DE112005003001T5 - Aus humanem Fettgewebe abgeleitete multipotente Stammzellen und diese enthaltende Zelltherapeutika - Google Patents

Aus humanem Fettgewebe abgeleitete multipotente Stammzellen und diese enthaltende Zelltherapeutika Download PDF

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Abstract

Verfahren zur Herstellung adulter Stammzellen, umfassend Kultivieren aus humanem Fettgewebe abgeleiteter Pellets in einem Medium, enthaltend N-Acetyl-L-cystein (NAC) und dann Sammeln der kultivierten Zellen, wobei die adulten Stammzellen dadurch gekennzeichnet sind, dass sie:
(a) positive Immunreaktionen auf alle von CD73, CD90, CD29, CD44 und CD105 und negative Immunreaktionen auf alle von CD33, CD34, CD45, CD4, CD31, CD62p, CD14 und HLA-DR zeigen;
(b) an ein Kunststoffmaterial angeheftet wachsen, spindelförmige morphologische Merkmale zeigen und Sphären in einem Medium, enthaltend CORM-2, bilden, so dass sie dazu fähig sind, für einen langen Zeitraum in einem undifferenzierten Zustand aufrechterhalten zu werden; und
(c) die Fähigkeit, zu vom Mesoderm abgeleiteten Zellen zu differenzieren, haben.

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft aus humanem Fettgewebe abgeleitete bzw. stammende adulte Stammzellen, und insbesondere aus humanem Brustfettgewebe abgeleitete multipotente adulte Stammzellen, die durch Bildung von Sphären für einen langen Zeitraum in einem undifferenzierten Zustand aufrechterhalten werden können und hohe Proliferationsraten haben. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Isolieren und Aufrechterhalten der adulten Stammzellen, ein Verfahren zum Differenzieren der adulten Stammzellen zu Nervenzellen, Fettzellen, Knorpelzellen, osteogene Zellen und insulinfreisetzende pankreatische Beta-Zellen, ein Zelltherapeutikum zur Behandlung von Osteoarthritis, Osteoporose und Diabetes und ein Zelltherapeutikum zur Bildung von Brustgewebe.
  • STAND DER TECHNIK
  • Die Biotechnologie des 21. Jahrhunderts ("21st biotechnology") bietet die Möglichkeit neuer Lösungen für die Nahrungs-, Umwelt- und Gesundheitsprobleme, mit dem Endziel der Förderung des menschlichen Wohlstands. In den letzten Jahren ist die Technologie der Verwendung von Stammzellen als neuer Weg zur Behandlung unheilbarer Erkrankungen in Betracht gezogen worden. Früher wurden Organtransplantation, Gentherapie usw. für die Behandlung unheilbarer menschlicher Erkrankungen präsentiert, aber ihre effiziente Verwendung ist aufgrund von Immunabstoßung, einer knappen Versorgung mit Organen, einer unzureichenden Entwicklung von Vektoren und einem unzureichenden Wissen über Krankheitsgene nicht erfolgt.
  • Aus diesem Grund ist bei steigendem Interesse an Stammzellstudien erkannt worden, dass totipotente Stammzellen mit der Fähigkeit, alle Organe durch Proliferation und Differenzierung zu bilden, nicht nur die meisten Erkrankungen behandeln können, sondern auch Organverletzungen grundsätzlich heilen können. Auch haben viele Wissenschaftler die Anwendbarkeit von Stammzellen für die Regeneration aller Organe und die Behandlung unheilbarer Erkrankungen, einschließlich Parkinson-Krankheit, verschiedenen Krebsarten, Diabetes und Rückenmarksschäden vorgeschlagen.
  • Stammzellen beziehen sich auf alle Zellen, die nicht nur eine Fähigkeit zur Selbstreplikation, sondern auch die Fähigkeit in wenigstens zwei Zellen zu differenzieren, aufweisen, und sie können in totipotente Stammzellen, pluripotente Stammzellen und multipotente Stammzellen unterteilt werden.
  • Totipotente Stammzellen sind Zellen mit totipotenten Eigenschaften, fähig zur Entwicklung zu einem vollständigen Individuum, und Zellen bis zum 8-Zellstadium nach der Befruchtung einer Eizelle bzw. Oocyte und eines Spermiums besitzen diese Eigenschaften. Wenn diese Zellen isoliert und in den Uterus transplantiert werden, können sie sich zu einem vollständigen Individuum entwickeln.
  • Pluripotente Stammzellen, die Zellen, die fähig zur Entwicklung zu verschiedenen Zellen und Gewebe, abgeleitet von den ectodermalen, mesodermalen und endodermalen Schichten, sind, sind von einer inneren Zellmasse, die in Blastocysten, die 4-5 Tage nach der Befruchtung gebildet werden, lokalisiert ist, abgeleitet bzw. stammen daraus. Diese Zellen werden "embryo nale Stammzellen" genannt und können zu zahlreichen anderen Gewebezellen differenzieren, aber keinen neuen lebenden Organismus bilden.
  • Multipotente Stammzellen, die Stammzellen sind, die fähig zur Differenzierung zu Zellen, die nur für Gewebe und Organe, die diese Zellen enthalten, spezifisch sind, sind nicht nur am Wachstum und der Entwicklung zahlreicher Gewebe und Organe in den fötalen, neonatalen und adulten Zeiträumen, sondern auch an der Aufrechterhaltung der Homöostase von adultem Gewebe und der Funktion des Induzierens der Regeneration nach einer Gewebeschädigung beteiligt. Gewebespezifische multipotente Zellen werden kollektiv "adulte Stammzellen" genannt.
  • Adulte Stammzellen werden erhalten durch Entnehmen von Zellen aus zahlreichen menschlichen Organen und Entwicklung dieser Zellen zu Stammzellen, und sie sind dadurch charakterisiert, dass sie nur zu spezifischen Geweben differenzieren. Vor kurzem waren jedoch Experimente zum Differenzieren adulter Stammzellen zu zahlreichen Geweben einschließlich Leberzellen, in dramatischer Weise erfolgreich.
  • Die multipotenten Stammzellen wurden zuerst aus adultem Knochenmark isoliert (Jiang et al., Nature, 418: 41, 2002) und dann auch in zahlreichen anderen adulten Geweben gefunden (Verfaillie, Trends Cell Biol., 12: 502, 2002). In anderen Worten wurden die multipotenten Stammzellen, obwohl das Knochenmark die am weitesten bekannte Quelle für Stammzellen ist, auch in der Haut, den Blutgefäßen, den Muskeln und im Gehirn gefunden (Tomas et al., Nat. Cell Biol., 3: 778; 2001; Sampaolesi et al., Science, 301: 487, 2003; Jiang et al., Exp. Hematol., 30: 896, 2002). Stammzellen liegen jedoch in adulten Geweben, wie z.B. dem Knochenmark, sehr selten vor, und derartige Zellen sind schwierig zu kultivieren, ohne eine Differenzierung zu induzieren und somit bei Fehlen spezifisch durchgemusterter Medien schwierig zu kultivieren. Namentlich ist es sehr schwierig, die isolierten Stammzellen in vitro aufrechtzuerhalten.
