PT734396E - Analogos da hgh-rh(1-29)nh2 possuindo actividade antagonistica - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

ANÁLOGOS DA hGH-RH (1-29)NH2 POSSUINDO ACTIVIDADE ANTAGONÍSTICA

ÂMBITO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a novos peptídeos sintéticos que inibem a libertação da hormona de crescimento na glândula pituitária em mamíferos, e às composições terapêuticas contendo estes novos peptídeos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A hormona do crescimento (“GH”) é um peptídeo possuindo 191 aminoácidos que estimula a produção de inúmeros factores de crescimento IGF-I diferentes promovendo assim o crescimento de inúmeros tecidos (esqueleto, tecido conectivo, músculos e vísceras) e a actividade fisiológica (crescimento do ácido nucléico e síntese protéica e lipólise, mas diminuindo a secreção de ureia). A libertação d hormona do crescimento está sob o controle dos factores de libertação e de inibição segregados pelo hipotálamo. O factor de libertação primário é a hormona de libertação da hormona do crescimento (“GH-RH”); a hormona de libertação da hormona do crescimento humana (“hGH-RH”) é um peptídeo possuindo 44 aminoácidos. Os novos peptídeos da presente invenção referem-se a análogos da hGH-RH possuindo apenas resíduos 1 até 29 (“hGH-RH(1-29)NH2”), isto é, a análogos do peptídeo que possuam a sequência de aminoácidos seguinte:

Tyr - Ala - Asp - Ala - lie5- Phe - Thr - Asn - Ser - Tyr10- Arg - Lys - Vai - Leu - Gly15 - Gin - Leu - Ser - Ala - Arg20 - Lys - Leu - Leu - Gin - Asp25 - lie - Met - Ser - Arg29 -NH2 A hormona do crescimento tem sido relacionada com várias doenças. Uma doença em que a hormona do crescimento está envolvida é a acromegalia, na qual estão presentes níveis excessivos de hormona do crescimento. O crescimento anormalmente elevado dos ossos faciais e das extremidades que caracteriza esta doença pode ser tratado administrando um antagonista da hormona de libertação da hormona de crescimento. 1 respectivamente, e que se acreditam ser devidos à hormona do crescimento, resultam na cegueira ou na redução da função urinária. Os danos mencionados podem ser evitados ou retardados por administração de um antagonista efectivo da hormona de libertação da hormona de crescimento.

Num esforço para intervir nestas doenças e noutras condições, alguns investigadores têm tentado controlar os níveis de hormona do crescimento usando somatostatina, um inibidor da libertação da hormona do crescimento. Contudo, a somatostatina, se administrada por si só, não leva os níveis de hormona do crescimento nem o IGF-I para valores desejados. Se administrada em combinação com um antagonista da hormona de libertação da hormona de crescimento, a somatostatina melhorará a supressão dos níveis de IGF-I mais eficazmente.

Outros profissionais têm investigado as várias modificações da hormona de libertação da hormona de crescimento para elucidar a relação entre a estrutura desta e a sua actividade num esforço para proporcionar congéneres sintéticas com propriedades antagonistas melhoradas. (A síntese pode ser através de um método de fase sólida, descrito na Patente US n.s 4 914 189, ou em fase líquida, tal como descrito na Patente US n.s 4 707 541.) Assim, num estudo, foi descoberto que a síntese da hormona de libertação da hormona de crescimento sem o resíduo do seu terminal N - isto é, formando HGH-RH(2-44) - resulta num análogo possuindo uma propriedade de libertação da hormona do crescimento que é apenas 0,1% da exibida pela GH-RH. Por outro lado, a síntese do análogo da hormona de libertação da hormona do crescimento sem os seus resíduos 30 a 44 - isto é, sintetizando a hGH-RH(1-29)NH2- resulta num análogo que retém 50% ou mais da potência da hGH-RH nativa. A síntese de análogos ainda mais curtos - por exemplo, GH-RH(1-28)NH2 ou GH-RH(1-27)NH2 - resulta numa redução significativa da respectiva actividade biológica. Estes resultados indicam que os resíduos 1 a 29 são importantes para a actividade biológica da hormona de libertação da hormona de crescimento.

Noutro estudo, foi descoberto que a acetilação do azoto terminal do resíduo de aminoácido da hormona de libertação da hormona de crescimento, ou a sua substituição por um isómero D - formando assim a [Ac-Tyr1]GH-RH ou [D-Tyr^GH-RH - diminui a habilidade dos análogos para a libertação da hormona do crescimento para 2 a 3% da exibida pela GH-RH. Estes análogos possuem também menor afinidade in vitro pelos 2 centros activos da GH-RH. Por outro lado, a acetilação do grupo amino alfa do resíduo 1 na hGH-RH(1-29)NH2 - assim formando a [Ac-Tyr1]hGH-RH(1-29)NH2 - foi descoberta aumentar a potência in vivo relativamente à da GH-RH num factor de 10 ou mais.

Em estudos precedentes, foi descoberto que [Ac-Tyr1, D-Arg2]hGH-RH(1-29)NH2 antagoniza a activação da adenilato ciclase pituitária anterior em ratos pela hGH-RH(1-29)NH2. O mesmo peptídeo foi descoberto bloquear a acção da GH-RH nos seus receptores na glândula pituitária e no hipotálamo, e inibir a secreção pulsátil da hormona do crescimento. Várias modificações reportadas da GH-RH resultaram em actividade antagonística. A Patente US n.s 4 659 693 descreve agonistas da hGH-RH(1-29) possuindo a fórmula: R1 - R2- Asp - Ala - lie - Phe - Thr - Asn - Ser - Tyr - Arg - Lys - Vai - Leu - Gly - Gin - Leu - Ser - Ala - Arg - Lys - Leu - Leu - Gin - Asp - lie - R27- Ser - Arg - NH2, em que R1 é H, Tyr ou His; R2 pode ser vários resíduos; e R27 é Nle. Estes agonistas são tidos como estimulantes da libertação do factor de libertação da hormona de crescimento (“GRF’) e serem assim apropriados a composições terapêuticas. (“GRF é meramente um sinónimo da GH-RH, e a última abreviação passa a ser usada daqui por diante, apesar da utilização da denominação GRF na Patente US n.s 4 659 693 e noutras publicações.) A Patente US n.s 4 659 693 descreve outros análogos da GH-RH que são agonistas. Nestes agonistas, o grupo Q1CO- do terminal N, em que Q1 refere-se a determinados grupos alquilo omega ou alfa substituídos, podem ser Tyr ou des-amino-Tyr; o grupo terminal C NH-Q2, em que Q2 refere-se a determinados grupos omega guadino alquilo, podendo ser Agm; e R27 pode ser Nle. Estes análogos são tidos como sendo estimulantes extremamente potentes da libertação da hormona do crescimento e gozar de elevada resistência à degradação enzimática in vivo devido ao grupo alquilo inferior omega guadino no terminal C. O pedido de patente publicado WO 91/16923 revê as tentativas anteriores de alteração da estrutura secundária da hGH-RH através da modificação da sua sequência de aminoácidos. Estas tentativas anteriores incluem: a substituição da Tyr1, Ala2, Asp3 ou Asn8 com os seus isómeros D; a substituição da Ser9 por Ala para aumentar o carácter 3 anfílico da região; e a substituição da Asn8 por L- ou D-Ser, D-Arg, Asn, Thr, Gin ou D-Lys. Algumas destas modificações são ditas aumentar a actividade de libertação da hormona do crescimento. O documento WO 91/16923 também afirma que a substituição da Asn8 pela Ala induz um aumento enorme na actividade de libertação da hormona de crescimento. Os peptídeos que são ditos possuir este benefício são da fórmula: [R1, R2, Ala8, R16, Nle27]hGH-RH(1-29)-NH2, em que R1 é Dat ou A-R1, em que A é acilo ou benzilo inferior e R1 incluem Tyr e His; R2 ó Ala, D-Ala ou N-Me-D-Ala (N-Metil-D-Ala); e R15 pode incluir Gly, Ala ou Aib. Uma incorporação preferível possuir R8,9,15como Ala. É notado que R8 nesta publicação nunca é a Asn. Composições farmacêuticas que fomentam o crescimento são adicionalmente descritas. O Pedido de Patente Europeia com o número de série 0 413 839 A, submetido a 22 de Agosto de 1989, em nome do mesmo requerente que esta invenção, descreve análogos da hGH-RH(1-29)-NH2 que é tida como aumentando a libertação da hormona do crescimento. Os análogos deste pedido substituem os resíduos 1,2, 8,12,15, 27, 28 e 29, tal como se segue: R1 pode ser Tyr ou Dat; R2 pode ser L ou D Ala; R8 pode ser Asn ou Ser; R12 pode ser os isómeros L ou D da Lys, Arg ou Orn; R15 pode ser Gly ou Ala; R27 pode ser Nle; R28 pode ser Asp, Asn ou Ser; e R29 pode ser Agm. Contudo, o resíduo 6 não pode nunca ser substituído, sendo sempre um Phe.

Ainda outra modificação da hGH-RH foi descrita na Patente US n.fi 5 183 660, em que a GH-RH foi conjugada com derivados do polietileno glicol. O conjugado resultante foi dito exibir antigeneticidade decrescente, retardamento na renovação biológica in vivo e na actividade fisiológica através de um período de tempo mais alargado.

Em muitas destas investigações, foi descoberto que variantes dos análogos agonistas da hGH-RH tinham actividade antagonista e não agonista. Assim, na patente US 4 659 693 (em que R2 pode ser determinados resíduos D-Arg substituídos por grupos alquilo), em que R1 é H, os análogos da hGH-RH são ditos actuar como antagonistas. De forma similar, no documento WO 91/16923, acima discutida, se R2 nos análogos é a D-Arg, e R8, R9 e R15 são substituídos tal como acima indicado, a actividade antagonística é dita resultar. Estes peptídeos antagonistas são tidos como sendo apropriados à administração em composições farmacêuticas para tratar condições associadas a existência de níveis demasiado elevados de hormona do crescimento, por exemplo, na acromegalia. 4 A actividade antagonista do análogo da hGH-RH “[SerL^CH^NHl-Tyr^jhGH-RHO^)” da patente US n.2 5 084 555 foi dito resultar na ligação pseudopeptídica (isto é, uma ligação peptídica reduzida a uma ligação [CH2-NH]) entre os resíduos R9 e R'°. (É notado que apesar desta invenção empregar a fórmula “Ψ[0Η2-ΝΗ]” aparentemente redundante da ligação pseudopeptídica, de facto apenas uma destas ligações foi introduzida no peptídeo.) Contudo, as propriedades antagonísticas do RH [Se^-TICHrNHJ-Tyr^hGH-RH(1-29) foram ditas ser inferiores à de um antagonista convencional, [N-Ac-Tyr1, D-Arg2]GH-RH(1-29)-NH2.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO É proporcionada uma nova série de análogos sintéticos da hGH-RH(1-29)NH2. Estes análogos inibem a actividade da hGH-RH endógena, e portanto impedem a libertação da hormona do crescimento. Acredita-se que esta inibição resulta de uma substituição de vários aminoácidos e da acilação com ácidos aromáticos ou não polares no terminal N da hGH-RH(1-29)NH2. Os análogos exibem duração antagonística prolongada.

