SE462364B - Anvaendning av gamma-interferon foer beredning av ett preparat foer behandling av vaskulaer stenos - Google Patents

Description

462 364 2 Alla manipuleringar av de större kärlen, antingen det gäller konventionell kirurgi eller angioplastiska förfaranden, besväras emellertid av den frekventa upp- komsten av intimahyperplasi, som leder till restenos 5 av artären. Ungefär 30% av alla patienter som genomgår perkutan, transluminal koronarangioplastik vid Sahlgrenska Sjukhuset, Göteborg, Sverige, utvecklar t ex intimale- sioner, som ger upphov till ischemiska symptom.

Problemet observeras också efter konventionell 10 kärlkirurgi. Rekonstruktiv kirurgi av artärerna, vilka förser de nedre extremiteterna med blod följs, i 50% av alla fall, av en upprepning av de ischemiska symp- tomen, på grund av intimalesioner. (Se Rutherford R (ed). Vascular Surgery. Ch. 58. 2nd ed., Saunders, 1984.) 15 På liknande sätt utvecklar ca 20% av alla patienter, vilka genomgår endarterektomi i a. carotis, intimahyper- plasi. Liknande resultat har rapporterats från flera andra behandlingscentra. Intimahyperplasi observeras också ofta i samband med bypass-kirurgi i hjärtats krans- 20 artärer. Postoperativ och "postangioplastisk“, intima- hyperplasi är idag således ett stort problem inom klinisk kardiologi, hjärtkirurgi och kärlkirurgi. Många patienter med angina pektoris måste t ex genomgå upprepade angio- plastiska behandlingar och eventuellt måste bypass-kirur- 25 gi utföras i hjärtats kransartärer. Det står klart att om man skulle kunna hejda utvecklingen av intimahyper- plasi, skulle man kunna bespara patienter mycket smärta och lidande, och också reducera behandlingskostnaderna väsentligt. ' 30 Den mekanism som ligger bakom intimal celltillväxt har studerats noggrant av kärlbiologer. Det är känt att mekaniska skador på artären resulterar i invandring av glatta muskelceller från medialagret till intiman.

Väl i intiman börjar cellerna förökas och bildar en 35 intimalesion, vilken består under månader. (Se Schwartz SM, Campbell GR, Campbell JH. Circ Res 58:427, 1986.) Reendotelialisering av ytan tycks vara viktig för att 10 15 20 25 30 35 462 364 3 r få en återgång av lesionen och såväl den involverade endotelytan som storleken på skadan av subendoteliala strukturer är viktig för hur lesionen fortskrider.

Tillväxten av vaskulära, glatta muskelceller kon- trolleras troligen av tillväxtfaktorer, vilka antingen cirkulerar i blodet, såsom insulin, eller frigöres från celler, såsom tillväxtfaktorn erhållen från blodplättar.

Denna senare faktor syntetiseras inte enbart av mega- karyocyter utan också av monocyter och endoteliska celler (se Ross R. New Engl J Med 3l4:488, 1986 och Ross R, Raines EW, Bowen-Pope DF. Cell l986:46:155-169), och detta antyder att inflammatoriska celler kan delta i tillväxtregleringen i kärlväggen.

Mycket mindre är känt om de tillväxthämmande fak- torerna för glatta muskelceller. Heparin, som admini- streras farmakologiskt, hämmar tillväxt av glatta muskel- celler (se Clowes AW, Karnovsky MJ. Nature 265:625, 1977), och det har antytts att endogena, heparinlik- nande substanser kan vara involverade i den fysiologiska tillväxtkontrollen. Det bör emellertid noteras att samt- liga patienter, vilka genomgår angioplastiska och kirur- giska behandlingar genomgår heparinterapi och trots detta utvecklar de betydande intimastenoser.

Nyligen gjorda immunocytokemiska studier, med ut- nyttjande av cellspecifika, monoklonala antikroppar, har visat att makrofager, som härstammar från monocyter, finns närvarande i stora mängder i den aterosklerotiska placken. (Se Vedeler CA, Nyland H, Matre R: In situ characterization of the foam cells in early human athero- sclerotic lesions. Acta Pathol Microbiol Immunol Scand (C) l984:92:l33-137, Aqel NM, Ball RY, Waldman H, Mitchin- son MJ: Monocytic origin of foam cells in human athero- sclerotic plaques. Atherosclerosis l984:53:265-271, Jonasson L, Holm J, Skalli O, Bondjers G, Hansson GK: Regional accumulations of T cells, macrophages and smooth muscle cells in the human atherosclerotic plaque. Athero- sclerosis l986:6:l31-140 och Gown AM, Tsukada T, Ross R: 462 364 10 15 20 25 30 35 4 Human atherosclerosis. II. Immunocytochemical analysis of the cellular composition of human atherosclerotic lesions. Am J Pathol 1986:l25:191-207.) De är emeller- tid inte de enda blodburna cellerna som man kan hitta i artärväggen under patologiska omständigheter. T-lymfo- cyter utgör en femtedel av cellpopulationen i den fibrösa kapseln till den mänskliga, aterosklerotiska placken (se Jonasson et al, Atherosclerosis l986:6:l3l-140), och de kan också observeras vid experimentella modeller av kärlskador. (Se Jonasson L, Holm J, Hansson GK: Smooth muscle cells express Ia antigens during arterial response to injury. Lab Invest l988:58:310-315.) Immunocytokemiska data antyder att T-celler kan förändra tillväxtegenskaperna och andra funktioner hos glatta muskelceller. I aterosklerotiska plackar, i vilka T-celler finns i stor mängd, uttrycker många glatta muskelceller histokompatibilitetsantigener av klass II-typ (Ia-antigen). Däremot saknar glatta muskelceller Ia-antigen i nonaterosklerotiska, normala artärer. (Se Jonasson L, Holm J, Skalli 0, Gabbiani G, Hansson GK: Expression of class II transplantation antigen on vascu- lar smooth muscle cells in human atherosclerosis. J Clin Invest l985:76:125-131 och Hansson GK, Jonasson L, Holm J, Claesson-Welsh L. Class II MHC antigen expres- sion in the atherosclerotic plaque; smooth muscle cells express HLA-DR, HLA-DQ, and the invariant gamma chain.

