DE69935889T2

DE69935889T2 - Polyphosphorsäure enthaltendes Zellwachstumsbeschleunigungsmittel und dessen Verwendung

Info

Publication number: DE69935889T2
Application number: DE69935889T
Authority: DE
Inventors: Toshikazu Shiba
Original assignee: Shiba Toshikazu Hino; Nipro Corp
Current assignee: Shiba Toshikazu Hino; Nipro Corp
Priority date: 1998-08-28
Filing date: 1999-08-25
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2019-08-26
Also published as: EP0987324A3; DE69935889D1; EP0987324B1; US6333193B1; EP0987324A2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die in vitro-Verwendung einer linearen kondensierten Polyphosphorsäure als Zellwachstumsbeschleuniger und ein Zellzüchtungsverfahren, wobei diese verwendet wird.
Beschreibung des Standes der Technik
Wenn Tierzellen in vitro kultiviert werden, wird im Allgemeinen ein Medium, erhalten durch Zugeben von 10 bis 20% eines Serums als Zellwachstumsfaktor zu einem Basalmedium, das Aminosäuren, Vitamine, Saccharide und anorganische Salze enthält, verwendet. Jedoch kann das Serum nicht fabrikmäßig hergestellt werden und es ist deshalb recht teuer, und ferner hat seine Zusammensetzung große individuelle Unterschiede (Chargenunterschiede). Da die Menge einer Charge begrenzt ist, sind umständliche Verfahrensweisen, wie z.B. Überprüfung von Chargen, Erstellung von Kulturbedingungen und deren Kontrolle erforderlich, wenn sich die Charge ändert.
Wenn Substanzen (Proteine einschließlich Enzyme, physiologisch aktive Substanzen, Vakzine und Viren) unter Verwendung von Kulturzellen produziert werden, ist im Allgemeinen ein Serum in vielen Fällen erforderlich. Die Entwicklung einer Technik, bei der die Menge an verwendetem Serum minimiert oder ein Serum-freies Medium verwendet wird, war am Laufen. Als Beispiel für ein Serum-freies Medium werden zahlreiche Zellwachstumsfaktoren oder Hormone, wie z.B. Insulin, einem Basalmedium anstelle eines Serums zugesetzt, um das Zellwachstum zu beschleunigen. Da jedoch Wachstumsfaktoren oder Hormone, die anstelle eines Serums zugegeben werden, teuer sind, werden die Kosten für die Erhaltung der Kulturzellen tatsächlich hoch. Ferner besteht die Wahrscheinlichkeit, dass Pathogene, wie z.B. Viren und Prionen, in einem Serum enthalten sind, und damit ist eine Kontamination mit derartigen Pathogenen ein Thema.
Ferner sind verschiedene Medikationen zur Therapie von Verletzungen, Verbrennungen oder Wunden, begleitet von einem chirurgischen Eingriff, eingesetzt worden. Jedoch gibt es keine Medikation zum Fördern bzw. Beschleunigen der Gewebereparatur durch Beschleunigen des Zellwachstums. Die Heilung wird indirekt gefördert, indem eine bakterielle Infektion, z.B. mit Antibiotika, verhindert wird. In der Therapie von Verbrennungen ist künstliche Haut, wirksam zur Förderung der Regeneration eines Gewebes und der Beschleunigung der Heilung, zur praktischen Verwendung gebracht worden. Jedoch ist eine Substanz, die aktiv als ein Inhaltsstoff einer künstlichen Haut zum Fördern des Zellwachstums funktioniert und die Heilung beschleunigt, unbekannt gewesen, abgesehen von natürlichen Proteinen, wie z.B. Collagen. Darüber hinaus ist in der Therapie der Alveolarpyorrhea ein periodontal Erkrankungs-Behandlungs-Material unter Verwendung natürlicher Substanzen, einschließlich Proteinen, wie z.B. Periodontium-Regenerations-Faktor, in der Entwicklung gewesen. Dennoch ist es noch nicht zur praktischen Verwendung gebracht worden.
Darüber hinaus sind hinsichtlich des Problems der Förderung von Haarwuchs bzw. Haarwachstum zahlreiche Extrakte aus natürlichen Substanzen, synthetische Mittel oder Östrogene mit einer Funktion der Haarmatrix-Zellaktivierung und einer Funktion der Förderung des Blutflusses als wirksame Komponenten berichtet worden, und es sind Pharmazeutika oder mit Arzneistoffen versetzte Toilettenartikel zur Förderung des Haarwachstums bereitgestellt worden. In der JP-A-10-194935 ist z.B. ein Haarwachstumspromotor, erhal ten durch Mischen eines Kopfhaut-Aktivierungspromotors, wie z.B. Campher, Caprinsäure, Phenol oder Salicylsäure, mit einem Extrakt aus Houttuynia cordata, Artemisia indica oder einer Aloe beschrieben. Ferner wird in der JP-A-9-227342 ein Haarwachstumspromotor, enthaltend einen Extrakt aus Geranium nepalense ssp. thunbergii als Zellaktivator beschrieben. Weiterhin wird in der JP-A-8-40835 ein Produkt, erhalten durch Mischen eines Blutflusspromotors mit Naphthalinsulfonsäure und/oder Benzophenonsulfonsäure beschrieben und ein Haarwachstumspromotor, enthaltend L-Menthol, Natrium-p-toluolsulfonylchloramid, Natriumhypochlorit oder D-Pantothenylalkohol wird in der JP-A-7-53334 beschrieben. Somit ist insoweit eine große Anzahl an Haarwachstumspromotoren eingeführt worden.
Aidar, Elizabeth et al.: „Marine Phytoplankton Assays: Effects of Detergents." Marine Environmental Research, Bd. 43, Nr. 1-2, 1996, Seiten 55-68, XP002208979 ISSN: 0141-1136 offenbart, dass Polyphosphate eine wirksame Quelle für Phosphor für das Zellwachstum sein können, wie an marinem Phytoplankton getestet.
Der Effekt der Haarwachstumsförderung in diesen Haarwachstumspromotoren ist nicht notwendigerweise zufrieden stellend gewesen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist gemacht worden, um solche Probleme des Standes der Technik zu lösen. Es ist eine Aufgabe der Erfindung, die Zellkultur zu führen bzw. durchzuführen und das Zellwachstum zu beschleunigen, und zwar sicher und effizient, bei geringen Kosten, wobei ein Medium und ein Zellwachstumsmaterial verwendet werden, in denen das Wachstum der Kulturzellen beschleunigt werden kann, wenn eine Substanz in vitro mit Kulturzellen produziert wird.
Das heißt, die Erfindung betrifft die in vitro-Verwendung einer linearen kondensierten Polyphosphorsäure, wiedergegeben durch die Formel: H_(n+2) P_nO_(3n+1) wobei n eine ganze Zahl zwischen 5 und 5000 ist, zusammen mit einem Zellwachstumsfaktor als Zellwachstumsbeschleuniger bei Tierzellen.
Ferner betrifft die Erfindung diese Verwendung, wobei die Zelle Haarmatrixzelle ist/sind.
Weiterhin betrifft die Erfindung diese Verwendung, wobei die Zelle Knochenzellen ist/sind.
Ferner betrifft die Erfindung ein Zellzüchtungsverfahren, dadurch gekennzeichnet, dass einem Medium für Tierzellen eine Polyphosphorsäure zugesetzt wird.
Weiterhin noch betrifft die Erfindung das bzw. ein Zellzüchtungsverfahren, wobei die Polyphosphorsäure dem Medium für Tierzellen, das 0 bis 10% eines Serums enthält, zugesetzt wird.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Zellzüchtungsverfahren, wobei die Polyphosphorsäure dem Medium für Tierzellen, das einen Zellwachstumsfaktor und/oder verschiedene physiologisch aktive Faktoren enthält, zugesetzt wird.
Die Erfindung betrifft darüber hinaus ein Zellzüchtungsverfahren, wobei die Zellen in einer Zellkultivierungsvorrichtung („cell cultivator") gezüchtet werden, die Polyphosphorsäure enthält oder damit beschichtet ist.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist ein Diagramm, das die zeitliche Veränderung des Wachstums von humanen normalen epithelialen Fibroblasten mit einer Polyphosphorsäure zeigt.
