JPH03500660A

JPH03500660A - 血管閉塞抑制剤

Info

Publication number: JPH03500660A
Application number: JP1506590A
Authority: JP
Inventors: ラムウェル，ピーター　ダブリュ．; ブラケ，ピエール
Original assignee: ソシエテ　ドゥ　コンセイユ　ドゥ　ルシエルシエ　エ　ダプリカシオン　サイエンティフィック
Priority date: 1988-06-03
Filing date: 1989-06-02
Publication date: 1991-02-14
Anticipated expiration: 2010-03-22
Also published as: WO1989012068A2; EP0383856B1; JPH0725691B2; DE68914435T2; EP0383856A1; DE68914435D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】血管閉塞の抑制に有用なペプチド肢歪分互本発明はヒトの療法におけるペプチドホルモンの類似体の使用に関する。

宵景狡王天然の１４個のアミノ酸より少数のアミノ酸を有する類似体を含めて、ＯＨ−放出阻害活性を示す多数のソマトスタチン類似体が文献中に記載されている。例えば、Ｃｏｙらの米国特許Ｎｏ、　４．４８５，１０１　（引用により本明細書に組み入れる）はＮ−末端アセチル基、Ｃ−末端ＮＨｔ、６位のＤ−Ｔｒｐ　、及び４位のｐ−Ｃ７！−Ｐｈｅを有するドデカペプチドを記載している。（この明細書においてコンフィグレーションが特に示されていない場合、Ｌ−異性体が意図される。）血管壁はしばしば、その血管が血管形成術”（ａｎｇｉｏｐｌａｓｆｙ）にかけられた後１年以内に硬化しそして閉塞することがしばしば知られる。同様の厚化及び閉塞はまた動脈移植片中で及び移植された組織の血管中で生ずることも知られている。

光訓墾旧肚ボ一般に、本発明は、次の式：〔式中、Ａ、及びＡ２はそれぞれ独立にＨ，Ｃ，〜、２アルキル、０７〜，０フエニルアルキル、Ｒ，ＣＯ（ここで、Ｒ１は０１〜２゜アルキル、Ｃ１〜２゜アルケニル、Ｃ３〜２゜アルキニル、フェニル、ナフチル、又はＣｔ、−１０フエニルアルキルである）、又はＲ，０ＣＯ（ここで、Ｒ２はＣ３〜１゜アルキル又は０７〜．。フェニルアルキルである）であり、但し、Ａ１又はＡ２の一方がＲ，Ｃｏ又はＲ，ＯＣＯである場合には他方はＨでなければならず；Ａ、はＣＨＥＡ＆（ここで、Ａ、はペンタフルオロフェニル、ナフチル、ピリジル、又はフェニルであり；Ａ、はｏ−、ｍ−又はさらに好ましくはＰ−置換Ｘ−Ｐｈｅ（ここで、Ｘはハロゲン、ＨｌＮＨｚ　、　Ｎｏ□、ＯＨ１又はＣｌ−１，アルキルである）、ペンタフルオロ−Ｐｈｅ　、β−Ｎａｌ又はＴｙｒであり；ＡｓはＴｈｒ　、　Ｓｅｒ　、　Ｐｈｅ　。

Ｖａｌ、α−アミノ酪酸、又はｌｉｅであり；Ａ７はＴｈｒ　、　Ｔｒｐｓ又は β−Ｎａｌ（そしてＤ−又はＬ−異性体のいずれでもよい）であり；そしてＺはＮ）Ｉ２又はＯＨである〕を有するオクタペプチド、又はその医療として許容される塩の医療として有効な量を患者に投与することにより哺乳類における血管閉塞を阻害する方法に向けられる。好ましい化合物は、次の式：（式中、Ａ４は前に定義した通りであり、Ａ５はＴｈｒであり、Ａ７はＬ−フェニルアラニン、スレオニン又はトリプトファンであり、そしてＡ８はＤ−β−ナフチルアラニン又はＤ−フェニルアラニンである）の１つである。これらのオクタペプチドは、例えば血管形成術、動脈バイパス、又は器官の移植の後に起こることがある血管閉鎖に対する効果的な阻害を提供する。この明細書で使用する場合、血管閉塞の阻害とは、閉塞を導くことがある血管壁の厚化の阻害を包含する意味に用いられる。

上記の式において、Ａ３が結合している炭素原子における分子のコンフィグレーションはＤ−コンフィグレーション又はＬ−コンフィグレーションを有することができる。

他の観点において、本発明は前記の式のオクタペプチドを、同種移植片が移植された哺乳類に投与することにより哺乳類における移植組織（すなわち同種移植片）の拒絶を阻止する方法を特徴とする。オクタペプチドは好ましくはサイクロスポリンと組合わせて投与される。

