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Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zur Förderung des Haarwachstums.
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Stand der Technik
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Menschliches Haar hat wichtige physiologische und soziale Funktionen. Die Hauptfunktionen der Haare bestehen darin, warm zu halten, vor Sonne zu schützen, Flüssigkeit umzuleiten und Schweiß zu verdunsten. Haar ist in der Lage, Hautareale zu schützen und äußere mechanische Einwirkungen abzupuffern. Durch Stylen der Haare kann eine Person seine Persönlichkeit stärker zum Ausdruck bringen, seine Gesichtsform, Kopfform, Körperform und sein Temperament betonen und mehr Charme ausstrahlen.
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Haare werden in den Haarfollikeln gebildet. Menschliche Haarfollikel befinden sich in der Dermis und sind mit den Haaraufrichtemuskeln verbunden. An der Unterseite der Haarfollikel sind zur Versorgung mit Nährstoffen Blutgefäße vorgesehen. Normalerweise setzt sich der Prozess der Haarproduktion immer weiter fort. Allerdings ist das Tempo im modernen Sozialleben schnell und die Konkurrenz in der Arbeitsumgebung hart, was zu anhaltendem Stress, mentalem Stress und sogar zu einem Zustand, in dem Betroffene permanent die ganze Nacht aufbleiben, führt. Die Gesundheit der Haarfollikel kann aufgrund endokriner Störungen stark geschädigt werden, was wiederum Haarausfall verursacht.
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Es gibt zwar viele Produkte, wie Shampoos und Haarwässer, auf dem Markt, bei denen behauptet wird, diese besäßen eine Haarwuchsfunktion, jedoch dienen solche Produkte nur zur Pflege der Kopfhaut und sie haben keine erkennbare Wirkung auf das Haarwachstum. Deshalb besteht in der Industrie immer noch eine starke Nachfrage nach Zusammensetzungen, die das Haarwachstum tatsächlich fördern können und dabei sicher für den menschlichen Körper und nicht reizend sind.
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Aufgabe der Erfindung
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Es ist deshalb Aufgabe der Erfindung, die genannte Nachfrage zu befriedigen.
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Lösung der Aufgabe
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In den letzten Jahren haben viele medizinische Studien gezeigt, dass Stammzellen das Potenzial zur Reparatur von Geweben oder Organen haben und in einer Vielzahl von Anwendungen wie der Behandlung von Krebs, der Reparatur von Organen, der Entwicklung neuer Medikamente und der Herstellung künstlicher Organe eingesetzt werden können. Insbesondere wurde festgestellt, dass Stammzellen verschiedene Wachstumsfaktoren, Zytokine und Chemokine absondern können. Diese kleinen Molekülpeptide können geschädigte Zellen reparieren, wodurch die Überlebensrate erhöht wird, das Nervenwachstum gefördert wird und Entzündungsreaktionen gehemmt werden. Daher ist die von Stammzellen sezernierte extrazelluläre Sekretion ein zunehmend beliebter werdendes medizinisches Material mit großem Entwicklungspotential.
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Der Erfinder hat herausgefunden, dass das konditionierte Kulturmedium (conditioned medium) der von Mesenchymalen Stammzellen (mesenchymal stem cells; MSCs) stammenden Kulturen (culture), wie z. B. das konditionierte Kulturmedium der von Mesenchymalen Stammzellen der Haut (skin-derived mesenchymal stem cells; SMSCs) stammenden Primärkultur (primary culture), die Fähigkeit besitzt, das Haarwachstum zu fördern, und dass durch sie ferner die Haarqualität und das Haarvolumen verbessert werden können.
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Zur Lösung der Aufgabe stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung zur Förderung des Haarwachstums bereit, die umfasst:
- - einen von einer oder mehreren Kulturen der Mesenchymalen Stammzellen abgeleiteten Überstand, in dem die Kulturen durch Kultivieren der Mesenchymalen Stammzellen in einem Kulturmedium für mindestens 3 Stunden erhalten und die Kulturen dann zur Gewinnung des Überstands verarbeitet werden; und
- - einen pharmakologisch oder kosmetisch akzeptablen Träger.
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Figurenliste
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Die zur Erläuterung der Ausführungsbeispiele verwendeten Zeichnungen zeigen in
- Fig. 1A bis 1F Säulendiagramme, die die Mengen von VEGF, von HGF, von KGF, von PDGF, von EGF und von TGF-β in den Überständen der Mesenchymalen Stammzellen der Haut zeigen und in
- 2 den Haarwachstumseffekt, der durch Auftragen der erfindungsgemäßen Zusammensetzung auf die Kopfhaut einer männlichen Testperson erhalten wird, wobei das linke Bild die Vortestbedingungen und das rechte Bild das Ergebnis eines zweimonatigen Tests zeigt.
