ES2314786T3 - Uso de interferon gamma para el tratamiento de la hipertrofia cardiaca. - Google Patents
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Abstract
Interferón gamma (IFN-gamma) para el uso en un método de tratamiento de hipertrofia cardiaca, en el que se va a administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de IFN-gamma a un paciente diagnosticado con hipertrofia cardiaca inducida por sobrecarga de presión.
Description
Uso de interferón gamma para el tratamiento de
la hipertrofia cardiaca.
La presente invención se refiere en líneas
generales a los efectos de IFN-\gamma sobre la
hipertrofia cardiaca. Más particularmente, la invención se refiere
al uso de IFN-\gamma para la prevención y
tratamiento de hipertrofia cardiaca y afecciones patológicas
asociadas.
Los interferones son glicoproteínas de una única
cadena, relativamente pequeñas liberadas por células invadidas por
virus o ciertas sustancias diferentes. Los interferones actualmente
están agrupados en tres clases principales, denominadas interferón
de leucocitos (interferón-alfa,
interferón-\alpha, IFN-\alpha),
interferón de fibroblastos (interferón-beta,
interferón-\beta, IFN-\beta), e
interferón inmune (interferón-gama,
interferón-\gamma, IFN-\gamma).
En respuesta a infección viral, los linfocitos sintetizan
principalmente interferón-\alpha (junto con una
menor cantidad de una especie distinta de interferón, habitualmente
llamada interferón omega), mientras que la infección de los
fibroblastos habitualmente induce
interferón-\beta. Los interferones \alpha y
\beta comparten aproximadamente el 20-30 por
ciento de homología de la secuencia de aminoácidos. El gen para
IFN-\beta humano carece de intrones, y codifica
una proteína que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos
del 29% con IFN-\alphaI, humano que sugiere que
los genes de IFN-\alpha e
IFN-\beta han evolucionado desde un ancestro
común (Taniguchi et al., Nature 285, 547-549
[1980]). Por el contrario, IFN-\gamma no se
induce por infección viral, en su lugar, se sintetiza por los
linfocitos en respuesta a mitógenos, y está apenas relacionado con
otros dos tipos de interferones con respecto a la secuencia de
aminoácidos. Se sabe que los interferones \alpha y \beta
inducen antígenos de MHC de clase I, mientras que
IFN-\gamma induce la expresión de antígenos de
MHC de clase II, y también aumenta la eficacia con las células diana
que presentan el péptido viral asociado con las moléculas MHC de
clase I para el reconocimiento por células T citotóxicas.
IFN-\gamma es un miembro de la
familia de interferones, que muestra las propiedades antivirales y
antiproliferativas características de los interferones \alpha y
\beta (IFN-\alpha e IFN-\beta)
pero, en contraste con esos interferones, es inestable con PH 2.
IFN-\gamma se produjo en un principio después de
la inducción mitogénica de los linfocitos. La producción
recombinante de IFN-\gamma humano se presentó por
primera vez por Gray, Goeddel y sus colaboradores (Gray et
al., Nature 295, 503-508 [1982]), y es el objeto
de las Patentes de Estados Unidos Nº 4.762.791, 4.929.544,
4.727.138, 4.925.793, 4.855.238, 5.582.824, 5.096.705, 5.574.137, y
5.595.888. El IFN-\gamma humano recombinante de
Gray y Goeddel producido en E. coli, constaba de 146
aminoácidos, comenzando la posición N-terminal de la
molécula con la secuencia CysTyrCys. Después se ha descubierto que
el IFN-\gamma humano nativo (es decir, que surge
por la inducción por mitógenos de linfocitos de sangre periférica
humana y purificación posterior) es un polipéptido que carece del
extremo N-terminal CysTyrCys asignado por Gray
et al., supra. Más recientemente, se determinó la
estructura cristalina de IFN-\gamma humano
recombinante derivado de E. coli
(rhIFN-\gamma) (Ealick et al., Science 252,
698-702 [1991]), que muestra que la proteína existe
como un homodímero no covalente fuertemente entrelazado, en el que
las dos cadenas polipeptídicas idénticas están orientadas de un modo
antiparalelo.
Se sabe que IFN-\gamma muestra
un amplio intervalo de actividades biológicas, incluyendo
actividades antitumorales, antimicrobianas e inmunorreguladoras.
Una forma particular de IFN-\gamma humano
recombinante (rhIFN-\gamma-Ib,
Actimmune®, Genentech, Inc. South San Francisco, California) está
disponible en el mercado como un fármaco inmunomodulador para el
tratamiento de enfermedad granulomatosa crónica caracterizada por
infecciones graves, recurrentes de la piel, ganglios linfáticos,
hígado, pulmones, y huesos debido a la disfunción de los fagocitos
(Baehner. R.L., Pediatric Pathol. 10, 143-153
[1990]). También se ha propuesto IFN-\gamma para
el tratamiento de dermatitis atópica, una enfermedad cutánea e
inflamatoria habitual caracterizada por prurito grave, un ciclo de
recaída crónico con frecuentes periodos de exacerbación, una
morfología clínica y distribución distintivas de las lesiones
cutáneas (véase, Publicación PCT Nº WO 91/07984, publicada el 13 de
junio de 1991), estenosis vascular, incluyendo el tratamiento de
reestenosis después de angioplastia y/o cirugía vascular
(Publicación PCT Nº WO 90/03189 publicada el 5 de abril de 1990),
diversas afecciones pulmonares, incluyendo síndromes de distrés
respiratorio (RDS), tales como síndrome de distrés respiratorio en
el adulto (ARDS) y una forma neonata, llamada de diversas formas
como RDS idiopático o enfermedad de la membrana hialina (Publicación
PCT Nº WO 89/01341, publicada el 23 de febrero de 1989). Además, se
ha propuesto IFN-\gamma para su uso en el
tratamiento de diversas alergias, por ejemplo, asma, y afecciones
relacionadas con infección por VIH, tales como infecciones
oportunistas, por ejemplo, neumonía por Pneumocystis carinii,
y sepsis asociada a un traumatismo. La producción alterada de
IFN-\gamma se ha observado en pacientes con
esclerosis múltiple (MP), y se ha informado de que la producción de
IFN-\gamma está enormemente suprimida en
suspensiones de células mononucleares estimuladas por mitógenos
derivadas de pacientes con SIDA. Para una revisión véase, por
ejemplo, el Capítulo 16, "The Presence of Possible Pathogenic
Role of Interferons in Disease". En: Interferons and other
Regulatory Cytokines, Edward de Maeyer (1988, John Wiler and Sons
Publishers).
El interferón-\gamma, junto
con otras citoquinas, se ha implicado como inductor de óxido nítrico
inducible (iNOS) que, a su vez, se ha descrito como un mediador
importante en el mecanismo inflamatorio subyacente a un fallo
cardiaco, de la respuesta cardiaca a sepsis o rechazo de un
aloinjerto, así como la progresión de cardiomiopatías dilatadas de
diversas etiologías. Ungureanu-Longrois et
al., Circ. Res. 77, 494-502 (1995); Pinsky
et al., J. Clin. Invest. 95, 677-685 (1995);
Singh et al., J. Biol. Chem. 270, 28471-8
(1995); Birks y Yacoub, Coronary Artery Disease 8,
389-402 (1997); Hattori et al., J. Mol. Cell.
Cardiol. 29, 1585-92 (1997). De hecho, se ha
informado de que IFN-\gamma es la única citoquina
más potente con respecto a la inducción de iNOS en miocitos
(Watkins et al., J. Mol. & Cell. Cardiol. 27,
2015-29 [1995]).
La hipertrofia está definida en líneas generales
como un aumento en el tamaño de un órgano o estructura
independientemente del crecimiento natural que no implica la
formación de tumores. La hipertrofia de un órgano o tejido se debe
a un aumento en la masa de las células individuales (hipertrofia
verdadera), o a un aumento en la cantidad de células que componen
el tejido (hiperplasia), o ambas.
La hipertrofia cardiaca es el agrandamiento del
corazón que se activa por estímulos mecánicos y hormonales y
posibilita que el corazón se adapte a la demanda de un rendimiento
cardiaco aumentado o a una lesión. Morgan y Baker, Circulation 83,
13-25 (1991). Esta respuesta está frecuentemente
asociada con una diversidad de afecciones patológicas distintas,
como tales como hipertensión, estenosis aórtica, infarto de
miocardio, cardiomiopatía, regurgitación valvular, derivación
cardiaca, fallo cardiaco congestivo, etc.
A nivel celular, el corazón funciona como un
sincitio de miocitos y células de soporte circundantes, llamadas
no-miocitos. Aunque los no-miocitos
son principalmente fibroblastos/células mesenquimáticas, también
incluyen células endoteliales y de músculo liso. De hecho, aunque
los miocitos componen la mayoría de la masa de un miocardio adulto,
representan sólo aproximadamente el 30% de la cantidad de células
total presente en el corazón.
El agrandamiento del corazón embrionario depende
enormemente de un aumento en la cantidad de miocitos, que continúa
hasta muy poco antes del nacimiento, cuando los miocitos cardiacos
pierden su capacidad de proliferación. Sucede un crecimiento
adicional a través de la hipertrofia de las células individuales. La
hipertrofia de los miocitos de los ventrículos cardiacos adultos es
una respuesta a una diversidad de afecciones que conducen a una
sobrecarga hemodinámica crónica. Por tanto, en respuesta a estímulos
hormonales, fisiológicos, hemodinámicos, y patológicos, las células
del músculo ventricular adulto pueden adaptarse a cargas de trabajo
aumentadas a través de la activación de un proceso hipertrófico.
Esta respuesta se caracteriza por un aumento en el tamaño de las
células miocitos y el contenido de proteínas contráctiles de las
células individuales del músculo cardiaco, sin división celular
concomitante y activación de genes embrionarios, incluyendo el gen
para el péptido natriurético atrial (ANP). Chien et al.,
FASEB J. 5, 3037-3046 (1991); Chien et al.,
Annu. Rev. Physiol. 55, 77-95 (1993). Se ha
descrito un aumento en la masa del miocardio como resultado de un
aumento en el tamaño de los miocitos que está asociado a una
acumulación de colágeno intersticial en la matriz extracelular y
alrededor de las arterias coronarias intramiocárdicas en
hipertrofia del ventrículo izquierdo después de una sobrecarga de
presión en seres humanos (Caspari et al., Cardiovasc. Res.
11, 554-8 [1977]; Schwarz et al., Am. J.
Cardiol. 42, 895-903 [1978]; Hess et al.,
Circulation 63, 360-371 [1981]; Pearlman et
al., Lab. Invest. 46, 158-164). La hipertrofia
cardiaca debida a una sobrecarga hemodinámica crónica es el
resultado final habitual de la mayoría de los trastornos cardiacos
y una característica constante del fallo cardiaco.
También se ha sugerido que los factores
paracrinos producidos por células de soporte
no-miocitos pueden estar adicionalmente implicados
en el desarrollo de hipertrofia cardiaca, y se han identificado
diversos factores hipertróficos derivados de
no-miocitos, tales como factor de inhibición de
leucocitos (LIF) y endotelina. Metcalf, Growth Factors 7,
169-173 (1992); Kurzrock et al., Endocrine
Reviews 12, 208-217 (1991); Inoue et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 2863-2867 (1989);
Yanagisawa y Masaki, Trends Pharm. Sci. 10, 374-378
(1989); Patente de Estados Unidos Nº 5.573.762 (presentada el 12 de
noviembre de 1996). Los factores ejemplares adicionales que se han
identificado como mediadores potenciales de la hipertrofia cardiaca
incluyen cardiotrofina-1 (CT-1)
(Pennica et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92:
1142-1146 [1995]), catecolaminas,
adrenocorticosteroides, angiotensina, y prostaglandinas.
