre. Til eksperimenterne anvendte man celler fra tredie til femte gennemløb, og disse celler blev udsået i mikrotiter-plader med 96 huller 20 (Nunc, Roskilde, Danmark) med henblik på vækstanalyse eller i Petri-skåle (10 cm2) med henblik på analyse af DNA-syntesen.

Vækstanalvse SMC'er voksede enten eksponentielt, eller også blev de induceret til at indtræde i gap 1 (Gi) fasen af cellens cyklus ved tilsætning af 10% FCS efter 48 25 timers serum-udsultning i 0,5% FCS. Kulturerne blev udsat for rekombinant muse-gamma-interferon (Genentech, San Francisco, Californien), som sattes til mediet sammen med 10% FCS. På forskellige tidspunkter blev kulturerne fikseret med 4% formaldehyd i en 0,1 M acetatpuffer, pH 3,1, og inkuberet med Amido Black B for at farve celleproteineme. Ikke-bundet farvestof blev 30 renset bort ved hjælp af destilleret vand, hvorefter farveoptagelsen blev bestemt ved 620 nm i et EIA mikrotiterfotometer. Farvebindingen per celle blev beregnet ved at dividere farveabsorbansen per kultur (A62o-enheder) med 9 DK 174523 B1 celleantallet per kultur, som for sit vedkommende blev bestemt ved hemocy-tometrisk tælling af trypsiniserede celler i parallelkulturer. Eftersom farveab-sorbansen per celle i disse kulturer kun varierede ganske lidt (under 2%), kunne cellernes antal estimeres ved at dividere A62o-absorbansen af en given 5 kultur med A62o/cellekoefficienten. Der var ikke nogen signifikant forskel i A62o/celle imellem gamma-interferon-behandlede og ikke-behandlede kultu rer. Korrelationen imellem mikroskopisk tælling og analyse af farvebindingen til bestemmelse af celleantallet var fremragende (r=0,98).

DNA-svntese I0 DNA-syntesen blev i alt væsentligt bestemt som beskrevet af Raines og Ross. I korte træk blev SMC synkroniseret i gap 0 fasen (G0) som beskrevet ovenfor og derefter induceret til at indtræde i cellens cyklus gennem tilsætning af 10% kalvefosterserum i nærværelse eller i fravær af gamma-interferon, som i givet fald blev tilsat samtidigt eller på forskellige tidspunkter I5 efter tilsætningen af serum. Man tilsatte 3H-thymidin (10 pCi/10 cm2fordybning) samtidigt med kalvefosterserum (FCS), hvorefter cellerne blev indhøstet ved tryptinisering efter 24 timers forløb. Cellerne blev opsamlet på 0,22 pm Millipore-filtre (Bedford, Massachusetts), hvorefter den trichlo-reddikesyre-uopløselige radioaktivitet blev analyseret i en scintillationstæller 20 efter solubilisering i Insta-gel 1®.

Enzvm-bundet immunoassay af la-ekspressionen SMC i mikrotiterplader med 96 huller (Nunc) blev eksponeret for gammainterferon, som det vil blive beskrevet i det følgende. Cellerne blev derefter renset tre gange med PBS (phosphatpufferholdigt saltvand, 150 mM NaCI, 25 15 mM phosphatpuffer, pH 7,2) og fikseret i 15 minutter ved 4 °C med 1% formaldehyd i 100 mM natriumphosphatpuffer, pH 7,2. De blev renset tre gange med PBS og derefter bragt til at reagere med 100 mM glycin i PBS indeholdende 0,1% okseserumalbumin (BSA; RIA-renhed, Sigma Chemical,

