ES2267258T3

ES2267258T3 - Tratamiento de hipertrofia cardiaca.

Info

Publication number: ES2267258T3
Application number: ES99912711T
Authority: ES
Inventors: Hongkui Jin; Hsienwie Lu; Nicholas J. Paoni; Renhui Yang
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1998-04-02
Filing date: 1999-03-19
Publication date: 2007-03-01
Anticipated expiration: 2019-03-19
Also published as: ATE332144T1; ES2314786T3; JP2009256375A; AR018174A1; WO1999051260A2; DE69939723D1; US6989364B1; AU757910B2; BR9909422A; EP1702623B1; HK1099197A1; ZA200004854B; JP5030329B2; DE69932235D1; AU3102499A; JP2002510645A; DK1067958T3; EP1702623A3; CN1201814C; EP1702623A2

Abstract

Uso de interferón gamma (IFN-) para la preparación de un medicamento para el tratamiento de hipertrofia cardiaca que comprende administrar a un paciente diagnosticado con hipertrofia cardiaca asociada con una afección seleccionada entre el grupo compuesto por hipertrofia después de infarto de miocardio, estenosis aórtica, regurgitación valvular, derivación cardiaca, y fallo cardiaco congestivo, una cantidad terapéuticamente eficaz de IFN-.

Description

Tratamiento de hipertrofia cardiaca.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en líneas generales a los efectos de IFN-\gamma sobre la hipertrofia cardiaca. Más particularmente, la invención se refiere al uso de IFN-\gamma para la prevención y tratamiento de hipertrofia cardiaca y afecciones patológicas asociadas.

Antecedentes de la invención Interferón-gamma (IFN-\gamma)

Los interferones son glicoproteínas de una única cadena, relativamente pequeñas liberadas por células invadidas por virus o ciertas sustancias diferentes. Los interferones actualmente están agrupados en tres clases principales, denominadas interferón de leucocitos (interferón-alfa, interferón-\alpha, IFN-\alpha), interferón de fibroblastos (interferón-beta, interferón-\beta, IFN-\beta), e interferón inmune (interferón-gama, interferón-\gamma, IFN-\gamma). En respuesta a infección viral, los linfocitos sintetizan principalmente interferón-\alpha (junto con una menor cantidad de una especie distinta de interferón, habitualmente llamada interferón omega), mientras que la infección de los fibroblastos habitualmente induce interferón-\beta. Los interferones \alpha y \beta comparten aproximadamente el 20-30 por ciento de homología de la secuencia de aminoácidos. El gen para IFN-\beta humano carece de intrones, y codifica una proteína que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos del 29% con IFN-\alphaI, humano que sugiere que los genes de IFN-\alpha e IFN-\beta han evolucionado desde un ancestro común (Taniguchi et al., Nature 285, 547-549 [1980]). Por el contrario, IFN-\gamma no se induce por infección viral, en su lugar, se sintetiza por los linfocitos en respuesta a mitógenos, y está apenas relacionado con otros dos tipos de interferones con respecto a la secuencia de aminoácidos. Se sabe que los interferones \alpha y \beta inducen antígenos de MHC de clase I, mientras que IFN-\gamma induce la expresión de antígenos de MHC de clase II, y también aumenta la eficacia con las células diana que presentan el péptido viral asociado con las moléculas MHC de clase I para el reconocimiento por células T citotóxicas.

IFN-\gamma es un miembro de la familia de interferones, que muestra las propiedades antivirales y antiproliferativas características de los interferones \alpha y \beta (IFN-\alpha e IFN-\beta) pero, en contraste con esos interferones, es inestable con PH 2. IFN-\gamma se produjo en un principio después de la inducción mitogénica de los linfocitos. La producción recombinante de IFN-\gamma humano se presentó por primera vez por Gray, Goeddel y sus colaboradores (Gray et al., Nature 295, 503-508 [1982]), y es el objeto de las Patentes de Estados Unidos Nº 4.762.791, 4.929.544, 4.727.138, 4.925.793, 4.855.238, 5.582.824, 5.096.705, 5.574.137, y 5.595.888. El IFN-\gamma humano recombinante de Gray y Goeddel producido en E. coli, constaba de 146 aminoácidos, comenzando la posición N-terminal de la molécula con la secuencia CysTyrCys. Después se ha descubierto que el IFN-\gamma humano nativo (es decir, que surge por la inducción por mitógenos de linfocitos de sangre periférica humana y purificación posterior) es un polipéptido que carece del extremo N-terminal CysTyrCys asignado por Gray et al., supra. Más recientemente, se determinó la estructura cristalina de IFN-\gamma humano recombinante derivado de E. coli (rhIFN-\gamma) (Ealick et al., Science 252, 698-702 [1991]), que muestra que la proteína existe como un homodímero no covalente fuertemente entrelazado, en el que las dos cadenas polipeptídicas idénticas están orientadas de un modo antiparalelo.

Se sabe que IFN-\gamma muestra un amplio intervalo de actividades biológicas, incluyendo actividades antitumorales, antimicrobianas e inmunorreguladoras. Una forma particular de IFN-\gamma humano recombinante (rhIFN-\gamma-Ib, Actimmune®, Genentech, Inc. South San Francisco, California) está disponible en el mercado como un fármaco inmunomodulador para el tratamiento de enfermedad granulomatosa crónica caracterizada por infecciones graves, recurrentes de la piel, ganglios linfáticos, hígado, pulmones, y huesos debido a la disfunción de los fagocitos (Baehner. R.L., Pediatric Pathol. 10, 143-153 [1990]). También se ha propuesto IFN-\gamma para el tratamiento de dermatitis atópica, una enfermedad cutánea e inflamatoria habitual caracterizada por pruritis grave, un ciclo de recaída crónico con frecuentes periodos de exacerbación, una morfología clínica y distribución distintivas de las lesiones cutáneas (véase, Publicación PCT Nº WO 91/07984, publicada el 13 de junio de 1991), estenosis vascular, incluyendo el tratamiento de reestenosis después de angioplastia y/o cirugía vascular (Publicación PCT Nº WO 90/03189 publicada el 5 de abril de 1990), diversas afecciones pulmonares, incluyendo síndromes de distrés respiratorio (RDS), tales como síndrome de distrés respiratorio en el adulto (ARDS) y una forma neonata, llamada de diversas formas como RDS idiopático o enfermedad de la membrana hialina (Publicación PCT Nº WO 89/01341, publicada el 23 de febrero de 1989). Además, se ha propuesto IFN-\gamma para su uso en el tratamiento de diversas alergias, por ejemplo, asma, y afecciones relacionadas con infección por VIH, tales como infecciones oportunistas, por ejemplo, neumonía por Pneumocystis carinii, y sepsis asociada a un traumatismo. La producción alterada de IFN-\gamma se ha observado en pacientes con esclerosis múltiple (MP), y se ha informado de que la producción de IFN-\gamma está enormemente suprimida en suspensiones de células mononucleares estimuladas por mitógenos derivadas de pacientes con SIDA. Para una revisión véase, por ejemplo, el Capítulo 16, "The Presence of Possible Pathogenic Role of Interferons in Disease". En: Interferons and other Regulatory Cytokines, Edward de Maeyer (1988, John Wiler and Sons Publishers).

El interferón-\gamma, junto con otras citoquinas, se ha implicado como inductor de óxido nítrico inducible (iNOS) que, a su vez, se ha descrito como un mediador importante en el mecanismo inflamatorio subyacente a un fallo cardiaco, de la respuesta cardiaca a sepsis o rechazo de un aloinjerto, así como la progresión de cardiomiopatías dilatadas de diversas etiologías. Ungureanu-Longrois et al., Circ. Res. 77, 494-502 (1995); Pinsky et al., J. Clin. Invest. 95, 677-685 (1995); Singh et al., J. Biol. Chem. 270, 28471-8 (1995); Birks y Yacoub, Coronary Artery Disease 8, 389-402 (1997); Hattori et al., J. Mol. Cell. Cardiol. 29, 1585-92 (1997). De hecho, se ha informado de que IFN-\gamma es la única citoquina más potente con respecto a la inducción de iNOS en miocitos (Watkins et al., J. Mol. & Cell. Cardiol. 27, 2015-29 [1995]). El documento EP0790062 describe el uso de IFN-\gamma para tratar una hipertrofia cardiaca, por la que el tejido de músculo cardiaco está infectado con virus de la hepatitis C humana.

Hipertrofia cardiaca

La hipertrofia está definida en líneas generales como un aumento en el tamaño de un órgano o estructura independientemente del crecimiento natural que no implica la formación de tumores. La hipertrofia de un órgano o tejido se debe a un aumento en la masa de las células individuales (hipertrofia verdadera), o a un aumento en la cantidad de células que componen el tejido (hiperplasia), o ambas.

La hipertrofia cardiaca es el agrandamiento del corazón que se activa por estímulos mecánicos y hormonales y posibilita que el corazón se adapte a la demanda de un rendimiento cardiaco aumentado o a una lesión. Morgan y Baker, Circulation 83, 13-25 (1991). Esta respuesta está frecuentemente asociada con una diversidad de afecciones patológicas distintas, como tales como hipertensión, estenosis aórtica, infarto de miocardio, cardiomiopatía, regurgitación valvular, derivación cardiaca, fallo cardiaco congestivo, etc.

A nivel celular, el corazón funciona como un sincitio de miocitos y células de soporte circundantes, llamadas no-miocitos. Aunque los no-miocitos son principalmente fibroblastos/células mesequimáticas, también incluyen células endoteliales y de músculo liso. De hecho, aunque los miocitos componen la mayoría de la masa de un miocardio adulto, representan sólo aproximadamente el 30% de la cantidad de células total presente en el corazón.

El agrandamiento del corazón embrionario depende enormemente de un aumento en la cantidad de miocitos, que continúa hasta muy poco antes del nacimiento, cuando los miocitos cardiacos pierden su capacidad de proliferación. Sucede un crecimiento adicional a través de la hipertrofia de las células individuales. La hipertrofia de los miocitos de los ventrículos cardiacos adultos es una respuesta a una diversidad de afecciones que conducen a una sobrecarga hemodinámica crónica. Por tanto, en respuesta a estímulos hormonales, fisiológicos, hemodinámicos, y patológicos, las células del músculo ventricular adulto pueden adaptarse a cargas de trabajo aumentadas a través de la activación de un proceso hipertrófico. Esta respuesta se caracteriza por un aumento en el tamaño de las células miocitos y el contenido de proteínas contráctiles de las células individuales del músculo cardiaco, sin división celular concomitante y activación de genes embrionarios, incluyendo el gen para el péptido natriurético atrial (ANP). Chien et al., ASEB J. 5, 3037-3046 (1991); Chien et al., Annu. Rev. Physiol. 55, 77-95 (1993). Se ha descrito un aumento en la masa del miocardio como resultado de un aumento en el tamaño de los miocitos que está asociado a una acumulación de colágeno intersticial en la matriz extracelular y alrededor de las arterias coronarias intramiocárdicas en hipertrofia del ventrículo izquierdo después de una sobrecarga de presión en seres humanos (Caspari et al., Cardiovasc. Res. 11, 554-8 [1977]; Schwarz et al., Am. J. Cardiol. 42, 895-903 [1978]; Hess et al., Circulation 63, 360-371 [1981]; Pearlman et al., Lab. Invest. 46, 158-164 [1982]). La hipertrofia cardiaca debida a una sobrecarga hemodinámica crónica es el resultado final habitual de la mayoría de los trastornos cardiacos y una característica constante del fallo cardiaco.