Especificamente, a invenção refere-se a peptídeos possuindo a fórmula: X - R1 - R2- R3- R4- R5- R6- Thr - R8- Ser-Tyr - R11 - R12- Vai - Leu - R15-Gln - Leu - Ser - R19 - R20- R21 - Leu - Leu - Gin - Asp - lie - R27- R28- R29 em que X é H, Ibu, Nac, 2-Nac, 1- Npt, nada, Ac, lAc, BrProp, 1- ou 2-Npr ou Aqc; R1 é Tyr, His, Glu ou Glt; R2 é D-arg, D-cit; R3 é Asp, Ala ou Gly; R4 é Ala ou Gly; R5 é lie, Ala ou Gly; R8 é Phe, Ala, Pro, Tpi, Nal ou Phe (Y), em que Y é o F, Cl, Br, NO2. CH3 ou OCH3; R8 é Asn, Ser, Vai, lie, Ala, Abu, Nle ou Aib; R11 é Arg, D-Arg ou Cit; R12 é Lys, D-Lys, Cit ou Ala; R15 é Ala ou Abu; 5 R19 é Ala; ...... -........ R20 é Arg, D-Arg ou Cit; RZ1 é Lys, D-Lys ou Cit; R27 é Nle ou Abu; R28 é Ser, Asn, Asp ou Abu; e R29 é Agm, Arg-NH2, Arg-OH, Cit-NH2, Cit-OH, Har-NH2 ou Har-OH, desde que quando R2 é a D-Arg: X é H, Ibu, Nac, 2-Nac ou 1- Npt, R1 não é Glt, R3 é Asp, R6é Phe(pCI), Tpi, ou Nal, R8 é Asn, R12 é Lys, R15 é Abu, R27 é Nle, R28 é Ser, e R29 é Agm ou Arg-NH2, desde que quando R2 é a D-Cit:

Xnãoé1-Npt, desde que quando R2 é a D-Cit e R1 é a Glt: X é nada e os respectivos sais de adição a ácidos farmaceuticamente aceitáveis.

Entre as incorporações preferíveis estão os peptídeos em que X é Nac ou Ibu, R1 é a Tyr ou His, R2 é D-arg ou D-cit, R3 é Asp, R4 é Ala, R5 é lie, R6 é Phe(pCI) ou Nal, R11 é Arg, R12 é Lys, R1S é Abu ou Ala, R19 é Ala, R20 é Arg, R21 é Lys, R27 é Nle; R28 é Ser ou Asp, e R29 é Agm ou Arg-NH2. Estas incorporações largamente preferíveis possuem as fórmulas:

Nac° - Tyr - D-Arg2 - Asp - Ala - lie - Phe(pCI)6 - Thr - Asn - Ser - Tyr - Arg - Lys - Vai - Leu - Abu15 - Gin - Leu - Ser - Ala - Arg - Lys - Leu - Leu - Gin - Asp - lie - Nle27 -Ser - Agm (“Peptídeo 18”)

Nac° - Tyr- D-Arg2- Asp - Ala - lie - Nal6 - Thr - Asn - Ser - Tyr - Arg - Lys - Vai - Leu - Abu15 - Gin - Leu - Ser - Ala - Arg - Lys - Leu - Leu - Gin - Asp - lie - Nle27 - Ser -Agm (“Peptídeo 32”)

Nac°- Tyr- D-Cit2- Asp - Ala - lie - Phe(pCI)6- Thr - Asn - Ser - Tyr - Arg - Lys - Vai -Leu Abu15 - Gin - Leu - Ser - Ala - Arg - Lys - Leu - Leu - Gin - Asp - lie - Nle27 - Ser -Agm (“Peptídeo 34”).

Sob a convenção bem estabelecida, estes podem ser abreviados tal como se segue: [Nac°, D-Arg2, Phe(pCI)6, Abu15, Nle^hGH-RHO -28) Agm Peptídeo 18 6

Peptídeo 32 [Nac°, D-Arg2, Nal6,Abu15, Nle27]hGH-RH(1-28) Agm [Nac°, D-Cit2, Phe(pCI)6, Abu15, Nle27]hGH-RH(1 -28) Agm Peptídeo 18

Quatro incorporações especialmente preferíveis possuem as fórmulas:

Nac°- Tyr - D-Arg2 - Asp - Ala - lie - Phe(pCI)6- Thr - Asn - Ser - Tyr - Arg - Lys - Vai - Leu - Abu15 - Gin - Leu - Ser - Aia - Arg - Lys - Leu - Leu - Gin - Asp - lie - Nle27 -Ser - Arg-NH2 (“Peptídeo 1”)

Nac°- Tyr- D-Arg2 - Asp - Ala - lie - Phe(pCI)6- Thr - Asn - Ser - Tyr - Arg - Lys - Vai - Leu - Abu15 - Gin - Leu - Ser - Ala - Arg - Lys - Leu - Leu - Gin - Asp - He - Nle27-Ser-Arg-NH2 (“Peptídeo 5") lbu°- Tyr- D-Arg2- Asp - Ala - lie - Phe(pCI)6- Thr - Asn - Ser - Tyr - Arg - Lys - Vai -Leu - Abu15 - Gin - Leu - Ser - Ala - Arg - Lys - Leu - Leu - Gin - Asp - lie - Nle27 - Ser -Agm (“Peptídeo 19").

Que podem ser representadas pela convenção bem aceite respectivamente como se segue: [Nac°, D-Arg2, Phe(pCI)6, Abu15, Nle^hGH-RHfl -28) NH2 Peptídeo 1 [Nac°, His1-D-Arg2, Phe(pCI)6, Abu15, Nle^JhGH-RHO-28) NH2 Peptídeo 5 [lbu°, D-Arg2, Phe(pCI)6, Abu15, Nle27]hGH-RH(1 -28) Agm Peptídeo 19

Note-se que os resíduos de aminoácidos entre 30 e 44 da molécula de GH-RH nativa não aparentam ser essenciais à actividade; nem a sua identidade aparenta ser crítica. Por consequência, é aparente que a adição de alguns ou a totalidade destes resíduos de aminoácidos ao terminal C dos análogos da hGH-RH(1-29) NH2da presente invenção não 7 afectará a eficácia destes análogos como antagonistas da hormona do crescimento. Se alguns ou a totalidade destes aminoácidos forem adicionados ao terminal C dos análogos da hGH-RH(i-29) NH2i os resíduos de aminoácidos adicionados podem ser os mesmos que os resíduos 30 a 44 na sequência nativa da hormona de libertação da hormona do crescimento ou nos seus equivalentes razoáveis. Métodos de Síntese

Os peptídeos sintéticos são sintetizados através de um método apropriado tal como através de técnicas exclusivas de fase sólida, por técnicas parciais de fase sólida, por condensação de fragmentos ou através da clássica síntese em solução.

Quando os análogos desta invenção são sintetizados através do método de fase sólida, o resíduo do C terminal (aqui, R29) encontra-se apropriadamente ligado (ancorado) a um suporte sólido inerte (resina) que simultaneamente comporta grupos protectores para o seu grupo amino (e, quando apropriado, para o seu grupo funcional da cadeia lateral). Uma vez este passo completo, o grupo de protecção amino alfa é removido do resíduo de aminoácido ancorado e o próximo resíduo de aminoácido, R28, é adicionado possuindo o grupo amino alfa (bem como qualquer grupo funcional de cadeia apropriada) convenientemente protegido, e assim por diante. Os grupos protectores do terminal N são removidos após a adição de cada resíduo, mas os grupos de protecção das cadeias laterais não são ainda removidos. Após todos os aminoácidos terem sido ligados na sequência apropriada, o peptídeo é separado do suporte e libertado de qualquer grupo de protecção de cadeia lateral sob condições que sejam minimamente destrutivas relativamente aos resíduos na sequência. Este processo deverá ser seguido por uma purificação cuidadosa e por uma caracterização escrupulosa do produto sintetizado, por forma a assegurar que a estrutura desejada seja de facto a obtida. É particularmente preferível proteger a função alfa amino dos aminoácidos durante o passo de adição com um grupo protector sensível à presença de ácido ou de base. Tais grupos protectores deverão possuir as propriedades de serem estáveis nas condições de formação da ligação peptídlca, e simultaneamente serem susceptíveis de ser prontamente removidos sem destruição da cadeia de peptídeo em crescimento e sem racemização de qualquer dos centros quirais aí contidos. Grupos protectores alfa amino apropriados são o Boc e o Fmoc. 8

Aplicações Médicas

Os peptídeos antagonistas da hGH-RH, ou os sais destes peptídeos, podem ser formulados na forma de dosagens farmacêuticas contendo quantidades efectivas deste e administrados a humanos e animais para propósitos terapêuticos ou de diagnóstico. Os peptídeos podem ser usados para suprimir os níveis de hormona do crescimento e para tratar condições associadas à presença de níveis excessivos de hormona do crescimento, por exemplo, retinopatia ou nefropatia diabéticas, e acromegalia. A principal aplicação dos antagonistas da GH-RH são, contudo, no campo do cancro, por exemplo, nos cancros humanos da mama, pulmão, cólon, cérebro, e pâncreas em que os receptores do IGF-I se encontram presentes.

BREVE DESCRIÇÃO DAS REPRESENTAÇÕES GRÁFICAS A figura 1 é uma representação gráfica dos volumes de tumor em rato exposta atímico possuindo sarcomas humanos SK-ES-1 transplantados s. c. no decorrer de tratamento com Peptídeo 19 administrado através de mini-bombas osmóticas a uma dose de 40 pg/animal/dia. O tratamento foi iniciado quando os tumores mediam aproximadamente 33 a 39 mm3 e mantido por 4 e 3 semanas, respectivamente. A figura 2 é uma representação gráfica dos volumes de tumor em rato exposto atímico possuindo sarcomas humanos MNNG/HOS transplantados s. c. no decorrer de tratamento com Peptídeo 19 administrado através de mini-bombas osmóticas a uma dose de 40 pg/animal/dia. O tratamento foi iniciado quando os tumores mediam aproximadamente 33 a 39 mm3 e mantido por 4 e 3 semanas, respectivamente. A figura 3 é uma representação gráfica do efeito inibidor do Peptídeo 19, antagonista da GH-RH, no crescimento do cancro mamário MXT estrogénio independente em cobaias. DESCRIÇÃO DETALHADA DAS INCORPORAÇÕES PREFERÍVEIS A. Abreviações A nomenclatura utilizada na definição dos peptídeos é a especificada pelo IUPAC-IUB Commissioner on Biochemical Nomenclature em que, em conformidade com a 9 representação convencional, o grupo amino no terminal N aparece à esquerda e o grupo carboxílico no terminal C aparece à direita. O termo “aminoácidos naturais” tal como aqui usado refere-se a um dos L-aminoácidos comuns que ocorrem naturalmente que se encontram nas proteínas que ocorrem naturalmente: Cly, Ala, Vai, Leu, ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met Phe, Tyr, Pro, Trp e His. Quando o resíduo de aminoácido natural possui formas isoméricas, é a forma L do aminoácido que é aqui representada a não ser que expressamente referido em contrário.

Os aminoácidos não codificados, ou análogos de aminoácidos, são também incorporados nos antagonistas da GH-RH. (Aminoácidos “não codificados” são aqueles aminoácidos que não se encontram entre os aproximadamente 20 aminoácidos naturais que se encontram nos peptídeos que ocorrem naturalmente.) Entre os aminoácidos não codificados que podem ser usados nos peptídeos antagonistas da GH-RH encontram-se os seguintes: por Abu refere-se ao ácido alfa amino butírico, por Agm refere-se à agmatina (1-amino-4-guanidino-butano), por Aib refere-se ao ácido alfa amino isobutírico, por Har refere-se à homoarginina, por hPhe refere-se à homo-feniialanina, por Nal refere-se à 2-naftil-alanina, e por Nle refere-se à norleucina. Quando estes aminoácidos não codificados, ou análogos de aminoácidos, possuem formas isoméricas, é a forma L do aminoácido que é aqui representada a não ser que expressamente referido em contrário.