  • Vor kurzem wurde gefunden, dass Fettgewebe eine neue Quelle für multipotente Stammzellen ist (Cousin et al., BBRC, 301: 1016, 2003; Miranville et al., Circulation, 110: 349, 2004; Gronthos et al., J. Cell Physiol., 189: 54, 2001; Seo et al., BBRC, 328: 258, 2005). Namentlich wurde berichtet, dass eine Gruppe undifferenzierter Zellen in humanem Fettgewebe, erhalten durch Fettabsaugung, enthalten ist und die Fähigkeit in Fettzellen, osteogene Zellen, Myoblasten und Chondroblasten zu differenzieren, aufweist (Zuk et al., Tissue Eng., 7: 211, 2001; Rodriguez et al., BBRC, 315: 255, 2004). Dieses Fettgewebe hat den Vorteil, dass es in großen Mengen extrahiert werden kann, und es wird somit als neue Quelle für Stammzellen, die die bestehenden Unzulänglichkeiten überwindet, beachtet.
  • Neue Studien unter Verwendung von Tiermodellexperimenten weisen auch darauf hin, dass aus Fettgewebe stammende Zellen die Fähigkeiten, Muskeln zu regenerieren und die Differenzierung von Nervenblutgefäßen zu stimulieren, aufweisen. Deshalb verdienen diese aus Fettgewebe stammenden bzw. abgeleiteten Zellen Aufmerksamkeit als neue Quelle für Stammzellen.
  • Bis zum jetzigen Zeitpunkt bekannte aus Fettgewebe abgeleitete Stammzellen umfassen aus humanem Fett(gewebe) abgeleitete ("human adiposederived") adulte Stammzellen, die zu Epitelzellen differenzieren können (Brzoska et al., BBRC, 330: 142, 2005), aus humanem Fett(gewebe) abgeleitete adulte Stammzellen, die zu osteogenen und Fettzellen differenzieren können (Cao et al., BBRC, 332: 370, 2005), aus humanem Fett(gewebe) abgeleitete adulte Stammzellen, die zu Nervenzellen differenzieren können (Safford et al., BBRC, 294: 371, 2002), aus Rattenfett(gewebe) abgeleitete Stammzellen, die zu Fettzellen differenzieren können (Ogawa et al., BBRC, 319: 511, 2004), aus Rattenfett(gewebe) abgeleitete Stammzellen, die zu osteogenen und chondrogenen Zellen differenzieren können (Ogawa et al., BBRC, 313: 871, 2004), aus humanem Fett(gewebe) abgeleitete Stammzellen, die zu Knorpelzellen differenzieren können (Biomaterials, 25: 3211, 2004), aus Rattenfett(gewebe) abgeleitete Stammzellen, die zu Nervenzel len differenzieren können (Fujimura et al., BBRC, 333: 116, 2005) und aus Fett(gewebe) abgeleitete Stammzellen, die zu Knochenzellen, Knorpelzellen, Nervenzellen oder Muskelzellen differenzieren können (US-Patent Nr. 6,777,231).
  • Jedoch sind die meisten der bis zum jetzigen Zeitpunkt bekannten aus Fett(gewebe) abgeleiteten Stammzellen Stammzellen, die aus dem Fettgewebe von anderen Tieren als Menschen abgeleitet sind. Selbst wenn sie aus humanem Fettgewebe abgeleitete Zellen sind, waren sie auf jene beschränkt, die aus durch die Fettabsaugung von Bauchfett erhaltenen Geweben abgeleitet waren, und die Art der aus den Stammzellen ausdifferenzierten Zellen war auch beschränkt. Insbesondere haben isolierte Stammzellen niedrige Proliferationsraten, und es ist schwierig, sie in einem undifferenzierten Zustand für einen langen Zeitraum aufrechtzuerhalten, und sie waren somit in der Anwendung beschränkt.
  • Demgemäß haben die Erfinder große Anstrengungen unternommen, um multipotente adulte Stammzellen zu entwickeln, die hohe Proliferationsraten haben, durch Bildung von Sphären für einen langen Zeitraum in einem undifferenzierten Zustand aufrechterhalten werden können und zu zahlreicheren Zellen differenzieren können. Als Ergebnis haben die Erfinder gefunden, dass multipotente Stammzellen, isoliert aus humanem Fettgewebe, zu zahlreichen Zellen, einschließlich osteogenen Zellen, chondrogenen Zellen, Nervenzellen, Astrocyten, Fettzellen und insulinfreisetzenden pankreatischen Beta-Zellen differenzieren können, eine sehr hohe Proliferationsrate haben und durch Bildung von Sphären für einen langen Zeitraum in einem undifferenzierten Zustand aufrechterhalten werden können, wodurch die vorliegende Erfindung vollendet wurde.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es ist deshalb eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, aus humanem Fettgewebe stammende multipotente adulte Stammzellen, die hohe Proliferationsraten aufweisen und durch Bildung von Sphären für einen langen Zeitraum in einem undifferenzierten Zustand aufrechterhalten werden können, sowie ein Herstellungsverfahren dafür bereitzustellen.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Differenzieren dieser multipotenten Stammzellen zu Nervenzellen, Astrocyten, Knorpelzellen, osteogenen Zellen, Fettzellen und insulinfreisetzenden pankreatischen Beta-Zellen, sowie Zelltherapeutika ("cellular therapeutic agents"), die diese differenzierten Zellen oder adulte Stammzellen enthalten, bereitzustellen.
  • Um die obigen Aufgaben zu lösen, stellt die Erfindung unter einem Gesichtspunkt ein Verfahren zum Herstellen adulter Stammzellen, umfassend das Kultivieren von aus humanem Fettgewebe abgeleiteten Pellets in einem Medium, enthaltend N-Acetyl-L-cystein (NAC) und dann Sammeln der kultivierten Zellen, bereit, wobei die adulten Stammzellen dadurch gekennzeichnet sind, dass sie: (a) positive Immunreaktionen auf alle von CD73, CD90, CD29, CD44 und CD105 und negative Immunreaktionen auf alle von CD33, CD34, CD45, CD4, CD31, CD62p, CD14 und HLA-DR zeigen; (b) an ein Kunststoffmaterial angeheftet bzw. anhaftend wachsen, spindelförmige morphologische Merkmale zeigen und in einem Medium, enthaltend CORM-2, Sphären bilden, so dass sie für einen langen Zeitraum in einem undifferenzierten Zustand aufrechterhalten werden können; und (c) die Fähigkeit zum Differenzieren zu aus dem Mesoderm abgeleiteten Zellen aufweisen.
  • In der vorliegenden Erfindung enthält das NAC-enthaltende Medium zusätzlich Ascorbinsäure, Calcium, rEGF, BPE, Insulin und Hydrocortison.
  • Unter einem anderen Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Aufrechterhaltung adulter Stammzellen in einem undifferenzierten Zu stand bereit, wobei das Verfahren Kultivieren adulter Stammzellen, hergestellt durch das genannte Verfahren, in einem Medium, enthaltend CORM-2, umfasst, so dass Sphären gebildet werden.
  • In der vorliegenden Erfindung ist das CORM-2-enthaltende Medium bevorzugt ein serumfreies Medium, das zusätzlich eine antibiotische antimycotische Lösung, Hydrocortison, Insulin, rEGF, FGF, B27 und β-Mercaptoethanol enthält.