好ましい具体例においては、投与されるオクタペプチドにおけるＺはＮＨ，であり、そしていオクタペプチドの例は、Ｄ−β−Ｎａｌ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−ＮＨｚ（アンジオベブチン）、又はその医療として許容される塩である。前記式に含まれる化合物の他の例には、［］−］ｐｈ６−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｄ−ＴｒｐＬｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−０）１　；Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ −Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−ａ−アミノ酪酸−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−ＮＨｚ　；Ｄ−β− Ｎａｌ−Ｃｙｓ−ペンタフルオロ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−ＮＨｚ　；Ｄ−β−Ｎａｌ−Ｃ５−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ− Ｖａｌ−Ｃｓ−β−Ｎａｌ−ＮＨｚ　；Ｄ−β−Ｎａｌ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ− Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−ｃｘ−アミノ酪酸−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−ＮＨｚ　；及びＨを　るための　のｌピ本発明に従えば、投与される組成物は好ましくは医薬として有効な量のオクタペプチド及び医療として許容されるキャリヤー物質（例えば、炭酸マグネシウム、ラクトース、又はそれと共に療法化合物がミセルを形成することができるリン脂質が含まれる。最も好ましいキャリヤー物質はマンニトールである。これらの組成物の例には九剤、錠剤、カプセル剤、又は経口用液剤；及び滴又はスプレーとして鼻に投与することができる液体、又は静脈内投与、非経腸投与、皮下投与、又は腹腔内投与を行うことができる液体が含まれる。火剤、錠剤又はカプセル剤は、組成物が患者の小腸に破壊されることなく移行することができるために十分な時間にわたって患者の胃内での胃酸から組成物を保護することができる物質によりコートされていてもよい。この医薬組成物はバモ酸のごとき親脂性塩と組み合わせた油乳剤又は分散体の形で投与することもできる。この医薬組成物は生分解性徐放製剤の形態であることができる。例えば、１０■の化合物を徐放性形に製剤化し、そして２〜３週間ごとの注射により投与することができる。最大効率のため零次放出が好ましい。医薬組成物を投与するための移植可能なポンプ又は体外ポンプを用いることによって零次放出を得ることができる。

このような閉塞が生ずる危険が増加している場合、例えば血管成形術（物理的手段、例えばバルーンカテーテル、レーザー、又は回転ブレードによる血管の拡大）；動脈バイパス手術（又は、血管の他の操作、例えば損傷した血管における破れの縫合）；又は同種移植手術（この場合、移植された同種移植片の血管が移植受容者の血管に結合される）の後に、血管の閉塞を阻害するためにオクタペプチドを使用することができる。

高い危険状態をもたらす方法を実施する前及びその後６ケ月までに２４時間以上（さらに好ましくは４８時間以上）連続して（連続的に又は間欠的に）＠乳類に投与して、この期間常に血流中に化合物を維持するのが好ましい。一般に、オクタペプチドは前記方法の間に投与した場合に、１も効果的である。

これらの化合物は、皮下投与される場合、１〜１００　ｎ　／　ｋｇ　／日、好ましくは２０〜１００　ｎ　／　ｋｇ　／日の投与量で哺乳類に投与されるべきである。オクタペプチドはこれらの投与量において非毒性である。投与が静脈内である場合いく分低い投与量を用いることができ、経口投与のためにはより高い投与量を用いることができる。

オクタペプチドは、上記の方法に類似する方法で投与される場合、移植された組織の拒絶の抑制においても有効である。

好ましくは、これらの化合物は標準的投与量のサイクロスポリンと組合わせて投与される。オクタペプチドは角膜移植の拒絶を抑制することができ、角膜移植については、局所投与、例えばクリーム、ゲル、スプレー又は軟こうとして使用するのが好ましい。

本発明の他の特徴及び利点は好ましい態様の以下の記載から明らかであろう。

辺ｌｊＵη襲吸第１図はバルーン血管形成術後のラビットの大動脈の正味重量を示すグラフであり；第２図はバルーン血管形成術後のラビットの大動脈中の蛋白質の量を示すグラフであり；第３図はバルーン血管形成術後のラビットの大動脈のＤＮＡ／蛋白質比を示すグラフであり；そして第４図はバルーン血管形成術後のラビットの大動脈における３−■］チミジンの取込みを示すグラフである。

分遣」−へ煎１じｇ１較」二ｊ１本発明の化合物は発明の開示の欄に前記した一般式を有する。これらはすべてソマトスタチンのオクタペプチド類似体であり、４位にＤ−Ｔｒｐを有し、そして３位（Ａ４）、６位（Ａ、）及び８位（Ａ７）に任意的変更を有する。１位のＤ −β−ナフチルアラニン、３位のＴｙｒ、及び６位のＶａｊｌ’が特に好ましい変更である。

