WO2004015093A1

WO2004015093A1 - Verfahren zur erzeugung von zellinien sowie organen mithilfe differenzierfähiger zellen

Info

Publication number: WO2004015093A1
Application number: PCT/AT2003/000232
Authority: WO
Inventors: Herbert Zech; Gottfried Dohr; Pierre Vanderzwalmen; Nicolas Zech
Original assignee: Dr. H. Zech Gmbh; Innovationsagentur Gmbh
Priority date: 2002-08-09
Filing date: 2003-08-11
Publication date: 2004-02-19
Also published as: IL166636A0; WO2004019285A1; AU2003257223A1; US20060110375A1; AU2003249749A8; EP1527162A1; AU2003249749A1

Abstract

Verfahren zur Erzeugung von Zelllinien oder einzelner Organe, wobei differenzierfähige Spenderzellen einer Morula oder Blastozyste zugeführt werden, die unter Bedingungen kultiviert werden, die eine weitere Entwicklung der Morula oder Blastozyste in Stadien, in denen neu gebildete Zeltlinien mit höherem Differenzierungsgrad auftreten, sowie Isolierung dieser Zeltlinien oder Weiterdifferenzierung dieser Zeltlinien in Organe gestatten. Das erfindungsgemässe Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass die Zellen der Morula oder der inneren Zellmasse der Blastozyste über eine im Vergleich zum jeweiligen Wildtyp eingeschränkte Überlebensfähigkeit verfügen oder deren Überlebensfähigkeit durch geeignete Kultivierungsbedingungen herabgesetzt wird, und die der Morula oder Blastozyste zugeführten Spenderzellen unterschiedlichen Differenzierungsgrad aufweisen. Dadurch kann im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren eine wesentlich verkürzte Kultivierungsdauer der Spenderzellen erreicht werden, wodurch die Bereitstellung natürlicher Stammzellen begünstigt, allenfalls erst dadurch ermöglicht wird. Als weitere Verwendung der Blastozyste kann auch deren Transfer in ein Leihmuttertier vorgesehen sein.

Description

Verfahren zur Erzeugung von Zelllinien sowie Organen mithilfe differenzierfähiger Zellen

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Erzeugung von Zelllinien sowie Organen mithilfe differenzierfähiger Zellen gemäß dem Oberbegriff von Anspruch 1.

Ein spezieller Typus differenzierfähiger Zellen sind pluripotente Zellen, wie sie in frühen Stadien der embryonalen Entwicklung auftreten, sowie Zellen der Keimbahn. Als pluripotente Zellen werden im folgenden Zellen verstanden, die sich in jeden Zelltypus differenzieren können. Eine zu Pluripotenz vergleichbare, aber vermutlich auf Plastizität beruhende Eigenschaft kann aber auch durch technische Maßnahmen in Zellen späterer Entwicklungsstufen etwa gemäß des erfindungsgemäßen Verfahrens induziert werden. Diese Zellen sind im folgenden von der Bezeichnung „pluripotente Zellen" nicht erfasst. Pluripotente Zellen verfügen über die Fähigkeit, alle Zelltypen des Embryos, Fötus sowie des erwachsenen Organismus zu erzeugen sowie sich selbst annähernd unbegrenzt zu erneuern. Eine erneuerbare Quelle an Zellen, die in eine Vielzahl unterschiedlicher Gewebstypen differenzieren können, bietet sicherlich vielfältige Anwendungsmöglichkeiten in der Grundlagenforschung sowie in der Transplantationstherapie. Ein wichtiger Schritt zur Verwirklichung dieses Ziels stellt die Entdeckung dar, dass menschliche, embryonale Stammzellen kultiviert werden können [3] . Unter „embryonale Stammzellen" werden im folgenden pluripotente Zellen verstanden, die einer Morula oder Blastozyste entnommen wurden und vorzugsweise in Kulturschalen lebensfähig gehalten werden. Deren Gewinnung und Kultivierung sind dem Fachmann wohlbekannt und wurden etwa in US 6.011.197 und WO 97/37009 offenbart. Diese embryonale Stammzellen (ES- Zellen) werden dabei in erster Linie von der inneren Zellmasse von Blastozysten gewonnen, also jener Zellen der Blastozyste, aus denen letztendlich alle Zellen des späteren Entoderms, Ektoderms und Mesoderms hervorgehen. Es sei an diesem Punkt festgehalten, dass im folgenden unter „Präembryo" eine sich entwickelnde Zellmasse bis Tag 6 nach Befruchtung der Eizelle verstanden wird und ab dem Tag 6 und somit gegebenenfalls ab Implantation in der Gebärmutter von einem „Embryo" gesprochen wird. Insbesondere umfasst der Begriff „Präembryo" hier die Präimplantationsstadien von der Zygote über die Morula bis hin zur Blastozyste bis Tag 6 nach Befruchtung der Eizelle. Unter Zygote wird hier der Embryo im Einzell-Stadium (Pronukleusstadium) bezeichnet. Präimplantationsstadien können eingeleitet werden durch Befruchtung einer Eizelle durch einen Samen, durch parthenogenetische Aktivierung einer Eizelle, oder durch Zugabe einer oder mehrerer Blastomere in eine induktive Umgebung wie etwa in eine Zona Pellucida, wie dies von Alikani und Willadsen beschrieben wurde [11] . Der Begriff Morula bezieht sich hier auf alle der Zygote nachfolgenden Stadien der Zellteilungen inklusive der frühen Zellteilungsstadien am Tag 2 und 3, in denen sich noch kein Blastozoel gebildet hat. Nach Bildung eines Blastozoel wird im folgenden von einer Blastozyste gesprochen, wobei sich dieser Begriff auch auf frühe embryonale Stadien beziehen kann. Die Blastozyste wird durch die Zona Pellucida (äußere, nicht zelluläre Masse) und durch den Trophoblasten gebildet und enthält die bereits erwähnte innere Zellmasse. Nach dem Schlüpfen („hatchen") aus der Zona Pellucida um Tag 6 wird diese Struktur ebenfalls als Blastozyste bezeichnet und ist gemäß obiger Terminologie ein Embryo. Methoden zur Isolierung einer inneren Zellmasse aus einer Blastozyste sind dem Fachmann bekannt [8, 9] . „Embryonale Stammzellen" oder „ES- Zellen" wären gemäß dieser Terminologie, sofern sie aus der Morula oder der Blastozyste bis Tag 6 gewonnen werden, somit eigentlich „präembryonale Stammzellen", es wird aber die Bezeichnung „embryonale Stammzellen" oder „ES-Zellen" allgemein für pluripotente Stammzellen, die aus der Morula oder Blastozyste gewonnen werden, beibehalten, auch wenn die Entnahme vor dem Tag 6 erfolgen sollte.

