PT91863B

PT91863B - Processo de preparacao de uma preparacao farmaceutica a base de gama-interferao

Info

Publication number: PT91863B
Application number: PT91863A
Authority: PT
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1988-09-30
Filing date: 1989-09-29
Publication date: 1995-05-31
Also published as: PH26293A; HUT57063A; SE8803472D0; HU206988B; DK56291D0; SE462364B; IL91796A; IL91796A0; NZ230816A; CA1338722C; ATE86869T1; KR0137017B1; IE893123L; EP0367735A1; KR900701308A; JPH04500966A; HU895542D0; AU4305189A; DK174523B1; AU623181B2

Description

M3MÕRIA DESCRITIVA presente invento refere-se à utilização do interferão gama na preparação de uma preparação farmacêutica para o trata mento da estenose vascular provocada, por exemplo, por hiperpla sia da intima, incluindo o tratamento da restenose após angioplastia e/ou cirurgia vascular. 0 presente invento dirige-se especialmente ao tratamento da estenose arterial após angioplastia e/ou cirurgia vascular.

Antecedentes da Invenção progresso na pesquisa cardiovascular tem tornado possivel reduzir a incidência dos ataques cardíacos em pacientes, prin cipalmente reduzindo os factores de risco da arterioesclerose, tais como a hipercolesterolemia, o tabagismo e a hipertensão. 2 conhecido que o desenvolvimento de um ataque cardíaco pode ser parado por administração de um activador de plasminogénio do tipo de tecido (t-PA), que, dissolve o trombo na artéria coronária. Recentemente, a clonação e a produção de t-PA por técnicas de ADN recombinante tem tornado possível produzir t-PA em quantidades ilimitadas.

Para a prevenção de ataques cardíacos em pacientes que de_ senvolveram arterioesclerose coronária, porém, estão apenas disponíveis métodos cirúrgicos. Para a terapia cirúrgica têm sido desenvolvidas várias novas técnicas importantes. Em particular, os procedimentos angioplásticos usando cateteres de balão, e mais recentemente lasers, têm tornado possível tratar pacientes com sintomas menos graves, onde a cirúrgia de bypass coronário não é garantida, e também pacientes cuja condição geral é demasiado pobre para permitir uma cirúrgia importante.

Todas as manipulações de vasos sanguíneos principais, sejam elas cirúrgia convencional ou procedimentos angioplásticos são porém dificultadas pela ocorrência frequente de hiperplasia da intima conducente à restenose da artéria. Por exemplo, aproximadamente 30% de todos os pacientes que se sujeitam a angiopla^ tia coronária transluminal percutánea no Hospital de Sahlgren,

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-3Gothenburg, Suécia, desenvolvem lesões ds intima que dão origem a sintomas isquémicos.

problema é também observado após cirurgia vascular con vencional. A cirurgia reconstrutiva das artérias que fornecem sangue às extremidades é seguida por uma recorrência dos sintomas isquémicos devida a lesões da intima, em 50% dos casos.

(vêr Rutherford R (ed). Vascular Surgery. Ch. 58. 2® ed., Saunders, 1984). Similarmente, aproximadamente 20% dos pacientes que se sujeitam a endarteroctomia carótida desenvolvem hiperplasia da íntima. Têm sido divulgados resultados similares a partir de outros centros de tratamento. A hiperplasia da íntima é também muitas vezes observada associada, à cirurgia de bypass coroná rio. A hiperplasia da íntima pós-operatória e pós-angioplastica é hoje pois um problema importante na cardiologia clínica, na cirúrgia cardíaca e na cirurgia vascular.

Por exemplo, muitos pacientes com angina de peito terão de se sujeitar a repetidos procedimentos angioplásticos, e even tualmente, pode ter de se realizar uma cirúrgia de bypass coronário. Ê evidente que se se pudesse parar o desenvolvimento da hiperplasia da íntima, seria possivel poupar os pacientes a muita dor e sofrimento e, também, reduzir substancialmente os custos do tratamento.

Os biólogos vasculares têm estudado meticulosamente os mecanismos subjacentes à proliferação de células da íntima. Ê conhecido que a lesão mecânica da artéria resulta na migração de células de músculo liso da média para a íntima. Uma vez na íntima, as células começam a proliferar formando-se uma lesão da íntima que persiste durante meses. (Vêr Schwartz SM, Campbell GR, Campbell JH. Circ Res 58:427, 1986). A re-endotelialização da superfície parece ser importante para a regressão da lesão e, tanto a área endotelial envolvida como a quantidade de danos nas estruturas subendoteliais são importantes para a progressão da lesão.

A proliferação de células de músculo liso vascular é, provavelmente, controlada por factores de crescimento que, quer

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-4circulam no sangue, tais como a insulina, quer são libertados pelas células, tais como o factor de crescimento derivado de plaquetas . O último factor é sintetizado não apenas por megaca riocitos mas também por monocitos e células endoteliais (Vêr Ross R. Nev/ Engl J Med 314:488, 1986 e Ross R, Raines EW, Bowen. -Pope DP. Cell 1986:46:155-169), θ isto implica que as células inflamatórias podem participar na regulação do crescimento da parede do vaso.

Muito menos se conhece ã cerca dos factores inibidores do crescimento para células de músculo liso. A heparina, quando administrada farmacologicamente, inibe a proliferação das células de músculo liso (Vêr Clowes AV/, Karnovsky MJ. Nature 265 : :625, 1977), e tem sido sugerido que substâncias do tipo da heparina endógenas possam estar envolvidas no controlo do crescimento fisiológico. Contudo, será de notar que todos os pacientes que se sujeitam a tratamento angioplástico e cirúrgico estão sob terapia de heparina, e mesmo assim, desenvolvem uma estenose da íntima significativa.