この化合物は医薬として許容される塩の形で提供することもできる。好ましい塩の例は、医薬として許容される有機酸、例えば酢酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、サルチル酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、又はバモ酸、並びにポリマー酸、例えばタンニン酸又はカルボキシメチルセルロースとの塩、並びに無機酸、例えば塩酸、硫酸又はリン酸との塩である。

企−底１つのオクタペプチドの合成は次の通りである。本発明の方法における使用に適する他のオクタペプチドは、当業者の能力内で、次の合成法に適当な変更を加えることにより調製することができる。

災搭炎上０−Ｎａ１−Ｃｓ−Ｔ　ｒ−Ｄ−Ｔｒ　−Ｌ　５−Ｖａｌ−Ｃ５−Ｔｈｒ−ＩＪＨｚ（アンジオベプチンカルボニル−Ｄ−β−ナフチルアラニン−３−メチルベンジミン樹脂の調製であった。

塩素イオン形のベンズヒドラミン−ポリスチレン樹脂（Ｖｅｇａ　ＢｉｏｃｈｅＩＩｌｉｃａｊ２ｓ　Ｉｎｃ、）を、次の反応サイクルを行うようにプログラムされたベックマン９９０Ｂペプチド合成機の反応容器に入れた：　（ａ）塩化メチレン；　（ｂ）塩化メチレン中３３％トリフルオロ酢酸（１分及び２分づつ２回）：　（Ｃ）塩化メチレン；（ｄ）エタノール；　（ｅ）塩化メチレン；　（ｆ）クロロホルム９１０％トリエチルアミン。

中和された樹脂を塩化メチレン中Ｂａｃ−０−ベンジルスレオニン及びジイソプロピルカルボジイミド（各１．５ｍｍｏ！りと共に１時間撹拌し、そして生ずるアミノ酸樹脂を上記の洗浄プログラム中段ＦＪ　（ａ　）〜（ｂ）を通して循環した。次に、下記のアミノ酸（１，５ｍｍｏｊ２）を逐次連結した：　Ｂｏｃ− ５−メチルベンジル−Ｃｙｓ　、　Ｂｏｃ−Ｖａｎ　、　Ｂｏｃ−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌｙｓ　、Ｂｏｃ−Ｄ−Ｔｒｐ　、Ｂｏｃ−Ｔｙｒ　、　Ｂｏｃ−３−メチルベンジル−Ｃｙｓ　。

Ｂｏｃ−Ｄ−β−ナフチルアラニン。

樹脂を洗浄し、そして乾燥し、そして次にＯ″Ｃにてアニソール（４戚）及び無水弗化水素（３６ｄ）と混合し、４５分間撹゛　拌した（チオアニソール、トリフルオロ酢酸及びトリフルオロメタンスルホン酸を１：９０：９の比率で６時間用いることもできる）。過剰の弗化水素を乾燥窒素流のもとで迅速に蒸発せしめ、そして遊離ペプチドを沈澱せしめてエーテルで洗浄した。次に、粗ペプチドを８００−の９０％酢酸に溶解し、これにメタノール中Ｉ２を永久褐色が存在するようになるまで添加した。次に、この溶液を１時間撹拌した後に溶剤を真空除去した。生ずる油状物を最少量の５０％酢酸に溶解し、そしテセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ−２５のカラム（２，５Ｘ　１００ｍｍ）上で溶出した。

次にＵ■吸収及び薄層クロマトグラフィーにより主成分を含有する画分をプールし、少体積に蒸発せしめ、そしてワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）　ＬＲＰ−１オクタデジルミラン（１５〜２０μＭ）のカラムに適用した。

カラムを、水中０．１％トリフルオロ酢酸中の１０−５０％アセトニトリルの直線グラジェントにより溶出した。両分を薄層クロマトグラフィー及び）ＩＰＬｃにより試験しそしてプールして最大純度を得、そして所望により異る塩、例えば酢酸塩又はリン酸塩を調製した。溶液を水から反復して凍結乾燥して１７０■の生成物を白色のフワフワした粉末として得た。この生成物はＨＰＬＣ及びＴＬＣにより均一であることが見出された。

酸加水分解物のアミノ酸分析によりオクタペプチドの組成が確認された。

上記の方法に類似する方法に従って次の式を有するオリゴペプチドを調製した：Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−β−Ｎａｌ−ＮＨｚ　：及び実１１吐１材杢すαＬ析汰チャールス・リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ）から得られた体重２５０〜３５０ｇの隨性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを制御された照明条件下に維持し、そしてラット餌及び水を自由に取らせた。

ナトリウムベントバルビッール麻酔下で右頚動脈の血管内膜（ｉｎｔｉｍａ）を、　Ｆｉｓｈｍａｎら、Ｌａｂ　Ｉｎｖｅｓｔ、、　３２．３３９　（１９７５）に記載されている空気乾燥傷害にかけた。この方法は、動脈内平滑筋細胞を増殖せしめることから主として成る血管内膜肥厚を生じさせる。このモデルにおいて、約４ＣＩＩ＋の血管を摘出しそして血液を除去する。空気（２０ｄ／分を）３０ゲージ針を通して５分間流し、この後血流を再開する。対何の頚動脈も露出するがしかし空気乾燥しない。１５日後にラットを殺す。