La hipertrofia de miocitos adultos es
inicialmente beneficiosa en una respuesta a corto plazo para una
función cardiaca alterada permitiendo una disminución en la carga
sobre las fibras musculares individuales. Con una sobrecarga de
larga duración, grave, sin embargo, las células hipertróficas
comienzan a deteriorarse y mueren. Katz, "Heart Failure", en:
Katz A. M. ed., Physiology of the Heart (New York, Raven Press,
1992) pág. 638-668. La hipertrofia cardiaca es un
factor de riesgo significativo tanto para mortalidad como para
morbilidad en el transcurso clínico del fallo cardiaco. Katz.
Trends Cardiovasc. Med. 5, 37-44 (1995).
Para detalles adicionales de las causas y
patología de hipertrofia cardiaca véase, por ejemplo, Heart Disease,
A. Textbook of Cardiovascular Medicine, Braunwald, E. ed., W.B.
Saunders Co., 1988, Capítulo 14, Pathophysiology of Heart
Failure.
Actualmente, el tratamiento de la hipertrofia
cardiaca varía dependiendo de la enfermedad cardiaca subyacente.
Las catecolaminas, adrenocorticosteroides, angiotensina,
prostaglandina, factor de inhibición de leucemia (LIF), endotelina
(incluyendo endotelina-1, 2 y 3 y endotelina
grande), cardiotrofina-1 (CT-1) y
factor de hipertrofia cardiaca (CHF) están entre los factores
identificados como mediadores potenciales de la hipertrofia. Se han
usado ampliamente en el tratamiento de la cardiomiopatía
hipertrófica fármacos bloqueantes del receptor
\beta-adrenérgico
(\beta-bloqueantes, por ejemplo, propanolol,
timolol, tertalolol, carteolol, nadolol, betaxolol, penbutolol,
acetobutolol, atenolol, metoprolol, carvedilol, etc.) y verapamil.
Los efectos beneficiosos de los \beta-bloqueantes
sobre los síntomas (por ejemplo, dolor de pecho) y la tolerancia al
ejercicio se deben ampliamente a una disminución en el ritmo
cardiaco con una prolongación posterior de la carga diastólica y la
carga ventricular pasiva aumentada. Thompson et al, Br. Heart
J. 44, 488-98 (1980); Harrison et al;
Circulation 29, 84-98 (1964). Se ha descrito que el
verapamil mejora la carga ventricular y probablemente reduce la
isquemia miocárdica. Bonow et al., Circulation 72
853-64 (1985). También se han usado nifedipina y
diltiazem ocasionalmente en el tratamiento de cardiomiopatía
hipertrófica. Lorell et al., Circulation 65,
499-507 (1982); Betocchi et al., Am. J.
Cardiol. 78, 451-7 (1996). Sin embargo, a causa de
sus propiedades vasodilatadoras potentes, la nifedipina puede ser
dañina, especialmente en pacientes con obstrucción de salida. Se ha
usado disopiramida para aliviar los síntomas debido a sus
propiedades inotrópicas negativas. Pollick, N. Engl. J. Med. 307,
997-9 (1982). En muchos pacientes, sin embargo, los
beneficios iniciales disminuyen con el tiempo. Wigle et al.,
Circulation 92, 1680-92 (1995).
Se ha informado de que la terapia con fármacos
antihipertensivos tiene efectos beneficiosos sobre hipertrofia
cardiaca asociada con presión sanguínea elevada. Ejemplos de
fármacos usados en terapia antihipertensiva, solos o en
combinación, son antagonistas de calcio, por ejemplo, nitrendipina;
agentes bloqueantes del receptor
\beta-adrenérgico, por ejemplo, los enumerados
anteriormente; inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina
(ACE), por ejemplo, quinapril, captopril, enalapril, ramipril,
benazepril, fosinopril, lisinopril; diuréticos, por ejemplo,
clorotiazida, hidroclorotiazida, hidroflumetacida, metilclotiazida,
benztiacida, diclorfenamida, acetazolamida, indapamida; bloqueantes
de los canales de calcio, por ejemplo, diltiazem, nifedipina,
verapamil, nicardipina. Por ejemplo, el tratamiento de la
hipertensión con diltiazem y captopril mostraron una disminución en
la masa muscular del ventrículo izquierdo, pero el índice de Doppler
de la función diastólica no se normalizó. Szlachcic et al.,
Am. J. Cardiol. 63, 198-201 (1989); Shahi et
al. Lancet 336, 458-61 (1990). Estos
descubrimientos se interpretaron como que indican que puede seguir
habiendo cantidades excesivas de colágeno intersticial después de
la regresión de la hipertrofia del ventrículo izquierdo. Rossi et
al., Am. Heart J. 124, 700-709 (1992). Rossi
et al ., supra, investigaron el efecto del captopril
sobre la prevención y regresión de la hipertrofia de células
miocárdicas y fibrosis intersticial en hipertrofia cardiaca por
sobrecarga de presión, en ratas experimentales.
Como no hay una terapia generalmente aplicable
para el tratamiento de la hipertrofia cardiaca, la identificación
de los factores que pueden prevenir o reducir la hipertrofia de
miocitos cardiacos es de importancia principal en el desarrollo de
nuevas estrategias terapéuticas para inhibir el crecimiento cardiaco
patofisiológico.
Se ha descubierto inesperadamente que
IFN-\gamma inhibe la propagación de los miocitos
cardiacos aislados de ratas adultas inducida por prostaglandina
F_{2\alpha} (PGF_{2\alpha}) y fenilefrina. Se ha descubierto
adicionalmente que IFN-\gamma inhibe in
vivo tanto la hipertrofia cardiaca inducida por fluprostenol,
un análogo agonista de PGF_{2\alpha}, como la hipertrofia inducida
por sobrecarga de presión en un modelo de rata.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere al uso de interferón gamma para la fabricación de un
médicamente para el tratamiento de hipertrofia cardiaca
administrando una dosis terapéuticamente eficaz de
IFN-\gamma, como se define en las
reivindicaciones. Si el objetivo es el tratamiento de pacientes
humanos, IFN-\gamma preferiblemente es
IFN-\gamma humano recombinante
(rhIFN-\gamma), más preferiblemente,
rhIFN-\gamma-1b, que se definirá
a continuación en este documento. El concepto de tratamiento se usa
en el sentido más amplio, e incluye específicamente la prevención
(profilaxis), moderación, reducción, y cura de hipertrofia cardiaca
de cualquier fase.
IFN-\gamma se administra
preferiblemente en forma de una formulación farmacéutica líquida,
que puede conservarse para conseguir una estabilidad en
almacenamiento ampliada. Las formulaciones farmacéuticas líquidas
conservadas pueden contener múltiples dosis de
IFN-\gamma, y pueden, por lo tanto, ser adecuadas
para su uso repetido.
IFN-\gamma puede administrarse
en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales usados
para el tratamiento de hipertrofia cardiaca, o una afección
fisiológica decisiva en el desarrollo de hipertrofia cardiaca, tal
como presión sanguínea elevada, estenosis aórtica, o infarto de
miocardio.
Además, se describe un método para preparar una
composición farmacéutica para el tratamiento de hipertrofia
cardiaca, que comprende IFN-\gamma como
ingrediente activo.
También se describe un producto farmacéutico que
comprende:
(a) Una composición farmacéutica que comprende
al menos una dosificación terapéuticamente eficaz de
IFN-\gamma;
(b) Un recipiente que contiene dicha composición
farmacéutica; y
(c) Una etiqueta fijada a dicho recipiente, o un
prospecto incluido en dicho producto farmacéutico que se refiere al
uso de dicho IFN-\gamma en el tratamiento de
hipertrofia cardiaca.
En las figuras y durante todos los ejemplos,
"IFN" o "IFN-\gamma" se refiere a
IFN-\gamma recombinante de ratón (Genentech. Inc.
South San Francisco, CA, o Genzyme, Cambridge, MA).
Figura 1 Inhibición de la respuesta de
propagación inducida por prostaglandina F_{2\alpha}
(PGF_{2\alpha}), por IFN-\gamma. Los miocitos
se preincubaron con vehículo salino o IFN-\gamma
(500 U/ml) en el día del aislamiento. Se realizó una segunda
adición de vehículo o IFN-\gamma 24 horas después
del aislamiento, junto con la adición de vehículo o PGF_{2\alpha}
(10^{-7}M). Después de 72 horas adicionales de incubación, las
células se fijaron en glutaraldehído, se tiñeron con eosina Y y se
vieron por microscopía de fluorescencia. A, B, C Miocitos cardiacos
después de 4 días en cultivo: control, PGF_{2\alpha}, y
PGF_{2\alpha}+IFN-\gamma, respectivamente.
Histografías que muestran la amplitud máxima de los miocitos
cardiacos con forma de bastón frente al porcentaje de la frecuencia
de la propia amplitud. La amplitud máxima del las células con forma
de bastón se determinó por microscopía de fluorescencia y un
software de formación de imágenes. Se examinaron al menos 200
células con forma de bastón a partir de un único experimento por
grupo. IFN-\gamma solo no tuvo efectos
observables sobre la morfología de las células. P<0,001 para
todas las comparaciones de grupo.
Figura 2 Inhibición sensible a dosis de la
respuesta inducida por PGF_{2\alpha}, por
IFN-\gamma (500-25 U/ml). Los
miocitos se preincubaron con vehículo salino o
IFN-\gamma el día del aislamiento. Se añadió una
segunda cantidad de IFN-\gamma 24 horas después
del aislamiento, junto con la adición de vehículo o PGF_{2\alpha}
(10 ^{-7} M). Después de una incubación adicional de 72 horas, las
células se fijaron en glutaraldehído, se tiñeron con eosina Y y se
vieron con fluorescencia. Cuantificación de la morfología de los
miocitos: A control, B PGF_{2\alpha},_{ }C
PGF_{2\alpha}+IFN-\gamma (25 U/ml), D
PGF_{2\alpha} +IFN-\gamma (100 U/ml), E
PGF_{2\alpha} +IFN-\gamma (500 U/ml).
Histografías que muestran la amplitud máxima de los miocitos
cardiacos con forma de bastón frente al porcentaje de la frecuencia
de la propia amplitud. La amplitud máxima de las células con forma
de bastón se determinó por microscopia de fluorescencia y un
software de formación de imágenes. Se examinaron al menos 200
células con forma de bastón a partir de un único experimento por
grupo. IFN-\gamma solo no tuvo efecto observable
sobre la morfología de las células. P<0,001 para todas las
comparaciones de grupo.
Figura 3 Inhibición de la respuesta de
propagación inducida por fenilefedrina (PE), por
IFN-\gamma. Los miocitos se preincubaron con
vehículo salino o IFN-\gamma (500 U/ml) el día del
aislamiento. Se realizó una segunda adición de vehículo o
IFN-\gamma 24 horas después del aislamiento, junto
con la adición de vehículo o PE (10^{-5} M). Después de una
incubación adicional de 72 horas, se fijaron en glutaraldehído, se
tiñeron con eosina Y y se vieron por microscopia de fluorescencia.
A, B, C Miocitos cardiacos después de 4 días en cultivos: control,
PE, y PE+INF-\gamma, respectivamente. Histografías
que muestran la amplitud máxima de miocitos cardiacos con forma de
bastón frente al porcentaje de frecuencia de la propia amplitud. La
amplitud máxima de las células con forma de bastón se determinó por
microscopía de fluorescencia y un software de formación de
imágenes. Se examinaron al menos 200 células con forma de bastón a
partir de un único experimento por grupo.