St. Louis, Missouri) i 30 minutter ved 37 °C. Efter at cellerne var blevet renset 30 to gange i PBS, blev de præ-inkuberet i 60 minutter ved 37 °C med 0,5% normalt hesteserum i PBS indeholdende 0,1% BSA. De blev renset tre gange med PBS indeholdende 0,05% Tween-20 og inkuberet med de monoklonale antistoffer OX6 og OX17 (Serafab, Crawle Down, Sussex, UK), som detekte- 10 DK 174523 B1 rer hhv. I-A og l-E-antigener i 60 minutter ved 37 °C i optimale fortyndinger bestemt ved "skakbræt-titrering". Overskydende antistoffer blev vasket bort ved rensning tre gange med PBS/Tween-20, hvorefter cellerne blev inkuberet i 30 minutter med affinitetsrensede anti-muse-immunoglobulin G antistoffer 5 fra geder (Jackson Lab, Avondale, Pennsylvania), som var mærket med alkalisk phosphatase og fortyndet 1:1000 i PBS/BSA. Efter udvaskninger med PBS/Tween-20 blev prøverne inkuberet i 60 minutter ved 37 °C i en substratopløsning indeholdende 1 mg/ml p-nitrophenylphosphat-substrat i 10% diethanolamin, 0,5 mM MgCh, pH 9,8. Reaktionen blev standset ved tilsæt-10 ning af 2 M NaOH, hvorefter absorbansen ved 405 nm blev bestemt i et mi-krotiter-fotometer.

Dyreforsøg I

Femten Sprague-Dawley-rotter med en alder på 5 måneder blev underkastet en beskadigelse af halspulsåren som beskrevet i det foregående. I korte træk 15 blev de bedøvede rotter forsynet med et Fogarty 2F ballonkateter via den venstre eksterne halspulsåre. Ballonen blev blæst op i den proximate del af den fælles halspulsåre, hvorefter kateteret blev trukket tilbage imod pulsårens forgrening. Denne procedure blev gentaget tre gange, hvorefter kateteret blev udtaget og den ydre halspulsåre og overfladesåret blev lukket. Den-20 ne procedure har vist sig at fjerne samtlige endothelialceller fra det sårede område og at fremkalde et vist tab af middelstore glatmuskelceller. Der indsprøjtedes kontinuerligt 3H-thymidin (6,7 Ci/mmol; New England Nuclear, Boston, Massachusetts) i fem rotter fra dagen for det kirurgiske indgreb via en intraperitoneal osmotisk minipumpe (se Clowes, A.W. og Schwartz, S.M.: 25 Significance of quiescent smooth muscle migration in the injured rat carotid artery; Circ. Res. 1985:56:139-145). De øvrige 10 rotter blev injiceret tre gange med 3H-thymidin i løbet af 24 timer på dag 14 (se Jonasson, L., Holm, J. og Hansson, G.K.: Smooth muscle cells express la antigens during arterial response to injury; Lab. Invest. 1988:58:310-315).

30 Fjorten dage efter det kirurgiske indgreb blev rotterne bedøvet, og pulsårerne blev fikseret ved perfusion med 1% formaldehyd i phosphatpuffer, pH 7,2. De segmenter, som indeholdt den skadede venstre og ikke-skadede højre halspulsåre blev lynfrosset i flydende nitrogen, og snit med en tykkelse på 8 pm DK 174523 B1 li blev udskåret på kryostat-mikrotom. la-antigenet l-A blev visualiseret ved inkubation med det monoklonale anti-rotte-antistof 0X6 fra mus efterfulgt af biotinyleret heste-anti-muse-immunoglobulin G og et biotin-avidin-alkalisk phosphatase-kompleks (Vector, Burlin-game, Californien). De udskårne snit 5 blev derefter fikseret i formaldehyd og neddyppet i en NTB2-emulsion til sporing af kerner (Kodak, Rochester, New York). Snittene blev fremkaldt efter to ugers forløb, farvet med hematoxylin og undersøgt i lysmikroskop. For hvert dyr blev 200 celler optalt i tilsvarende områder af den intimale fortykkelse, og forholdene imellem la-positive og 3H-thymidin-positive celler blev bestemt.

I0 Middelværdieren blev sammenlignet ved Student's t-test. I tilfælde af flere sammenligninger anvendte man Scheffe's korrektion som beskrevet af Armi-tage (se Armitage, P.: Statistical Methods in Medical Research, Oxford, England, Blackwell, 1971). Forskellene blev betragtet som værende signifikante ved p<0,05. Regressionslinierne blev fastlagt ved mindste kvadraters meto-15 de.