実験は１個の対照群と１０個の処理群とがら成る。使用したソマトスタチン類似体にヘプタペプチド又はオクタペプチド、すナワチＢＩＢ２３０１４（アンシオヘブチ７）　、ＢＩＭ２３０１２　、８１Ｍ２３０２７　。

ＢＩＭ２３０３０及び８１Ｍ２３０３４であった。これらの化合物はすべて成長ホルモン放出の強力な阻害剤であった。第１表（Ｈｅｉｍｅｎら、Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ＋　４５＋　４２９　（１９８７）ｓ　Ｃｏｙら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ。

Ｅｓｃｏｍ、　Ｌｅｉｄｅｎ＋　４６２−４６３頁（１９８８）　；及びＴｏｌｉｓら、Ｉｎｔ。

Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　Ａ　ｄｖ、、　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　ａｎｄ　Ｇｒｏｗ　ｔｈ　ＦａｃｔｏｒＲｅｒｅａｒｃｈ、門：　ｔａｎ　（１９８Ｂ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ）を参照のこと。動物を前記の処理前２日間前処理し、そして前記内皮傷害の後さらに５日間処理した。内皮傷害の３０分前及びさらに５日間投与したアンジオベブチン２０ｇ／ｋｇ／日及び５０■／ｋｇ／日）が筋血管内膜（ｍｙｏｉｎｔｉｍａ　Ｅ　）増殖に対して保護を行うか否かを検討するため追加の２動物群を加えた。

動物を傷害後１５日百日瀉血により殺した。血管系を食塩水によりフラッシュし、そして８０ｍｍＨｇにて１０％ホルマリンにより潅流固定した。次に頚動脈を固定し、包埋し、そして光学顕微鏡及び形態学的分析のために切片化した。最大血管内膜／メディア比は管腔から内部弾性層までの距離と内部弾性層から外部弾性層までの距離との比である。これらの距離は各血管において光学顕微鏡に取り付けたデジタル化系を用いて決定した。この決定は血管の３個の異る断面において行い、そして各切片を３回測定した。各血管について平均を計算した。

各群間の差をスチューデントの非対を一検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’　５ｕｎｐａｉｒｅｄ　ｔ−ｔｅｒｔ）を用いて評価した。

結果を次の表に示す。

】−一り一表ペプチド　アミノ酸配列　動脈内膜／メディア比カッコ内の数値は各群のラットの数を示す。動脈内膜／メディア比は、管腔から内部弾性層までの距離と内部弾性層から外部弾性層までの距離との比である。比の平均（±ＳＥ）の差の統計的有意性をスチューデントのｔ−検定により分析した。＄ｐ＜０．０１及び＊　ｐ　＜０．０５゜ランドを内皮傷害の後２日間及び傷害の後５日間試験した。

ソマトスタチン１４（＝１）と比較したラットにおける生体内成長ホルモン抑制に関するペプチドの効力のランクはアンジオペプチン（５”）　、８１Ｍ２３０３４　（２）　、ＢＩ？Ｉ２３０３０　（０，５）、８１Ｍ２３０２７（１００）　、及び８１Ｍ２３０１２　（６２）であった。

（ａ）　Ｄ−Ｎａｌ＝３−　（２−ナフチル）−Ｄ−アラニン；（ｂ）ヒト゛ロキシーサンドスタチン（ｈｙｂｒｏｘｙ−３ａｎｄｏｒｔａｔｉｎ）ではなくアミド−サンドスタチン。

趙−来アンジオベプチン及び密接に関連するオクタペプチドＢＩＭ２３０３４　（第１表）は、空気乾燥による内皮傷害の後頚動脈の筋血管内膜の増殖を有意に（ｐ＜０．０１）阻害した。両薬剤は空気乾燥に先立って２日に投与した。アンジオベプチンの低投与量（２０１Ｉｇ／ｋｇ／日）及び高投与量（５０■／ｋｇ／日）並びに８１Ｍ２３０３４の高投与量（５０ｉ／ｋｇ／日）は有効であった。他の３種類のソマトスタチン類偵体ＢＩＭ２３０１２　、８１Ｍ２３０２７及び８１Ｍ２３０３０は用いた投与量において平滑筋細胞増殖を示さなかった。動脈傷害の前（３０分）及びさらに５日間投与されたアンジオペブチン５０■／ｋｇ／日は筋動脈内膜増殖を有意に（ｐ＜０．０１）阻害した。