2 ist ein Diagramm, das die zeitliche Veränderung des Wachstums von humanen normalen epithelialen Fibroblasten mit einer Polyphosphorsäure zeigt.
3 ist ein Diagramm, das eine zeitliche Änderung des Haarwachstumsflächenverhältnisses (Fläche mit Haarwachstum/enthaarte Fläche) zeigt.
4 sind Photographien, die die Haarwachstumszustände von Rennmäusen zeigen, 5 Tage nachdem bei diesen die Hautbereiche der Rücken mittels der Verfahren von Beispiel 7 und Vergleichsbeispiel 11 beschichtet wurden.
5 sind Photographien, die die Haarwachstumszustände von Rennmäusen zeigen, 14 Tage nachdem bei diesen die Hautbereiche der Rücken mittels der Verfahren von Beispiel 7 und Vergleichsbeispiel 11 beschichtet wurden.
6 sind Photographien, die die Haarwachstumszustände von Rennmäusen zeigen, 25 Tage nachdem bei diesen die Hautbereiche der Rücken mittels der Verfahren von Beispiel 7 und Vergleichsbeispiel 11 beschichtet wurden.
7 sind Photographien, die die Haarwachstumszustände der Hautbereiche der Rücken von Rennmäusen zeigen, wenn diese zuerst (Tag 0) mittels der Verfahren von Beispiel 8 und Vergleichsbeispiel 12 beschichtet wurden.
8 sind Photographien, die die Haarwachstumszustände von Rennmäusen zeigen, 10 Tage nachdem die Hautbereiche der Rücken mittels der Verfahren von Beispiel 8 und Vergleichsbeispiel 12 beschichtet wurden.
9 sind Photographien, die die Haarwachstumszustände von Rennmäusen zeigen, 14 Tage nachdem die Hautbereiche der Rücken mittels der Verfahren von Beispiel 8 und Vergleichsbeispiel 12 beschichtet wurden.
10 sind Photographien, die die Haarwachstumszustände von Rennmäusen zeigen, 21 Tage nachdem die Hautbereiche der Rücken mittels der Verfahren von Beispiel 8 und Vergleichsbeispiel 12 beschichtet wurden.
11 ist ein Diagramm, das eine Veränderung der alkalische-Phosphatase-Aktivierung mit Natriumpolyphosphat und Natriumphosphatpufferlösung mit der Kultivierungszeit („cultivated time") zeigt.
12 ist das Zellwachstum nach 72 Stunden bei Inkubation unter verschiedenen Bedingungen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die lineare kondensierte Polyphosphorsäure wird durch Dehydrokondensation einer Orthophosphorsäure, einer Polyphosphorsäure mit einer Seitenkette, bei der eine organische Gruppe in eine Seitenkette eingeführt ist, und einer cyclischen Polyphosphorsäure erhalten. Die Erfindung betrifft die in vitro-Verwendung einer linearen kondensierten Polyphosphorsäure, wiedergegeben durch die Formel H_(n+2) (P_nO_3n+1) und mit einer Struktur derart, dass zwei oder mehr PO₄-Tetraeder linear über ein gemeinsames Brückensauerstoffatom („top oxygen atom") verbunden sind. Ein Polyphosphat ist eine Verbindung mit einer Molekülstruktur, die so ist, dass der Wasserstoff einer Hydroxylgruppe einer Polyphosphorsäure durch ein Metall ersetzt ist. Beispiele für das Metall umfassen Natrium und Kalium. n ist eine ganze Zahl zwischen 5 und 5000, stärker bevorzugt zwischen 15 und 2000.
Der Zellwachstumsbeschleuniger zur erfindungsgemäßen Verwendung kann zusätzlich zur Polyphosphorsäure Additive bzw. Zusatzstoffe enthalten.
Die Polyphosphorsäure hat die Funktion der Stabilisierung des Zellwachstumsfaktors, den Zellen per se in einer kleinen Menge sezernieren, um das Wachstum von Zellen per se zu beschleunigen, oder der Verstärkung der Bindung zwischen Zellen und dem Zellwachstumsfaktor. Die Polyphosphorsäure fördert die Aktivierung von Haarmatrixzellen und führt zu einem Effekt der Förderung des Haarwachstums. Der Gehalt an Polyphosphorsäure im Haarwachstumspromotor ist zwischen 1 × 10^–7 und 50 Gew.-%, bevorzugt zwischen 0,001 und 10 Gew.-%. Wenn der Gehalt an Phosphorsäure weniger als 1 × 10^–7 Gew.-% ist, wird kein Effekt der Förderung des Haarwachstums beobachtet. Wenn er 50 Gew.-% überschreitet, führt dies zu Problemen mit den Zubereitungen und das Produkt kann nicht mehr als Haarwachstumspromotor verwendet werden.
Ferner wird die Polyphosphorsäure in dieser Erfindung verwendet, indem sie mit zahlreichen Substanzen, deren Effekt auf die Förderung des Haarwachstums anerkannt worden ist, gemischt wird. Das heißt, die Polyphosphorsäure wird mit wenigstens einem Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Zellaktivator, einem durchblutungsfördernden Mittel („blond flow stimulant"), einem Hautstimulans, einem Feuchthaltemittel bzw. einem Feuchtigkeitsregulator und einem antiinflammatorischen Mittel, gemischt. Beispiele für den Zellaktivator umfassen Panthotensäure und seine Derivate, das photosensitive Element Nr. 301, Karottenextrakt, Biotin, Mononitroguajacol, Allantoin und Glycerinpentadecanoat. Der Gehalt an Zellaktivator im Haarwachstumspromotor ist bevorzugt zwischen 0,001 und 10 Gew.-%.
Zusätzlich umfassen Beispiele für das mit der Polyphosphorsäure zu mischende durchblutungsfördernde Mittel Acetylcholin, Carproniumchlorid, Swertia japonica-Extrakt, Guinea-Pfeffertinktur, Hinokitiol, Cepharanthin, Benzylnicotinat, Knoblauchextrakt, Ligusticumextrakt, Enzianextrakt, γ-Oryzanol, Süßholzsaft, Minoxidil, Cnidium, Panax japonicus C. A. Mey, Panax ginseng C. A. Mey, Ingwer, Rhmannia-Wurzel, Aloe, Spironolacton, Vitamin B6-hydrochlorid, D-Campher, DL-Campher, DL-α-Tocopherol, iodierten Knoblauchextrakt, DL-α-Tocopherollinoleat, Inositolhexanicotinat, Vitamin E-Derivate, Natriumdextransulfat, Nicotinsäure, DL-α-Tocopherolnicotinat, Butoxyethylnicotinat, Methylnicotinat, Vanillylamidnonanoat, DL-α-Tocopherolsuccinat, DL-α-Tocopherolacetat, Cantharistinktur und Ingwertinktur. Der Gehalt an durchblutungsförderndem Mittel ist bevorzugt zwischen 0,001 und 10 Gew.-%.
Ferner umfassen Beispiele für das mit der Polyphosphorsäure zu mischende Hautstimulans 1(L)-Menthol, Pfefferminzöl, Benzylnicotinat, Vanilamidnonylat und Campher. Der Gehalt an Hautstimulans im Haarwachstumspromotor ist bevorzugt zwischen 0,001 und 5 Gew.-%.
Ferner umfassen Beispiele für den mit der Polyphosphorsäure zu mischenden Feuchtigkeitsregulator Glycerin, Propylenglykol, Hyaluronsäure und ihr Salz, Natriumpyrrolidoncarboxylat, Chondroitinsulfat, Mini-Sasanishiki-Extrakt, vegetativen Wespenextrakt und Safranextrakt. Der Gehalt an Feuchtigkeitsregulator im Haarwachstumspromotor ist bevorzugt zwischen 0,001 und 5 Gew.-%.