Abreviações aqui usadas são:

Abu Ácido a-aminobutírico Ac Acetilo AcOH Ácido Acético Ac20 Anidrido Acético Agm Agmatina (1 -amino-4-guanidino-butano) Aib Ácido a-aminoisobutírico Aqc Antraquinona-2-carbonilo BHA Benzidrilamina Boc ter-butiloxicarbonilo Bom Benziloximetilo BOP Hexafluorofosfato de benzotriazole-1-yl-oxi-tris-(dimetílamino) fosfónio BrProp Bromopropionilo Bzl Benzilo 10 cHx Ciclohexilo Cit Citrulina, por exemplo, ácido 2-amino-5-ureidovalérico DCC Diciclohexilcarbodiimida DCM Diclorometano DIC N, N '-di-isopropilcarbodiimida DIEA Di-isopropiletilamina DMF Dimeti Iformamida Fmoc Fluorenilmetiloxicarbonil GH Hormona do Crescimento GH-RH Hormona de Libertação da Hormona do Crescimento Glt Glutarilo Har Homoarginina hPhe Homofenilalanina HPLC Cromatografia Líquida de Elevado Desempenho lAc lodoacetilo Ibu Isobutirilo MeOH Metanol MeCN Acetonitrilo MBHA Para-metiibenzilhidrilamina Nac 1 -Naftilacetil 2-Nac 2-Naftilacetil Nal 2-Naftil-alanina Nle Norleucina NMM N-metiimorfolina Npr 1- Npt 2- Npt Phe(pCI) RGH-RH Naftilpropionil 1 -Naftofl 2-Naftofl Para-cloro-fenilalanina GH-RH de rato RP-HPLC HPLC de fase reversa SPA Acetil sulfofenoxi TFA Ácido trifluoroacético Tos Para-toluenosulfonil Tpi Ácido 2, 3, 4, 9-tetrahidro-1 H-pirido[3,4-b]indol-3-carboxílico z Benziloxicarbonilo 11 φ

Anel aromático não substituído

B. Os análogos da GH-RH

Os análogos da GH-RH da presente invenção foram projectados para aumentar as afinidades do peptídeo pelo receptor, para melhorar a estabilidade metabólica e para maximizar a estrutura secundária anfofílica das moléculas. Vários destes análogos causam inibição da libertação muito eficaz e de duração prolongada da hormona do crescimento estimulada pela hGH-RH(1-29)NH2.

As seguintes incorporações são especialmente preferíveis por possuírem actividade biológica notável: [Nac°, D-Arg2, Phe(pCI)6, Abu15, Nle^hGH-RHO^NHa Peptídeo # 1 [lbu°-His\ D-Arg2, Phe(pCI)6, Abu15, Nle27]hGH-RH(1-29)NH2 Peptídeo # 3 [Nac°, His1-D-Arg2, Phe(pCI)6, Abu15, Nle27]hGH-RH(1-29)NH2 Peptídeo # 5 [lbu°-Glu1, D-Arg2, Phe(pCI)6, Abu15, Nle27]hGH-RH(1-29)NH2 Peptídeo # 7 [IAc°-Glu1, D-Arg2, Phe(pCI)6, Abu15, Nle27]hGH-RH(1-29)NH2 Peptídeo # 8 [Nac°-Glu1, D-Arg2, Phe(pCI)6, Abu15, Nle27]hGH-RH(1-29)NH2 Peptídeo # 9 [lbu°-His1, D-Arg2, Tpi6, Abu15, Nle27]hGH-RH(1-29)NH2 Peptídeo # 10 [Nac°, D-Arg2, Phe(pCI)5,Abu15, Nle27]hGH-RH(1-28)Agm Peptídeo # 18 [lbu°. D-Arg2, Phe(pCI)6, Abu15, N!e27]hGH-RH(1-28) Agm Peptídeo #19 [Nac°, D-Arg2, Nal6, Abu15, Nle27]hGH-RH(1-28)Agm [Nac°, D-Cit2, Phe(pCI)6, Abu15, Nle27]hGH-RH(1-28)Agm 12 Peptídeo # 32 Peptídeo # 34

Peptídeo # 34 [D-Cit2, Phe(pCI)6, Abu15, Nle27]hGH-RH(1-28) Agm Peptídeo # 35 [Nac°, D-Cit2, Nal6, Abu15, Nle^jhGH-RI-KI -28) Agm Peptídeo # 36 [D-Arg2, Phe(pCI)6, Abu15, Nle27]hGH-RH(1-28) Agm Peptídeo # 37

Três incorporações altamente preferíveis possuem as seguintes fórmulas: [Nac°, D-Arg2, Phe(pCI)6, Abu15, Nle27]hGH-RH(1-28)Agm Peptídeo #18 [Nac°, D-Arg2, Nal®, Abu15, Nle^JhGH-RHO -28) Agm Peptídeo # 32 [Nac°, D-Cit2, Phe(pCI)6, Abu15, Nle27]hGH-RH(1-28) Agm As incorporações mais privilegiadas possuem as fórmulas: Peptídeo # 34 [Nac°, D-Arg2, Phe(pCI)6,Abu15, Nle^hGH-RHíl^SJNHz Peptídeo # 1 [Nac°, His1-D-Arg2, Phe(pCI)6, Abu15, Nle27]hGH-RH(1-28)NH2 Peptídeo # 5 [lbu°, D-Arg2, Phe(pCI)6, Abu15, Nle27]hGH-RH(1-28) Agm C. Método de Preoaracão Peptídeo #19. 1. Breve Descricão da Síntese

Os peptídeos sintéticos são preparados através de um método apropriado tal como através de técnicas exclusivas de fase sólida, por técnicas parciais de fase sólida, por condensação de fragmentos ou através da clássica síntese em solução. Por exemplo, as técnicas de síntese exclusiva em fase sólida são avançadas no livro de texto “Solid Phase Peptide Synthesis”, da autoria de J. M. Stewart e J. D. Young, da Pierce Chem. Company, Rockford, 111, de 1984 (2a edição), e “Principies of Peptide Synthesis”, da autoria de M. Bodansky, da SpringerVerlag, de 1984. Os peptídeos antagonistas da hGH-RH são de preferência preparados usando técnicas de síntese em fase sólida, tais como as descritas 13 na generalidade por Merrifield no J. Am. Chem. Soc., 85, pág. 2149 (1963), apesar de outras sínteses químicas equivalentes conhecidas da técnica poderem também ser utilizadas tal como anteriormente mencionado. A síntese á levada a cabo com aminoácidos que são protegidos no seu grupo amino alfa. Grupos de protecção do tipo uretano (Boc e Fmoc) são de preferência usados para a proteeção do grupo amino alfa. O grupo de protecção preferível é o Boc.

Na síntese de fase sólida, o fragmento que forma o grupo aminoacilo do peptídeo final no terminal C é ligado a um suporte de resina polimérica através de uma ligação química. Após a reacção de acoplamento ter sido completa o grupo protector amino alfa é removido selectivamente para permitir que as subsequentes reacções de acoplamento tomem lugar no terminal amino, de preferência com 50% de TFA em DCM: Os aminoácidos restantes com grupos amino alfa similarmente protegidos são acoplados passo a passo ao grupo amino livre do aminoácido precedente na resina para obter a desejada sequência peptídica. Uma vez que os resíduos de aminoácidos são adicionados ao grupo amino alfa do resíduo de carbono terminal, o crescimento dos peptídeos sintéticos de análogos da hGH-RH tem inicio no terminal C e progridem até ao terminal N. Uma vez obtida a sequência desejada, o peptídeo é acilado, se apropriado, e é removido do polímero de suporte.

Cada aminoácido protegido é usado em excesso (2,5 ou 3 equivalentes) e as reacções de acoplamento são usualmente levadas a cabo em DCM, DMF ou misturas destes. A extensão da concretização da reacção de acoplamento é monitorizada em cada estágio através da reacção da ninhidrina. Em casos em que é identificado o acoplamento incompleto, o procedimento de acoplamento é repetido antes da remoção do grupo protector amino alfa antes do acoplamento do próximo aminoácido.

Um típico ciclo de síntese é apresentado na Tabela I.

TABELA I

Protocolo para um Típico Ciclo Sintético Usando a Estratégia do Boc 14

Passo (min)

Reagente

Tempo de Mistura 1. Desprotecção 5 + 25

50 % TFA em DCM

Lavagem com DCM 1

Lavagem com 2-propanol 1 2. Neutralização 3. Acoplamento 4. Acetilação +20 (se apropriado) 5 % Dl EA em DCM 1

Lavagem com DCM 1

Lavagem com MeOH 1 5 % Dl EA em DCM 3

Lavagem com MeOH 1

Lavagem com DCM (3 vezes) 1 -1 3 equiv. de Boc - Aminoácido em DCM ou DMF 60 + 3 equiv. DIC ou o éster de HOBt preparado do

Boc - Aminoácido

Lavagem com MeOH 2

Lavagem com DCM 2

Lavagem com MeOH 2

Lavagem com DCM 2

Lavagem com MeOH 2

Lavagem com DCM 2

Ac20 em DCM (30 %) 10

Lavagem com MeOH (3 vezes) 2

Lavagem com DCM (3 vezes) 2

Uma vez estando a síntese completa, o destacamento do peptídeo da resina pode ser efectuado através de procedimentos bem conhecidos da química de peptídeos.

Alguns dos resíduos de aminoácidos dos peptídeos possuem grupos funcionais de cadelas laterais que são reactivos com reagentes usados no acoplamento ou na desprotecção. Quando tais cadeias laterais se encontram presentes, grupos de protecção apropriados são adicionados a estes grupos funcionais para impedir a ocorrência de reacções químicas indesejáveis durante as reacções usadas para formar os peptídeos. As 15 seguintes regras gerais são seguidas na selecção de um grupo de protecção de uma cadeia lateral particular: (a) o grupo de protecção de preferência retém as suas propriedades e não é eliminado durante as reacções de acoplamento, (b) o grupo de protecção deverá ser estável em relação ao reagente usado nas condições da reacção de acoplamento nem nas condições de remoção do grupo de protecção alfa amino a cada passo da síntese e, (c) o grupo de protecção da cadeia lateral tem que ser susceptível de ser removido após a síntese da desejada sequência de aminoácidos estar terminada, sob condições de reacção que não alterem indesejavelmente a cadeia peptídica.

Os passos iniciais de síntese aqui utilizados são descritos na patente US n.s 4 914 189. Referência é particularmente feita aos Exemplos I a IV aqui apresentados. 2. Acoplamento do R29 ao Polímero de Suporte

Os peptídeos antagonistas da hGH-RH podem ser sintetizados sobre uma variedade de polímeros de suporte. Estes polímeros de suporte podem ser resinas amino tais como resinas metil amino, resinas benzihidrilamina, resinas p-metilbenzidrilamina e outras deste tipo. O Boc-R29 é o material inicial que é fixo à fase de suporte, apropriadamente Boc-Arg(Tos)-OH ou Boc-Agm.