Clin exp Immunol l986:64:26l-268.) Det har visat sig att Ia-antigen uppträder på glatta muskelceller vid artärens svar på skada hos råttor, men det finns inget tidigare arbete som visar eller föreslår en koppling mellan Ia-antigen och vaskulär stenos.

Dessa antigen spelar en grundläggande roll då T- -celler utsättes för främmande antigen. Deras expres- sion induceras i makrofager, endotelceller och flera andra celltyper av gamma-interferon, vilket utsöndras av aktiverade T-celler. (Se Pober JS, Gimbrone MA, Cotran 10 15 20 25 30 35 46-2 364 _ 5 RS, Reiss CS, Burakoff SJ, Fiers W, Ault KA: Ia expression by vascular endothelium is inducible by activated T cells and by human gamma-interferon. J Exp Med l983:l57: 1139- -1353 och Unanue ER, Allen PM: Comment on the finding of Ia expression in non-lymphoid cells. Lab Invest 1986: 55:l23-125.) Interferon av alfa- och beta-typ, som produceras av leukocyter, fibroblaster och andra celltyper, är kända för att hämma tillväxt av vissa celltyper. Gamma- -interferon frigöres av aktiverade T-celler och det har också visats hämma tillväxt då konditionerade medier eller renade beredningar tillsättes odlade celler av olika typer, såsom bröstkörtelceller och fibroblaster.

(Se Rubin BY, Gupta SL: Differential efficacies of human type I and type II interferons as antiviral and anti- proliferative agents. Proc Natl Acad Sci USA 1980: 77: 5928-5932, Blalock JE, Georgiades JA, Langford NF, Johnson HM: Purified human immune interferon has more potent anticellular activity than fibroblast or leukocyte inter- feron. Cell Immunol 1980:49:390-401 och Wahl SM, Galtely CL: Modulation of fibroblast growth by a lymphokine of human T cell and continuous T cell line origin. J Immunol l983:l30:l226-1230.) Emellertid har det ifråga- satts om denna effekt är orsakad av föroreningar i be- redningarna med lymfotoxin (tumörnekrosfaktor) snarare än en hämmande effekt av gamma-interferon självt.

Sammanfattningsvis vore det fördelaktigt att kunna behandla vaskulär stenos och därmed förknippade sjukdomar med hjälp av beredningar, vilka hämmar tillväxten av glatta muskelceller.

Kort beskrivning av uppfinningen Det har nu överraskande visat sig, och detta utgör basen för föreliggande uppfinning, att gamma-interferon är en viktig tillväxthämmare av glatta muskelceller vid intimalesioner liksom vid ateroskleros. 462 364 10 15 20 25 30 35 6 En aspekt av föreliggande uppfinning tillhanda- håller användningen av gamma-interferon för beredning av ett farmaceutiskt preparat för behandling av vaskulär stenos, vilken orsakats av t ex intimahyperplasi.

I ett utförande av denna aspekt av uppfinningen är behandlingen av vaskulär stenos en behandling av restenos till följd av en behandling av arteriell ste- nos eller ocklusion.

I ett föredraget utförande av denna aspekt av upp- finningen är behandlingen av vaskulär stenos behand- lingen av arteriell stenos till följd av angioplastik och/eller kärlkirurgi.

En annan aspekt av föreliggande uppfinning till- handahåller en metod för användning av gamma-interferon för behandling av vaskulär stenos, vilken orsakats av t ex intimahyperplasi, varvid gamma-interferon admini- streras till en patient som en farmaceutisk beredning innehållande nämnda interferon i en tillräcklig mängd för att ge en terapeutisk effekt.

I ett utförande av denna aspekt av uppfinningen är behandlingen av vaskulär stenos behandlingen av res- tenos som följd av behandlingen av arteriell stenos eller ocklusion.

I ett föredraget utförande av denna aspekt av upp- finningen är behandlingen av vaskulär stenos behand- lingen av arteriell stenos som följd av angioplastik och/eller kärlkirurgi.

Den gamma-interferonkälla som utnyttjas är inte kritisk utan kan utgöras av syntetiskt, nativt eller rekombinant gamma-interferon, framställt med hjälp av rekombinant DNA-teknik.

Föreliggande farmaceutiska preparat ges företrädes- vis till patienter genom parenteral administrering; dvs genom subkutan, intravenös eller intramuskulär injek- tion.

Utspädningsmedel och konstituenter är de som konven- tionellt användes inom farmacin, t ex en fysiologisk koksaltlösning. 10 15 20 25 30 35 462 564 7 Kort beskrivning av ritningarna Fig 1 är en kurva som visar effekten av olika kon- centrationer av gamma-interferon pà tillväxten av glatta muskelceller.