Resultater

Formeringen af eksponentielt voksende glatmuskelceller hos rotter blev inhi-beret gennem tilstedeværelse af rekombinant gamma-interferon i dyrkningsmediet. Idet der henvises til fig. 1, er det eftervist, at glatmuskelcelleformering 20 inhiberes af gamma-interferon. Eksponentielt voksende arterieglatmuskelcel-ler i mikrotiterplader med 96 huller blev udsat for forskellige doser af rekombinant muse-gamma-interferon (gamma-IFN) i dyrkningsmediet. A, B, C, D og E svarer til koncentrationer af gamma-interferon i enheder/ml (u/ml) på hhv. 0, 1, 10, 50 og 100. Der blev opnået signifikant inhibering med 10 enhe-25 der/ml efter 4 dages behandling og med 50 eller 100 enheder/ml 2 dage efter interferon-tilsætningen. Der var en dosis-respons-relation imellem doseringen af gamma-interferon og inhiberingen af cellemes formering op til 50 enheder/ml, hvor der blev nået et plateau.

Inhiberingen af vækst var endnu mere udtalt i de tilfælde, hvor cellerne først 30 blev vækstinhiberet ved serum-udsultning og derefter bragt til at indtræde i cellernes cyklus gennem tilsætning af FCS. Dette er eftervist i fig. 2, som viser, at induktion afvækst i synkroniserede glatmuskelkulturer inhiberes af gamma-interferon. A, B, C, D og E svarer til de samme gamma-interferon- 12 DK 174523 B1 koncentrationer som A-E i fig. 1.1 dette tilfælde bevirkede 10 enheder/ml gamma-interferon i mediet en vækstinhibering på 50%, og en signifikant inhi-bering blev opnået med så lidt som 1 enhed/ml efter 9 dages eksponering.

Der opnåedes en signifikant inhibering efter 4 dages forløb med 10 enhe-5 der/ml, og den maksimale inhibering blev opnået med 50 enheder/ml.

Effekten af gamma-interferon på glatmuskelcellereplikation blev yderligere belyst gennem analyse af 3H-thymidin-optagelsen hos synkroniserede celler under og efter indtræden i cellecyklus (se fig. 3). Først bestemte man varigheden af Gi-fasen i cellernes cyklus. Væksten af celler i 10 cm2 Pe.tri-skåle 10 blev standset ved serum-udsultning, hvorefter cellerne blev induceret til at træde ind i cellecyklen (0 timer) ved tilsætning af 10% kalvefosterserum. 3H-thymidin blev tilsat sammen med kalvefosterserum, og cellerne blev høstet på forskellige tidspunkter, hvorefter den trichloreddikesyre-uopløselige radioaktivitet blev bestemt ved scintillationstælling af tredobbelte kulturer. Tiden 15 fra serum-tilsætningen til starten af 3H-thymidin-optagelsen blev bestemt (dvs. vendepunktet på kurven i fig. 3). Det viste sig, at Gi-fasen varede omkring 20 timer.

I fig. 4 er det vist, at optagelsen af 3H-thymidin reduceres med 70%, når man tilsætter gamma-interferon sammen med serum. Gamma-interferon inhiberer 20 replikationen af cellerne i glatmuskulaturen ved at indvirke på en begivenhed i cellecyklens tidlige Gi-fase. Væksten af celler i 10 cm2 Petri-skåle blev standset, hvorefter cellerne blev induceret til at indtræde i cellecyklen gennem tilsætning af kalvefosterserum. Cellerne blev kontinuerligt eksponeret for 3H-thymidin fra dette tidspunkt. Man tilsatte gamma-interferon sammen med 25 kalvefosterserum eller hhv. 3, 6, 9,12 og 15 timer senere. Alle celler blev indhøstet efter 24 timers forløb, hvorefter den trichloreddikesyre-uopløselige radioaktivitet blev bestemt ved scintillationstælling af firdobbelte kulturer. På figuren viser x-aksen tidsrummet fra tilsætning af kalvefosterserum (FCS) til tilsætning af gamma-interferon, idet "0 timer" repræsenterer de kulturer, som 30 modtog FCS og gamma-interferon samtidigt, mens "15 timer'1 repræsenterer de kulturer, som modtog gamma-interferon 15 timer efter tilsætningen af kalvefosterserum. På y-aksen repræsenterer "100%" 3H-radioaktiviteten i kulturer, som aldrig blev eksponeret for gamma-interferon, mens radioaktiviteten i de gamma-interferon-behandlede kulturer er angivet i procent af denne værdi 13 DK 174523 B1 (middelværdi + standardafvigelse). Hvis imidlertid tilsætningen af gammainterferon blev forsinket mere end 9 timer efter tilsætningen af serum, kunne der ikke iagttages nogen inbibering (se fig. 4). De fundne data antyder derfor, at gamma-interferon virker på den måde, at der fremkaldes en blokering af 5 overgangen fra Go til Gi eller en tidlig begivenhed under Grfasen i cellens cyklus i den vaskulære glatmuskulatur.