Darüber hinaus umfassen Beispiele für das mit der Polyphosphorsäure zu mischende antiinflammatorische Mittel Glycyrhizinsäurederivate, Süßholzextrakt, Dinatriumcarbenoxolon, Guajazulen, Diphenhydraminhydrochlorid, Lithospermuswurzelextrakt, Rosenfruchtextrakt, Hydrocortison acetat und Prednisolon. Der Gehalt an antiinflammatorischem Mittel in dem Haarwachstumspromotor ist bevorzugt zwischen 0,001 und 3 Gew.-%.
Der Haarwachstumspromotor, verwendet gemäß der Erfindung, kann zusätzlich zu diesen Komponenten ein antibakterielles Mittel, ein keratolytisches Mittel, ein Östrogen, ein antiseborrhoisches Mittel und einen Nährstoff enthalten. Beispiele für das antibakterielle Mittel umfassen Benzalkoniumchlorid, das photosensitive Element Nr. 201, eine Chlorhexidingluconatlösung, Chlorxylenol, Trichlorcarbanilid, Halocarvan und Mononitroguajacol.
Beispiele für das keratolytische Mittel umfassen Salicylsäure, Resorcin und Milchsäure. Beispiele für das Östrogen umfassen Östron, Östradiol und Ethinylöstradiol. Beispiele für das antiseborrhoische Mittel umfassen Pyridoxin und seine Derivate, Schwefel, Thioxolon und Lecithin. Beispiele für den Nährstoff umfassen Aminosäuren, Cystin, Cystein, Methionin, Serin und Vitamine.
Darüber hinaus kann der Haarwachstumspromotor, verwendet gemäß der Erfindung, ein Öl, ein Tensid, einen mehrwertigen Alkohol, ein Antioxidans, einen Chelatbildner für Metallionen, ein Pigment und einen Aromastoff, wie erforderlich, enthalten. Beispiele für das Öl umfassen Isopropylenmyristat, Lecithin und Squalan. Beispiele für das Tensid umfassen Polyoxyethylensorbitanfettsäureester, Sorbitanfettsäureester, Polyoxyethylenfettsäureester und Glycerinfettsäureester. Beispiele für den mehrwertigen Alkohol umfassen Propylenglykol, Glycerin und Macrogol. Beispiele für das Antioxidans umfassen Dibutylhydroxytoluol und Isopropylgallat. Beispiele für den Chelatbildner für Metallionen umfassen Ethylendiamintetraacetat und sein Salz. Der erfindungsgemäße Haarwachstumspromotor wird verwendet, indem eine geeignete Menge davon einmal oder mehrmals am Tag auf eine Kopfhaut oder einen Bereich, auf/in dem/der Haar- Wachstum erwartet wird, aufgetragen wird. Die Form des Haarwachstumspromotors in der Erfindung ist nicht auf besondere Weise beschränkt und er kann als ein Haartonikum, eine Haarlotion, eine Haarcreme, ein Aerosol oder eine Salbe verwendet werden, was insoweit bekannt gewesen ist.
Wie oben angegeben, hat die in den gemäß der Erfindung verwendeten Haarwachstumspromotor eingearbeitete Polyphosphorsäure den herausragenden Effekt der Förderung des Haarwachstums, und dessen Verwendung weist einen exzellenten Effekt der Förderung des Haarwachstums im Vergleich zu einem herkömmlichen Produkt auf.
Die Polyphosphorsäure hat eine Funktion der Förderung der/zur Bildung von neuem Knochengewebe. Der Füllstoff für eine Schönheitsoperation, das Knochen-morphogenetische Protein und/oder die ein Knochen-morphogenetisches Protein enthaltende natürliche Substanz wird mit einer Polyphosphorsäure gemischt und das Gemisch kann lokal als ein Implantat oder eine Vorrichtung verabreicht werden. In diesem Fall wird das zu verabreichende Produkt eingeschlossen („occluded") oder in einer physiologisch verträglichen viskosen Form, frei von einer pyrogenen Substanz und geeignet zur Einbringung bzw. Einspeisung in eine Knochbruchstelle, injiziert. Folglich wird eine harte oder weiche Knochenstrukur in der Knochbruchstelle gebildet, wodurch eine Matrix bereitgestellt wird, die in einem optimalen Zustand in den Körper re-absorbiert werden kann. Das Knochenregenerationsmaterial der Erfindung wird, als eine osteogene Zubereitung, enthaltend die Polyphosphorsäure, in präventiven Anwendungen, wie z.B. Verbesserungen der Verringerung des geschlossenen Bruchs bzw. der Fraktur mit Weichteilverletzung („complicated fracture") und der Fixierung künstlicher Gelenke verwendet. Ferner induziert die osteogene Zubereitung die Knochenbildung von neuem und sie wird in der Wiederherstellung eines angeborenen oder aufgrund von Trauma fehlenden Teils oder des Teils, dessen Fehlen durch Tumorentfernung verursacht wurde, verwendet.
Zellkulturen sezernieren in vitro eine Spurenmenge eines Zellwachstumsfaktors in die Kulturlösung. Jedoch muss unter den gewöhnlichen Inkubationsbedingungen ein Gemisch eines Zellwachstumsfaktors in Form eines Serums von außen supplementiert bzw. zugeführt werden, und es wird unter Serum-freien Bedingungen kein effizientes Wachstum der Zellen beobachtet. Wenn die Polyphosphorsäure einem Medium zur Inkubation von Tierzellen zugesetzt wird, können Zellen, die gewöhnlicherweise unter Serum-freien Bedingungen nicht gezüchtet werden können, selbst in dem Serum-freien Medium gezüchtet werden. Die Kulturzellen können selbst in dem Serum-freien Medium oder dem Medium mit einer geringen Serumkonzentration gezüchtet werden, indem diese Eigenschaft der Polyphosphorsäure verwendet wird. Die in dem Medium zu dieser Zeit verwendete Konzentration der Polyphosphorsäure ist zwischen 1 nM und 100 mM, bevorzugt zwischen 10 nM und 2 mM.
Ein Serum-freies Medium, erhalten durch Zusetzen einer Polyphosphorsäure zu einem Medium für Tierzellen, oder ein Medium, erhalten durch Zusetzen einer Phosphorsäure und einer kleinen Menge eines Serums zu einem Medium für Tierzellen, wird verwendet. Die Menge des Serums, die dem Medium in der Erfindung zugesetzt wird, ist zwischen 0 und 10 Gew.-%, bevorzugt zwischen 0 und 5 Gew.-%. Das in der Erfindung verwendete Medium kann auf zahlreiche Kulturzellen angewendet werden. Es kann auf primäre Kulturzellen oder Stammzellen, abgeleitet von Organen, wie z.B. der Leber, der Niere, der Lunge, dem Magen und der Milz, primäre Kulturzellen oder Stammzellen, abgeleitet von Leukozyten, wie z.B. Lymphozyten, und Geweben, wie z.B. Nerven, Muskeln, Häute und Knochen, und zahlreiche Tumorzellen angewandt werden. In diesem Fall bedeuten die Zellen Zellen aller Arten von Organismen, einschließlich Arthropoden (Insekten), sowie embryonale und fötale Zellen.
Zahlreiche Myelomzellen und Hybridomzellen, die allgemein für die Produktion monoklonaler Antikörper verwendet werden, sind ebenfalls anwendbar. Beispiele dafür umfassen epitheliale Keratinozyten, Melanozyten, Gefäßendothelzellen, glatte Gefäßmuskelzellen, Haarmatrixzellen, Osteoblasten, Chondrozyten, Amnionzellen, fötale Nierenzellen, fötale Lungenzellen und Zelllinien („strain cells"), wie z.B. Hela-Zellen, FL-Zellen, KB-Zellen, HEp-2-Zellen, WI-38-Zellen, MA104-Zellen, BSC-1-Zellen, Vero-Zellen, CV-1-Zellen, BHK-21-Zellen, RK-13-Zellen, Raji-Zellen, R388D1-Zellen, Ralb/3T3-Zellen, CHO-K1, EB-3, EI-38, HEL-Zellen, hl-60-Zellen, K562-Zellen, MPC-11-Zellen, MRC-5-Zellen, Namalva-Zellen und L-Zellen. Insbesondere werden bevorzugt Zelllinien mit Bedarf an Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), humane normale epitheliale Fibroblasten, humane normale gingivale Fibroblastenzellen, humane normale Epithelzellen und Mauszelllinien verwendet. Es kann auch auf die Herstellung künstlicher Organe, wie z.B. einer künstlichen Leber usw., angewendet werden.