Fig 2 är en kurva som visar effekten av olika kon- centrationer av gamma-interferon på tillväxtinduktionen av glatta muskelcellkulturer.

Fig 3 är en kurva som visar längden av G1-fasen hos den glatta muskelcellens cellcykel.

Fig 4 är en kurva som visar effekten av gamma-inter- feron på replikationen av glatta muskelceller i ett tidigt stadium av cellcykeln.

Fig 5 är en kurva som visar effekten av gamma-inter- feron på I-A-expressionen i glatta muskelceller vid olika gamma-interferonkoncentrationer.

Fig 6 är en kurva som visar den tidsberoende effek- ten av gamma-interferon på I-A-expressionen i glatta muskelceller.

Fig 7 är en kurva som visar frånvaron av endotoxin- kontamination i gamma-interferonberedningarna som an- vänds för hämning av tillväxten av glatta muskelceller.

Fig 8 är ett diagram som visar replikationens om- fattning hos I-A-uttryckande, resp I-A-negativa glatta muskelceller.

Detaljerad beskrivning av uppfinningen Effekten av rekombinant gamma-interferon pà odlade, arteriella, glatta muskelceller har studerats och det har funnits att denna lymfokin hämmar celltillväxten.

Denna effekt erhålles samtidigt med en induktion av I-A-antigen. Därför studerades I-A-expression och cell- replikation vid artärens svar på skada med ballongka- teter i halspulsådern hos råtta. Bevis på en korrela- tion mellan I-A-expression och upphörd celltillväxt erhölls.

Försök gjordes att identifiera de cellpopulationer 462 364 10 15 20 25 30 35 8 som bildar den aterosklerotiska placken. Monoklonala antikroppar mot cellspecifika antigen applicerades där- för på snitt av vävnadsbitar som avlägsnats vid endar- terektomi. De flesta cellerna i den centrala delen be- fanns färgas med antikroppar mot makrofagantigen och de i den fibrösa kapseln färgades ofta med anti-glatt- muskelcellantikroppar. (Se Jonasson L, Holm J, Skalli O, Bondjers G, Hansson GK. Arteriosclerosis 6:l3l, 1986.) Dessutom, och vilket är mera överraskande, observerades väsentliga mängder T-lymfocyter, speciellt i det fiber- haltiga höljet. Många av dem visade tecken på aktivering, dvs expression av HLA-DR, VLA-l och interleukin-2-recep- torn. (Se t ex Jonasson L, Holm J, Skalli O, Gabbiani G, Hansson GK. J Clin Invest 76:l25, 1985 och Hansson GK, Jonasson L, Holm J, Claesson-Welsh L. Clin exp Immunol 64:26l, 1986.) Många glatta muskelceller i dessa T-cellrika områden uttryckte HLA-DR (I-A-antigen), medan sådana antigen aldrig fanns pà glatta muskelceller i väggen till den normala artären. HLA-DR-expression induceras av akti- verade T-celler via frigöring av gamma-interferon (se Pober JS et al. Nature 305:726, 1983 och Unanue ER, Allen PM. Lab Invest 55:l23, 1983). Upptäckterna avseende ateroskleros antyder således att gamma-interferon är involverad i en parakrin reglering av genexpressionen i den aterosklerotiska placken. Vidare har man nyligen erhållit direkta, immunohistokemiska bevis pâ närvaron av gamma-interferon i den aterosklerotiska placken.

Experimentellt förfarande En experimentell djurmodell utnyttjades för analys av T-lymfocyternas roll vid reglering av förökningen av arteriella, glatta muskelceller och genexpression.

Ballongkatetermodellen, vilken utvecklats av Baumgartner och förbättrats av Clowes och Reidy anammades för detta syfte. Intimalesioner inducerades i halspulsådern hos råtta med hjälp av en Fogarty ballongkateter och infilt- 10 15 20 25 30 35 462 364 9 rationen av olika typer av leukocyter och expressionen av I-A-antigen analyserades genom immunohistokemi vid olika tidpunkter efter skadan.

En liten, men signifikant mängd T-cellinfiltration fann man efter 2 veckor och man fann också att glatta muskelceller i intiman började uttrycka I-A-antigen.

In vitro kunde I-A-expression induceras med hjälp av rekombinant gamma-interferon. Dessa upptäckter antyder att gamma-interferon frigöres och påverkar genexpressio- nen hos glatta muskelceller vid intimalesioner.

In vitro är gamma-interferon en effektiv tillväxt- hämmare för glatta muskelceller och det anses därför att det kan tjäna som endogen inhibitor av tillväxten av glatta muskelceller i intiman efter en skada. In- direkt stöd för denna hypotes erhölls genom analys av replikationen av glatta muskelceller i lesionen. Man fann att I-A-positiva, glatta muskelceller inte tog upp 3H-tymidin under en 24 h-period 14 dagar efter en skada.

I en andra uppsättning experiment märktes alla replikerande, glatta muskelceller med 3H-tymidin, via en osmotisk pump, som införts vid tiden för behandlingen med ballongkateter. Med hjälp av kombinerad 3H-auto- radiografi och immunohistokemifärgning av I-A fann man att celler som uttryckte I-A vid avdödningstiden, dvs 14 dagar efter behandlingen med ballongkateter. hade genomgått väsentligt färre replikationscykler än I-A- -negativa, glatta muskelceller. Detta stödde antagandet att gamma-interferon är en endogen inhibitor av replika- tionen av glatta muskelceller vid intimahyperplasi.