Das Potential von pluripotenten Zellen wie etwa ES-Zellen für die Forschung und den klinischen Einsatz ist weitreichend. Deren zukünftige Bedeutung etwa für in vitro-Studien der menschlichen Embryogenese, für Untersuchungen abnormaler Entwicklungen (etwa durch die Erzeugung von Zelllinien mit gezielten Genveränderungen) , zur Untersuchung der Wirkung einzelner Gene, für die Entwicklung und das Testen neuer Medikamente oder als erneuerbare Quelle für Zeil- und Gewebstransplantationen oder für Gentherapien sind zur Zeit noch kaum abschätzbar.

Einen weiteren Auftrieb für Forschungen dieser Art lieferte die Beobachtung, dass ES-Zellen einer ersten Spezies in die Blastozyste einer zweiten, auch unterschiedlichen Spezies eingeführt werden konnten, die nach Transfer in ein Weibchen der zweiten Spezies zur Geburt eines Nachkommens führte, der genetische Merkmale beider Spezien vereint und somit eine Chimäre darstellt, worunter im folgenden eine sich entwickelnde Zellmasse verstanden wird, die eine Untergruppe von Zellen enthält, die im Zellkern DNA mit signifikant unterschiedlicher Nukleotidbasensequenz als die anderen Zellen der Zellmasse aufweisen.

Um den genetischen Beitrag der Spender-ES-Zellen zum letztendlich resultierenden Organismus zu erhöhen, wurde etwa in US 2002062493 vorgeschlagen, nicht-humane Säugetiere zu erzeugen, indem ES-Zellen des betreffenden Tieres in tetraploide Blastozysten derselben Spezies injiziert werden. Die Blastozyste wird bis zur Entwicklung eines Embryos kultiviert und einem Weibchen zum weiteren Austragen übertragen. In einer weiteren Ausführungsform werden die ES- Zellen mit Mutationen versehen und danach in tetraploide Blastozysten injiziiert, wodurch Nachkommen mit gezielten Mutationen erzeugt werden können. Verfahren dieser Art werden ein großes Potential für die Erforschung der Wirkung einzelner Gene bzw. deren Mutationen auf die phänotypische Entwicklung von Nachkommen zugeschrieben.

Zur Erzeugung tetraploider Blastozysten werden in der Regel die Blastomere von diploiden Präembryonen im Zwei-Zell-Stadium durch Anwendung kurzer elektrischer Pulse fusioniert. Die so entstandenen Embryos können kultiviert werden und führen zur Entwicklung von Morulae und Blastozysten, wobei sich bei letzteren die Tetraploidie etwa in den Zellen der inneren Zellmasse manifestiert.

