HU220969B1 - A C-MYC-re specifikus antiszensz oligonukleotid alkalmazása simaizomsejtek proliferációjának szabályozásában - Google Patents

Description

A találmány tárgya a simaizomsejtek szaporodásának befolyásolása a c-myc protoonkogén elleni antiszenszterápiával.

A koszorúér-angioplasztia a betegek több mint 90%-ában sikeres, sebészeti beavatkozás nélküli revaszkularizációt eredményez. 1990-ben több mint 300 000 koszorúér-angioplasztiát végeztek az Amerikai Egyesült Államokban. A koszorúér-angioplasztia legnagyobb korlátja a 30-40%-os resztenózisarány, ami a beavatkozás elvégzése utáni első hat hónapban fordul elő.

Megállapították, hogy a véredény-simaizomsejtek (SMC) fontos szerepet játszanak a koszorúér-angioplasztia utáni ateroszklerózis és resztenózis kifejlődésében. Jelenlétüket megerősítették mindkét típusú lézióban, és ez elsősorban annak a következménye, hogy az SMC-k összehúzódó fenotípusúról szintetikus fenotípusra váltanak át. Ez a jelentős változás kapcsolatban áll az SMC szaporodásával, az érfal középső részéből a belső részébe való vándorlással, valamint az extracelluláris mátrix szintézisével, aminek mind neointimális képződés az eredménye (keskenyíti az artériát). Az ateroszklerózissal ellentétben, ahol ez a folyamat több évtizedre teqed ki, a vaszkuláris resztenózis egy akut választ jelent a ballon által okozott sérülésre, ami egy jelentős beszűkülésben nyilvánul meg, egy kezdetben nyílt érben néhány hónap alatt lejátszódó neointimális képződés révén. Tehát nyilvánvalóvá vált, hogy az SMC-növekedés gátlása szükséges a resztenózis folyamatának szabályozásában.

Az elmúlt évtizedben intenzív kísérleti és klinikai vizsgálatokat végeztek a resztenózis megelőzésére. Számos beavatkozásról, mint például az antivérlemezke, antikoagulációs, gyulladáscsökkentő és értágító terápiákról kimutatták, hogy előnyösen csökkentik a kísérleti ballonsérülést követő neointimális szaporodást [Powell és munkatársai: Science245, 186-188 (1989); Castellotés munkatársai: J. Cell. Physiol. 124, 21-38 (1985); Fox és munkatársai: Science 241, 453-456 (1988)].

Újabban megkísérelték, hogy új mechanikai eszközöket alkalmazzanak a resztenózis korlátozására (például stent, aterektómia, lézer, rotablator stb.). Az előzetes adatok azonban azt mutatják, hogy ezek a beavatkozások korlátozott szerepet játszanak, mivel míg a mechanikai beavatkozások javítják a koszorúér-angioplasztia elsődleges eredményeit, a mechanikai technikák hajlamosak növelni az eljárásból eredő érfalsérülést, és ennélfogva nem képesek csökkenteni az SMC szaporodását és a resztenózis arányát. Emellett a mechanikai beavatkozásokat a betegeknek csak kis csoportjára lehet alkalmazni, akik optimális koszorúér-anatómiával rendelkeznek.

A resztenózis megakadályozására az antimitogénterápiát is javasolták. Például a tömény heparint vizsgálták meg antiproliferatív ágensként, az angioplasztia utáni resztenózis problémáinak kézbentartására [Wolinsky és munkatársai: JACC 75(2), 475-481 (1990)]. A γinterferonról kiderítették, hogy lehet egy másik, a resztenózis kezelésében potenciálisan hasznos ágens (WO 90/03189,1990. április 5.). Azonban a szisztémás úton beadott szaporodásellenes ágensek dózisa valószínűleg nem elég nagy ahhoz, hogy a kívánt hatást elérjük. Ennélfogva az ez idáig vizsgált ágensek nem elég erőteljesek ahhoz, hogy jótékony hatást mutassanak egy bonyolultabb klinikai helyzetben.

A sejt- és molekuláris biológiában lezajlott fejlődés azonban lehetővé tette, hogy belelássunk az SMCszaporodás molekuláris mechanizmusába, ami az extracelluláris környezetből származó jeleknek (azaz például növekedési faktorok) a sejtmagba való transzdukciójának a következménye. Számos gén aktiválódik ideiglenesen az SMC-k fenotípusos modulációja során [Gabbiani és munkatársai: J. Clin. Invest. 73, 148-152 (1984); Walker és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 83, 7311-7315 (1986); Miano és munkatársai: Am. J. Pathol. 137, 761-765 (1990); Majesky és munkatársai: Circulation Research 71, 759-768 (1992)]. Ezek az eredmények irányították az érdeklődést arra, hogy meghatározzák az abnormális génexpresszió szerepét az SMC növekedésében, és potenciális terápiás célpontokat válasszanak ki a szerzett kardiovaszkuláris rendellenességek, mint például a vaszkuláris resztenózis molekuláris alapú megközelítéséhez. Újabban Speir és munkatársai mutatták ki, hogy a patkány-simaizomsejtek növekedése nagy koncentrációjú, a szaporodó sejtmag antigén mRNS-sel komplementer antiszensz oligonukleotiddal gátolható.

A sejtmag-protoonkogének erősen konzerválódott foszfofehérjék, amelyek erősen kötődnek a sejtszaporodáshoz. Kimutatták a mitogénserkentést követő sejtmag protoonkogén(ek) mRNS-ének ideiglenes növekedését, amint a sejt a G1 fázisba lép, és szükségesnek tűnik a Gl-Sl átmenethez. A tenyésztett SMC-kkel végzett vizsgálatokkal kimutatták, hogy a c-fos, c-myc és c-myb protoonkogének röviddel a különböző mitogén serkentés után aktiválódnak [Kindy és munkatársai: Journal of Biological Chemistry 261, 12 865-12 868 (1986); Brown és munkatársai: Journal of Biological Chemistry 267, 4625-4630 (1992)]. Ballonlecsupaszítás után a protoonkogén expresszióját is indukálták a véredény falában, az in vitro vizsgálatokhoz hasonló módon [Miano és munkatársai: Am. J. Pathol. 137, 761-765 (1990)]. A fenti megfigyelések és a szignál transzdukciós bioszintézis utak redundanciája felvetették a lehetőségét, hogy a sejtmag protoonkogén-aktiválás egy végső, közös bioszintézis út, amelyhez számos különböző mitogén szignál konvergál, és ezzel egy potenciális terápiás célponttá teszi. Collins és munkatársai felfedezték, hogy a c-myccel komplementer antiszensz oligonukleotidok gátolják a bélkarcinómasejtek telepképződését [Collins és munkatársai: J. Clin. Invest. 89, 1523-1527 (1992)]. Más csoportok a protoonkogénre, a c-myb-re koncentráltak, és kiderítették, hogy a c-myb-gátlása gátolja a simaizomsejtek szaporodását. Újabban Simon és Rosenberg kimutatták, hogy a c-myb antiszensz oligonukleotidoknak növekedésgátló hatása van a patkány-simaizomsejtekre [Rosenberg és munkatársai: Circulation Research 70, 835-843 (1992)].

Az antiszensztechnológia egyre inkább olyan hatékony eszközzé fejlődik, amellyel egy specifikus génter2

HU 220 969 Bl mék szintjét csökkenteni lehet. Ez azon a megfigyelésen alapul, hogy ezek az „antiszensz” szekvenciák egy génhez vagy kapcsolódó célpolinukleotidhoz hibridizálódnak, stabil duplex vagy triplex képződése közben, a Watson-Crick- vagy Hoogsteen-kötódés alapján. A specifikusan megkötött antiszensz vegyület azután vagy érzékenyebbé teszi az adott célmolekulákat az enzimatikus lebomlásra, blokkolja a transzlációt vagy a processzálást, vagy egyéb módon gátolja a célpolinukleotid működését. Ha a megcélzott polinukleotid RNS, akkor az antiszensz molekulák specifikus RNS-átiratokhoz hibridizálódnak, elrontják a normál RNS-processzálási folyamatot, stabilitást és transzlációt, ezáltal megakadályozzák a megcélzott gén expresszióját. Az antiszensz oligonukleotidok beadásáról, vagy a számunkra érdekes mRNS-sel komplementer intracelluláris antiszensz szekvenciákat előállítani képes expressziós konstrukciók bejuttatásáról kimutatták, hogy a specifikus géneknek mind in vivő, mind in vitro gátolja a transzlációját. Például Holt és munkatársai a c-myc-re fókuszálva a humán promielocitás leukémia HL-60 sejtekben a megcélzott mRNS-sel kialakított intracelluláris duplexek kialakulását, valamint a c-myc fehérje mennyiségének szelektív csökkenését figyelték meg [Holt és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 8, 963-973 (1988)].

Nagy szükség lenne olyan módszerekre, amelyekkel a resztenózishoz kapcsolódó simaizomsejtek szaporodását befolyásolni lehet. Az ilyen módszer olyan betegekre alkalmazható, akik széles körű érrendellenességben szenvednek, beleértve a koszorúér és perifériális sztenózisokat (azaz elzáródásokat). A módszernek emellett nagyon hatékonynak is kell lennie. A jelen találmány ilyen módszereket szolgáltat.

A jelen találmány szerint simaizomsejteket hozunk érintkezésbe egy c-myc-re specifikus antiszensz oligonukleotiddal, hogy befolyásoljuk ezeknek a sejteknek a szaporodását.

A jelen találmány szerinti egyik előnyös megvalósítási mód szerint eljárást adunk meg simaizomsejtek szaporodásának szabályozására, ami abban áll, hogy a simaizomsejteket érintkezésbe hozzuk a c-myc-et kódoló mRNS egy régiójával komplementer oligonukleotiddal.