Stärkt av dessa resultat bestämdes att arbetet skulle fortgå genom test av effekten av parenteralt administrerat gamma-interferon på artärens svar på en skada.

Material och metoder Cellkultur Glatta muskelceller (SMC) från rått-aorta isolerades från 200 g:s Sprague-Dawley hanråttor genom kollagenas- 462 364 10 15 20 25 30 35 10 digestion och fick växa i RPMI-1640-medium, vilket komp- letterats med fetalt kalvserum (FCS), 100 enheter/ml penicillin G, 100 pg/ml streptomycin och 50 pg/ml askor- binsyra. Celler i tredje till femte passagen användes för experimenten och de placerades i 96-brunnars mikro- titerplattor (Nunc, Roskilde, Danmark) för tillväxt- analys eller i 10 cm2 petriskàlar för analys av DNA- -syntes.

Eillyëëëëaalyë SMC-celler läts antingen växa exponentiellt eller inducerades att komma in i gap 1 (Gl)-fasen i cellcykeln genom tillsats av 10% FCS efter 48 h "serumsvält" i 0,5% FCS. Kulturerna exponerades för rekombinant mus- gamma-interferon (Genentech, South San Francisco, Kali- fornien), vilket tillsattes mediet tillsammans med 10% FCS. Vid olika tidpunkter fixerades de med 4%-ig form- aldehyd i en 0,1 M acetatbuffert, pH 3,1 och inkuberades med Amido Black B för färgning av cellproteinerna. Icke bundet färgämne tvättades bort med hjälp av destillerat vatten och färgupptagningen bestämdes vid 620 nm med hjälp av en EIA-mikrotiterfotometer. Färgbindningen per cell beräknades genom dividering av färgabsorbansen per kultur (A620 enheter) med celltalet per kultur, vilket i sin tur bestämdes genom hemocytometrisk räkning av trypsinbehandlade celler i parallellkulturer. Eftersom det förekom mycket liten variation av färgabsorbansen per cell i dessa kulturer (mindre än 2%) kunde celltalen beräknas genom dividering av A620-absorbansen för en given kultur med koefficienten A620/cell. Det förelåg ingen väsentlig skillnad i A620/cell mellan gamma-inter- feronbehandlade och obehandlade kulturer. Korrelationen mellan mikroskopisk räkning och färgbindningsanalysen för bestämningen av celltalen var utmärkt (r = 0,98).

Qäêzâyëêêä DNA-syntes bestämdes väsentligen såsom beskrivits av Éaines och Ross. Kortfattat, synkroniserades SMC i gap 0-fasen (G0), såsom beskrivits ovan, och de induce- rades därefter att gå in i cellcykeln genom tillsats H 10 15 20 25 30 35 462 364 ll av 10% FCS i närvaro eller frånvaro av gamma-interferon, vilket tillsattes samtidigt med eller vid olika tidpunk- ter efter tillsatsen av serum. 3H-tymidin (10 uCi/10 cmz brunn) tillsattes tillsammans med FCS och cellerna skör- dades genom trypsinbehandling efter 24 h. De uppsamlades på 0,22 um Milliporfilter (Bedford, Massachusetts) och triklorättiksyra-olöslig radioaktivitet analyserades i en scintillationsräknare efter solubilisering i Insta- -gel l®.

Eazzlis:Lia1s§§_l1flm2129§§§ëy_§y_l:Ixeëelzsëëiea SMC i 96-brunnars mikrotiterplattor (Nunc) expone- rades för gamma-interferon, såsom kommer att beskrivas nedan. Cellerna tvättades därefter tre gånger med PBS (fosfatbuffrad, koksaltlösning, 150 mM NaC1, 15 mM fosfat- buffert, pH 7,2) och fixerades under 15 min vid 4°C med 1%-ig formaldehyd i 100 mM natriumfosfatbuffert, pH 7,2.

De tvättades tre gånger med PBS, läts reagera med 100 mM glycin i PBS med 0,l% bovint serumalbumin (BSA: RIA- -kvalitet, Sigma Chemical, St. Louis, Missouri) under 30 min vid 37°C. Efter det att cellerna tvättats två gånger i PBS förinkuberades de under 60 min vid 37°C med 0,5% normalt hästserum i PBS innehållande 0,l% BSA, tvättades tre gånger med PBS med 0,05% Tween-20 och inkuberades med de monoklonala antikropparna OX6 och OX17 (Seralab, Crawle Down, Sussex, UK), som detekterar I-A- resp I-E-antigen efter 60 min vid 37°C, vid optimala utspädningar, vilka bestämts med hjälp av "checkerboard"- -titrering. överskott av antikroppar tvättades bort genom sköljning tre gånger med PBS/Tween och cellerna inkuberades under 30 min med alkaliskt-fosfatas-märkta, affinitetsrenade, getanti-musimmunoglobulin G-antikroppar (Jackson Lab, Avondale, Pennsylvania) som utspätts l:1000 i PBS/BSA. Efter PBS/Tween-tvättarna, inkuberades arterna under 60 min vid 37°C i en substratlösning innehållande 1 mg/ml p-nitrofenylfosfatsubstrat i 10% dietanolamin, 0,5 mM MgCl2, pH 9,8. Reaktionen stoppades genom tillsats av 2 M Na0H och absorbansen vid 405 nm bestämdes i mikro- titerfotometern. 462 10 15 20 25 30 35 564 12 9i2§s§es§¿æ§§§_l Femton 5 mån gamla Sprague-Dawley råttor utsattes för en skada på halspulsàdern, såsom beskrivits tidigare.