  • Unter noch einem weiteren Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung adulte Stammzellen, hergestellt durch das genannte Verfahren und dadurch gekennzeichnet, dass sie: (a) positive Immunreaktionen auf alle von CD73, CD90, CD29, CD44 und CD105 und negative Immunreaktionen auf alle von CD33, CD34, CD45, CD4, CD31, CD62p, CD14 und HLA-DR zeigen; (b) an ein Kunststoffmaterial angeheftet bzw. anhaftend wachsen, spindelförmige morphologische Merkmale zeigen und in einem Medium, enthaltend CORM-2, Sphären bilden, so dass sie für einen langen Zeitraum in einem undifferenzierten Zustand aufrechterhalten werden können; und (c) die Fähigkeit zum Differenzieren zu aus dem Mesoderm abgeleiteten Zellen aufweisen, bereit.
  • In der vorliegenden Erfindung werden die adulten Stammzellen bevorzugt für wenigstens 16 Passagen in einem undifferenzierten Zustand kultiviert, und die aus dem Mesoderm abgeleiteten Zellen sind bevorzugt Knorpelzellen, osteogene Zellen, Nervenzellen, Astrocyten, Fettzellen und insulinfreisetzende pankreatische Beta-Zellen.
  • Unter noch einem weiteren Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Differenzieren adulter Stammzellen zu Nervenzellen bereit, wobei das Verfahren die Stufen: (a) Vorinkubieren der adulten Stammzellen in einem DMEM-Medium, enthaltend BME und FBS; und (b) Behandeln der vorinkubierten Brühe mit DMSO und BHA, um so die Differenzierung zu Nervenzellen zu induzieren, bereit. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Zelltherapeutikum zur Behandlung einer Nervenerkrankung bereit, das die differenzierten Nervenzellen als aktive Inhaltsstoffe enthält.
  • Unter noch einem weiteren Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Differenzierung adulter Stammzellen zu Knorpelzellen bereit, wobei das Verfahren Kultivieren der adulten Stammzellen in einem α-MEM-Medium, enthaltend TFG-β1, L-Ascorbat-2-phosphat und Insulin, umfasst. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Zelltherapeutikum zur Behandlung von Osteoarthritis bereit, das die differenzierten Knorpelzellen als aktive Inhaltsstoffe enthält.
  • Unter noch einem weiteren Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Differenzierung adulter Stammzellen zu osteogenen Zellen bereit, wobei das Verfahren Mischen der adulten Stammzellen mit Tricalciumphosphat (TCP) und Isotransplantation des Gemisches umfasst. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Zelltherapeutikum zur Behandlung von Knochenmangel bereit, das die differenzierten osteogenen Zellen als aktive Inhaltsstoffe enthält.
  • Unter noch einem weiteren Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Differenzierung adulter Stammzellen zu Fettzellen bereit, wobei das Verfahren Kultivieren der adulten Stammzellen in einem α-MEM-Medium, enthaltend Dexamethason, Indomethacin, Insulin und IBMX, umfasst. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Zelltherapeutikum zur Bildung von Brustgewebe bereit, das die differenzierten Fettzellen als aktive Inhaltsstoffe enthält.
  • Unter noch einem weiteren Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Differenzierung adulter Stammzellen zu insulinfreisetzenden pankreatischen Beta-Zellen bereit, wobei das Verfahren die Stufen: (a) Kultivieren der adulten Stammzellen in glucosearmem DMEM-Medium, enthaltend Nicotinamid, β-Mercaptoethanol und FBS, für 12-72 Stunden; und (b) Kultivieren der kultivierten Zellen in glucosereichem DMEM-Medium, enthaltend Nicotinamid, β-Mercaptoethanol und FBS, für 4-7 Tage umfasst. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Zelltherapeutikum zur Behandlung von Diabetes bereit, das die insulinfreisetzenden pankreatischen Beta-Zellen als aktive Inhaltsstoffe enthält.
  • Unter noch einem weiteren Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung ein Zelltherapeutikum zur Behandlung einer Nervenerkrankung bereit, enthaltend die adulten Stammzellen, die die Fähigkeit zur Differenzierung zu Nervenzellen haben, als aktive Inhaltsstoffe.
  • Unter noch einem weiteren Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung ein Zelltherapeutikum zur Behandlung von Diabetes bereit, enthaltend die adulten Stammzellen, die die Fähigkeit zur Differenzierung zu insulinfreisetzenden pankreatischen Beta-Zellen aufweisen, als aktive Inhaltsstoffe.
  • Unter noch einem weiteren Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung ein Zelltherapeutikum zur Behandlung von Osteoarthritis bereit, enthaltend die adulten Stammzellen, die die Fähigkeit zur Differenzierung zu Knorpelzellen aufweisen, als aktive Inhaltsstoffe.
  • Unter noch einem weiteren Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung ein Zelltherapeutikum zur Behandlung von Knochenmangel bereit, enthaltend die adulten Stammzellen, die die Fähigkeit zur Differenzierung zu osteogenen Zellen aufweisen, als aktive Inhaltsstoffe.
  • Unter noch einem weiteren Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung ein Zelltherapeutikum zur Bildung von Brustgewebe bereit, enthaltend die adulten Stammzellen, die die Fähigkeit zur Differenzierung zu Fettzellen aufweisen, als aktive Inhaltsstoffe.
  • Die obigen und andere Aufgaben, Merkmale und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung und den begleitenden Ansprüchen klarer verstanden werden.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 zeigt Fotografien, aufgenommen bei 100×-Vergrößerung, von erfindungsgemäßen aus humanem Fettgewebe stammenden multipotenten Stammzellen.
  • 2 zeigt den kumulativen Populationsverdoppelungslevel (CPDL) von erfindungsgemäßen aus humanem Fettgewebe stammenden multipotenten Stammzellen. A-1 und A-2: erfindungsgemäße aus humanem Fettgewebe stammende multipotente Stammzellen; und B und C: aus Fett(gewebe) stammende Stammzellen gemäß dem Stand der Technik.
  • 3 zeigt Fotografien, aufgenommen bei 200×-Vergrößerung, von Sphären, gebildet bei 7 Tagen nach Kultivierung von aus humanem Brustfettgewebe stammenden multipotenten Stammzellen gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • 4 ist eine Fotografie, aufgenommen bei 200×-Vergrößerung, der Form einer Sphäre, die durch die Proliferation einer Stammzelle in Agar gebildet wurde.
  • 5 stellt Fotografien, aufgenommen bei 100×-Vergrößerung, dar, die die Expression von Nestin, Oct4, SH2, SH3/4 in den erfindungsgemäßen aus humanem Fettgewebe stammenden multipotenten Stammzellen, die in einem CORM-2-enthaltenden MEBM-Medium zu Sphären kultiviert ("sphere-cultured") und dann immungefärbt wurden, zeigen.
  • 6 zeigt, dass erfindungsgemäße aus humanem Fettgewebe stammende multipotente Stammzellen zu Nervenzellen und Astrocyten differenziert wurden.
  • 7 zeigt Fotografien, aufgenommen bei 200×-Vergrößerung, von Fettzellen, differenziert aus humanem Fettgewebe stammenden multipotenten Stammzellen gemäß der Erfindung. A: differenzierter Phasenkontrast; und B: gefärbt mittels Ölrot O-Färbung.
