JP3991345B2

JP3991345B2 - 細胞増殖促進剤を用いた細胞増殖方法

Info

Publication number: JP3991345B2
Application number: JP24241698A
Authority: JP
Inventors: 肇一柴
Original assignee: Nipro Corp
Current assignee: Nipro Corp
Priority date: 1998-08-28
Filing date: 1998-08-28
Publication date: 2007-10-17
Anticipated expiration: 2018-08-28
Also published as: JP2000069961A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は細胞増殖方法に関し、詳しくは細胞増殖促進剤であるポリリン酸を使用して細胞を増殖する方法である。
【０００２】
【従来の技術】
一般に動物細胞をインビトロで培養する際には、アミノ酸、ビタミン、糖、無機塩類からなる基礎培地に細胞増殖因子として10〜20％の血清を添加した培地が用いられる。しかしながら、血清は大量生産ができず非常に高価である上に、その組成は個体差（ロット差）が大きい。１ロットの量が限られているために、ロット変更のたびにロットチェック、培養条件の調製や管理等の煩雑な操作が必要となる。
【０００３】
一般的に培養細胞を用いて物質（酵素を含む各種蛋白質、生理活性物質、ワクチン、ウイルス等）を生産する場合には血清が必要となることが殆どであり、使用する血清量を最小限にとどめる、または無血清培地を用いる技術の開発が進められている。無血清培地の例としては、血清の代わりに、基礎培地内に各種細胞成長因子やインシュリンなどのホルモンを添加して細胞の増殖促進を促すものであるが、血清の代わりに添加する成長促進因子やホルモンが高価であることから、培養細胞の維持にコストが嵩むのが実状である。また、血清中には、ウイルス、プリオンなどの病原体が混入している可能性もあり、そういった病原体による汚染も問題となる。
【０００４】
また、外傷や火傷、外科手術に伴う創傷の治療には種々の薬剤が使用されているが、細胞増殖を促進することによって組織修復を促す薬剤はなく、抗生物質のように細菌の感染を防御する事によって、間接的に治癒を促進している状態である。火傷の治療においては、組織の再生を促し、治癒の促進に有効な人工皮膚も実用化されているが、コラーゲンなどの天然タンパク質を除いて、人工皮膚の成分として細胞増殖の促進に積極的に働き、治癒を促進する物質は知られていない。また歯槽膿漏などの治療において、歯周組織再生因子などのタンパク質を含む天然物質を使用した歯周病治療材が開発されつつあるが、未だ実用化されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、かかる従来の課題を解決するためになされたものであって、本発明の目的は、インビトロで培養細胞を用いて物質を生産する際に、培養細胞の増殖を促進しうる培地および細胞増殖材料を使用して廉価で安全に効率的に細胞培養および細胞増殖促進を行うことである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は動物細胞用培地にポリリン酸を添加した培地で、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）要求性の細胞を培養することを特徴とする細胞増殖方法である。
更に、本発明は前記細胞増殖方法において、血清が０〜１０％添加された動物細胞用培地にポリリン酸を添加することを特徴とする細胞増殖方法である。
更にまた、本発明は前記細胞増殖方法において、細胞増殖因子または／および種々の生理活性因子が添加された動物細胞用培地にポリリン酸を添加することを特徴とする細胞増殖方法である。
また、本発明は前記細胞増殖方法において、ポリリン酸が含有または被覆されてなる細胞培養容器で線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）要求性の細胞を増殖することを特徴とする細胞増殖方法である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
ポリリン酸は、オルトリン酸が脱水縮合して得られる直鎖縮合ポリリン酸が挙げられ、特に一般式が（Ｐ_ｎＯ_３ｎ＋１Ｈ_ｎ＋２）で表され、２個以上のＰＯ_４四面体が頂点の酸素原子を共有して直鎖状に連なった構造をした直鎖縮合ポリリン酸が挙げられる。ポリリン酸の水酸基の水素が金属と置換した分子構造をしたものがポリリン酸塩である。金属としてはナトリウム、カリウム等が挙げられる。ｎは１５〜２０００である。ｎが１のリン酸においては本発明の効力はなかった。本発明の細胞増殖促進剤はポリリン酸に他の添加剤を含有していてもよい。
【０００８】
ポリリン酸は、細胞自体が少量分泌しその細胞自身の増殖を促進させる細胞増殖因子を安定化、もしくは細胞と細胞増殖因子の結合を強固なものにする働きがある。インビトロにおいて培養細胞はその培養液内に細胞増殖因子を微量に分泌しているが、通常の培養条件では、外から血清などの形で細胞増殖因子の混合物を補う必要があり、血清のない状態では細胞の効率的な増殖がみられない。ポリリン酸を動物細胞培養用培地に添加することにより、通常血清のない状態では増殖できない細胞が血清を含まない培地においても増殖可能となる。ポリリン酸のもつこの特質を利用して、無血清または血清濃度の低い培地を用いても、培養細胞を増殖させることができる。このとき用いられるポリリン酸濃度は、培地に１nM〜100 mMであり、好ましくは10nM〜2mM である。
【０００９】
動物細胞用培地にポリリン酸を加えた無血清培地、または動物細胞用培地にポリリン酸と少量の血清を加えた培地が使用される。培地に添加される血清量は、血清を０〜10重量％、好ましくは０〜５重量％である。本発明で使用される培地は種々の培養細胞に適応でき、肝臓、腎臓、肺、胃、脾臓などの各種臓器由来の初代培養細胞または株化細胞、神経、筋肉、皮膚、骨などの組織由来の初代培養細胞または株化細胞、種々のガン細胞にも適応できる。この場合の細胞は、例えば、上皮角化細胞、メラノサイト、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、毛母細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、羊膜由来細胞、胎児腎由来細胞、胎児肺由来細胞、株化細胞としてはHeLa細胞、FL細胞、KB細胞、HEp-２細胞、WI−38細胞、MA104 細胞、BSC-１細胞、Vero細胞、CV-1細胞、BHK-21細胞、Ｌ細胞等が挙げられ、特に線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）要求性の細胞株や、ヒト正常上皮線維芽細胞、ヒト正常歯肉線維芽細胞、ヒト正常上皮細胞、マウス由来細胞株等が好適に用いられる。
【００１０】