Para a síntese de peptídeos possuindo Agm no terminal C, é preferível que a fase de suporte [SP] seja uma resina amino metil. O grupo guanidino do Boc-Agm é adicionado ao polímero de suporte através de um grupo de ligação estável mas susceptível de ser prontamente eliminado. Foi descoberto que tal ponte pode ser prontamente proporcionada pelo fragmento sulfoníl fenoxi acetilo. A Agm alfa amino protegida é feita reagir com o ácido clorosulfoníl fenoxiacético

Cl - S02 - φ - CH2 - COOH

Para formar

Boc - Agm29- S02 - φ - CH2 - COOH

Este composto é então acoplado ao polímero de suporte [SP] usando DIC ou BOP como agente de activação para dar lugar a:

Boc - Agm29- S02 - φ - CH2 - CO - [SP] 16

Para a síntese dos peptídeos possuindo o Arg-NH2 no terminal C, o Boc-Arg(Tos)-OH é acoplado à resina BHA ou MBHA neutralizada usando DIC ou BOP como agente de activação. 3. Acoplamento Passo a Passo de Resíduos de Aminoácidos

Utilizando a resina Agm protegida pelo grupo Boc (Califórnia Peptide Res. Inc.), (ou a resina Boc-Arg(Tos)), o próprio peptídeo pode apropriadamente ser construído através de técnicas de síntese em fase sólida da forma convencional. A selecção de um reagente de acoplamento apropriado está dentro do conhecimento da técnica. Particularmente apropriados como reagentes de acoplamento são a Ν,Ν'-diisopropil carbodiimida (DIC) ou o reagente activador BOP carboxílico.

Cada aminoácido protegido é acoplado num excesso molar de cerca de três vezes, com respeito ao(s) resíduo(s) aminoacilo ligados à resina, e o acoplamento pode ser levado a cabo num meio tal como o DMF : CH2CI2 (1 : 1) ou em DMF ou CH2CI2 por si só. Nos casos em que ocorre acoplamento incompleto, o procedimento de acoplamento é repetido antes da remoção do grupo de protecção alfa amino. O sucesso da reacção de acoplamento em cada estágio da síntese é de preferência monitorizado através da reacção de ninhidrina. 4. Remoção do Peptídeo do Suporte de Polímero

Quando a síntese se encontra completa, o peptídeo é separado da fase de suporte. A remoção do peptídeo da resina é levada a cabo através de tratamento com um reagente tal como o fluoreto de hidrogénio líquido que também extrai todos os restantes grupos protectores de cadeias laterais.

Apropriadamente, a resina de peptídeo seca e protegida é tratada com uma mistura consistindo de 1,0 ml de m-cresol e 10 ml de fluoreto de hidrogénio anidro por grama de resina de peptídeo durante 60 minutos a 0 SC para libertar o peptídeo da resina bem como para remover todos os grupos de protecção das cadeias laterais. Após a remoção do fluoreto de hidrogénio sob uma corrente de azoto e vácuo, os peptídeos livres são precipitados com éter, filtrados, lavados com éter e etil acetato, extraídos com 50 % de ácido acético, e liofilizados. 17 5. Purificação A purificação dos peptídeos em bruto pode ser levada a cabo através de procedimentos bem conhecidos na química de peptídeos. Por exemplo, a purificação pode ser efectuada um sistema MacRabbit (Rainin Instruments Co. Inc., Woburn, MA) com um Fotómetro UV Knauer e um Registador BD40 Kipp and Zonen usando uma coluna VYDAC 228TP de 10 x 250 mm com enchimento de sílica gel C8 (300 Aa de tamanho de poro, 10 pm de tamanho de partícula) (Rainin Inc.). A coluna é eluída por um sistema de solvente consistindo de (A) 0,1 % de TFA aquoso e (B) 0,1 % de TFA em 70 % de MeCN aquoso num modo de gradiente linear (por exemplo, 30 a 65 % de B durante 120 minutos). O eluente é monitorizado a 220 nm, e as fracções são examinadas através de HPLC analítica usando um cromatógrafo líquido Hewlett-Packard Modelo HP-1090 e extraídas para dar lugar à pureza máxima. A HPLC analítica á levada a cabo numa coluna W-Porex C18 de fase reversa (4,6 x 250 mm, 5 pm de tamanho de partícula, 300 A- de tamanho de poro) (Phenomenex, Rancho Paios Verdes, CA) usando eluição isocrática com um sistema de solvente consistindo de (A) e de (B) talo como acima definidos. Os picos são monitorizados a 220 e a 280 nm. Os peptídeos são determinados ser substancialmente puros (> 95 %) por HPLC analítica. A composição de aminoácido esperada é também confirmada através de análise de aminoácidos. D. Composições Farmacêuticas

Os peptídeos da invenção podem ser administrados na forma de sais não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis, tais como os sais de adição ácida. Ilustrativos de tais sais de adição ácida são o hidrocloreto, hidrobrometo, sulfato, fosfato, fumarato, gluconato, tanato, maleato, acetato, citrato, benzoato, succinato, alginato, pamoato, malato, ascorbato, tartarato e similares. Antagonistas particularmente preferíveis são os sais de baixa solubilidade, por exemplo, sais de pamoato e similares. Estes exibem longa duração de actividade.

Os compostos da presente invenção são administrados apropriadamente a sujeitos humanos ou animais s. c., i. m., ou i. v.; intra-nasalmente ou através de inalação pulmonar; ou na forma de depósito (por exemplo, microcápsulas, microgrânulos, ou implantes de forma cilíndrica ou similar a uma barra) formulados a partir dos polímeros apropriados biodegradáveis (tais como o D, L-lactido-coglicolide), sendo preferíveis os 18 dois últimos meios de depósito. Outros modos de administração equivalentes estão também dentro do âmbito desta invenção, isto é, gotejamento contínuo, injecção de depósito, bombas de infusão e modos de libertação temporal tais como mlcrocápsulas e similares. A administração é efectuada através de qualquer meio injectável fisiologicamente aceitável, sendo aceitável salino fisiológico, apesar de outros meios conhecidos da técnica também poderem ser usados.

Os peptídeos são de preferência administrados parentalmente, intramuscularmente, subcutanemente ou intravenosamente com um meio farmaceuticamente aceitável tal como o isotónico salino. Em alternativa, os peptídeos podem ser administrados como um vaporizador intranasal com um meio apropriado ou através de inalação pulmonar. Uma possível via de administração é constituída pela forma de um depósito formulado a partir de um polímero apropriado biodegradável, por exemplo, o poly-D, L-lactide-coglycolide como microcápsulas, microgrânulos ou implantes cilíndricos contendo compostos antagonísticos dispersos. A quantidade de peptídeo necessária depende do modo de administração e do resultado pretendido. Em geral, a gama de dosagem encontra-se entre 1 e 100 pg/kg de peso corporal do hospedeiro por dia.

E. Aolicacões Terapêuticas dos antagonistas da GH-RH

Os antagonistas da hGH-RH podem ser aplicados no tratamento de condições causadas pelo excesso de hormona de crescimento, por exemplo, a acromegalia, que pode ser manifestada através de um crescimento anormal dos ossos da face e das extremidades. Os antagonistas da GH-RH podem também ser aplicados no tratamento da retinopatia diabética (a principal causa de cegueira nos diabéticos) e na nefropatia diabética, em que os danos aos olhos e aos rins, respectivamente, são tidos como sendo causados pela hormona do crescimento.

Os antagonistas da hGH-RH são projectados para bloquear a ligação e por consequência a acção da GH-RH, que estimula a secreção da hormona do crescimento, que por sua vez estimula a produção do ICGI. Os antagonistas da GH-RH podem ser administrados por si só ou em conjunto com análogos de somatostatina, uma combinação que suprime mais completamente os níveis de IGF-I. É vantajoso administrar antagonistas de GH-RH em vez de somatostatina devido ao facto dos antagonistas de GH-RH poderem ser utilizados em situações em que os centros activos não possuam receptores de somatostatina.

Contudo, as maiores aplicações dos antagonistas de GH-RH são no ramo do cancro. Isto é baseado nas seguintes considerações: os antagonistas de GH-RH são projectados para bloquear a ligação e por consequência a acção da GH-RH, que estimula a secreção da hormona do crescimento, que por sua vez estimula a produção do factor de crescimento semelhante à insulina (ICG-I) também designado de somatomedina-C. O envolvimento da IGF-I (somatomedina-C) no cancro da mama, cancro da próstata, cancro do cólon, tumores ósseos e outras formas malignas está bem caracterizado, e os análogos de somatostatina por si sós não suprimem adequadamente os níveis de GH e de IGF-I. Uma supressão completa dos níveis ou da secreção de IGF-I é requerida para uma melhor inibição do crescimento do tumor. A produção autocrínica da IGF-I por vários tumores pode estar também sob controlo da GH-RH e pode por consequência ser inibida por antagonistas da GH-RH. Os antagonistas da hGH-RH podem também inibir a produção de IGF-I. Um enquadramento teórico mais detalhado das aplicações da GH-RH no ramo da oncologia (cancro) é tal como a seguir se apresenta: Os receptores do IGF-I encontram-se presentes nos cancros da mama primários humanos, nos cancro do pulmão, nos cancros do cólon humanos, nos tumores do cérebro humanos, e em cancros pancreáticos humanos. A presença de receptores IGF-I nestes tumores aparenta estar relacionada com a transformação maligna e com a proliferação destes cancros. O IGF-I pode actuar como factor de crescimento endócrino, paracrínico ou autocrínico em vários cancros humanos, o que significa que o crescimento destes neoplasmas está dependente do ICG-I. Os antagonistas da GH-RH ao suprimirem a secreção da hormona do crescimento irão baixar a produção de IGF-I. Uma vez que o IGF-I estimula o crescimento destes diferentes neoplasmas (cancros), o abaixamento dos níveis de IGF-I resultantes deverá conduzir à inibição do crescimento do tumor. É possível que os antagonistas da GH-RH possam também diminuir a produção paracrínica ou autocrínica de IGF-I pelos tumores, que pode também levar à inibição da proliferação do cancro. Estas perspectivas encontram-se em consonância com os modernos conceitos de oncologia clínica. Os antagonistas da GH-RH deverão ser administrados por si sós ou em conjunto com análogos de somatostatina e uma combinação irá atingir uma supressão mais completa dos níveis de IGF-I, eliminação dos níveis de IGF-I nos tecidos, por exemplo, nos osteosarcomas humanos, bem como no 20 cancro da mama, cancro do cólon, cancro da próstata, e no cancro do pulmão de células não pequenas (não SCLC).

Esta vantagem dos antagonistas da GH-RH sobre os análogos de somatostatina é baseada no facto dos antagonistas da GH-RH poderem ser utilizados para a supressão de tumores que não possuam receptores de somatostatina, por exemplo, os sarcomas osteogénicos humanos. A presente invenção é descrita em conjunto com os seguintes exemplos que são avançados apenas com o propósito de ilustração.

Os seguintes exemplos avançam métodos de síntese dos novos antagonistas da GH-RH através de técnicas de síntese em fase sólida.

EXEMPLO I

Síntese da Boc-Agmatina EXEMPLO II Síntese o Ácido 4-Clorosuifonfl Fenoxiacético (Cl-SPA) EXEMPLO III Boc-Agmatina-[SPA]

EXEMPLO IV

Acoplamento da Boc-Agmatina-[SPA] à fase de suporte A sequência sintética inicial aqui utilizada e indicada nos títulos acima é descrita nos exemplos I a IV da Patente n.s 4 914 189.