Gamma-interferon inducerer ekspression af la-antigener hos en række forskellige målceller, herunder endothelialceller og fibroblaster. Glatmuskelceller i atherosclerotiske arterier har vist sig at udtrykke disse antigener (se Jonas-10 son, L, Holm, J., Skalli, O., Gabbiani, G. og Hansson, G.K.: Expression of class II transplantation antigen on vascular smooth muscle cells in human atherosclerosis; J. Clin. Invest. 1985:7^:125-131), og tilstedeværelsen af aktiverede T-lymfocytter i atherosclerotisk plaque tyder på, at gamma-interferon frigivet fra T-lymfocytterne kan inducere en ekspression af dette antigen (se 15 Jonasson, L.Holm, J., Skalli, O., Gabbiani, G. og Hansson, G.K.: Expression of class II transplantation antigen on vascular smooth muscle cells in human atherosclerosis; J. Clin. Invest. 1985:Z6: 125-131 og Hansson, G.K. Jonasson, L, Holm, J. og Claesson-Welsh, L: Class II MHC antigen expression in the atherosclerotic plaque; smooth muscle cells express HLA-DR, HLA-DQ, 20 and the invariant gamma chain; Clin. Exp. Immunol. 1986:64: 261-268).

Denne mulighed blev nu afprøvet ved at eksponere dyrkede celler fra glatmuskulatur for gamma-interferon.

Fig. 5 viser, at gamma-interferon (gamma-IFN) inducerer ekspression af l-A på celleoverfladen hos glatmuskelceller på dosis-afhængig måde. Cellerne 25 blev behandlet i mikrotiterplader med 96 huller med rekombinant muse-gamma-interferon i forskellige koncentrationer i tre dage, hvorefter de blev prøvet for l-A ekspression ved enzym-bundet immunoassay-teknik. I-A ekspression pr. celle blev beregnet ved at dividere den totale l-A værdi i hver kultur (absorbansenheder ved 405 nm) med antallet af celler pr. kultur som 30 bestemt ved farvestofbinding. Gennemsnitsværdier for kulturerne (n=16) er vist; variationskoefficienterne var altid under 2%.

I fig. 6 vises tidsforløbet af den gamma-interferon-inducerede glatmuskel l-A ekspression. Celler i mikrotiterplader med 96 huller (n=16) blev behandlet 14 DK 174523 B1 med gamma-interferon (gamma-IFN stim; 100 enheder/ml), hvorefter ekspressionen af l-A på celleoverfladen blev analyseret ved enzym-bundet immunoassay på forskellige tidspunkter efter tilsætning af gamma-interferon (A). I-A ekspression pr. celle blev bestemt ved at dividere l-A ekspression pr.

5 hul (Åbenheder) med antallet af celler pr. hul. Kontrolværdierne (B) er udledt af ikke-stimulerede celler. Standardafvigelserne var under 2% af middelværdierne. Induktionen kunne påvises efter 40 timers eksponering for gamma-interferon, og et plateau blev nået efter 60 timers stimulering. Tidsrammen for induktion af l-A ekspression var klart parallel med vækstinhiberingen 10 induceret af gamma-interferon.