また、ポリリン酸が安定化もしくは細胞との結合を強固にしその機能を高める細胞増殖因子としては、種々の増殖因子が挙げられるが、中でも、β-FGF (塩基性線維芽細胞増殖因子）、α-FGF (酸性線維芽細胞増殖因子）、FGF-7 （角質細胞増殖因子）、PDGF (血小板由来増殖因子）、EGF （上皮増殖因子）、血管内皮増殖因子、プレイオトロフィン等が好ましい。これらの細胞増殖因子は単独または複数でポリリン酸と混合され、動物細胞培養用培地に添加されることにより、細胞増殖因子のみ添加した場合に比べて高い増殖促進能を示す。この時用いられる増殖因子濃度はその種類にも依存し 0.1〜50ng/ml である。
【００１１】
ポリリン酸によってその機能が促進されうる増殖因子以外の物質としては、サイトカイン、走化因子、ホルモン、分化誘導因子、形態形成因子、血管新生因子、血管新生抑制因子、造血因子、TGF-βスーパーファミリー、TNF 、INF など細胞外から細胞に働きかけて細胞の生理活性を調節する物質全般（以下、生理活性因子という）が挙げられる。これらの生理活性因子は単独または複数でポリリン酸と混合され、動物細胞培養用培地に添加することによっても培養細胞の増殖のみでなく、細胞の生理活性を調節することができる。細胞増殖因子を含むこれらの物質は市販されているものを用いればよい。生理活性因子の添加量は、その種類に依存するが１pg／ml〜１mg／mlが好ましい。
【００１２】
本発明において用いられる培地としては、糖類、アミノ酸、ビタミン類、塩類等を含有する、通常動物細胞の培養に用いられるものいずれであってもよい。例えば、イーグルMEM 培地、培養する細胞に適するように、イーグルMEM 培地のアミノ酸、ビタミン、無機塩等を新しく加えるかあるいは増減したイーグルMEM改変培地、ダルベッコ改変イーグル培地、イスコフ培地、RPMI1640培地、ハムF10 培地、ハムF12 培地、MCDB131 培地、MCBD151 培地、MCBD152 培地、MCBD153培地、MCBD201 培地、MCBD302 培地、MEDIUM199 等が挙げられる。また本発明の培地には通常細胞培養に用いられる添加物、例えば、抗生物質、抗かび剤、緩衝剤、色素、寒天等の他の因子を添加してもよい。
【００１３】
また、本発明で用いられる細胞培養容器としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリカ−ボネ−ト、アセチルセルロ−ス、ポリアクリレ−ト等のプラスチックまたはガラス製のペトリ皿、シャ−レ、ボトル、フラスコ、試験管、プレ−ト、ビ−カ−、中空糸等が挙げられ、これらの容器材料に予めポリリン酸が含有されて容器に成形されるか、容器表面がポリリン酸を含有する被膜で覆われてなっている。
【００１４】
またポリリン酸による生理活性因子の安定化もしくは細胞と生理活性因子の結合の安定化は、培養細胞のみならずヒトを含む動物細胞（組織）にも適応可能である。組織中の細胞が分泌する微量の生理活性因子の働きをポリリン酸が安定化することにより、組織中の細胞の増殖や生理活性を活発にし、組織の修復再生等に有効である。
【００１５】
【実施例】
以下、実施例にて本発明の一例を説明する。
【実施例１】
【比較例１〜２】
ヒト正常真皮線維芽細胞（ＨＦ）を5000個ずつ96穴マイクロタイタープレートに撒き10％血清を含んだイーグルMEM 培地で24時間、37℃で培養した。培地を吸引してからプレートに接着した細胞をPBS(リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、血清を含まないイーグルMEM 培地を加え、さらに24時間培養した。培養後に培地を吸引除去し、0.67 mM ポリリン酸をイーグルMEM 培地に加えた培養液に交換し、その後の細胞増殖をMTS 法(CellTiter 96 Non-Radioactive Cell ProliferationAssay Technical Bulletin, #TB112, Promega Corporation)により測定した。比較例として、0.67 mM リン酸緩衝液を含むイーグルMEM 培地（比較例１）、滅菌水のみを加えたイーグルMEM 培地（比較例２）で同様に培養した細胞数の経時変化を測定した。その結果を図１に示す。本実施例においてポリリン酸（polyphosphate glass, Sigma社製）はナトリウム塩を用い、その平均鎖長（リン酸数）は65であった。また、リン酸緩衝液も同じくナトリウム塩であり培地と同様のpH 7.0に調節したものを用いた。
【００１６】
図１は実施例１で培養した細胞数の経時変化を示したもので、ヒト正常真皮線維芽細胞（ＨＦ）の細胞増殖の経時変化をグラフにしたものである。リン酸緩衝液を含む培地（比較例１）、及び滅菌水のみを含む培地（比較例２）で培養した細胞は、培養後細胞数の減少が見られた後、24時間以降ほとんど増殖しなかったのに対して、ポリリン酸を含む培地で培養した実施例１は24時間以降徐々に増殖した。ポリリン酸による増殖促進効果は培養開始後100 時間にまで及んだ。
【００１７】
【実施例２】
【比較例３〜４】
実施例１と同様にして、ヒト正常歯肉線維芽細胞を用いて実験を行った。培地としてダルベッコ改変イーグルMEM 培地を用いた他は、実施例１と全く同じ操作で細胞増殖を観察した。比較例として、0.67 mM リン酸緩衝液を含むイーグルMEM 培地（比較例３）、滅菌水のみを加えたイーグルMEM 培地（比較例４）で同様に培養した細胞数の経時変化を測定した。その結果を図２に示す。
図２は実施例２の結果を示したもので、ヒト正常歯肉線維芽細胞の細胞増殖を表したグラフである。図１で示したＨＦの増殖と同様に、リン酸緩衝液を含む培地（比較例３）および滅菌水のみを含む培地で培養した細胞（比較例４）は培養後細胞数が減少し、２４時間以後顕著な増殖が見られなかった。これに対して、ポリリン酸を含む培地で培養したものは、培養開始直後の細胞数の減少が見られず、時間をおって徐々に増殖した。ポリリン酸による増殖促進効果は培養開始後70〜100 時間にまで及んだ。
【００１８】
【実施例３】
【比較例５〜６】
ヒト正常真皮線維芽細胞（ＨＦ）を2.5X10⁵個ずつ12穴マイクロタイタープレートに撒き10％血清を含んだイーグルMEM 培地で24時間、37℃で培養した。培地を吸引してからプレートに接着した細胞をPBS(リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、血清を含まないイーグルMEM 培地を加え、さらに24時間培養した。培養後に培地を吸引し、0.67 mM ポリリン酸をイーグルMEM 培地に加えた培養液に交換し、その後の細胞増殖を細胞数をカウントすることによって測定した。50時間培養後の生細胞数を表１に示す。比較例として、0.67mMリン酸緩衝液を含むイーグルMEM 培地（比較例５）、滅菌水のみを加えたイーグルMEM 培地（比較例６）で培養する群を設けた。本実施例において実施例１と同様に、ポリリン酸はナトリウム塩を用い、その平均鎖長（リン酸数）は65であった。また、リン酸緩衝液は同じくナトリウム塩であり培地と同様のpH 7.0に調節したものを用いた。
【００１９】
【表１】