Kortfattat, infördes en Fogarty 2F ballongkateter via vänstra, yttre halspulsàdern på sövda råttor. Ballongen blåstes upp i den proximala delen av den gemensamma halspulsàdern och katetern drogs tillbaka mot halspuls- åderns förgrening. Detta förfarande upprepades tre gånger och katetern avlägsnades därefter och den yttre pulsådern och det ytliga såret syddes igen. Detta förfarande har visat sig avlägsna samtliga endotelceller i det skadade området och ge vissa förluster av glattmuskelceller från median. 3H-tymidin (6,7 Ci/mmol; New England Nuclear, Boston, Massachusetts) insprutades kontinuerligt i fem råttor, från och med dagen för det kirurgiska ingreppet, via en intraperitoneal, osmotisk minipump (se Clowes AW, Schwartz SM: Significance of quiescent smooth muscle migration in the injured rat carotid artery. Circ Res l985:56:l39-145). De andra 10 råttorna injicerades med 3H-tymidin tre gånger under 24 h på dag 14 (se Jonasson L, Holm J, Hansson GK: Smooth muscle cells express Ia antigens during arterial response to injury, Lab Invest l988:58:3l0-315). 14 dagar efter det kirurgiska ingreppet sövdes råttorna och halspulsådrarna fixerades genom perfusion med 1% formaldehyd i fosfatbuffert, pH 7,2. Segment innehållande den skadade vänstra och icke skadade högra halspulsàdern snabbfrystes i flytande kväve och 8 pm snitt framställdes i en kryostatmikrotom. Ia-antigenet I-A visualiserades genom inkubering med monoklonala anti-rått-antikroppar av mus OX6 följt av biotinmärkt anti-mus-immunoglobulin G av häst och ett biotin-avidin- -alkaliskt fosfataskomplex (Vector, Burlingame, Kali- fornien). Snitten fixerades därefter i formaldehyd och doppades ner i NTB2-emulsion för att spåra radioaktivitet (Kodak, Rochester, New York). De framkallades efter två veckor, färgades med hematoxylin och undersöktes f) 10 15 20 25 30 35 462 364 13 i ljusmikroskop. För varje djur räknades 200 celler i motsvarande områden med intimaförtjockning och andelarna I-A-positiva och 3H-tymidin-positiva celler bestämdes.

Medelvärden jämfördes med Student's t-test, vid multipel jämförelse utnyttjades Scheffe's korrektion såsom beskrivits av Armitage (se Armitage P: Statis- tical Methods in Medical Research. Oxford, England, Blackwell, 1971). Differenser ansågs signifikanta vid p < 0,05. Regressionslinjer skattades med hjälp av minsta kvadratmetoden.

Resultat Förökningen av exponentiellt växande, glatta muskel- celler från råtta inhiberades genom närvaro av rekombi- nant gamma-interferon i odlingsmediet. Med hänvisning till fig 1 visas att tillväxten av glatta muskelceller hämmas av gamma-interferon. Exponentiellt växande, arte- riella, glatta muskelceller i 96-brunnars mikrotiter- plattor utsattes för olika doser av rekombinant, murint gamma-interferon (gamma-IFN) i kulturmediet. A, B, C, D och E motsvarar koncentrationerna av gamma-interferon i enheter (u)/ml av 0, l, 10, 50 resp 100. Signifikant hämning erhölls med l0 enheter/ml efter 4 dagars behand- ling och med 50 eller 100 enheter/ml 2 dagar efter inter- ferontillsats. Det förelåg ett dos-responsförhàllande mellan gamma-interferondos och hämning av tillväxten upp till 50 enheter/ml, då en platå uppnåddes.

Hämningen av tillväxten var än mer uttalad då cel- lerna först tillväxthämmades genom serumsvält, och där- efter fick gå in i cellcykeln genom tillsats av FCS.

Detta demonstreras av fig 2, som visar att tillväxtin- duktionen i synkroniserade, glatta muskelcellkulturer hämmas av gamma-interferon. A, B, C, D och E motsvarar samma gamma-interferonkoncentrationer som A-E i fig 1.

I detta fall resulterade 10 enheter/ml gamma-interferon i mediet i en 50%-ig tillväxthämning och en signifikant 462 364 10 15 20 25 30 35 14 hämning erhölls med så lite som l enhet/ml efter 9 dagars exponering. En signifikant hämning erhölls efter 4 dagar med 10 enheter/ml och en maximal hämning uppnâddes med 50 enheter/ml.

Effekten av gamma-interferon på replikationen av glatta muskelceller belystes vidare genom analys av 3H-tymidin-upptagningen av synkroniserade celler under och efter ingången i cellcykeln (se fig 3). Först be- stämdes längden av G1-fasen för cellcykeln. Celler i 10 cmz petriskålar stoppades i tillväxt genom serum- svält och inducerades därefter att gå in i cellcykeln vid tid O genom tillsats av 10% fetalt kalvserum. 3H- -tymidin tillsattes tillsammans med fetalt kalvserum, cellerna skördades vid olika tidpunkter och triklor- ättiksyra-olöslig radioaktivitet bestämdes genom scin- tillationsräkning av trippelprover av kulturerna. Tiden från serumtillsatsen till start av 3H-tymidinupptagningen bestämdes (dvs inflektionspunkten av kurvan i fig 3).