Morulae können etwa für eine Aggregation mit ES-Zellen und Blastozysten für eine Injektion von ES-Zellen verwendet werden. Tetraploide Blastozysten zeichnen sich allerdings durch eine beschränkte Entwicklungsfähigkeit aus. Während die Differenzierung tetraploider Zellen kaum über die Entwicklung von frühem Entoderm und Trophoektoderm hinausgeht, können etwa injizierte diploide ES-Zellen zur Entwicklung eines reifen Embryos führen. Daher wurde diese Methode, wie etwa in US2002062493 dargelegt, vorgeschlagen, um auf effektive Weise Chimären zu erzeugen, da durch die reduzierte Lebensdauer der tetraploiden Zellen der inneren Zellmasse die Entfaltung des Phänotypus des Wirtes auf natürliche Weise zugunsten der ES- Zellen des Spenderorganismus unterdrückt wird. Insbesondere wurde vorgeschlagen, mithilfe gentechnisch veränderter ES- Zellen auf rasche Weise den phänotypischen Beitrag bestimmter Gene zu bestimmen [1] . In diesem Zusammenhang ist es erwähnenswert, dass sich alle Versuche, durch komplette Entfernung der inneren Zellmasse und dessen Ersetzen durch ES-Zellen eine normale fötale Entwicklung zu induzieren, als Fehlschlag erwiesen haben, obwohl ES-Zellen die Fähigkeit zugeschrieben wird, den gesamten Fötus zu erzeugen. Somit wird angenommen, dass die innere Zellmasse des Wirts offenbar eine entscheidende Funktion darin ausübt, die ES-Zellen zum Wiedereintritt in ein embryonales Differenzierungsprogramm zu induzieren, auch wenn es sich bei den Zellen der inneren Zellmasse um eingeschränkt lebensfähige, tetraploide Zellen handeln möge.

Die Gewinnung, Verwendung sowie genetische Veränderung von ES- Zellen stößt allerdings insbesondere bei humanen ES-Zellen auf ethische Bedenken, sodass sowohl hinsichtlich des Einsatzes von humanen Blastozysten als auch humaner ES-Zellen in Forschung und klinischer Therapie nach Alternativen zu suchen ist .

Die Verwendung embryonaler Stammzellen stößt allerdings auch auf technische Schwierigkeiten. So können diese Zellen zur Zeit etwa nur von Präembryos oder sehr frühen Embryos gewonnen werden und sind, auch wenn gegenwärtig mehrere ES-Zelllinien isoliert wurden, mit den meisten Patienten immunologisch nicht verträglich. Eine mögliche Erklärung könnte darin liegen, dass menschliche ES-Zellen MHC-I exprimieren [10] . Somit wird es entweder notwendig sein, eine Vielzahl weiterer ES-Zelllinien zu isolieren, oder aber ES-Zelllinien mithilfe des "therapeutischen Klonens" an jeden Patienten anzupassen. Des weiteren neigen ES-Zellen dazu, nach deren Transplantation Teratomae zu bilden. ES-Zellen müssten daher während deren Kultivierung zuverlässig in entsprechende Gewebstypen vor deren Transplantation differenziert werden. Außerdem stellt sich die Frage, ob spezialisierte Zellen, die von ES-Zellen abgeleitet wurden, im entsprechenden Gewebe nach deren Transplantation auch die gewünschten funktionalen Eigenschaften aufweisen. So konnte etwa von Mäuse-ES-Zellen, die in vitro Insulin produzierten, nachgewiesen werden, dass sie in vivo keine Senkung des Blutzuckerspiegels bewirken konnten.

Somit rücken Alternativen zur Verwendung von ES-Zellen in den Blickpunkt des Forschungsinteresses. So stellt sich etwa die Frage, ob nicht auch adulte Stammzellen, eventuell auch aus Nabelschnurblut, als Ersatz für ES-Zellen dienen könnten, deren Gewinnung etwa aus Proben von adulten Organismen auch beim Menschen ethisch weniger bedenklich erscheint als die Gewinnung von ES-Zellen aus Präembryos oder frühen Embryos. Dies schien zunächst aufgrund der eingeschränkten Differenzierungsfähigkeit adulter Stammzellen unmöglich.