  • 8 zeigt Fotografien, aufgenommen bei 100×-Vergrößerung, von Knorpelzellen, differenziert aus aus humanem Fettgewebe stammenden multipotenten Stammzellen gemäß der Erfindung. A: differenzierter Phasenkontrast; und B: Alcianblau-Färbung, die Ergebnisse zeigen die Differenzierung zu Knorpelzellen.
  • 9 zeigt osteogene Zellen, differenziert aus aus humanem Fettgewebe stammenden multipotenten Stammzellen gemäß der vorliegenden Erfindung. A: eine Gruppe, behandelt mit TCP alleine; B: eine Gruppe, behandelt mit einem Gemisch aus TCP und Knochenmarkstammzellen; und C: eine Gruppe, behandelt mit einem Gemisch aus TCP und aus Fett(gewebe) stammenden Stammzellen.
  • 10 zeigt Immunfärbungsergebnisse für insulinfreisetzende pankreatische Beta-Zellen, differenziert aus aus humanem Fettgewebe stammenden multipotenten Stammzellen gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG UND BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die vorliegende Erfindung betrifft multipotente Stammzellen, isoliert aus humanem Brustfettgewebe.
  • In der vorliegenden Erfindung wurden multipotente Stammzellen aus humanem Brustfettgewebe auf die folgende Weise zuerst isoliert und gereinigt. Das isolierte humane Fettgewebe wurde mit PBS gewaschen und fein geschnitten und dann in einem DMEM-Medium, supplementiert mit Collagenase vom Typ 1 (1 mg/ml), bei 37⎕ für 2 Stunden verdaut. Nach Waschen mit PBS wurde dann Gewebe bei 1000 U/min für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und die auf dem Boden verbleibenden Pellets wurden mit PBS gewaschen und bei 1000 U/min für 5 Minuten zentrifugiert. Die resultierenden Pellets wurden durch ein 100 μm-Sieb ("100-μm mesh") filtriert, um Debris zu entfernen, gefolgt von Waschen mit PBS. Dann wurden die Pellets in einem DMEM-Medium (10% FBS, 2 mM NAC, 0,2 mM Ascorbinsäure) inkubiert. Nach einer Übernachtperiode wurden die nicht angehefteten Zellen mit PBS weggewaschen, und die verbleibenden Zellen wurden in einem K-NAC-Medium (Keratinocyten-SFM-Medium + 2 mM NAC + 0,2 mM Ascorbinsäure + 0,09 mM Calci um + 5 ng/ml rEGF + 50 μg/ml BPE + 5 μg/ml Insulin + 74 ng/ml Hydrocortison) kultiviert, während die Medien in Intervallen von zwei Tagen ersetzt wurden, wodurch eine Lösung von aus humanem Brustgewebe stammenden multipotenten Stammzellen erhalten wurde.
  • Die Proliferationsrate der isolierten aus humanem Brustfettgewebe stammenden multipotenten Stammzellen wurde untersucht, als Ergebnis wurde gefunden, dass der CPDL stufenweise bis zu einer Passagenzahl von 16 anstieg, was darauf hinwies, dass die Stammzellen hohe Proliferationsraten aufweisen.
  • Unterdessen wurden für die Sphärenkultur der Stammzellen 5 × 104-1 × 105-Zellen/ml der isolierten aus Fettgewebe stammenden multipotenten Stammzellen in jede Vertiefung ("well") einer 6-Well-Platte, die MEBM-Medium (10 μM CORM-2 (Tricarbonyldichlorruthenium(II)-Dimer), B27, 5 ml antibiotische antimycotische Lösung (100×), 1 μg/ml Hydrocortison, 5 μg/ml Insulin, 20 ng/ml EGF, 40 ng/ml FGF und β-Mercaptoethanol) enthält, inokuliert. Als Ergebnis begannen sie ab 3 Tagen nach der Inokulation Sphären zu bilden. Dies legt nahe, dass die Stammzellen hohe Proliferationsraten aufweisen, während sie in einem undifferenzierten Zustand aufrechterhalten werden.
  • Verfahren zum Erhalten multipotenter Stammzellen, die die gewünschten Oberflächenantigene exprimieren, aus der oben erhaltenen Brühe der aus humanem Fettgewebe stammenden Stammzellen umfassen ein FACS-Verfahren unter Verwendung eines Durchflusscytometers mit Sortierfunktion (Int. Immunol., 10(3): 275, 1998), ein Verfahren unter Verwendung magnetischer Beads bzw. Kügelchen und ein Panning-Verfahren unter Verwendung eines Antikörpers, der multipotente Stammzellen spezifisch erkennt (J. Immunol., 141(8): 2797, 1998). Verfahren zum Erhalten multipotenter Stammzellen aus einer großen Menge an Kulturbrühe umfassen ein Verfahren, wobei Antikörper, die auf der Oberfläche von Zellen exprimierte Moleküle (hiernach als "Oberflächenantigene" bezeichnet) spezifisch erkennen, alleine oder in Kombination als Säulen verwendet werden.
  • Durchflusscytometrie-Sortierverfahren umfassen ein Wassertropfenladungsverfahren ("water drop charge method") und ein Zellfangverfahren ("cell capture method"). In jedem dieser Verfahren wird ein Antikörper, der ein Antigen auf der Zelloberfläche spezifisch erkennt, fluoreszenzmarkiert, die Fluoreszenzintensität, die von einem an das auf der Zelloberfläche exprimierte Molekül gebundenen Antikörper emittiert wird, wird in ein elektrisches Signal umgewandelt, wodurch die exprimierte Menge des Antigens quantifiziert werden kann. Es ist auch möglich, Zellen, die eine Vielzahl von Oberflächenantigenen exprimieren, durch Kombination der dafür verwendeten Fluoreszenztypen zu separieren. Beispiele für Fluoreszenzen, die in diesem Fall verwendet werden können, umfassen FITC (Fluoresceinisothiocyanat), PE (Phycoerythrin), APC (Allophycocyanin), TR (Texas Rot), Cy3, CyChrome, Red 613, Red 670, TRI-Color, Quantum Red usw.
  • FACS-Verfahren unter Verwendung eines Durchflusscytometers umfassen: ein Verfahren, wobei die obige Stammzellbrühe gesammelt wird, aus der Zellen durch z.B. Zentrifugation isoliert werden und direkt mit Antikörpern gefärbt werden; und ein Verfahren, wobei die Zellen in einem geeigneten Medium kultiviert und gezüchtet und dann mit Antikörpern gefärbt werden. Das Färben von Zellen wird durch Mischen eines primären Antikörpers, der ein Oberflächenantigen erkennt, mit einer Zielzellprobe und Inkubieren des Gemisches auf Eis für 30 Minuten bis 1 Stunde durchgeführt. Wenn der primäre Antikörper fluoreszenzmarkiert ist, werden die Zellen nach dem Waschen mit einem Durchflusszytometer isoliert. Wenn der primäre Antikörper nicht fluoreszenzmarkiert ist, werden die mit dem primären Antikörper umgesetzten Zellen und ein fluoreszenzmarkierter sekundärer Antikörper mit Bindungsaktivität gegenüber dem primären Antikörper nach Waschen gemischt und auf Eis für 30 Minuten bis 1 Stunde inkubiert. Nach Waschen werden die mit dem primären und dem sekundären Antikörper gefärbten Zellen mit einem Durchflusszytometer isoliert.