Gl-fasen var ca 20 h.

Med hänvisning till fig 4 visas att då gamma-inter- feron tillsättes tillsammans med serum reduceras upp- taget av 3H-tymidin med 70%. Gamma-interferon hämmar replikationen av glatta muskelceller genom att verka vid ett läge tidigt i G1 av cellcykeln. Tillväxten av celler i 10 cm2 petriskålar avstannades och de indu- cerades därefter att gå in i cellcykeln genom tillsats av FCS. De utsattes kontinuerligt för 3H-tymidin från och med då. Gamma-interferon tillsattes tillsammans med FCS, eller 3, 6, 9, 12 eller 15 h senare. Alla celler skördades vid 24 h och triklorättiksyra-olöslig radio- aktivitet bestämdes genom scintillationsräkning av fyr- faldiga odlingsprover. X-axeln visar tiden från till- satsen av FCS till tillsatsen av gamma-interferon, var- vid "0 h" representerar de kulturer som erhållit FCS och gamma-interferon samtidigt och "l5 h" de kulturer som mottog gamma-interferon 15 h efter tillsats av FCS.

På y-axeln representerar 100% 3H-radioaktivitet i kul- 10 15 20 25 30 35 462 364 15 turer, vilka aldrig utsatts för gamma-interferon och radioaktiviteten hos gamma-interferonbehandlade kulturer ges i % av detta värde (medel i standardavvikelse).

Om emellertid tillsatsen av gamma-interferon fördröj- des mer än 9 h efter tillsatsen av serum sågs ingen hämning (se fig 4). Data antyder därför att gamma-inter- feron agerar genom att blockera övergången från G0 till Gl eller i ett tidigt läge av G1-fasen av cellcykeln i vaskulära, glatta muskelceller.

Gamma-interferon inducerar expressionen av I-A- -antigen i ett antal målceller, inklusive endotelceller och fibroblaster. Glatta muskelceller i aterosklerotiska artärer observerades uttrycka dessa antigen (se Jonasson L, Holm J, Skalli 0, Gabbiani G, Hansson GK: Expression of class II transplantation antigen on vascular smooth muscle cells in human atherosclerosis. J Clin Invest 1985:76:l25-131), och närvaron av aktiverade T-celler i aterosklerotiska plackar antydde att gamma-interferon, som frisatts från T-cellerna, kan inducera expressionen av detta antigen (se Jonasson L, Holm J, Skalli O, Gab- biani G, Hansson GK: Expression of class II transplan- tation antigen on vascular smooth muscle cells in human atherosclerosis. J Clin Invest l985:76:l25-131 och Hansson GK, Jonasson L, Holm J, Claesson-Welsh L: Class II MHC antigen expression in the atherosclerotic plaque; smooth muscle cells express HLA-DR, HLA-DQ, and the invariant gamma chain. Clin Exp Immunol l986:64:26l-268). Denna möjlighet testades nu genom att odlade, glatta muskel- celler utsattes för gamma-interferon.

Fig 5 visar att gamma-interferon (gamma-IFN) indu- cerar I-A-expression på cellytan av glatta muskelceller på ett dos-beroende sätt. Celler i 96-brunnars mikrotiter- plattor behandlades med rekombinant, murint gamma-inter- feron vid olika koncentrationer under tre dagar och analyserades därefter med avseende på I-A-expression med hjälp av tekniken enzyme-linked immunoassay. I-A- 462 364 10 15 20 25 30 35 16 -expression per cell beräknades genom dividering av totala mängden I-A i varje kultur (absorbansenheter vid 405 nm) med antalet celler per kultur såsom bestämts med hjälp av färgbindning. Medelvärden för kulturerna (n = 16) ges; variationskoefficienterna var alltid mindre än 2%.

I fig 6 visas tidsförloppet för I-A-expression av gamma-interferoninducerade, glatta muskelceller. 16) behand- lades med gamma-interferon (gamma-IFN stimulering; 100 Celler i 96-brunnars mikrotiterplattor (n = enheter/ml) och I-A-expressionen på cellytan analysera- des med enzyme-linked immunoassay vid olika tidpunkter efter tillsats av gamma-interferon (A). I-A-expression per cell bestämdes genom dividering av I-A-expression per brunn (A405 enheter) med celltalet per brunn. Kont- rollvärden (B) erhålles från ostimulerade celler. Stan- dardavvikelserna var under 2% av medelvärdena. Induk- tionen detekterades efter 40 h exponering för gamma- -interferon och en platå uppnåddes efter 60 h stimule- ring. Tidsramen för induktion av I-A-expression löpte parallellt med tillväxthämningen som inducerades av gamma-interferon.

Med hänvisning till fig 7 visas att effekterna av gamma-interferon på tillväxten och I-A-expression inte orsakas av kontaminerande endotoxiner, eftersom endotoxinhämning med polymyxin B, som tillsatts till- sammans med gamma-interferon, inte påverkade resultaten.

Tillväxtsynkroniserade celler inkuberades med rekombi- nant gamma-interferon vid olika koncentrationer, med (B) eller utan (A) tillsats av polymyxin B (50 pg/ml).