IFN-\gamma solo no tuvo efectos observables sobre
la morfología de las células. P<0,001 para todas las
comparaciones de grupo.
Figura 4 Efectos de IFN-\gamma
sobre la hipertrofia cardiaca inducida por fluprostenol en ratas.
Los datos se presentan como media \pm SEM. El número en
paréntesis es el número de animales en cada grupo. *P<0,05,
*P<0,01, comparado con el grupo de vehículo. #P<0,05,
\alm{2}P<0,01, comparado con el grupo Flup. Flup:
fluprostenol; IFN=IFN-\gamma; HW: peso del
corazón; BW: peso corporal; VW: peso ventricular; LVW: peso del
ventrículo izquierdo.
Figura 5 Efectos de Flup y/o IFN sobre MAP y HR.
Los datos se presentan como media \pm SEM. El número en
paréntesis es el número de animales en cada grupo. *P<0,05
comparado con el grupo de vehículo. #P<0,05, comparado con el
grupo Flup. +P<0,05, comparado con el grupo Flup + IFN. Flup:
fluprostenol; IFN: IFN-\gamma; MAP: presión
arterial media; HR: ritmo cardiaco.
Figura 6 Gráficos de barras que muestran el
efecto de fluprostenol (FLUP) e IFN-\gamma sobre:
A Actina esquelética (SKA); B ATPasa cálcica del retículo
sarcoplásmico (SRCA); C Colágeno 1 (COL1); D Factor natriurético
atrial (ANF). Los niveles de expresión se normalizan para el
mensaje de gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH). VEH es el vehículo. Hubo 7 animales por
grupo y los datos se presentan como la media \pm SEM. P<0,05
frente al grupo VEH.
Figura 7 Efectos de IFN-\gamma
sobre el peso del corazón, el peso ventricular, y el peso del
ventrículo izquierdo en ratas con sobrecarga de presión. Los datos
se presentan como media \pm SEM. El número en paréntesis es el
número de animales en cada grupo. **P<0,01, comparado con el
grupo de simulación. \alm{2}P<0,01, comparado con el grupo
Constricción + vehículo. Simulado: ratas con una operación simulada;
Constricción: ratas con constricción aórtica; IFN:
IFN-\gamma; HW: peso del corazón; VW: peso
ventricular; LVW: peso del ventrículo izquierdo.
Figura 8 Efectos de IFN-\gamma
sobre la proporción del peso del corazón, peso ventricular, y peso
del ventrículo izquierdo al peso corporal en ratas con sobrecarga
de presión. Los datos se presentan como media \pm SEM. El número
en paréntesis es el número de animales en cada grupo. **P<0,01,
comparado con el grupo simulado. \alm{2}P<0,01, comparado con
el grupo Constricción + vehículo. Simulado: ratas con una operación
simulada; Constricción: ratas con constricción aórtica; IFN:
IFN-\gamma; HW: peso del corazón; BW: peso
corporal; VW: peso ventricular; LVW: peso del ventrículo
izquierdo.
\newpage
Figura 9 Efectos de IFN-\gamma
sobre la presión sistólica arterial, presión arterial media, y
presión diastólica arterial en ratas con sobrecarga de presión. El
número en paréntesis es el número de animales en cada grupo.
**P<0,01, comparado con el grupo de simulación. Simulado: ratas
con una operación simulada; Constricción: ratas con constricción
aórtica; IFN: IFN-\gamma, SAP: presión sistólica
arterial; MAP: presión arterial media; DAP: presión diastólica
arterial.
"Interferón gamma",
"interferón-gamma", o
"IFN-\gamma" se refiere de diversas maneras a
todas las formas de interferón gamma (de seres humanos y animales
no humanos) que demuestran ser biológicamente activas en cualquier
ensayo de hipertrofia cardiaca, por ejemplo, los ensayos de
hipertrofia descritos en este documento, y se entiende que
incluyen, aunque sin limitación, la forma madura, pro, met y/o
des(1-3) (también llamada
IFN-\gamma desCysTyrCys), se obtengan de una
fuente natural, se sinteticen químicamente o se produzcan por
técnicas de tecnología de ADN recombinante. Se describe una
descripción completa de la preparación de
IFN-\gamma humano recombinante
(rhuIFN-\gamma) que incluye su ADNc y secuencias
de aminoácidos, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nº
4.727.138; 4.762.791; 4.925.793; 4.929.554; 5.582.824; 5.096.705;
4.855.238; 5.574.137; y 5.595.888. IFN-\gamma
humano recombinante que carece de CisTyrCys, incluyendo derivados
truncados de diversas maneras se describen, por ejemplo, en la
publicación de Patente Europea Nº 146.354. Los interferones de
animales no-humanos incluyendo
IFN-\gamma, se describen, por ejemplo, en la
Publicación Europea Nº 88.622. El término incluye formas
glicosiladas de diversas maneras y otras variantes (por ejemplo,
variantes de la secuencia de aminoácidos) y derivados tales como
interferones nativos (tipo silvestre), sean conocidos en la técnica
o lleguen a estar disponibles en el futuro. Ejemplos de dichas
variantes son alelos, y los productos de mutagénesis dirigida al
sitio en los que los restos se delecionan, insertan y/o sustituyen
(véase, por ejemplo, Publicación Europea Nº 146.354 mencionada
anteriormente). Se sabe que IFN-\gamma tiene un
intervalo de hospedador estrecho, por lo tanto, debe usarse un
homólogo de IFN-\gamma para el animal a tratar. En
terapia humana, la variante desCysTyrCys de la secuencia mostrada
en la Patente de Estados Unidos Nº 4.717.138 y su homólogo,
documento EP 77.670, se emplea preferiblemente, y opcionalmente la
variante C-terminal en la que los últimos cuatro
restos de aminoácidos se delecionan en el procesamiento
post-traduccional. Para su uso terapéutico en seres
humanos, el IFN-\gamma de la presente invención es
preferiblemente IFN-\gamma humano recombinante
(rhIFN-\gamma), con o sin los aminoácidos
CysTyrCys en el extremo N-terminal. Más
preferiblemente, IFN-\gamma es una especie de
IFN-\gamma humano recombinante (interferón gamma
humano recombinante-1b,
rhIFN-\gamma-1b, que contiene 140
aminoácidos), que es el ingrediente activo de la formulación
comercial, Actimmune® (Genentech, Inc., South San Francisco,
California). Como se sabe que IFN-\gamma es
altamente específico de la especie, en experimentos animales, o
para uso veterinario, se emplea preferiblemente
IFN-\gamma de la especie animal a tratar. Por
tanto, en los experimentos in vivo que usan un modelo animal
de rata, se ha empleado IFN-\gamma recombinante
murino (de ratón) (Genentech, Inc.). Las ratas y los ratones están
suficientemente bien relacionados para permitir el uso de
IFN-\gamma de ratón en un modelo de
rata.
rata.
En un sentido farmacológico, en el contexto de
la presente invención, una "cantidad terapéuticamente eficaz"
de IFN-\gamma se refiere a una cantidad eficaz en
el tratamiento de hipertrofia, especialmente hipertrofia
cardiaca.
"Hipertrofia", como se usa en este
documento, se define como un aumento en la masa de un órgano o
estructura independiente del crecimiento natural que no implica
formación de tumores. La hipertrofia de un órgano o tejido se debe
a un aumento en la masa de las células individuales (hipertrofia
verdadera), o a un aumento en la cantidad de células que componen
el tejido (hiperplasia), o ambas. Ciertos órganos, tales como el
corazón, pierden la capacidad de dividirse poco antes del
nacimiento. Por consiguiente, "hipertrofia cardiaca" se define
como un aumento en la masa del corazón que, en adultos, se
caracteriza por un aumento del tamaño de las células miocitos y el
contenido de proteínas contráctiles sin división celular con
concomitante. El carácter del estrés responsable de incitar la
hipertrofia (por ejemplo, precarga aumentada, poscarga aumentada,
pérdida de miocitos, como en el infarto de miocardio, o depresión
primaria de la contractilidad), parece jugar un papel crítico en la
determinación de la naturaleza de la respuesta. La fase temprana de
la hipertrofia cardiaca está habitualmente caracterizada
morfológicamente por aumentos en el tamaño de las microfibrillas y
mitocondrias, así como un agrandamiento de las mitocondrias y
núcleos. En esta fase, aunque las células musculares son más grandes
que las normales, la organización celular está ampliamente
conservada. En una fase más avanzada de la hipertrofia cardiaca,
hay aumentos preferentes en el tamaño o cantidad de organelas
específicas, tales como mitocondrias, y se añaden nuevos elementos
contráctiles en áreas localizadas de las células, de un modo
irregular. Las células sometidas a hipertrofia de larga duración
muestran alteraciones más obvias en la organización celular,
incluyendo núcleos marcadamente agrandados con membranas altamente
lobuladas, que se desplazan adyacentes a las miofibrillas y causan
la ruptura del registro de banda Z normal. La expresión
"hipertrofia cardiaca" se usa para incluir todas las fases de
la progresión de esta afección, caracterizada por diversos grados de
daño estructural del músculo cardiaco, independientemente del
trastorno cardiaco subyacente.
"Fallo cardiaco" se refiere a una
anormalidad de la función cardiaca en la que el corazón no bombea
sangre al ritmo necesario para los requisitos de los tejidos
metabolizantes. El fallo cardiaco puede estar causado por varios
factores, incluyendo formas isquémicas, congénitas, reumáticas, o
idiopáticas.
"Fallo cardiaco congestivo" es una
patología progresiva en la que el corazón cada vez es más incapaz de
administrar el rendimiento cardiaco adecuado (el volumen de sangre
bombeado por el corazón en el tiempo) para suministrar la sangre
oxigenada a los tejidos periféricos. Según progresa el fallo
cardiaco, suceden daños estructurales y hemodinámicos. Aunque estos
daños tienen una diversidad de manifestaciones, un síntoma
característico es la hipertrofia ventricular. El fallo cardiaco
congestivo es un resultado final habitual de varios trastornos
cardiacos.
El "infarto de miocardio" generalmente está
provocado por aterosclerosis de las arterias coronarias, a menudo
con trombosis coronaria superimpuesta. Puede dividirse en dos tipos
principales: infartos transmurales, en los que la necrosis
miocárdica implica al grosor completo de la pared ventricular, e
infartos subendocárdicos (no transmurales), en los que la necrosis
implica al subendocardio, el miocardio intramural, o ambos, sin
extenderse abriéndose paso a través de la pared ventricular del
epicardio. Se sabe que el infarto de miocardio provoca tanto un
cambio en los efectos hemodinámicos como una alteración en la
estructura de las zonas dañadas y sanas del corazón. Por tanto, por
ejemplo, el infarto de miocardio reduce el rendimiento cardiaco
máximo y el volumen de impulso del corazón. También está asociada
con el infarto de miocardio una estimulación de la síntesis de ADN
que sucede en el intersticio así como un aumento en la formación de
colágeno en las áreas del corazón no afectadas.
Como resultado del estrés o tensión aumentada en
el corazón en hipertensión prolongada debida, por ejemplo, a la
resistencia periférica total aumentada, la hipertrofia cardiaca se
ha asociado durante mucho tiempo con "hipertensión". Una
característica del ventrículo que llega a ser hipertrófico como
resultado de sobrecarga de presión crónica es un rendimiento
diastólico alterado. Fouad et al., J. Am. Coll. Cardiol. 4,
1500-6 (1984); Smith et al., J. Am. Cardiol.