A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint eljárást adunk meg resztenózisban szenvedő betegek kezelésére, ami abban áll, hogy az említett betegnek hatásos mennyiséget adunk be a c-myc-et kódoló mRNS egy régiójával komplementer oligonukleotidból.

A jelen találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint eljárást adunk meg vaszkuláris resztenózis megelőzésére olyan betegben, aki érzékeny a resztenózisra, ami abban áll, hogy az említett betegnek hatásos mennyiséget adunk be a c-myc-et kódoló mRNS egy régiójával komplementer oligonukleotidból.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékletben szereplő ábrákat.

Az 1. ábra a c-myc mRNS-nek egy autoradiogramja nyugodt és szaporodó humán SMC-kben, 6%-os denaturálógélben elektroforetizálva.

A 2. ábra az SMC-k növekedési görbéjének sematikus ábrázolása, amelyeket 10 pmol/l c-myc antiszensz oligonukleotidokkal (teli körök), szensz oligonukleotidokkal (teli háromszögek) és nem illeszkedő oligonukleotidokkal (üres körök) inkubáltunk.

A 3. ábra a humán SMC-k dózisfuggő növekedésgátlását mutatja, c-myc antiszensz oligonukleotidok hozzáadása után. Az eredményeket átlag ±SD formában fejezzük ki. A conc. jelentése koncentráció.

A 4. ábra a fölöslegben levő szensz oligonukleotidok hatását mutatja a c-myc antiszensz oligonukleotidok növekedésgátló hatására. Az 1. napi százalékos gátlást három párhuzamos mérésből számítjuk. Az adatokat átlag±SD formában fejezzük ki.

Az 5. ábra szensz vagy antiszensz oligonukleotiddal kezelt humán SMC-kből származó c-myc mRNS gél autoradiogramja. Az mRNS-t 6%-os denaturáló poliakrilamid gélben futtattuk. C: kontroll (nincs oligonukleotid), S: c-myc szensz oligonukleotidok (10 pmol/l), A: c-myc antiszensz oligonukleotid (10 pmol/l).

A 6. ábra az oligonukleotidok intracelluláris felhalmozódását mutatja be humán SMC-kben. Az oligonukleotidok intracelluláris mennyiségét a sejthez kapcsolódó radioaktivitás szcintillációs számlálóval való mérésével határozzuk meg.

A 7. ábra a ³⁵S-jelzett oligomer farmakokinetikáját mutatja sertések plazmájában, egy oligomemek a koszorúerekbe való fecskendezése után (1 mg/ér), porózus ballonkatéterrel, 4 atmoszféra nyomással. Az állatokat az oligonukleotid bejuttatása után 30 perccel, 1, 3 és 7 nappal levágjuk.

A 8. ábrán a ³⁵S-jelzett oligomer farmakokinetikája látható, ugyanazokban az állatokban, mint amelyek a 7. ábrán szerepelnek.

A 9A. és 9B. ábrák fényképek, amelyeken egy sertés koszorúerének keresztmetszete látható, egy hónappal az angioplasztia után. A c-myc szensz oligomert (SEQ ID NO. 2) intramurális injekcióval adjuk be (2 ml 4 atmoszféra nyomással 27 másodperc alatt), közvetlenül az angioplasztia után. Jelentős neointimális vastagodás figyelhető meg (nyilak).

A 10A. és 10B. ábrák fényképek, amelyek hasonlóak a 9A. és 9B. fényképekhez, azzal az eltéréssel, hogy az állat a szensz oligonukleotid helyett c-myc antiszensz oligonukleotidot kapott (SEQ ID NO. 1). A neointima jelentős csökkenése figyelhető meg.

All. ábra a neointima sematikus bemutatása, amit a szenszkezelt (üres körök) és antiszenszkezelt (teli körök) sertések koszorúér-sérülésének mértékében (sérülés mértéke) ábrázolunk. A regressziós vonalakat a neointima és a sérülés mértéke közötti kapcsolat bemutatására húztuk meg. A meredekség jelentős csökkenése a csökkent neointimális képződést mutatja az antiszenszkezelt állatokban.

A 12. ábrán a különböző, a humán SMC-kben levő c-myc RNS-t megcélzó antiszensz szekvenciák növekedésgátló hatásának sematikus ábrázolása látható. A 3. napon mérhető százalékos gátlást a SEQ ID NO. 1 és 6-12 antiszensz oligonukleotidokra mértük

HU 220 969 Bl meg, 8 és 16 pmol/l koncentrációban, valamint szensz, nem illeszkedő (mis) és összekevert (ser) oligonukleotidokra.

Az antiszensz oligonukleotidok nagyon ígéretes terápiás ágensek számos humán betegség kezelésében. Elméletileg sokkal könnyebb olyan vegyületeket tervezni, amelyek egy primer struktúrával, mint például egy RNS-molekulával lépnek kölcsönhatásba bázispárosodás révén, mint olyan molekulákat tervezni, amelyek egy enzim aktív helyével lépnek kapcsolatba. Az oligonukleotidok specifikusan kötődnek (hibridizálódnak) a DNS, pre-mRNS vagy érett mRNS komplementer szekvenciájához, a Watson-Crick- vagy Hoogsteen-féle bázispárosodás révén, és ezzel megzavarják a genetikai információ áramlását a DNS-től a fehéije felé. Az antiszensz oligonukleotidoknak azok a tulajdonságai, amelyek specifikussá teszik őket a célszekvenciájukra, ugyanakkor különösen verzatilissá is teszik őket. Mivel az antiszensz oligonukleotidok négy monomer egységből álló hosszú láncok, ezért könnyen megszintetizálhatók bármely célszekvenciára. Számos új vizsgálat igazolja az antiszensz oligonukleotidoknak mint célfehérjék vizsgálatára alkalmas biokémiai eszközöknek a használhatóságát [Rothenberg és munkatársai: J. Natl. Cancer Inst. 81, 1539-1544 (1988); Zon, G.: Pharmaceutical Rés. 5, 539-549 (1988)]. Az oligonukleotidkémiában és a nukleázrezisztens, fokozott stabilitást mutató oligonukleotidok szintézisében tapasztalt legújabb fejlődés miatt ma már lehetséges, hogy megfontoljuk az antiszensz oligonukleotidoknak a gyógyszerek új formájaként való alkalmazását.

A resztenózis újra előfordulásának kezelésére vagy megelőzésére szolgáló jelenlegi módszerek csak korlátozott hatékonyságot mutatnak a resztenózis kezelésében vagy megelőzésében. A jelen találmány, amely a simaizomsejtek szaporodásának befolyásolására irányul, kielégíti ezeket az igényeket.

Az „oligonukleotid” szakkifejezés a továbbiakban egymáshoz kapcsolódó nukleotidokból álló polinukleotidot jelent. Emellett az „oligonukleotid” szakkifejezés olyan, a természetben előforduló vagy szintetikus oligonukleotidokra is vonatkozik, amelyek a természetben előforduló alegységekből vagy analóg alegységekből képződnek, és amelyeket úgy terveztek meg, hogy speciális tulajdonságokat biztosítsanak az oligonukleotidnak, és ezzel stabilabbá tegyék őket a biológiai rendszerekben, vagy jobban kapcsolódjanak a célszekvenciákhoz. Idetartoznak az oligonukleotidok olyan módosításai is, mint például kémiai kötéssel egy másik vegyülethez való kötésük, ami fokozza a sejtekbe vagy a sejtmagba, vagy egyéb sejtszervbe való bejutásukat. Emellett a találmány szerinti oligonukleotidok tartalmazhatnak módosított intemukleotidkötéseket, hogy ezzel a nukleázokkal szemben stabilabbak legyenek. Például a találmány tartalmazhat foszforotioát oligonukleotidokat is. Tehát az „oligonukleotid” szakkifejezés vonatkozik módosítatlan ribonukleotid és/vagy dezoxiribonukleotid oligomerekre, valamint olyan oligomerekre, amelyekben egy vagy több pufin- vagy pirimidinegységet, cukoregységet vagy intemukleotidkötést kémiailag módosítottak.

Az előzőek általánosságának korlátozása nélkül az „oligonukleotid” szakkifejezés a továbbiakban természetes vagy módosított monomerek, vagy kötések lineáris oligomeqeire vonatkozik, beleértve a dezoxiribonukleozidokat, ribonukleozidokat, ezek α-anomer-formáit, a poliamid nukleinsavakat és hasonlókat, amelyek képesek specifikusan kötődni egy megcélzott polinukleotidhoz, a monomer-monomer kölcsönhatások ismert módján, azaz például a Watson-Crick-típusú bázispárosodással, a Hoogsteen- vagy fordított Hoogsteen-típusú bázispárosodással, vagy hasonlókkal. A monomereket általában foszfodiészter-kötések vagy azok analógjai kapcsolják össze, így jönnek létre oligonukleotidok, amelyeknek mérete néhány (3-4) monomeregységtől néhány száz monomeregységig terjed. A foszfodiészter-kötések analógjai közé tartoznak: a foszforotioát-, foszforoditioát-, foszforoszelenoát-, foszforodiszelenoát-, foszforoanilotioát-, foszforoanilidát-, foszforoamidit- és hasonló kötések, amint azt az alábbiakban részletesen ismertetjük. A továbbiakban a „nukleozid” szakkifejezés a természetes nukleozidokra vonatkozik, beleértve a 2’dezoxi- és 2’-hidroxil-formákat is, amint azt például Komberg és Baker leírja [Komberg és munkatársai: DNA Replication, 2. kiadás, Freeman, San Francisco (1992)]. Az „analóg” szakkifejezés a nukleozidokra vonatkoztatva kiterjed a szintetikus nukleozidokra, amelyek módosított bázisegységekkel és/vagy módosított cukoregységekkel rendelkeznek, amint azt például Scheit publikálta [Scheit: Nucleotide Analogs (John Wiley, New York) (1980)]. Ilyen analógok lehetnek a szintetikus nukleozidok, amelyeket úgy terveztek, hogy javítsák a kötődési tulajdonságokat, így például a duplex- vagy triplexstabilitást, -specifitást vagy a hasonlókat.