  • Die zahlreichen Oberflächenantigene können mit der Hämatopoese zusammenhängende Antigene ("hematopoietic-associated antigens"), die Oberflä chenantigene von Mesenchym-Zellen und Antigene, die für Nervensystem-Neuronen spezifisch sind, umfassen. Die mit der Hämatopoese zusammenhängenden Antigene umfassen CD34, CD45 usw., die Oberflächenantigene von Mesenchym-Zellen umfassen SH-2, SH-3 usw., und die Antigene, die für Nervensystem-Neuronen spezifisch sind, umfassen NSE, GFAP usw. Die einzelne oder kombinierte Verwendung von Antikörpern, die die oben stehend beschriebenen Oberflächenantigene erkennen, erlaubt es, die gewünschten Zellen zu erhalten.
  • Die erfindungsgemäßen isolierten multipotenten adulten Stammzellen wurden unter Verwendung eines Durchflusszytometers untersucht, sie zeigten als Ergebnis positive Reaktionen auf CD73, CD90, CD29, CD44 und CD105. Die multipotenten Stammzellen zeigten auch negative Immunreaktionen auf alle von CD33, CD34, CD45, CD4, CD31, CD62p, CD14 und HLA-DR.
  • Zusätzlich wurde gefunden, dass die erfindungsgemäßen isolierten multipotenten adulten Stammzellen multipotente Stammzellen sind, die zu Nervenzellen, Astrocyten, osteogenen Zellen, Knorpelzellen, Fettzellen und insulinfreisetzenden pankreatischen Beta-Zellen differenzieren können.
  • Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung wird hiernach durch Beispiele detaillierter beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass diese Beispiele nur für Zwecke der Erläuterung sind und nicht als den Umfang der vorliegenden Erfindung beschränkend ausgelegt werden.
  • Beispiel 1: Isolierung von multipotenten Stammzellen aus Fettgewebe
  • Fettgewebe wurde isoliert aus Brustgewebe von Frauen, vertrieben vom Breast Cancer Center, Seoul National University, und mit PBS gewaschen und dann fein geschnitten. Das geschnittene Gewebe wurde in DMEM-Medium, supple mentiert mit Collagenase vom Typ 1 (1 mg/ml), bei 37⎕ für 2 Stunden verdaut. Das verdaute Gewebe wurde mit PBS gewaschen und dann bei 1000 U/min für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und die auf dem Boden verbliebenen Pellets wurden mit PBS gewaschen und dann bei 1000 U/min für 5 Minuten zentrifugiert. Die resultierenden Pellets wurden durch ein 100 μm-Sieb filtriert, um Debris zu entfernen, gefolgt von Waschen mit PBS. Die resultierenden Zellen wurden in einem DMEM-Medium (10% FBS, 2 mM NAC, 0,2 mM Ascorbinsäure) inkubiert. Nach einer Übernachtperiode wurden nicht angeheftete Zellen mit PBS gewaschen und in Keratinocyten-SFM-Medium (enthaltend 2 mM NAC, 0,2 mM Ascorbinsäure, 0,09 mM Calcium, 5 ng/ml rEGF, 50 μg/ml BPE, 5 μg/ml Insulin und 74 ng/ml Hydrocortison) kultiviert, wobei die Medien in Intervallen von zwei Tagen ersetzt wurden, wodurch multipotente Stammzellen isoliert wurden. 1 zeigt bei 100×-Vergrößerung aufgenommene Fotografien der wie oben beschrieben isolierten aus humanem Fettgewebe stammenden multipotenten Stammzellen.
  • Beispiel 2: Untersuchung der Proliferationsrate von aus Fettgewebe abgeleiteten Stammzellen
  • Fettgewebe wurde von jeder der verschiedenen menschlichen Brustgewebeproben gemäß dem Isolationsverfahren, wie in Beispiel 1 beschrieben ist, erhalten. Um die Proliferationsrate multipotenter Stammzellen, abgeleitet von dem humanen Brustfettgewebe, zu untersuchen, wurden 2 × 105 Zellen in einen T-75-Kolben inokuliert und dann wurde der CPDL (kumulativer Populationsverdoppelungslevel) gemessen und als Funktion der Passagenzahl ausgedrückt. Der CPDL ist ein Index, der für die Proliferationsrate der Zellen bezeichnend ist und wird durch die folgende Gleichung ausgedrückt. CPDL = In(Nf/Ni)/In2,wobei gilt Ni: die anfängliche Anzahl inokulierter Zellen; und Nf: die endgültige Anzahl an Zellen.
  • Im Ergebnis, wie in "A-1" und "A-2" von 2 gezeigt, zeigten die erfindungsgemäßen adulten Stammzellen (hMAD-MCS1 und hMAD-MCS2) einen CPDL-Wert von etwa 50 bei einer Passagenzahl von 16.
  • "B" und "C" von 2 zeigen indessen die CPDL-Werte der früheren von humanem Fettgewebe abgeleiteten Stammzellen (Lin et al., Stem Cells and Development, 14: 92, 2005; Zuk et al., Tissue Eng., 7: 211, 2001) als Funktion der Passagenzahl. Wie in 2 gezeigt, waren die CPDL-Werte der Zellen 30-35 und 21 bei Passagenzahlen von 7 bzw. 13.
  • Diese Ergebnisse legen nahe, dass die erfindungsgemäßen adulten Stammzellen sehr hohe Proliferationsraten aufweisen.
  • Beispiel 3: Immunologische Merkmale der aus Fett(gewebe) abgeleiteten multipotenten Stammzellen
  • Die aus Fettgewebe abgeleiteten multipotenten Stammzellen, erhalten in Beispiel 1, wurden mit PBS gewaschen und mit Trypsin behandelt. Die behandelten Zellen wurden gesammelt und bei 1000 U/min für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und (sie) wurden dann mit einem Gemisch aus 2% FBS und PBS gewaschen, gefolgt von Zentrifugation bei 1000 U/min für 5 Minuten. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen wurden in PBS suspendiert und 1 × 105 Zellen wurden für jede Probe in eine Platte mit Vertiefungen (wells) dispensiert. Ein Antikörper (R-Phycoerythrin-konjugierter monoklonaler Maus-Anti-human-Antikörper) wurde in jede Vertiefung eingegeben und für 40 Minuten auf Eis inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Medium bei 1000 U/min für 5 Minuten inkubiert. Der Überstand wurde entfernt und die Zellen wurden mit PBS gewaschen und bei 1000 U/min für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde wiederum entfernt und die Zellen wurden mit PBS gewaschen und bei 1000 U/min für 5 Minuten zentrifugiert. Nach dem Entfernen des Überstandes wurden die Zellen mit 1% Paraformaldehyd fixiert und unter Verwendung eines Durchflusszytometers untersucht.