5, 869-74 (1985). Se ha detectado una relajación del
ventrículo izquierdo prolongada en hipertensión esencial temprana,
a pesar de la función sistólica normal o supranormal. Hartford et
al., Hypertension 6, 329-338 (1984). Sin
embargo, no hay un paralelismo cercano entre los niveles de presión
sanguínea y la hipertrofia cardiaca. Aunque se ha presentado una
mejora en la función del ventrículo izquierdo en respuesta a
terapia hipertensiva en seres humanos, los pacientes tratados de
diversas maneras con un diurético (hidroclorotiazida), un
\beta-bloqueante (propranolol), o un bloqueante de
los canales de calcio (diltiazem), han mostrado una inversión de la
masa del ventrículo izquierdo, sin mejora de la función diastólica.
Inouye et al., Am. J. Cardiol. 53, 1583-7
(1984).
Otra enfermedad cardiaca compleja asociada con
la hipertrofia cardiaca es "cardiomiopatía hipertrófica". Esta
afección está caracterizada por una gran diversidad de
características morfológicas, funcionales, y clínicas (Maron et
al., N. Engl. J. Med. 316, 780-9 [1987]; Spirito
et al., N. Engl. J. Med. 320, 749-55 [1989];
Louie y Edwards, Prog. Cardiovasc. Dis. 36, 275-308
[1994]; Wigle et al., Circulation 92, 1680-92
[1995]), cuya heterogenicidad está acentuada por el hecho de que
afecta a pacientes de todas las edades (Spirito et al., N.
Engl. J. Med. 336, 775-785 [1997]). Los factores
causantes de la cardiomiopatía hipertrófica también son diversos y
poco entendidos. Los datos recientes sugieren que las mutaciones en
la cadena pesada de \beta-miosina pueden
representar aproximadamente del 30 al 40 por ciento de los casos de
cardiomiopatía hipertrófica familiar (Watkins et al., N.
Engl. J. Med. 326, 1108-14 [1992] Schwartz et
al, Circulation 91, 532-40 [1995]; Marian y
Roberts, Circulation 92, 1336-47 [1995]; Thierfelder
et al., Cell 77, 701-12 [1994]; Watkins
et al., Nat. Gen. 11, 434-7 [1995]).
La "estenosis aórtica" supravalvular es un
trastorno valvular heredado, que se caracteriza por el
estrechamiento de la aorta ascendente, pero otras arterias,
incluyendo las arterias pulmonares, también pueden estar afectadas.
La estenosis aórtica sin tratar puede conducir a presión
intracardiaca aumentada que produce hipertrofia miocárdica y
finalmente fallo cardiaco y muerte. La patogénesis de este trastorno
no se entiende completamente, pero la hipertrofia y posiblemente la
hiperplasia del músculo liso medial son características prominentes
de este trastorno. Se ha informado de que las variantes moleculares
del gen de la elastina están implicadas en la patogénesis de
desarrollo de estenosis aórtica. (Patente de Estado Unidos Nº
5.650.282 presentada el 22 de julio de 1997).
La "regurgitación valvular" sucede como
resultado de enfermedades cardiacas que producen trastornos de las
válvulas cardiacas. Diversas enfermedades, como fiebre reumática,
pueden causar el encogimiento o extracción del orificio de la
válvula, mientras que otras enfermedades pueden provocar
endocarditis, una inflamación del endocardio o membrana de
revestimiento de los orificios auriculoventriculares y
funcionamiento del corazón. Defectos tales como el estrechamiento
de la válvula, estenosis o el cierre deficiente de la válvula
provocan una acumulación de sangre en la cavidad cardiaca o la
regurgitación de sangre pasada la válvula. Si no se corrige, una
estenosis o insuficiencia valvular prolongada puede producir
hipertrofia cardiaca y daño asociado al músculo cardiaco, que
finalmente puede necesitar un reemplazo de la válvula.
Se describe el tratamiento de todos estos, y de
otros trastornos cardiacos acompañados de hipertrofia cardiaca.
"Tratamiento" se refiere tanto a
tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas,
donde el objeto es prevenir o ralentizar (reducir) la hipertrofia.
Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen los que ya tienen un
trastorno así como los propensos a tener el trastorno o aquéllos en
los que se quiere prevenir el trastorno. La hipertrofia puede ser
el resultado de cualquier causa, incluyendo causas idiopáticas,
cardiotróficas, o miotróficas, o isquemia o fallos isquémicos, tales
como, infarto de miocardio.
La administración "crónica" se refiere a la
administración del agente o agentes de un modo continuo en oposición
a un modo agudo, para mantener el efecto antihipertrófico inicial
durante un periodo de tiempo prolongado.
"Mamífero" para propósitos de tratamiento
se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo
seres humanos, animales domésticos y de granja, y animales de
zoológico, deportivos o de compañía, tales como perros, gatos,
vacas, caballos, ovejas, cerdos, etc. Preferiblemente, el mamífero
es un ser humano.
La administración "en combinación con" uno
o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración
simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.
En este ensayo, se aíslan miocitos ventriculares
de una única rata (Sprague-Dawley macho),
esencialmente siguiendo una modificación del procedimiento descrito
con detalle por Piper et al., "Adult ventricular rat heart
muscle cells". En: Cell Culture Techniques in Heart and Vessel
Research, H.M. Piper, ed., Berlin: Spinger-Verlag,
1990. pág. 36-60. Este procedimiento permite el
aislamiento de miocitos ventriculares adultos y el cultivo de larga
duración de estas células en el fenotipo con forma de bastón. La
fenilefrina y la prostaglandina F_{2\alpha} (PGF_{2\alpha}) han
demostrado inducir una respuesta de propagación en estas células
adultas. Piper et al., supra; Lai et al., Am.
J. Physiol. 1996; 271 (Heart Circ. Physiol. 40):
H2197-H2208. Después se ensaya la inhibición de la
propagación de miocitos inducida por análogos PGF_{2\alpha}'' o
PGF_{2\alpha} (por ejemplo, fluprostenol) y fenilefrina por
diversos inhibidores potenciales de la hipertrofia cardiaca. Se
describe un protocolo detallado en los siguientes ejemplos.
Un modelo farmacológico que ensaya la capacidad
de IFN-\gamma de inhibir la hipertrofia cardiaca
inducida en ratas (por ejemplo, Wistar o
Sprague-Dawley macho) por inyección subcutánea de
fluprostenol (un análogo agonista de PGF_{2\alpha}). Se sabe que
las ratas con hipertrofia cardiaca patológica inducida por infarto
de miocardio tienen niveles crónicamente elevados de PGF_{2\alpha}
extraíble en su miocardio. Lai et al., Am. J. Physiol.
(Heart Circ. Physiol.) 271: H2197-H2208 (1996). Por
consiguiente, los factores que pueden inhibir los efectos del
fluprostenol en el crecimiento del miocardio in vivo son
potencialmente útiles para tratar la hipertrofia cardiaca. Los
efectos de IFN-\gamma sobre la hipertrofia
cardiaca se determinan midiendo el peso del corazón, los
ventrículos, y el ventrículo izquierdo (normalizado por el peso
corporal) con relación a ratas tratadas con fluprostenol que no han
recibido IFN-\gamma. Se proporciona una
descripción detallada de este ensayo en los ejemplos.
Para el ensayo in vivo es habitual
inducir hipertrofia cardiaca por sobrecarga de presión por
constricción de la aorta abdominal de animales de ensayo. En un
protocolo típico, se tratan ratas (por ejemplo Wistar o
Sprague-Dawley macho) con anestesia, y la aorta
abdominal de cada rata se estrecha justo por debajo del diafragma.
Beznak M., Can. J. Biochem. Physiol. 33, 985-94
(1955). La aorta se expone a través de una incisión quirúrgica, y
se coloca una aguja roma al lado del vaso. La aorta se constriñe con
una ligadura de hilo de lana alrededor de la aguja que se retira
inmediatamente y que reduce el lumen de la aorta al diámetro de la
aguja. Este enfoque se describe, por ejemplo, en Rossi et
al., Am. Heart J. 124, 700-709 (1992) y O'Rourke
y Reibel, P.S.E.M.B. 200, 95-100 (1992). Se
describe una descripción detallada del protocolo usado por la
presente invención en los siguientes ejemplos.
El MI agudo se induce en ratas por ligamiento de
la arteria coronaria izquierda y se confirma por examen
electrocardiográfico. También se prepara un grupo de animales con
una operación simulada como animales de control. Los datos más
tempranos han mostrado que la hipertrofia cardiaca está presente en
el grupo de animales con MI, como es evidente por un aumento del
18% en la proporción de peso cardiaco a peso corporal. Lai et
al., supra. El tratamiento de estos animales con
bloqueantes candidatos de la hipertrofia cardiaca, por ejemplo,
IFN-\gamma, proporciona una información valiosa
acerca del potencial terapéutico de los candidatos ensayados.
Puede usarse IFN-\gamma para
el tratamiento de hipertrofia cardiaca, es decir, el agrandamiento
del corazón, independientemente de la etiología y patogénesis.
Cuando se impone una presión excesiva o carga de volumen al corazón
(ventrículo), se desarrolla hipertrofia cardiaca (miocárdica),
proporcionando un mecanismo compensatorio fundamental que permite
que el ventrículo sostenga este volumen. Krayenbuehl et al.,
Eur. Heart J. 4 (Supl. A), 29 (1983). El carácter del estrés
(precarga aumentada, poscarga aumentada, pérdida de miocitos, como
en infarto de miocardio, o depresión primaria de la contractilidad)
responsable del desarrollo de la hipertrofia juega un papel crítico
en la determinación de la naturaleza de la respuesta hipertrófica.
Scheuer y Buttrick, Circulation 75 (Supl. I), 63 (1987). Se
describe el tratamiento de hipertrofia cardiaca asociada con
cualquier afección patológica subyacente incluyendo, sin
limitación, después de infarto de miocardio, hipertensión,
estenosis aórtica, cardiomiopatía, regurgitación valvular,
derivación cardiaca, y fallo cardiaco congestivo. Las
características principales de estas afecciones se han analizado
anteriormente en este documento.
Es particularmente importante el uso de
IFN-\gamma para la prevención del fallo cardiaco
después de infarto de miocardio. Aproximadamente 750.000 paciente
padecen infarto de miocardio agudo (AMI) anualmente, y
aproximadamente una cuarta parte de todas las muertes en los
Estados Unidos se debe a AMI. En los últimos años, los agentes
trombolíticos, por ejemplo, estreptoquinasa, uroquinasa, y en
particular el activador de plasminógeno tisular
(t-PA) han aumentado significativamente la
supervivencia de pacientes que padecían infarto de miocardio. Cuando
se administra como una infusión intravenosa continua en 1,5 a 4
horas, t-PA produce permeabilidad coronaria a los
90 minutos en el 69% al 90% de los pacientes tratados. Topol et
al., Am. J. Cardiol. 61, 723-8 (1988); Neuhaus
et al., J. Am. Coll. Cardiol. 12, 581-7
(1988); Neuhaus et al., J. Am. Coll. Cardiol. 14,
1566-9 (1989). Los índices de permeabilidad más
altos se han presentado con una dosis alta o regímenes de
dosificación acelerada. Topol, J. Am. Coll. Cardiol. 15,
922-4 (1990). t-PA también puede
administrarse como un único bolo, aunque debido a su vida media
relativamente corta, es más adecuado para terapia de infusión. Tebbe
et al., Am. J. Cardiol. 64, 448-53 (1989).
Una variante de t-PA, específicamente diseñada para
tener una vida media más larga y una especificidad por fibrina muy
alta, TNK t-PA (una variante de t-PA
T103N, N117Q, KHRR(296-299)AAAA, Keyt
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,
3670-3674 (1994)) es particularmente adecuada para
la administración en embolada. Sin embargo, a pesar de todos estos
avances, el pronóstico a largo plazo de la supervivencia del
paciente depende enormemente del control después del infarto y el
tratamiento de los pacientes, que debe incluir el control y el
tratamiento de la hipertrofia cardiaca.