Estudos imuno-citoquímicos recentes usando anticorpos mo. noclonais específicos do tipo de célula têm mostrado que, na pia ca arteroesclerótica estão presentes, em grande número, macrofagos derivados de monocitos. (Vêr Vedeler CA, Nyland H, Matre R: In situ characterization of the foam cells in early human atherosclerotic lesions. Acta Pathol Microbiol Immunol Scand (C) 1984:92:133-137, Aqel NM, Bali RY, V/aldman H, Mitchinson MJ: Mo. nocytic origin of foam cells in human atherosclerotic plaques. Atherosclerosis 1984:53:265-271, Jonasson L, Holm J, Skalli 0, Bondjers G, Hansson GK: Regional accumulations of T cells, macr£ phages and smooth muscle cells in the human atherosclerotic plaque. Atherosclerosis 1986:6:131-140 e Gown AM, Tsukada T, Ross R: Human atherosclerosis. II. Immunocytochemical analysis of the cellular composition of human atherosclerotic lesions. Am J Pathol 1986:125:191-207). Não são, porém, as únicas células, originadas a partir do sangue, que podem ser encontradas na pare de arterial sob circunstâncias patológicas. Os linfócitos T conEs tituem um quinto da população de células na capa fibrosa da pia69 966

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-5ca arterioesclerótica humana (Vêr Jonasson et al, Atherosclerosis 1986:6:131-140), e podem também ser observados em modelos experimentais de lesão vascular. (Vêr Jonasson L, Holm J, Hansson GK: Smooth muscle cells express Ia antigens during arterial response to injury. Lab Invest 1988:58:310-315)·

Os dados imuno-citoquímicos sugerem que os linfocitos T podem modular as propriedades de crescimento e outras funções de células de músculo liso. Nas placas arterioescleróticas, onde os linfócitos T são abundantes, muitas células de músculo li. so exprimem antigénios de complexo de histocompatibilidade prin cipal da classe II (antigénios Ia). Por outro lado, as células de músculo liso não exprimem antigénios Ia em artérias, não arterioescleróticas, normais, (vêr Jonasson L, Holm J, Skalli 0, Gabbiani G, Hansson GK: Expression of class II transplantation antigen on vascular smooth muscle cells in human atherosclerosis J Clin Invest 1985:76:125-131 e Hansson GK, Jonasson L, Holm J, Claesson-Welsh 1. Class II MHC antigen expression in the atheros clerotic plaque; smooth muscle cells express HLA-DR, HLA-DQ, and the invariant gamma chain. Clin exp Immunol 1986:64:261-268).

Tem sido mostrado que os antigénios Ia aparecem em células de músculo liso durante a resposta arterial a lesões, em ratazanas, mas não existe qualquer trabalho anterior que mostre ou sugira uma relação entre os antigénios Ia e a estenose vascular.

Estes antigénios desempenham um papel básico na apresentação de antigénios estranhos aos linfócitos T. A sua expressão por macrofagos, células endoteliais e vários outros tipos de cé. lulas, é induzido pelo interferão gama segregado pelos linfócitos T activados. (Vêr Pober JS, Gimbrone MA, Cotran RS, Reiss CS, Burakoff SJ, Piers V/, Ault KA: Ia expression by vascular en dothelium is inducible by activated T cells and by human gamma-interferon. J Exp Med 1983:157:1139-1353 e Unanue ER, Allen PM: Comment on the finding of Ia expression in non-lymphoid cells. Lab Invest 1986:55:123-125).

E conhecido que os interferões dos tipos alfa e beta, que são produzidos por leucócitos, fibroblastos e por outros tipos de células, inibem a proliferação de certos tipos de células. 0

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-6interferão gama é libertado pelos linfocitos T activados, e tem -se também mostrado que inibe a proliferação quando se adicionam meios condicionados ou preparações purificadas, a células de cul tura de vários tipos. (Vêr Rubin BY, Gupta SL: Differential effi_ cacies of human type I and type II interferons as antiviral and antiproliferative agents. Proc Natl Acad Sei USA 1980:77:5928-5932, Blalock JE, Georgiades JA, Langford NP, Johnson HM: Purified human immune interferon has more potent anticellular activi ty than fibroblast or leukocyte interferon. Cell Immunol 1980: :49:390-401 e Wahl SM, Galtely Cl: Modulation of fibroblast growth by a lymphokine of human T cell and continuous T cell line origin. J Immunol 1983:130:1226-1230). Contudo, tem sido questi£ nado se este efeito pode ou não ser devido a contaminações das preparações com linfotoxina (factor de necrose de tumor) em vez de ser devido a um efeito inibidor do próprio interferão gama.

Em resumo, seria vantajoso ser possível tratar a estenose vascular e desordens relacionadas pelo uso de preparações que inibem o crescimento de células de músculo liso.

Breve descrição da Invenção

Surpreendentemente, verificou-se agora, e este facto cons titui a base do presente invento, que o interferão gama é um ini bidor de crescimento importante para células de músculo liso em lesões da íntima bem como na arterioesclerose.

Num seu aspecto, o presente invento descreve o uso do interferão gama no processo de preparação de uma preparação farmacêutica para o tratamento da estenose vascular provocada, por exemplo, por hiperplasia da íntima.

Numa concretização deste aspecto da invenção o tratamento da estenose vascular é o tratamento da restenose, após o tratamento da estenose ou oclusão arterial.

Numa concretização preferida deste aspecto da invenção, o tratamento da estenose vascular é o tratamento da estenose arterial após angioplastia e/ou cirúrgia vascular.