Wie jüngste Untersuchungen allerdings gezeigt haben, können bei der Aufreinigung mesenchymaler Stammzellen der Maus sogenannte MAPCs ("multipotent adult progenitor cells") gewonnen werden,- -die nicht nur in mesenchymale -Zellen differenzieren, sondern auch in Zellen des Entoderm, Mesoderm oder Ektoderm [2] . Werden MAPCs etwa in frühe Maus- Blastozysten injiziert, kann festgestellt werden, dass sie zur Bildung einer Vielzahl, vielleicht sogar aller somatischer Zelltypen beitragen. Diese Untersuchungen sind insofern interessant, als bis dahin angenommen wurde, dass gewebstypische Stammzellen, die sicherlich über eine geringere Fähigkeit zur Selbsterneuerung verfügen wie ES, im allgemeinen lediglich in Zellen des betreffenden Gewebes differenzieren. Zwar wurde beobachtet, dass etwa hämatopoetische Stammzellen unter Umständen auch in Zellen anderer Gewebstypen differenzieren können oder dass neuronale Stammzellen nach Injektion in eine Blastozyste zu mehreren Gewebstypen beitragen können, dass eine einzelne gewebstypische Stammzelle allerdings in funktionale Zellen einer Vielzahl an Gewebstypen differenzieren könnte, wurde in der Regel für praktisch nicht umsetzbar gehalten. Wie des weiteren gezeigt werden konnte, tragen MAPCs in vivo auch zur Bildung einer Vielzahl somatischer Gewebstypen bei, wenn sie einer Maus verabreicht werden. Tatsächlich hat sich gezeigt, dass MAPCs in ihren Eigenschaften ES-Zellen ähneln und überdies hinsichtlich ihrer Differenzierungsfähigkeit einen sehr synchronen Zelltypus darstellen, wie anhand von Untersuchungen der Genexprimierung gezeigt werden konnte. Sie bedürfen etwa vergleichbarer Kulturbedingungen wie ES-Zellen, exprimieren zumindest einige der genetischen Marker, die auch bei ES-Zellen in vitro beobachtet werden (Oct-4, Rex-1, SSEA-1), verfügen über ausgeprägte Proliferations- und Differenzierungseigenschaften, tragen möglicherweise zur Bildung aller Organe bei, wenn sie in Blastozysten injiziert werden und differenzieren in gewebstypische Zellen, wenn sie entsprechendem Einfluss der betreffenden Organe ausgesetzt werden.

Die Natur dieser MAPCs ist zur Zeit allerdings noch -ungeklärt, es scheint sogar fraglich, ob die in vitro beobachteten MAPCs, die das Ergebnis vergleichsweiser langer Kultivierungsperioden von mehreren Monaten sind, in dieser Form auch in vivo existieren. So wird etwa spekuliert, dass MAPCs tatsächlich in vivo nicht existieren, sondern dass Zellen mit veränderten Eigenschaften, unter Umständen auch ähnlich zu denen von Krebszellen, gezüchtet wurden. Einem weiteren Erklärungsmodell zu Folge könnte die lange Kultivierungsdauer die Reduktion der ursprünglichen Zellpopulation auf enthaltene Stammzellen begünstigen, wie dies etwa bei den in ihren Eigenschaften durchaus ähnlichen hämatopoetischen Zellen beobachtet wurde. In EP 1176189 wurde schließlich offenbart, dass aus Proben von adulten, somatischen Zellen etwa aus Muskelgewebe, Gehirngewebe, dem Blut, dem Knochenmark, der Leber oder der Brustdrüse Zellen gewonnen werden konnten, die ein den pluripotenten Stammzellen ähnliches Verhalten zeigen, insbesondere zeigen sie eine Exprimierung von Oct-4, wie dies auch bei pluripotenten Stammzellen in frühen Stadien der embryonalen Entwicklung der Fall ist. Diese Zellen wurden auch als "dedifferenzierte" Stammzellen bezeichnet, um so die Vermutung auszudrücken, dass offenbar Zellen eine größere Differenzierfähigkeit wiedererlangen konnten. Genauere Angaben über deren Einsetzbarkeit für die Produktion differenzierter oder neuer, differenzierfähiger Zellen wurden aber nicht geliefert .

Es ist nun Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Erzeugung differenzierter oder neuer, differenzierfähiger Zelllinien oder auch ganzer Organe zu bieten, ohne dabei differenzierfähige Zellen, die aus Präembryonen oder Embryonen gewonnen werden, wie etwa ES-Zellen, zu verwenden. Es ist weiters Ziel der Erfindung, dies unter -Vermeidung längerer Kultivierungsperioden der verwendeten differenzierfähigen Zellen zu bewerkstelligen. Abgesehen von den bereits skizzierten Risiken langer Kultivierungsperioden im Zusammenhang mit den oben erwähnten MAPCs zeichnen sich hierbei nämlich Gefahren auch aufgrund des "genetic imprinting" ab [4, 5] .

Das Ziel der Erfindung wird durch die kennzeichnenden Merkmale von Anspruch 1 erreicht.

Anspruch 1 sieht dabei vor, zur Erzeugung differenzierter oder neuer, differenzierfähiger Zelllinien oder auch Organen keine embryonalen Stammzellen oder Stammzelllinien, die hinsichtlich ihrer Pluripotenz über einen einheitlichen Differenzierungsgrad verfügen sollten, zu verwenden, wie dies etwa in US 6,200,806 oder in [12] beschrieben ist, sondern Zellen mit primär unterschiedlichem Differenzierungsgrad, wodurch insbesondere eine Probe eines Spenderorganismus enthaltend adulte, somatische Stammzellen charakterisiert ist. Unter „unterschiedlichem Differenzierungsgrad" von Spenderzellen wird hier verstanden, dass sie multipotente/pluripotente oder auch differenzierte Zellen umfassen können, wobei in einer Probe adulter Zellen eines Spenderorganismus in der Regel eine relativ große Anzahl an differenzierter oder kaum mehr differenzierfähiger Zellen anzufinden sein wird und lediglich eine geringe Anzahl an Zellen noch über multipotenten/pluripotenten Charakter verfügt. Zwar handelt es sich bei den Spenderzellen durchaus um Zellpopulationen, die zur Konzentrationserhöhung enthaltener Stammzellen eine Aufbereitung mithilfe gängiger Methoden erfahren haben, etwa im Rahmen der Herstellung einer hochgereinigten Fraktion aus Nabelschnurblut, es entfällt aber die Gewinnung synchroner Zellpopulationen, also von Zellen mit -einheitlichem Differenzierungsgrad, wie -dies bei der Gewinnung von embryonalen Stammzelllinien der Fall ist, und der damit verbundenen langen Kultivierungsdauer.