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Detaillierte Beschreibung der Ausführungsbeispiele
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In der vorliegenden Beschreibung sind unter dem Begriff „Mesenchymale Stammzelle“ oder dessen Abkürzung „MSC“ aus dem adulten Stromagewebe (adult stromal tissues) stammende multipotente Stammzellen (multipotent stem cells) zu verstehen. Dieses adulte Stromagewebe umfasst, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Knochenmark (bone marrow), Nabelschnur (umbilical cord), Amnionmembran (amnion), Fruchtwasser (amniotic fluid), Fettgewebe (adipose tissue), Zahnpulpa (dental pulp), Skelettmuskulatur (skeletal muscle) und Haut. MSC verfügt über die Fähigkeit zur Selbsterneuerung (self-renewal) und die Fähigkeit, sich in Zellen der mesenchymalen Zelllinie (cells of mesenchymal lineages) zu differenzieren. Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung stammen die MSCs aus der Haut, d. h. es handelt sich um Mesenchymale Stammzellen der Haut (SMSCs). Im Vergleich zu anderen MSCs haben SMSCs die Vorteile, dass die Quellen reichlich sind und das Material einfach zu erhalten ist, dass die Anzahl und die Reinheit der isolierten Zellen hoch sind, und dass die Eigenschaften der Stammzellen nach mehrmaligem Passieren (passages) aufrechterhalten bleiben. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten MSCs können von Menschen, Ratten, Mäusen, Schafen, Schweinen, Hunden, Katzen, Pferden und nichtmenschlichen Primaten (non-human primates), wie Affen, Gorillas und Schimpansen, gesammelt werden. Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel stammen die MSCs von Menschen.
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Da MSCs mit zunehmender Anzahl der Subkultivierungen allmählich ihre Vitalität verlieren, werden üblicherweise MSCs der ersten bis zehnten Generation verwendet. Vorzugsweise werden MSCs der zweiten bis sechsten Generation zur Herstellung der Überstände der MSC-Kulturen verwendet.
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Die Überstände der MSC-Kulturen werden in der Regel wie folgt erhalten. Aus dem Gewebe werden Stammzellen isoliert und dann für eine Zeitdauer in einem geeigneten Kulturmedium inkubiert, anschließend werden die Überstände gesammelt. Im konkreten Beispiel der Gewinnung von Überständen aus SMSC-Kulturen wird von der Haut des Spenders zunächst ein Hautgewebe chirurgisch gewonnen, anschließend wird das Gewebe mit Hilfe von Kollagenase verdaut, wobei das durch Zentrifugation ausgefällte Zellpellet mit einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung (phosphate-buffered saline) gewaschen wird und dann die Zellen in einem Kulturmedium kultiviert werden und dann zur Gewinnung der SMSCs die anderen Zellen entfernt werden. Die gewonnenen MSCs werden dann in einem geeigneten Kulturmedium für mindestens 3 Stunden, vorzugsweise für 3 bis 120 Stunden, bevorzugter für 24 bis 96 Stunden, beispielsweise für 72 bis 96 Stunden, kultiviert.
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Unter dem oben erwähnten Begriff „Kulturmedium“ ist jedes flüssige Kulturmedium, das in vitro Kulturen zur Unterstützung von menschlichen oder tierischen Zellen enthält, zu verstehen. Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist das Kulturmedium ein Basalmedium, das basische Nährstoffe wie anorganische Salze, Aminosäuren und Vitamine enthält und keinen Wachstumsfaktor enthält. Beispiele für das Basalmedium, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen Basal Medium Eagle (BME), Minimum Essential Medium (MEM), Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Nährstoffmixtur F-10 (HAM's F-10), Nährstoffmixtur F-12 (HAM's F-12) oder eine Kombination davon, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. All diese Kulturmedien können leicht hergestellt oder über den Handel bezogen werden. Bei einem bevorzugteren Ausführungsbeispiel ist das Basalmedium DMEM. Bei einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel ist das Kulturmedium ein mit Serum ergänztes Basalmedium. Unter dem Begriff „Serum“ ist eine flüssige Zubereitung zu verstehen, die von menschlichem oder tierischem Blut stammt, in der die Blutzellen, Fibrinogen und Fibrin allesamt entfernt sind, um so Nährstoffe für das Zellwachstum bereitzustellen. Insbesondere ist das Serum ein Serumpräparat, das von Menschen oder Tieren, die in seuchenfreien Gebieten (disease-free areas) leben, stammt. Das Serum umfasst Humanserum, fetales Kälberserum (FKS), Serum von neugeborenen Kälbern (newborn calf serum), Serum von erwachsenen Rindern (calf serum) oder andere Tierseren, wie Serumprodukte von Pferden und Kamelen, jedoch ist das im Rahmen der Erfindung verwendbare Tierserum nicht darauf beschränkt. Die Menge des im Kulturmedium verwendeten Serums liegt im Bereich zwischen etwa 0,5 Vol.-% bis 20 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen des Kulturmediums. Bei Bedarf kann das Kulturmedium weiter mit Antibiotika, Fungiziden (fungicides), Antioxidantien usw. ergänzt werden.