Num outro aspecto do presente invento, descreve-se um mé69 966

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-7todo que usa o interferão gama no tratamento da estenose vascular provocada, por exemplo, por hiperplasia da íntima, caracterizado por se administrar o interferão gama a um paciente na for ma de uma preparação farmacêutica contendo o referido interferão numa quantidade suficiente para produzir um efeito terapêutico.

Numa concretização do referido aspecto da invenção o tratamento da estenose vascular é o tratamento da restenose após o tratamento da estenose ou oclusão arterial.

Numa concretização preferida do referido aspecto da inven. ção, o tratamento da estenose vascular é o tratamento da estenose arterial após angioplastia e/ou cirurgia vascular.

A fonte do interferão gama usado não é crítica, e este po. de ser sintético, original ou interferão gama recombinante, produzido por técnicas de ADN recombinante.

A presente preparação farmacêutica é preferivelmente admi nistrada aos pacientes por via parenteral; i.e., por injecção subcutânea, intravenosa ou intramuscular.

Os diluentes e excipientes são os usados convencionalmente em farmácia, por exemplo, uma solução salina fisiológica.

Breve Descrição das Figuras

A Pig. 1 é um gráfico que mostra o efeito de várias concentrações de interferão gama na proliferação de culturas de células de músculo liso.

A Pig. 2 é um gráfico que mostra o efeito de várias concentrações de interferão gama na indução do crescimento em culturas de células de músculo liso.

A Pig. 3 é um gráfico que mostra a duração da fase G^ do ciclo das células de músculo liso.

A Fig. 4 é um gráfico que mostra o efeito do interferão gama na replicação de células de músculo liso numa fase inicial do ciclo celular.

A Pig. 5 é um gráfico que mostra o efeito do interferão gama na expressão de I-A, em células de músculo liso, para diferentes concentrações de interferão gama.

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-8A Fig. 6 é um gráfico que mostra o efeito de dependência do tempo do interferão gama na expressão de I-A em células de másculo liso.

A Fig. 7 é um gráfico que mostra a ausência de contamina ção por endotoxina, em preparações de interferão gama usadas pa ra inibição da proliferação de células de músculo liso.

A Fig. 8 é um diagrama que mostra o grau de replicação de células de músculo liso exprimindo o I-A e células I-A negativas, respectivamente.

Descrição Detalhada da Invenção

Tem-se estudado o efeito do interferão gama recombinante em células de músculo liso arterial e verificou-se que esta linfoquina inibe a proliferação celular. Faralelamente a este efeito, verifica-se uma indução dos antigénios Ia. Deste modo, estudou-se a expressão de Ia e a replicação celular na resposta arte, rial à lesão na artéria carótida da ratazana provocada pelo cateter de balão. Obteve-se a evidência de uma correlação entre a expressão de Ia e a ausência de proliferação.

Fizeram-se esforços para identificar as populações de células que formam a placa arterioesclerótica. Deste modo, aplicaram-se anticorpos monoclonais em relação a antigénios, específicos do tipo de célula, a secção de espécimes de endarteroctomia. Verificou-se que a maior parte das células na região interior, rica em lípido, eram coradas com anticorpos em relação a antigénios de macrofago, e muitas das células da capa fibrosa foram muitas vezes coradas por anticorpos anti-músculo liso. (Vêr Jonasson L, Holm J, Skalli 0, Bondjers G, Hansson GK. Arteriosclerosis 6:131, 1986 ). Adicionalmente, e surpreendentemente, obser varam-se quantidades substanciais de linfócitos T, parti cularmen. te na capa fibrosa. Muitos deles mostravam sinais de activação,

i.e., expressão de HLA-DR, VLA-1, e de receptor de interleucina-2. (Vêr, p.e., Jonasson L, Holm J, Skalli 0, Gabbiani G, Hansson GK. J Clin Invest 76:125, 1985 e Hansson GK, Jonasson L, Holm J, Claesson-Welsh L. Clin exp Immunol 64:261, 1986).

Muitas das células de músculo liso, nestas áreas ricas em

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-9células T, exprimiram o HLA-DR (antigénios Ia) , enquanto que nunca se encontraram estes antigénios em células de músculo liso da parede arterial normal. A expressão de HLA-DR é induzida pelas células T activadas através da libertação de interferão gama (Vêr Pober JS et al. Nature 305:726, 1983 e Unanue ER, Allen PM. lab Invest 55:123, 1983). As verificações na arterioesclerose sugerem pois que o interferão gama está envolvido numa regulação de paracrina da expressão genética na placa arterioe^ clerótica. Adicionalmente, obteve-se recentemente evidência imu no-bistoquimica da presença do interferão gama na placa arterio esclerótica.

Procedimento Experimental

Usou-se um modelo animal experimental para a análise do papel dos linfócitos T na regulação da proliferação e da expre£ são genética de células de músculo liso arterial. Para este pro. pósito adaptou-se o modelo de cateter de balão desenvolvido por Baumgartner e melhorado por Clowes e Reidy. Induziram-se lesões da íntima na artéria carótida da ratazana, utilizando um cateter de balão Pogarty, e analisou-se a infiltração de tipos diferentes de leucócitos e a expressão de antigénios Ia, por imuno-histoquimica, em diferentes intervalos de tempo após a lesão.

Verificou-se, em duas semanas, uma quantidade, pequena mas significativa, de infiltração de células T, e verificou-se também que as células de músculo liso na íntima começaram a exprimir os antigénios Ia. In vitro, pôde induzir-se a expressão de Ia pelo interferão gama recombinante. Estas constatações sugerem que se liberta interferão gama, é que este afecta a expressão genética de células de músculo liso em lesões da íntima.