Als der Zellwachstumsfaktor, der durch die Polyphosphorsäure stabilisiert wird oder dessen Bindung an Zellen durch die Polyphosphorsäure verstärkt wird, werden zahlreiche Wachstumsfaktoren genannt. Von diesen sind β-FGF (basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor), α-FGF (saurer Fibroblasten-Wachstumsfaktor), FGF-7 (Keratinozyten-Wachstumsfaktor), PDGF (Blutplättchen-Wachstumsfaktor), EGF (epidermaler Wachstumsfaktor), ein Gefäßendothel-Wachstumsfaktor und Pleiotrophine bevorzugt. Diese Zellwachstumsfaktoren werden mit der Polyphosphorsäure entweder einzeln oder in Kombination gemischt und das Gemisch wird einem Medium zur Tierzellkultur zugesetzt, wobei es eine hohe Wachstumsbeschleunigungsfähigkeit, verglichen mit der beim Zusetzen des Zellwachstumsfaktors alleine, aufweist. Die zu dieser Zeit verwendete Konzentration des Wachstumsfaktors hängt von dessen Typ ab und liegt zwischen 0,1 und 1000 ng/ml.
Beispiele für andere Substanzen als der Wachstumsfaktor, deren Funktion durch die Polyphosphorsäure beschleunigt wird, umfassen alle Substanzen, die die physiologische Aktivität von Zellen regulieren („adjust"), indem sie extracellulär auf die Zellen wirken (hiernach als „physiologisch aktive Faktoren" bezeichnet), z.B. Cytokine, ein chemotaktischer Faktor, Hormone, ein die Differenzierung induzierender Faktor, ein morphogenetischer Faktor, ein angiogenetischer Faktor, ein Angiogenesis-Inhibitor, ein hämopoetischer Faktor, eine TGF-β-Superfamilie, TNF, INF und ein Pflanzen-Wachstumsfaktor. Diese physiologisch aktiven Faktoren werden mit der Polyphosphorsäure entweder einzeln oder in Kombination gemischt und das Gemisch wird einem Medium zur Inkubation von Tierzellen zugegeben, wodurch nicht nur das Wachstum der Kulturzellen, sondern auch die Kontrolle der physiologischen Aktivität der Zellen gesteuert werden kann. Die den Zellwachstumsfaktor enthaltenden Substanzen können kommerzielle Produkte sein. Die Menge an physiologisch aktivem Faktor hängt von dessen Typ ab und liegt bevorzugt zwischen 1 pg/ml und 1 mg/ml.
Als das mit der Erfindung verwendete Medium ist ein Medium, enthaltend Saccharide, Aminosäuren, Vitamine und Salze, das gewöhnlicherweise zum Inkubieren von Tierzellen verwendet wird, verfügbar. Beispiele für das Medium umfassen Eagle's-MEM-Medium, modifiziertes Eagle's-MEM-Medium, denen Aminosäuren, Vitamine und anorganische Salze, neu zugesetzt sind oder bei denen diese erhöht oder verringert sind, um die zu inkubierenden Zellen zu adaptieren, Dulbecco's-modifiziertes Eagle's-Medium, Iskov-Medium, RPMI 1640-Medium, Ham F10-Medium, Ham F12-Medum, MCDB131-Medium MCBD151-Medium, MCBD152-Medium, MCBD153-Medium, MCBD201-Medium, MCBD302-Medium, GIT-Medium und MEDIUM199. Weiter hin kann das Medium der Erfindung Additive bzw. Zusatzstoffe enthalten, die gewöhnlicherweise in der Zellkultur verwendet werden, wie z.B. Antibiotika, Fungizide, Puffer, Pigmente und Agars. Weiterhin noch umfassen Beispiele für das Medium zur Inkubation von Pflanzenzellen Murashige-Skoog-Medium, B5-Medium, Nagata-Takebe-Medium, Kao-Michayluk (8p)-Medium, Nagy-Maliga (K₃)-Medium, Shepard (CL)-Medium und Chupeau (To).
Beispiele für den in der Erfindung verwendeten Zellinkubator umfassen eine Petrischale, eine Flasche, einen Kolben, ein Teströhrchen, einen Becher bzw. ein Becherglas und Hohlfasern, hergestellt aus Kunststoffen, wie z.B. Polystyrol, Polyethylen, Polyvinylchlorid, Polyester, Polycarbonat, Acetylcellulose und Polyacrylat, und einem Glas. Die Polyphosphorsäure ist diesen Inkubatormaterialien zugegeben worden und das Gemisch wird in einem Inkubator geformt. Oder die Oberfläche des Inkubators ist mit einem Film, enthaltend die Polyphosphorsäure, beschichtet.
Die Stabilisierung des physiologisch aktiven Faktors oder die Stabilisierung der Bindung zwischen den Zellen und dem physiologisch aktiven Faktor durch die Polyphosphorsäure kann nicht nur auf die Kulturzellen angewandt werden, sondern auch auf die Zellen (Gewebe) von Tieren einschließlich Menschen. Die Polyphosphorsäure stabilisiert die Funktion einer sehr kleinen Menge des physiologisch aktiven Faktors, welche(n) die Zellen im Gewebe sezernieren, wodurch das Wachstum oder die physiologische Aktivität der Zellen im Gewebe und die Reparatur oder Regeneration des Gewebes effizient erhöht werden.
Das Polyphosphorsäure enthaltende Medium und der Polyphosphorsäure enthaltende Inkubator in der Erfindung haben die Eigenschaften, dass sie das Wachstum von Kulturzellen in einem Serum-freien Zustand oder in einem Zustand, in dem eine kleine Menge eines Serums oder eines physiologisch aktiven Faktors enthalten ist, beschleunigen, und sie können in der Produktion zahlreicher Substanzen unter Verwendung von Kulturzellen angewandt werden. Ferner wirken der Zellwachstumsbeschleuniger und die die Polyphosphorsäure enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung so, dass sie die Gewebereparatur beschleunigen und zum Beschleunigen der Heilung von Verletzungen und Verbrennungen, der Therapie peridontaler Erkrankungen und der Heilung nach einem chirurgischen Eingriff verwendet werden.
Beispiele
Die Erfindung wird spezifisch durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele und Vergleichsbeispiele erläutert.
Beispiel 1 und Vergleichsbeispiele 1 und 2
Humane normale epitheliale Fibroblasten (HF) wurden auf einer 96-Well-Mikrotiterplatte bei einer Konzentration von 5000 Zellen/Well verteilt bzw. inokuliert und in Eagle's-MEM-Medium, enthaltend 10% Serum, bei 37°C für 24 Stunden inkubiert. Nachdem das Medium durch Absaugen entfernt worden war, wurden die an die Platte gebundenen Zellen mit PBS (Phosphat-gepufferte physiologische Salzlösung) gewaschen. Serum-freies Eagle's-Medium wurde zugegeben und die Inkubation wurde für 24 Stunden weiter fortgesetzt. Nach Abschluss der Inkubation wurde das Medium durch Absaugen entfernt und durch eine Kulturlösung, erhalten durch Zusetzen von 0,67 mM Polyphosphorsäure zu Eagle's-MEM-Medium ersetzt. Das nachfolgende Zellwachstum wurde mittels der MTS-Methode (CellTiter 96, Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Technical Bulletin, #TB112, Promega Corporation) gemessen. Zum Vergleich wurden auch die zeitlichen Änderungen der Zahl von Zellen, inkubiert auf die gleiche Weise, in Eagle's-MEM-Medium, enthaltend 0,67 mM Phosphatpuffer (Vergleichsbeispiel 1), und in Eagle's-MEM-Medium, enthaltend nur steriles Wasser, (Vergleichsbeispiel 2) ge messen. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt. In diesem Beispiel wurde die Polyphosphorsäure (Polyphosphatglas, geliefert von Sigma) als ein Natriumsalz verwendet und seine mittlere Kettenlänge (Zahl der Phosphorsäuren) war 65. Ferner war der Phosphatpuffer auch ein Natriumsalz, und sein pH war ebenfalls, wie im Medium, auf 7,0 eingestellt.