Auch wenn es denkbar wäre, die Probe mithilfe ausreichend langer Kultivierungsperioden hinsichtlich der Differenzierfähigkeit der enthaltenen Zellen zu synchronisieren, ist dies dann nicht erforderlich, wenn sie erfindungsgemäß in Morulae oder Blastozysten eingebracht werden, deren Zellen, bei Blastozysten jene der inneren Zellmasse, über eine im Vergleich zur Wildtyp-Morula bzw. Wildtyp-Blastozyste eingeschränkte Überlebensfähigkeit verfügen, oder wenn die Überlebensfähigkeit dieser Zellen durch geeignete Kultivierungsbedingungen herabgesetzt wird. Unter Wildtyp-Morula bzw. Wildtyp-Blastozyste wird im folgenden eine Morula oder Blastozyste verstanden, die in diesem Zusammenhang noch keine Manipulation erfahren hat. Wie bereits erwähnt wurde, übt die innere Zellmasse der

Wirtsblastozyste offenbar eine entscheidende Funktion darin aus, in die Blastozyste eingefügte ES-Zellen zum

Wiedereintritt in ein embryonales Differenzierungsprogramm zu induzieren, auch wenn es sich bei den Zellen der inneren

Zellmasse, etwa aufgrund von Tetraploidie, um eingeschränkt lebensfähige Zellen handeln möge. Wie nun überraschend festgestellt wurde, ist es aufgrund der durch die Zellen der inneren Zellmasse, aber auch durch die Zellen der Morula, gegebenen "reprogrammierenden" Zellmatrix möglich, auch bei nicht-embryonalen Stammzellen eine "Dedifferenzierung" hinsichtlich einer größeren Differenzierfähigkeit zu bewirken.

Es ist auch denkbar, dass es treffender ist, von einer

"Transdifferenzierung" der zugeführten Spenderzellen zu sprechen, wobei durch deren Einbettung in eine entsprechend stimulierende zelluläre Umgebung deren Plastizität zur

Entfaltung gebracht wird. Die Wirkungsweise der „Stimulierung" ist zwar zur Zeit nicht vollends geklärt, es scheinen aber neben der extrazellulären Matrix sowohl interzelluläre, etwa autokrine und parakrine Faktoren als auch die „Polarität" des

Embryos eine Rolle zu spielen. Es liegt der vorliegenden

Erfindung somit die Vorstellung zugrunde, dass mögliche

Defizite hinsichtlich ihrer Differenzierfähigkeit von

Stammzellen, die nicht aus Präembryos oder frühen Embryos gewonnen wurden, durch deren Kontakt mit einer entsprechenden reprogrammierenden Zellmatrix kompensiert werden können, wobei darauf Bedacht genommen werden muss, dass hinsichtlich einer optimierten Ausbeute von neugebildeten Zelllinien die Zellen der inneren Zellmasse der Blastozyste bzw. die Zellen der

Morula über eine im Vergleich zur Wildtyp-Blastozyste bzw.

Wildtyp-Morula eingeschränkte Überlebensfähigkeit verfügen, oder deren Überlebensfähigkeit durch geeignete Kultivierungsbedingungen herabgesetzt wird. Somit unterstützen die Zellen der inneren Zellmasse bzw. die Zellen der Morula zwar die erwünschte Reprogra mierung der zugeführten Spender- Stammzellen, wenngleich durch deren eingeschränkte Überlebensfähigkeit ihr Anteil an den Zellen des sich entwickelnden Organismus laufend abnimmt.

Eine „eingeschränkte Überlebensfähigkeit" der Zellen der Morula bzw. der inneren Zellmasse der Blastozyste kann auf unterschiedliche Art erfolgen. Entweder ist die eingeschränkte Überlebensfähigkeit schon „intrinsisch" gegeben, wie etwa bei tetraploiden Embryonen, oder es kann „extrinsisch" eine eingeschränkte Überlebensfähigkeit gewisser Zellen mithilfe geeigneter Kultivierungsbedingungen hervorgerufen werden. Auf beide Möglichkeiten wird im folgenden noch eingegangen werden.