【００２０】
表１は実施例３の結果、つまりＨＦの細胞増殖を示したものである。実施例１でMTS 法を用いて計測した時と同様に、リン酸緩衝液を含む培地（比較例５）、および滅菌水のみを含む培地（比較例６）で培養した細胞は培養後細胞数の増加が見られなかったが、ポリリン酸を含む培地で培養したものは、50時間培養後の細胞数が約2.4 倍にまで増殖した。
【００２１】
【実施例４】
【比較例７〜８】
マウス由来の細胞株、Balb 3T3を5000個ずつ96穴マイクロタイタープレートに撒き10％血清を含んだイーグルMEM 培地で24時間、37℃で培養した。培地を吸引除去してからプレートに接着した細胞をPBS(リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、血清を含まないイーグルMEM 培地を加え、さらに24時間培養した。培養後に培地を吸引除去し、0.67mMポリリン酸を含むイーグルMEM 培地に交換し、その後の細胞増殖をMTS 法によって測定した。30時間培養後の細胞数を、10％血清を含む培地（比較例７）での30時間培養後の細胞数を１としたときの相対値で算出した値を表２に示す。比較例８として、滅菌水のみを含むイーグルMEM 培地での30時間培養後の細胞増殖率を表２に示す。本実施例においてポリリン酸はナトリウム塩を用い、その平均鎖長（リン酸数）は65であった。また、リン酸緩衝液は同じくナトリウム塩であり培地と同様のpH 7.0に調節したものを用いた。
【００２２】
【実施例５〜６】
【比較例９〜１０】
実施例４と同様にマウス由来の細胞株、Balb 3T3を使用して実験を行った。0.67mMポリリン酸の代わりに、0.67mMポリリン酸と10ng/ml の酸性線維芽細胞増殖因子（α-FGF）を混合したイ−グルMEM 培地で培養した（実施例５）。また、ポリリン酸の代わりに、0.67mMポリリン酸と10ng/ml の塩基性線維芽細胞増殖因子（β-FGF) を混合したイ−グルMEM 培地で培養した（実施例６）、および比較例として、10ng/ml の酸性線維芽細胞増殖因子（α-FGF）のみを加えたイ−グルMEM 培地（比較例９）、10ng/ml の塩基性線維芽細胞増殖因子（β-FGF) のみを加えたイ−グルMEM 培地で培養した（比較例10）30時間培養後の細胞数を、10％血清を含む培地（比較例７）での30時間培養後の細胞数を１としたときの相対値で算出した値を表２に示す。
【００２３】
【表２】