También se ha sugerido que los factores paracrinos producidos por células de soporte no-miocitos pueden estar adicionalmente implicados en el desarrollo de hipertrofia cardiaca, y se han identificado diversos factores hipertróficos derivados de no-miocitos, tales como factor de inhibición de leucocitos (LIF) y endotelina. Metcalf, Growth Factors 7, 169-173 (1992); Kurzrock et al., Endocrine Reviews 12, 208-217 (1991); Inoue et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 2863-2867 (1989); Yanagisawa y Masaki, Trends Pharm. Sci. 10, 374-378 (1989); Patente de Estados Unidos Nº 5.573.762 (presentada el 12 de noviembre de 1996). Los factores ejemplares adicionales que se han identificado como mediadores potenciales de la hipertrofia cardiaca incluyen cardiotrofina-1 (CT-1) (Pennica et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92: 1142-1146 [1995]), catecolaminas, adrenocorticosteroides, angiotensina, y prostaglandinas.

La hipertrofia de miocitos adultos es inicialmente beneficiosa en una respuesta a corto plazo para una función cardiaca alterada permitiendo una disminución en la carga sobre las fibras musculares individuales. Con una sobrecarga de larga duración, grave, sin embargo, las células hipertróficas comienzan a deteriorarse y mueren. Katz, "Heart Failure", en: Katz A. M. ed., Physiology of the Heart (New York, Raven Press, 1992) pág. 638-668. La hipertrofia cardiaca es un factor de riesgo significativo tanto para mortalidad como para morbilidad en el transcurso clínico del fallo cardiaco. Katz. Trends Cardiovasc. Med. 5, 37-44 (1995).

Para detalles adicionales de las causas y patología de hipertrofia cardiaca véase, por ejemplo, Heart Disease, A. Textbook of Cardiovascular Medicine, Braunwald, E. ed., W.B. Saunders Co., 1988, Capítulo 14, Pathophysiology of Heart Failure.

Tratamiento de hipertrofia cardiaca

Actualmente, el tratamiento de la hipertrofia cardiaca varía dependiendo de la enfermedad cardiaca subyacente. Las catecolaminas, adrenocorticosteroides, agiotensina, prostaglandina, factor de inhibición de leucemia (LIF), endotelina (incluyendo endotelina-1, 2 y 3 y endotelina grande), cardiotrofina-1 (CT-1) y factor de hipertrofia cardiaca (CHF) están entre los factores identificados como mediadores potenciales de la hipertrofia. Por ejemplo, los fármacos bloqueantes del receptor \beta-adrenérgico (\beta-bloqueantes, por ejemplo, propanolol, timolol, tertalolol, carteolol, nadolol, betaxolol, penbutolol, acetobutolol, atenolol, metoprolol, carvedilol, etc.) y el verapamil se han usado ampliamente en el tratamiento de cardiomiopatía hipertrofia. Los efectos beneficiosos de los \beta-bloqueantes sobre los síntomas (por ejemplo, dolor de pecho) y la tolerancia al ejercicio se deben ampliamente a una disminución en el ritmo cardiaco con una prolongación posterior de la carga diastólica y la carga ventricular pasiva aumentada. Thompson et al, Br. Heart J. 44, 488-98 (1980); Harrison et al; Circulation 29, 84-98 (1964). Se ha descrito que el verapamil mejora la carga ventricular y probablemente reduce la isquemia miocárdica. Bonow et al., Circulation 72 853-64 (1985). También se han usado nifedipina y diltiazem ocasionalmente en el tratamiento de cardiomiopatía hipertrófica. Lorell et al., Circulation 65, 499-507 (1982); Betocchi et al., Am. J. Cardiol. 78, 451-7 (1996). Sin embargo, a causa de sus propiedades vasodilatadoras potentes, la nifedipina puede ser dañina, especialmente en pacientes con obstrucción de salida. Se ha usado disopiramida para aliviar los síntomas debido a sus propiedades inotrópicas negativas. Pollick, N. Engl. J. Med. 307, 997-9 (1982). En muchos pacientes, sin embargo, los beneficios iniciales disminuyen con el tiempo. Wigle et al., Circulation 92, 1680-92 (1995).

Se ha informado de que la terapia con fármacos antihipertensivos tiene efectos beneficiosos sobre hipertrofia cardiaca asociada con presión sanguínea elevada. Ejemplos de fármacos usados en terapia antihipertensiva, solos o en combinación, son antagonistas de calcio, por ejemplo, nitrendipina; agentes bloqueantes del receptor \beta-adrenérgico, por ejemplo, los enumerados anteriormente; inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ACE), por ejemplo, quinapril, captopril, enalapril, ramipril, benazepril, fosinopril, lisinopril; diuréticos, por ejemplo, clorotiazida, hidroclorotiazida, hidroflumetacida, metilclotiazida, benztiacida, diclorfenamida, acetazolamida, indapamida; bloqueantes de los canales de calcio, por ejemplo, diltiazem, nifedipina, verapamil, nicardipina. Por ejemplo, el tratamiento de la hipertensión con diltiazem y captopril mostraron una disminución en la masa muscular del ventrículo izquierdo, pero el índice de Doppler de la función diastólica no se normalizó. Szlachcic et al., Am. J. Cardiol. 63, 198-201 (1989); Shahi et al. Lancet 336, 458-61 (1990). Estos descubrimientos se interpretaron como que indican que puede seguir habiendo cantidades excesivas de colágeno intersticial después de la regresión de la hipertrofia del ventrículo izquierdo. Rossi et al., Am. Heart J. 124, 700-709 (1992). Rossi et al., supra, investigaron el efecto del captopril sobre la prevención y regresión de la hipertrofia de células miocárdicas y fibrosis intersticial en hipertrofia cardiaca por sobrecarga de presión, en ratas experimentales.

Como no hay una terapia generalmente aplicable para el tratamiento de la hipertrofia cardiaca, la identificación de los factores que pueden prevenir o reducir la hipertrofia de miocitos cardiacos es de importancia principal en el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para inhibir el crecimiento cardiaco patofisiológico.

Sumario de la invención

Se ha descubierto inesperadamente que IFN-\gamma inhibe la propagación de los miocitos cardiacos aislados de ratas adultas inducida por prostaglandina F_{2}_{\alpha} (PGF_{2}_{\alpha}) y fenilefrina. Se ha descubierto adicionalmente que IFN-\gamma inhibe in vivo tanto la hipertrofia cardiaca inducida por fluprostenol, un análogo agonista de PGF_{2}_{\alpha}, como la hipertrofia inducida por sobrecarga de presión en un modelo de rata.

Por consiguiente, la presente invención se refiere al tratamiento de hipertrofia cardiaca, independientemente de la causa subyacente, administrando una dosis terapéuticamente eficaz de IFN-\gamma. Si el objetivo es el tratamiento de pacientes humanos, IFN-\gamma preferiblemente es IFN-\gamma humano recombinante (rhIFN-\gamma), más preferiblemente,
rhIFN-\gamma-1b, que se definirá a continuación en este documento. El concepto de tratamiento se usa en el sentido más amplio, e incluye específicamente la prevención (profilaxis), moderación, reducción, y cura de hipertrofia cardiaca de cualquier fase.

IFN-\gamma se administra preferiblemente en forma de una formulación farmacéutica líquida, que puede conservarse para conseguir una estabilidad en almacenamiento ampliada. Las formulaciones farmacéuticas líquidas conservadas pueden contener múltiples dosis de IFN-\gamma, y pueden, por lo tanto, ser adecuadas para su uso repetido.

IFN-\gamma puede administrarse en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales usados para el tratamiento de hipertrofia cardiaca, o una afección fisiológica decisiva en el desarrollo de hipertrofia cardiaca, tal como presión sanguínea elevada, estenosis aórtica, o infarto de miocardio.

La invención se refiere adicionalmente a un método para preparar una composición farmacéutica para el tratamiento de hipertrofia cardiaca, que comprende IFN-\gamma como ingrediente activo.

La invención también se refiere al uso de un producto farmacéutico que comprende:

(a) Una composición farmacéutica que comprende al menos una dosificación terapéuticamente eficaz de IFN-\gamma;

(b) Un recipiente que contiene dicha composición farmacéutica; y

(c) Una etiqueta fijada a dicho recipiente, o un prospecto incluido en dicho producto farmacéutico que se refiere al uso de dicho IFN-\gamma en el tratamiento de hipertrofia cardiaca.

Breve descripción de las figuras

En las figuras y durante todos los ejemplos, "IFN" o "IFN-\gamma" se refiere a IFN-\gamma recombinante de ratón (Genentech. Inc. South San Francisco, CA, o Genzyme, Cambridge, MA).

Figura 1 Inhibición de la respuesta de propagación inducida por prostaglandina F_{2}_{\alpha} (PGF_{2}_{\alpha}), por IFN-\gamma. Los miocitos se preincubaron con vehículo salino o IFN-\gamma (500 U/ml) en el día del aislamiento. Se realizó una segunda adición de vehículo o IFN-\gamma 24 horas después del aislamiento, junto con la adición de vehículo o PGF_{2}_{\alpha} (10^{-7}M). Después de 72 horas adicionales de incubación, las células se fijaron en glutaraldehído, se tiñeron con eosina Y y se vieron por microscopía de fluorescencia. A, B, C Miocitos cardiacos después de 4 días en cultivo: control, PGF_{2}_{\alpha}, y PGF_{2}_{\alpha}+IFN-\gamma, respectivamente. Histografías que muestran la amplitud máxima de los miocitos cardiacos con forma de bastón frente al porcentaje de la frecuencia de la propia amplitud. La amplitud máxima del las células con forma de bastón se determinó por microscopía de fluorescencia y un software de formación de imágenes. Se examinaron al menos 200 células con forma de bastón a partir de un único experimento por grupo. IFN-\gamma solo no tuvo efectos observables sobre la morfología de las células. P<0,001 para todas las comparaciones de grupo.

Figura 2 Inhibición sensible a dosis de la respuesta inducida por PGF_{2}_{\alpha}, por IFN-\gamma (500-25 U/ml). Los miocitos se preincubaron con vehículo salino o IFN-\gamma el día del aislamiento. Se añadió una segunda cantidad de IFN-\gamma 24 horas después del aislamiento, junto con la adición de vehículo o PGF_{2}_{\alpha} (10 ^{-7} M). Después de una incubación adicional de 72 horas, las células se fijaron en glutaraldehído, se tiñeron con eosina Y y se vieron con fluorescencia. Cuantificación de la morfología de los miocitos: A control, B PGF_{2}_{\alpha}, C PGF_{2}_{\alpha}+IFN-\gamma (25 U/ml), D PGF_{2}_{\alpha} +IFN-\gamma (100 U/ml), E PGF_{2}_{\alpha} +IFN-\gamma (500 U/ml). Histografías que muestran la amplitud máxima de los miocitos cardiacos con forma de bastón frente al porcentaje de la frecuencia de la propia amplitud. La amplitud máxima de las células con forma de bastón se determinó por microscopia de fluorescencia y un software de formación de imágenes. Se examinaron al menos 200 células con forma de bastón a partir de un único experimento por grupo. IFN-\gamma solo no tuvo efecto observable sobre la morfología de las células. P<0,001 para todas las comparaciones de
grupo.

Figura 3 Inhibición de la respuesta de propagación inducida por fenilefedrina (PE), por IFN-\gamma. Los miocitos se preincubaron con vehículo salino o IFN-\gamma (500 U/ml) el día del aislamiento. Se realizó una segunda adición de vehículo o IFN-\gamma 24 horas después del aislamiento, junto con la adición de vehículo o PE (10^{-5} M). Después de una incubación adicional de 72 horas, se fijaron en glutaraldehído, se tiñeron con eosina Y y se vieron por microscopia de fluorescencia. A, B, C Miocitos cardiacos después de 4 días en cultivos: control, PE, y PE+INF-\gamma, respectivamente. Histografías que muestran la amplitud máxima de miocitos cardiacos con forma de bastón frente al porcentaje de frecuencia de la propia amplitud. La amplitud máxima de las células con forma de bastón se determinó por microscopía de fluorescencia y un software de formación de imágenes. Se examinaron al menos 200 células con forma de bastón a partir de un único experimento por grupo. IFN-\gamma solo no tuvo efectos observables sobre la morfología de las células. P<0,001 para todas las comparaciones de grupo.