Anspruch 2 sieht eine bevorzugte Ausführungsform vor, der zu Folge die Spenderzellen natürlich vorkommende Stammzellen enthalten. Unter „natürlich vorkommende" Stammzellen werden hier adulte, so atische Stammzellen, auch aus Nabelschnurblut, verstanden, wie sie in vivo zu finden sind. Bezüglich der oben erwähnten MAPCs wurde festgestellt, dass die nach langer Kultivierungsdauer von mehreren Monaten isolierten MAPCs tatsächlich in vivo nicht existieren dürften, sondern dass aufgrund der langen Kultivierungsdauer Zellen mit veränderten Eigenschaften gezüchtet wurden. Es ist auch beim erfindungsgemäßen Verfahren nicht gänzlich auszuschließen, dass trotz der wesentlich kürzeren Aufbereitungs- und Kultivierungsperiode die Spenderzellen eine, im Vergleich zu den in vivo vorkommenden natürlichen Stammzellen, veränderte Zellpopulation darstellen. In der bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens enthalten die Spenderzellen jedoch natürlich vorkommende Stammzellen, was neben der erfindungsgemäßen Verwendung von Spenderzellen mit unterschiedlichem Differenzierungsgrad auch durch eine rasche

Aufbereitung und Kultivierung der Spenderzellen begünstigt wird.

Anspruch 3 sieht eine spezielle Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens vor, der zu Folge die Zellen der Morula oder der inneren Zellmasse der Blastozyste als Reaktionsmedium in einer Kulturschale aufbereitet sind. Es wäre aber auch denkbar, die Zellen der Morula oder der inneren Zellmasse der Blastozyste zur Aufbereitung eines Reaktionsmediums wie in [37] beschrieben, zu verwenden, da man derzeit annimmt, dass auch gelöste Matrixbestandteile wie z.B. Laminin, Kollagen-IV, Zytokine oder auch auf der Zelle vorhandene Proteine wie etwa Glykoproteine als „reprogrammierende" Zellmatrix wirken können. Vorzugsweise wird hierzu ein Standard-Medium verwendet, das insbesondere auf die Verwendung von FCS („Fetal calf serum") oder eines anderen, von tierischen Proteinen abgeleiteten Serum verzichtet .

Anspruch 4 sieht vor, die Spenderzellen aus Nabelschnurblut zu gewinnen, insbesondere über Herstellung einer hochgereinigten Fraktion, die etwa zu 5% Stammzellen enthält.

Anspruch 5 sieht vor, die Spenderzellen aus der Plazenta zu gewinnen. Die Plazenta enthält eine Vielzahl an Zellen, die für das erfindungsgemäße Verfahren interessant sind, wie etwa mesenchymale Zellen und Endothelzellen, von denen angenommen wird, eine besonders ergiebige Quelle für Stammzellen zu sein. Anspruch 6 sieht vor, die Spenderzellen aus dem Knochenmark zu gewinnen. Anspruch 7 sieht vor, die Spenderzellen aus dem Fettgewebe zu gewinnen, das sich als besonders interessante Quelle abzeichnet, da Stammzellen aus dem Fettgewebe relativ leicht zu gewinnen sind. Die Gewinnung der Spenderzellen umfasst eine Aufbereitung der etwa aus einem erwachsenen Organismus entnommenen Probe, wobei die Aufbereitung darauf abzielt, die Konzentration an in der Probe enthaltenen Stammzellen zu erhöhen. Methoden dieser Art sind Stand der Technik und dem Fachmann wohlvertraut.

Anspruch 8 sieht vor, dass die Zellen der Empfängermorula bzw. der inneren Zellmasse der Empfängerblastozyste tetraploide Zellen sind. Verfahren zur Verwirklichung einer solchen Tetraploidie sind gemäß dem Stand der Technik bekannt [6, 7] . Wie bereits erwähnt wurde, verfügen tetraploide Zellen über eine eingeschränkte Lebensfähigkeit. Aufgrund der intrinsisch gegebenen, eingeschränkten Überlebensfähigkeit der tetraploiden Zellen der Morula bzw. der inneren Zellmasse der Blastozyste nehmen diese in ihrer Anzahl allmählich ab und stellen so eine zunehmende Popularisierung der sich entwickelnden Blastozyste mit Nachfolgerzellen der zugeführten Spenderzellen sicher, wobei sie über die Zeitdauer ihres Bestehens die erforderlichen interzellulären Signale zur Reprogrammierung-- der- zugeführten Spenderzellen -hinsichtlich einer größeren Differenzierfähigkeit setzen.

Anspruch 9 sieht ein alternatives Verfahren vor, die Zellen der Morula oder der inneren Zellmasse der Blastozyste mit einer eingeschränkten Überlebensfähigkeit auszustatten, indem deren Genom ein Vektor eingeschleust wird, der eine letale Sensibilität gegenüber entsprechend gewählten Kultivierungsbedingungen verursacht. Werden nach Zufuhr der Spenderzellen zur Morula bzw. zur Blastozyste die Kultivierungsbedingungen entsprechend gewählt, hat dies ein gezieltes Absterben der Zellen der Morula bzw. der inneren Zellmasse zur Folge, ohne die Überlebensfähigkeit der Spenderzellen und der Trophoblasten zu beeinträchtigen. So können etwa Vektoren gewählt werden, die eine höhere Sensitivität gegenüber Temperaturerhöhung oder bestimmten Zusätzen für Kulturmedien verursachen.