Med hensyn til fig. 7 er det vist, at virkningerne af gamma-interferon på vækst og l-A ekspression ikke skyldes kontaminerende endotoxiner, eftersom endo-toxininhibering med polymyxin B tilsat sammen med gamma-interferon ikke påvirker resultaterne. Vækst-synkroniserede celler blev inkuberet med re-15 kombinant gamma-interferon i forskellige koncentrationer med (B) eller uden (A) tilsætning af polymyxin B (50 pg/ml). Der vises et gennemsnit af 16 parallelkulturer i mikrotiterplader med 96 huller; variationskoefficienten var under 2%. Forkortelsen Pm refererer til polymyxin B. Virkningerne på vækst og laekspression opnået med muse-gamma-interferon (produceret af Genentech) 20 var identiske med de virkninger, som opnås med rekombinant rotte-gamma-interferon (produceret af Holland Biotechnology). I modsætning hertil inducerede humant gamma-interferon ikke nogen la-ekspression i rotteceller.

Observationerne in vitro af samtidig gamma-interferon-induceret inhibering af celleformering og ekspression af l-A antigen tilskyndede en afprøvning af den 25 hypotese, at vækstinhibering og l-A ekspression er beslægtede fænomener, også in vivo. Derfor inducerede man glatmuskelformering i rottehalspulsåren ved ballon-kateter-beskadigelse, og alle replikerende celler fra tidspunktet for skadens frembringelse og fremefter blev mærket med 3H-thymidin, som blev afgivet kontinuerligt via en osmotisk pumpe. Cellereplikation og l-A ekspres-30 sion blev analyseret 14 dage efter skadens frembringelse, hvor den intimale fortykkelse er etableret, men hvor formeringen stadig foregår. Resultaterne er angivet i den efterfølgende tabel I.

I5 DK 174523 B1

Tabel J

Cellereplikation og la-ekspression i proliferative intimallæsioner under en 14-dages 3H-thymidin-mærknlngsperiode 5 3H-thymidin* 3H-thymidin' l-A+ 1,3(1,4) 9.6(6,2) l-A' 80,6(4,1) 8,5(8,9) Værdierne er anført i procent af det totale celleantal. Gennemsnitsværdi + 10 standardafvigelse er anført i parentes.

Af de intimale glatmuskefceller var 81,9% 3H-thymidin-positive, hvilket indikerede, at de havde undergået mindst én cyklus af cellereplikation. I-A, som kunne detekteres immunocytokemisk, blev udtrykt i 10,9% af cellerne. Størstedelen afalle de intimale glatmuskelceller blev mærket med 3H-thymidin, 15 men kun 1/8 af de l-A positive celler var 3H-thymidin-positive. Blandt de 3H-thymidin-negative glatmuskelceller var mere end halvdelen l-A positive.

Korrelationen mellem DNA-replikation og ekspression af l-A blev også analyseret i løbet af den 14. dag efter det kirurgiske indgreb, idet man injicerede 3H-thymidin som en 24-timers puls umiddelbart før dyrene blev aflivet. I dette 20 tilfælde var 25,5% af cellerne 3H-thymidin-positive, men ingen af disse celler udtrykte l-A. Disse resultater fremgår af den nedenstående tabel II.

Tabel II

Cellereplikation og la-ekspression i proliferative intimallæsioner under en 24-timers 3H-thymidin-mærkningsperiode 25 _ 3H-thymidin+ 3H-thymidin' l-A+ 0 (0) 5,8 (2,2) l-A' 25,5 (4,2) 68,7 (6,4) 30 Værdierne er anført i procent af det totale celleantal, middelværdi + standardafvigelse i parentes.

Den omvendte korrelation imellem DNA-replikation og I-A ekspression kunne tyde på, at den mekanisme, der inducerer I-A ekspression, også inhiberer celleformering.

Denne idé blev understøttet af en detaljeret analyse af de autoradiogrammer, som I6 DK 174523 B1 blev opnået fra rotter mærket efter 14 dages programmet ved hjælp af en osmotisk pumpe. Som det fremgår af fig. 8, er det eftervist, at de I-A udtrykkende glatmuskel-celler undergår færre replikationer end de I-A negative celler i neointima under responset på skade. Arteriel skade hos rotter blev fremkaldt ved anbringelse af et bal-5 lon-kaleter i halspulsåren, og de replikerende celler blev mærket ved hjælp af 3H-thymidin, som blev indsprøjtet kontinuerligt via osmotiske pumper i løbet af 14 dage.