Figura 4 Efectos de IFN-\gamma sobre la hipertrofia cardiaca inducida por fluprostenol en ratas. Los datos se presentan como media \pm SEM. El número en paréntesis es el número de animales en cada grupo. *P<0,05, *P<0,01, comparado con el grupo de vehículo. #P<0,05, \alm{2}P<0,01, comparado con el grupo Flup. Flup: fluprostenol; IFN=IFN-\gamma; HW: peso del corazón; BW: peso corporal; VW: peso ventricular; LVW: peso del ventrículo izquierdo.

Figura 5 Efectos de Flup y/o IFN sobre MAP y HR. Los datos se presentan como media \pm SEM. El número en paréntesis es el número de animales en cada grupo. *P<0,05 comparado con el grupo de vehículo. #P<0,05, comparado con el grupo Flup. +P<0,05, comparado con el grupo Flup + IFN. Flup: fluprostenol; IFN: IFN-\gamma; MAP: presión arterial media; HR: ritmo cardiaco.

Figura 6 Gráficos de barras que muestran el efecto de fluprostenol (FLUP) e IFN-\gamma sobre: A Actina esquelética (SKA); B ATPasa cálcica del retículo sarcoplásmico (SRCA); C Colágeno 1 (COL1); D Factor natriurético atrial (ANF). Los niveles de expresión se normalizan para el mensaje de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). VEH es el vehículo. Hubo 7 animales por grupo y los datos se presentan como la media \pm SEM. P<0,05 frente al grupo VEH.

Figura 7 Efectos de IFN-\gamma sobre el peso del corazón, el peso ventricular, y el peso del ventrículo izquierdo en ratas con sobrecarga de presión. Los datos se presentan como media \pm SEM. El número en paréntesis es el número de animales en cada grupo. **P<0,01, comparado con el grupo de simulación. \alm{2}P<0,01, comparado con el grupo Constricción + vehículo. Simulado: ratas con una operación simulada; Constricción: ratas con constricción aórtica; IFN: IFN-\gamma; HW: peso del corazón; VW: peso ventricular; LVW: peso del ventrículo izquierdo.

Figura 8 Efectos de IFN-\gamma sobre la proporción del peso del corazón, peso ventricular, y peso del ventrículo izquierdo al peso corporal en ratas con sobrecarga de presión. Los datos se presentan como media \pm SEM. El número en paréntesis es el número de animales en cada grupo. **P<0,01, comparado con el grupo simulado. \alm{2}P<0,01, comparado con el grupo Constricción + vehículo. Simulado: ratas con una operación simulada; Constricción: ratas con constricción aórtica; IFN: IFN-\gamma; HW: peso del corazón; BW: peso corporal; VW: peso ventricular; LVW: peso del ventrículo izquierdo.

Figura 9 Efectos de IFN-\gamma sobre la presión sistólica arterial, presión arterial media, y presión diastólica arterial en ratas con sobrecarga de presión. El número en paréntesis es el número de animales en cada grupo. **P<0,01, comparado con el grupo de simulación. Simulado: ratas con una operación simulada; Constricción: ratas con constricción aórtica; IFN: IFN-\gamma, SAP: presión sistólica arterial; MAP: presión arterial media; DAP: presión diastólica arterial.

Descripción detallada de la invención A. Definiciones

"Interferón gamma", "interferón-gamma", o "IFN-\gamma" se refiere de diversas maneras a todas las formas de interferón gamma (de seres humanos y animales no humanos) que demuestran ser biológicamente activas en cualquier ensayo de hipertrofia cardiaca, por ejemplo, los ensayos de hipertrofia descritos en este documento, y se entiende que incluyen, aunque sin limitación, la forma madura, pro, met y/o des(1-3) (también llamada IFN-\gamma desCysTyrCys), se obtengan de una fuente natural, se sinteticen químicamente o se produzcan por técnicas de tecnología de ADN recombinante. Se describe una descripción completa de la preparación de IFN-\gamma humano recombinante (rhuIFN-\gamma) que incluye su ADNc y secuencias de aminoácidos, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.727.138; 4.762.791; 4.925.793; 4.929.554; 5.582.824; 5.096.705; 4.855.238; 5.574.137; y 5.595.888. IFN-\gamma humano recombinante que carece de CisTyrCys, incluyendo derivados truncados de diversas maneras se describen, por ejemplo, en la publicación de Patente Europea Nº 146.354. Los interferones de animales no-humanos incluyendo IFN-\gamma, se describen, por ejemplo, en la Publicación Europea Nº 88.622. El término incluye formas glicosiladas de diversas maneras y otras variantes (por ejemplo, variantes de la secuencia de aminoácidos) y derivados tales como interferones nativos (tipo silvestre), sean conocidos en la técnica o lleguen a estar disponibles en el futuro. Ejemplos de dichas variantes son alelos, y los productos de mutagénesis dirigida al sitio en los que los restos se delecionan, insertan y/o sustituyen (véase, por ejemplo, Publicación Europea Nº 146.354 mencionada anteriormente). Se sabe que IFN-\gamma tiene un intervalo de hospedador estrecho, por lo tanto, debe usarse un homólogo de IFN-\gamma para el animal a tratar. En terapia humana, la variante desCysTyrCys de la secuencia mostrada en la Patente de Estados Unidos Nº 4.717.138 y su homólogo, documento EP 77.670, se emplea preferiblemente, y opcionalmente la variante C-terminal en la que los últimos cuatro restos de aminoácidos se delecionan en el procesamiento post-traduccional. Para su uso terapéutico en seres humanos, el IFN-\gamma de la presente invención es preferiblemente IFN-\gamma humano recombinante (rhIFN-\gamma), con o sin los aminoácidos CysTyrCys en el extremo N-terminal. Más preferiblemente, IFN-\gamma es una especie de IFN-\gamma humano recombinante (interferón gamma humano recombinante-1b, rhIFN-\gamma-1b, que contiene 140 aminoácidos), que es el ingrediente activo de la formulación comercial, Actimmune® (Genentech, Inc., South San Francisco, California). Como se sabe que IFN-\gamma es altamente específico de la especie, en experimentos animales, o para uso veterinario, se emplea preferiblemente IFN-\gamma de la especie animal a tratar. Por tanto, en los experimentos in vivo que usan un modelo animal de rata, se ha empleado IFN-\gamma recombinante murino (de ratón) (Genentech, Inc.). Las ratas y los ratones están suficientemente bien relacionados para permitir el uso de IFN-\gamma de ratón en un modelo
de rata.

En un sentido farmacológico, en el contexto de la presente invención, una "cantidad terapéuticamente eficaz" de IFN-\gamma se refiere a una cantidad eficaz en el tratamiento de hipertrofia, especialmente hipertrofia cardiaca.

"Hipertrofia", como se usa en este documento, se define como un aumento en la masa de un órgano o estructura independiente del crecimiento natural que no implica formación de tumores. La hipertrofia de un órgano o tejido se debe a un aumento en la masa de las células individuales (hipertrofia verdadera), o a un aumento en la cantidad de células que componen el tejido (hiperplasia), o ambas. Ciertos órganos, tales como el corazón, pierden la capacidad de dividirse poco antes del nacimiento. Por consiguiente, "hipertrofia cardiaca" se define como un aumento en la masa del corazón que, en adultos, se caracteriza por un aumento del tamaño de las células miocitos y el contenido de proteínas contráctiles sin división celular con concomitante. El carácter del estrés responsable de incitar la hipertrofia (por ejemplo, precarga aumentada, poscarga aumentada, pérdida de miocitos, como en el infarto de miocardio, o depresión primaria de la contractilidad), parece jugar un papel crítico en la determinación de la naturaleza de la respuesta. La fase temprana de la hipertrofia cardiaca está habitualmente caracterizada morfológicamente por aumentos en el tamaño de las microfibrillas y mitocondrias, así como un agrandamiento de las mitocondrias y núcleos. En esta fase, aunque las células musculares son más grandes que las normales, la organización celular está ampliamente conservada. En una fase más avanzada de la hipertrofia cardiaca, hay aumentos preferentes en el tamaño o cantidad de organelas específicas, tales como mitocondrias, y se añaden nuevos elementos contráctiles en áreas localizadas de las células, de un modo irregular. Las células sometidas a hipertrofia de larga duración muestran alteraciones más obvias en la organización celular, incluyendo núcleos marcadamente agrandados con membranas altamente lobuladas, que se desplazan adyacentes a las miofibrillas y causan la ruptura del registro de banda Z normal. La expresión "hipertrofia cardiaca" se usa para incluir todas las fases de la progresión de esta afección, caracterizada por diversos grados de daño estructural del músculo cardiaco, independientemente del trastorno cardiaco subyacente.

"Fallo cardiaco" se refiere a una anormalidad de la función cardiaca en la que el corazón no bombea sangre al ritmo necesario para los requisitos de los tejidos metabolizantes. El fallo cardiaco puede estar causado por varios factores, incluyendo formas isquémicas, congénitas, reumáticas, o idiopáticas.

"Fallo cardiaco congestivo" es una patología progresiva en la que el corazón cada vez es más incapaz de administrar el rendimiento cardiaco adecuado (el volumen de sangre bombeado por el corazón en el tiempo) para suministrar la sangre oxigenada a los tejidos periféricos. Según progresa el fallo cardiaco, suceden daños estructurales y hemodinámicos. Aunque estos daños tienen una diversidad de manifestaciones, un síntoma característico es la hipertrofia ventricular. El fallo cardiaco congestivo es un resultado final habitual de varios trastornos cardiacos.

El "infarto de miocardio" generalmente está provocado por aterosclerosis de las arterias coronarias, a menudo con trombosis coronaria superimpuesta. Puede dividirse en dos tipos principales: infartos transmurales, en los que la necrosis miocárdica implica al grosor completo de la pared ventricular, e infartos subendocárdicos (no transmurales), en los que la necrosis implica al subendocardio, el miocardio intramural, o ambos, sin extenderse abriéndose paso a través de la pared ventricular del epicardio. Se sabe que el infarto de miocardio provoca tanto un cambio en los efectos hemodinámicos como una alteración en la estructura de las zonas dañadas y sanas del corazón. Por tanto, por ejemplo, el infarto de miocardio reduce el rendimiento cardiaco máximo y el volumen de impulso del corazón. También está asociada con el infarto de miocardio una estimulación de la síntesis de ADN que sucede en el intersticio así como un aumento en la formación de colágeno en las áreas del corazón no afectadas.

Como resultado del estrés o tensión aumentada en el corazón en hipertensión prolongada debida, por ejemplo, a la resistencia periférica total aumentada, la hipertrofia cardiaca se ha asociado durante mucho tiempo con "hipertensión". Una característica del ventrículo que llega a ser hipertrófico como resultado de sobrecarga de presión crónica es un rendimiento diastólico alterado. Fouad et al., J. Am. Coll. Cardiol. 4, 1500-6 (1984); Smith et al., J. Am. Cardiol. 5, 869-74 (1985). Se ha detectado una relajación del ventrículo izquierdo prolongada en hipertensión esencial temprana, a pesar de la función sistólica normal o supranormal. Hartford et al., Hypertension 6, 329-338 (1984). Sin embargo, no hay un paralelismo cercano entre los niveles de presión sanguínea y la hipertrofia cardiaca. Aunque se ha presentado una mejora en la función del ventrículo izquierdo en respuesta a terapia hipertensiva en seres humanos, los pacientes tratados de diversas maneras con un diurético (hidroclorotiazida), un \beta-bloqueante (propranolol), o un bloqueante de los canales de calcio (diltiazem), han mostrado una inversión de la masa del ventrículo izquierdo, sin mejora de la función diastólica. Inouye et al., Am. J. Cardiol. 53, 1583-7 (1984).