【００２４】
表２で明らかなように培養30時間後に、α-FGFとポリリン酸を含む培地ではα-FGFのみを含む培地に比べ、約1.5 倍の増殖が見られた。また、β-FGFとポリリン酸を含む培地においても、β-FGFのみを含む培地に比べて約1.6 倍の増殖が見られた。また、ポリリン酸のみ含む培地においても、増殖の促進効果は見られたが、細胞増殖因子とポリリン酸を組み合わせた時にもっとも高い増殖促進効果が得られた。
【００２５】
【発明の効果】
本発明のポリリン酸含有培地および培養器具は、無血清条件もしくは微量の血清または生理活性因子を含む状態で、培養細胞の増殖を促進する性質をもち、培養細胞を用いた種々の物質生産に応用できる。また、ポリリン酸を含んだ細胞増殖促進剤および医薬品組成物は組織修復促進能をもち、外傷、火傷の治癒促進、歯周病治療、手術後の治癒促進などに利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ポリリン酸によるヒト正常真皮線維芽細胞の増殖経時変化
【図２】ポリリン酸によるヒト正常歯肉線維芽細胞の増殖経時変化

Claims

一般式
（Ｐ_ｎＯ_３ｎ＋１Ｈ_ｎ＋２）〔式中、ｎは１５〜２０００を示す〕で表される、オルトリン酸が脱水縮合して得られる直鎖縮合ポリリン酸を添加した動物細胞用培地で、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）要求性の細胞を培養することを特徴とする細胞増殖方法。
血清が０〜１０％添加された動物細胞用培地にポリリン酸を添加することを特徴とする請求項１記載の細胞増殖方法。
細胞増殖因子が添加された動物細胞用培地にポリリン酸を添加することを特徴とする請求項１記載の細胞増殖方法。
生理活性因子が添加された動物細胞用培地にポリリン酸を添加することを特徴とする請求項１記載の細胞増殖方法。
一般式
（Ｐ_ｎＯ_３ｎ＋１Ｈ_ｎ＋２）〔式中、ｎは１５〜２０００を示す〕で表される、オルトリン酸が脱水縮合して得られる直鎖縮合ポリリン酸が含有または被覆されてなる細胞培養容器で線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）要求性の細胞を増殖することを特徴とする細胞増殖方法。