Alternativ dazu sieht Anspruch 10 vor, das Genom der Spenderzellen mit einem Vektor wie z.B. einem Neomycin- Resistenz-Gen oder Puromycin-Resistenz-Gen zu versehen, der eine Resistenz gegenüber Medien mit Zusätzen wie z.B. G418 oder Puromycin verursacht. Es muss hierbei aber sicher gestellt sein, dass die Einschleusung des Vektors in die Spenderzellen nicht Kultivierungszeiten bedingt, die das erfindungsgemäße Ziel von möglichst kurzen Kultivierungszeiten der Spenderzellen vor deren Zufuhr zur Blastozyste beeinträchtigt. Es können ebenfalls Vektoren zugeführt werden, die Zellen resistent gegenüber gewissen Temperatureinflüssen, wie z.B. Temperaturerhöhungen, machen [13-17].

Als weitere Alternative sieht Anspruch 11 vor, die Überlebensfähigkeit der Zellen der Morula bzw. der inneren Zellmasse der Blastozyste durch Zusatz geeigneter Antikörper zum Kulturmedium herabzusetzen. Durch Zugabe—von spezifischen Antikörpern (AK) , die mit zeilschädigenden Substanzen beladen sind und nur an Zellen anhaften, die einen Rezeptor für den spezifischen AK besitzen, werden so nur diese Zellen geschädigt. Techniken dieser Art sind etwa in [18-22] beschrieben.

Die Verwirklichung der Ansprüche 9 bis 11 ermöglicht es, eine vorteilhafte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß Anspruch 12 zu verwirklichen, der zu Folge die Herabsetzung der Überlebensfähigkeit der Zellen der Morula bzw. der inneren Zellmasse der Blastozyste in einer auf die unterschiedlichen Differenzierungsgrade der Spenderzellen abgestimmten und zeitlich wohlgeordneten Weise erfolgt. Eine unterschiedliche Zusammensetzung der in die Wirtsmorula bzw. Wirtsblastozyste eingeführten Spenderzellen kann nämlich bedingen, dass das Absterben der Zellen der Morula bzw. der inneren Zellmasse der Blastozyste in einer zeitlich abgestimmten Weise erfolgen muss, um eine optimierte Signalsetzung der reprogrammierenden Zellmatrix zu erzielen. Die gezielte Herabsetzung der Überlebensfähigkeit der Zellen der Morula bzw. der inneren Zellmasse muss aber darauf Rücksicht nehmen, die Trophoblasten in ihrer Überlebensfähigkeit nicht zu beeinträchtigen, da sie für das weitere Überleben des Embryos wichtig sind, insbesondere wenn die Blastozysten in ein Leihmuttertier transferiert werden.

Die aus einer Zellprobe des Spenderorganismus oder aus Nabelschnurblut gewonnene Zellprobe stellt, wie erwähnt, auch nach Reinigung der Probe hinsichtlich der Differenzierfähigkeit der enthaltenen Zellen eine asynchrone Zellpopulation dar, die nicht nur multipotente, bestenfalls auch pluripotente Stammzellen enthält, sondern auch Zellen mit geringerer Differenzierfähigkeit wie gewebstypische Zellen, die aber dennoch unter bestimmten - Umständen eine Transdifferenzierung in gewebstypische Zellen anderer Gewebe vollziehen könnten, oder auch differenzierte Zellen womöglich ohne jegliche Differenzierfähigkeit. Es kann sich daher als vorteilhaft erweisen, vor dem Zuführen der Spenderzellen in die Morula bzw. Blastozyste die Spenderzellen in Kulturschalen mit anderen Blastozysten oder isolierten inneren Zellmassen anderer Blastozysten gemäß Anspruch 13 in Kontakt zu bringen. Methoden zur Isolierung und Kultivierung innerer Zellmassen sind dem Fachmann bekannt, wobei aus isolierten inneren Zellmassen letztendlich ein Medium undifferenzierter Zellen bereitet wird, auf das die Spenderzellen mit hoher Kontaktwahrscheinlichkeit zu den Zellen der aufbereiteten inneren Zellmassen aufgetragen oder gespült werden können. Es hat sich nämlich herausgestellt, dass durch den Kontakt mit Blastozysten oder isolierten inneren Zellmassen von Blastozysten eine Selektion von für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten Zellen hinsichtlich höherer Differenzierfähigkeit erreicht werden kann. Spenderzellen mit relativ höherer Affinität zu dem aus inneren Zellmassen aufbereiteten Medium oder den Blastozysten können isoliert werden und stehen zur weiteren therapeutischen, diagnostischen oder wissenschaftlichen Applikation zur Verfügung, könnten aber auch zur weiteren Differenzierung in Morulae oder Blastozysten injiziert werden. Im letzteren Fall wird dadurch die Wahrscheinlichkeit einer Induktion einer höheren Differenzierungsfähigkeit der injizierten Spenderzellen durch die Zellmatrix der Morula bzw. der inneren Zellmasse der Wirtsblastozyste erhöht, wobei die Zeitdauer dieses zusätzlichen Verfahrensschrittes lediglich einige wenige Minuten beträgt, im Fall eines Aufspülens der Spenderzellen auf das aus inneren Zellmassen aufbereiteten Medium auch nur wenige Sekunden, sodass auch bei Verwirklichung dieses Schrittes die Kultivierungsperioden vergleichsweise kurz gehalten werden können.