1 zeigt die zeitliche Veränderung der Zahl an Zellen inkubiert in Beispiel 1 und gibt graphisch die zeitliche Änderung im Zellwachstum von humanen normalen epithelialen Fibroblasten (HF) wieder. Hinsichtlich der Zellen, die in dem den Phosphatpuffer enthaltenden Medium (Vergleichsbeispiel 1) und im nur steriles Wasser enthaltenden Medium (Vergleichsbeispiel 2) inkubiert wurden, wurde eine Abnahme der Zellzahl nach der Inkubation beobachtet. Nach 24 Stunden wurde beinahe kein Wachstum (mehr) beobachtet. Indessen waren in Beispiel 1, bei dem die Inkubation in dem die Polyphosphorsäure enthaltenden Medium durchgeführt wurde, die Zellen stufenweise nach 24 Stunden gewachsen. Der Effekt der Beschleunigung des Zellwachstums durch die Polyphosphorsäure wurde für 100 Stunden nach dem Beginn der Inkubation beobachtet.
Beispiel 2 und Vergleichsbeispiele 3 und 4
Das Experiment wurde wie in Beispiel 1 unter Verwendung humaner normaler gingivaler Fibroblasten durchgeführt. Das Zellwachstum wurde in genau der gleichen Weise wie in Beispiel 1 beobachtet, außer dass Dulbecco's-modifiziertes Eagle's-Medium verwendet wurde. Zum Vergleich wurden auch die zeitlichen Änderungen der Zahlen von Zellen, die auf die gleiche Weise in 0,67 mM Phosphatpuffer enthaltendem Eagle's-MEM-Medium (Vergleichsbeispiel 3) und in nur steriles Wasser enthaltendem Eagle's-Medium (Vergleichsbeispiel 4) inkubiert, auch gemessen. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt.
2 zeigt die Ergebnisse von Beispiel 2 und gibt graphisch das Zellwachstum von humanen normalen gingivalen Fibroblasten wieder. Hinsichtlich der Zellen, inkubiert in dem den Phosphatpuffer enthaltenden Medium (Vergleichsbeispiel 3) und in dem nur steriles Wasser enthaltenden Medium (Vergleichsbeispiel 4) war, wie beim Wachstum von HF, gezeigt in 1, die Zellzahl nach der Inkubation verringert. 24 Stunden später wurde beinahe kein merkliches Wachstum beobachtet. Indessen war, wenn die Inkubation in dem die Polyphosphorsäure enthaltenden Medium durchgeführt wurde, die Zellzahl nicht sofort nach Beginn der Inkubation verringert, und die Zellen wurden stufenweise im Zeitverlauf gezüchtet. Der Effekt der Beschleunigung des Zellwachstums durch die Polyphosphorsäure wurde für 100 Stunden nach dem Beginn der Inkubation beobachtet.
Beispiele 3 und Vergleichsbeispiele 5 und 6
Humane normale epitheliale Fibroblasten (HF) wurden in eine 12-Well-Mikrotiterplatte bei einer Konzentration von 2,5 × 10⁵ Zellen/Well inokuliert und in Eagle's-MEM-Medium, enthaltend 10% Serum, bei 37°C für 24 Stunden inkubiert. Nachdem das Medium durch Absaugung entfernt worden war, wurden die an die Platte gebundenen Zellen mit PBS (Phosphat-gepufferte physiologische Salzlösung) gewaschen. Serum-freies Eagle's-Medium wurde zugegeben und die Inkubation wurde für 24 Stunden weiter fortgesetzt. Nach Abschluss der Inkubation wurde das Medium durch Absaugung entfernt und durch eine Kulturlösung, erhalten durch Zusetzen von 0,67 mM Polyphosphorsäure zu Eagle's-MEM-Medium, ersetzt. Das nachfolgende Zellwachstum wurde durch Auszählung der Zellzahl gemessen. Die Zahl lebensfähiger Zellen nach 50-stündiger Inkubation ist in Tabelle 1 gezeigt.
Zum Vergleich wurden die Zellgruppen, inkubiert und 0,67 mM Phosphatpuffer enthaltendem Eagle's-MEM-Medium (Vergleichsbeispiel 5) und in nur steriles Wasser enthaltendem Eagle's-MEM-Medium (Vergleichsbeispiel 6), bereitgestellt.
In diesem Beispiel wurde, wie in Beispiel 1, ein Natriumsalz als die Polyphosphorsäure (Polyphosphatglas, geliefert von Sigma) verwendet und seine mittlere Kettenlänge (die Zahl der Phosphorsäuren) war 65. Ferner war die Phosphatpufferlösung auch die des/seines Natriumsalzes und ihr pH war auch auf 7,0, wie im Medium, eingestellt. Tabelle 1

Beispiel 3 Vergleichsbeispiel 5 Vergleichsbeispiel 6

Zahl lebensfähiger Zellen (x 10⁵) 6,0 2,6 2,0
Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse von Beispiel 3, namentlich das Zellwachstum von HF. Wie es bei der Messung mittels der MTS-Methode in Beispiel 1 der Fall war, wurde die Erhöhung der Zellzahl nach der Inkubation nicht bei Zellen, inkubiert in dem den Phosphatpuffer enthaltenden Medium (Vergleichsbeispiel 5) und in dem nur steriles Wasser enthaltenden Medium (Vergleichsbeispiel 6), beobachtet. Jedoch war die Zahl der Zellen, die in dem die Polyphosphorsäure enthaltenden Medium inkubiert wurden, nach 50-stündiger Inkubation näherungsweise auf das 2,4-Fache erhöht.
Beispiel 4 und Vergleichsbeispiele 7 und 8
Eine Mauszelllinie, Balb 3T3, wurde in eine 96-Well-Mikrotiterplatte bei einer Konzentration von 5000 Zellen/Well inokuliert und in Eagle's-MEM-Medium, enthaltend 10% Serum, bei 37°C für 24 Stunden inkubiert. Nachdem das Medium durch Absaugen entfernt worden war, wurden die an die Platte gebundenen Zellen mit PBS (Phosphat-gepufferte physiologische Salzlösung) gewaschen. Serum-freies Eagle's-Medium wurde zugegeben und die Inkubation wurde für 24 Stunden weiter fortgesetzt. Nach Abschluss der Inkubation wurde das Medium durch Absaugung entfernt und durch 0,67 mM Polyphosphorsäure enthaltendes Eagle's-MEM-Medium ersetzt. Das nachfolgende Zellwachstum wurde mittels der MTS-Methode gemessen. Die Zellzahl nach 30-stündiger Inkubation wurde als ein relativer Wert berechnet, wobei die Zellzahl nach 30-stündiger Inkubation in einem 10% Serum enthaltenden Medium (Vergleichsbeispiel 7) als 1 definiert war. Das Ergebnis ist in Tabelle 2 gezeigt. Als Vergleichsbeispiel 8 ist die Geschwindigkeit des Zellwachstums nach 30-stündiger Inkubation in Eagle's-MEM-Medium, das nur steriles Wasser enthielt, in Tabelle 2 gezeigt. In diesem Beispiel wurde ein Natriumsalz als die Polyphosphorsäure verwendet und seine mittlere Kettenlänge (die Zahl der Phosphorsäuren) war 65. Ferner war das verwendete Polyphosphat auch ein Natriumsalz und sein pH wurde ebenfalls auf 7,0, wie im Medium, eingestellt.