Otra indicación terapéutica importante es el
tratamiento de hipertrofia cardiaca asociada con hipertensión. Como
se ha indicado anteriormente, se sabe que la hipertensión sostenida
produce hipertrofia cardiaca. Aunque ciertos agentes hipotensivos
han demostrado reducir la masa del ventrículo izquierdo, el
tratamiento no siempre produce la mejora en la función diastólica.
Por consiguiente, puede administrarse IFN-\gamma
en combinación con agentes bloqueantes del receptor
\beta-adrenérgico, por ejemplo, propranolol,
timolol, tertalolol, carteolol, nadolol, betaxolol, penbutolol,
acetobutolol, atenolol, metoprolol, carvedilol; inhibidores de la
enzima convertidora de angiotensina (ACE), por ejemplo, quinapril,
captopril, enalapril, ramipril, benazepril, fosinopril, lisinopril;
diuréticos, por ejemplo, clorotiazida, hidroclorotiazida,
hidroflumetazida, metilclorotiazida, benztiazida, diclorfenamida,
acetazolamida, indapamida; y/o bloqueantes de los canales de calcio,
por ejemplo, diltiazem, nifedipina, verapamil, nicardipina. Las
composiciones farmacéuticas que comprenden los agentes terapéuticos
identificados por sus nombres genéricos están disponibles en el
mercado, y tienen que administrarse siguiendo las instrucciones del
fabricante para la dosificación, administración, efectos adversos,
contraindicaciones, etc. (Véase, por ejemplo, Physicians' Desk
Reference, Medical Economics Data Production Co., Montvale, N. J.,
51ª Edición, 1997).
También puede administrarse
IFN-\gamma de forma profiláctica a pacientes con
hipertrofia cardiaca, para prevenir la progresión de la afección, y
evitar la muerte repentina, incluyendo muerte de pacientes
asintomáticos. Dicha terapia preventiva está particularmente
justificada en el caso de pacientes diagnosticados con hipertrofia
cardiaca masiva del ventrículo izquierdo (un grosor de pared máximo
de 35 mm o más en adultos, o un valor comparable en niños), o en
casos en los que la carga hemodinámica en el corazón es
particularmente fuerte.
IFN-\gamma también puede ser
útil en el tratamiento de fibrilación auricular, que se desarrolla
en una parte sustancial de pacientes diagnosticados con
cardiomiopatía hipertrófica.
Se administra IFN-\gamma en
forma de una composición farmacéutica que comprende
IFN-\gamma como ingrediente activo, junto con un
vehículo farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones terapéuticas
de IFN-\gamma para tratar hipertrofia cardiaca se
preparan para el almacenamiento mezclando
IFN-\gamma que tiene el grado deseado de pureza
con vehículos, excipientes, o estabilizadores fisiológicamente
aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences,
supra), en forma de torta liofilizada o soluciones acuosas.
Los vehículos, excipientes, o estabilizadores aceptables son no
tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones
empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, y otros
ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico;
polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10
restos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o
inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como
polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina,
asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros
carbohidratos incluyendo glucosa, manosa, o dextrinas; agentes
quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o
sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; y/o
tensioactivos no iónicos tales como Tween, Pluronics, o
polietilenglicol (PEG).
El IFN-\gamma a usar para la
administración in vivo puede estar estéril. Esto se consigue
fácilmente por filtración a través de membranas de filtración
estériles, antes de o después de la liofilización y reconstitución.
Habitualmente, el IFN-\gamma se almacenará en
forma liofilizada o en solución.
Puede usarse IFN-\gamma en
forma liofilizada, en combinación con otros ingredientes para la
reconstitución con un diluyente apropiado en el momento del uso.
Como se sabe que IFN-\gamma es inestable en ácido,
tradicionalmente se ha manejado a pH neutro o ligeramente alcalino.
Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.499.014 que
describe la reactivación de una solución ácida de
IFN-\gamma liofilizada a un pH de 6 a 9. Las
soluciones neutras o ligeramente alcalinas de concentraciones más
altas de IFN-\gamma son generalmente no adecuadas
como formulaciones inyectables a causa de la formación inmediata de
un precipitado visible. Dicho precipitado puede causar trombosis en
administración o potencia disminuida. La Publicación de Patente
Europea Nº 0196.203 describe la reconstitución de
IFN-\gamma liofilizado a un pH de 4 a 6,0.
Las composiciones farmacéuticas líquidas
estables que comprenden una cantidad eficaz de
IFN-\gamma no liofilizado junto con un tampón
capaz de mantener el pH a 4,0-6,0, un agente
estabilizador, y un detergente no iónico se describen en la Patente
de Estados Unidos Nº 5.151.265 presentada el 29 de septiembre de
1992. El agente estabilizador típicamente es un alcohol de azúcar
polihídrico tal como manitol, y el detergente no iónico puede ser
un tensioactivo, por ejemplo, polisorbato 80 o polisorbato 20. El
detergente no iónico está preferiblemente presente en un intervalo
de aproximadamente 0,07 a 0,2 mg/ml, y más preferiblemente en una
concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml. Los tampones adecuados
son tampones convencionales de ácidos orgánicos y sales de los
mismos, tal como tampones nitrato (por ejemplo, mezcla de citrato
monosódico-citrato disódico, mezcla de ácido
cítrico-citrato trisódico, mezcla de ácido
cítrico-citrato monosódico, etc.), tampones
succinato (por ejemplo, mezcla de ácido
succínico-succinato monosódico, mezcla de ácido
succínico-hidróxido sódico, mezcla de ácido
succínico-succinato disódico, etc.), tampones
tartrato (por ejemplo, mezcla de ácido
tartárico-tartrato sódico, mezcla de ácido
tartárico-tartrato potásico, mezcla de ácido
tartárico-hidróxido sódico, etc.), tampones
fumarato (por ejemplo, mezcla de ácido
fumárico-fumarato monosódico, mezcla de ácido
fumárico-fumarato disódico, mezcla de fumarato
monosódico-fumarato disódico, etc.), tampones
gluconato (por ejemplo, mezcla de ácido
glucónico-gluconato sódico, mezcla de ácido
glucónico-hidróxido sódico, mezcla de ácido
glucónico-gluconato potásico, etc.), tampones
oxalato (por ejemplo, mezcla de ácido
oxálico-oxalato sódico, mezcla de ácido
oxálico-hidróxido sódico, mezcla de ácido
oxálico-oxalato potásico, etc.), tampones lactato
(por ejemplo, mezcla de ácido láctico-lactato
sódico, mezcla de ácido láctico-hidróxido sódico,
mezcla de ácido láctico-lactato potásico, etc.), y
tampones acetato (por ejemplo, mezcla de ácido
acético-acetato sódico, mezcla de ácido
acético-hidróxido sódico, etc.).
Una formulación líquida comercial conocida de
IFN-\gamma (Actimmune®
rhuIFN-\gamma, Genentech, Inc.) es una solución
no conservada estéril, transparente, incolora cargada en un vial
monodosis para inyección subcutánea. Cada vial de 0,5 ml de
Actimmune contiene 100 \mug (3 millones U, actividad específica:
30 millones U/mg) de
IFN-\gamma-1b formulado en 20 mg
de manitol, 0,36 mg de succinato sódico, 0,05 mg de polisorbato 20 y
agua estéril para inyección.
Las composiciones farmacéuticas conservadas que
son adecuadas para el uso repetido, preferiblemente contienen:
- a)
- IFN-\gamma no sometido a liofilización anterior;
- b)
- un tampón acetato capaz de mantener el pH entre aproximadamente 4 y aproximadamente 6 (el intervalo de pH de estabilidad máxima de la proteína en solución);
- c)
- un detergente no iónico principalmente para estabilizar la proteína contra la agregación inducida por agitación;
- d)
- un agente de isotonicidad;
- e)
- un conservante seleccionado entre el grupo de fenol, alcohol bencílico y un haluro de bencetonio, por ejemplo, cloruro; y
- f)
- agua.
Los detergentes no iónicos (tensioactivos)
pueden ser, por ejemplo, polisorbatos (por ejemplo, polisorbato
[Tween] 20, 80, etc.) o poloxámeros (por ejemplo, poloxámero 188).
El uso de tensioactivos no iónicos permite exponer la formulación a
estrés superficial de cizalla sin causar la desnaturalización de la
proteína. Además, dichas formulaciones que contienen tensioactivo
pueden emplearse en dispositivos de aerosol tales como los usados
en una dosificación pulmonar, y pistolas de inyección a chorro sin
aguja (véase, por ejemplo, el documento EP 257.956).
El agente de isotonicidad está presente para
asegurar la isotonicidad de las composiciones líquidas de la
presente invención, e incluye alcoholes de azúcar polihídrico,
preferiblemente alcoholes de azúcares trihídricos o superiores,
tales como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y
manitol. Estos alcoholes de azúcar pueden usarse solos o en
combinación. Como alternativa, puede usarse cloruro sódico u otras
sales inorgánicas apropiadas para volver las soluciones
isotónicas.
El tampón acetato puede, por ejemplo, ser una
mezcla de ácido acético-acetato sódico, mezcla de
ácido acético-hidróxido sódico, etc. El pH de la
formulación líquida de esta invención se tampona en el intervalo de
aproximadamente 4,0 a 6,0, preferiblemente de 4,5 a 5,5, y más
preferiblemente a aproximadamente pH 5.
Los conservantes fenol, alcohol bencílico y
haluros de bencetonio, por ejemplo, cloruro, son agentes
antimicrobianos conocidos.
En un ejemplo preferido, se administra
IFN-\gamma en forma de una composición
farmacéutica líquida que comprende los siguientes componentes:
- IFN-\gamma
- 0,1-2,0 mg/ml
- acetato sódico (pH 5,0)
- 5-100 mM
- Tween 20
- 0,1 a 0,01% en peso
- fenol
- 0,05 a 0,4% en peso
- manitol
- 5% en peso
- agua para inyección, USP
- hasta 100%
donde las cantidades en porcentaje
se basan en el peso de la composición. Puede reemplazarse el fenol
por alcohol bencílico del 0,5-1,0% en peso, y puede
reemplazarse el manitol por cloruro sódico al 0,9% en
peso.
Más preferiblemente, las composiciones
comprenden
- IFN-\gamma
- 0,1 a 1,0 mg/ml
- acetato sódico (pH 5,0)
- 10 mM
- Tween 20
- 0,01% en peso
- fenol
- 0,2%
- manitol
- 5%
Puede reemplazarse el fenol por alcohol
bencílico al 0,75% en peso y el manitol por cloruro sódico al 0,9%
en peso.
Las formulaciones líquidas conservadas contienen
preferiblemente dosis múltiples de una cantidad terapéuticamente
eficaz de IFN-\gamma. En vista del estrecho
intervalo de hospedador de este polipéptido, para el tratamiento de
pacientes humanos se prefieren formulaciones líquidas que comprenden
IFN-\gamma humano, más preferiblemente
IFN-\gamma humano de secuencia nativa. Como
modificador de la respuesta biológica, IFN-\gamma
ejerce una amplia diversidad de actividades sobre un amplio
intervalo de tipos celulares, en una diversidad de especies de
mamíferos humanos y no humanos. La dosis terapéuticamente eficaz
variará, por supuesto, dependiendo de factores tales como la
afección patológica a tratar (incluyendo prevención), la edad, peso,
estado médico general, historia médica, etc. del paciente, y su
determinación pertenece a la experiencia del médico. La dosis
eficaz generalmente está en el intervalo de aproximadamente 0,001 a
aproximadamente 1,0 mg/kg, más preferiblemente de aproximadamente
0,01-1 mg/kg, más preferiblemente aproximadamente
0,01-0,1 mg/kg. En dichas formulaciones,
huIFN-\gamma mostrará preferiblemente una
actividad específica del orden de aproximadamente 2 x 10^{7} U/mg
de proteína o superior cuando se ensaya sobre células A549 frente al
virus de la encefalomiocarditis. Debe apreciarse que la
contaminación con endotoxinas debe mantenerse al mínimo a un nivel
seguro, por ejemplo, menos de 0,5 ng/mg de proteína. Además, para
la administración a seres humanos, las formulaciones líquidas deben
cumplir las normas de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general,
y pureza requeridas por la FDA Office and Biologics.