Otra enfermedad cardiaca compleja asociada con la hipertrofia cardiaca es "cardiomiopatía hipertrófica". Esta afección está caracterizada por una gran diversidad de características morfológicas, funcionales, y clínicas (Maron et al., N. Engl. J. Med. 316, 780-9 [1987]; Spirito et al., N. Engl. J. Med. 320, 749-55 [1989]; Louie y Edwards, Prog. Cardiovasc. Dis. 36, 275-308 [1994]; Wigle et al., Circulation 92, 1680-92 [1995]), cuya heterogenicidad está acentuada por el hecho de que afecta a pacientes de todas las edades (Spirito et al., N. Engl. J. Med. 336, 775-785 [1997]). Los factores causantes de la cardiomiopatía hipertrófica también son diversos y poco entendidos. Los datos recientes sugieren que las mutaciones en la cadena pesada de \beta-miosina pueden representar aproximadamente del 30 al 40 por ciento de los casos de cardiomiopatía hipertrófica familiar (Watkins et al., N. Engl. J. Med. 326, 1108-14 [1992] Schwartz et al, Circulation 91, 532-40 [1995]; Marian y Roberts, Circulation 92, 1336-47 [1995]; Thierfelder et al., Cell 77, 701-12 [1994]; Watkins et al., Nat. Gen. 11, 434-7 [1995]).

La "estenosis aórtica" supravalvular es un trastorno valvular heredado, que se caracteriza por el estrechamiento de la aorta ascendente, pero otras arterias, incluyendo las arterias pulmonares, también pueden estar afectadas. La estenosis aórtica sin tratar puede conducir a presión intracardiaca aumentada que produce hipertrofia miocárdica y finalmente fallo cardiaco y muerte. La patogénesis de este trastorno no se entiende completamente, pero la hipertrofia y posiblemente la hiperplasia del músculo liso medial son características prominentes de este trastorno. Se ha informado de que las variantes moleculares del gen de la elastina están implicadas en la patogénesis de desarrollo de estenosis aórtica. (Patente de Estado Unidos Nº 5.650.282 presentada el 22 de julio de 1997).

La "regurgitación valvular" sucede como resultado de enfermedades cardiacas que producen trastornos de las válvulas cardiacas. Diversas enfermedades, como fiebre reumática, pueden causar el encogimiento o extracción del orificio de la válvula, mientras que otras enfermedades pueden provocar endocarditis, una inflamación del endocardio o membrana de revestimiento de los orificios auriculoventriculares y funcionamiento del corazón. Defectos tales como el estrechamiento de la válvula, estenosis o el cierre deficiente de la válvula provocan una acumulación de sangre en la cavidad cardiaca o la regurgitación de sangre pasada la válvula. Si no se corrige, una estenosis o insuficiencia valvular prolongada puede producir hipertrofia cardiaca y daño asociado al músculo cardiaco, que finalmente puede necesitar un reemplazo de la válvula.

El tratamiento de todos estos, y otros trastornos cardiacos acompañados por hipertrofia cardiaca es el asunto de la presente invención.

"Tratamiento" se refiere tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, donde el objeto es prevenir o ralentizar (reducir) la hipertrofia. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen los que ya tienen un trastorno así como los propensos a tener el trastorno o aquéllos en los que se quiere prevenir el trastorno. La hipertrofia puede ser el resultado de cualquier causa, incluyendo causas idiopáticas, cardiotróficas, o miotróficas, o isquemia o fallos isquémicos, tales como, infarto de miocardio.

La administración "crónica" se refiere a la administración del agente o agentes de un modo continuo en oposición a un modo agudo, para mantener el efecto antihipertrófico inicial durante un periodo de tiempo prolongado.

"Mamífero" para propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo seres humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, deportivos o de compañía, tales como perros, gatos, vacas, caballos, ovejas, cerdos, etc. Preferiblemente, el mamífero es un ser humano.

La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.

B. Modos de realizar la invención 1. Ensayos de hipertrofia cardiaca Ensayos in vitro a. Inducción de propagación de miocitos cardiacos de rata adulta

En este ensayo, se aíslan miocitos ventriculares de una única rata (Sprague-Dawley macho), esencialmente siguiendo una modificación del procedimiento descrito con detalle por Piper et al., "Adult ventricular rat heart muscle cells". En: Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research, H.M. Piper, ed., Berlin: Spinger-Verlag, 1990. pág. 36-60. Este procedimiento permite el aislamiento de miocitos ventriculares adultos y el cultivo de larga duración de estas células en el fenotipo con forma de bastón. La fenilefrina y la prostaglandina F_{2}_{\alpha} (PGF_{2}_{\alpha}) han demostrado inducir una respuesta de propagación en estas células adultas. Piper et al., supra; Lai et al., Am. J. Physiol. 1996; 271 (Heart Circ. Physiol. 40): H2197-H2208. Después se ensaya la inhibición de la propagación de miocitos inducida por análogos PGF_{2}_{\alpha''} o PGF_{2}_{\alpha} (por ejemplo, fluprostenol) y fenilefrina por diversos inhibidores potenciales de la hipertrofia cardiaca. Se describe un protocolo detallado en los siguientes ejemplos.

Ensayos in vivo a. Inhibición de hipertrofia cardiaca inducida por fluprostenol in vivo

Este modelo farmacológico ensaya la capacidad de IFN-\gamma de inhibir la hipertrofia cardiaca inducida en ratas (por ejemplo, Wistar o Sprague-Dawley macho) por inyección subcutánea de fluprostenol (un análogo agonista de PGF_{2}_{\alpha}). Se sabe que las ratas con hipertrofia cardiaca patológica inducida por infarto de miocardio tienen niveles crónicamente elevados de PGF_{2}_{\alpha} extraíble en su miocardio. Lai et al., Am. J. Physiol. (Heart Circ. Physiol.) 271: H2197-H2208 (1996). Por consiguiente, los factores que pueden inhibir los efectos del fluprostenol en el crecimiento del miocardio in vivo son potencialmente útiles para tratar la hipertrofia cardiaca. Los efectos de IFN-\gamma sobre la hipertrofia cardiaca se determinan midiendo el peso del corazón, los ventrículos, y el ventrículo izquierdo (normalizado por el peso corporal) con relación a ratas tratadas con fluprostenol que no han recibido IFN-\gamma. Se proporciona una descripción detallada de este ensayo en los ejemplos.

b. Ensayo de hipertrofia cardiaca por sobrecarga de presión

Para el ensayo in vivo es habitual inducir hipertrofia cardiaca por sobrecarga de presión por constricción de la aorta abdominal de animales de ensayo. En un protocolo típico, se tratan ratas (por ejemplo Wistar o Sprague-Dawley macho) con anestesia, y la aorta abdominal de cada rata se estrecha justo por debajo del diafragma. Beznak M., Can. J. Biochem. Physiol. 33, 985-94 (1955). La aorta se expone a través de una incisión quirúrgica, y se coloca una aguja roma al lado del vaso. La aorta se constriñe con una ligadura de hilo de lana alrededor de la aguja que se retira inmediatamente y que reduce el lumen de la aorta al diámetro de la aguja. Este enfoque se describe, por ejemplo, en Rossi et al., Am. Heart J. 124, 700-709 (1992) y O'Rourke y Reibel, P.S.E.M.B. 200, 95-100 (1992). Se describe una descripción detallada del protocolo usado por la presente invención en los siguientes ejemplos.

c. Efecto sobre la hipertrofia cardiaca después de infarto de miocardio inducido experimentalmente (MI)

El MI agudo se induce en ratas por ligamiento de la arteria coronaria izquierda y se confirma por examen electrocardiográfico. También se prepara un grupo de animales con una operación simulada como animales de control. Los datos más tempranos han mostrado que la hipertrofia cardiaca está presente en el grupo de animales con MI, como es evidente por un aumento del 18% en la proporción de peso cardiaco a peso corporal. Lai et al., supra. El tratamiento de estos animales con bloqueantes candidatos de la hipertrofia cardiaca, por ejemplo, IFN-\gamma, proporciona una información valiosa acerca del potencial terapéutico de los candidatos ensayados.

2. Usos, composiciones terapéuticas y administración de IFN-\gamma

De acuerdo con la presente invención, puede usarse IFN-\gamma para el tratamiento de hipertrofia cardiaca, es decir, el agrandamiento del corazón, independientemente de la etiología y patogénesis. Cuando se impone una presión excesiva o carga de volumen al corazón (ventrículo), se desarrolla hipertrofia cardiaca (miocárdica), proporcionando un mecanismo compensatorio fundamental que permite que el ventrículo sostenga este volumen. Krayenbuehl et al., Eur. Heart J. 4 (Supl. A), 29 (1983). El carácter del estrés (precarga aumentada, poscarga aumentada, pérdida de miocitos, como en infarto de miocardio, o depresión primaria de la contractilidad) responsable del desarrollo de la hipertrofia juega un papel crítico en la determinación de la naturaleza de la respuesta hipertrófica. Scheuer y Buttrick, Circulation 75 (Supl. I), 63 (1987). La presente invención se refiere al tratamiento de hipertrofia cardiaca asociada con cualquier afección patológica subyacente incluyendo, sin limitación, después de infarto de miocardio, hipertensión, estenosis aórtica, cardiomiopatía, regurgitación valvular, derivación cardiaca, y fallo cardiaco congestivo. Las características principales de estas afecciones se han analizado anteriormente en este documento.

Es particularmente importante el uso de IFN-\gamma para la prevención del fallo cardiaco después de infarto de miocardio. Aproximadamente 750.000 paciente padecen infarto de miocardio agudo (AMI) anualmente, y aproximadamente una cuarta parte de todas las muertes en los Estados Unidos se debe a AMI. En los últimos años, los agentes trombolíticos, por ejemplo, estreptoquinasa, uroquinasa, y en particular el activador de plasminógeno tisular (t-PA) han aumentado significativamente la supervivencia de pacientes que padecían infarto de miocardio. Cuando se administra como una infusión intravenosa continua en 1,5 a 4 horas, t-PA produce permeabilidad coronaria a los 90 minutos en el 69% al 90% de los pacientes tratados. Topol et al., Am. J. Cardiol. 61, 723-8 (1988); Neuhaus et al., J. Am. Coll. Cardiol. 12, 581-7 (1988); Neuhaus et al., J. Am. Coll. Cardiol. 14, 1566-9 (1989). Los índices de permeabilidad más altos se han presentado con una dosis alta o regímenes de dosificación acelerada. Topol, J. Am. Coll. Cardiol. 15, 922-4 (1990). t-PA también puede administrarse como un único bolo, aunque debido a su vida media relativamente corta, es más adecuado para terapia de infusión. Tebbe et al., Am. J. Cardiol. 64, 448-53 (1989). Una variante de t-PA, específicamente diseñada para tener una vida media más larga y una especificidad por fibrina muy alta, TNK t-PA (una variante de t-PA T103N, N117Q, KHRR(296-299)AAAA, Keyt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3670-3674 (1994)) es particularmente adecuada para la administración en embolada. Sin embargo, a pesar de todos estos avances, el pronóstico a largo plazo de la supervivencia del paciente depende enormemente del control después del infarto y el tratamiento de los pacientes, que debe incluir el control y el tratamiento de la hipertrofia
cardiaca.