Egy „c-myc-re specifikus antiszensz oligonukleotid”, vagy „c-myc antiszensz oligonukleotid” egy olyan oligonukleotid, amelynek a szekvenciája (i) képes stabil triplexet képezni a c-myc protoonkogének egy részével, vagy (ii) képes stabil duplexet képezni a c-myc protoonkogén mRNS-átirata egy részével.

A „stabilitás” szakkifejezés a duplex- vagy triplexképzódés szempontjából durván azt jelenti, hogy egy antiszensz oligonukleotid milyen szorosan kötődik a megcélzott szekvenciához; pontosabban, a duplexvagy triplexképződés szabad energiáját jelenti fiziológiás körülmények között. A standard körülmények között (azaz amit az alábbiakban ismertetünk) mért olvadáspont kényelmes mértéke a duplex vagy triplex stabilitásának. A találmány szerinti antiszensz oligonukleotidokat előnyösen úgy választjuk meg, hogy olvadáspontjuk legalább 50 °C-kal az ismertetett standard körülmények alatt legyen; így fiziológiás körülmények között és az előnyös koncentrációk mellett a duplex- vagy triplexképződés lesz az előnyben részesített folyamat azzal az állapottal szemben, amelyben az antiszensz oligonukleotid és a célpontja disszociálva van. Az nyilvánvaló, hogy néhány megvalósítási mód esetében egy stabil duplex vagy triplex tartalmazhat illeszkedési hibákat a bázispárok között, és/vagy a triplexek esetében a bázistriplettek között. A találmány szerinti antiszensz oligonukleotidok előnyösen tökéletesen illeszkedő dup4

HU 220 969 Bl lexeket és/vagy triplexeket képeznek a megcélzott polinukleotidokkal.

Előnyös, ha a találmány szerinti oligonukleotidokat módosítjuk, hogy fokozzuk stabilitásukat és megelőzzük az intracelluláris és extracelluláris lebomlásukat. Az még előnyösebb, ha a találmány szerinti oligonukleotidokat úgy módosítjuk, hogy fokozzuk a célszekvenciához való affinitásukat, valamint fokozzuk a megfelelő sejtekbe és sejtszervekbe való transzportjukat, amikor egy emlősszervezetbe juttatjuk be őket egy gyógyászatilag elfogadható formában.

A célpolinukleotidok lehetnek egyszálú vagy kétszálú DNS- vagy RNS-molekulák; azonban az egyszálú DNS- vagy RNS-célpontok az előnyösek. Az nyilvánvaló, hogy a célpont, amelyre a találmány szerinti c-myc antiszensz oligonukleotidok irányulnak, tartalmazhatja a c-myc protoonkogén alléljeit. A szakirodalomban részletes információ található egy antiszensz oligonukleotid adott szekvenciájának a kiválasztásához, ha adott a célpolinukleotid szekvenciája [Peyman és munkatársai: Chemical Reviews 90, 543-584 (1990); Crooke: Ann. Rév. Pharmacol. Toxicol. 32, 329-376 (1992); Zamecnik és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 75, 280-284 (1974)]. A cmyc antiszensz vegyületek szekvenciáját úgy választjuk meg, hogy a G-C tartalmuk legalább 60%-os legyen. Az előnyös protoonkogén mRNS-célpontok közé tartozik az 5’ cap hely, a tRNS kötődési helye, az iniciációs kodon helye, az mRNS-donor illesztési helye és az mRNS-akceptor illesztési helye [Goodchild és munkatársai : 4,806,463 számú US szabadalmi leírás].

A találmány szerinti antiszensz oligonukleotidok tartalmazhatnak bármely olyan polimer vegyületet, amely képes specifikusan kötődni egy megcélzott polinukleotidhoz a monomer-nukleozid kölcsönhatás szokásos módján, azaz a Watson-Crick-típusú bázispárosodással, Hoogsteen- vagy fordított Hoogsteen-típusú bázispárosodással és hasonló módon. A találmány szerinti antiszensz vegyületek tartalmazhatnak függőcsoportokat vagy -egységeket, amelyek képezhetik a polimer alap ismétlődő egységeinek a részét, vagy lehetnek attól függetlenek, amivel fokozzák a specifitásukat, a nukleázrezisztenciájukat, a sejtekbe való bejutásuk mértékét, és más, a hatékonysághoz kötődő tulajdonságukat. Ilyenek lehetnek például a koleszterolegységek, a duplexinterkalátorok, azaz például az akridin, a poli-Llizin „end-capping” egy vagy több nukleázrezisztens kötőcsoporttal, azaz például foszforotioáttal és hasonlókkal.

Az például ismert, hogy a fokozott lipidoldékonyság és/vagy a nukleázemésztéssel szembeni rezisztencia származhat abból, ha a nukleotidok közötti foszfodiészter-kötésben levő foszfátcsoport egyik oxigénatomját egy alkilcsoportra vagy alkoxicsoportra cseréljük ki, és ezzel egy alkil-foszfonát oligonukleozidot vagy alkil-foszfotriészter oligonukleotidot hozunk létre. Ezeket a nemionos oligonukleotidokat például a nukleázhidrolízissel szembeni fokozott rezisztencia és/vagy a sejtbe való fokozott bejutás képessége jellemzi, míg megtartják azt a képességüket, hogy stabil komplexeket képezzenek a komplementer nukleinsavszekvenciákkal. Az alkil-foszfonátok különösen stabilak a nukleázhasítással szemben, és oldódnak lipidekben. Az alkil-foszfonátok készítését Tso és munkatársai írták le [4,469,863 számú USA szabadalmi leírás],

A nukleázrezisztenciát előnyösen úgy biztosítjuk a találmány szerinti antiszensz vegyületeken, hogy nukleázrezisztens intemukleotidkötéseket használunk. Számos ilyen kötés ismert a szakirodalomban. Ilyen például a foszforotioát [Zon és munkatársai: Anti-Cancer Drug Design 6, 539-568 (1991); Stec és munkatársai; 5,151,510 számú USA szabadalmi leírás; Hirschbein: 5,166,387 számú USA szabadalmi leírás; Bergot: 5,183,885 számú USA szabadalmi leírás; Marshall és munkatársai: Science 59, 1564-1570 (1993); Caruthers és munkatársai: PCT/US89/02293 Nemzetközi bejelentés], a foszfor-amiditek, azaz például az -OP(=O)(NR¹NR²)-O-, amelyben R¹ és R² jelentése hidrogénatom vagy 1-3 szénatomos alkilcsoport [Jager és munkatársai: Biochemistry 27, 7237-7246 (1988); Frohler és munkatársai: PCT/US90/03138 nemzetközi bejelentés], a peptid nukleinsavak [Nielsen és munkatársai: Anti-Cancer Drug Design 8, 53-63 (1993); PCT/EP92/01220 nemzetközi bejelentés], a metilfoszfonátok [Miller és munkatársai: 4,507,433 számú USA-bejelentés; Ts’o és munkatársai: 4,469,863 számú USA-bejelentés; Miller és munkatársai: 4,757,055 számú USA-bejelentés], és a különböző típusú P-királis kötések, főleg a foszforotioátok [Stec és munkatársai: 506,24 számú európai bejelentés (1992); Lesnikowski: Bioorganic Chemistry 21, 127-155 (1993)]. További nukleázkötés lehet a foszforoszelenoát, foszforodiszelenoát, foszforoanilotioát, foszforanilidát, alkil-foszfotriészter, karbonát, úgymint a karboxi-metil-észter, karbamát, morfolino-karbamát, 3’-tioformacetál, szilil, úgymint a dialkil(Cj-C₆)- vagy difenil-szilil, szulfamát-észter és hasonlók. Az ilyen kötéseket és a bevitelük módját számos publikációban ismertetik, általánosságban több közlemény összefoglalja [Peyman és munkatársai: Chemical Reviews 90, 543-584 (1990); Milligan és munkatársai: J. Med. Chem. 36, 1923-1937 (1993); Matteucci és munkatársai: PCT/US91/06855 számú nemzetközi bejelentés].

A nukleázemésztéssel szembeni rezisztenciát úgy is el lehet érni, hogy az intemukleotidkötéseket mind az 5’ mind a 3’ végeken foszfor-amiditekkel módosítjuk, Dagle és munkatársai eljárását használva [Nucleic Acids Research 18, 4751-4757 (1990)].

A találmány szerinti vegyületekben előnyösen a foszfodiészter-kötés foszforanalógjait használjuk, azaz például a foszforotioátot, a foszforoditioátot, foszforamidátot vagy metil-foszfonátot. Még előnyösebb, ha a foszforotioátot használjuk nukleázrezisztens kötésként.

A foszforotioát oligonukleotidok egy kén-oxigén helyettesítést tartalmaznak az intemukleotid foszfodiészter-kötésben. A foszforotioát oligonukleotidok kombinálják a duplexképződéshez szükséges hatékony hibridizáció tulajdonságát a jelentős nukleázrezisztenciával, míg megtartják a töltött foszfátanalógok vízoldhatóságát. Úgy gondolják, hogy a töltés jelenti a sejtbe való

HU 220 969 BI bejutás tulajdonságát egy receptoron keresztül [Loke és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 86, 3474-3478 (1989)].