  • Tabelle 1: FACS-Untersuchung von Oberflächenantigenen von aus Fett(gewebe) abgeleiteten Stammzellen
    Figure 00170001
  • Als Ergebnis wie in Tabelle 1 gezeigt, zeigten die erfindungsgemäßen aus Fettgewebe abgeleiteten Stammzellen positive Reaktionen von 91% auf CD73, 97% auf CD90, 96% auf CD29, 83% auf CD44 und 80% auf CD105. Die erfindungsgemäßen Stammzellen zeigten auch negative Immunreaktionen auf alle von CD33, CD34, CD45, CD4, CD31, CD62p, CD14 und HLA-DR.
  • Beispiel 4: Sphärenbildung von aus Fettgewebe abgeleiteten multipotenten Stammzellen
  • 5 × 104-1 × 105/ml der aus humanem Brustfettgewebe abgeleiteten multipotenten Stammzellen, erhalten in Beispiel 1, wurden in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte, enthaltend ein serumfreies MEBM-Medium, enthaltend 10 μM CORM-2, 5 ml antibiotische antimycotische Lösung (100×), 1 μg/ml Hydrocortison, 5 μg/ml Insulin, 20 ng/ml EGF, 40 ng/ml FGF, B27 und β-Mercaptoethanol, inokuliert. Als Ergebnis begannen die Zellen die Form von Sphären ab 3-7 Tagen nach der Inokulation zu bilden, und wie es in 3 und 4 gezeigt ist, proliferierten die Zellen selbst bei 7-10 Tagen nach der Inokulation, um Sphären zu bilden.
  • Die erfindungsgemäßen Stammzellen wurden auch in Agar kultiviert. Als Ergebnis, wie in 4 gezeigt, bildeten die Zellen Sphären.
  • Währenddessen wurden 5 × 104-Stammzellen, erhalten in Beispiel 1, in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte inokuliert und die Anzahl an Sphären wurde bei jeder Passage gemessen (siehe Tabelle 2). Als Ergebnis, wie in Tabelle 2 gezeigt, hielten die Zellen Sphären aufrecht, was darauf hindeutet, dass die Zellen für einen langen Zeitraum proliferiert und aufrechterhalten werden können. Wie in 5 gezeigt, wurde Oct4 positiv exprimiert, was darauf hinweist, dass die Zellen eine hohe Proliferationsrate aufweisen, während sie in einem undifferenzierten Zustand aufrechterhalten werden.
  • Tabelle 2
    Figure 00180001
  • Beispiel 5: Immunfärbungsuntersuchung von aus Fettgewebe abgeleiteten Stammzellen
  • Die aus Fettgewebe abgeleiteten Stammzellsphären, erhalten in Beispiel 4, wurden dreimal mit PBS gewaschen und mit 4% Paraformaldehyd enthaltendem PBS für 30 Minuten fixiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Sphären für 10 Minuten mit PBS, enthaltend 0,1% Triton-X100, imprägniert bzw. permeiert. Nachdem sie dreimal mit PBS gewaschen wurden, wurden die Sphären für 1 Stunde mit 10% NGS und dann über Nacht mit PBS, enthaltend einen primären Antikörper, reagieren gelassen. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Sphären mit einem sekundären Antikörper für 1 Stunde in einem dunklen Raum reagieren gelassen. Nachdem sie dreimal mit PBS gewaschen wurden, wurden die Sphären montiert.
  • Als Ergebnis, wie in 5 gezeigt, zeigten die erfindungsgemäßen multipotenten Stammzellsphären positive Reaktionen auf alle von Nestin, das als ein Marker für Nervenvorläuferzellen angesehen werden kann, Oct4, das als ein Marker für undifferenzierte Zellen angesehen werden kann, und SH2(CD105) und SH3/4(CD73), die Marker für Mesenchymalstammzellen sind.
  • Beispiel 6: Differenzierung von von Fett(gewebe) abgeleiteten multipotenten Stammzellen zu Nervenzellen und Astrocyten
  • Die von Fettgewebe abgeleiteten multipotenten Stammzellen, erhalten in Beispiel 1, wurden in einem DMEM-Medium, supplementiert mit 1 mM BME und 10% FBS, für 24 Stunden vorinkubiert. Nach der Vorinkubation wurden die Stammzellen in einem Medium zum Induzieren von Nervenzelldifferenzierung, enthaltend 1% DMSO und 100 μM BHA (butyliertes Hydroxyanisol), für 90 Minuten inkubiert, um so die Differenzierung zu Nervenzellen zu induzieren, gefolgt von Immunfärbung (6). Als Ergebnis, wie in 6 gezeigt, zeigten die erfindungsgemäßen aus humanem Fettgewebe abgeleiteten multipotenten Stammzellen positive Reaktionen auf GFAP (saures Gliaf Faserprotein), das ein für Astrocyten im Nervensystem spezifisches Antigen ist, und MAP2 (Mikrotubuli-assoziiertes Protein2), das eine Nervenzell-spezifische Substanz ist.
  • Die Fotografien in der ersten Zeile von 6 zeigen die Ergebnisse für eine negative Kontrollgruppe, welche darauf hinweisen, dass differenzierte Zellen selbst nicht die Fluoreszenz von FITC und TRITC zeigen. Die MAP2-Fotografie auf der linken Seite der zweiten Zeile zeigt die rote Fluoreszenz von TRITC, was darauf hinweist, dass MAP2 exprimiert wurde. Ausgehend von der Phasenkontrastfotografie und der Mischfotografie ("Merge photograph") wurde gefunden, dass die rote Fluoreszenz eine von Zellen, in denen MAP2 exprimiert wurde, emittierte Fluoreszenz war. Auch die GFAP-Fotografie auf der linken Seite der dritten Zeile zeigte die grüne Fluoreszenz von FITC und aus der Phasenkontrastfotografie und der Mischfotografie war ersichtlich, dass die grüne Fluoreszenz eine von Zellen, in denen GFAP exprimiert wurde, emittierte Fluoreszenz war. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die erfindungsgemäßen von humanem Fett(gewebe) abgeleiteten multipotenten Stammzellen zu Nervenzellen und Astrocyten (aus)differenzieren.
  • Beispiel 7: Differenzierung von aus Fett(gewebe) abgeleiteten multipotenten Stammzellen zu Fettzellen
  • Die aus Fettgewebe abgeleiteten multipotenten Stammzellen, erhalten in Beispiel 1, wurden in einem α-MEM-Medium, enthaltend 5% FBS, 1 μM Dexamethason, 200 μM Indomethacin, 10 μg/ml Insulin und 0,5 mM IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthin) für 2 Wochen inkubiert, um die Differenzierung zu Fettzellen zu induzieren, und wurden dann unter Verwendung eines Ölrot O-Färbeverfahrens untersucht. Als Ergebnis, wie in 7 gezeigt, wurde beobachtet, dass die aus humanem Fettgewebe abgeleiteten multipotenten Stammzellen zu Fettzellen (aus)differenziert wurden.