Otra indicación terapéutica importante es el tratamiento de hipertrofia cardiaca asociada con hipertensión. Como se ha indicado anteriormente, se sabe que la hipertensión sostenida produce hipertrofia cardiaca. Aunque ciertos agentes hipotensivos han demostrado reducir la masa del ventrículo izquierdo, el tratamiento no siempre produce la mejora en la función diastólica. Por consiguiente, puede administrarse IFN-\gamma en combinación con agentes bloqueantes del receptor \beta-adrenérgico, por ejemplo, propranolol, timolol, tertalolol, carteolol, nadolol, betaxolol, penbutolol, acetobutolol, atenolol, metoprolol, carvedilol; inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ACE), por ejemplo, quinapril, captopril, enalapril, ramipril, benazepril, fosinopril, lisinopril; diuréticos, por ejemplo, clorotiazida, hidroclorotiazida, hidroflumetazida, metilclorotiazida, benztiazida, diclorfenamida, acetazolamida, indapamida; y/o bloqueantes de los canales de calcio, por ejemplo, diltiazem, nifedipina, verapamil, nicardipina. Las composiciones farmacéuticas que comprenden los agentes terapéuticos identificados por sus nombres genéricos están disponibles en el mercado, y tienen que administrarse siguiendo las instrucciones del fabricante para la dosificación, administración, efectos adversos, contraindicaciones, etc. (Véase, por ejemplo, Physicians' Desk Reference, Medical Economics Data Production Co., Montvale, N. J., 51ª Edición, 1997.)

También puede administrarse IFN-\gamma de forma profiláctica a pacientes con hipertrofia cardiaca, para prevenir la progresión de la afección, y evitar la muerte repentina, incluyendo muerte de pacientes asintomáticos. Dicha terapia preventiva está particularmente justificada en el caso de pacientes diagnosticados con hipertrofia cardiaca masiva del ventrículo izquierdo (un grosor de pared máximo de 35 mm o más en adultos, o un valor comparable en niños), o en casos en los que la carga hemodinámica en el corazón es particularmente fuerte.

IFN-\gamma también puede ser útil en el tratamiento de fibrilación auricular, que se desarrolla en una parte sustancial de pacientes diagnosticados con cardiomiopatía hipertrófica.

Se administra IFN-\gamma en forma de una composición farmacéutica que comprende IFN-\gamma como ingrediente activo, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones terapéuticas de IFN-\gamma para tratar hipertrofia cardiaca se preparan para el almacenamiento mezclando IFN-\gamma que tiene el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes, o estabilizadores fisiológicamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra), en forma de torta liofilizada o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes, o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como Tween, Pluronics, o polietilenglicol (PEG).

El IFN-\gamma a usar para la administración in vivo puede estar estéril. Esto se consigue fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles, antes de o después de la liofilización y reconstitución. Habitualmente, el IFN-\gamma se almacenará en forma liofilizada o en solución.

Puede usarse IFN-\gamma en forma liofilizada, en combinación con otros ingredientes para la reconstitución con un diluyente apropiado en el momento del uso. Como se sabe que IFN-\gamma es inestable en ácido, tradicionalmente se ha manejado a pH neutro o ligeramente alcalino. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.499.014 que describe la reactivación de una solución ácida de IFN-\gamma liofilizada a un pH de 6 a 9. Las soluciones neutras o ligeramente alcalinas de concentraciones más altas de IFN-\gamma son generalmente no adecuadas como formulaciones inyectables a causa de la formación inmediata de un precipitado visible. Dicho precipitado puede causar trombosis en administración o potencia disminuida. La Publicación de Patente Europea Nº 0196.203 describe la reconstitución de IFN-\gamma liofilizado a un pH de 4 a 6,0.

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Las composiciones farmacéuticas líquidas estables que comprenden una cantidad eficaz de IFN-\gamma no liofilizado junto con un tampón capaz de mantener el pH a 4,0-6,0, un agente estabilizador, y un detergente no iónico se describen en la Patente de Estados Unidos Nº 5.151.265 presentada el 29 de septiembre de 1992. El agente estabilizador típicamente es un alcohol de azúcar polihídrico tal como manitol, y el detergente no iónico puede ser un tensioactivo, por ejemplo, polisorbato 80 o polisorbato 20. El detergente no iónico está preferiblemente presente en un intervalo de aproximadamente 0,07 a 0,2 mg/ml, y más preferiblemente en una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml. Los tampones adecuados son tampones convencionales de ácidos orgánicos y sales de los mismos, tal como tampones nitrato (por ejemplo, mezcla de citrato monosódico-citrato disódico, mezcla de ácido cítrico-citrato trisódico, mezcla de ácido cítrico-citrato monosódico, etc.), tampones succinato (por ejemplo, mezcla de ácido succínico-succinato monosódico, mezcla de ácido succínico-hidróxido sódico, mezcla de ácido succínico-succinato disódico, etc.), tampones tartrato (por ejemplo, mezcla de ácido tartárico-tartrato sódico, mezcla de ácido tartárico-tartrato potásico, mezcla de ácido tartárico-hidróxido sódico, etc.), tampones fumarato (por ejemplo, mezcla de ácido fumárico-fumarato monosódico, mezcla de ácido fumárico-fumarato disódico, mezcla de fumarato monosódico-fumarato disódico, etc.), tampones gluconato (por ejemplo, mezcla de ácido glucónico-gluconato sódico, mezcla de ácido glucónico-hidróxido sódico, mezcla de ácido glucónico-gluconato potásico, etc.), tampones oxalato (por ejemplo, mezcla de ácido oxálico-oxalato sódico, mezcla de ácido oxálico-hidróxido sódico, mezcla de ácido oxálico-oxalato potásico, etc.), tampones lactato (por ejemplo, mezcla de ácido láctico-lactato sódico, mezcla de ácido láctico-hidróxido sódico, mezcla de ácido láctico-lactato potásico, etc.), y tampones acetato (por ejemplo, mezcla de ácido acético-acetato sódico, mezcla de ácido acético-hidróxido sódico, etc.).

Una formulación líquida comercial conocida de IFN-\gamma (Actimmune® rhuIFN-\gamma, Genentech, Inc.) es una solución no conservada estéril, transparente, incolora cargada en un vial monodosis para inyección subcutánea. Cada vial de 0,5 ml de Actimmune contiene 100 \mug (3 millones U, actividad específica: 30 millones U/mg) de IFN-\gamma-1b formulado en 20 mg de manitol, 0,36 mg de succinato sódico, 0,05 mg de polisorbato 20 y agua estéril para inyección.

Las composiciones farmacéuticas conservadas a usar de acuerdo con la presente invención, que son adecuadas para el uso repetido, preferiblemente contienen:

a) IFN-\gamma no sometido a liofilización anterior;

b) un tampón acetato capaz de mantener el pH entre aproximadamente 4 y aproximadamente 6 (el intervalo de pH de estabilidad máxima de la proteína en solución);

c) un detergente no iónico principalmente para estabilizar la proteína contra la agregación inducida por agitación;

d) un agente de isotonicidad;

e) un conservante seleccionado entre el grupo de fenol, alcohol bencílico y un haluro de bencetonio, por ejemplo, cloruro; y

f) agua.

Los detergentes no iónicos (tensioactivos) pueden ser, por ejemplo, polisorbatos (por ejemplo, polisorbato [Tween] 20, 80, etc.) o poloxámeros (por ejemplo, poloxámero 188). El uso de tensioactivos no iónicos permite exponer la formulación a estrés superficial de cizalla sin causar la desnaturalización de la proteína. Además, dichas formulaciones que contienen tensioactivo pueden emplearse en dispositivos de aerosol tales como los usados en una dosificación pulmonar, y pistolas de inyección a chorro sin aguja (véase, por ejemplo, el documento EP 257.956).

El agente de isotonicidad está presente para asegurar la isotonicidad de las composiciones líquidas de la presente invención, e incluye alcoholes de azúcar polihídrico, preferiblemente alcoholes de azúcares trihídricos o superiores, tales como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol. Estos alcoholes de azúcar pueden usarse solos o en combinación. Como alternativa, puede usarse cloruro sódico u otras sales inorgánicas apropiadas para volver las soluciones isotónicas.

El tampón acetato puede, por ejemplo, ser una mezcla de ácido acético-acetato sódico, mezcla de ácido acético-hidróxido sódico, etc. El pH de la formulación líquida de esta invención se tampona en el intervalo de aproximadamente 4,0 a 6,0, preferiblemente de 4,5 a 5,5, y más preferiblemente a aproximadamente pH 5.

Los conservantes fenol, alcohol bencílico y haluros de bencetonio, por ejemplo, cloruro, son agentes antimicrobianos conocidos.

En una realización preferida, se administra IFN-\gamma en forma de una composición farmacéutica líquida que comprende los siguientes componentes:

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IFN-\gamma	0,1-2,0 mg/ml
acetato sódico (pH 5,0)	5-100 mM
Tween 20	0,1 a 0,01% en peso
fenol	0,05 a 0,4% en peso
manitol	5% en peso
agua para inyección, USP	hasta 100%

donde las cantidades en porcentaje se basan en el peso de la composición. Puede reemplazarse el fenol por alcohol bencílico del 0,5-1,0% en peso, y puede reemplazarse el manitol por cloruro sódico al 0,9% en peso.

Más preferiblemente, las composiciones comprenden

IFN-\gamma	0,1 a 1,0 mg/ml
acetato sódico (pH 5,0)	10 mM
Tween 20	0,01% en peso
fenol	0,2%
manitol	5%

Puede reemplazarse el fenol por alcohol bencílico al 0,75% en peso y el manitol por cloruro sódico al 0,9% en peso.

Las formulaciones líquidas conservadas contienen preferiblemente dosis múltiples de una cantidad terapéuticamente eficaz de IFN-\gamma. En vista del estrecho intervalo de hospedador de este polipéptido, para el tratamiento de pacientes humanos se prefieren formulaciones líquidas que comprenden IFN-\gamma humano, más preferiblemente IFN-\gamma humano de secuencia nativa. Como modificador de la respuesta biológica, IFN-\gamma ejerce una amplia diversidad de actividades sobre un amplio intervalo de tipos celulares, en una diversidad de especies de mamíferos humanos y no humanos. La dosis terapéuticamente eficaz variará, por supuesto, dependiendo de factores tales como la afección patológica a tratar (incluyendo prevención), la edad, peso, estado médico general, historia médica, etc. del paciente, y su determinación pertenece a la experiencia del médico. La dosis eficaz generalmente está en el intervalo de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 1,0 mg/kg, más preferiblemente de aproximadamente 0,01-1 mg/kg, más preferiblemente aproximadamente 0,01-0,1 mg/kg. En dichas formulaciones, huIFN-\gamma mostrará preferiblemente una actividad específica del orden de aproximadamente 2 x 10^{7} U/mg de proteína o superior cuando se ensaya sobre células A549 frente al virus de la encefalomiocarditis. Debe apreciarse que la contaminación con endotoxinas debe mantenerse al mínimo a un nivel seguro, por ejemplo, menos de 0,5 ng/mg de proteína. Además, para la administración a seres humanos, las formulaciones líquidas deben cumplir las normas de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general, y pureza requeridas por la FDA Office and Biologics.

La vía de administración de IFN-\gamma es de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo, inyección o infusión por vías intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial o intralesional, o por sistemas de liberación sostenida, como se indica a continuación. Las composiciones de IFN-\gamma terapéuticas generalmente se colocan en un recipiente que tiene una vía de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica. Las formulaciones se administran preferiblemente como inyecciones intravenosas (i.v.), subcutáneas (s.c.) o intramusculares (i.m.) repetidas, o como formulaciones en aerosol adecuadas para el suministro intranasal o intrapulmonar (para suministro intrapulmonar véase, por ejemplo, el documento EP 257.956).

Las composiciones acuosas estables de IFN-\gamma están preferiblemente contenidas en viales, que contienen hasta aproximadamente 30 dosis terapéuticamente eficaces de IFN-\gamma. La bioactividad de IFN-\gamma permanece preferiblemente en aproximadamente el 20% de la bioactividad mostrada en el momento de la primera administración durante al menos aproximadamente 14 días, más preferiblemente durante al menos aproximadamente 200 días después de la primera administración.