In vitro, o interferão gama é um inibidor eficiente da proliferação de células de músculo liso e, assim, crê-se que po£ sa servir como inibidor endógeno da proliferação de células de músculo liso, na lesão da íntima após a lesão. Por análise da re. plicação das células de músculo liso na lesão, obteve-se suporte indirecto para esta hipótese. Verificou-se que as células de mús culo suave Ia-positivas não incorporaram a ^H-timidina durante

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-10um impulso de 24 horas, 14 dias após a lesão.

Noutro conjunto de experiências, marcaram-se todas as cé_ lulas de músculo liso em replicação, com ^H-timidina, através de uma bomba osmótica introduzida na altura em que se introduziu o cateter de balão. Combinando a autoradiografia de e a coloração imuno-histoquimica para o Ia, verificou-se que as células que exprimiam o Ia na altura do sacrifício, i.e., no dia 14 após a introdução do cateter de balão, tinham sofrido significativamente menos ciclos de replicação do que as células de músculo li. so Ia-negativas. Este facto suporta a opinião de que o interferão gama é um inibidor endógeno da replicação de células de músculo liso na hiperplasia da íntima. Encorajados por estes resultados decidiu-se continuar o trabalho testando o efeito do inter ferão gama, administrado parenteralmente na resposta arterial à lesão.

Materiais e Métodos

Cultura de Células

Isolaram-se células de músculo liso aórtico de ratazana (SMCs) a partir de ratazanas Sprague-Dawley, machos com 200 g, por digestão com calagenose, e cultivaram-se em meio RDMI-1640 suplementado com soro do vitelo fetal (PCS), 100 unidades/ml de penicilina G, 100 g/ml de estreptomicina, e 50 g/ml de ácido ascórbico. Para as experiências usaram-se células de terceira a quinta passagem, e colocaram-se as células em placas de microtí.

tulo de 96 cavidades (Nunc, Roskilde, Dinamarca) para análise 2 de crescimento, ou em caixas de petri de 10 cm para análise da síntese de ADN.

Análise de crescimento

As SMCs estavam crescendo exponencialmente ou foram induzidas a entrar na fase do intervalo 1 (G·^) do ciclo celular pela adição de 10% de ECS, após 48 horas de carência de soro em 0,5% de PCS. Expuseram-se as culturas a interferão gama recombinante de ratinho (Genentech, South San Francisco, Califórnia E.U.A.) adicionado ao meio conjuntamente com 10% de FCS. Em vários instantes, fixaram-se com 4% de formaldeído num tampão acetato O,1M,

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-11ρΗ 3,1, e incubaram-se com Amido Black B para corar as proteínas das células. Removeu-se o corante não ligado, por lavagem com água destilada, e determinou-se a incorporação de corante a 620 nm num fotómetro de microtítulo EIA. Calculou-se a ligação de corante por células dividindo a absorvãncia do corante por cultura (unidades A^q) Ρθΐθ número de células por cultura, o que por sua vez foi determinado por contagem hemocitométrica de células tripsinizadas em culturas pararelas. Uma vez que existia uma variabilidade muito pequena de absorvãncia de corante por célula nestas culturas ( 2%), puderam estimar-se os números de células dividindo a absorvãncia A^q de uma dada cultura pelo coeficiente Αθ^θ/οόlulas. Não existia uma diferença significat^ va no valor de A^g/célula entre as culturas tratadas com inter ferão gama ou não tratadas. A correlação entre a cartagem microjs cópica e a análise da ligação a corante para a determinação do número de células, foi excelente (M=O,98).

Síntese cLe ADN

Determinou-se a síntese de ADN essencialmente tal como é descrito por Raines e Ross. Resumidamente, sincronizaram-se SMC, na fase do intervalo 0 (GO) tal como anteriormente se descreveu, e depois induziram-se a entrar no ciclo celular pela adição de 10% de FCS na presença ou na ausência de interferão gama, adici£ nado simultaneamente ou em vários instantes após a adição do soro. Adicionou-se H-timidina (10 >UCi/cavidade de 10 cm ) conjuntamente com FCS, e colheram-se as células por tripsinização após 24 horas. Recolheram-se em filtros Millipore de 0,22_?um (Bedford, . t

Massachusetts, E.U.A.) e analisou-se a radioactividade insolúvel em ácido tricloroacético num contador de cintilação após solubili^ Insta-gel zaçao em

Imuno-Ensaio ligado a Enzima da Expressão de Ia

Expuseram-se as SMCs, em placas de microtítulo de 96 cavi^ dades Nunc ao interferão gama, tal como aqui a seguir se descreve. Davaram-se depois as células, três vezes com BBS (solução sa lina tamponizada com fosfato, 150 mM de NaCl, 15 mM de tampão fosfato pH 7,2), e fixaram-se durante 15 minutos a 4²C com 1% de formaldeido em tampão fosfato de sódio 100 mM, pH 7,2. Lavaram-se três vezes com PBS, fizeram-se reagir com glicina 100 mM de