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Unter dem Begriff „Kultivieren“ ist die Aufrechterhaltung von MSCs unter In-vitro-Bedingungen, die das Wachstum und Überleben von MSCs begünstigen, zu verstehen. Die zum Kultivieren von MSCs verwendeten Mittel sind herkömmliche Routinemittel auf dem technischen Gebiet, auf das sich diese Erfindung bezieht. Normalerweise beträgt die optimale Temperatur für die Kultivierung etwa 35 °C bis 37 °C. Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel werden die Zellen in einem Kohlendioxid-Inkubator kultiviert. Der Kohlendioxid-Inkubator wird üblicherweise auf eine konstante Temperatur (beispielsweise 37 °C), einen stabilen CO2-Gehalt (beispielsweise 5 %), einen konstanten pH-Wert (beispielsweise pH 7,2 bis 7,4) und eine hohe relative Feuchtigkeit (beispielsweise 95 %) eingestellt, um die Wachstumsumgebung von Zellen im Organismus zu simulieren.
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Nach der Kultivierung werden die MSC-Kulturen zur Entfernung von Zell- und Feststoffverunreinigungen mittels herkömmlicher Verfahren wie Zentrifugation oder Filtration verarbeitet. Die gesammelte wässrige Fraktion ist der Überstand der MSC-Kulturen. Der Überstand kann zur Entfernung von Proteasen und toxischen Chemikalien weiteren Reinigungsschritten unterzogen werden. Der Überstand der MSC-Kulturen oder dessen gereinigtes Produkt kann durch ein herkömmliches Gefriertrocknungsverfahren auch zu einem lyophilisierten Pulver (lyophilized powder) weiterverarbeitet werden.
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Mit dem Überstand kann die Wirkung der Förderung des Haarwachstums erzielt werden. Ohne an irgendeine Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass während der In-vitro-Kultur MSCs bestimmte Substanzen im Kulturmedium freisetzen, die das Haarwachstum fördern und sogar die Regeneration der Haarfollikel unterstützen können, wodurch die Haarqualität und das Haarvolumen verbessert werden können. Durch das folgende Ausführungsbeispiel 1 wird bestätigt, dass der Überstand der SMSC-Kulturen reich an vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (vascular endothelial growth factor; VEGF), epidermalem Wachstumsfaktor (epidermal growth factor; EGF), Hepatozyten-Wachstumsfaktor (hepatocyte growth factor; HGF), Keratinozyten-Wachstumsfaktor (Keratinocyte growth factor; KGF), transformierendem Wachstumsfaktor-β (transforming growth factor-β; TGF-β) und Thrombozyten-Wachstumsfaktor (platelet-derived growth factor; PDGF) ist. Es ist bekannt, dass durch VEGF die lokale vaskuläre Permeabilität erhöht, die Mikrozirkulation der Haut verbessert, das Haarwachstum wirksam gefördert, die Anzahl der Haarfollikel erhöht und der Haardurchmesser vergrößert werden kann. Durch EGF kann die Regeneration der Hautzellen und die Bildung von Kollagen gefördert werden. HGF ist förderlich für die Restrukturierung und Regeneration des Gewebes, um die Haarfollikelproliferation zu stimulieren. Durch KGF können die Proliferation und Differenzierung von Epithelzellen und die Kollagenproduktion gefördert werden, um somit die Haarfollikelproliferation zu stimulieren. Durch TGF-β kann die Fibroblastenproliferation stimuliert und die Kollagensynthese bewirkt werden. Durch PDGF kann die Regeneration der Hautzellen und die Bildung von Kollagen gefördert und somit für die Haarfollikel eine lange Haarwachstumsphase erreicht werden.
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Bezüglich der Erfindung ist unter „pharmakologisch oder kosmetisch akzeptabler Träger“ eine inerte Substanz, die als Träger für den Überstand der MSC-Kulturen verwendet wird, welche für die Applikationsstelle (z. B. Haut) nicht toxisch, reizend, pyrogen, antigen und hämolytisch ist und keine wesentliche pharmakologische Aktivität besitzt und die vorteilhaften Wirkungen des Überstands der MSC-Kulturen nicht behindert, zu verstehen. Üblicherweise beträgt die Menge des pharmakologisch oder kosmetisch akzeptablen Trägers bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung etwa 1 % bis etwa 99,9 %, vorzugsweise etwa 50 % bis etwa 99 %. Der anwendbare Typ des pharmakologisch oder kosmetisch akzeptablen Trägers hängt von der Form der Zusammensetzung ab.