La vía de administración de
IFN-\gamma es de acuerdo con métodos conocidos,
por ejemplo, inyección o infusión por vías intravenosa,
intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular,
intraarterial o intralesional, o por sistemas de liberación
sostenida, como se indica a continuación. Las composiciones de
IFN-\gamma terapéuticas generalmente se colocan
en un recipiente que tiene una vía de acceso estéril, por ejemplo,
una bolsa de solución intravenosa o vial que tiene un tapón
perforable por una aguja de inyección hipodérmica. Las formulaciones
se administran preferiblemente como inyecciones intravenosas
(i.v.), subcutáneas (s.c.) o intramusculares (i.m.) repetidas, o
como formulaciones en aerosol adecuadas para el suministro
intranasal o intrapulmonar (para suministro intrapulmonar véase,
por ejemplo, el documento EP 257.956).
Las composiciones acuosas estables de
IFN-\gamma están preferiblemente contenidas en
viales, que contienen hasta aproximadamente 30 dosis
terapéuticamente eficaces de IFN-\gamma. La
bioactividad de IFN-\alpha permanece
preferiblemente en aproximadamente el 20% de la bioactividad
mostrada en el momento de la primera administración durante al
menos aproximadamente 14 días, más preferiblemente durante al menos
aproximadamente 200 días después de la primera administración.
También puede administrarse
IFN-\gamma en forma de preparaciones de liberación
sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación
sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos
sólidos que contienen la proteína, estando dichas matrices en forma
de artículos con forma, por ejemplo películas, o microcápsulas. Los
ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres,
hidrogeles (por ejemplo,
poli(2-hidroxietil-metacrilato)
como se describe por Langer et al., J. Biomed. Mater. Res.,
15: 167-277 [1981] y Langer, Chem. Tech., 12,
98-105 [1982] o poli(alcohol vinílico)),
polilactidas (Patente de Estados Unidos Nº 3.773.919, documento EP
58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma
etil-L-glutamato (Sidman et
al., Biopolymers, 22, 547-556 [1983]),
etilen-vinil acetato no degradable (Langer et
al., supra), copolímeros de ácido láctico-ácido
glicólico degradables tales como Lupron Depot^{TM} (microesferas
inyectables compuestas de copolímeros de ácido láctico-ácido
glicólico y acetato de leuprolida), y ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico
(documento EP 133.988).
\newpage
Aunque los polímeros tales como
etilen-vinil acetato y ácido láctico-ácido glicólico
posibilitan la liberación de moléculas durante unos 100 días,
ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más
cortos. Cuando las proteínas encapsuladas permanecen en el cuerpo
durante un tiempo prolongado, pueden desnaturalizarse o agregarse
como resultado de la exposición a humedad a 37ºC, produciendo la
pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la
inmunogenicidad. Pueden idearse estrategias racionales para la
estabilización de proteínas dependiendo del mecanismo implicado.
Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la
formación de enlaces S-S intermoleculares a través
del intercambio de tio-disulfuro, la estabilización
puede conseguirse modificando los restos sulfhidrilo, liofilizando
soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando
aditivos apropiados, y desarrollando composiciones de matriz
polimérica específicas.
Las composiciones de
IFN-\gamma de liberación sostenida también pueden
incluir IFN-\gamma atrapado en liposomas. Los
liposomas que contienen IFN-\gamma se preparan por
métodos conocidos per se: documento DE 3.218.121; Epstein
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:
3688-3692 (1985); Hwagn et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034 (1980); documento EP
52.322; documento EP 36.676; documento EP 88.046; documento EP
143.949; documento EP 142.641; solicitud de Patente japonesa
83-118008; Patentes de Estados Unidos Nº 4.485.045
y 4.544.545; y documento EP 102.324. Normalmente, los liposomas son
de tipo unilamelar pequeños (aproximadamente
200-800 Angstrom) en los que el contenido de lípidos
es superior a aproximadamente el 30% en moles de colesterol,
estando la proporción seleccionada ajustada para la terapia
óptima.
Una cantidad eficaz de
IFN-\gamma a emplear terapéuticamente dependerá,
por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la vía de
administración, y el estado del paciente. Por consiguiente, será
necesario para el terapeuta valorar la dosificación y modificar la
vía de administración según sea necesario para obtener el efecto
terapéutico óptimo. La dosificación recomendada para administración
de IFN-\gamma (Actimmune®, Genentech, Inc.) para
tratar pacientes con enfermedad granulomatosa crónica es 50
mcg/m^{2} (1,5 millones U/m^{2}) para pacientes cuya área
superficial corporal es mayor a 0,5 m^{2}, y 1,5 mcg/kg/dosis para
pacientes cuya área superficial corporal es igual a o menor de 0,5
m^{2}, administrado como inyección subcutánea, tres veces a la
semana. Esto es una directriz valiosa para un médico para
determinar la dosis eficaz óptima para el tratamiento de
hipertrofia cardiaca. El médico administrará
IFN-\gamma hasta que se alcance una dosis que
consiga el efecto deseado para el tratamiento de la disfunción
cardiaca. Por ejemplo, si el objetivo es el tratamiento de fallo
cardiaco congestivo, la cantidad será una que inhiba la hipertrofia
cardiaca progresiva asociada con esta afección. La progresión de
esta terapia se controla fácilmente por ecocardiografía. De forma
similar, en pacientes con cardiomiopatía hipertrófica, puede
administrarse IFN-\gamma en una base empírica,
dependiendo de la percepción subjetiva de beneficio del
paciente.
Puede administrarse IFN-\gamma
en combinación con otros agentes terapéuticos usados para el
tratamiento (incluyendo prevención) de hipertrofia cardiaca. Por
ejemplo, puede combinarse terapia con IFN-\gamma
con la administración de inhibidores de factores de hipertrofia de
miocitos cardiacos conocidos, por ejemplo, inhibidores de agonistas
\alpha-adrenérgicos, por ejemplo, fenilefrina;
endotelina-1; CT-1; LIF; enzima
convertidora de angiotensina; y angiotensina II. Los inhibidores del
factor de hipertrofia cardiaca (CHF, cardiotrofina o
cardiotrofina-1, véase, por ejemplo, el documento US
5.679.545) son particularmente preferidos para la terapia de
combinación.
Los candidatos preferidos para la terapia de
combinación en el tratamiento de cardiomiopatía hipertrófica son
fármacos bloqueantes \beta-adrenérgicos (por
ejemplo, propanolol, timolol, tertalolol, carteolol, nadolol,
betaxolol, penbutolol, acetobutolol, atenolol, metoprolol,
carvedilol), verapamil, difedipina, diltiazem. El tratamiento de la
hipertrofia asociada con presión sanguínea alta puede requerir el
uso de terapia de fármacos antihipertensivos usando bloqueantes de
los canales de calcio, por ejemplo, diltiazem, nifedipina,
verapamil, nicardipina; agentes bloqueantes
\beta-adrenérgicos; diuréticos, por ejemplo,
clorotiazida, hidroclorotiazida, hidroflumetazida, metilclotiazida,
benztiazida, ciclorfenamida, acetazolamida, indapamida; y/o
inhibidores de ACE, por ejemplo, quinapril, captopril, enalapril,
ramipril, benazepril, fosinopril, lisinopril.
La cantidad eficaz de los agentes terapéuticos
administrados en combinación con IFN-\gamma será a
juicio del médico o veterinario. La administración y el ajuste de
la dosificación se hace para conseguir el tratamiento óptimo de las
afecciones a tratar, e idealmente tiene en cuenta el uso diuréticos
y digitalis, y afecciones tales como hiper o hipotensión, fallo
renal, etc. La dosis dependerá adicionalmente de factores tales como
el tipo de agente terapéutico a usar y el paciente específico que
se está tratando. Típicamente, la cantidad empleada será la misma
dosis que la usada si el agente terapéutico dado se administrara sin
IFN-\gamma.
Cultivos de miocitos adultos El
procedimiento usado para el aislamiento de miocitos ventriculares de
ratas adultas fue una modificación de un procedimiento descrito por
Piper et al., supra, y se detalla en Lai et
al., supra. Para cada preparación de miocitos, se
anestesió una rata Sprague-Dawley macho que pesaba
aproximadamente 250 g con pentobarbital sódico, y se retiró el
corazón. Se recortó del corazón el tejido extraño, y se montó sobre
un sistema Langendorff que tenía la temperatura controlada a 37ºC.
El corazón se perfundió con aproximadamente 40 ml de tampón de
Krebs (NaCl 110 mM, KCl 2,6 mM, KH_{2}PO_{4} 1,2 mM, MgSO_{4}
\cdot 7H_{2}O 1,2 mM, NaHCO_{3} 25 mM y glucosa 11 mM).
Después se hizo recircular una solución que contenía 30 mg de
colagenasa y 12,5 \mul de CaCl_{2} 100 mM y 50 ml de tampón de
Krebs a través del corazón durante 30 minutos. Se retiró el corazón
del aparato Langendorff, y se retiraron las aurículas y los tejidos
conectivos. Los ventrículos se cortaron en cubos de 2 mm con tijeras
de disección, y se digirieron adicionalmente en una solución de
colagenasa reciente (30 mg de colagenasa y 400 mg de BSA disueltos
en tampón de Krebs con 12,5 \mul de CaCl_{2} 100 mM) durante
cinco minutos a 37ºC. Durante la digestión, la suspensión tisular
se agitó a mano suavemente una vez por minuto. Después de la
digestión, se retiró el sobrenadante y se guardó, y el tejido
restante se digirió adicionalmente en solución de colagenasa
reciente durante cinco minutos adicionales.
Se sembraron los miocitos de rata adulta
aislados en placas recubiertas con laminina a una densidad de
3x10^{3} células/ml. Después de 72 horas de estimulación
apropiada, las células se fijaron con glutaraldehído y se tiñeron
con Eosina Y. Se capturaron imágenes de las células con forma de
bastón con microscopía fluorescente y se determinó la amplitud
máxima usando un software de formación de imágenes (Simple 32,
Compix Imaging, Mars, PA).
Se ha demostrado que PGF_{2\alpha} y el
agonista \alpha-adrenérgico fenilefrina inducen la
hipertrofia de miocitos cardiacos de rata neonata cultivados (Adams
et al., J. Biol. Chem. 271: 1179-1186 [1996];
Lai et al., Am. J. Physiol. (Heart Circ. Physiol.) 271:
H2197-H2208 [1996]; Meidell et al., Am. J.
Physiol. 251: H1076-H1084 [1986]; Simpson, J. Clin.
Invest. 72: 732-738 [1983]; Simpson, Circ. Res. 56:
884-894 [1985]). Los miocitos ventriculares de rata
adulta se propagaron cuando se expusieron a estos factores en
cultivo (Lai et al., supra; Piper et al.,
"Adult ventricular rat heart muscle cells", en: Cell Culture
Techniques in Heart and Vessel Research, H.M. Piper, Editor, 1990,
Springer-Verlag: Berlin, pág.