EXEMPLO V A síntese do Peptídeo 10 possuindo a fórmula:

Nac°- Tyr1 - D-Arg2- Asp3 - Ala4 - lie5 - Phe(pCI)6- Thr7 - Asn8 - Ser9 - Tyr10 - Arg11 -Lys12 - Vai13- Leu14 - Abu15- Gin16 - Leu17 - Ser18 - Ala19 - Arg20 - Lys21 - Leu22- Leu23 -Gin24 - Asp25 - lie26 - Nle27- Ser28 - Arg^-NHa 21

Ou [Nac°, D-Arg2, Phe(pCI)6, Abu15, Nle27]hGH-RH(1-29)NH2 é conduzida de uma forma passo a passo usando equipamento manual de síntese em fase sólida. Sucintamente, a resina de 4-metilbenzihidrilamina (MBHA) (Bachem, Califórnia) (200 mg, 0,11 mmole) é neutralizada com 5% de Dl EA em CH2CI2 e lavada de acordo com o protocolo descrito na Tabela I. A solução de Boc-Arg(Tos)-OH (141 mg, 0,33 mmole) em DMF - CH2CI2 (1 : 1) é agitada com a resina neutralizada e a DIC (57 μΙ, 0,36 mmole) num equipamento manual de síntese de peptídeos em fase sólida durante uma hora. Após a reacção de acoplamento se apresentar completa através do teste da ninhidrina negativo, a desprotecção com 50% de TFA em CH2CI2, e a neutralização com 5% de DIEA, a cadeia peptídica é construída passo a passo através da adição dos seguintes aminoácidos protegidos pela ordem indicada à resina para obter a desejada sequência peptídica:

Boc - Ser(Bzl) - OH, Boc - Nle - OH, Boc - Ele - OH, Boc - Asp(OcHx) - OH, Boc - Gin -OH, Boc - Leu - OH, Boc - Leu - OH, Boc - Lys(2-Cl-Z) - OH, Boc - Arg(Tos) - OH, Boc -Ala - OH, Boc - Ser(Bzl) - OH, Boc - Leu - OH, Boc - Gin - OH, Boc - Abu - OH, Boc -Leu - OH, Boc - Vai - OH, Boc - Lys(2-CI-Z) - OH, Boc - Arg(Tos) - OH, Boc - Tyr(2,6-diCI-Z) - OH, Boc - Ser(Bzl) - OH, Boc - Asn - OH, Boc - Thr(Bzl) - OH, Boc - Phe(pCI) -OH, Boc - lie - OH, Boc - Ala - OH, Boc - Asp(OcHx) - OH, Boc - D-Arg(Tos) - OH, Boc -Tyr(2,6-diCI-Z) - OH.

Estes resíduos de aminoácidos protegidos (também facilmente disponíveis a partir da Bachem Co.) são representados acima de acordo com uma convenção bem aceite. O grupo protector apropriado para o grupo funcional da cadeia lateral de um aminoácido particular aprece entre parêntesis. Os grupos OH nas fórmulas acima indicam que cada terminal carboxílico do resíduo se encontra livre.

Os aminoácidos protegidos (0,33 mmole de cada) são acoplados com a DIC (57 μΙ, 0,36 mmole), com as excepções do Boc-Asn-OH e do Boc-GIn-OH que são acoplados com os seus respectivos ésteres HOBt previamente formados. Após a remoção dos grupos protectores Boc após o grupo amino alfa daTyr1, o alfa amino grupo da Tyr1 é aciiado. Esta operação é levada a cabo através do método do anidrido simétrico, no qual o ácido 1-naftilacético (123 mg, 0,66 mmole) é deixado reagir com a DIC como um reagente de 22 activação (60 μΙ, 0,37 mmole) para formar um anidrido simétrico do ácido naftilacético. O anidrido simétrico é deixado reagir com o peptídeo.

Por forma a separar o peptídeo da resina e desprotege-lo, a resina de peptídeo seca (325 mg) é agitada com 0,5 ml de m-cresol e 5 ml de fluoreto de hidrogénio (HF) a 0 SC durante 1 hora. Após evaporação do fluoreto de hidrogénio sob vácuo, o remanescente é lavado com éter dietílico e etil acetato secos. O peptídeo solto e desprotegido é dissolvido em ácido acético a 50 % e separado da resina por filtração. Após a diluição com água e liofilização, 145 mg de produto em bruto são obtidas. O peptídeo em bruto é verificado por HPLC analítica usando um HPLC analítica usando um cromatógrafo líquido Hewlett-Packard Modelo HP-1090 com uma coluna W-Porex C18 de fase reversa (4,6 x 250 mm, 5 pm de tamanho de partícula, 300 Ae de tamanho de poro da Phenomenex, Rancho Paios Verdes, CA) e um gradiente linear de eluição (por exemplo, entre 35 e 70 %) com um sistema de solvente consistindo de (A) 0,1 % de TFA aquoso e (B) 0,1 % de TFA em 70 % de MeCN aquoso. 60 mg do peptídeo em bruto são dissolvidas em AcOH/H20, agitadas, filtradas e aplicadas numa coluna VYDAC 228TP (10 x 250 mm) com enchimento de sílica gel C8. A coluna é eluída com o sistema de solvente acima descrito num modo de gradiente linear (por exemplo, 30 a 55 % de B durante 120 minutos); fluxo de 3 ml/min. O eluente é monitorizado a 220 nm, e as fracções são examinadas através de HPLC analítica. As fracções com pureza superior a 95 % são extraídas e liofilizadas para dar origem a 3,5 mg de produto puro. A HPLC analítica á levada a cabo numa coluna W-Porex C18 de fase reversa acima descrita usando eluição isocrática com o sistema de solvente acima descrito com um fluxo de 1,2 ml/min. Os picos são monitorizados a 220 e a 280 nm. Rt = 13, 70 min e k’ = 0,828 (eluição isocrática com 52 % de B). Os peptídeos são determinados ser substancialmente puros (> 95 %) através de HPLC analítica. A composição de aminoácido esperada é também confirmada através de análise de aminoácidos.

Os peptídeos 3 e 5 são sintetizados da mesma forma que o Peptídeo 1, excepto que o Boc-Tyr(2,6-diCI-Z)-OH1 é substituído pelo Boc-HisíBomJ-OH1 (0,33 mmole) e os peptídeos resultantes são acilados com os anidrídos apropriados de ácido butírico ou ácido 1 -naftilacético, respectivamente, para dar lugar a: [lbu°-His1, D-Arg2, Phe(pCI)6, Abu15, Nle27]hGH-RH(1 -29) NH2 Peptídeo # 3 23 [Nac°-His1-D-Arg2, Phe(pCI)6, Abu15, Nle27]hGH-RH{1 -29) NH2 Peptídeo # 5

Os peptídeos 7, 8 e 9 são sintetizados da mesma forma que o Peptídeo 1, excepto que o Boc-Tyr(2,6-diCI-Z)-OH1 é substituído pelo Boc-Glu(OcHx)-OH1 (0,33 mmole) e são acilados com os anidridos apropriados de ácido isobutírico, ácido iodoacético e ácido 1-naftilacético, respectivamente, para dar lugar a: [lbu°-Glu1, D-Arg2, Phe(pCI)6, Abu15, Nle27]hGH-RH(1-29) NH2 Peptídeo # 7 [IAc°-Glu1, D-Arg2, Phe(pCI)6, Abu15, Nle27]hGH-RH(1-29) NH2 Peptídeo # 8 [Nac°-Glu1, D-Arg2, Phe(pCI)6, Abu15, Nle27]hGH-RH(1 -29) NH2 Peptídeo # 9

EXEMPLO VI A síntese do Peptídeo 10 possuindo a fórmula:

Nac° - His1 - D-Arg2- Asp3 - Ala4- lie5 -Tpi6- Thr7 - Asn8 - Ser9 - Tyr10 - Arg11 - Lys12 -Vai13- Leu14 - Abu15- Gin16 - Leu17 - Ser18 - Ala19 - Arg20 - Lys21 - Leu22- Leu23 - Gin24 -Asp25 - lie26 - Nle27- Ser28 - Arg^-NHa ou [lbu°- His1, D-Arg2, Tpi8, Abu15, Nle27]hGH-RH(1-29) NH2 é conduzida de uma forma passo a passo usando equipamento manual de síntese em fase sólida. A resina de benzihidrilamina (BHA) (Bachem, Califórnia) (200 mg, 0,11 mmole) é neutralizada com 5% de DIEA em CH2C!2 e lavada de acordo com o protocolo descrito na Tabela I. A solução de Boc-Arg(Tos)-OH (141 mg, 0,33 mmole) em CH2CI2 -DMF (1 : 1) é agitada com a resina neutralizada e a DIC (60μΙ, 0,37 mmole) num equipamento manual de síntese em fase sólida durante uma hora. Após a reacção de acoplamento se apresentar completa através do teste da ninhidrina negativo, a desprotecção com 50 % de TFA em CH2CI2, e a neutralização com 5% de DIEA em CH2CI2, a cadeia peptídica é construída passo a passo através da adição dos seguintes aminoácidos protegidos pela ordem indicada à resina para obter a desejada sequência peptídica: 24

Boc - Ser(Bzl) - OH, Boc - Nle - OH, Boc - !le - OH, Boc - Asp(OcHx) - OH, Boc - Gin -OH, Boc - Leu - OH, Boc - Leu - OH, Boc - Lys(2-CI-Z) - OH, Boc - Arg(Tos) - OH, Boc -Ala - OH, Boc - Ser(Bzl) - OH, Boc - Leu - OH, Boc - Gin - OH, Boc - Abu - OH, Boc -Leu - OH, Boc - Vai - OH, Boc - Lys(2-CI-Z) - OH, Boc - Arg(Tos) - OH, Boc - Tyr(2,6-diCI-Z) - OH, Boc - Ser(Bzl) - OH, Boc - Asn - OH, Boc - Thr(Bzl) - OH, Boc - Tpi · OH, Boc - lie - OH, Boc - Ala - OH, Boc - Asp(OcHx) - OH, Boc - D-Arg(Tos) - OH, Boc -His(Bom) - OH.

Os aminoácidos protegidos (0,33 mmole de cada) são acoplados com a DIC (57 μΙ, 0,36 mmole), com as excepções do Boc-Asn-OH e do Boc-GIn-OH que são acoplados com os seus respectivos ésteres HOBt previamente formados e do Boc - Tpi - OH que é acoplado usando o método de acoplamento BOP. Após a remoção dos grupos protectores Boc após o grupo amino alfa daHis1, o peptídeo é acilado através do método do anidrido simétrico. Este método é levado a cabo fazendo reagir o ácido isobutírico (59 mg, 0,66 mmole) com DIC (60 μΙ, 0, 37 mmole) para formar o respectivo anidrido e fazendo-o reagir com o peptídeo.

Por forma a separar o peptídeo da resina e desprotege-lo, a resina de peptídeo seca (300 a 350 mg) é agitada com 0,5 ml de m-cresol e 5 ml de fluoreto de hidrogénio (HF) a 0 aC durante 1 hora. Após evaporação do fluoreto de hidrogénio sob vácuo, o remanescente é lavado com éter dietílico e etil acetato secos. O peptídeo solto e desprotegido é dissolvido em ácido acético a 50 % e separado da resina por filtração. Após a diluição com água e a liofilização, aproximadamente 150 mg de produto em bruto são obtidas. O peptídeo em bruto é purificado (60 mg de substância sendo purificadas por HPLC de fase reversa usando o mesmo procedimento e equipamentos descritos no Exemplo IV), e depois verificado por HPLC analítica. O produto é avaliado como sendo substancialmente puro (> 95 %) através de HPLC analítica. A confirmação da estrutura é proporcionada através de análise de aminoácidos.