  • Beispiel 8: Differenzierung von aus Fett(gewebe) abgeleiteten multipotenten Stammzellen zu Knorpelzellen
  • 107-Zellen/ml der aus Fettgewebe abgeleiteten multipotenten Stammzellen, erhalten in Beispiel 1, wurden in jedes Zentrum einer 24-Well-Platte in einer Menge von 10 μl dispensiert. Danach wurden die Zellen in einem α-MEM-Medium, enthaltend 5% FBS, 10 ng/ml TFG-β1, 50 μM L-Ascorbat-2-phosphat und 6,25 μg/ml Insulin, für 2 Wochen inkubiert, um so die Differenzierung zu Knorpelzellen zu induzieren. Dann wurde unter Verwendung des Alcianblau-Färbeverfahrens untersucht, ob die multipotenten Stammzellen zu Knorpelzellen differenziert waren. Als Ergebnis, wie in 8 gezeigt, waren bzw. wurden die aus humanem Fettgewebe abgeleiteten multipotenten Stammzellen zu Knorpelzellen differenziert.
  • Beispiel 9: Differenzierung von aus Fett(gewebe) abgeleiteten multipotenten Stammzellen zu osteogenen Zellen
  • 107-Zellen/ml der aus Fettgewebe abgeleiteten adulten Stammzellen, erhalten in Beispiel 1, wurden mit TCP (Tricalciumphosphat) gemischt und in Hunde subkutan isotransplantiert bzw. isogentransplantiert. Nach 14 Tagen wurde das Gewebe unter Verwendung des H&E-Färbeverfahrens behandelt und untersucht. Als Ergebnis, wie in 9 gezeigt, zeigte eine Gruppe (A), die mit TCP alleine behandelt wurde, die Permeation inflammatorischer Zellen in einen Teil bzw. Teilbereich, um das TCP und eine Gruppe (B), die mit einem Gemisch aus TCP und Knochenmarksstammzellen behandelt wurde, zeigte inflammatorische Reaktionen, die um das TCP intakt blieben. In einer Gruppe (C), die mit einem Gemisch aus TCP und aus Fett(gewebe) abgeleiteten Stammzellen behandelt wurde, wurde der größte Teil des TCP absorbiert und eine typische initiale Osteogenese wurde beobachtet, und Osteoblasten-artige Zellen, multinukleäre Osteoclast-artige Zellen und Knochenmatrizes wurden ebenfalls beobachtet. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die aus humanem Fettgewebe abgeleiteten multipotenten Stammzellen zu osteogenen Zellen differenziert waren.
  • Beispiel 10: Differenzierung von aus Fett(gewebe) abgeleiteten multipotenten Stammzellen zu insulinfreisetzenden pankreatischen Beta-Zellen'
  • Die aus Fettgewebe abgeleiteten multipotenten Stammzellen, erhalten in Beispiel 1, wurden in glucosearmem DMEM-Medium, enthaltend 10 mmol/L Nicotinamid, 1 mmol/L β-Mercaptoethanol und 10% FBS, für 24 Stunden inkubiert und dann in glucosereichem DMEM-Medium, enthaltend 10 mmol/L Nicotinamid, 1 mmol/L β-Mercaptoethanol und 5% FBS, für 5 Tage inkubiert, um so die Differenzierung zu insulinfreisetzenden pankreatischen Beta-Zellen zu induzieren. Nach Induzieren der Differenzierung wurden die Zellen mittels Immunfärbung untersucht, und die Ergebnisse sind in 10 gezeigt. Wie in 10 gezeigt, waren das C-Peptid und Insulin in den Zellen vorhanden. Wie es im Fachgebiet bekannt ist, wird Proinsulin, das in Insulin und C-Peptid geteilt bzw. gespalten wird, in insulinfreisetzenden pankreatischen Beta-Zellen produziert. Somit weisen die obigen Ergebnisse darauf hin, dass die erfindungsgemäßen aus Fettgewebe abgeleiteten multipotenten Stammzellen zu insulinfreisetzenden pankreatischen Beta-Zellen differenziert wurden.
  • Obwohl die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf spezielle Merkmale im Detail beschrieben worden ist, wird es für Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich sein, dass diese Beschreibung nur für eine bevorzugte Ausführungsform steht und den Umfang der vorliegenden Erfindung nicht beschränkt. Somit wird der wesentliche Umfang der vorliegenden Erfindung durch die angehängten Ansprüche und die Äquivalente davon definiert werden.
  • GEWERBLICHE ANWENDBARKEIT
  • Obwohl die erfindungsgemäßen multipotenten Stammzellen adulte Stammzellen sind, können sie, wie oben im Detail beschrieben, zu zahlreicheren Arten von Zellen differenzieren, als jene, die aus den früheren aus Fett(gewebe) abgeleiteten adulten Stammzellen differenziert wurden. Insbesondere haben die erfindungsgemäßen adulten multipotenten Stammzellen die Fähigkeit, zu Nervenzellen, Astrocyten, Fettzellen, chondrogenen Zellen, osteogenen Zellen oder insulinfreisetzenden pankreatischen Beta-Zellen zu differenzieren und sind wirksam bei der Behandlung von Osteoporose, Osteoarthritis, Nervenerkrankungen, Diabetes usw., und sind auch für die Bildung von Brustgewebe verwendbar. Die erfindungsgemäßen adulten Stammzellen bilden auch Sphären in einem serumfreien Medium, so dass sie mit hoher Reinheit isoliert werden können, für einen langen Zeitraum in einem undifferenzierten Zustand aufrechterhalten werden können und haben eine hohe Proliferationsrate. Somit sind die erfindungsgemäßen adulten Stammzellen als Zelltherapeutika verwendbar.
  • ZUSAMMENFASSUNG
  • Diese Erfindung betrifft von humanem Fettgewebe abgeleitete multipotente adulte Stammzellen. Insbesondere betrifft die Erfindung von humanem Fettgewebe abgeleitete multipotente Stammzellen, die durch Bildung von Sphären für einen langen Zeitraum in einem undifferenzierten Zustand aufrechterhalten werden können und hohe Proliferationsraten haben, sowie Verfahren zum Isolieren und Aufrechterhalten der adulten Stammzellen, und Verfahren zur Differenzierung der multipotenten adulten Stammzellen zu Nervenzellen, Fettzellen, Knorpelzellen, osteogenen Zellen und insulinfreisetzenden pankreatischen Beta-Zellen. Die Erfindung betrifft auch Zelltherapeutika zur Behandlung von Osteoarthritis, Osteoporose und Diabetes und für die Bildung von Brustgewebe, die die differenzierten Zellen oder die adulten Stammzellen enthalten. Obwohl die multipotenten Stammzellen adulte Stammzellen sind, haben sie die Fähigkeit, zu osteogenen Zellen, Nervenzellen, Astrocyten, Fettzellen, chondrogenen Zellen oder insulinfreisetzenden pankreatischen Beta-Zellen zu differenzieren und sind so wirksam bei der Behandlung von Osteoporose, Osteoarthritis, Nervenerkrankungen und Diabetes usw. Auch bilden die Stammzellen Sphären in einem serumfreien Medium, das CORM-2 enthält, und sie können somit für einen langen Zeitraum in einem undifferenzierten Zustand aufrechterhalten werden. Die Stammzellen haben auch sehr hohe Proliferationsraten. Demgemäß sind die Stammzellen als Zelltherapeutika verwendbar.