36-60). Los miocitos adultos tienen una morfología
de tipo bastón. Cuando estas células se exponen a PGF_{2\alpha}
0,1 \muM, las células con forma de bastón se aplanan y propagan
(Figura 1). La respuesta de propagación se cuantificó midiendo la
amplitud máxima celular de al menos 200 células con forma de bastón
y representando este valor frente al porcentaje de frecuencia de la
amplitud celular en la población. PGF_{2\alpha} indujo un cambio
significativo en la amplitud máxima celular como fue evidente por
un cambio en la distribución de la población para este parámetro en
comparación con células de control (P<0,001). Tratando las
células con IFN-\gamma se inhibió
significativamente su respuesta a PGF_{2\alpha} (P<0,001
PGF_{2\alpha} + IFN-\gamma comparado con
PGF_{2\alpha}). El efecto inhibidor de
IFN-\gamma sobre la propagación de miocitos
inducida por PGF_{2\alpha} fue dependiente de la dosis (Figura 2)
sobre un intervalo de concentración que es coherente con la
respuesta biológica a IFN-\gamma en miocitos
cardiacos y otros sistemas celulares (Singh et al., J. Biol.
Chem. 271: 1111-1117 [1996]; Pinsky et al.,
J. Clin. Invest. 95: 766-685 [1995];
Ungureanu-Longrois et al., Circ. Res. 77:
494-502 [1995]; Soderberg-Naucler
et al., J. Clin. Invest. 100: 3154-3163
[1997]; Gou et al., J. Clin. Invest. 100:
829-838 [1997]; Marra et al., Can J. Cardiol.
12: 1259-1267 [1996]). La capacidad de inhibir la
propagación de miocitos inducida por PGF_{2\alpha} parece ser
específica de IFN-\gamma ya que varias citoquinas
diferentes incluyendo IL-1\alpha,
IL-1\beta, IL-2,
IL-6, TNF-\alpha,
IFN-\alpha e IFN-\beta no
pudieron inhibir la respuesta de propagación. El efecto inhibidor de
IFN-\gamma no es específico para PGF_{2\alpha}.
IFN-\gamma también puede inhibir la propagación
inducida por fenilefrina (Figura 3).
Animales Todos los procedimientos
experimentales se ajustaron a los principios de guía de la American
Physiology Society, y se aprobaron por el Genentech's Institutional
Animal Care and Use Commitee. Los animales usados en este estudio
eran ratas Sprague/Dawley (SD) macho (de 8 semanas de edad, Charles
River Breeding Laboratories, Inc.). Los animales se aclimataron a
la instalación durante al menos una semana antes de los
experimentos, se alimentaron con pienso de rata en gránulos y agua
ad libitum, y se albergaron en una habitación con luz y
temperatura controladas.
Administración de fluprostenol y/o
IFN-\gamma Las ratas recibieron una inyección
subcutánea de fluprostenol (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) a 0,15
mg/kg, IFN-\gamma de ratón recombinante
(Genentech, Inc., South San Francisco, CA) a 0,08 mg/kg,
combinación de fluprostenol e IFN-\gamma, o
vehículo salino, dos veces al día durante 14 días. En los grupos de
IFN-\gamma y fluprostenol+
IFN-\gamma, los animales se pretrataron con
IFN-\gamma durante un día. Se midió el peso
corporal antes y después del tratamiento. Un estudio previo ha
demostrado que la dosis de fluprostenol usada en este documento es
la dosis más baja que produce una hipertrofia cardiaca
significativa en ratas. Lai et al., supra. Un estudio
piloto demostró que IFN-\gamma a la dosis
indicada anteriormente inhibía la hipertrofia cardiaca inducida por
fluprostenol con pequeños efectos sobre el peso corporal en las
ratas.
Evaluación hemodinámica Trece días
después del tratamiento, se anestesió a las ratas con una inyección
intraperitoneal de ketamina 80 mg/kg (Aveco Co., Inc., Fort Dodge,
Iowa) y xilazina 10 mg/kg (Rugby Laboratories, Inc., Rockville
Center, NY.). Se implantó un catéter (PE-10
fusionado con PE 50) cargado con heparina-solución
salina (50 U/ml) en la aorta abdominal, mediante la arteria femoral
derecha, para la medida de la presión arterial media (MAP) y el
ritmo cardiaco (HR). El catéter se exteriorizó y se fijó a la parte
posterior del cuello.
Un día después de la cateterización, se conectó
el catéter arterial a un transductor de presión Modelo CP10
(Century Technology Company, Inglewood, CA, USA) que se acopló a un
polígrafo Grass Modelo 7 (Grass Instruments, Quincy, MA, USA). Se
midieron MAP y HR simultáneamente en ratas conscientes, no
controladas.
Medida de los pesos de los órganos Con
anestesia con ketamina/xilazina, se retiró el corazón, el riñón, y
el bazo, se diseccionaron y se pesaron. El ventrículo izquierdo se
almacenó a -80ºC para la evaluación de la expresión génica.
Modelo animal de sobrecarga de presión La
inducción de la sobrecarga de presión por ligamiento parcial de la
aorta abdominal en ratas fue como se ha descrito previamente. Kimura
et al., Am. J. Physiol. 1989: 256 (Heart Circ. Physiol.
25):H1006-H1-11; Batra et
al., J. Cardiovasc. Pharmacol. 17 (supl. 2),
S151-S153 (1991). En resumen, las ratas se
anestesiaron con ketamina/xilazina como se ha descrito
anteriormente. Se hizo una incisión de línea media de 3 cm en la
pared abdominal. La aorta abdominal entre el diafragma y la arteria
renal se expuso y se hizo un bucle con una sutura de seda
5-0. La sutura se apretó alrededor de una aguja de
calibre 23, y después se retiró la aguja. Los animales de simulación
recibieron la cirugía sin que se apretara la sutura.
Protocolo experimental en ratas con
sobrecarga de presión Las ratas con constricción aórtica
recibieron aleatoriamente inyección subcutánea de
IFN-\gamma a 0,08 mg/kg dos veces al día durante
un día antes de la cirugía y durante 14 días después de la cirugía.
Los animales de simulación no se trataron. Trece días después del
tratamiento se implantó un catéter en la arteria carótida derecha
con anestesia como se ha indicado anteriormente. Un día después del
implante, se midió la presión arterial y HR en ratas conscientes. El
corazón y otros órganos incluyendo el hígado, riñón, y bazo se
retiraron, se pesaron, y se fijaron en formalina tamponada al 10%
para estudios patológicos. El ventrículo izquierdo se diseccionó
rápidamente y se congeló con nitrógeno líquido en algunos animales
y se almacenó a -80ºC para la evaluación de la expresión génica.
Análisis estadístico Los resultados se
expresan como media \pm SEM. Se realizó un análisis de la varianza
de una vía (ANOVA) para evaluar las diferencias en los parámetros
entre grupos. Después se sometieron las diferencias significativas
a un análisis post hoc usando el método de
Newman-Keuls; P<0,05 se consideró
significativo.
Preparación del ARN Se aisló el ARN total
usando columnas RNeasy Maxi (Qiagen) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante.
RT-PCR Se usó la
tecnología de RT-PCR a tiempo real (TaqMan) para
comparar la expresión génica entre los diversos grupos de
tratamiento. Se diseñó una sonda oligonucleotídica que contenía un
colorante informador fluorescente,
6-carboxitetrametil-rodamina
(TAMRA), en el extremo 3' para hibridar con el amplicón definido
por dos cebadores de PCR. El fosfato de bloqueo de 3' evita la
extensión de la sonda. Se libera el colorante informador de la
sonda por la actividad exonucleasa 5' de la Taq polimerasa durante
la fase de extensión de la reacción de PCR. La fluorescencia
resultante se controla en el tubo de reacción por el detector de
secuencia y se cuantifica sin manipulación adicional, de ahí el
término "tiempo real". El número de ciclos umbral (Ct),
definido como el punto en el que la fluorescencia informadora
alcanza un valor superior a 10 veces la desviación típica de la
medida inicial, es proporcional a la cantidad de amplicón producido
a partir de la muestra. Como la fluorescencia se detecta durante la
fase exponencial de la amplificación, ninguno de los componentes de
reacción es limitante. En cada experimento, se analiza un control
que carece de molde de ARN para controlar la contaminación, y se
incluye otro control en el que la etapa RT se omite para eliminar la
amplificación de posibles ADN contaminantes como fuente de la
señal. Las reacciones se optimizan para dar la señal de
fluorescencia mayor y el menor Ct por valoración de las
concentraciones de magnesio y de cebador, y el producto se procesa
en un gel de agarosa para verificar la presencia de una única banda
en el peso molecular previsto. Además, la secuencia del amplicón se
explora frente a Genbank para eliminar la posibilidad de un
solapamiento con genes muy relacionados.
Para cada muestra, se determina el ARNm de cada
gen diana usando una curva patrón como se describe a continuación y
después normalizándolo a la cantidad de
gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa
(GAPDH) en la muestra (véase a continuación para las detalles de
este cálculo). La abundancia relativa de cada gen diana a GAPDH
después puede compararse entre los grupos de tratamiento.
Se realizó RT-PCR sobre 1 ng de
ARN total por reacción usando el Detector de Secuencia TaqMan Modelo
7700 (ABI-Perkin Elmer) (Gibson et al.,
Genome Res. 6, 995-1001 [1996]). Las condiciones de
reacción de amplificación (para 50 \mul) fueron Tampón A TaqMan
1x, dATP, dCTP, dGTP 200 \muM, y dUTP 400 \muM, glicerol al 10%,
MgCl_{2} 6,5 mM, transcriptasa inversa MuLV 50 U, inhibidor de
ARNasa 20 U, AmpliTaq Gold 1,25 U, cebadores directo e inverso 100
nM, y sonda fluorogénica 100 nM. Se adquirieron los reactivos de
RT-PCR y el glicerol de Perkin Elmer y Sigma,
respectivamente. Las reacciones se realizaron en tubos y tapones
MicoAmp Optical (ABI-Perkin Elmer). Los cebadores y
sondas TaqMan se diseñaron de acuerdo con la directriz determinada
por Perkin Elmer y se sintetizaron en Genentech, Inc., excepto para
los de GAPDH de roedores que los aportaron generosamente Perkin
Elmer. La transcripción inversa se realizó a 48ºC durante 30 minutos
seguido por activación por calor de AmpliTaq Gold a 95ºC durante 10
minutos. El ciclado térmico fue a 95ºC durante 30 segundos y 60ºC
durante 1,5 minutos durante 40 ciclos.
La cuantificación de los resultados TaqMan se
realizó como se describe por Heid et al., Genome Res.
6:986-994 (1996), con modificaciones. En resumen,
se procesaron por duplicado curvas patrón (dilución en serie 1:5)
para cada gen diana de interés. El Ct se representó en el eje Y
frente al log de la concentración de ARN total (eje X), y se
determinó la ecuación que describe la línea. Se determinó el ARNm
para cada gen diana a partir de la curva patrón apropiada
introduciendo el Ct (valor Y) y resolviéndolo para la entrada de
ARNm (X). Después se normalizó el valor para
el gen diana a GAPDH resolviendo la siguiente ecuación: 10^{X1}/10^{X2}, en la que X1 es el gen diana y X2 es GAPDH.
el gen diana a GAPDH resolviendo la siguiente ecuación: 10^{X1}/10^{X2}, en la que X1 es el gen diana y X2 es GAPDH.