I-A ekspressionen blev bestemt ved immunocylokemi, og optagelsen af 3H-thymidin blev bestemt ved autoradiografi af det samme udsnit. Antallet af sølvpartikler over ΙΑ positive og I-A negative celler blev optalt i fire læsioner (50 I-A positive og 50 I-A.

10 negative celler per læsion). Eftersom der ikke var nogen signifikant forskel imellem dyrene, blev de fundne data fra alle fem læsioner sammenlagt med henblik på den statistiske analyse. Forskellen i antallet af sølvpartikler imellem I-A positive og I-A negative celler er forskellig ved p<0,01, og gennemsnitsværdier + standardafvigelser er angivet på figuren. I den 3H-thymidin-mærkede cellepopulation under fonnering 15 var det gennemsnitlige antal sølvpartikler pr. cellekerne omtrent dobbelt så højt i de I-A negative celler som i de I-A positive celler. Det måtte forventes, at der ville akkumuleres mere 3H-thymidin i cellerne for hver yderligere formeringscyklus, og partikelantallet per celle er tæt forbundet med radioaktiviteten per celle. Forskellen imellem I-A positive og I-A negative glatmuskelceller indebærer derfor, at de I-A 20 positive celler har undergået færre cykler med hensyn til DNA-syntese end de glatmuskelceller, som ikke udtrykker I-A (med hensyn til en diskussion af denne analysetype kan der henvises til Clowes, A.W. og Schwartz, S.M.: Significance of quiescent smooth muscle migration in the injured rat carotid artery; Circ. Res. 1985:56:139-145).

25 Dyreforsøg II

Man gennemførte et pilot-forsøg in vivo, som omfattede otte Sprague-Dawley hanrotter, der hver vejede 400 g. Man fremkaldte en intimal læsion i den almindelige halspulsåre ved hjælp af et Fogarty 2F ballon-kateter som tidligere beskrevet. Fire af rotterne modtog rekombinant rotte-gamma-interferon sub-30 kutant i en daglig dosis på 200 000 enheder i syv dage, mens de øvrige fire rotter blev injiceret med det samme volumen bærestof (natriumchlori-dopløsning).

17 DK 174523 B1

Alle rotterne blev aflivet 14 dage efter indføring af ballon-kateteret, og man foretog en fiksering ved perfusion med 1% paraformaldehyd i phosphatpuffer.

De behandlede (venstre) og ikke-behandlede (højre) halspulsårer blev indesluttet i OCT-medium og lynfrosset i n-hexan/flydende nitrogen. For hver 100 5 pm udskar man 10 pm kryostat-snit, hvorefter det areal, som var optaget af neointima, blev bestemt ved morfometri ved hjælp af stikprøvemetoden. Resultaterne er sammenfattet i den efterfølgende tabel III.

Tabel III

Neointima i gamma-interferon-behandlede rotter og kontrolrotter 10 _

Behandling n a standardafvigelse P

gamma-IFN 4 2,30 1,00 <0,01 15 kontrol 4 4,80 0,50 π er antallet af rotter og a er tværsnitsarealet målt i pm2. Statistisk analyse ved Student's t-test.

Det fremgår klart, at en behandling med gamma-interferon på signifikant må-20 de inhiberer udviklingen af den intimale fortykkelse, og det er værd at bemærke, at denne inhibering varede ved i en uge efter at behandlingen med gamma-interferon var ophørt. Denne iagttagelse understøtter den hypotese, at medialceller undergår replikation og migration på et kritisk tidspunkt efter beskadigelsen. Inhibering af celleformering på dette tidspunkt synes varigt at 25 kunne reducere størrelsen af læsionen.

De ovenfor beskrevne eksperimenter viser klart den inhiberende effekt af gamma-interferon på glatmuskelcellereplikation.