Beispiele 5 und 6 und Vergleichsbeispiele 9 und 10
Das Experiment wurde wie in Beispiel 4 durchgeführt, wobei eine Mauszelllinie, Balb 3T3, verwendet wurde. Die Inkubation wurde unter Verwendung von Eagle's-MEM-Medium, enthaltend ein Gemisch aus 0,67 mM Polyphosphorsäure und 10 ng/ml eines sauren Fibroblasten-Wachstumsfaktors (α-FGF) anstelle von 0,67 mM Polyphosphorsäure (Beispiel 5) durchgeführt. Ferner wurde die Inkubation unter Verwendung von Eagle's-MEM-Medium, enthaltend ein Gemisch aus 0,67 mM Polyphosphorsäure und 10 ng/ml eines basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors (β-FGF) anstelle von Polyphosphorsäure (Beispiel 6) durchgeführt. Zum Vergleich wurden die Zellzahlen nach 30-stündiger Inkubation in Eagle's-MEM-Medium, enthaltend nur 10 ng/ml eines sauren Fibroblasten- Wachstumsfaktors (α-FGF), (Vergleichsbeispiel 9) und in Eagle's-MEM-Medium, enthaltend nur 10 ng/ml eines basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors (β-FGF), (Vergleichsbeispiel 10) als relative Werte berechnet, wobei die Zellzahl nach 30-stündiger Inkubation in einem 10% Serum enthaltenden Medium (Vergleichsbeispiel 7) als 1 definiert war. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2

Vgl.bsp. 7 Vgl.bsp. 8 Vgl.bsp. 9 Vgl.bsp. 10 Bsp. 4 Bsp. 5 Bsp. 6

1,00 0,52 0,60 0,67 0,68 0,92 1,08

Vgl.bsp.: Vergleichsbeispiel
Bsp.: Beispiel

Tabelle 2 enthüllt, dass, nach 30-stündiger Inkubation, das Wachstum in dem α-FGF und die Polyphosphorsäure enthaltenden Medium näherungsweise 1,5-mal höher als das in dem nur α-FGF enthaltenden Medium war. Ferner war das Wachstum in dem β-FGF und die Polyphosphorsäure enthaltenden Medium näherungsweise 1,6-mal höher als das in dem nur β-FGF-enthaltenden Medium. Weiterhin noch wurde der Effekt der Beschleunigung des Wachstums auf dem nur die Polyphosphorsäure enthaltenden Medium beobachtet. Wenn jedoch der Zellwachstumsfaktor mit der Polyphosphorsäure kombiniert wurde, wurde der stärkste Effekt hinsichtlich der Beschleunigung des Wachstums bereitgestellt.
Beispiel 7 und Vergleichsbeispiel 11
Das Haar auf den Hautbereichen auf den Rücken 7 Wochen alter Rennmäuse (männlich) wurde auf einer Fläche von näherungsweise 8 cm² unter Verwendung einer elektrischen Haarschneidemaschine geschoren und mit einer Enthaarungscreme vollständig entfernt. Diese Rennmäuse wurden in zwei Grup pen aufgeteilt, wobei jede aus 10 Rennmäusen bestand. Vaseline, enthaltend 1 Gew.-% eines feinen Pulvers von einer Polyphosphorsäure (die Zahl der Phosphorsäurereste – 1000 oder mehr), wurde auf den enthaarten Bereich einer der Gruppen in einer Dosis von jeweils näherungsweise 0,2 g einmal täglich aufgetragen (Beispiel 7). Indessen wurde ein Gemisch von Vaseline mit 1 Gew.-% feinen Pulvers von Natriumdihydrogenphosphat und Dinatriumhydrogenphosphat (pH, wenn in Wasser gelöst, 7,5) auf den enthaarten Bereich der anderen Gruppe in einer Dosis von jeweils 0,2 g einmal täglich auftragen (Vergleichsbeispiel 11). Um den Zustand des Haarwachstums zu beobachten, wurde der enthaarte Bereich jeden Tag unter Verwendung einer Digitalkamera photographiert. Das Bild wurde unter Verwendung eines Arbeitsplatzrechners analysiert, um ein Haarwachstums-Flächenverhältnis („hair growth area rate") (Fläche mit Haarwachstum/enthaarte Fläche) zu berechnen. Dessen zeitliche Änderung ist in 3 gezeigt. Wie aus 3 ersichtlich ist, ist das Haarwachstums-Flächenverhältnis von Rennmäusen in Beispiel 7 der Erfindung in extremem Maße höher als das von Rennmäusen in Vergleichsbeispiel 11, und es wird erkannt, dass der merkliche Effekt der Förderung des Haarwachstums in der Erfindung gezeigt wird.
4 sind Photographien, die die Haarwachstumszustände von Rennmäusen zeigen, 5 Tage nachdem bei diesen die Hautbereiche der Rücken bzw. Rückenhautbereiche mittels der Verfahren von Beispiel 7 und Vergleichsbeispiel 11 beschichtet wurden. 4-1 ist eine Photographie, in der der Rückenhautbereich mittels des Verfahrens von Beispiel 7 beschichtet ist und 4-2 ist eine Photographie, in der der Rückenhautbereich mittels des Verfahrens von Vergleichsbeispiel 11 beschichtet ist. Wie aus 4 ersichtlich ist, wird das Haarwachstum auf der Schulter in der Photographie von 4-1, in der die Beschichtung mittels des Verfahrens von Beispiel 7 durchgeführt wurde, im Vergleich zu 4-2, in der die Beschichtung mittels des Verfahrens von Vergleichsbeispiel 11 durchgeführt wurde, eindeutig beobachtet.
5 sind Photographien, die die Haarwachstumszustände der Rennmäuse zeigen, 14 Tage, nachdem bei diesen die Rückenhautbereiche mittels der Verfahren von Beispiel 7 und Vergleichsbeispiel 11 beschichtet wurden. 5-1 ist eine Photographie, in der der Rückenhautbereich mittels des Verfahrens von Beispiel 7 beschichtet ist, und 5-2 ist eine Photographie, in der der Rückenhautbereich mittels des Verfahrens von Vergleichsbeispiel 11 beschichtet worden ist.
Wie aus 5 ersichtlich ist, wird das Haarwachstum auf dem gesamten Hautbereich des Rückens, abgesehen vom zentralen Bereich, in der Photographie von 5-1 beobachtet, in der die Beschichtung mittels des Verfahrens von Beispiel 7 durchgeführt ist. Indessen wird das Haarwachstum nur auf dem zentralen und unteren Hautbereich des Rückens beobachtet und wird noch nicht im oberen Hautbereich des Rückens in der Photographie von 5-2 beobachtet, in der die Beschichtung mittels des Verfahrens von Vergleichsbeispiel 11 durchgeführt ist.
6 sind Photographien, die die Haarwachstumszustände von Rennmäusen zeigen, 25 Tage nachdem bei diesen die Rückenhautbereiche mittels der Verfahren von Beispiel 7 und Vergleichsbeispiel 11 beschichtet wurden. 6-1 ist eine Photographie, in der der Rückenbereich mittels des Verfahrens von Beispiel 7 beschichtet worden ist und 6-2 ist eine Photographie, in der der Rückenhautbereich mittels des Verfahrens von Vergleichsbeispiel 11 beschichtet ist.
Wie aus 6 ersichtlich ist, wird das Haarwachstum aus dem gesamten Rückenhautbereich in der Photographie von 6-1 beobachtet, in der die Beschichtung mittels des Verfahrens von Beispiel 7 durchgeführt ist. Indessen wird das Haarwachstum auf dem zentralen Rückenhautbereich in der Photographie von 6-2, in der die Beschichtung mittels des Verfahrens von Vergleichsbeispiel 11 durchgeführt ist, noch nicht beobachtet.
Wie aus 4 bis 6 ersichtlich ist, wird der merkliche Effekt der Förderung des Haarwachstums bei den Rennmäusen, die mit der Polyphosphorsäure der Erfindung in Beispiel 7 behandelt wurden, beobachtet, verglichen mit den Rennmäusen, die mit dem Phosphat in Vergleichsbeispiel 11 behandelt wurden.