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-12glicina em PBS, com 0,1% de albumina de soro bovino (BSA; grau de pureza RIA, Sigma Chemical, St. Louis, Missouri, E.U.A.) durante 30 minutos a 37^QC. Após se terem lavado as células duas vezes com PBS, pré-incubaram-se durante 60 minutos a 37-C com 0,5% de soro de cavalo normal em PBS contendo 0,1% de BSA lavaram-se três vezes com PBS com 0,05% de Tween 20, e incubaram-se com os anticorpos monoclonais 0X6 e 0X17 (Seralab, Crawle Down, Sussex, GB), que detectaram respectivamente os antigénios I-A e Ι-Ξ, durante 60 minutos a 37²C, em diluições óptimas determinadas por titulação de placa de microtítulo. Removeu-se por lavagem o excesso de anticorpo, três vezes com PBS/Tween, e incubaram-se as células durante 30 minutos, com anticorpos de cabra anti-imunoglobulina G de ratinho, purificadas por afinidade, marcados com fosfatase alcalina (Jackson Lab, Avondale Pennsyl^ vania, E.U.A.) diluídos 1:1000 em PBS/BSA. Após várias lavagens com PBS/Tween incubaram-se os espécimes durante 60 minutos a 37²C numa solução de substrato contendo 1 mg/ml de substrato de fosfato de p-nitrofenilo em dietanolamina a 10%, 0,5 mM de MgC^, pH 9,8. Parou-se a reacção pela adição de NaOH 2M, e determinou-se a absorvância a 405 nm no fotómetro de microtítulo.

Experiências com Animais I

Provocou-se uma ferida na carótida de 15 ratazanas Sprague-Dawley, com 5 meses de idade, tal como anteriormente se des, creveu. Resumidamente, introduziu-se um cateter de balão Fogarty 2F nas ratazanas anestesiadas, através da artéria carótida ex terna esquerda. Insuflou-se o balão na parte próximal da carótida comum e retraiu-se o cateter na direcção da bifurcação da carótida. Repetiu-se o procedimento três vezes, e removeu-se depois o cateter, e fecharam-se a carótida externa e a ferida superficial. Mostrou-se que este procedimento remove todas as células endoteliais da área ferida e produz alguma perda de células de músculo liso da média. Infundiu-se continuamente ^H-timidina (6,7 Ci/mmole; New England Nuclear, Boston, Massachusetts, E.U.A.) em cinco ratazanas, a partir do dia da cirúrgia, utilizando uma mini-bomba osmótica intraperitoneal (Vêr Clowes AW, Schwartz SM: Significance of quiescent smooth muscle migration in the injured

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-13rat carotid artery. Circ Res 1985:56:139-145). As outras 10 ratazanas foram injectadas com ^H-timidina três vezes durante 24 horas ao 14^Q dia (Vêr Jonasson L, Holm J, Hansson GK: Smooth muscle cells express Ia antigens during arterial response to injury, Lah Invest 1988:58:310-315).

Catorze dias após a cirurgia, anestesiaram-se as ratazanas e fixaram-se as artérias carótidas por perfusão com 1/ de formaldeído em tampão fosfato, pH 7,2. Congelaram-se instantaneamente segmentos da carótida esquerda ferida e da artéria carótida direita não ferida, em azoto líquido, e cortaram-se secções de 8pm num micrótomo-criostático. Visualizou-se o antigénio de Ia, I-A, por incubação com o anticorpo monoclonal de ratinho anti-ratazana 0X6, seguida de incubação com imunoglobulina G anti-ratinho de cavalo, hiotinilada, e com um complexo de biotina-avidina-fosfatase alcalina (Vector, Burlingame, Califór nia, E.U.A.). Fixaram-se depois as secções em formaldeído, e mergulharam-se em emulsão de pesquisa nuclear NTB2 (Kodak, Rocbe ter, New York, E.U.A.). Desenvolveram-se após duas semanas, cora ram-se com hematoxilina, e examinaram-se no micróscopio óptico. Para cada animal, contaram-se 200 células em áreas correspondentes do espessamento da íntima e determinaram-se as proporções de células la-positivas e ^H-timidina-positivas.

Compararam-se os valores médios com o teste t de Student; no caso de comparações múltiplas, usou-se a carrecção de Scheffe tal como é descrito por Armitage (Vêr Armitage P: Statistical Me thods in Medicai Research. Oxford, England, Blackwell, 1971). Pa ra p<0,05 consideraram-se as diferenças significativas. Ajustaram-se curvas de regressão pelo método dos mínimos quadrados.

Resultados

A proliferação de células de músculo liso de ratazana, crescendo exponencialmente, foi inibida pela presença de interferão gama recombinante no meio de cultura. Na Fig. 1 mostra-se que a proliferação das células de músculo liso é inibida pelo in terferão gama. Expuseram-se as células de músculo liso arterial, crescendo exponencialmente, em placas de microtítulo de 96 cavidades, a doses diferentes de interferão gama murino recombinante

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-14(IFN-gama) no meio de cultura. A, B, C, D e E correspondem às concentrações do interferão gama em unidades (u)/ml de 0,1, 10, 50 e 100, respectivamente. Obteve-se uma inibição significativa com 10 unidades/ml após 4 dias de tratamento e com 50 ou 100 uni dades/ml, 2 dias após a adição do interferão. Existe uma relação dose-resposta entre a dose de interferão gama e a inibição da proliferação até 50 unidades/ml, quando se atinge um patamar.