EXEMPLO VII A síntese do Peptídeo 18 possuindo a fórmula: 25

Nac°- Tyr1 - D-Arg2- Asp3 - Ala4- He5 -Phe(pCI)6- Thr7 - Asn8 - Ser9 - Tyr10 - Arg11 -Lys12 - Vai13- Leu14 - Abu15- Gin16 - Leu17 - Ser18 - Ala19 - Arg20 - Lys21 - Leu22- Leu23 -Gin24 - Asp26 - lie26 - Nle27— Ser®8 - Agm20 ou [Nac°, D-Arg2, Phe(pCI)6, Abu15, Nle^hGH-RHO -28) Agm é conduzida de uma forma passo a passo usando equipamento manual de síntese de peptídeos em fase sólida. A resina de Boc-Agm-SPA-aminometilo (BHA) (Califórnia Peptide Co., Inc., Califórnia) (200 mg, 0,06 mmole) é desprotegida com 50 % de TFA em CH2CI2, e neutralizada com 5% de Dl EA em CH2CI2, e lavada tal como descrito na Tabela I. A solução de Boc-Ser(Bzl)-OH (55 mg, 0,18 mmole) em CH2CI2 é agitada com a resina de H-Agm-SPA-aminometilo (31 μΙ, 0,2 mmole) num equipamento manual de síntese em fase sólida durante uma hora. Após a lavagem e a efectuação da reacção de ninhidrina para confirmar a total extensão do acoplamento, o ciclo é repetido de uma forma tal como a descrita na Tabela I para dar construir passo a passo a cadeia peptídica através da adição dos seguintes aminoácidos protegidos pela ordem indicada à resina:

Boc - Nle - OH, Boc - lie - OH, Boc - Asp(OcHx) - OH, Boc - Gln - OH, Boc - Leu - OH, Boc - Leu - OH, Boc — Lys(2-CI-Z) - OH, Boc - Arg(Tos) - OH, Boc - Ala - OH, Boc -Ser(Bzl) - OH, Boc - Leu - OH, Boc - Gln - OH, Boc - Abu - OH, Boc - Leu - OH, Boc -Vai - OH, Boc - Lys(2-CI-Z) - OH, Boc - Argflos) - OH, Boc - Tyr(2,6-diCI-Z) - OH, Boc -Ser(Bzl) - OH, Boc - Asn - OH, Boc - Thr(Bzl) - OH, Boc - Phe(pCI) - OH, Boc - Ala - OH, Boc - Asp(OcHx) - OH, Boc - D-Arg(Tos) - OH e Boc - Tyr(2,6-diCi-Z) - OH.

Os aminoácidos protegidos (0,18 mmole de cada) são acoplados com a DIC (31 μΙ, 0,2 mmole), com as excepções do Boc-Asn-Oh e do Boc-GIn-OH que são acoplados com os seus respectivos ésteres HOBt previamente formados. Após a remoção do grupo protector Boc do grupo amino alfa da Tyr1, o peptídeo é acilado através do método do anidrido simétrico. Neste método o anidrido simétrico do ácido 1 -naftilacético é formado fazendo reagir 123 mg ou 0,66 mmole) do ácido 1-naftilacético com 60 μΙ (0, 37 mmole) de DIC; o anidrido simétrico resultante é feito reagir com o peptídeo. 26

Por forma a separar o peptídeo da resina e desprotege-lo, a resina de peptídeo seca (210 mg) é agitada com 0,5 ml de m-cresol e 5 ml de fluoreto de hidrogénio (HF) a 0 SC durante 1 hora. Após a evaporação do fluoreto de hidrogénio sob vácuo, o remanescente é lavado com éter dietílico e etil acetato secos. O peptídeo solto e desprotegido é dissolvido em ácido acético a 50 % e separado da resina por filtração. Após a diluição com água e a liofilização, aproximadamente 54 mg de produto em bruto são obtidas. 60 mg de antagonista de GH-RH são dissolvidas em AcOH/H20 e purificadas por HPLC de fase reversa usando o mesmo procedimento e equipamentos descritos no Exemplo V. O produto é avaliado como sendo substancialmente puro (> 95 %) através de HPLC analítica. Rt= 13,52 min ek' = 0,819 (eluição isocrática com 52% de B). A confirmação da estrutura é proporcionada através de análise de aminoácidos. O peptídeo 19 é sintetizado da mesma forma que o Peptídeo 18, excepto que este é acilado com o anidrido de ácido isobutírico apropriado em vez do Nac, para dar origem a: [lbu°, D-Arg2, Phe(pCI)6, Abu15, Nle^JhGH-RHO^e) Agm Peptídeo #19. O peptídeo 32 é sintetizado da mesma forma que o Peptídeo 18, excepto em que o Boc-Phe(pCI)-OH6é substituído pelo Boc-Nal-OH6, para dar origem a: [Nac0, D-Arg2, Nal6, Abu15, Nle27]hGH-RH(1 -28) Agm Peptídeo # 32. O peptídeo 34 é sintetizado da mesma forma que o Peptídeo 18, excepto em que o Boc-D-Arg(Tos)-OH2é substituído pelo Boc-D-Cit-OH2, para dar origem a: [Nac0, D-Cit2, Phe(pCI)6, Abu15, Nle^JhGH-RHO -28) Agm Peptídeo # 34. O peptídeo 35 é sintetizado da mesma forma que o Peptídeo 34, exceptuando pelo facto da acilação com o anidrido do ácido 1-naftilacético ser omitida para dar origem a: [D-Cit2, Phe(pCl)6, Abu16, Nle^hGH-RHfl -28) Agm Peptídeo # 35. O peptídeo 36 é sintetizado da mesma forma que o Peptídeo 34, excepto em que o Boc-Phe(pCI)-OH6é substituído pelo Boc-Nal-OH, respectivamente para dar origem a: 27

Peptídeo # 36.

[Nac°, D-Cit2, Nal6, Abu15, Nle27]hGH-RH(1-28)Agm O peptídeo 37 é sintetizado da mesma forma que o Peptídeo 18, exceptuando pelo facto de após a remoção do grupo protector Boc do grupo amino alfa da Tyr, o peptídeo não ser acilado.

EXEMPLO VIII

Actividade Biológica

Os peptídeos da presente invenção foram testados em ensaios in vitro e in vivo no que respeita à sua habilidade para inibir a libertação da hormona do crescimento induzida pela hGH-RH(1-29)NHz.

Sistema Pituitário Superfundido do Rato. Os análogos foram testados in vitro através de um teste anteriormente descrito (S. Vigh e A. V. Schally, Peptides 5 : págs. 241 a 347, 1984) com modificação (Z. Rekasi e A. V. Schally, P. N. A. S. 90: págs. 2146 a 2149, 1993).

De forma sucinta, as células são incubadas previamente com peptídeos durante 9 minutos (3 ml) a várias concentrações. Imediatamente após a incubação, 1 nM de hGH-RH(1-29)NH2 é administrada durante 3 minutos (1 ml) [resposta de 0 minutos]. Para verificar a duração do efeito antagonístico no análogo, 1 nM de hGH-RH(1-29)NH2 é aplicado 30, 60 e 90 minutos mais tarde durante 3 minutos [respostas de 30, 60, 90 e 120 minutos]. São avaliados os valores integrais totais das respostas da hormona do crescimento. As respostas de hormona do crescimento são comparadas a e expressas como uma percentagem da resposta original da hormona do crescimento induzida por 1 nM de hGH-RH(1-29)NH2. O efeito dos novos antagonistas é comparado com o de [Ac-Tyr1, D-Arg*]hGH-RH(1-29)NI-l2, o “antagonista Padrão”.

Ensaio de Radio-imunidade da Hormona do Crescimento. Níveis de hormona do crescimento em ratos em quantidades de amostras de superfusão não diluídas e diluídas são medidas através de um ensaio duplo de radio-imunidade fornecido pelo National Hormone and Pituitary Program, Baltimore, Maryland. Os resultados do ensaio de radio-imunidade foram analisados com um programa de computador desenvolvido no nosso 28 instituto (V. Csernus θ A. V. Schally, Harwood Academic (Greenstein, B. C., ed., London, págs. 71 a 109, 1991), e aqui incorporado por referência. A variação intra-ensaio foi inferior a 10 %.

Ensaio de Liaação da GH-RH. Um ensaio sensível de ligação do radio-receptor foi desenvolvido para determinar as características de ligação dos antagonistas da GH-RH ( G. Halmos, A. V. Schally et ai., Receptor 3, págs. 87 a 97, 1993), aqui incorporado por referência. O ensaio é baseado na ligação de [His1, Nle27]hGH-RH(1-29)NH2 marcada a homogenatos da membrana pituitária anterior. Os derivados iodados da [His1, Nle27]hGH-RH(1-29)NH2 preparados através do método da cloramina -T (F. C. Greenwood et al., Biochemistry 89: págs. 114 a 123, 1963). Pituitárias de ratos (250 a 300 g) de Sprague-Dawley machos são usadas para preparar membranas em bruto. Para as análises de saturação de ligação, os homogenatos das membranas são incubados com pelo menos 6 concentrações de [His1, Nle^jhGH-RHO^JNHa, variando entre 0,005 e 0,35 nM na presença ou ausência de excesso de peptídeo não marcado (1 μΜ). A pastilha é medida no que se refere à sua radioactividade num contador-γ. As afinidades dos peptídeos antagonistas testados nos receptores de GH-RH pituitários de ratos são determinadas em experiências de ligação competitiva. As afinidades de ligação finais são estimadas por Ki (constante de dissociação do complexo inibidor - receptor) e são determinadas pelo programa de computador Ligand PC de Munson e Rodbard tal como modificado por Mc Pherson. As afinidades relativas comparadas com [Ac-Tyr1, D-Arg2]hGH-RH(1-29)NH2, o antagonista Padrão, são calculadas com a razão entre K,- do antagonista de GH-R testado e o Kj do antagonista Padrão.

Testes In Vivo. Ratos de Sprague - Dawley machos adultos foram anestesiados com pentobarbital (6 mgftOO g b. w., i. p.). Amostras de sangue foram retiradas da veia jagular 30 minutos após a injecção de pentobarbital. Um grupo de 7 animais recebeu hGH-RH(1-29)NH2 como controlo. Outros grupos de ratos foram injectados com [Ac-Tyr1, D-Arg^hGH-RHO^JNH^omo antagonista Padrão, ou com um dos peptídeos antagonistas 30 segundos antes da hGH-RH(1-29)NH2, que foi administrada numa dose entre 2 e 3 pg/kg b. w. Amostras de sangue foram retiradas da veia jugular 5 e 15 minutos após a injecção dos antagonistas. Os níveis de hormona do crescimento foram medidos através de RIA. As potências dos antagonistas são calculadas através da análise factorial de Bliss e Marks com limites de confiança de 95% e são baseados nas doses de 100 e 400 pg/kg 29 b. w. do antagonista Padrão e 20 e 80 pg/kg b. w. dos antagonistas testados. A significância estatística foi determinada pelo novo teste de gama múltipla de Duncan.

Resultados In Vitro. Os resultados das actividades antagonísticas in vitro testadas no sistema pituitário superfundido de rato e dos ensaios de ligação são sumariamente apresentados na Tabela II e na Tabela III, respectivamente. Tal como pode ser concluído destes dados, a acilação dos análogos com Nac ou Ibu que contenham substituição de 0-Arg2 ou D-Cit2 combinada com Phe(pCI)6 ou Nal6, Abu15, Nle27, e Agm29 causam um aumento imenso na ligação ao receptor bem como na inibição da libertação de hormona do crescimento in vitro. Os peptídeos antagonistas [Nac0, D-Arg2, Phe(pCI)6, Abu15, Nle27]hGH-RH(1-29)NH2(Peptídeo# 1), [Nac0, His1-D-Arg2, Phe(pCI)6, Abu15, Nle^JhGH-RH(1-29)NH2 (Peptídeo # 5), [Ibu0, D-Arg2, Phe(pCI)6, Abu15, Nle27]hGH-RH(1-28) Agm (Peptídeo # 19) e [Nac0, D-Arg2, Phe(pCI)6, Abu15, Nle^JhGH-RHO -28) Agm (Peptídeo # 18) são os antagonistas mais activos in vitro. O peptídeos 1 e 18 têm também uma actividade extremamente longa in vitro: a inibição das libertações de hormona do crescimento é 90% (dose de 30 nM) do valor de controlo 4,5 horas após a incubação no caso do peptídeo 1; e a inibição das libertações de hormona do crescimento pelo peptídeo 18 é cerca de 96% (dose de 30 nM) e 48% (dose de 3 nM) do valor de controlo mesmo 4,5 e 6 horas após a incubação, respectivamente. As afinidades de ligação dos receptores pelos análogos Peptídeos 1, 5 e 19 são respectivamente 82,56, 67,08, e 26,18 vezes superior à do antagonista da GH-RH padrão.