Beispiel 8, Vergleichsbeispiele 12 und 13
Das Haar auf Rückenhautbereichen von 7 Wochen alten Rennmäusen (männlich) wurde auf einer Fläche von näherungsweise 8 cm² unter Verwendung einer elektrischen Haarschneidemaschine geschoren und vollständig mit einer Enthaarungscreme entfernt. Diese Rennmäuse wurden in drei Gruppen, die jeweils aus 5 Rennmäusen bestanden, aufgeteilt. Vaseline, enthaltend 1 Gew.-% eines feinen Pulvers einer Polyphosphorsäure (die Zahl der Polyphosphorsäurereste – 1000 oder mehr), wurde auf die enthaarten Bereiche einer Gruppe (Beispiel 8) in einer Dosis von jeweils näherungsweise 0,2 g einmal täglich aufgetragen. Weiterhin wurde nur Vaseline auf die enthaarten Bereiche einer anderen Gruppe (Vergleichsbeispiel 12) in einer Dosis von jeweils etwa 0,2 g einmal täglich aufgetragen. Die andere verbleibende Gruppe (Vergleichsbeispiel 13) war unbehandelt und wurde unter den gleichen Bedingungen wie bei den oben genannten zwei Gruppen wachsen gelassen. Um die Haarwachstumszustände zu beobachten, wurden die enthaarten Bereiche jeden Tag unter Verwendung einer Digitalkamera photographiert und die Bilder wurden aufgezeichnet. Die Photographien sind in 7 bis 10 gezeigt.
7 sind Photographien, die die Haarwachstumszustände auf den Rückenhautbereichen der Rennmäuse zeigen, wenn sie zuerst (Tag 0) mittels der Verfahren von Beispiel 8 und Vergleichsbeispiel 12 beschichtet wurden. 7-1 ist eine Photographie, in der der Rückenhautbereich mittels des Verfahrens von Beispiel 8 beschichtet ist, und 7-2 ist eine Photographie, in der der Rückenhautbereich mittels des Verfahrens von Vergleichsbeispiel 12 beschichtet ist. 7-3 ist eine Photographie, in der der Rückenhautbereich in Vergleichsbeispiel 13 unbehandelt ist. Wie aus 7 ersichtlich ist, wird noch in keinem dieser Fälle Haarwachstum beobachtet.
8 sind Photographien, die Haarwachstumszustände von Rennmäusen zeigen, 10 Tage nachdem bei diesen die Rückenhautbereiche mittels der Verfahren von Beispiel 8 und Vergleichsbeispiel 12 beschichtet wurden. 8-1 ist eine Photographie, in der der Rückenhautbereich mittels des Verfahrens von Beispiel 8 beschichtet ist. 8-2 ist eine Photographie, in der der Rückenhautbereich mittels des Verfahrens von Vergleichsbeispiel 12 beschichtet ist. 8-3 ist eine Photographie, in der der Rückenhautbereich in Vergleichsbeispiel 13 unbehandelt ist. Wie aus 8 ersichtlich ist, ist der obere Bereich der Rückenhaut schwärzlich und Haarwachstum wird in der Photographie von 8-1 geringfügig beobachtet, während der seitliche Bereich der Rückenhaut nur schwärzlich ist und Haarwachstum in der Photographie von 8-2 noch nicht beobachtet wird. Der Rückenhautbereich ist nur geringfügig schwärzlich und Haarwachstum wird in der Photographie von 8-3, in der die Rennmaus in Vergleichsbeispiel 13 unbehandelt ist, noch nicht beobachtet.
9 sind Photographien, die Haarwachstumszustände von Rennmäusen zeigen, 14 Tage nachdem bei diesen die Rückenhautbereiche mittels der Verfahren von Beispiel 8 und Vergleichsbeispiel 12 beschichtet wurden. 9-1 ist eine Photographie, in der der Rückenhautbereich mittels des Verfahrens von Beispiel 8 beschichtet ist. 9-2 ist eine Photographie, in der der Rückenhautbereich mittels des Verfahrens von Vergleichsbeispiel 12 beschichtet ist. 9-3 ist eine Photographie, in der die Rennmaus in Vergleichsbeispiel 13 unbehandelt ist. Wie aus 9 ersichtlich ist, wird Haarwachstum auf näherungsweise 80% des Rückenhautbereichs in der Photographie von 9-1 beobachtet, in der die Beschichtung mittels des Verfahrens von Beispiel 8 durchgeführt ist. Indessen sind in der Photographie von 9-2, in der die Beschichtung mittels des Verfahrens von Vergleichsbeispiel 12 durchgeführt ist, näherungsweise 80% des Rückenhautbereichs schwärzlich, aber Haarwachstum wird nicht beobachtet. Ferner ist in der Photograhie von 9-3, in der die Rennmaus in Vergleichsbeispiel 13 unbehandelt ist, der obere Rückenhautbereich nur schwärzlich und Haarwachstum wird nicht beobachtet.
10 sind Photographien, die Haarwachstumszustände von Rennmäusen zeigen, 21 Tage nachdem bei diesen die Rückenhautbereiche mittels der Verfahren von Beispiel 8 und Vergleichsbeispiel 12 beschichtet wurden. 10-1 ist eine Photographie, in der der Rückenhautbereich mittels des Verfahrens von Beispiel 8 beschichtet ist. 10-2 ist eine Photographie, in der der Rückenhautbereich mittels des Verfahrens von Vergleichsbeispiel 12 beschichtet ist.
10-3 ist eine Photographie, in der der Rückenhautbereich in Vergleichsbeispiel 13 unbehandelt ist. Wie aus 10 ersichtlich ist, wird Haarwachstum auf dem gesamten Rückenhautbereich in der Photographie von 10-1, in der die Beschichtung mittels des Verfahrens von Beispiel 8 durchgeführt ist, beobachtet. Indessen wird in der Photographie von 10-2, in der die Beschichtung mittels des Verfahrens von Vergleichsbeispiel 12 durchgeführt ist, kein Haarwachstum im unteren Rückenhautbereich be obachtet. Ferner sind in der Photographie von 10-3, in der die Rennmaus in Vergleichsbeispiel 13 unbehandelt ist, näherungsweise 80% des Rückenhautbereichs schwärzlich und Haarwachstum wird beobachtet, jedoch sind näherungsweise 20% (restlicher Bereich) davon nicht einmal schwärzlich.
Wie aus 7 bis 10 ersichtlich ist, weisen die mit der Polyphosphorsäure der Erfindung in Beispiel 8 behandelten Rennmäuse einen merklichen Effekt hinsichtlich der Förderung des Haarwachstums im Vergleich zu den Rennmäusen, die in Vergleichsbeispiel 12 mit Vaseline alleine behandelt wurden, und den unbehandelten Rennmäusen in Vergleichsbeispiel 13 auf.
Beispiel 9
Normale humane Osteoblastenzellen (hergestellt von Bio Whittaker Co.) wurden kultiviert, um so den Effekt von Polyphosphat auf die Knochendifferenzierung zu bestätigen. Die Abschätzung wurde in in vitro-Reihen unter Messung der Aktivierung der alkalischen Phosphatase, die anzeigte, wie die Knochenzellen durch Zusetzen von Polyphosphorsäure zum Differenzieren angeregt wurden, durchgeführt.
Es ist gut bekannt, dass die Aktivierung der alkalischen Phosphatase der Osteoblastenzelle ansteigt, wenn die Zelle neuen Knochen bildet. Der Anstieg dieser Aktivierung ist das Anzeichen zur Bildung von neuem Knochen. Die normalen humanen Osteoblastenzellen wurden zu 10.000 Zellen/cm² in einem 35 mm-Kulturgefäß bzw. einer 35 mm-Petrischale ausgestreut und für 48 Stunden in Osteoblasten-Basalmedium (hergestellt von Bio Whittaker Co.), umfassend fötales Rinderserum, kultiviert. Danach wurde die Kulturlösung, umfassend 1 mM Natriumpolyphosphat (mit einer durchschnittlichen Kettenlänge von 75) ausgetauscht und die Aktivierung der alkalischen Phosphatase der Zellen wurde je den Tag gemessen. Auch wurde die kultivierte Lösung, die Polyphosphorsäure umfasste, alle drei Tage nach Beginn der Messung ausgetauscht.