Az nyilvánvaló, hogy az előnyös kapcsolócsoportok mellett a találmány szerinti vegyületek tartalmazhatnak további módosításokat is, azaz például boronátozott bázisokat [Spielvogel és munkatársai: 5,130,302], koleszterinegységeket [Shea és munkatársai: Nucleic Acids Research 18, 3777-3783 (1990); Letsinger és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 86, 6553-6556 (1989)], és a pirimidinek 5-propinil-módosítását [Froehler és munkatársai: Tetrahedron Lett. 33, 5307-5310 (1992)].

A találmány szerinti oligonukleotidokat a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló módszerekkel szintetizálhatjuk meg. A találmány szerinti eljárásban előnyös, ha az oligonukleotidokat szintetikus kémiai módszerekkel szintetizáljuk, azaz például foszforamiditkémiával, acetonitrilben tetraetiltiurámmal végzett szulfürizációval [Vu és munkatársai: Tetrahedron Lett. 32, 30 005-30 008 (1991)]. A találmány szerinti oligonukleotidokat megszintetizálhatjuk in vitro és in vivő transzkripciós módszerek alkalmazásával, azaz például T7 polimerázzal vagy expressziós vektorokkal végzett transzkripcióval. Az in vitro és in vivő transzkripciós rendszerek felhasználásával szintetizált oligonukleotidokat a szakterületen jártas szakember számára ismert kémiai módszerekkel módosíthatjuk. Ilyen módosítás lehet a liposzómákba való kapszulázás, vagy szteroidokhoz, ellenanyagokhoz és sejtreceptor-ligandumokhoz való kémiai kapcsolás.

Abban a megvalósítási módban, amelyben triplexképződésre van szükség, vannak megszorítások a célszekvencia kiválasztásában. A Hoogsteen-típusú kötés útján való harmadiklánc-asszociáció általában egy kétszálú célszekvencia homopurin-homopiridin része mentén a legstabilabb. A bázistriplettek általában T-A*T vagy C-G*C motívumok formájában jönnek létre (ahol „-” jelentése Watson-Crickbázispárosodás, a „*” jelentése Hoogsteen-típusú kötődés); azonban más motívumok is lehetségesek. Például a Hoogsteen-típusú bázispárosodás lehetővé tesz paralell és antiparalell orientációkat a harmadik lánc (a Hoogsteen-lánc) és a duplex purinban gazdag szála között, amelyhez a harmadik lánc hozzákötődik, a körülményektől és a szálak összetételétől függően. A megfelelő szekvenciák, orientáció, körülmények, nukleozidtípus (azaz hogy ribóz vagy dezoxiribóz nukleozidokat használunk), a bázismódosítás (azaz metilezett citozin és hasonlóak) kiválasztásához sok információt közölnek a szakirodalomban, hogy maximalizálni, vagy egyéb módon szabályozni lehessen a triplex stabilitását az egyes megvalósítási módokban szükséges módon [Roberts és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 88, 9397-9401 (1991); Roberts és munkatársai: Science 258, 1463-1464 (1992); Distefano és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 90, 1179-1183 (1993); Mergny és munkatársai: J. Am. Chem. Soc. 114, 4465-4474 (1992);

Beái és munkatársai: Nucleic Acids Research 20, 2773-2776 (1992); Beái és munkatársai: J. Am. Chem. Soc. 114, 4976-4982; Giovannangeli és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 89, 8631-8635 (1992); Moser és munkatársai: Science 238, 645-650 (1987); McShan és munkatársai: Journal of Biological Chemistry 267, 5712-5721 (1992); Yoon és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 89, 3840-3844 (1992); Blume és munkatársai: Nucleic Acids Research 20, 1777-1784(1992)].

Az oligonukleotidegységek hossza elegendő ahhoz, hogy biztosítsa, hogy a specifikus kötődés a polinukleotidnak csak a kiválasztott részén történjen meg, egyéb helyeken nem, amint azt számos publikációban kifejtik [Rosenberg és munkatársai: PCT/US92/05305; Szostak és munkatársai: Methods in Enzymology 68, 419-429 (1979)]. A hossz felső határát számos faktor határozza meg, beleértve a nagy oligomerek szintetizálásának és tisztításának kényelmetlenségét és költségét, a hosszabb oligonukleotidoknak azt a tulajdonságát, hogy jobban elviselik az egyes rossz illeszkedéseket, mint a rövid oligonukleotidok, vannak-e módosítások a kötődés vagy a specifitás fokozására, duplex- vagy triplexkötődést akarunk kialakítani, és hasonlók.

Az az előnyös, ha az oligonukleotid hossza 5 és 200 oligonukleotid között van. Még előnyösebb, ha az oligonukleotid mérete 10 és 50 oligonukleotid között van. A legelőnyösebb, ha az oligonukleotid hossza 15-25 nukleotid. Az előnyös megvalósítási módok szerint az oligonukleotid specifikusan hibridizálódik egy transzlációs iniciációs helyhez. A jelen találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint az oligonukleotid szekvenciája 5’ AACGTTGAGGGGCAT 3’ (SEQ ID NO. 1). Ez az oligonukleotid komplementer a c-myc mRNS egyik szegmentjével, amely egy transzlációs iniciációs kodonnal kezdődik és attól 3’ irányban folytatódik. A transzlációs iniciációs kodon a c-myc mRNS 559-562-es nukleotidjait tartalmazza. Az 559-562-es nukleotidokat tartalmazó kódolórégiót egy 5’ nemkódoló régió és egy 3’ nemkódoló régió határolja, amely a 2121-es nukleotidig teljed.

A jelen találmány gyakorlatában alkalmazott antiszensz oligonukleotidok általában olyan szekvenciával rendelkeznek, amelyek teljesen komplementerek a megcélzott polinukleotid kiválasztott részével. Az abszolút komplementaritásra nincs azonban szükség, különösen a nagyobb oligomereknél. Tehát a továbbiakban a „komplementer nukleotidszekvencia” kifejezésre való hivatkozás nem szükségszerűen jelenti azt, hogy egy szekvencia 100%-ban komplementer a megcélzott szekvenciával. Általában bármely nukleotid, amelynek a komplementaritása elegendő ahhoz, hogy stabil duplexet képezzen a megcélzott szekvenciával (azaz a c-myc mRNS-sel), azaz egy „hibridizálódó” oligonukleotid megfelelő. A stabil duplexképződés függ a szekvenciától és a hibridizálódó oligonukleotid hosszától, valamint a megcélzott oligonukleotiddal való komplementaritás mértékétől. Általában minél hosszabb a hibridizálódó oligomer, annál több hibás illeszkedést visel el.

HU 220 969 Bl

A szakterületen jártas szakember a keletkező duplex olvadáspontja, azaz a hőstabilitása alapján könnyen meg tudja határozni a hibás illeszkedésnek azt a mértékét, amely még elviselhető bármely adott antiszensz oligomer és a célszekvencia között.

A találmány szerinti antiszensz oligonukleotidok által képzett hibridek hőstabilitását előnyösen az olvadási, vagy száldisszociációs görbék alapján határozzuk meg. A száldisszociáció ötven százalékának hőmérsékletét vesszük az olvadási hőmérsékletnek (T_m), ami emellett a stabilitásnak is kényelmes mértéke. A T_m-méréseket általában sóoldatban végezzük semleges pH-η, a megcélzott és az antiszensz oligonukleotid koncentrációja pedig 1,0-2,0 pmol/l között változik. A tipikus körülmények az alábbiak: 150 mmol/1 NaCl és 10 mmol/1 MgCl₂ 10 mmol/1 koncentrációjú foszfátpufferben (pH=7,0), vagy 10 mmol/1 koncentrációjú TRIS-HCl-pufferben (pH=7,0). Az olvadáspontgörbékre vonatkozó adatokat úgy nyerjük, hogy az antiszensz oligonukleotid/célnukleotidkomplex egy mintáját szobahőmérsékletről körülbelül 85-90 °C-ra melegítjük. Ahogy a minta hőmérséklete nő, a 260 nm-es fény abszorbanciáját 1 °C-os intervallumokban megmérjük, például egy Cary (Ausztrália) model 1E vagy egy Hewlett-Packard (Palo Alto, CA) model HP 8459 UV/VIS spektrofotométer és egy HP 89100A hőmérséklet-szabályozó vagy hasonló berendezés alkalmazásával. Ezek a technikák kényelmes eszközt kínálnak a különböző hosszúságú és összetételű antiszensz oligonukleotidok kötési erősségének mérésére és összehasonlítására.

Az egyik megvalósítási mód szerint a jelen találmány szerinti oligonukleotidokat úgy tervezzük meg, hogy hibridizálódjanak a c-myc génből származó hírvivő RNS-sel. Az ilyen hibridizáció, ha lejátszódik, akkor zavarja a hírvivő RNS normális működését, és ezzel befolyásolja a sejtbeli funkcióját. A hírvivő RNS zavarandó funkciói közé tartozik az összes létfontosságú funkció, azaz például az RNS transzlokációja a fehérjetranszláció helyére, a fehéije transzlációja az RNS-ről, az RNS érése, egy vagy több mRNS-fajta képződése közben, és még az esetleges független katalitikus aktivitás is, amellyel az RNS rendelkezhet. Az RNSfunkció ilyen zavarásának összhatása az, hogy befolyásolja a c-myc gén expresszióját. A c-myc gén expressziójának befolyásolásával a simaizomsejtek szaporodását befolyásoljuk vagy gátoljuk.

A jelen találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a simaizomsejtek resztenózissal kapcsolatban álló szaporodása célozható meg. Tehát a simaizomsejtek előnyösen vaszkuláris simaizomsejtek, azaz az artériák, vénák és hajszálerek simaizomsejtjei.