Medelvärden för 16 parallella kulturer i 96-brunnars mikrotiterplattor visas; variationskoefficienten låg under 2%. Pm, polymyxin B. Effekterna på tillväxten och I-A-expressionen, som erhölls med musgamma-inter- feron (tillverkat av Genentech) var identiska med de som erhölls med rekombinant råttgamma-interferon (fram- ställd av Holland Biotechnology). Däremot inducerade inte humant gamma-interferon I-A-expression i råttceller. 10 15 20 25 30 35 462 364 17 In vitro-observationer av samtidig gamma-inter- feroninducerad hämning av celltillväxt och expression av I-A-antigen föranledde testningen av hypotesen att tillväxthämning och I-A-expression är besläktade feno- men också in vivo. Därför inducerades tillväxten av glatta muskelceller i râtthalspulsådern med hjälp av en ballongkateterskada och alla replikerande celler från skadetiden och framåt märktes med 3H-tymidin, som levererades kontinuerligt via en osmotisk pump. Cell- replikationen och I-A-expressionen analyserades 14 dagar efter skadan då intimaförtjockningen etablerats, men då förökningen fortfarande pågår. Resultaten ges i ta- bell I nedan.

Tabell I Cellreplikation och I-A-expression vid proliferativa intimaskador under en 14 dagars 3H-tymidinmärknings- period 3H-tymidin+ 3H-tymidin- I-A+ 1,3 (1,4) 9,6 (6,2) I-A- 80,6 (4,1) 8,5 (8,9) Värden i % av totalantal celler, medelvärde 1 stan- dardavvikelse inom parentes.

Av de intimala, glatta muskelcellerna var 8l,9% 3H-tymidinpositiva, vilket angav att de hade genomgått åtminstone en cellreplikationscykel. I-A, som detek- terades med hjälp av immunocytokemi, uttrycktes i l0,9% av cellerna. Medan större delen av samtliga intimala, glatta muskelceller märkts med 3H-tymidin, var endast en åttondel av de I-A-positiva cellerna 3H-tymidinposi- tiva. Bland de 3H-tymidinnegativa, glatta muskelcellerna var mer än hälften I-A-positiva.

Korrelationen mellan DNA-replikation och I-A-expres- sion analyserades också under fjortonde dagen efter det kirurgiska ingreppet, genom injicering av 3H-tymidin som en 24 h puls omedelbart före det att djuren dödades. 462 364 10 15 20 25 30 35 o 18 I detta fall var 25,5% av cellerna 3H-tymidinpositiva, men inga av dessa celler uttryckte I-A. Resultaten ges i tabell II.

Tabell II Cellreplikation och I-A-expression i proliferativa intimaskador under 24 h 3H-tymidinmärkningsperioden 3H-tymidin+ 3H-tymidin_ I-A* 0 <0) s,e (2,2) 1-A' 25,5 (4,2) 68,7 (6,4) Värden i % av totalantal celler, medelvärde i stan- dardavvikelse inom parentes.

Den omvända korrelationen mellan DNA-replikationen och I-A-expressionen antydde att den mekanism som indu- cerar I-A-expression också hämmar tillväxt. Denna idé stöddes av en detaljerad analys av de autoradiogram, som erhållits från råttor som märkts med hjälp av 14- -dagarsprogrammet med osmotisk pump. Med hänvisning till fig 8 visas att I-A-uttryckande, glatta muskel- celler genomgår färre replikationer än I-A-negativa i neointima under svaret på skada. Artârskador tillfo- gades med hjälp av ballongkateter i halspulsàdern hos råttor och replikerande celler märktes med 3H-tymidin, vilket insprutades kontinuerligt via osmotiska pumpar under 14 dagar. I-A-expression bestämdes med hjälp av immunocytokemi och 3H-tymidinupptaget med autoradiografi av samma snitt. Antalet silverkorn på I-A-positiva och I-A-negativa celler räknades i fyra lesioner (50 I-A- -positiva och 50 I-A-negativa celler per lesion). Efter- som det inte fanns någon signifikant skillnad mellan djuren samlades data från alla fem skadorna för den statistiska analysen. Differensen i silverkorn mellan I-A-positiva och I-A-negativa celler skiljer sig vid p < 0,01 och medelvärdet i standardavvikelsen anges i figuren.

I '9- 10 15 20 25 30 35 462 364 19 I de 3H-tymidinmärkta, tillväxande populationerna av cellerna är medeltalet silverkorn per kärna nästan två gånger så högt som i I-A-negativa celler, i jäm- förelse med I-A-positiva celler. Mera 3H-tymidin kan förväntas ackumuleras i celler med varje ytterligare delningscykel och korntalet per cell är nära besläktat med radioaktiviteten per cell. Differensen mellan I-A- -positiva och I-A-negativa, glatta muskelceller ger därför att I-A-positiva celler genomgick färre cykler DNA-syntes än de glatta muskelceller, som inte uttryck- te I-A (för diskussion av denna typ av analys, se Clowes AW, Schwartz SM: Significance of quiescent smooth muscle migration in the injured rat carotid artery. Circ Res 1985:56:l39-145).

PiEEÉëEÉšÉ@ÉEÉ_ll Ett in vivo-pilotexperiment utfördes, vilket inne- fattade åtta 400 g Sprague-Dawley hanråttor. En intima- lesion tillfogades den gemensamma halspulsådern med hjälp av en Fogarty 2F ballongkateter, såsom tidigare beskrivits. Fyra av råttorna fick rekombinant råttgamma- -interferon (200 000 U subkutant) dagligen under 7 dagar, och de andra fyra råttorna injicerades med samma volym vehikel (natriumkloridlösning).