検−社アンジオペブチン及びＢＩ？！２３０３４の皮下投与はわずか５日間であったが平滑筋増殖の阻害は内皮傷害後１５゛日間観察された。

これは、増殖のシグナルが内皮傷害後の早期の事象であることを示している。従って、アンジオベプチン及び８１Ｍ２３０３４は血管の傷害の時に放出された異るマイトジェンの早期効果を妨害するであろう。処理の前３０分の短時間前処理として投与された場合、アンジオペプチンの保護効果はまた迅速な抗増殖効果を示す。

可能性ある作用機構は成長ホルモンの、そしてそれによりインシュリン一様成長因子の阻害であるかもしれないが、しかし下垂体ソマトスタチンレセプターへの結合はアンジオベプチン、８１Ｍ２３０１２　（サンドスタチン）及び８１Ｍ２３０３４について検討されており、そしてそのアッセイは３種類のオクタペプチドについて類似した結合の程度を示す（Ｃｏｙら、前掲）。これらはいずれも生体内で成長ホルモンの強力な阻害剤であり、８１Ｍ２３０２７が最も強力である。アンジオペプチン及び８１Ｍ２３０３４の両者は成長ホルモンの放出の阻害において活性が低いが血管平滑筋の増殖において活性であるので、抗増殖効果が成長ホルモンの分泌に無関係である可能性があり、傷害の部位での血管平滑筋に対するこれらの２種類のペプチドの直接的効果を示している。

内皮が通常は平滑筋細胞増殖の阻害物質を分泌し、この仮定の内皮自己分泌阻害物質が走化性シグナル及び有糸分裂シグナルに高度に寄与する可能性がある。この阻害物質及びこの明細書に記載する２種類のペプチドは関連している可能性ジオペブチンのｔ雄性及び雌性の白色ニューシーラントラビット（２，８〜３．０ｋｇ）を２群（Ａ及びＢ）に分けた。Ａ群（ビヒクル対照）には生理的食塩水（０，１）の皮下注射を毎日２回行った。

Ｂ群には生理的食塩水に溶解したアンジオペブチン（２０ｊｔｇ／眩、１日２回）の皮下注射（０，２ｄ、１日２回）を行った。

動物を血管形成術の前日、及び約３週間後に殺すまで処理した。血管形成はケクミン及びキシラジンによる全身麻酔下で行った。各動物の左腸骨動脈及び大動脈を血管形成カテーテル（Ｆｏｇａｒｔｙ）により裸化（ｄｅｎｕｄｅ）　Ｌ／た。血管形成カテーテルを左大腿動脈に挿入し、そして該血管を通して膨大動脈まで通した。カテーテルを３回往復させた。血管形成術の２２〜２４日後すべての動物を殺した。大動脈及び腸骨動脈を、一定の潅流圧のもとてのホルムアルデヒドの潅流によりその場で固定した。

内膜肥厚をエラスチン染色（Ｖａｎ　Ｇｉｅｓｅｎ）　Ｌ／た水平切断切片上で決定した。この切片は、（ｉ）腎動脈のレベルでの大動脈、（ｉｉ）分岐のレベルでの一般腸骨動脈、及び（ｉｉｉ）Ｄｉ径部靭帯上の外部腸骨動脈から得た。

内膜肥厚の面積及び全血管面積を体型測定により決定した。血管内膜肥厚の％は次のようにして表現した。

各動物の各大動脈及び２個の腸骨動脈の３個の切片について一回の測定を行った。血管内膜肥厚の％を各血管の最も近い測定値の平均として決定した。

対照群においては、筋肉血管内膜肥厚は外部腸骨動脈において最大であり、他方、血管内膜肥厚の％は３４．７％±１１．５％（雌性ラビット）及び３０．０％ ±６．３％（雄性ラビット）であった。血管内膜肥厚の％は血管のサイズが大きくなるに従って減少するようであり、一般腸骨動脈及び大動脈は、それぞれ２３．７％±４．９％及び１８．８％±２．９％の血管内膜肥厚％（雌性ラヒット）並びにそれぞれ２３．０％±５．８％及び２２．０％±６．５％（雄性ラビット）を示した。アンジオベプチン（２０羅／ｋｇ／日）による筋肉血管内膜の阻害の％は有意でありそして３個の血管片のすべてについて類似しており、外部腸骨動脈、一般腸骨動脈及び大動脈については、雌性ラビットにおいてそれぞれ約４１％、３３％及び４３％であり、そして雄性ラビットにおいてはそれぞれ２０％、３９％及び３２％であった。結果を次の表に示す。