A terápiás vagy megelőzési kezelésekhez az oligonukleotidokat a jelen találmány szerint adjuk be. Az oligonukleotidokat formulázhatjuk gyógyászati készítményekben, amelyek tartalmazhatnak hordozókat, sürítőket, hígítószereket, puffereket, konzerválószereket, felületaktív anyagokat és hasonlókat, az oligonukleotid mellett. A jelen találmány néhány megvalósítási módja szerint az oligonukleotidot más olyan gyógyászati hatóanyagokkal együtt is beadhatjuk, amelyeket hatásosnak találtak a resztenózis korlátozásában vagy eliminálásában, azaz például vérlemezke elleni, antikoagulációs, gyulladáscsökkentő és értágító gyógyszerekkel együtt. Az oldat tartalmazhat egy proteolitikus enzimet, azaz például disparse-t, tripszint, kollagenázt, papaint, pepszint vagy kimotripszint. A proteolitikus enzimek mellett lipázokat is használhatunk. Enyhe felületaktív anyagként az oldat tartalmazhat ΝΡ-40-et, Triton XlOO-at, dezoxikolátot, SDS-t és hasonlókat.

A találmány szerinti antiszensz vegyületek közé tartoznak a gyógyászatilag elfogadható sók, beleértve az alkáli- vagy alkálifoldfémsókat, azaz a nátrium- vagy magnéziumsókat, ammónium- vagy NX₄+-sókat, amelyekben X jelentése 1-4 szénatomos alkilcsoport. Más, gyógyászatilag elfogadható sók lehetnek a szerves karbonsavak, mint például az ecetsav, tejsav, borkősav, almasav, izetionsav, laktobionsav és borostyánkősav sói; elfogadható sók lehetnek a szerves szulfonsavak, mint például a metánszulfonsav, etánszulfonsav és benzolszulfonsav sói, valamint a szerves savak, azaz a sósav, kénsav, foszforsav és szulfámsav sói. Egy hidroxilcsoportot tartalmazó vegyület gyógyászatilag elfogadható sói közé tartozhat az ilyen vegyület anionjának egy megfelelő kationnal, azaz például nátrium- és ammóniumionnal és hasonlókkal képezett sója.

A gyógyászati készítményt számos különböző módon lehet beadni, függően attól, hogy lokális vagy szisztémás kezelésre van szükség, valamint attól, hogy hol kell alkalmazni. A beadást a szakterületen jártas szakember számára ismert módszerekkel végezhetjük, ilyen például az intravénás beadás vagy katéter alkalmazása az érintett terület közvetlen kezelésére. Az intravaszkuláris eszközök és alkalmazásuk a szakterületen jártas szakember számára jól ismertek.

A beadás egyik formája a megfelelő traumatizált érbe való juttatás katéter segítségével. A c-myc antiszensz oligonukleotidot a sérülés szomszédságába juttatjuk el egy, az érben vezetett katéter segítségével, azaz például egy porózus ballonnal [Wolinsky és munkatársai: JACC 15, 475-481 (1990)], vagy az érfal legkülső rétegén keresztül, olyan anyagokkal, amelyek elősegítik az antiszensz vegyület lassú felszabadulását, azaz például egy „pluronic” (több komponensű?) gélrendszerrel [Simons és munkatársai: Natúré 359, 67-70 (1992)]. A helyi kezelés egyéb, lassú kibocsátási technikái közé tartoznak az antiszensz vegyületekkel átitatott stentek, azaz például egy Wilensky és munkatársai által leírt kötőanyag vagy gél [Wilensky és munkatársai: Trends in Cardiovascular Med. 3, 163-170 (1993)]. A megcélzott területre eljuttatott dózis az 1 pg-100 pg tartományban van, előnyösebb, ha az 1 pg-5 pg tartományban van. A bejuttatás ideje előnyösen körülbelül 30 másodperc és 60 perc között változik, előnyösebb, ha 30 másodperc és

1-2 perc között van [Zaliewski és munkatársai: Coronary Angioplasty 79-87. old., szerk. Goldberg (Davis, Philadelphia, 1988)].

A szisztémás és intravénás bejuttatást is megfontoljuk. Anélkül, hogy bármilyen elmélethez kötődnénk, az a véleményünk, hogy a test bizonyos szervei alkalmasak arra, hogy az oligonukleotid ott lerakodjon, és így a

HU 220 969 BI korábban vártnál hosszabb idő alatt térjen vissza a keringésbe. Az a véleményünk, hogy az ilyen raktározószervek, főleg a vese és a máj, az oligonukleotidnak az érfalban való felhalmozódásához szolgálnak forrásként, a beadás után még 72 órával is.

A dózis nagysága és gyakorisága fiigg a kezelendő állapot súlyosságától és reagálásától, de normális körülmények között egy vagy két dózist alkalmazunk naponta, és a kezelés hossza néhány naptól több hónapig terjedhet, egészen addig, amíg a gyógyulást, vagy a kóros állapot mérséklődését el nem éljük. Az átlagos gyakorlattal rendelkező szakember könnyen meg tudja határozni az optimális dózist, a dozírozás módszerét és az ismétlődés sebességét.

Az alábbi példák csak illusztrálják a találmányt, de az oltalmi kört nem korlátozzák.

1. példa

Sejttenyésztés

A humán SMC-k rutin bypass-beavatkozáson átesett betegek rózsaeréből származnak. A sejteket explantációs módszerrel izoláljuk. Az explantumokat Dulbecco-féle módosított Eagle táptalajt (DMEM) tartalmazó szövettenyésztő csészékbe tesszük. A DMEM táptalajt 20% hővel inaktivált boíjúmagzatszérummal (FBS), 100 NE/ml penicillinnel, 100 pg/ml sztreptomicinnel, 2 mmol/1 glutaminnal egészítjük ki (20% FBS-DMEM). A tenyészeteket 37 °C-on tartjuk, nedvesített inkubátorban, amelynek levegőjét 5% CO₂-dal egészítjük ki. A sejtek a vaszkuláris SMC-k tipikus morfológiai jellemzőit mutatják, azaz orsóformát és hegy-völgy mintázatot. A vaszkuláris SMC-k azonosítását in situ simaizom alfaaktinfestéssel erősítettük meg.

2. példa

Az oligonukleotidok szintézise tagú antiszensz, szensz és helytelenül illeszkedő oligonukleotidokat szintetizálunk egy Applied Biosystems model 394 nagyteljesítményű DNSszintetizátorral (Applied Biosystems, Foster City, CA). Az in vivő vizsgálatokhoz nagyobb mennyiségeket szintetizálunk egy Applied Biosystems módosított 390Z, nagy DNS-mennyiségek szintetizálására képes berendezéssel. Az oligonukleotidokat liofilezzük, PBS-ben szuszpendáljuk, majd mennyiségüket spektrofotometriával határozzuk meg. A humán c-myc gén transzlációs iniciációs régiójából származó módosított (foszforotioát) oligonukleotidokat használjuk ezekben a vizsgálatokban. A szekvenciák az alábbiak: szensz oligonukleotid (5’ ATGCCCCTCAACGTT 3’; SEQ ID NO. 2), antiszensz oligonukleotid (5’ AACGTTGAGGGGCAT 3’; SEQ ID NO. 1), és rosszul illeszkedő oligonukleotid (5’ TACGGGGTTGAGCAA 3’; SEQ ID NO. 3).

3. példa

Növekedési vizsgálat

A humán SMC-k 20%-os FBS-DMEM-ben végzett korai (2 és 4) átoltását 24 lukas lemezen végezzük, 10 000 sejt per luk sűrűségben. Huszonnégy órával a szélesztés után az eredeti táptalajt növekedést leállító táptalajjal helyettesítjük (0,5% FBS-DMEM) a következő 48 órában. A sejtek növekedését azután 20% FBS DMEM hozzáadásával szinkronizáljuk. Az oligonukleotidokat a serkentés előtt 24 órával, a serkentés időpontjában és ezek után minden 48 órában adjuk a sejtekhez, hacsak a szövegben külön nem jelezzük az eltérést. A jelzett időpontokban az SMC-ket tripszinnel kezeljük, és egy Coulter-Counterben megszámláljuk. A gátlás százalékát az alábbiak szerint számítjuk ki:

% gátlás=1 - (az antiszensz oligonukleotiddal kezelt sejtek tiszta növekedése/a szensz oligonukleotiddal kezelt sejtek tiszta növekedése) χ 100

A humán SMC-k tiszta növekedését úgy kapjuk meg, hogy a kiindulási sejtszámot (abban az időpontban, amikor a sejtek kilépnek a G_o fázisból) kivonjuk a kísérlet jelzett időpontjaiban kapott sejtszámból. Mindegyik kísérletet három párhuzamosban hajtjuk végre. Az adatokat átlag±SD formában fejezzük ki.

4. példa

Az oligonukleotidok bejutása a sejtekbe

Az SMC-ket 20%-os FBS-DMEM-mel kiegészített 100 mm-es lemezeken növesztjük. Miután a növekedést 48 órára leállítottuk (0,5% FBS-DMEM), az SMC-ket 20%-os FBS-DMEM-mel szinkronizáljuk. Az oligonukleotidok sejtekbe való bejutásának meghatározásához az SMC-ket 2 pmol ³²P-vel végjelzett oligonukleotidokkal (5xl0⁶ cpm/pg) inkubáljuk 1, 3, 6, 16,24 és 36 óra hosszat. Az inkubálást követően a sejteket PBS-ben és 0,2 mol/1 glicinben (pH=2,8) mossuk, a membránhoz kötött oligonukleotidok eltávolításához. A megmaradt, sejthez asszociálódó radioaktivitást, amely az oligonukleotidok intracelluláris bejutását jellemzi, szcintillációs számlálóval határozzuk meg. A humán SMC-k oligonukleotidfelvételét pmol/10⁵ sejt formában fejezzük ki.