Resultados In Vivo. A Tabela IV apresenta os níveis de hormona de crescimento no soro em ratos tratados previamente com antagonistas de GH-RH. Os peptídeos 1 e 19 produzem uma inibição da resposta da hormona do crescimento à hGH-RH(1-29)NH2 significativamente superior à do antagonista padrão. Nos ensaios in vivo, o Peptídeo 19 inibe a libertação da hormona de crescimento induzida pela hGH-RH(1-29)NH2 numa maior extensão e durante um período mais longo que o Peptídeo 1.

TABELA II

Inibição da Libertação da Hormona do Crescimento no Sistema Pituitário Superfundido de

Rato

Inibição da Libertação da Hormona do Crescimento (%) Peptídeo Dose O min 30 min 60 min 120 min 30 (ηΜ)

Antagonista Padrão 100 62,1 2,5 19 1 100 23,3 93,9 89,3 30 96,1 95 92,1 88,8 10 90,3 90 87,1 83,1 3 18,1 31,5 17,1 3 30 80,7 16,4 0 5 30 92,6 86,4 81,4 64,5 7 100 73,9 25 45 10 14,2 20,8 51.6 8 30 59,1 0 7,3 14 9 100 90,7 79,5 76 30 46,5 43,9 32,1 300 2,5 21,5 100 29,4 48,7 18 30 83,6 93,9 89,3 98,9 10 96,6 97,2 97,1 90,0 3 77,6 83,4 75,3 58,8 1 56,7 41,3 45,8 0,3 45,0 15,6 13,5 19 100 95 74,7 36,7 30 82,7 40,7 9,6 10 70 18,2 13,9 3 62 16,4 32 30 87,3 88,3 75,9 71,8 3 35,9 37,1 43,4 34 30 91,2 87,4 84,8 3 70,4 50,5 40,6 35 30 59,3 39,5 22,3 37 30 97,5 67,3 58,4 62,1 3 78,5 38,8 TABELA 111 31

Valores de Ki e Afinidades Relativas (A. R.) dos antagonistas da hGH-RH

Peptídeo Ki (nM) A. R. Padrão 3,22 ±0,12 1 1 0,04 ± 0,01 82,56 5 0,05 ± 0,01 67,08 7 1,35 ±0,02 2,39 8 0,91 ± 0,01 3,54 9 0,87 ± 0,1 3,72 19 0,12 ±0,04 26,18

TABELA IV Níveis de Hormona do Crescimento no Soro de Ratos Tratados Previamente com Diferentes Antagonistas GH-RH 5 Minutos Antes da Estimulação com GH-RH(1-29)NH2

Tratamento Dose (pg/kg) Níveis de Potência (I ntravenosamente) Hormona do (medida contra o Crescimento Antagonista Padrão) (ng/ml) Salino 89,0 ± 17,7 GH-RH(1-29)NH2 3,0 956,7 ± 113,6 Antagonista Padrão 100,0 738,3 ± 34,7 400,0 439,7 ± 47,3* Peptídeo 19 20,0 451,8 ± 42,2* 80,0 155,0 ±38,2* 18,90 Limites de 95% -11,0 a 32,47 Peptídeo 1 20,0 641,2 ±81,4 80,0 470,0 ±46,1*

Limites de 95% - 3,11 a 11,96 *p, 0,01 vs. GH-RH(1-29)NH2; As potências dos antagonistas foram calculadas através da análise factorial de Bliss e de Marks.

EXEMP.LQJX A experiência do Exemplo VIII é repetida para avaliar a eficácia e a duração do efeito do Peptídeo 18 antagonista da GH-RH na supressão da libertação da hormona de crescimento do soro em ratos estimulada pela GH-RH(1-29). Ratos de Sprague-Dawley pesando entre 300 e 350 gramas foram anestesiados com pentobarbital de sódio (50 mg/kg b. w.) e metade da dosagem inicial de pentobarbital foi administrada em intervalos de 45 min para manter a anestesia. Vinte minutos após a injecção do pentobarbital, o Peptídeo 18 antagonista da GH-RH foi administrado intravenosamente numa dose de 80 pg/kg b. w. aos ratos (tempo 0). Nove ratos foram usados em cada grupo. Por forma a estimular a libertação da hormona de crescimento, injecções i. v. de bombas de GH-RH(1-29)NH2 numa dose de 3 pg/kg b. w. foram administradas ao tempo O e aos 30 minutos após administração dos antagonistas da GH-RH. Amostras de sangue foram tiradas da veia jagular 5 minutos após as injecções de GH-RH(1-29)NH2. Os níveis de soro foram medidos por radio-imunoensaio. A significância estatística foi determinada através do novo método da gama múltipla de Duncan. Os resultados desta experiência são apresentados na Tabela V.

TABELA V Níveis de Hormona do Crescimento no Soro em Ratos tratados previamente com Peptídeo 18 Antagonista da GH-RH 5 minutos antes da estimulação com GH-RH(1-29)NHa numa dose de 3 pg/kg

Tratamento Prévio Dose (pg/kg) Níveis de Hormona do Crescimento (intravenosamente) (ng/mi) Salino 10,6 ±0,02 GH-RH(1-29)NH2 3,0 1650,6 ±182 Peptídeo 18 80,0 1231,3 ±81,3* 33 ρ < 0,05 vs. GH-RH(1-29)NH2 O Peptídeo 18 antagonista da GH-RH injectado numa dose de 80 pg/kg inibiu a secreção de hormona do crescimento induzida pela GH-RH(1-29)NH2 em cerca de 24% 5 minutos após a sua administração.

EXEMPLO X A investigação do efeito do Peptídeo 19 no crescimento das Linhas Celulares SK-ES-1 de Osteosarcoma humanas e MMNG/HOS Transplantadas Atímicas de Cobaia Exposta ou Cultura In Vitro. Métodos: Cobaias expostas masculinas atímicas possuindo Peptídeo 19 implantado subcutaneamente e tumores MNNG/HOS foram tratados durante 4 e 3 semanas, respectivamente, com Peptídeo 19 administrado através de minibombas osmóticas numa dose de 40 pg/animal/dia. O volume de tumor e peso, índice mitótico, apoptósis e índice de marcação Bromodeoxiuridina (BudR), um indicador de proliferação de células de tumor foram determinados. O efeito do Peptídeo 19 nos níveis de IGF-I no soro e nos tecidos do tumor e do fígado, foram determinados. A concentração de receptores de IGF-I foi determinada nas fracções de membrana do tumor de ambos os osteosarcomas. Em adição, os efeitos directos do Peptídeo 19 na síntese de DNA e a proliferação das células SK-ES-1 e MNNG/HOS, bem como na secreção de IGF-I por estas linhas celulares foram avaliadas em culturas celulares.

Resultados: O crescimento de ambos os osteosarcomas em cobaias expostas foi inibido significativamente pelo Peptídeo 19 (Figs. 1 e 2). A inibição do crescimento dos tumores SK-ES-1 e MNNG/HOS foi reflectida por uma redução no volume de tumor de 64% e de 49%, e uma redução no peso do tumor de 62% e de 47%, respectivamente, após o tratamento com Peptídeo 19. A terapia com Peptídeo 19 também diminuiu os tumores em 76% tal como medido através de RIA. As análises aos receptores demonstraram a existência de centros activos de elevada afinidade em relação ao IGF-I nas membranas de ambos os tumores. A concentração de IFG-I no tecido do fígado na cobaia exposta não possuidora de tumor injectada diariamente durante 5 dias com peptídeo 19 foi diminuída de cerca de 40% quando comparada com a dos animais não tratados. Nas culturas 34 celulares a proliferação de células SK-ES-1 e MNNG/HOS, bem como a incorporação de [3H]timidina no DNA de ambas as linhas celulares foi fortemente inibida pelo Peptídeo 19 antagonista. O antagonista da GH-RH também reduziu marcadamente a secreção autocrínica do IGF-I em ambas as linhas celulares in vitro.

EXEMPLO XI

Estudo dos Efeitos do Peptídeo 19 nos Tumores Mamários MXT Independentes do Estrogénio em Cobaias

Cobaias BDF fêmeas foram transplantadas com 3 porções de 1 mm de um cancro da mama MXT independente do estrogénio (3,2). O tratamento com Peptídeo 19 foi iniciado um dia após o transplante tal como se segue: 0,8 pg/dia s. c. uma vez ao dia 5 cobaias 3,2 μg/dia s. c. uma vez ao dia 5 cobaias O volume do tumor foi medido nos dias 10, 14 e 18. Os resultados são apresentados no gráfico (Fig. 3). O peptídeo 19 antagonista em qualquer dose inibiu significativamente o crescimento do cancro da mama nas cobaias.

EXEMPLO XIII

Formulação injectável intramuscular de longa duração (Gel de Óleo de Sésamo) [Nac°, D-Arg2, Phe(pCI)6, Abu15, Nle^JhGH-RHfl -29)NH2 (Peptídeo 1) 10,0 mg

Monoestearato de Alumínio, USP 20,0 mg Óleo de Sésamo g. s. ad 1,0 ml O monoestearato de alumínio é combinado com o óleo de sésamo e aquecido a 125 SC com agitação até que se forme uma solução amarela clara. Esta mistura é então autoclavada para se tornar estéril e deixada arrefecer. O Peptídeo 1 é então adicionado em condições assépticas com trituração. Antagonistas particularmente preferíveis são os 35 sais de baixa solubilidade, por exemplo, os sais de pamoato e similares. Estes exibem longa duração de actividade. EXEMPLO Xlli

Solução Aquosa para Injecção Intramuscular [Nac°, His1-D-Arg2, phe(pCI)6, Abu15, Mle27)hGH-RH(1-29)NH2 (Peptídeo 5) 500 mg

Gelatina, não antigénica 5 mg Água para injecção g. s. adlOOml A gelatina e o Peptídeo 19 são dissolvidos em água para injecção, e então a solução é filtrada em condições de esterilidade.

EXEMPLO XIV icrocápsulas de Polímero Biodegradável IM Injectável de Acção Prolongada

As microcápsulas são produzidas do seguinte: 25/75 copoiímero de glicólido/lactídeo (viscosidade intrínseca 0,5) 99% [lbu°, D-Arg2, Phe(pCI)6, Abu15, Mle27)hGH-RH(1-29)NH2 (Peptídeo 19) 1% 25 mg das microcápsulas acima mencionadas são suspendidas em 1,0 ml do seguinte veículo:

Dextrose 5% CMC, Sódio 0,5% Álcool Benzíiico 0,9%

Tween80 0,1% Água, purificada q. s. 100,0% 36

Os resultados dos testes aqui descritos são considerados na generalidade pelos peritos na técnica como sendo susceptíveis de constituir uma previsão dos resultados em humanos.