１エ」Ｌ−衷雌性ラビットの外部腸骨動脈における血管内膜肥厚に対する効果サンフル　対　照　アンジオペプチン（血管内膜肥厚％）１　２６．９　２６．４２　５７．５　１５．２３　２８．６　２１．３４　３３．２　３３．６５　３３．６　２４．１６　２６．１　２０．６平均　３４．７　２０．７Ｓ　Ｄ　１１．５　８．０を一統計　２．６７９自由度　１２有意性　０．０２０第一」Ｌ−表雌性ラビットの一般腸骨動脈における血管内膜肥厚に対する効果サンプル　対　照　アンジオペブチン（血管内膜肥厚％）４　１８．８　２０．５５　２７．１　１５．３６　２０．４　１６．６平均　２３．７　１３．１Ｓ　Ｄ　４．９　５．６を一統計　３．７０６自由度　１２有意性　０．００３第−ＩＶ−表雌性ラビットの大動脈における血管内膜肥厚Ｇこ対自由度　９有意性　０．０２３男−ハ仁−表雄性ラピツドの外部腸骨動脈における血管内膜肥厚１　３０．３　３０．５２　２４．５　１９．２３　３３．７　２５．７４　２５．４　２６．５５　４２．２　２２．３６　２７．２　３７．９７　２６．５　２２．２平均　３０．０　２４．４を一統計　１．８６０自由度　１１有意性　０．０９０茅〜ハＬ−表雄性ラビットの一般腸骨動脈における血管内膜肥厚に対する効果２　２４．０　１６．０３　２４．１　６．４４　１７．６　１７．４５　３０．４　１３．９６　２３．９　１５．８平均　２３．０　１４．ＩＳ　Ｄ　５．８　３．６を一統計　３．４３９自由度　１２有意性　０．００５男−」Ｌ−表雄性ラビットの大動脈における血管内膜肥厚に対する効果３　１７．９　１２．４４　２９．３　１３．３５　２１．３　１３．８６　４．６　１５．７平均　２２．０　１４．８Ｓ　Ｄ　６．５　１．７を一統計　２．８１０自由度　１０有意性　０．０１８裏絡尉土アンジオペプチンを１日２回５０Ｊ！ｇ／ｋｇ／日で体重２５０　ｇ〜３５０ｇの雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｉｙｌｅｙ　（チャールスリバー）ラットに皮下投与した。２日の前処理の後、３日目の乾の投与の後に、マウスを麻酔して（ケタミンーインノバール、筋肉内注射）、右頚動脈を空気乾燥することにより病変を作った。処理を４゜５．６及び７日目に続けた。傷害後１４４日目ラットを殺した。

１０％ホルマリンにより一定圧でその場で固定した後、組織を調製して形態試験片を形成した。

血管内膜の厚さとメディア層との比率として肥厚を測定した。各ラットにつき３個の異る組織切片を測定し、そして各切片につき３回形態試験を行った。結果を次の表に示す。

１．５１＋０．０７　０．４６＋０．０８１．２２＋０．０８　０．２Ｂ＋０．０３１．２８＋０．０５　０．５２＋０．０５１．９６＋０．２　０．６９＋０．０２１．７７＋０．１４統計処理：データーの有意性を評価するためスチューデントのむ一検定を行った。

又り工土各作　ＩＬＪＬＪＬ　処−理靭亙最小　１．２２　０．２８平均　１．５４　０．４８最大　１．９６　０・６９計　７．７４　１．９５標準偏差　０．３１　０．１６標準誤差　０．１４　８．４５−０２９５％Ｃ，Ｌ、　０．３９　０．２６非処理対　処　理　プールされた変動６．９３−０２ｔ（９５％）　２．３６　７ｄ、ｆ。

ｔ（９９％）　３．４９ｔ　（ｃａｌ）　６．００　ｐ＜０．０１テ（７）有意性実施炎エアンジオペブチンの評価に適する霊長類冠動脈形成術モデルを得るため、ボウマンーグルイ、メディアルスクール、ウィンストン〜サレム、ノースカロライナのコロニーから得た霊長類に対して可能性試験を行った。高コレステロール飼料が投与された場合、霊長類は血中脂質を十分に上昇せしめないので、コロニーからこれらの動物が選ばれた６体重が約３、５　ｋｇの若い雄性カニクイザルを霊長類施設での１週間以上の平衡期間の後に用いた。

動物をケタミンで鎮静させ、そして酸素中１％ハロセ・イン（ｂａｌｏｔｈａｎｅ）と共に保持した。大動脈及び大腿動脈をバルーンカテーテル（ＬＩＳＣＩ、　Ｂａｎｄ）により傷害した。５週間後、霊長類を麻酔し、そして殺した。大動脈及び大腿動脈を摘出し、そして形態学的分析のためにホルムアルデヒド中で固定した。

１日２回の注射のストレスを回避するため、処理の２日前及びバルーン処理の時に再び、アンジオペブチンを雄性ミドリザルに徐放系で筋肉内投与した。各注射は２５■／ｋｇの計算された日用放出量を有し、これは合計５０ｎ／ｋｇ／日である（ＩＰＳＥＮ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、パリ）。