También puede administrarse IFN-\gamma en forma de preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen la proteína, estando dichas matrices en forma de artículos con forma, por ejemplo películas, o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) como se describe por Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 [1981] y Langer, Chem. Tech., 12, 98-105 [1982] o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (Patente de Estados Unidos Nº 3.773.919, documento EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556 [1983]), etilen-vinil acetato no degradable (Langer et al., supra), copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como Lupron Depot^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (documento EP 133.988).

Aunque los polímeros tales como etilen-vinil acetato y ácido láctico-ácido glicólico posibilitan la liberación de moléculas durante unos 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando las proteínas encapsuladas permanecen en el cuerpo durante un tiempo prolongado, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a humedad a 37ºC, produciendo la pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Pueden idearse estrategias racionales para la estabilización de proteínas dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través del intercambio de tio-disulfuro, la estabilización puede conseguirse modificando los restos sulfhidrilo, liofilizando soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados, y desarrollando composiciones de matriz polimérica específicas.

Las composiciones de IFN-\gamma de liberación sostenida también pueden incluir IFN-\gamma atrapado en liposomas. Los liposomas que contienen IFN-\gamma se preparan por métodos conocidos per se: documento DE 3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985); Hwagn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034 (1980); documento EP 52.322; documento EP 36.676; documento EP 88.046; documento EP 143.949; documento EP 142.641; solicitud de Patente japonesa 83-118008; Patentes de Estados Unidos Nº 4.485.045 y 4.544.545; y documento EP 102.324. Normalmente, los liposomas son de tipo unilamelar pequeños (aproximadamente 200-800 Angstrom) en los que el contenido de lípidos es superior a aproximadamente el 30% en moles de colesterol, estando la proporción seleccionada ajustada para la terapia óptima.

Una cantidad eficaz de IFN-\gamma a emplear terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la vía de administración, y el estado del paciente. Por consiguiente, será necesario para el terapeuta valorar la dosificación y modificar la vía de administración según sea necesario para obtener el efecto terapéutico óptimo. La dosificación recomendada para administración de IFN-\gamma (Actimmune®, Genentech, Inc.) para tratar pacientes con enfermedad granulomatosa crónica es 50 mcg/m^{2} (1,5 millones U/m^{2}) para pacientes cuya área superficial corporal es mayor a 0,5 m^{2}, y 1,5 mcg/kg/dosis para pacientes cuya área superficial corporal es igual a o menor de 0,5 m^{2}, administrado como inyección subcutánea, tres veces a la semana. Esto es una directriz valiosa para un médico para determinar la dosis eficaz óptima para el tratamiento de hipertrofia cardiaca. El médico administrará IFN-\gamma hasta que se alcance una dosis que consiga el efecto deseado para el tratamiento de la disfunción cardiaca. Por ejemplo, si el objetivo es el tratamiento de fallo cardiaco congestivo, la cantidad será una que inhiba la hipertrofia cardiaca progresiva asociada con esta afección. La progresión de esta terapia se controla fácilmente por ecocardiografía. De forma similar, en pacientes con cardiomiopatía hipertrófica, puede administrarse IFN-\gamma en una base empírica, dependiendo de la percepción subjetiva de beneficio del paciente.

Puede administrarse IFN-\gamma en combinación con otros agentes terapéuticos usados para el tratamiento (incluyendo prevención) de hipertrofia cardiaca. Por ejemplo, puede combinarse terapia con IFN-\gamma con la administración de inhibidores de factores de hipertrofia de miocitos cardiacos conocidos, por ejemplo, inhibidores de agonistas \alpha-adrenérgicos, por ejemplo, fenilefrina; endotelina-1; CT-1; LIF; enzima convertidora de angiotensina; y angiotensina II. Los inhibidores del factor de hipertrofia cardiaca (CHF, cardiotrofina o cardiotrofina-1, véase, por ejemplo, el documento US 5.679.545) son particularmente preferidos para la terapia de combinación.

Los candidatos preferidos para la terapia de combinación en el tratamiento de cardiomiopatía hipertrófica son fármacos bloqueantes \beta-adrenérgicos (por ejemplo, propanolol, timolol, tertalolol, carteolol, nadolol, betaxolol, penbutolol, acetobutolol, atenolol, metoprolol, carvedilol), verapamil, difedipina, diltiazem. El tratamiento de la hipertrofia asociada con presión sanguínea alta puede requerir el uso de terapia de fármacos antihipertensivos usando bloqueantes de los canales de calcio, por ejemplo, diltiazem, nifedipina, verapamil, nicardipina; agentes bloqueantes \beta-adrenérgicos; diuréticos, por ejemplo, clorotiazida, hidroclorotiazida, hidroflumetazida, metilclotiazida, benztiazida, ciclorfenamida, acetazolamida, indapamida; y/o inhibidores de ACE, por ejemplo, quinapril, captopril, enalapril, ramipril, benazepril, fosinopril, lisinopril.

La cantidad eficaz de los agentes terapéuticos administrados en combinación con IFN-\gamma será a juicio del médico o veterinario. La administración y el ajuste de la dosificación se hace para conseguir el tratamiento óptimo de las afecciones a tratar, e idealmente tiene en cuenta el uso diuréticos y digitalis, y afecciones tales como hiper o hipotensión, fallo renal, etc. La dosis dependerá adicionalmente de factores tales como el tipo de agente terapéutico a usar y el paciente específico que se está tratando. Típicamente, la cantidad empleada será la misma dosis que la usada si el agente terapéutico dado se administrara sin IFN-\gamma.

Ejemplos Ejemplo 1 Inhibición de la respuesta de propagación inducida por PGF_{2}_{\alpha} de miocitos adultos, por IFN-\gamma Materiales y Métodos

Cultivos de miocitos adultos El procedimiento usado para el aislamiento de miocitos ventriculares de ratas adultas fue una modificación de un procedimiento descrito por Piper et al., supra, y se detalla en Lai et al., supra. Para cada preparación de miocitos, se anestesió una rata Sprague-Dawley macho que pesaba aproximadamente 250 g con pentobarbital sódico, y se retiró el corazón. Se recortó del corazón el tejido extraño, y se montó sobre un sistema Langendorff que tenía la temperatura controlada a 37ºC. El corazón se perfundió con aproximadamente 40 ml de tampón de Krebs (NaCl 110 mM, KCl 2,6 mM, KH_{2}PO_{4} 1,2 mM, MgSO_{4} \cdot 7H_{2}O 1,2 mM, NaHCO_{3} 25 mM y glucosa 11 mM). Después se hizo recircular una solución que contenía 30 mg de colagenasa y 12,5 \mul de CaCl_{2} 100 mM y 50 ml de tampón de Krebs a través del corazón durante 30 minutos. Se retiró el corazón del aparato Langendorff, y se retiraron las aurículas y los tejidos conectivos. Los ventrículos se cortaron en cubos de 2 mm con tijeras de disección, y se digirieron adicionalmente en una solución de colagenasa reciente (30 mg de colagenasa y 400 mg de BSA disueltos en tampón de Krebs con 12,5 \mul de CaCl_{2} 100 mM) durante cinco minutos a 37ºC. Durante la digestión, la suspensión tisular se agitó a mano suavemente una vez por minuto. Después de la digestión, se retiró el sobrenadante y se guardó, y el tejido restante se digirió adicionalmente en solución de colagenasa reciente durante cinco minutos adicionales.

Se sembraron los miocitos de rata adulta aislados en placas recubiertas con laminina a una densidad de 3x10^{3} células/ml. Después de 72 horas de estimulación apropiada, las células se fijaron con glutaraldehído y se tiñeron con Eosina Y. Se capturaron imágenes de las células con forma de bastón con microscopía fluorescente y se determinó la amplitud máxima usando un software de formación de imágenes (Simple 32, Compix Imaging, Mars, PA).

Resultados IFN-\gamma inhibe la propagación de miocitos cardiacos adultos inducida por los factores de hipertrofia PGF_{2}_{\alpha} y fenilefrina

Se ha demostrado que PGF_{2}_{\alpha} y el agonista \alpha-adrenérgico fenilefrina inducen la hipertrofia de miocitos cardiacos de rata neonata cultivados (Adams et al., J. Biol. Chem. 271: 1179-1186 [1996]; Lai et al., Am. J. Physiol. (Heart Circ. Physiol.) 271: H2197-H2208 [1996]; Meidell et al., Am. J. Physiol. 251: H1076-H1084 [1986]; Simpson, J. Clin. Invest. 72: 732-738 [1983]; Simpson, Circ. Res. 56: 884-894 [1985]). Los miocitos ventriculares de rata adulta se propagaron cuando se expusieron a estos factores en cultivo (Lai et al., supra; Piper et al., "Adult ventricular rat heart muscle cells", en: Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research, H.M. Piper, Editor, 1990, Springer-Verlag: Berlin, pág. 36-60). Los miocitos adultos tienen una morfología de tipo bastón. Cuando estas células se exponen a PGF_{2}_{\alpha} 0,1 \muM, las células con forma de bastón se aplanan y propagan (Figura 1). La respuesta de propagación se cuantificó midiendo la amplitud máxima celular de al menos 200 células con forma de bastón y representando este valor frente al porcentaje de frecuencia de la amplitud celular en la población. PGF_{2}_{\alpha} indujo un cambio significativo en la amplitud máxima celular como fue evidente por un cambio en la distribución de la población para este parámetro en comparación con células de control (P<0,001). Tratando las células con IFN-\gamma se inhibió significativamente su respuesta a PGF_{2}_{\alpha} (P<0,001 PGF_{2}_{\alpha} + IFN-\gamma comparado con PGF_{2}_{\alpha}). El efecto inhibidor de IFN-\gamma sobre la propagación de miocitos inducida por PGF_{2}_{\alpha} fue dependiente de la dosis (Figura 2) sobre un intervalo de concentración que es coherente con la respuesta biológica a IFN-\gamma en miocitos cardiacos y otros sistemas celulares (Singh et al., J. Biol. Chem. 271: 1111-1117 [1996]; Pinsky et al., J. Clin. Invest. 95: 766-685 [1995]; Ungureanu-Longrois et al., Circ. Res. 77: 494-502 [1995]; Soderberg-Naucler et al., J. Clin. Invest. 100: 3154-3163 [1997]; Gou et al., J. Clin. Invest. 100: 829-838 [1997]; Marra et al., Can J. Cardiol. 12: 1259-1267 [1996]). La capacidad de inhibir la propagación de miocitos inducida por PGF_{2}_{\alpha} parece ser específica de IFN-\gamma ya que varias citoquitas diferentes incluyendo IL-1\alpha, IL-1\beta, IL-2, IL-6, TNF-\alpha, IFN-\alpha e IFN-\beta no pudieron inhibir la respuesta de propagación. El efecto inhibidor de IFN-\gamma no es específico para PGF_{2}_{\alpha}. IFN-\gamma también puede inhibir la propagación inducida por fenilefrina
(Figura 3).

Ejemplo 2 Inhibición de hipertrofia cardiaca in vivo Materiales y Métodos

Animales Todos los procedimientos experimentales se ajustaron a los principios de guía de la American Physiology Society, y se aprobaron por el Genentech's Institutional Animal Care and Use Commitee. Los animales usados en este estudio eran ratas Sprague/Dawley (SD) macho (de 8 semanas de edad, Charles River Breeding Laboratories, Inc.). Los animales se aclimataron a la instalación durante al menos una semana antes de los experimentos, se alimentaron con pienso de rata en gránulos y agua ad libitum, y se albergaron en una habitación con luz y temperatura controladas.