5. példa

Reverz transzkripció és polimeráz láncreakció (RT-PCR)

A c-myc mRNS szintek humán SMC-kben való meghatározásához egy módosított RT-PCR technikát használunk. Össz-RNS-t izolálunk egy egylépéses eljárásban, savas guanidium tiocianát-fenol/kloroform extrakciós módszert használva. Ahhoz, hogy meg tudjuk különböztetni a genomiális DNS és a cDNS amplifíkációját, a primerpárokat úgy tervezzük, hogy legalább egy intront tartalmazzanak a c-myc genomiális szekvenciájából. Az indítómolekulákat az előzőkben leírt módon szintetizáljuk, és szekvenciájuk az alábbi: A indítómolekula:

5’ TGGTGCTCCATGAGGAGACA 3’ (SEQ ID NO.

4) ; B indítómolekula:

5’ GTGTTTCAACTGTTCTCGTC 3’ (SEQ ID NO.

5) . Az indítómolekulákat az 5’ végükön jelezzük 50 pCi (y-³²P)-ATP-vel, az 5’ DNS-vég-jelzési protokoll szerint (GIBCO BRL Life Technologies, Inc. Gaithersburg, MD). Két pg össz-RNS-t reverz transzkripcióval cDNS-sé alakítjuk át 200 egység Superscript reverz transzkriptázzal. A cDNS PCR-amplifikálását

HU 220 969 Bl

GeneAmp RNS PCR-protokoll szerint hajtjuk végre (Perkin-Elmer Corp., Hayward, CA). Röviden, a cDNS alikquot részét egy olyan reakcióelegyhez adjuk, amely 20-20 pmol indítómolekulát és 5 egység Taq polimerázt tartalmaz. Az amplifikálást egy PCRberendezéssel hajtjuk végre (Perkin-Elmer Cetus), 30 ciklusban. Egy ciklus a következő lépésekből áll:

perc 94 °C-on a denaturáláshoz, 2 perc 60 °C-on az illeszkedéshez, és 2 perc 72 °C-on az indítómolekula meghosszabbításához. Az RT-PCR termékeket 6%-os poliakrilamid gélen elektroforetizáljuk, majd Kodak filmre exponáljuk.

6. példa

C-myc protoonkogének expressziója humán SMCkben

A c-myc protoonkogén expressziószintjének megbecsüléséhez humán SMC-kben, a c-myc mRNS mennyiségét nyugvó állapotban levő (48 órára leállított) és szaporodó (2, 4 és 24 órával a szérumserkentés után) sejtekben határozzuk meg. Az RT-PCR-t az 5. példában leírtak alapján hajtjuk végre, specifikus c-myc indítómolekulák alkalmazásával. Az 1. ábra egy autoradiogram a nyugvó és szaporodó sejtekből származó, amplifikált mRNS-ekről. Amint az az 1. ábráról látható, a nyugvó humán SMC-k alacsony szinten expresszálják a c-myc mRNS-t. Ezzel szemben a szaporodó SMC-kben a c-myc mRNS-szint a sejtnövekedés serkentése után 2 és 4 órával megnőtt. A c-myc mRNS szintje 24 órára lecsökkent, jóllehet a szintje magasabb maradt mint a nyugvó sejtekben.

7. példa

Az SMC-szaporodás gátlása

A humán SMC-ket c-myc antiszensz foszforotioát oligonukleotidokkal inkubáljuk, a 3. példában leírtak alapján. A kísérleteket három párhuzamosban hajtjuk végre, és különböző alkalmakkor háromszor megismételve hasonló eredményeket kapunk. Az eredményeket átlag+SD formában fejezzük ki. Amint a 2. ábráról látható, a humán SMC-k c-myc antiszensz foszforotioát oligonukleotidokkal való inkubálása jelentős növekedésgátló hatást eredményez, míg a szensz vagy rosszul illeszkedő oligonukleotidok nincsenek hatással a sejtnövekedésre. A jelentős gátlás legalább 4 napig megmarad, az oligonukleotidokkal való folyamatos expozícióval (p< 0,001). Szemben a foszforotioát oligonukleotidok növekedésgátló hatásával a nem módosított antiszensz oligonukleotidoknak nincs hatásuk az SMC növekedésére, egészen 40 pmol dózisig.

A 3. példa alapján végzett növekedési vizsgálatok is azt mutatták, ami várható volt, hogy a c-myc antiszensz foszforotioát oligonukleotidok szaporodásgátló hatása dózisfuggő az 1-10 pmol tartományban, amint az a

3. ábráról látható. Emellett, előkezelés nélkül, a humán SMC-k c-myc antiszensz oligonukleotidokkal (10 pmol) való inkubálása 8 és 24 óra hosszat összemérhető növekedésgátlást mutat (58+13% és 70+14%).

Hasonló vizsgálatokat végzünk a c-myc antiszensz oligonukleotidok növekedésgátló hatásának sertésSMC-kben való meghatározására. 90%-ot meghaladó növekedésgátlást figyelhetünk meg c-myc antiszenszkezelést követően (12 pmol), a kontrolihoz vagy a szensz oligonukleotiddal kezelt SMC-khez viszonyítva. A kezelt SMC-k normálmorfológiát mutatnak mindegyik növekedési kísérletben, és a vizsgált dózistartományban nem figyelhető meg sejtpusztulás.

A c-myc antiszenszkezelésnek a sejtnövekedésre gyakorolt potenciális hosszú távú hatásának felbecsülésére az oligonukleotidokat nyolcórás inkubálás után megvonjuk, és a humán SMC-ket 7 nappal később átoltjuk. A sejtszámokat 1, 2, 4 és 6 nappal később határozzuk meg. Az antiszensz oligonukleotidokkal kezelt és a kontroll-SMC-k növekedési sebessége azonos. Ez azt mutatja, hogy az SMC-k normális életképességgel rendelkeznek az antiszensz oligonukleotidkezelés után.

Azt vártuk, hogy a c-myc antiszensz oligonukleotidok szaporodásgátló hatását meg lehet szüntetni, ha szensz oligonukleotidokat fölöslegben hozzáadunk az SMC tenyészethez. Amint a 4. ábrán látható, ha növeljük a szensz oligonukleotid arányát az antiszensz oligonukleotidhoz képest, akkor ezzel teljesen meg lehet szüntetni a növekedésgátlást. Ez valószínűleg annak a következménye, hogy heteroduplexek képződnek a két oligonukleotid között, ami azt mutatja, hogy az antiszensz oligonukleotidok szekvenciaspecifikus növekedésgátlási hatással rendelkeznek.

8. példa

A c-myc-expresszió gátlása

Ahhoz, hogy meghatározzuk, hogy az antiszensz oligonukleotidok szaporodásellenes hatása a c-myc expresszió csökkenésének a következménye, meghatározzuk a c-myc mRNS-mennyiségét antiszensz és szensz oligonukleotidokkal kezelt sejtekben, az 5. példában leírtak alapján. Az 5. ábra azt mutatja, hogy a c-myc antiszensz foszforotioát oligonukleotidok (10 pmol) csökkentik a cél-mRNS mennyiségét a szaporodó humán SMC-kben, míg a szensz oligonukleotidokkal kezelt sejtekben a c-myc mRNS-szintje nem változik az oligonukleotiddal nem kezelt sejtekhez viszonyítva.

9. példa

Az oligonukleotidok sejtekbe való bejutása és intracelluláris kinetikája

Az oligonukleotidok sejtekbe való bejutásának kinetikáját a 6. ábrán mutatjuk be. A sejteket 2 pmol ³²P-vel végjelzett foszforotioát oligonukleotidokkal inkubáljuk, a sejtek serkentésének időpontjától. A jelzett időpontokban a sejteket PBS-sel és 0,2 mol/1 koncentrációjú glicinnel (pH=2,8) mossuk. Az SMChez kötődő radioaktivitás már egy órával az inkubálás megkezdése után kimutatható, és gyorsan fokozódik 16 óráig. Nincs különbség a ³²P-vel végjelzett oligonukleotidok felvételében a nyugvó és a szaporodó sejtek között. Hasonló eredmények kaphatók fluoreszcens aktiválású sejtszortírozóval, FITC-vel jelzett oligonukleotidokat használva.

Mivel a sejthez kötődő radioaktivitás nemcsak érintetlen oligonukleotidokból származhat, hanem ³²P9

HU 220 969 Bl jelzést tartalmazó lebomlott oligonukleotidokból, vagy a sejtek makromolekuláiba beépült ³²P-ból is, ezért az intakt oligonukleotidoknak a humán SMC-kben való felhalmozódását meghatározzuk. Az érintetlen oligonukleotidok intracelluláris koncentrációja 24 óra alatt nó, majd hasonló mennyiségű lebomlatlan oligonukleotid marad az SMC-kben legalább a következő 12 órában (azaz 36 órával az érintkezés után). Ennélfogva a rövid intracelluláris felezési idő ellenére a foszforotioát oligonukleotidok stabilitása a szérumban és a sejtbe való gyors bejutásuk lehetővé tette, hogy a humán SMC-ken belül megmaradjon a szintjük.