最大血管内膜／メディア比（管腔から内部弾性層までの距離／内部弾性層から外部弾性層までの距離）を、光学顕微鏡に取り付けられたデジタル系を用いて各血管において決定した。血管の３つの異る断面において決定を行い、そして各切片を３回測定し、そして各３回の測定を平均した。

霊長類のこのサイズは冠動脈への再現性ある接近のためには小さすぎることが見出された。７．５ｋｇ以上のより大きなアフリカミドリザルを使用することが推奨される。低投与量のヘパリンを使用する試みが頚動脈形成術に続く頚動脈の血栓及び発作を導いた。動物の早過ぎる安楽死を要求する合併症の危険のため、頚動脈血管形成術は回避されるべきである。

末梢血管のバルーン処理に耐えた２頭の霊長類の内、１頭をアンジオペプチンで処置し、そして他方は処置しなかった。

アンジオベプチンで処置された霊長類は、対照動物に比べて、大動脈並びに左及び右大腿動脈の両方において平滑筋細胞増殖のほとんど完全な阻害を示した。

１１貫エニュージ−ランドホワイトラビットをロンパン（Ｒｏｍｐｕｎ）（キシラジン）及びケタラール（Ｋｅｔａｌａｒ）　（ケタミン）により麻酔し、そして大腿動脈からカニユーレ（３Ｆ　Ｆｏｇａｒｔｙ）を挿入した。バルーンを一定圧力で拡大し、そして大動脈を血管形成により内皮を除去した。この方法を３回反復し、そして傷ついた部位を閉じた。バルーン血管形成の７２時間後動物を殺し、そして外膜を除去した後大動脈を薄い輪に切った。これらの輪を３−Ｈチミジンの存在下でインキュベートし、そして組織を処理した後に放射能を測定した。これらの組織についてＤＮＡ含量及び蛋白質含量を同時に測定した。

アンジオペプチンの８回の注射を行った。バルーン処理の前日の朝及び夕方、処理当日に２回、その後の２日間に各２回づつであり、合計日用量は２．２０又は２００ｊ１ｇ／ｋｇ体重であった。

バルーン血管形成の後のラビットの大動脈における筋肉血管内膜細胞増殖に対する薬剤の阻害効果を示すアンジオベブチンの３種類の投与量（２ｇ、２０ＩＪｇ及び２００　ｔｒｉ　／　ｋｇ　）を試験した。

１、Ｉａ！！Ｌニ一般に、この薬剤は大動脈の湿重量に影響を与えないようである。バルーン処理されていない領域の湿重量において差異は存在しなかった。しかしながら、大動脈のバルーン処理された領域は、組織の水和の差異に９％されるわずかに高い湿重量を有していた。結果を第１図に示す。

２、Ｘ皇ｉ食に丘上：低い投与量（２硝）において、アンジオペプチンはバルーン血管形成術の後傷害された動脈の合計量白質含量を低下せしめた。アンジオペプチンのより高い投与量が全蛋白質レベルに影響を与えなかった。これは対照と処理された大動脈との間に有意な差が存在しないことから言える。結果を第２図に示す。

３、−回）し〜／」【白Ｊｔｕ七：アンジオペブチン２０題／ｋｇ体重はＤＮＡ／蛋白質比を有意に低下せしめ、これによりラビットの大動脈の筋肉血管内膜に対するその阻害効果を示した。より高い投与量（２００ｘ／ｋｇ体重）はまたこの薬剤の阻害的影響に反映した。結果を第３図に示す。

４、　チミジン　３−）−１の　入　：細胞増殖（筋肉血管内膜の増殖）の速度をバルーン血管形成後のラビットの大動脈への３−ＨＴｄＲの取込みによりモニターし、そしてアンジオベプチンが細胞増殖の速度を有意に阻害したことが観察された。２０ｘ／ｋｇ体重の投与量が、バルーン血管形成術後の細胞増殖速度を有意に低下せしめることが見出された。より高い投与量、ずなわち２００ｇ／ｋｇが筋肉血管内膜の増殖をなお阻害したが、阻害の程度は２０■投与よりも低かった。結果を第４図に示す。

実施±７　王猾　ブタ右ゴ゛　の　に・−灸１ヱ２第３１１づ勺囚肱及家畜ブタの心臓を、動物を殺した直後に屠殺場から得た。

心臓を得、そして氷冷したクレーブス・リンゲル緩衝液に入れ、そして実験室に輸送した。左冠動脈（ＬＡＤ）を無菌条件下で切り取り、そして５ｍ１１１の切片に分割した。管腔に金属棒をおだやかに導入することにより切片から内皮を除去した。組織を無菌多ウェル培養皿中の１滅の培地（ウシ胎児血清を含まず抗性物質を含むＤ？ＩＥＭ　）に入れた。、Ｈ３−チミジン（２，５μＣｉ　／　ｒａｉｌ　）及び増加する濃度のアンジオテンシン（１０〜１１０００ｒ１／Ｉｄ）を培地に加えた。３種類の異る濃度のホルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）と共にインキュベートした切片を各実験において陽性対照として使用した。インキュベーション時間は３７°Ｃ及び５％ＣＯ，にて２４時間であった。組織をリン酸緩衝液で洗浄し、そして冷チミジンの溶液に入れそして液体窒素で凍結し、粉砕し、そして低張液により溶解した。溶解した組織をプロテイナーゼにと共に５０°Ｃにて一夜さらにインキュベートした。放射能、蛋白質含量及びＤＮＡを測定した。