Administración de fluprostenol y/o IFN-\gamma Las ratas recibieron una inyección subcutánea de fluprostenol (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) a 0,15 mg/kg, IFN-\gamma de ratón recombinante (Genentech, Inc., South San Francisco, CA) a 0,08 mg/kg, combinación de fluprostenol e IFN-\gamma, o vehículo salino, dos veces al día durante 14 días. En los grupos de IFN-\gamma y fluprostenol+ IFN-\gamma, los animales se pretrataron con IFN-\gamma durante un día. Se midió el peso corporal antes y después del tratamiento. Un estudio previo ha demostrado que la dosis de fluprostenol usada en este documento es la dosis más baja que produce una hipertrofia cardiaca significativa en ratas. Lai et al., supra. Un estudio piloto demostró que IFN-\gamma a la dosis indicada anteriormente inhibía la hipertrofia cardiaca inducida por fluprostenol con pequeños efectos sobre el peso corporal en las ratas.

Evaluación hemodinámica Trece días después del tratamiento, se anestesió a las ratas con una inyección intraperitoneal de ketamina 80 mg/kg (Aveco Co., Inc., Fort Dodge, Iowa) y xilazina 10 mg/kg (Rugby Laboratories, Inc., Rockville Center, NY.). Se implantó un catéter (PE-10 fusionado con PE 50) cargado con heparina-solución salina (50 U/ml) en la aorta abdominal, mediante la arteria femoral derecha, para la medida de la presión arterial media (MAP) y el ritmo cardiaco (HR). El catéter se exteriorizó y se fijó a la parte posterior del cuello.

Un día después de la cateterización, se conectó el catéter arterial a un transductor de presión Modelo CP10 (Century Technology Company, Inglewood, CA, USA) que se acopló a un polígrafo Grass Modelo 7 (Grass Instruments, Quincy, MA, USA). Se midieron MAP y HR simultáneamente en ratas conscientes, no controladas.

Medida de los pesos de los órganos Con anestesia con ketamina/xilazina, se retiró el corazón, el riñón, y el bazo, se diseccionaron y se pesaron. El ventrículo izquierdo se almacenó a -80ºC para la evaluación de la expresión génica.

Modelo animal de sobrecarga de presión La inducción de la sobrecarga de presión por ligamiento parcial de la aorta abdominal en ratas fue como se ha descrito previamente. Kimura et al., Am. J. Physiol. 1989: 256 (Heart Circ. Physiol. 25):H1006-H1-11; Batra et al., J. Cardiovasc. Pharmacol. 17 (supl. 2), S151-S153 (1991). En resumen, las ratas se anestesiaron con ketamina/xilazina como se ha descrito anteriormente. Se hizo una incisión de línea media de 3 cm en la pared abdominal. La aorta abdominal entre el diafragma y la arteria renal se expuso y se hizo un bucle con una sutura de seda 5-0. La sutura se apretó alrededor de una aguja de calibre 23, y después se retiró la aguja. Los animales de simulación recibieron la cirugía sin que se apretara la sutura.

Protocolo experimental en ratas con sobrecarga de presión Las ratas con constricción aórtica recibieron aleatoriamente inyección subcutánea de IFN-\gamma a 0,08 mg/kg dos veces al día durante un día antes de la cirugía y durante 14 días después de la cirugía. Los animales de simulación no se trataron. Trece días después del tratamiento se implantó un catéter en la arteria carótida derecha con anestesia como se ha indicado anteriormente. Un día después del implante, se midió la presión arterial y HR en ratas conscientes. El corazón y otros órganos incluyendo el hígado, riñón, y bazo se retiraron, se pesaron, y se fijaron en formalina tamponada al 10% para estudios patológicos. El ventrículo izquierdo se diseccionó rápidamente y se congeló con nitrógeno líquido en algunos animales y se almacenó a -80ºC para la evaluación de la expresión génica.

Análisis estadístico Los resultados se expresan como media \pm SEM. Se realizó un análisis de la varianza de una vía (ANOVA) para evaluar las diferencias en los parámetros entre grupos. Después se sometieron las diferencias significativas a un análisis post hoc usando el método de Newman-Keuls; P<0,05 se consideró significativo.

Preparación del ARN Se aisló el ARN total usando columnas RNeasy Maxi (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

RT-PCR Se usó la tecnología de RT-PCR a tiempo real (TaqMan) para comparar la expresión génica entre los diversos grupos de tratamiento. Se diseñó una sonda oligonucleotídica que contenía un colorante informador fluorescente, 6-carboxitetrametil-rodamina (TAMRA), en el extremo 3' para hibridar con el amplicón definido por dos cebadores de PCR. El fosfato de bloqueo de 3' evita la extensión de la sonda. Se libera el colorante informador de la sonda por la actividad exonucleasa 5' de la Taq polimerasa durante la fase de extensión de la reacción de PCR. La fluorescencia resultante se controla en el tubo de reacción por el detector de secuencia y se cuantifica sin manipulación adicional, de ahí el término "tiempo real". El número de ciclos umbral (Ct), definido como el punto en el que la fluorescencia informadora alcanza un valor superior a 10 veces la desviación típica de la medida inicial, es proporcional a la cantidad de amplicón producido a partir de la muestra. Como la fluorescencia se detecta durante la fase exponencial de la amplificación, ninguno de los componentes de reacción es limitante. En cada experimento, se analiza un control que carece de molde de ARN para controlar la contaminación, y se incluye otro control en el que la etapa RT se omite para eliminar la amplificación de posibles ADN contaminantes como fuente de la señal. Las reacciones se optimizan para dar la señal de fluorescencia mayor y el menor Ct por valoración de las concentraciones de magnesio y de cebador, y el producto se procesa en un gel de agarosa para verificar la presencia de una única banda en el peso molecular previsto. Además, la secuencia del amplicón se explora frente a Genbank para eliminar la posibilidad de un solapamiento con genes muy relacionados.

Para cada muestra, se determina el ARNm de cada gen diana usando una curva patrón como se describe a continuación y después normalizándolo a la cantidad de gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH) en la muestra (véase a continuación para las detalles de este cálculo). La abundancia relativa de cada gen diana a GAPDH después puede compararse entre los grupos de tratamiento.

Se realizó RT-PCR sobre 1 ng de ARN total por reacción usando el Detector de Secuencia TaqMan Modelo 7700 (ABI-Perkin Elmer) (Gibson et al., Genome Res. 6, 995-1001 [1996]). Las condiciones de reacción de amplificación (para 50 \mul) fueron Tampón A TaqMan 1x, dATP, dCTP, dGTP 200 \muM, y dUTP 400 \muM, glicerol al 10%, MgCl_{2} 6,5 mM, transcriptasa inversa MuLV 50 U, inhibidor de ARNasa 20 U, AmpliTaq Gold 1,25 U, cebadores directo e inverso 100 nM, y sonda fluorogénica 100 nM. Se adquirieron los reactivos de RT-PCR y el glicerol de Perkin Elmer y Sigma, respectivamente. Las reacciones se realizaron en tubos y tapones MicoAmp Optical (ABI-Perkin Elmer). Los cebadores y sondas TaqMan se diseñaron de acuerdo con la directriz determinada por Perkin Elmer y se sintetizaron en Genentech, Inc., excepto para los de GAPDH de roedores que los aportaron generosamente Perkin Elmer. La transcripción inversa se realizó a 48ºC durante 30 minutos seguido por activación por calor de AmpliTaq Gold a 95ºC durante 10 minutos. El ciclado térmico fue a 95ºC durante 30 segundos y 60ºC durante 1,5 minutos durante 40 ciclos.

La cuantificación de los resultados TaqMan se realizó como se describe por Heid et al., Genome Res. 6:986-994 (1996), con modificaciones. En resumen, se procesaron por duplicado curvas patrón (dilución en serie 1:5) para cada gen diana de interés. El Ct se representó en el eje Y frente al log de la concentración de ARN total (eje X), y se determinó la ecuación que describe la línea. Se determinó el ARNm para cada gen diana a partir de la curva patrón apropiada introduciendo el Ct (valor Y) y resolviéndolo para la entrada de ARNm (X). Después se normalizó el valor para el gen diana a GAPDH resolviendo la siguiente ecuación: 10^{X1}/10^{X2}, en la que X1 es el gen diana y X2 es GAPDH.

Resultados IFN-\gamma inhibe la hipertrofia cardiaca in vivo

La administración crónica de fluprostenol, un análogo agonista de PGF_{2}_{\alpha}, ha demostrado inducir hipertrofia cardiaca in vivo, y las ratas con hipertrofia cardiaca patológica inducida por infarto de miocardio tienen niveles crónicamente elevados de PGF_{2}_{\alpha} en su miocardio (Lai et al., supra). Por tanto, los factores que pueden inhibir los efectos de PGF_{2}_{\alpha} sobre el crecimiento del miocardio in vivo pueden ser útiles para el tratamiento de la hipertrofia cardiaca. Se dosificó a las ratas con fluprostenol en presencia y ausencia de IFN-\gamma durante dos semanas, y se determinaron los efectos sobre la hipertrofia cardiaca. El peso absoluto del corazón, los ventrículos, y el ventrículo izquierdo tendieron a aumentar en las ratas tratadas con fluprostenol, en comparación con los controles con vehículo, y disminuyó significativamente en estos parámetros en ratas tratadas con fluprostenol + IFN-\gamma con relación a las ratas tratadas con fluprostenol (Tabla 1). El tratamiento con fluprostenol provocó un aumento significativo en la proporción de los pesos del corazón, de los ventrículos, y el ventrículo izquierdo al peso corporal (BW), indicando que el fluprostenol inducía hipertrofia cardiaca (Figura 4). IFN-\gamma inhibió la hipertrofia inducida por fluprostenol. Las ratas que recibieron + IFN-\gamma tuvieron un peso cardiaco, ventricular y del ventrículo izquierdo significativamente disminuido, normalizado por BW, en comparación con animales en los grupos de fluprostenol (Figura 4). La comparación entre los grupos tratados con IFN-\gamma y vehículo mostraron que la administración de IFN-\gamma solo no alteró significativamente los pesos absolutos o normalizados con BW del corazón, los ventrículos, o el ventrículo izquierdo (Tabla 1, Figura 4).

La administración crónica de fluprostenol se asoció a una disminución significativa en la presión arterial media (MAP) en comparación con los controles tratados con vehículo (Figura 5). IFN-\gamma no tuvo efecto sobre MAP comparado con el vehículo, y no afectó a la MAP de animales tratados con fluprostenol. Hubo una alteración significativa en el ritmo cardiaco en los cuatro grupos de tratamiento (Figura 5). Estos resultados indican que IFN-\gamma no inhibe la hipertrofia inducida por fluprostenol contrarrestando los efectos hemodinámicos del tratamiento.

IFN-\gamma no sólo inhibió el aumento de la masa cardiaca asociada con la administración de fluprostenol, sino también las alteraciones en la expresión de genes cardiacos asociada con hipertrofia inducida por fluprostenol (Figura 6). Hubo un aumento en la abundancia de ARNm para la \alpha-actina esquelética, colágeno 1, y el factor natriurético en los corazones de ratas tratadas con fluprostenol en comparación con el vehículo. El ARNm para la ATPasa cálcica de retículo sarcoplásmico se redujo significativamente en estas ratas. IFN-\gamma inhibió todas menos la respuesta del factor natriurético atrial.

IFN-\gamma también se ensayó en un modelo de roedor de hipertrofia cardiaca inducida por sobrecarga de presión generada por constricción aórtica abdominal. La constricción aórtica provocó una hipertrofia cardiaca como fue evidente por los aumentos sustanciales en los pesos absolutos del corazón, las aurículas, los ventrículos y el ventrículo izquierdo, y también las proporciones de estos pesos a BW. El tratamiento con IFN-\gamma atenuó significativamente la hipertrofia cardiaca en este modelo (Tabla 2 y Figura 7 y 8).

También se examinó el efecto de IFN-\gamma sobre otros órganos (Tabla 2). Ni la constricción aórtica ni el tratamiento con IFN-\gamma alteraron el peso del riñón y la proporción del peso del riñón a BW. En comparación con los animales con operación simulada, el peso del hígado y la proporción de BW tendieron a disminuir en las ratas con constricción aórtica tratadas con vehículo, pero no en los tratados con IFN-\gamma. La constricción aórtica causó una elevación significativa en el peso del bazo absoluto y normalizado con BW, que fue exagerado por el tratamiento con IFN-\gamma. Por tanto, los efectos de IFN-\gamma sobre la masa cardiaca no se debieron a un efecto generalizado sobre el peso de los órganos.