A inibição do crescimento foi ainda mais pronunciada qua£ do se inibiu primeiro o crescimento por carência de soro, e depois se deixou iniciar o ciclo celular pela adição de FCS. Isto é demonstrado na Fig. 2, onde se mostra que a indução do crescimento está sincronizada nas culturas de músculo liso inibidas pe. lo interferão gama. A, B, C, D e E correspondem às mesmas conceri trações de interferão gama de A-E na Fig. 1. Neste caso, 10 unidades/ml de interferão gama no meio resultaram numa inibição de 50$ no crescimento, e obteve-se uma inibição significativa com uma quantidade tão pequena quanto 1 unidade/ml, após 9 dias de exposição. Obteve-se uma inibição significativa após 4 dias com 10 unidades/ml, e atingiu-se a inibição máxima com 50 unidades/ /ml.

efeito do interferão gama na replicação das células de músculo liso foi ainda elucidado pela análise da incorporação da ^H-timidina pelas células sincronizadas durante e após a entrada no ciclo celular (Vêr Fig. 3). Em primeiro lugar, determinou-se a duração da fase 0-, do ciclo celular. Parou-se o crescimento das células, em caixas de petri de 10 cm , por carência de soro, e depois induziram-se a entrar no ciclo celular pela adição de 10$ de soro de vitelo fetal. Adicionou-se ^H-timidina con. juntamente com o soro de vitelo fetal, colheram-se as células em vários intervalos de tempo, e determinou-se a radioactividade in. solúvel em ácido tricloroacético por contagem de cintilação de culturas em triplicado. Determinou-se o tempo desde a adição do soro até ao início da incorporação de ^í-timidina (i.e., o parto de inflecção da curva da Fig. 3). A fase G-^ tinha, aproximadamen. te 20 horas.

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-15Em relação à Eig. 4 mostra-se que, quando se adiciona o interferão gama conjuntamente com o soro, reduz-se a incorporação de ^H-timidina em 70$. 0 interferão gama inibe a replicação das células de músculo liso actuando num fenómeno no início da fase G-, do ciclo celular. Parou-se o crescimento das células, ^X 2 em placas de petri de 10 cm , e depois induziram-se a entrar no ciclo celular pela adição de FCS. A partir daí expuseram-se co£ tinuamente à ^H-timidina. Adicionou-se interferão gama, conjuntamente com o PCS, ou 3, 6, 9, 12 ou 15 horas mais tarde. Colhe, ram-se todas as células 24 horas depois, e determinou-se a radio, actividade insolúvel em ácido tricloroacético por contagem de cintilação de culturas em quadruplicado. 0 eixo dos x mostra o tempo desde a adição do FCS até à adição do interferão gama, com as 0 horas representando as culturas que receberam o FCS e o interferão gama simultâneamente e as 15 horas as culturas que receberam o interferão gama 15 horas após a adição do soro de vitelo fetal. No eixo dos y, 100$ representa a radioactividade do em culturas que nunca estiveram expostas ao interferão ga ma, e a radioactividade em culturas tratadas com interferão gama é dada em percentagem deste valor (média ± desvio padrão. Con. tudo se se retarda a adição do interferão gama mais do que 9 horas após a adição do soro, não se observa qualquer inibição (Vêr Fig. 4). Os resultados sugerem pois que o interferão gama actua bloqueando a transição de G_q para G^ ou num fenómeno logo no ini. cio da fase G^ do ciclo celular em células de músculo liso vasciJ lar.

interferão gama induz a expressão de antigénios Ia numa variedade de células alvo, incluindo células endoteliais e fibro blastos. Observou-se que as células de músculo liso em artérias arterioescleróticas exprimem estes antigénios (Vêr Jonasson L, Holm J, Skalli 0, Gabbiani G, Hansson GK: Expression of class II transplantation antigen on vascular smooth muscle cells in hu man atherosclerosis. J Clin Invest 1985:76:125-131), e a presença de linfócitos T em placas arterioescleróticas sugere que o ijn terferão gama libertado pelos linfócitos T pode induzir a expres^ são deste antigénio (Vêr Jonasson L, Holm J, Skalli 0, Gabbiani G, Hansson GK: Expression of class II transplantation antigen on

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-16vascular smooth muscle cells in human atherosclerosis. J Clin Invest 1985:76:125-131 e Hansson GK, Jonasson L, Holm J, Claesson-V/elsh 1: Class II MHC antigen expression in the atherosclerotic plaque; smooth muscle cells express HLA-DR, HLA-DQ, and. the invariant gamma Chain. Clin Exp Immunol 1986:64:261-268). Esta possibilidade foi agora testada expondo as células de músculo liso cultivadas ao interferão gama.

A Fig. 5 mostra que o interferão gama (IFN-gama induz a expressão de I-A, na superfície celular, de uma forma dependente da dose. Trataram-se as células, em placas de microtítulo de 96 cavidades, com interferão gama murino recombinante, em várias concentrações, durante três dias, e depois testaram-se pela técnica de imunoensaio ligado a enzima para determinar a expressão de I-A. Calculou-se a expressão de I-A por célula dividindo o valor de I-A total em cada cultura (unidades de absorvância a 405 nm) pelo número de células por cultura, tal como foi determinado por ligação a corante. I/íostram-se valores médios das cul_ turas (n=16); os coeficientes de variação foram sempre menores do que 2$.

Na Fig. 6 mostra-se a evolução com o tempo da expressão de I-A, em células de músculo liso, induzida pelo interferão ga ma. Trataram-se células, em placas de microtítulo de 96 cavidades (n=l6), com interferão gama (pequenas partículas de IFN-gama, 100 unidades/ml), e analisou-se a expressão de I-A na super fície celular por imunoensaio ligado a enzima em vários interva los de tempo após a adição do interferão gama (A). Determinou-se a expressão de I-A dividindo a expressão de I-A por cavidade (unidades de Α^θ^) pelo número de células por cavidade. Os valores de controlo (B) são obtidos a partir de células não estimulados. Os desvios padrão foram inferiores a 2?₀ em relação ao valor médio. Detectou-se a indução 40 horas após a exposição ao interferão gama e atingiu-se um patamar após 60 horas de estimulação. A evolução no tempo da indução da expressão de I-A foi claramente paralela à inibição do crescimento induzida por inter ferão gama.