Claims (22)

  1. Verfahren zur Herstellung adulter Stammzellen, umfassend Kultivieren aus humanem Fettgewebe abgeleiteter Pellets in einem Medium, enthaltend N-Acetyl-L-cystein (NAC) und dann Sammeln der kultivierten Zellen, wobei die adulten Stammzellen dadurch gekennzeichnet sind, dass sie: (a) positive Immunreaktionen auf alle von CD73, CD90, CD29, CD44 und CD105 und negative Immunreaktionen auf alle von CD33, CD34, CD45, CD4, CD31, CD62p, CD14 und HLA-DR zeigen; (b) an ein Kunststoffmaterial angeheftet wachsen, spindelförmige morphologische Merkmale zeigen und Sphären in einem Medium, enthaltend CORM-2, bilden, so dass sie dazu fähig sind, für einen langen Zeitraum in einem undifferenzierten Zustand aufrechterhalten zu werden; und (c) die Fähigkeit, zu vom Mesoderm abgeleiteten Zellen zu differenzieren, haben.
  2. Verfahren zur Herstellung adulter Stammzellen nach Anspruch 1, wobei das NAC-enthaltende Medium zusätzlich Ascorbinsäure, Calcium, rEGF, BPE, Insulin und Hydrocortison enthält.
  3. Verfahren zum Aufrechterhalten adulter Stammzellen in einem undifferenzierten Zustand, wobei das Verfahren Kultivieren adulter Stammzellen, hergestellt durch das Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, in einem Medium, enthaltend CORM-2, umfasst, so dass Sphären gebildet werden.
  4. Verfahren zum Aufrechterhalten adulter Stammzellen in einem undifferenzierten Zustand, wobei das CORM-2-enthaltende Medium ein serumfreies Medium ist, das zusätzlich eine antibiotische antimycotische Lösung, Hydrocortison, Insulin, rEGF, FGF, B27 und β-Mercaptoethanol enthält.
  5. Adulte Stammzellen, hergestellt durch das Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2 und dadurch gekennzeichnet, dass sie: (a) positive Immunreaktionen auf alle von CD73, CD90, CD29, CD44 und CD105 und negative Immunreaktionen auf alle von CD33, CD34, CD45, CD4, CD31, CD62p, CD14 und HLA-DR zeigen; (b) an ein Kunststoffmaterial angeheftet wachsen, spindelförmige morphologische Merkmale zeigen und Sphären in einem Medium, enthaltend CORM-2, bilden, so dass sie dazu fähig sind, für einen langen Zeitraum in einem undifferenzierten Zustand aufrechterhalten zu werden; und (c) die Fähigkeit, zu vom Mesoderm abgeleiteten Zellen zu differenzieren, haben.
  6. Adulte Stammzellen nach Anspruch 5, wobei die adulten Stammzellen für wenigstens 16 Passagen in einem undifferenzierten Zustand kultiviert werden.
  7. Adulte Stammzellen nach Anspruch 5, wobei die vom Mesoderm abgeleiteten Zellen ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus: Knorpelzellen, osteogenen Zellen, Nervenzellen, Astrocyten, Fettzellen und insulinfreisetzenden pankreatischen Beta-Zellen.
  8. Verfahren zum Differenzieren adulter Stammzellen zu Nervenzellen, wobei das Verfahren die Stufen: (a) Vorinkubieren der adulten Stammzellen nach einem der Ansprüche 5 bis 7 in einem DMEM-Medium, enthaltend BME und FBS; und (b) Behandeln der vorinkubierten Brühe mit DMSO und BHA, um so die Differenzierung zu Nervenzellen zu induzieren, umfasst.
  9. Zelltherapeutikum zur Behandlung einer Nervenerkrankung, das Nervenzellen, differenziert durch das Verfahren von Anspruch 8, als aktive Inhaltsstoffe enthält.
  10. Verfahren zur Differenzierung adulter Stammzellen zu Knorpelzellen, wobei das Verfahren Kultivieren der adulten Stammzellen nach einem der Ansprüche 5 bis 7 in einem α-MEM-Medium, enthaltend TFG-β1, L-Ascorbat-2-phosphat und Insulin, umfasst.
  11. Zelltherapeutikum zur Behandlung von Osteoarthritis, das Knorpelzellen, differenziert durch das Verfahren von Anspruch 10, als aktive Inhaltsstoffe enthält.
  12. Verfahren zur Differenzierung adulter Stammzellen zu osteogenen Zellen, wobei das Verfahren Mischen der adulten Stammzellen nach einem der Ansprüche 5 bis 7 mit Tricalciumphosphat (TCP) und Isotransplantation des Gemisches umfasst.
  13. Zelltherapeutikum zur Behandlung von Knochenmangel, das osteogene Zellen, differenziert durch das Verfahren von Anspruch 12, als aktive Inhaltsstoffe enthält.
  14. Verfahren zur Differenzierung adulter Stammzellen zu Fettzellen, wobei das Verfahren Kultivieren der adulten Stammzellen nach einem der Ansprüche 5 bis 7 in einem α-MEM-Medium, enthaltend Dexamethason, Indomethacin, Insulin und IBMX, umfasst.
  15. Zelltherapeutikum zur Bildung von Brustgewebe, das Fettzellen, differenziert durch das Verfahren von Anspruch 14, als aktive Inhaltsstoffe enthält.
  16. Verfahren zur Differenzierung adulter Stammzellen zu insulinfreisetzenden pankreatischen Beta-Zellen, wobei das Verfahren die Stufen: (a) Kultivieren der adulten Stammzellen nach einem der Ansprüche 5 bis 7 in glucosearmem DMEM-Medium, enthaltend Nicotinamid, β-Mercaptoethanol und FBS, für 12-72 Stunden; und (b) Kultivieren der kultivierten Zellen in glucosereichem DMEM-Medium, enthaltend Nicotinamid, β-Mercaptoethanol und FBS, für 4-7 Tage umfasst.
  17. Zelltherapeutikum zur Behandlung von Diabetes, das insulinfreisetzende pankreatische Beta-Zellen, differenziert durch das Verfahren von Anspruch 16, als aktive Inhaltsstoffe enthält.
  18. Zelltherapeutikum zur Behandlung einer Nervenerkrankung, enthaltend die adulten Stammzellen nach einem der Ansprüche 5 bis 7, welche die Fähigkeit zur Differenzierung zu Nervenzellen haben, als aktive Inhaltsstoffe.
  19. Zelltherapeutikum zur Behandlung von Diabetes, enthaltend die adulten Stammzellen nach einem der Ansprüche 5 bis 7, welche die Fähigkeit zur Differenzierung zu insulinfreisetzenden pankreatischen Beta-Zellen haben, als aktive Inhaltsstoffe.
  20. Zelltherapeutikum zur Behandlung von Osteoarthritis, enthaltend die adulten Stammzellen nach einem der Ansprüche 5 bis 7, welche die Fähigkeit zur Differenzierung zu Knorpelzellen haben, als aktive Inhaltsstoffe.
  21. Zelltherapeutikum zur Behandlung von Knochenmangel, enthaltend die adulten Stammzellen nach einem der Ansprüche 5 bis 7, welche die Fähigkeit zur Differenzierung zu osteogenen Zellen haben.
  22. Zelltherapeutikum zur Bildung von Brustgewebe, enthaltend die adulten Stammzellen nach einem der Ansprüche 5 bis 7, welche die Fähigkeit zur Differenzierung zu Fettzellen haben, als aktive Inhaltsstoffe.
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