詰−果浄書（内容に変更なし）Ａ＝大動脈のバルーン処理された領域処理（ＡＰ　ＰＧ）Ｎ＝５処理（ＡＰ　ＰＧ）処理（ＡＰ　ＩＬＧ）手続補正書（方式）％式％１、事件の表示ＰＣＴ／ＵＳ８９１０２３５２２、発明の名称血管閉塞の抑制に有用なペプチド３、補正をする者事件との関係　特許出願人名称　ソシエテ　ブトラブ　ドウ　プロドユイシミク４、代理人住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号静光虎ノ門ビル　電話５０４ −０７２１６、補正の対象図面の翻訳文７、補正の内容図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし）８、　添付書類の目録図面の翻訳文　１５Ｍ国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．哺乳類における血管閉塞を抑制する方法であって、次の式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立に、Ｈ，Ｃ１−１２アルキル、Ｃ７〜１０フェニルアルキル、Ｒ１ＣＯ（ここで、Ｒ１はＣ１〜２０アルキル、Ｃ３〜２０アルケニル、Ｃ３〜２０アルキニル、フェニル、ナフチル、又はＣ７〜１０フェニルアルキルである）、又はＲ２ＯＣＯ（ここで、Ｒ２はＣ１〜１０アルキル又はＣ７〜１０フェニルアルキルであり、但しＡ１又はＡ２の−方がＲ１ＣＯ又はＲ２ＯＣＯである場合他方はＨでなければならず；Ａ３はＣＨ２Ａ６（ここで、Ａ６はペンタフルオロフェニル、ナフチル、ピリジル、又はフェニルである）であり；Ａ４はｏ−，ｍ−又はより好ましくはｐ−置換Ｘ−Ｐｈｅ（ここで、Ｘはハロゲン、Ｈ，ＮＨ２，ＮＯ２，ＯＨ、又はＣ１〜１３アルキルである）、ペンタフルオロ−Ｐｈｅ，β−Ｎａｌ又はＴｙｒであり；Ａ５はＴｈｒ，Ｓｅｒ，Ｐｈｅ，Ｖａｌ，α−アミノ酪酸、又はＩｌｅであり；Ａ７はＴｈｒ，Ｔｒｐ、又はβ−Ｎａ１（そしてＤ−又はＬ−異性体のいずれであってもよい）であり；そしてＺはＮＨ２又はＯＨである〕を有するオクタペプチド又はその医薬として許容される塩の血管閉塞抑制有効量を哺乳類に投与することを含んで成る方法。
２．前記オクタペプチドが次の式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ａ４は前に定義した通りであり、Ａ５はＶａｌ又はＴｈｒであり、Ａ７はＬ−ナフチルアラニン、スレオニン又はトリプトファンであり、そしてＡ８はＤ−β−ナフチルアラニン又はＤ−フェニルアラニンである）を有する、請求項２に記載の方法。
３．前記オクタペプチドを、血管形成術のすぐ前に、その間に、又はその後６ヶ月以内に投与する、請求項２に記載の方法。
４．前記オクタペプチドを血管形成術の２４時間以上前に投与する、請求項４に記載の方法。
５．投与されるオクタペプチドが次の式：▲数式、化学式、表等があります▼ を有するか化合物であるか又はその医薬として許容される塩である、請求項１に記載の方法。
６．投与されるオクタペプチドにおいてＺがＮＨ２であり、そして▲数式、化学式、表等があります▼がＤ−β−ナフチルアラニンである、請求項１に記載の方法。
７．前記オクタペプチドを皮下投与する、請求項２に記載の方法。
８．前記オクタペプチドを１〜１００μｇ／ｋｇ／日の投与量で投与する、請求項２に記載の方法。
９．血管形成術、動脈バイパス手術又は同種移植片移植手術後の哺乳類において血管閉塞を抑制する方法であって、次の式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＺはＮＨ２又はＯＨである）のオクタペプチド又はその医薬として許容される塩を患者に、血管形成術、動脈バイパス手術又は同種移植片移植手術の２４時間以上の前に投与することを含んで成る方法。
１０．投与を血管形成術の後に続ける、請求項９に記載の方法。
１１．前記オクタペプチドを皮下投与する、請求項１０に記載の方法。