LISTAGEM DA SEQUÊNCIA (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Os administradores do Tulane Educational Fund (ii) ·· TÍTULO DA INVENÇÃO: ANÁLOGOS DA hGH-RH (1-29)NH2 POSSUINDO ACTIVIDADE ANTAGONÍSTICA Φ (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 2 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: * · (V, (A) ENDEREÇADO: OMRI M. BEHR, ESQ. (B) RUA: 325 PIERSON AVENUE (C) CIDADE: EDISON (D) ESTADO: NEW JERSEY (E) PAÍS: E. U. A. (F) CÓDIGO POSTAL: 08837 FORMA LEGÍVEL PELO COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete (B) COMPUTADOR: Compatível com PC da IBM (B) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (C) SOFTWARE: Patentln Lote # 1.0, Versão # 1.25 (Vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DO PEDIDO: (C) CLASSIFICAÇÃO: 37 (vii) INFORMAÇÃO DO PROCURADOR/AGENTE: (A) NÚMNOME: BEHR, OMRI M. (B) NÚMERO DE REGISTO: 22 940 (C) REFERÊNCIA/NÚMERO DE DOCKET: SHAL 3,0-020 (viii) INFORMAÇÃO DE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: (908) 494 5240 (B) TELEFAX: (908) 494 0428

(C) TELEX: 511642 BEPATEDIN (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID N.s 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácido (C) RAMA: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (ii) TIPO DA MOLÉCULA: Peptídeo (iii) TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal (iv) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME / CHAVE: miscjeature (B) LOCALIZAÇÃO: 29 (C) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota = “Res 29 = Arg -NH2” (v) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N.B 1

Tyr Ala Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Gin Leu 15 10 15

Gly Gin Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gin Asp lie Met Ser Xaa 20 25 (3) INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID N.B 2: 38

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácido (C) RAMA: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (ii) TIPO DA MOLÉCULA: Peptídeo (iii) TIPO DE FRAGMENTO: N-termina! (iv) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME / CHAVE: miscjeature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (C) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota = “Res 1 = Tyr ou His” (v) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME / CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 2 (C) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota = “Res 2 = Resíduos D-Arg substituídos” (vi) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME / CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 27 (C) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota = “Res 127 = Nle” (vii) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME / CHAVE: miscjeature

(B) LOCALIZAÇÃO: 29 (C) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota = “Res 29 = Arg-NH2” (viii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N.B 2

Xaa Xaa Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Vai Leu Gly 15 10 15

Gin Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gin Asp lie Xaa Ser Xaa 20 25 39

Lisboa, r-;9 ]AN.

Por The Administrators of the Tulane Educational Fund

ENG? MAN1

Agente Oficial da Propriedade industriai ftrco da Concsfeao, 3, it HOC USSOA 40

Claims (26)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Peptídeo possuindo a fórmula: X - R1 - R1- R3- R4- R5- R6-Thr - R8- Ser - Tyr - R11 - R12- Vai - Leu - R15- Gin - Leu -Ser - R19 - R20 - R21 - Leu - Leu - Gin - Asp - lie - R27 - R28 - R29 Em que X é H, Ibu, Nac, 2-Nac, 1- Npt, nada, Ac, lAc, BrProp, 1- ou 2-Npr ou Aqc; R1 é Tyr, His, Glu ou Glt; R1 é D-arg ou D-cit; R3 é Asp, Ala ou Gly; R4 é Ala ou Gly; R5 é lie, Ala ou Gly; R6 é Phe, Ala, Pro, Tpi, Nal ou Phe(Y), em que Y é o F, Cl, Br, N02, CH3 ou OCH3; R8 é Asn, Ser, Vai, lie, Ala, Abu, Nle ou Aib; R11 é Arg, D-Arg ou Cit; R12 é Lys, D-Lys, Cit ou Ala; R15 é Ala ou Abu; R19 é Ala; R20 é Arg, D-Arg ou Cit; R21 é Lys, D-Lys ou Cit; R27 é Nle ou Abu; R28 é Ser, Asn, Asp ou Abu; e R29 é Agm, Arg-NH2, Arg-OH, Cit-NH2, Cit-OH, Har-NH2 ou Har-OH, desde que quando R1 é a D-Arg: X é H, Ibu, Nac, 2-Nac ou 1- Npt, R1 não é Glt, R3 é Asp, R6é Phe(pCI), Tpi, ou Nal, R8 é Asn, R12 é Lys, R15 é Abu, R27 é Nle, R28 é Ser, e R29 é Agm ou Arg-NH2, desde que quando R1 é a D-Cit: X não é o 1-Npt, desde que quando R1 é a D-Cit e R1 é a Glt: X é nada e os respectivos sais de adição a ácidos farmaceuticamente aceitáveis. 1 1 Peptídeo de acordo com a reivindicação 1 em que R1 é a D-Arg.
2. 4. Peptídeo de acordo com a reivindicação 3 em que X é IBU ou Nac, e R1 é a Tyr ou a His.
3. 5. Peptídeo de acordo com a reivindicação 4 em que X é Nac, e R1 é a Tyr.
4. 6. Peptídeo de acordo com a reivindicação 4 em que X é ibu.
5. 7. Peptídeo de acordo com a reivindicação 4 em que R1éa His.
6. 8. Peptídeo de acordo com a reivindicação 2 em que X é Nac, R6 é Nal e R29 é Agm.
7. 9. Peptídeo de acordo com a reivindicação 2 seleccionado de entre o grupo constituído pelos peptídeos da fórmula: Nac°- Tyr - D-Arg2- Asp - Ala - lie - Phe(pCI)6- Thr -Asn - Ser - Tyr - Arg - Lys - Vai - Leu - Abu15- Gin -Leu - Ser - Ala - Arg - Lys - Leu - Leu - Gin - Asp - lie -Nle27- Ser - Arg - NH2, Nac°- His1 - D-Arg2- Asp - Ala - lie - Phe(pCI)6- Thr -Asn - Ser - Tyr - Arg - Lys - Vai - Leu - Abu15- Gin - Leu -Ser - Ala - Arg - Lys - Leu - Leu - Gin - Asp - lie - Nle27-Ser-Arg - NH2, e lbu°- Tyr - D-Arg2- Asp - Ala - ile - Phe(pCI)6- Thr -Asn - Ser - Tyr - Arg - Lys - Vai - Leu - Abu15- Gin -Leu - Ser - Ala - Arg - Lys - Leu - Leu - Gin - Asp -Ile-Nle27-Ser-Agm.
8. 10. Um peptídeo de acordo com a reivindicação 9 possuindo a fórmula: Nac°- Tyr - D-Arg2- Asp - Ala - Ile - Phe(pCI)6- Thr -Asn - Ser - Tyr - Arg - Lys - Vai - Leu - Abu15- Gin -Leu - Ser - Ala - Arg - Lys - Leu - Leu - Gin - Asp - Ile -Nle27-Ser-Arg-NH2. 2
9. 11. Peptídeo de acordo com a reivindicação 9 possuindo a fórmula: Nac°- His1 - D-Arg2- Asp - Ala - lie - Phe(pCI)6- Thr -Asn - Ser - Tyr - Arg - Lys - Vai - Leu - Abu15- Gin - Leu -Ser - Ala - Arg - Lys - Leu - Leu - Gin - Asp - lie - Nle27-Ser - Arg - NH2.
10. 12. Peptídeo de acordo com a reivindicação 9 possuindo a fórmula: lbu°- Tyr - D-Arg2- Asp - Ala - lie - Phe(pCI)6- Thr -Asn - Ser - Tyr - Arg - Lys - Vai - Leu - Abu1s- Gin -Leu - Ser - Ala - Arg - Lys - Leu - Leu - Gin - Asp -lie - Nle27- Ser - Agm.
11. 13. Peptídeo de acordo com a reivindicação 2 seleccionado de entre o grupo consistindo dos peptídeos possuindo a fórmula: Nac° - Tyr - D-Arg2- Asp - Ala — He - Phe(pCI)6- Thr -Asn - Ser - Tyr - Arg - Lys - Vai - Leu - Abu15- Gin -Leu - Ser - Ala - Arg - Lys - Leu - Leu - Gin - Asp -lie - Nle27 - Ser-Agm e Nac°- Tyr - D-Arg2- Asp - Ala - lie - Nal6- Thr - Asn -Ser - Tyr - Arg - Lys - Vai - Leu - Abu15 - Gin - Leu -Ser - Ala - Arg - Lys - Leu - Leu - Gin - Asp - lie - Nle27-Ser - Agm.
12. 14. Peptídeo de acordo com a reivindicação 13 possuindo a fórmula: Nac°- Tyr - D-Arg2- Asp - Ala - lie - Phe(pCI)6- Thr -Asn - Ser - Tyr - Arg - Lys - Vai - Leu - Abuls- Gin -Leu - Ser - Ala - Arg - Lys - Leu - Leu - Gin - Asp -lie - Nle27- Ser-Agm. 3
13. 15. Peptídeo de acordo com a reivindicação 13 possuindo a fórmula: Nac°- Tyr - D-Argz- Asp - Ala - lie - Nal°- Thr - Asn -Ser - Tyr - Arg - Lys - Vai - Leu - Abu15- Gin - Leu -Ser - Ala - Arg - Lys - Leu - Leu - Gin - Asp - lie - Nle27-Ser - Agm.
14. 16. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1 em que R2 é a D-cit.
15. 17. Peptídeo de acordo com a reivindicação 16 em que X é Nac e R29 é Agm.
16. 18. Peptídeo de acordo com a reivindicação 16 possuindo a fórmula: Nac°- Tyr - D-Cit2- Asp - Ala - lie - Phe(pCI)6- Thr -Asn - Ser - Tyr - Arg - Lys - Vai - Leu - Abu15- Gin -Leu - Ser - Ala - Arg - Lys - Leu - Leu - Gin - Asp -lie - Nle27- Ser - Agm.
17. 19. Utilização de um peptídeo de acordo com uma das reivindicações 1 a 18 na preparação de um medicamento.
18. 20. Utilização de um peptídeo de acordo com uma das reivindicações 1 a 18 na preparação de um medicamento para o tratamento da retinopatia diabética.
19. 21. Utilização de um peptídeo de acordo com uma das reivindicações 1 a 18 na preparação de um medicamento para o tratamento da nefropatia diabética.
20. 22. Utilização de um peptídeo de acordo com uma das reivindicações 1 a 18 na preparação de um medicamento para o tratamento da acromegalia.
21. 23. Utilização de um peptídeo de acordo com uma das reivindicações 1 a 18 na preparação de um medicamento para o tratamento de cancros mamários.
22. 24. Utilização de acordo com a reivindicação 23 em que os cancros são os da mama, pulmão, cólon, cérebro e pancreático. 4
23. 25. Utilização de acordo com a reivindicação 23 em que os cancros são tumores possuindo receptores para o ICG-I ou são sensíveis à presença da hormona do crescimento.
24. 26. Utilização de um peptídeo de acordo com uma das reivindicações 1 a 18 na preparação de um medicamento para o tratamento de osteosarcomas humanos.
25. 27. Composição compreendendo uma quantidade farmaceuticamente efectiva de pelo menos um peptídeo de acordo com uma das reivindicações 1 a 18 num meio de aplicação farmaceuticamente aceitável.
26. 28. Produtos contendo pelo menos um peptídeo de acordo com uma das reivindicações 1 a 18 e pelo menos um análogo de somatostatina na forma de uma preparação combinada para a utilização na terapia do cancro. Lisboa, i~g JAN. 2001 Por The Administrators of The Tulane Educational Fund

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