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Die erfindungsgemäße Zusammensetzung zur Förderung des Haarwachstums kann in jeder geeigneten Form ohne besondere Einschränkungen vorliegen. Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird die erfindungsgemäße Zusammensetzung in Form von Lösungen, Lotionen, Cremes, Gelen, Salben, Schäumen, Shampoos, Conditionern, Sprays usw. für topische Anwendungen verwendet. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann auf die Haut aufgetragen werden, um sie mit den Haarfollikeln und ihren umgebenden Geweben in Kontakt zu bringen. Bei einem bevorzugteren Ausführungsbeispiel wird der Überstand der MSC-Kulturen oder sein gereinigtes Produkt in Form eines lyophilisierten Pulvers verwendet und in einem sterilen Behälter aufbewahrt. Vor Gebrauch wird dieser in dem wässrigen Träger eines anderen sterilen Behälters zur Rekonstitution (reconstitution) aufbewahrt. Wenn der Patient zur Blutspende geeignet ist, kann eine hohe Konzentration von thrombozytenreichem Plasma (PRP), das vom Patienten gewonnen wird, der Zusammensetzung zugegeben werden, um die Regenerationsfähigkeit der Haare zu verbessern.
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Die vorstehende Beschreibung bezieht sich nur auf bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung und soll nicht die Schutzansprüche beschränken.
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Zubereitungsbeispiel 1: Zubereitung der Zusammensetzung
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Eine quantitative Menge an Mesenchymalen Stammzellen der Haut (SMSCs) wurde in einer 150-ml-Zellkulturflasche ausgesät und in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) für 1 bis 3 Tage kultiviert. Die Zellkulturen wurden täglich geerntet und die Überstände wurden durch Filtration erhalten.
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Ausführungsbeispiel 1: Wachstumsfaktor der Zusammensetzung
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Zur Analyse und für die Zubereitung der Menge des Wachstumsfaktors des im Ausführungsbeispiel 1 erhaltenen Überstands wurde ein handelsübliches Analysekit gemäß den Kit-Richtlinien verwendet.
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Die 1A bis 1F zeigen, dass der Überstand verschiedene Typen von Wachstumsfaktoren enthält, deren Menge sich mit der Erhöhung der Anzahl der Tage der Kultivierung erhöht. Im Vergleich zur Kontrollgruppe, die nur das Kulturmedium enthielt, enthält insbesondere der Überstand höhere Mengen an VEGF, HGF, KGF und TGF-β, was bedeutet, dass der Überstand das Potenzial zur Förderung des Haarwachstums besitzt.
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Ausführungsbeispiel 2: Auswirkungen des Überstands auf das Haarwachstum
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Der im Zubereitungsbeispiel 1 erhaltene Überstand wurde einmal täglich auf die Kopfhaut einer männlichen Testperson aufgetragen. Wie in 2 gezeigt, konnte nach etwa 2 Monaten beobachtet werden, dass sich das Haarvolumen der männlichen Testperson signifikant erhöht hat. Durch eine kontinuierliche Anwendung des Überstands wird ermöglicht, dass neugebildete Haare kräftiger werden und weiter lang wachsen können, ohne vorzeitig auszufallen.
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Zusammenfassend betrifft die vorliegende Erfindung somit eine Zusammensetzung zur Förderung des Haarwachstums. Die Zusammensetzung umfasst einen Überstand aus einer Kultur von Mesenchymalen Stammzellen, wie beispielsweise einen Überstand aus einer Primärkultur von Mesenchymalen Stammzellen der Haut. Vorzugsweise wird der Überstand in Form eines lyophilisierten Pulvers verwendet, wobei er in einem sterilen Behälter aufbewahrt und vor Gebrauch in einem wässrigen Träger wieder gelöst wird. Es ist auch möglich, der erfindungsgemäßen Zusammensetzung zusätzlich eine hohe Konzentration von Thrombozytenreichem Plasma (PRP) hinzuzufügen, um den Effekt der Stimulierung des Haarwuchses zu verstärken.
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Die vorstehende Beschreibung bezieht sich nur auf bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung und soll nicht die Schutzansprüche beschränken. Alle gleichwertigen Änderungen und Modifikationen, die gemäß der Beschreibung und den Zeichnungen der Erfindung von einem Fachmann auf diesem Gebiet vorgenommen werden können und in den Schutzbereich der angehängten Schutzansprüche fallen, sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