Gamma-interferon kan således anvendes til behandling af vaskulær stenosis, som eksempelvis er fremkaldt af intimal hyperplasi, og i en foretrukken udfø-30 relsesform anvendes gamma-interferon til behandling af arteriel stenosis efter vaskulær kirurgi og/eller angioplastik. I denne sammenhæng bør gammainterferon administreres til patienten i en farmaceutisk formulering, der indeholder interferonet i en mængde, som er tilstrækkelig til at frembringe en te- 18 DK 174523 B1 rapeutisk virkning. Den faktiske dosis og den påkrævede behandlingsperiode bestemmes af lægen i de enkelte specifikke tilfælde. Den indgivne dosis bør være tilstrækkelig til at inducere ekspression af klasse ll-MHC-antigener på målceller, eksempelvis keratinocytter.

5 Gamma-interferon defineres i nærværende sammenhæng som et polypeptid, der indeholder sekvensen for naturligt gamma-interferon som angivet i EP-offentliggørelsesskrift nr. 77 670 samt alle aminosyresekvens-varianter eller andre varianter deraf, der er i stand til at inhibere stenosis ved de ovenfor beskrevne metoder eller disses analoge ved anvendelse af celler fra andre 10 dyr. Eksempler på sådanne varianter er alleler eller produkterne af sted-rettet mutagenese, hvori aminosyrerester fjernes, inserteres eller udskiftes. I denne sammenhæng kan der eksempelvis henvises til EP offentliggørelsesskrift nr.

146 354. Til veterinær terapi bør man anvende gamma-interferon, som er homologt med eller aktivt i den dyreart, som skal behandles. Ved human te-15 rapi bør man anvende desCysTyrCys-varianten af den sekvens, som er vist i EP offentfiggørelsesskrift nr. 77 670, og eventuelt den C-terminale variant, hvori de sidste fire rester er deleteret ved post-translationel forarbejdning.

Man kan opnå gamma-interferon, der indeholder naturlige sekvenser, ved oprensning fra naturlige kilder under anvendelse af I sig selv kendte metoder.

20 Man kan opnå det samme molekyle eller dets varianter fra rekombinante kilder, ligeledes ved i sig selv kendte metoder.

En typisk sammensætning indeholder gamma-interferon (20 x 10f6) i en mængde på 1,0 eller 0,2 mg/ml, ravsyre i en koncentration på 0,27 mg/ml, dinatriumsuccinat-hexahydrat i en mængde på 0,73 mg/ml, mannitol i en 25 mængde på 40 mg/ml, polysorbat 20 i en mængde på 0,1 mg/ml samt op til 1 g sterilt vand per ml ved pH 5,0. Denne vandige sammensætning indgives i terapeutiske doser, som vil være lavere end de maksimale tolererede doser hos mennesker som bestemt af lægen. Man kan også indgive gammainterferon fra et rekonstitueret lyofiliseret præparat.

30 Gamma-interferon kan indgives ad en hvilken som helst konventionel indgivelsesvej, som vil lede en terapeutisk dosis til det sted, hvor der er opstået en intimal skade, f.eks. ad intravenøs eller intrapulmonær vej (den sidstnævnte indgivelsesmetode er beskrevet i EP 257 956). Indgivelsen kan fore- I9 DK 174523 B1 gå ved kontinuerlig infusion eller ved bolus-dosering i et omfang, der er tilstrækkeligt til at opretholde terapeutiske niveauer. Gamma-interferonet bør om muligt i det mindste anvendes i iøbet af de begivenheder, der fører til stenosis, og derefter kontinuerligt i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til at mulig-5 gøre en forsvarlig heling af vaskulaturen, typisk fra omkring 3 til omkring 10 dage som bestemt af lægen.

Claims (4)

1. Anvendelse af gamma-interferon til fremstilling af et lægemiddel til behandling af vaskulær stenosis.

2. Anvendelse af gamma-interferon ifølge krav 1,kendetegnet ved, at 5 den vaskulære stenosis er forårsaget af vækst eller formeringsaktivitet af blodkarceller.

3. Anvendelse af gamma-interferon ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den vaskulære stenosis er restenosis efter behandling af arteriel stenosis eller okklusion. l o

4. Anvendelse af gamma-interferon ifølge krav 3, kendetegnet ved, at restenosen er arteriel stenosis efter angioplastik og/eller vaskulær kirurgi.