La administración crónica de fluprostenol, un
análogo agonista de PGF_{2\alpha}, ha demostrado inducir
hipertrofia cardiaca in vivo, y las ratas con hipertrofia
cardiaca patológica inducida por infarto de miocardio tienen
niveles crónicamente elevados de PGF_{2\alpha} en su miocardio
(Lai et al., supra). Por tanto, los factores que
pueden inhibir los efectos de PGF_{2\alpha} sobre el crecimiento
del miocardio in vivo pueden ser útiles para el tratamiento
de la hipertrofia cardiaca. Se dosificó a las ratas con
fluprostenol en presencia y ausencia de IFN-\gamma
durante dos semanas, y se determinaron los efectos sobre la
hipertrofia cardiaca. El peso absoluto del corazón, los ventrículos,
y el ventrículo izquierdo tendieron a aumentar en las ratas
tratadas con fluprostenol, en comparación con los controles con
vehículo, y disminuyó significativamente en estos parámetros en
ratas tratadas con fluprostenol + IFN-\gamma con
relación a las ratas tratadas con fluprostenol (Tabla 1). El
tratamiento con fluprostenol provocó un aumento significativo en la
proporción de los pesos del corazón, de los ventrículos, y el
ventrículo izquierdo al peso corporal (BW), indicando que el
fluprostenol inducía hipertrofia cardiaca (Figura 4).
IFN-\gamma inhibió la hipertrofia inducida por
fluprostenol. Las ratas que recibieron +
IFN-\gamma tuvieron un peso cardiaco, ventricular
y del ventrículo izquierdo significativamente disminuido,
normalizado por BW, en comparación con animales en los grupos de
fluprostenol (Figura 4). La comparación entre los grupos tratados
con IFN-\gamma y vehículo mostraron que la
administración de IFN-\gamma solo no alteró
significativamente los pesos absolutos o normalizados con BW del
corazón, los ventrículos, o el ventrículo izquierdo (Tabla 1, Figura
4).
La administración crónica de fluprostenol se
asoció a una disminución significativa en la presión arterial media
(MAP) en comparación con los controles tratados con vehículo (Figura
5). IFN-\gamma no tuvo efecto sobre MAP comparado
con el vehículo, y no afectó a la MAP de animales tratados con
fluprostenol. Hubo una alteración significativa en el ritmo
cardiaco en los cuatro grupos de tratamiento (Figura 5). Estos
resultados indican que IFN-\gamma no inhibe la
hipertrofia inducida por fluprostenol contrarrestando los efectos
hemodinámicos del tratamiento.
IFN-\gamma no sólo inhibió el
aumento de la masa cardiaca asociada con la administración de
fluprostenol, sino también las alteraciones en la expresión de
genes cardiacos asociada con hipertrofia inducida por fluprostenol
(Figura 6). Hubo un aumento en la abundancia de ARNm para la
\alpha-actina esquelética, colágeno 1, y el
factor natriurético en los corazones de ratas tratadas con
fluprostenol en comparación con el vehículo. El ARNm para la ATPasa
cálcica de retículo sarcoplásmico se redujo significativamente en
estas ratas. IFN-\gamma inhibió todas menos la
respuesta del factor natriurético atrial.
IFN-\gamma también se ensayó
en un modelo de roedor de hipertrofia cardiaca inducida por
sobrecarga de presión generada por constricción aórtica abdominal.
La constricción aórtica provocó una hipertrofia cardiaca como fue
evidente por los aumentos sustanciales en los pesos absolutos del
corazón, las aurículas, los ventrículos y el ventrículo izquierdo,
y también las proporciones de estos pesos a BW. El tratamiento con
IFN-\gamma atenuó significativamente la
hipertrofia cardiaca en este modelo (Tabla 2 y Figura 7 y 8).
También se examinó el efecto de
IFN-\gamma sobre otros órganos (Tabla 2). Ni la
constricción aórtica ni el tratamiento con
IFN-\gamma alteraron el peso del riñón y la
proporción del peso del riñón a BW. En comparación con los animales
con operación simulada, el peso del hígado y la proporción de BW
tendieron a disminuir en las ratas con constricción aórtica
tratadas con vehículo, pero no en los tratados con
IFN-\gamma. La constricción aórtica causó una
elevación significativa en el peso del bazo absoluto y normalizado
con BW, que fue exagerado por el tratamiento con
IFN-\gamma. Por tanto, los efectos de
IFN-\gamma sobre la masa cardiaca no se debieron
a un efecto generalizado sobre el peso de los órganos.
La presión arterial media, la presión sistólica,
y la presión diastólica fueron marcadamente superiores en ratas con
constricción aórtica en comparación con controles con una operación
simulada, y el aumento gradual en la presión arterial no fue
diferente entre las ratas con constricción tratadas con
IFN-\gamma o vehículo (Figura 9). Este resultado
indica que la atenuación de la hipertrofia cardiaca observada en
ratas con constricción que recibieron IFN-\gamma
no se relacionó con una alteración en la poscarga.
La constricción aórtica provocó varios cambios
en la expresión de genes cardiacos. La abundancia relativa del ARNm
para la cadena pesada de \beta-miosina,
\alpha-actina de músculo liso y
\alpha-actina de músculo esquelético, el factor
natriurético atrial, colágeno I y III, y fibronectina aumentaron
todas en ratas con constricción en comparación con controles con
operación simulada. Los efectos en dos de estos genes;
\alpha-actina de músculo liso y colágeno I se
inhibieron por IFN-\gamma (Tabla 3).
Tomados en conjunto, los resultados de los
Ejemplos 1 y 2 muestran que IFN-\gamma puede
inhibir la hipertrofia cardiaca. Los efectos de
IFN-\gamma no se limitan a la inhibición de un
aumento en la masa cardiaca inducida por los estímulos
hipertróficos, IFN-\gamma también puede inhibir
ciertas alteraciones moleculares que suceden en el corazón
hipertrófico al nivel de expresión génica. Es especialmente
importante que IFN-\gamma inhibió la inducción
del gen del colágeno I in vivo, tanto en respuesta a
estimulación crónica con fluprostenol como en un modelo de
hipertrofia inducida por sobrecarga de presión. El colágeno I
representa aproximadamente el 75% del colágeno miocárdico (Ju et
al., Can. J. Cardiol. 12: 1259-1267 [1996]). La
deposición de matriz extracelular aumentada y la fibrosis
intersticial que acompaña a la hipertrofia cardiaca pueden
contribuir a la patofisiología del fallo cardiaco. Inhibiendo la
producción de colágeno I, IFN-\gamma puede reducir
la fibrosis intersticial en el tratamiento del fallo cardiaco.
\vskip1.000000\baselineskip
Datos expresados como media \pm SEM, y los
números de animales son 14, 14, 14 y 9 en el grupo de Vehículo,
Flup, Flup + IFN, e IFN respectivamente. Vehículo, solución salina;
Flup, fluprostenol; IFN, interferón \gamma, BWO, niveles basales
de peso corporal; BW, peso corporal después del tratamiento;
\DeltaBW, BW-BWO; HW, peso del corazón; VW, peso
ventricular; LVW, peso del ventrículo izquierdo; KW, peso del riñón;
SW, peso del bazo. * p<0,05, ** P<0,01, en comparación con el
grupo de Vehículo, # p<0,05, \alm{2} p<0,01, en comparación
con el grupo Flup.
\vskip1.000000\baselineskip
Datos expresados como media \pm SEM. Los
números de animales son 16, 22, y 21 en el grupo Simulado,
PO+ve-
hículo, y PO+IFN, respectivamente, para todos los parámetros excepto HR para los que los números de animales son 7, 8, y 7, respectivamente. PO, sobrecarga de presión; IFN, interferón \gamma; BWO, niveles basales de peso corporal; BW, peso corporal después del tratamiento; \DeltaBW, BW-BWO; AW, peso de las aurículas; KW, peso del riñón; LW, peso del hígado; SW, peso del bazo; HR, ritmo cardiaco. * p<0,05, ** P<0,01, en comparación con el grupo simulado. # p<0,05, \alm{2} p<0,01, en comparación con el grupo PO+vehículo.
hículo, y PO+IFN, respectivamente, para todos los parámetros excepto HR para los que los números de animales son 7, 8, y 7, respectivamente. PO, sobrecarga de presión; IFN, interferón \gamma; BWO, niveles basales de peso corporal; BW, peso corporal después del tratamiento; \DeltaBW, BW-BWO; AW, peso de las aurículas; KW, peso del riñón; LW, peso del hígado; SW, peso del bazo; HR, ritmo cardiaco. * p<0,05, ** P<0,01, en comparación con el grupo simulado. # p<0,05, \alm{2} p<0,01, en comparación con el grupo PO+vehículo.
PO indica sobrecarga de presión; IFN, interferón
gamma; ANF, factor natriurético atrial; \betaMHC, cadena pesada
de la \beta-miosina; SKA,
\alpha-actina de músculo esquelético; SMA,
\alpha-actina de músculo liso; COLI, colágeno I;
COLIII, colágeno III; FIB, fibronectina. Los niveles de expresión se
calculan como proporciones con la
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa. n=6 por grupo. Los valores son media \pm SEM.
\dagger P<0,05 frente al grupo simulado+vehículo.
Claims (13)
1. Interferón gamma
(IFN-\gamma) para el uso en un método de
tratamiento de hipertrofia cardiaca, en el que se va a administrar
una cantidad terapéuticamente eficaz de IFN-\gamma
a un paciente diagnosticado con hipertrofia cardiaca inducida por
sobrecarga de presión.
2. El IFN-\gamma de la
reivindicación 1, en el que dicho paciente es un ser humano.
3. El IFN-\gamma de la
reivindicación 2, en el que dicho IFN-\gamma es
IFN-\gamma-1b humano recombinante
(rhIFN-\gamma-1b).
4. El IFN-\gamma de la
reivindicación 2, en el que dicho IFN-\gamma se va
a administrar en combinación con al menos un agente terapéutico
adicional usado para el tratamiento de hipertrofia cardiaca o una
enfermedad cardiaca que produce hipertrofia cardiaca.
5. El IFN-\gamma de la
reivindicación 4, en el que dicho agente terapéutico adicional se
selecciona entre el grupo compuesto por agentes bloqueantes
\beta-adrenérgicos, verapamil, difedipina, y
diltiazem.
6. El IFN-\gamma de la
reivindicación 5, en el que dicho agente bloqueante
\beta-adrenérgico es carvedilol, propranolol,
metoprolol, timolol, oxprenolol o tertatolol.
7. El IFN-\gamma de la
reivindicación 4, en el que dicho IFN-\gamma se va
a administrar en combinación con un fármaco antihipertensivo.
8. El IFN-\gamma de la
reivindicación 4, en el que dicho IFN-\gamma se va
a administrar con un inhibidor de ACE.
9. El IFN-\gamma de la
reivindicación 4, en el que dicho IFN-\gamma se va
a administrar con un antagonista del receptor de endotelina.
10. El IFN-\gamma de la
reivindicación 4, en el que dicho IFN-\gamma se va
a administrar después de la administración de un agente
trombolítico.
11. El IFN-\gamma de la
reivindicación 10, en el que dicho agente trombolítico es el
activador de plasminógeno tisular humano recombinante
(rht-PA).
12. El IFN-\gamma de la
reivindicación 4, en el que dicho IFN-\gamma se va
a administrar después de angioplastia primaria para el tratamiento
de infarto de miocardio agudo.
13. Uso de interferón gamma
(IFN-\gamma) para la fabricación de un medicamento
para el tratamiento de hipertrofia cardiaca, en el que se va a
administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de
IFN-\gamma a un paciente diagnosticado con
hipertrofia cardiaca inducida por sobrecarga de presión,
particularmente en el que la composición es como se define en las
reivindicaciones 2 a 12.
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