La presión arterial media, la presión sistólica, y la presión diastólica fueron marcadamente superiores en ratas con constricción aórtica en comparación con controles con una operación simulada, y el aumento gradual en la presión arterial no fue diferente entre las ratas con constricción tratadas con IFN-\gamma o vehículo (Figura 9). Este resultado indica que la atenuación de la hipertrofia cardiaca observada en ratas con constricción que recibieron IFN-\gamma no se relacionó con una alteración en la poscarga.

La constricción aórtica provocó varios cambios en la expresión de genes cardiacos. La abundancia relativa del ARNm para la cadena pesada de \beta-miosina, \alpha-actina de músculo liso y \alpha-actina de músculo esquelético, el factor natriurético atrial, colágeno I y III, y fibronectina aumentaron todas en ratas con constricción en comparación con controles con operación simulada. Los efectos en dos de estos genes; \alpha-actina de músculo liso y colágeno I se inhibieron por IFN-\gamma (Tabla 3).

Tomados en conjunto, los resultados de los Ejemplos 1 y 2 muestran que IFN-\gamma puede inhibir la hipertrofia cardiaca. Los efectos de IFN-\gamma no se limitan a la inhibición de un aumento en la masa cardiaca inducida por los estímulos hipertróficos, IFN-\gamma también puede inhibir ciertas alteraciones moleculares que suceden en el corazón hipertrófico al nivel de expresión génica. Es especialmente importante que IFN-\gamma inhibió la inducción del gen del colágeno I in vivo, tanto en respuesta a estimulación crónica con fluprostenol como en un modelo de hipertrofia inducida por sobrecarga de presión. El colágeno I representa aproximadamente el 75% del colágeno miocárdico (Ju et al., Can. J. Cardiol. 12: 1259-1267 [1996]). La deposición de matriz extracelular aumentada y la fibrosis intersticial que acompaña a la hipertrofia cardiaca pueden contribuir a la patofisiología del fallo cardiaco. Inhibiendo la producción de colágeno I, IFN-\gamma puede reducir la fibrosis intersticial en el tratamiento del fallo cardiaco.

TABLA 1 Peso Corporal y Peso de los Órganos en Ratas Tratada con Flup y/o IFN

	Vehículo	Flup	Flup + IFN	IFN
BWO (g)	292,4 \pm 1,7	292,3 \pm 2,2	292,2 \pm 2,1	292,5 \pm 3,2
BW (g)	391,6 \pm 6,3	381,1 \pm 4,4	377 \pm 4,5	380,8 \pm 6,1
\DeltaBW (g)	99,2 \pm 5,5	91,9 \pm 4,0	84,8 \pm 3,9	88,3 \pm 5,0
HW (g)	0,988 \pm 0,022	1,000 \pm 0,018	0,9279 \pm 0,16#	0,956 \pm 0,029
VW (g)	0,922 \pm 0,022	0,957 \pm 0,017	0,0889 \pm 0,15#	0,914 \pm0,029
LVW (g)	0,706 \pm 0,018	0,740 \pm 0,013	0,678 \pm 0,011\alm{2}	0,696 \pm 0,023
KW (g)	1,440 \pm 0,035	1,397 \pm 0,038	1,377 \pm 0,031	1,327 \pm 0,035#
KW/BW (g/kg)	3,678 \pm 0,075	3,632 \pm 0,076	3,649 \pm 0,070	3,483 \pm 0,069
SW (g)	0,799 \pm 0,50	0,880 \pm 0,048	1,009 \pm 0,042*	0,924 \pm 0,068
SW/BW (g/kg)	2,065 \pm 0,149	2,309 \pm 0,130	2,676 \pm 0,082**	2,415 \pm 0,149

Datos expresados como media \pm SEM, y los números de animales son 14, 14, 14 y 9 en el grupo de Vehículo, Flup, Flup + IFN, e IFN respectivamente. Vehículo, solución salina; Flup, fluprostenol; IFN, interferón \gamma, BWO, niveles basales de peso corporal; BW, peso corporal después del tratamiento; \DeltaBW, BW-BWO; HW, peso del corazón; VW, peso ventricular; LVW, peso del ventrículo izquierdo; KW, peso del riñón; SW, peso del bazo. *p<0,05, **P<0,01, en comparación con el grupo de Vehículo, #p<0,05, \alm{2}p<0,01, en comparación con el grupo Flup.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2 Peso Corporal, Peso de los Órganos, y HR en ratas con Sobrecarga de Presión

	Simulado	PO+vehículo	PO+IFN
BWO (g)	278,8 \pm 1,9	279,4 \pm 1,3	279,0 \pm 1,3
BW (g)	367,9 \pm 6,8	347,5 \pm 5,7*	355,5 \pm 5,2
\DeltaBW (g)	89,1 \pm 5,8	68,1 \pm 5,6*	76,5 \pm 4,7
AW (g)	0,038 \pm 0,002	0,056 \pm 0,002**	0,046 \pm 0,003*\alm{2}
AW/BW (g/kg)	0,104 \pm 0,004	0,162 \pm 0,006**	0,129 \pm 0,007*\alm{2}
KW (g)	1,438 \pm 0,051	1,334 \pm 0,033	1,349 \pm 0,071
KW/BW (g/kg)	3,894 \pm 0,078	3,841 \pm 0,070	3,776 \pm 0,071
LW (g)	13,84 \pm 0,55	12,53 \pm 0,36	13,96 \pm 0,47#
LW/BW (g/kg)	37,46 \pm 0,96	36,01 \pm 0,71	38,94 \pm 0,92#
SW (g)	0,724 \pm 0,030	0,839 \pm 0,026*	1,170 \pm 0,53**\alm{2}
SW/BW (g/kg)	1,959 \pm 0,051	2,418 \pm 0,069**	3,261 \pm 0,121**\alm{2}
HR (bpm)	371 \pm 12	415 \pm 12*	418 \pm 19*

Datos expresados como media \pm SEM. Los números de animales son 16, 22, y 21 en el grupo Simulado,
PO+vehículo, y PO+IFN, respectivamente, para todos los parámetros excepto HR para los que los números de animales son 7, 8, y 7, respectivamente. PO, sobrecarga de presión; IFN, interferón \gamma; BWO, niveles basales de peso corporal; BW, peso corporal después del tratamiento; \DeltaBW, BW-BWO; AW, peso de las aurículas; KW, peso del riñón; LW, peso del hígado; SW, peso del bazo; HR, ritmo cardiaco. *p<0,05, **P<0,01, en comparación con el grupo simulado. #p<0,05, \alm{2}p<0,01, en comparación con el grupo PO+vehículo.

TABLA 3 Efecto del IFN sobre la Expresión Génica

Tratamiento	Simulado+Vehículo	PO+Vehículo	PO+IFN
ANF	0,98 \pm 0,37	5,29 \pm 1,21\dagger	3,61 \pm 1,32
\betaMHC	0,89 \pm 0,24	1,91 \pm 0,15\dagger	1,71 \pm 0,14\dagger
SKA	0,95 \pm 0,13	3,35 \pm 0,46\dagger	2,47 \pm 0,51\dagger
SMA	0,71 \pm 0,06	0,89 \pm 0,04\dagger	0,77 \pm 0,06
COLI	0,55 \pm 0,05	0,91 \pm 0,09\dagger	0,77 \pm 0,10
COLIII	0,44 \pm 0,05	0,66 \pm 0,08\dagger	0,72 \pm 0,09\dagger
FIB	0,66 \pm 0,17	1,03 \pm 0,11\dagger	0,97 \pm 0,12

PO indica sobrecarga de presión; IFN, interferón gamma; ANF, factor natriurético atrial; \betaMHC, cadena pesada de la \beta-miosina; SKA, \alpha-actina de músculo esquelético; SMA, \alpha-actina de músculo liso; COLI, colágeno I; COLIII, colágeno III; FIB, fibronectina. Los niveles de expresión se calculan como proporciones con la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa. n=6 por grupo. Los valores son media \pm SEM. \dagger P<0,05 frente al grupo simulado+vehículo.

Claims

1. Uso de interferón gamma (IFN-\gamma) para la preparación de un medicamento para el tratamiento de hipertrofia cardiaca que comprende administrar a un paciente diagnosticado con hipertrofia cardiaca asociada con una afección seleccionada entre el grupo compuesto por hipertrofia después de infarto de miocardio, estenosis aórtica, regurgitación valvular, derivación cardiaca, y fallo cardiaco congestivo, una cantidad terapéuticamente eficaz de IFN-\gamma.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que dicho paciente es un ser humano.

3. El uso de la reivindicación 2, en el que dicho IFN-\gamma es IFN-\gamma humano recombinante (rh-IFN-\gamma)

4. El uso de la reivindicación 3, en el que dicho IFN-\gamma es rhIFN-\gamma-1b.

5. El uso de la reivindicación 3, en el que dicha hipertrofia cardiaca está caracterizada por la presencia de un nivel elevado de PGF_{2}_{\alpha}.

6. El uso de la reivindicación 2, en el que dicha hipertrofia cardiaca es hipertrofia después de infarto de miocardio.

7. El uso de la reivindicación 6, en el que dicha administración de IFN-\gamma se inicia en 48 horas después del infarto de miocardio.

8. El uso de la reivindicación 7, en el que dicha administración de IFN-\gamma se inicia en 24 horas después del infarto de miocardio.

9. El uso de la reivindicación 2, en el que en el que dicho IFN-\gamma se administra en combinación con al menos un agente terapéutico adicional usado para el tratamiento de hipertrofia cardiaca o una enfermedad cardiaca que produce hipertrofia cardiaca.

10. El uso de la reivindicación 9, en el que dicho agente terapéutico adicional se selecciona entre el grupo compuesto por agentes bloqueantes \beta-adrenérgicos, verapamil, difedipina, y diltiazem.

11. El uso de la reivindicación 10, en el que dicho agente bloqueante \beta-adrenérgico es carvedilol, propranolol, metoprolol, timolol, oxprenolol o tertatolol.

12. El uso de la reivindicación 9, en el que dicho IFN-\gamma se administra en combinación con un fármaco antihipertensivo.

13. El uso de la reivindicación 9, en el que dicho IFN-\gamma se administra con un inhibidor de ACE.

14. El uso de la reivindicación 9, en el que dicho IFN-\gamma se administra con un antagonista del receptor de endotelina.

15. El uso de la reivindicación 9, en el que dicho IFN-\gamma se administra después de la administración de un agente trombolítico.

16. El uso de la reivindicación 15, en el que dicho agente trombolítico es el activador de plasminógeno tisular humano recombinante (rht-PA).

17. El uso de la reivindicación 9, en el que dicho IFN-\gamma se administra después de angioplastia primaria para el tratamiento de infarto de miocardio agudo.

18. Uso de IFN-\gamma en la preparación de un producto farmacéutico que comprende:

(b) un recipiente que contiene dicha composición farmacéutica; y

(c) una etiqueta fijada a dicho recipiente, o un prospecto incluido en dicho producto farmacéutico que hace referencia la uso de dicho IFN-\gamma en el tratamiento de hipertrofia cardiaca;

en el tratamiento de hipertrofia cardiaca asociada con una afección seleccionada entre el grupo compuesto por hipertrofia después de infarto de miocardio, estenosis aórtica, regurgitación valvular, derivación cardiaca y fallo cardiaco congestivo.

19. El uso de la reivindicación 18, en el que dicho recipiente tiene una vía de acceso estéril.

20. El uso de la reivindicación 18, en el que dicho recipiente es una bolsa o vial de solución intravenosa que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.