10. példa

Az oligomerek farmakokinetikája a koszorúerekben A falon belülre való juttatás hatékonyságának és az oligomerek in vivő farmakokinetikájának felbecsüléséhez a c-myc antiszensz oligonukleotidokat ³⁵S-sel jelezzük. Lokalizált ballonsérülést követően, amint azt a 11. példában ismertetjük, egyenlő mennyiségű jelzett oligonukleotidot injekciózunk sertéskoszorúerekbe (1 mg/ér) a sérülés helyén, egy porózus ballonkatéterrel, 4 atmoszféra nyomással. A bejuttatás ideje 26±4 másodperc. Az állatokat 30 perc, 1, 3 és 7 nappal az oligonukleotid bejuttatása után elpusztítjuk. A kezelt koszorúereket kivágjuk és homogenizáljuk (a súly 75-100 mg/ér). A minta radioaktivitását egy szcintillációs számlálóval határozzuk meg. Az oligonukleotidok mennyiségét ismert mennyiségű ³⁵S-jelzett oligonukleotiddal készült standarddal határozzuk meg. Az eredmények a 7. ábrán (plazmaoligomer) és a 8. ábrán (koszorúér-oligomer) láthatók. Az oligonukleotidoknak a szervekben való megoszlását a bejuttatás utáni idő függvényében az alábbi táblázatban mutatjuk be:

1. táblázat

Az oligonukleotid koncentrációja a szervekben (pg per gramm szövet)

Szerv	30 perc	1 nap	3 nap	7 nap
Csontvelő	0,37	0,38	0,46	0,45
Vékonybél	0,53	0,51	0,48	0,11
Szívizom	0,45	0,38	1,14	0,34
Vázizom	0,34	0,25	0,29	0,35
Tüdő	0,49	0,42	0,43	0,35
Máj	2,18	2,39	1,71	0,73
Vese	10,12	4,8	0,70	0,57
Távoli erek	0,0	0,0	0,0	0,0
(nem sérültek)

A 7. ábrán az oligonukleotidok plazmaszintjei láthatók. Az oligomerek gyorsan eltűnnek a plazmából, a felezési idő a plazmában körülbelül 20 perc. Jóllehet az oligonukleotidok koncentrációja a plazmában háttérszintre csökken 24 órával a helyi bejuttatás után, az oligonukleotidkoncentráció növekedése figyelhető meg 72 óra elteltével. A megnövekedett oligonukleotidszint további 96 óra hosszat megmarad. Azt állítjuk, hogy az oligonukleotidok gyorsan kiürülnek a plazmából és felhalmozódnak a májban, a vesében és a szívizomban.

Ezek a szervek a keringésbe hosszabb idő múlva visszatérő oligonukleotidok raktáraiként működnek.

A 8. ábra a lokalizált ballonsérülés koszorúérpontjain levő oligonukleotidok farmakokinetikájának sematikus ábrázolása látható. A kontrolierek (nincs oligomer) egyetlen időpontban sem mutattak radioaktivitást, amint az 1. táblázatban láthatjuk. Körülbelül 0,2% oligomer rakódik le a lokalizált ballonsérülés koszorúérpontjaiban. Meg kell jegyeznünk, hogy az oligomerek transzkatéteres bejuttatása az oligonukleotidok nagyobb koncentrációját teszi lehetővé a bejuttatás helyén (2-64-szeres növekedés), a különböző szervekkel és távoli erekkel összehasonlítva 30 perccel az injekció után. Az oligonukleotidok koncentrációja nő az érfalban az injekciózás után 72 órával. Meg kell jegyeznünk, hogy a ballonkárosodástól távoli, nem sérült koszorúerekben nem halmozódott fel jelzett oligomer egyetlen időpontban sem. A lehetséges magyarázat az, hogy az érfalsérülés egy gyulladásos választ és sejtszaporodást indukál, ami fokozhatja az oligonukleotidok felvételét. Azok az oligonukleotidok, amelyek a „tároló”-szervekből visszatértek a keringésbe, lehetnek a forrásai az érfal sérült helyéhez való újbóli eljutásnak.

Meglepő módon az oligonukleotidfölöslegnek (azaz a nem közvetlenül az érfalhoz injekciózott oligonukleotiddózis) a plazmából a tárolószervekbe való lerakódásának eredményeképpen az oligonukleotidból terápiásán hatásos koncentrációt lehet fenntartani, azáltal, hogy az oligonukleotid a tárolószervekből folyamatosan kiáramlik a keringő plazmába, megnövelve a plazmából való fokozott felvétellel a sérülés helyén.

A sertésmodellből kapott farmakokinetikai adatok azt sugallják, hogy az oligonukleotidok szintjének folyamatos fenntartása az érfalban elérhető lokális katéteres bejuttatással. Az adatok jelzik a resztenózis c-myc oligonukleotidokkal való szisztémás kezelésének lehetőségeit, mivel a keringő plazmában meglepően alacsony koncentrációk képesek biztosítani a sérülés helyén egy terápiásán hatékony koncentrációt.

A terápiás hatékonyság lehetőségét meglepő módon sugallja az alábbi, állatban végzett in vivő vizsgálat. Az előzőkben ismertetett in vivő vizsgálatokban (7. példa) az SMC növekedését az oligonukleotid 10 pmol/1 koncentrációban csak részlegesen gátolja, négy napig folyamatos érintkezésben a humán SMC-kkel. Mindezek ellenére a tranziens lokalizált oligonukleotidok in vivő alkalmazása 20 pg/g ér koncentrációban (körülbelül 6 pmol/l), majd a raktározószervekből való felvétel a neointima képződését lényegesen csökkentette standard sertés-resztenózismodellben.

11. példa

Vizsgálatok állatokban - A resztenózis gátlása cmyc antiszensz oligonukleotidokkal A c-myc antiszensz vegyületeknek a resztenózis gátlásában való hatékonyságát úgy vizsgáljuk, hogy cmyc specifikus antiszensz (SEQ ID NO. 1) és placebo (SEQ ID NO. 2) oligonukleotid foszforotioátokat juttatunk el a koszorúér-angioplasztia helyére egy standard sertés-resztenózismodellben, szokványos protokollokat

HU 220 969 Bl alkalmazva [Karas és munkatársai: J. Am. Coll. Card. 20, 467-474 (1992); Schwartz és munkatársai: Circulation 82, 2190-2200 (1990)]. Keresztezett házisertéseket (Sus scrofa) a vizsgálat előtt orálisan 650 mg aszpirinnel kezelünk. Az általános érzéstelenítés ketamin (12 mg/kg) és xylazin (8 mg/kg) intramuszkuláris injekciózását jelenti. Az érzéstelenítés további dózisait a kísérlet során intravénásán adjuk be. Miután a jobb oldali extemális karitid artériát sebészetileg feltártuk, heparint (10 000 E) adunk be intravénásán a sertésnek. Egy 8 French SÁL 1 vezetőkatétert (Medtronic Interventional Vascular, Inc., Danvers, MA) használva a koszorúér szájadékát fluoroszkópos vezetéssel kanülözzük. A c-myc antiszensz és a placebo bejuttatása előtt egy túlméretezett ballont használunk arra, hogy sérülést okozzunk az érfal belső és középső rétegeiben, háromszor egymás után 10 atmoszféra nyomással megnyomatva és 30 másodpercig így tartva. Közvetlenül azután, hogy az angioplasztiás ballont eltávolítottuk, a koszorúerekbe intramurális injekciókat juttatunk be, egy másik, porózus ballon alkalmazásával. A c-myc antiszensz (13 ismétlés) vagy a placebo (12 ismétlés) oligonukleotidokat 4 atmoszférás nyomással injekciózzuk be, a bejuttatás átlagosan 27 másodpercig tart. Az oligomerek dózisa 1 mg per sérült koszorúér. Az oligomerek bejuttatásával kapcsolatban nem figyelhető meg káros mellékhatás. Egy hónappal a bejuttatás után az állatokat leöljük és a sérülés területének maximális neointimális területét (NA max), a neointima vastagságát (NT max) és a maradék lument (RL) morfometriásan meghatározzuk. Az eredményeket (átlagiSEM) az alábbi táblázatban és a mellékelt ábrákon (9-11.) mutatjuk be.

2. táblázat

Oligomer Ismétlé- NA max. NT max. RL (%) sek száma (mm²) (mm)

Placebo	12	0,80±0,17	0,48±0,09	64±6
Antiszensz	13	0,24±0,06	0,20±0,04	81±5
P		<0,01	<0,01	<0,05

A 9A. ábra (közepes sérülés) és a 9B. ábra (súlyos sérülés) egy példaként megadott kontrollkoszorúér keresztmetszetének a képe (azaz amely szensz oligomer injekciót kapott) egy hónappal a sérülés után. A hisztológiai sérülést az alábbiak szerint értékeljük: 1-es fokozat: pontszerű törések a belső elasztikus rétegben; a neointima a belső elasztikus rétegnek csak a luminális oldalán látható; ΙΙ-es fokozat: hasadások a belső elasztikus rétegben, és a neointima a belső elasztikus réteg mindkét oldalán látható; ΠΙ-as fokozat: törött belső elasztikus réteg, a neointima a közeg 2/3 részét helyettesíti; IV-es fokozat: törött belső elasztikus réteg, a neointima az adneticiába nyúlik. A gyenge sérülés az Ies és ΙΙ-es kategóriába tartozik, a súlyos sérülés a III-as és IV-es kategóriába. A jelentős neointimális vastagodást nyilakkal jelezzük a 9A. és 9B. ábrákon.

A 10A. ábra (közepes sérülés) és a 10B. ábra (súlyos sérülés) egy példaként megadott, antiszensz oligonukleotiddal kezelt koszorúér keresztmetszetének a fényképe. A neointima jelentős csökkenése figyelhető meg. Ha a maximális neointimális területet a sérülés mértékének a függvényében vizsgáljuk (11. ábra), akkor a neointima és a sérülés foka (azaz a sérülés súlyossága) közötti regressziós vonalak iránytangense jelentős különbséget mutatott (p<0,01). Amint all. ábrán látható, az antiszensz oligonukleotidok jelentősen csökkentik a neointima képződését, különösen a nagyobb sérülések esetében.