Samtliga råttor avdödades 14 dagar efter behand- lingen med ballongkateter och fixerades genom perfusion med 1% paraformaldehyd i fosfatbuffert. Den opererade (vänstra) och icke opererade (högra) pulsådern inbäddades i OCT-medium och snabbfrystes i n-hexan/flytande kväve. 10 um kryostatsnitt framställdes vid varje 100 um och det område som uppfylldes av neointiman bestämdes genom mörfometri med hjälp av "point-sampling"~metoden. Resul- taten sammanfattas i tabell III. 462 364 10 15 20 25 30 35 20 Tabell III Neotima hos gamma-interferon-behandlade råttor och kontroller Behandling n a s.d. P gamma-IFN 4 2,30 1,00 < 0,01 kontroll 4 4,80 0,50 n är antalet råttor och a är tvärsnittsytan i pmz.

Statistisk analys med hjälp av Student's t-test.

Det är klart att en behandling med gamma-interferon väsentligt hämmar utvecklingen av en intimaförtjockning och det är värt att notera att denna hämning kvarstod 1 vecka efter det att behandlingen med gamma-interferon upphört. Detta stöder hypotesen att mediala celler rep- likerar och migrerar vid en kritisk tidpunkt efter skada.

Hämningen av tillväxten vid denna tidpunkt tycks bestående reducera storleken av lesionen.

Experimenten ovan visar klart hämningseffekten av gamma-interferon på replikationen av flatta muskelceller.

Gamma-interferon kan således användas för behand- ling av vaskulär stenos, som orsakats av t ex intima- hyperplasi och i ett föredraget utförande för behand- ling av artärstenos, som följd av kärlkirurgi och/eller angioplastik. Gamma-interferon bör administreras till en patient som en farmaceutisk beredning innehållande nämnda interferon i en tillräcklig mängd för att fram- kalla en terapeutisk effekt. Den aktuella dos och be- handlingsperiod som erfordras i ett specifikt fall kom- mer att avgöras av den vårdande läkaren. Dosen bör vara tillräcklig för att inducera expression av klass II- -MHC-antigen på málceller, t ex keratinocyter.

Gamma-interferon definieras häri såsom en polypeptid vilken har samma sekvens som nativt gamma-interferon, såsom anges i den europeiska patentskriften nr 77 670 och alla àminosyrasekvenser eller andra varianter därav med 10 15 20 25 30 35 462 364 21 förmåga att inhibera stenos med hjälp av de metoder som beskrives häri eller deras analoger, då man utnytt- jar celler från andra djur. Exempel på sådana varianter är alleler eller produkterna från riktad punktmutagenes i vilka rester uteslutes, införes eller ersättes. Se t ex den europeiska patentskriften 146 354. För veterinär terapi bör ett gamma-interferon som är homologt med eller aktivt i den djurart som skall behandlas användas.

Vid human terapi bör den desCysTyrCys-variant av sekvensen som visas i EP 77 670 användas och eventuellt den C-ter- minala varianten, i vilken de sista fyra resterna ute- slutes vid post-translationsbearbetning. Gamma-inter- feron med nativa sekvenser kan erhållas genom rening från naturliga källor, med användande av kända metoder.

Samma molekyl eller dess varianter kan erhållas från rekombinantkällor, också med hjälp av kända metoder.

En typisk beredning innehållande gamma-interferon (20 x l0f6) vid 1,0 eller 0,2 mg/ml, bärnstenssyra 0,27 mg/ml, dinatriumsuccinathexahydrat 0,73 mg/ml, mannitol 40 mg/ml, polysorbat 20 0,1 mg/ml qs till 1 g vatten för injektion/ml vid pH 5,0. Denna vattenhaltiga bered- ning administreras som terapeutisk dos, vilken är mindre än den maximalt tolererade dosen för människor såsom bestämts av kliniker. Gamma-interferon kan också admi- nistreras från en rekonstituerad, frystorkad beredning.

Gamma-interferon administreras på varje konventio- nellt sätt, som ger en terapeutisk dos till stället för intimaskadan, t ex genom intravenös eller intra- pulmonär (EP 257 956) tillförsel. Administrering kan göras genom kontinuerlig infusion eller bolusdosering, som är tillräcklig för att upprätthålla en terapeutisk nivå. Gamma-interferon bör om möjligt användas åtminstone under den tid patienten genomgår en behandling som kan leda till stenos och fortsättas därefter under en tid som är tillräcklig för att medge korrekt läkning av kärlen, vanligtvis mellan ca 3 och 10 dagar, såsom be- stämmes av klinikern.

Claims (4)

462 364 22 PATENTKRAV

1. l. Användning av gamma-interferon för beredning av ett farmaceutiskt preparat för behandling av vaskulär stenos.

2. Användning av gamma-interferon enligt krav 1, varvid den vaskulära stenosen är orsakad av tillväxt eller delningsaktivitet hos blodkärlsceller.

3. Användning av gamma-interferon enligt krav 2, varvid den vaskulära stenosen är en restenos till följd av behandling av artärstenos eller ocklusion.

4. Användning av gamma-interferon enligt krav 3, varvid restenosen är en artärstenos till följd av angio- plastik och/eller kärlkirurgi. I"