Em relação à Fig. 7 mostra-se que os efeitos do interferão gama no crescimento e na expressão de I-A não são devidos a

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-17endotoxinas contaminantes, uma vez que a inibição de endotoxina pela polimixina B adicionada conjuntamente com o interferão gama, não afectou os resultados. As células com o crescimento sin. cronizado foram incubadas com interferão gama recombinante em várias concentrações, com (B) ou sem (A) a adição de polimixina B (50/4g/ml). Apresentam-se os valores médios de 16 culturas em placas de microtítulo de 96 cavidades; o coeficiente de variação foi inferior a 2%. P_m refere-se à polimixina B. Os efeitos no crescimento e na expressão de Ia obtidos com o interferão ga ma de ratinho (produzido por Genentech) foram idênticos aos obtidos com interferão gama de ratazana recombinante (produzido pela Holland Biotechnology). Em contraste, o interferão gama humano não induziu a expressão de Ia em células de ratazana.

As observações in vitro da inibição simultânea, induzida pelo interferão gama, da proliferação celular e da expressão do antigénio I-A sugeriu o teste da hipótese de que a inibição do crescimento e a expressão de I-A são fenómenos relacionados tam bém in vivo. Deste modo, a proliferação de células de músculo liso na artéria carótida de ratazana foi induzida pela lesão pro. vocada pelo cateter de balão, e todas as células em replicação, desde a altura da lesão em diante, foram marcadas com ^H-timidina, continuamente adicionada utilizando uma bomba osmótica. Analisou-se a replicação celular e a expressão de I-A 14 dias após a lesão quando o espessamento da íntima está estabelecida mas a proliferação ainda continua. Os resultados são apresentados na Tabela I seguinte.

Tabela I

Replicação celular e Expressão de I-A em lesões da íntima proliferativas durante o dia 14 no período de marcação com ^H-timidina.

	^H-timidina⁺	^H-timidina
I-A ⁺	1,3 (1,4)	9,6 (6,2)
I-A	80,6 (4,1)	8,5 (8,9)

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-18Valores em percentagem do número total de células, média

- desvio padrão entre parenteses.

Das células de músculo liso da íntima, 81,9% eram Aí-timidino-positivas, indicando que tinham sofrido pelo menos um ci. cio de replicação celular. 0 I-A, detectável foi imunocitoquimi ca, foi expresso em 10,9% das células. Enquanto que a maioria de todas as células de músculo liso da íntima foi marcada com Aí-timidina, apenas um oitavo das células I-A positivas eram Aí-timidino-positivas. Entre as células de músculo liso ^í-timi dino-negativas, mais do que metade eram I-A positivas.

Durante o décimo quarto dia após a cirúrgia analisou-se também a correlação entre a replicação de ADN e a expressão de

I-A, injectando Aí-timidina na forma de um impulso na 24ê hora imediatamente antes dos animais serem mortos. Neste caso, 25,5% das células eram Aí-timidino-positivas, mas nenhuma destas célii las exprimiu o I-A. Estes resultados são apresentados na Tabela

II.

Tabela II

Replicação celular e a Expressão de Ia em lesões íntimas proliferativas durante a 24® hora do período de marcação _com ^Η-timidina_ ^H-timidina⁺

I-A⁺ 0 (0)

I-A” 25,5(4,2) ^H-timidina 5,8 (2,2) 68,7 (6,4

Valores em percentagem do número total de células, o valor médio - o desvio padrão entre parenteses.

A correlação inversa entre a replicação de ADN e a expre£ são de I-A sugeriu que o mecanismo que induz a expressão de I-A inibe também a proliferação. Esta ideia foi apoiada por uma análise detalhada dos audiogramas obtidos a partir de ratazanas mar cadas pelo regime da bomba osmótica no dia 14. Em relação à Fig. 8 mostra-se que as células de músculo liso exprimindo I-A sofrem

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-19menos replicações do que as I-A-negàtivas na neo-íntima durante a resposta à lesão. A lesão arterial foi inflingida pela introdução do cateter de balão na carótida das ratazanas, e as células em replicação foram marcadas com ^H-timidina continuamente infundida utilizando as bombas osmóticas, durante 14 dias. A ex pressão de I-A foi determinada por imunocitoquimica e a incorpo_ ração da ^H-timidina por auto-radiografia da mesma secção. Contou-se o número de grãos de prata sobre as células I-A positivas e I-A negativas em quatro lesões (50 células I-A pos.i tivas e 50 células I-A negativas por lesão). Uma vez que não exi£ tia diferença significativa entre os animais, reuniram-se os valores de todas as cinco lesões para a análise estatística. A diferença nos grãos de prata entre as células I-A positivas e I-A negativas é diferente para p<0,01, e na figura indicam-se os valores médios - o desvio padrão. Na população de células proliferantes marcadas com 3H-timidina, o número nédio de grãos de prata por núcleo foi quase duas vezes mais elevado nas células I-A negativas, quando comparado com o das células I-A positivas. Será de esperar que se acumule nas células mais ^H-timidina com cada ciclo de proliferação adicional e o número de grãos por célula está fortemente relacionado com a radioactividade por célula. A diferença entre as células de músculo liso I-A positivas e I-A negativas implica deste modo que as células I-A positivas tivessem sofrido menos ciclos da sintese de ADN do que as células de músculo liso que não exprimiram o

I-A (para uma discussão deste tipo de análise, vêr Clowes AW, Schwartz SM: Significance of quiescent smootb muscle migration in the injured rat carotid artery. Circ Res 1985:56:139-145).