Die Aktivierung der alkalischen Phosphatase wurde mittels der folgenden Methode gemessen.
Nachdem die Zellen mit PBS [eine gemischte Lösung aus 20 mM NaPO₄-Pufferlösung (pH 7,0) und 150 mM NaCl] gewaschen wurden, wurden die Zellen mittels Trypsin-EDTA vom Gefäß abgelöst und sie wurden in PBS suspendiert. Die Zellen wurden mittels einer Zentrifugation abgetrennt und der Überstand wurde entfernt. Die diese Zellen umfassende Lösung (1 ml) wurde in TBS [eine gemischte Lösung von 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 150 mM NaCl] suspendiert. Nachdem die Zellen mittels einer Schallwellenquelle („sonic oscillator") in Schwingungen versetzt bzw. aufgeschlossen wurde, wurde diese Suspension wiederum zentrifugiert und der Überstand wurde als eine rohe Enzymlösung verwendet. Die Proteinkonzentration in der rohen Enzymlösung (A) wurde unter Verwendung des BIORAD-Proteinassaykits (hergestellt von BIORAD) gemessen. Als Nächstes wurde ein geeignetes Volumen der rohen Enzymlösung zu einer Substratlösung, bei der 1,2M Tris-HCl (pH 8,2) und 20n mM Dinatrium-p-nitrophenylphosphat im Verhältnis von 1:1 gemischt waren, gegeben und bei 28°C für eine festgelegte (Zahl von) Stunden (Δt) umgesetzt. Nachdem die Reaktion durch Zugabe von 2M K2HPO4 gestoppt worden war, wurde die Absorption der Reaktionslösung (B) bei 410 nm gemessen. Die Aktivierung der alkalischen Phosphatase wurde gemäß der nachstehenden Formel berechnet:
11 zeigt die Veränderung der alkalischen Phosphatase hinsichtlich Natriumpolyphosphat mit der Kultivierungszeit.
Vergleichsbeispiel 14
Natriumphosphatpufferlbsung wurde anstelle von Natriumpolyphosphat (mittlere Kettenlänge von 75), verwendet in Beispiel 9, verwendet. Die Aktivierung der alkalischen Phosphatase wurde durch Zusetzen der gleichen Konzentration an Natriumphosphat zur Umwandlung von Polyphosphorsäure in Phosphorsäure in der Kulturlösung und Kultivieren für eine festgelegte Zeit gemessen.
11 zeigt die Änderung der Aktivierung der alkalischen Phosphatase hinsichtlich Natriumphosphatpufferlösung mit der Kultivierungszeit.
Wie aus 11 ersichtlich ist, erhöhten die Zellen von Beispiel 9, behandelt mit Polyphosphorsäure, die Enzymaktivierung nach einer Woche bemerkenswert. Jedoch erhöhten die Zellen von Vergleichsbeispiel 14, behandelt mit Phosphorsäurepufferlösung, die Enzymaktivierung nicht bemerkenswert. D.h., dass der Zusatz von Polyphosphorsäure zu den Zellen eine Beschleunigung zur Differenzierung der Knochenzellen (zum Bilden des Knochens) zeigt.
Beispiel 10 und Vergleichsbeispiele 15 bis 18
Humane dermale Haarpapillenzellen („human hair dermal papilla cells") wurden in eine 96-Well-Mikrotiterplatte bei einer Konzentration von 1000 Zellen/Well inokuliert und mit Papillenzellen-Wachstumsmedium (PCGM) (Toyobo Co.), enthaltend 1% fötales Kälberserum (FCS) und 1% bovinen Hyophysenextrakt (BPE), bei 37°C für 24 Stunden inkubiert. Nachdem das Medium durch Absaugung entfernt worden war, wurden die an die Platte gebundenen Zellen mit Phosphat gepufferter physiologischer Salzlösung gewaschen. PCGM, enthaltend 0,5% FCS, wurde dazu zugegeben und die Inkubation wurde für 24 Stunden weiter fortgesetzt. Nach Abschluss der Inkubation wurde das Medium durch Absaugung entfernt und durch PCGM, enthaltend 0,5% FCS und 0,67 mM Polyphosphorsäure, ersetzt. Das nachfolgende Zellwachstum wurde mittels der MTS-Methode (CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Technical Bulletin, #TB112, Promega Corporation) nach 72-stündiger Inkubation gemessen. Als Vergleichsbeispiele wurde das Zellwachstum durch Inkubieren mit 0,5% FCS-enthaltendem PCGM (Vergleichsbeispiel 15), mit 0,5% FCS und 0,67 mM Phosphatpuffer-enthaltendem PCGM (Vergleichsbeispiel 16), mit 0,5% FCS und 50 mM Pentadecansäure-enthaltendem PCGM (Vergleichsbeispiel 17) und mit 0,5% FCS und 500 nM Pantadecansäure-enthaltendem PCGM (Vergleichsbeispiel 18) überwacht. Das Zellwachstum nach 72-stündiger Inkubation bei verschiedenen Bedingungen wurde in 12 gezeigt. Die Zellwachstumsrate bei Inkubation mit Polyphosphorsäure ist etwa 1,4-mal höher als die des Zellwachstums bei Inkubation mit 0,5% Serum-enthaltendem PCGM (Vergleichsbeispiel 15). Beim Inkubieren mit Phosphatpuffer (Vergleichsbeispiel 16) oder Pentadecansäure (Vergleichsbeispiele 17, 18) wurde keine offensichtliche Wachstumsstimulation beobachtet. In diesem Beispiel wurde die Polyphosphorsäure in Form eines Natriumsalzes verwendet und ihre mittlere Kettenlänge (die Zahl der Phosphorsäuren) war 65. Ferner war auch der verwendete Phosphatpuffer in Form eines Natriumsalzes und sein pH war ebenfalls, wie im Medium, auf 7,0 eingestellt.

Claims

In vitro-Verwendung einer linearen kondensierten Polyphosphorsäure, wiedergegeben durch die Formel: H_(n+2) P_nO_(3n+1) wobei n eine ganze Zahl zwischen 5 und 5.000 ist, zusammen mit einem Zellwachstumsfaktor als Zellwachstumsbeschleuniger bei Tierzellen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Polyphosphorsäure ein Polyphosphat ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Zelle Haarmatrixzellen ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Zelle Knochenzellen ist.
Zellzüchtungsverfahren, umfassend die Stufe des Zusetzens einer linearen kondensierten Polyphosphorsäure, wiedergegeben durch die Formel: H_(n+2) P_nO_(3n+1) wobei n eine ganze Zahl zwischen 5 und 5.000 ist, zu einem Zellwachstumsmedium für Tierzellen, das einen Zellwachstumsfaktor enthält.
Zellzüchtungsverfahren, wie in Anspruch 5 beansprucht, wobei die Konzentration der einem Medium für Tierzellen zugesetzten Polyphosphorsäure zwischen 1 nM und 100 nM ist.
Zellzüchtungsverfahren, wie in Anspruch 5 beansprucht, wobei die Polyphosphorsäure einem Medium für Tierzellen zugesetzt wird, das 0 bis 10% eines Serums enthält.
Zellzüchtungsverfahren, wie in Anspruch 5 beansprucht, wobei die Polyphosphorsäure dem Medium für Tierzellen, das einen physiologisch aktiven Faktor enthält, zugesetzt wird.
Zellzüchtungsverfahren, wie in Anspruch 5 beansprucht, wobei die Zellen in einer Zellkultivierungsvorrichtung („cell cultivator") gezüchtet werden, die die lineare kondensierte Polyphosphorsäure enthält oder damit beschichtet ist.
Verwendung einer linearen kondensierten Polyphosphorsäure, wiedergegeben durch die Formel: H_(n+2) P_nO_(3n+1) wobei n eine ganze Zahl zwischen 5 und 5.000 ist, zusammen mit einem Zellwachstumsfaktor zur Herstellung eines Medikaments zur Beschleunigung der Heilung von Verletzungen und Verbrennungen, Therapie peridontaler Erkrankungen und Heilung nach einem chirurgischen Eingriff.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Polyphosphorsäure ein Polyphosphat ist.