Összefoglalva, ezek az eredmények azt mutatják, hogy a c-myc antiszensz oligonukleotidok lokális transzkatéteres bejuttatása csökkenti a neointima képződését a koszorúerekben, az érfal ballon által okozott sérülését követően.

12. példa

Növekedési vizsgálatok - További c-myc antiszensz oligonukleotidok A c-myc mRNS transzlációs iniciációs régiójától különböző régióit megcélzó antiszensz oligonukleotidok növekedésgátló hatását az alábbiak szerint vizsgáljuk. A humán SMC-t 5000/cm² sűrűségben szélesztjük, majd 0,5%-os FBS-sel állítjuk le 48 óra hosszat. A sejteket azután 20%-os FBS-sel serkentjük, majd az alábbi foszforotioát oligonukleotidok közül egyet (8 pmol/l vagy 16 pmol/l), amely komplementer a c-myc mRNS különböző megcélzott szekvenciáival, a serkentéssel egy időben hozzáadjuk a sejtekhez:

5’ AAAGTGCCCG CCCGCTGCTG 3’ (SEQ ID NO. 6), amely az 5’ nemkódoló régió 358-377-es nukleotidjait célozza meg;

5’ GGGAGAGTCG CGTCCTTGCT 3’ (SEQ ID NO. 7), amely az 5’ nemkódoló régió 400-419-es nukleotidjait célozza meg;

5’ CCAGTGCAAA GTGCCCGCCC 3’ (SEQ ID NO. 8), amely az 5’ nemkódoló régió 365-384-es nukleotidjait célozza meg;

5’ GGCCTTTTCA TTGTTTTCCA 3’ (SEQ ID NO. 9), amely a kódolórégió 1709-1728-as nukleotidjait célozza meg;

5’ TCATGGAGCA CCAGGGGCTC 3’ (SEQ ID NO. 10), amely a kódolórégió 1264-11283-as nukleotidjait célozza meg;

5’ CGGATCTCCC TTCCCAGGAC 3’ (SEQ ID NO. 11), amely az 5’ nemkódoló régió 242-262-es nukleotidjait célozza meg;

5’ CGTTCTTTTT TCCCGCCAAG 3’ (SEQ ID NO. 12), amely az 5’ nemkódoló régió 80-89-es nukleotidjait célozza meg.

Az 5’ AACGTTGAGG GGCAT 3’ (SEQ ID NO.

1) , amely a transzlációs iniciációs régiót célozza meg, szolgál pozitív kontrollként. Az alábbi oligonukleotidok szolgálnak negatív kontrollként: a transzlációs iniciációs régió szensz oligonukleotidja (SEQ ID NO.

2) ; a rosszul illeszkedő 5’ AACGTGGATT GGCAG oligonukleotid (SEQ ID NO. 13), amely a SEQ ID NO. 1-től négy hibás illeszkedésben tér el; és az 5’ GAACGGAGAC GGTTT 3’ összekevert szensz oligonukleotid (SEQ ID NO. 14). A sejteket az oligonukleo11

HU 220 969 Bl tidokkal vagy azok nélkül inkubáljuk 3 napig, majd a sejtek számát egy Coulter-Counter-ben megszámláljuk. A növekedést és a gátlást az előzőkben leírt módon számítjuk ki.

Az eredményeket a 12. ábrán közöljük. A növekedés gátlásának különböző mértéke érhető el. A SEQ ID NO. 7 és SEQ ID NO. 10 c-myc antiszensz oligonukleotidok hasonló mértékben gátolják a humán SMC-k növekedését, ha a transzlációs iniciációt megcélzó oligonukleotid (SEQ ID NO. 1) hatásával hasonlítjuk össze. A szensz, rosszul illeszkedő (mis) és az összekevert szensz (ser) oligonukleotidok nem gátolták a növekedést. A 12. ábrán látható eredmények három megfigyelés átlagát jelentik. A kísérletet kétszer megismételtük. Hasonló eredményeket kaptunk.

Mindegyik, a szintetikus, preparatív és analitikai eljárásokra vonatkozó idézett publikációt referenciának tekintjük.

A jelen találmány más specifikus formában is megfogalmazható anélkül, hogy eltérnénk a szellemétől és lényegétől, ezért a leírás helyett a mellékelt igénypontokra hivatkozunk a találmány oltalmi körének megfogalmazásakor.

Az alábbiakban közöljük a szekvencialistákat.

SZEKVENCIALISTA (1) Általános információk:

(i) A találmány bejelentője: Thomas Jefferson University (ii) A találmány címe: A c-myc antiszensz gátlása a simaizomsejtek szaporodásának befolyásolására (iii) A szekvenciák száma: 14 (iv) Levelezési cím:

(A) Cím: Seidel, Gonda, Lavorgna & Monaco,

P. C.

(B) Utca: Two Penn Center, Suite 1800 (C) Város: Philadelphia (D) Állam: PA (E) Ország: USA (F) Irányítószám: 19102 (v) Számítógéppel olvasható forma:

(A) Adathordozó fajtája: Flopilemez, 3,5”,

720 Kb (B) Számítógép: IBM PS/2 (C) Operációs rendszer: MS/DOS (D) Szoftver: WordPerfect 5.1 (vi) Jelenlegi bejelentési adatok:

(A) A bejelentés száma: n/a (B) A benyújtás dátuma:

(C) Osztályozás:

(vii) A korábbi bejelentés adatai:

(A) A bejelentés száma: 004,799 (B) A bejelentés időpontja: 1993. január 7.

(viii) Ügyvivő/Ügynöki információk:

(A) Név: Dániel A. Monaco (B) Bejegyzés száma: 30,480 (C) Referencia/akta száma: 8321-9 (ix) Telekommunikációs információ:

(A) Telefon: 215-568-8383 (B) Telefax: 215-568-5549 (2) Információk a SEQ ID NO. 1-ről:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 15 nukleotid (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A szekvencia leírása: SEQ ID NO. 1

AACGTTGAGGGGCAT 10 (2) Információk a SEQ ID NO. 2-ről:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 15 nukleotid (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: SEQ ID NO. 2

ATGCCCCTCAACGTT (2) Információk a SEQ ID NO. 3-ról:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 15 nukleotid (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris 25 (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: SEQ ID NO. 3

TACGGGGTTGAGCAA (2) Információk a SEQ ID NO. 4-ről:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 20 nukleotid (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: SEQ ID NO. 4

TGGTGCTCCATGAGGAGACA (2) Információk a SEQ ID NO. 5-ről:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 20 nukleotid 40 (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: SEQ ID NO. 5 45 GTGTTTCAACTGTTCTCGTC (2) Információk a SEQ ID NO. 6-ról:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 20 nukleotid (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A szekvencia leírása: SEQ ID NO. 6

AAAGTGCCCG CCCGCTGCTG 55 (2) Információk a SEQ ID NO. 7-ről:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 20 nukleotid (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris

HU 220 969 Bl (iv) Antiszensz: igen (ix) A szekvencia leírása: SEQ ID NO. 7:

GGGAGAGTCG CGTCCTTGCT (2) Információk a SEQ ID NO. 8-ról :

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 20nukleotid (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A szekvencia leírása: SEQ ID NO. 8: CCAGTGCAAA GTGCCCGCCC (2) Információk a SEQ ID NO. 9-ről:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 20nukleotid (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A szekvencia leírása: SEQ ID NO. 9: GGCCTTTTCA TTGTTTTCCA (2) Információk a SEQ ID NO. 10-ről:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 20 nukleotid (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A szekvencia leírása: SEQ ID NO. 10: TCATGGAGCA CCAGGGGCTC (2) Információk a SEQ ID NO. 11-ről:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 20 nukleotid (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A szekvencia leírása: SEQ ID NO. 11: CGGATCTCCC TTCCCAGGAC (2) Információk a SEQ ID NO. 12-ről :

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 20nukleotid (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) A szekvencia leírása: SEQ ID NO. 12: CGTTCTTTTT TCCCGCCAAG (2) Információk a SEQ ID NO. 13-ról:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 15 nukleotid (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: SEQ ID NO. 13: AACGTGGATT GGCAG (2) Információk a SEQ ID NO. 14-ről:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 15 nukleotid (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: SEQ ID NO. 14: GAACGGAGAC GGTTT

Claims (12)

1. A c-myc-re specifikus antiszensz oligonukleotid terápiásán hatásos mennyiségének in vivő alkalmazása simaizomsejtek szaporodását befolyásoló gyógyszerkészítmény előállítására.

2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antiszensz oligonukleotid komplementer a c-myc-et kódoló mRNS egyik régiójával.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antiszensz oligonukleotid az artériák simaizomsejtjeire hat és komplementer a c-myc-et kódoló mRNS egyik régiójával.

4. A 2. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antiszensz oligonukleotid komplementer a c-myc-et kódoló mRNS transzlációs iniciációs régiójával.

5. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antiszensz oligonukleotid szekvenciája az 1. számú szekvencia szerinti.

6. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antiszensz oligonukleotid szekvenciája a 7. számú szekvencia szerinti.

7. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antiszensz oligonukleotid szekvenciája a 10. számú szekvencia szerinti.

8. Az előző igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás vaszkuláris resztenózis megelőzésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására.

9. Az előző igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás vaszkuláris sérülés helyén alkalmazható gyógyszerkészítmény előállítására.

10. Az előző igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás katéterrel bejuttatható gyógyszerkészítmény előállítására.

11. Az előző igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás szisztémásán alkalmazható gyógyszerkészítmény előállítására.

12. Az előző igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás intravénásán alkalmazható gyógyszerkészítmény előállítására.