Experiências com animais II

Realizou-se uma experiência piloto in vivo, que inclui oito ratazanas Sprag e-Dawley machos com 400 g. Infligiu-se uma lesão íntima na artéria carótida comum com um cateter de balão Fogarty 2F, tal como anteriormente se descreveu. Quatro das ratazanas receberam interferão gama, recombinante, de ratazana com uma dose diária de 200000 U S.C. durante sete dias e as outras quatro ratazanas foram injectadas com o mesmo volume de veículo (solução de cloreto de sódio).

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-20Sacrificaram-se todas as ratazanas catorze dias após a introdução do cateter de balão, e fixaram-se por perfusão com 1% de paraformaldeído em tampão fosfato. Embeberam-se as carótidas operadas (esquerda) e não operada (direita) em meio OCT e congelaram-se instantaneamente em n-hexano/azoto líquido. Cortaram-se secções de lO^um no criostato de 100 em lOOyjlni θ a área ocupada pela neo-intima foi determinada por morfometria usando o método do ponto de amostragem. Na Tabela III resumem-se os resultados obtidos

Tabela III

Neo-intima em ratazanas tratadas com interferão gama e em ratazanas de controlo

Tratamento	n	a	d. p.	P
IPN-gama	4	2,30	1,00	<0,01
Controlo	4	4,80	0,50
n é o número micrómetros	de ratazanas quadrados. A	e a é ánalise	a área transversal em estatística foi feita

pelo teste do t de Student.

E óbvio que o tratamento com interferão gama inibiu significativamente o espessamento da íntima e é notável que esta inibição tivesse persistido uma semana após o fim do tratamento com interferão gama. Este facto apoia a hipótese de que as células de média estão envolvidas na replicação e na migração num instante crítico após a lesão. A inibição da proliferação neste instante parece reduzir persistentemente a dimensão da le. são.

As experiências anteriores mostram claramente o efeito inibidor do interferão gama na replicação de células de músculo liso.

Deste modo, pode usar-se o interferão gama para o tratamento da estenose vascular provocada, por exemplo, por hiperpla sia da íntima, e numa concretização preferida, para o tratamento da estenose arterial após cirúrgia vascular e/ou angioplas tia. 0 interferão gama deverá ser administrado a um paciente na

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-21forma de uma preparação farmacêutica contendo, o referido inter ferão numa quantidade suficiente para produzir um efeito terapêu. tico. A dose real e o período de tratamento requeridos num caso específico serão decididos pelo médico assistente. A dose deverá ser suficiente para induzir a expressão dos antigénios MHC da classe II em células alvo, por exemplo, em queratinocitos.

interferão gama é aqui definido como sendo um polipeptídeo com a sequência do interferão gama original tal como se descreve na Patente Europeia n2 77670 e todas as sequências de aminoácidos ou outras suas variantes que são capazes de inibir a estenose pelos métodos que aqui se descrevem ou pelos seus análogos usando células de outros animais. Exemplos destas vari antes são os alelos ou os produtos de mutagénese dirigida a cer tos locais, caracterizada por se eliminarem, inserirem ou substituírem resíduos de aminoácidos. Por exemplo, vêr a Patente Eu. ropeia n^. 146354. Para terapia veterinária deverá usar-se um interferão gama que seja homólogo ou activo na espécie animal a ser tratado. Em terapia humana deverá usar-se a variante desCys Tyr Cys da sequência que se mostra na patente Europeia 77670 e, facultativamente, a variante C-terminal na qual são eliminados os últimos quatro resíduos no processamento pós-tradução. 0 interferão gama com sequências originais pode ser obtido por puri. ficação a partir de fontes naturais usando métodos conhecidos. Pode obter-se a mesma molécula ou suas variantes a partir de fontes recombinantes, também por métodos conhecidos.

Uma formulação típica contém interferão gama (20 x 10f6) em 1,0 ou 0,2 mg/ml, ácido succínico 0,27 mg/ml, hexa-hidrato de succinato de dissódio 0,73 mg/ml, manitol 40 mg/ml, polissor bato 20 0,1 mg/ml e qs até 1 g de água para injecção/ml a pH 5,0. Esta formulação aquosa é administrada em doses terapêuticas que serão inferiores às doses máximas toleradas em humanos tal como é determinado pelo clínico. 0 interferão gama pode também ser administrado a partir de uma preparação liofilizada reconstituída.

interferão gama é administrado por qualquer via conven cional que dirigirá uma dose terapêutica para o local da lesão

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-22da íntima, por exemplo, por vias de administração intravenosa ou intrapulmonar (Patente Europeia n2. 257956). A administração pode ser por infusão contínua ou por dose de bolo suficiente pa ra manter os níveis terapêuticos. 0 interferão gama deverá ser usado pelo menos no decorrer dos acontecimentos que conduzem à estenose, se possível, e continua-se depois a administração por um período suficiente para permitir a cicatrização adequada da vasculatura, tipicamente de cerca de 3 a 10 dias tal como for determinado pelo clínico.

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Claims

1 - Processo de preparação de uma preparação farmacêutica para o tratamento da estenose vascular, caracterizado por se misturar diluente(s) e/ou excipiente(s) com uma quantidade sufi, ciente de gama-interferão para produzir un efeito terapêutico.

2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se usar como diluente uma solução salina fisiológica.

3 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por a preparação farmacêutica ser reconstituída a partir de uma preparação liofilizada preparada de acordo com as reivindicações anteriores.

4 - Processo de preparação de uma preparação farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracteri. zado por se misturar 0,2-1,0 mg/ml de gama-interferão com 0,27 mg/ml de ácido succínico, 0,73 mg/ml de hexa-hidrato de succina to de dissódio, 40 mg/ml de manitol, 0,1 mg/ml de poli-sorbato 20 qs a 1 g de água para injecção/ml a pH 5·