Alternativ dazu kann auch die Verwirklichung der Merkmale von Anspruch 14 vorgesehen sein, indem die Präselektion von für das erfindungemäße Verfahren geeigneten Zellen über entsprechende Marker erfolgt.

Die Ansprüche 15 und 16 sehen spezielle Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens dar. Insbesondere bei der Verwendung von humanen Spenderzellen und beispielsweise deren Injektion in Schwein-Blastozysten besteht über das erfindungsgemäße Verfahren die Möglichkeit, Zelllinien zu erzeugen, deren genetische Eigenschaften vergleichbar, im besten Fall ident zu jenen der ursprünglichen, humanen Spenderzellen sind, obwohl die nach Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens sich entwickelnde Schwein- Blastozyste keineswegs genetisch ident zu den Spenderzellen ist. In einem späteren Entwicklungsstadium der Schwein- Blastozyste können neue, differenzierfähige Zellen, differenzierte Zelllinien oder auch ganze Organe mit genetischer Identität zu den humanen Spenderzellen und im Optimalfall auch immunologischer Kompatibilität zum Spenderorganismus isoliert werden, ohne dass dies den Einsatz humaner embryonaler Stammzellen erfordern würde.

Anspruch 17 sieht eine vorteilhafte Art der Zufuhr der Spenderzelle in die Wirtsblastozyste vor, indem die Zufuhr durch Injektion erfolgt.

Anspruch 18 sieht eine vorteilhafte Art der Zufuhr der Spenderzelle in die Wirtsmorula vor, indem die Zufuhr durch Aggregation erfolgt.

Anspruch 19 bezieht sich auf eine spezielle Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, der zu Folge es sich bei den Spenderzellen um humane Zellen handelt. Es ist jedoch durchaus möglich, dass die Morula oder Blastozyste, denen die Spenderzellen zugeführt werden, dennoch nicht-humanen Ursprungs sind. Da die aus dem erfindungemäßen Verfahren geernteten Zelllinien oder auch Organstrukturen genetisch ident zu den Spenderzellen sind, eignen sie sich zur Verwendung als Präparat zur therapeutischen Intervention gemäß der Ansprüche 20 und 21, etwa für Erkrankungen, wie sie in Anspruch 22 genannt sind.

Anspruch 23 bezieht sich auf eine spezielle Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, der zu Folge es sich bei den Spenderzellen um nicht-humane Zellen handelt. Da die aus dem erfindungsgemäßen Verfahren geernteten Zelllinien wiederum genetisch ident zu den Spenderzellen sind, eignen sie sich zur Verwendung als Präparat zur therapeutischen und diagnostischen Intervention im Veterinärbereich gemäß Anspruch 24, sowie zur Erzeugung von genetisch identen Zellen und Organstrukturen zur therapeutischen, diagnostischen oder wissenschaftlichen Anwendung gemäß Anspruch 25, etwa für Erkrankungen, wie sie in Anspruch 26 genannt sind.

Eine mögliche Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nun anhand der beiliegenden Figuren 1 bis 3 näher beschrieben.

Figur 1 soll hierbei schematisch darstellen, wie gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zunächst eine tetraploide Blastozyste 1 hergestellt wird. Die von der Zona Pellucida 3 umgebenen Blastomeren 2 eines Zwei-Zell-Präembryos können etwa durch Elektrofusion in einen Ein-Zell-Präembryo mit vierfachem Chromosomensatz umgewandelt werden. Techniken zur Erzeugung tetraploider Präembryonen sind gemäß dem Stand der Technik bekannt -und-etwa-in [6, 7, 23-27] beschrieben. Der Präembryo vollzieht weiterhin Zellteilungen der Blastomeren und entwickelt sich in weiterer Folge zu einer Blastozyste 1. In Fig. 1 sind in schematischer Weise die innere Zellmasse 4 sowie die Trophoblasten 5 angedeutet.

Andererseits wird eine etwa von Nabelschnurblut stammende Probe oder auch eine von einem erwachsenen Organismus, etwa von Fettgewebe, entnommene Probe einer Aufbereitung unterzogen, die auf eine Konzentrationserhöhung der enthaltenen Stammzellen abzielt. Techniken zur Aufbereitung einer Probe zwecks Herstellung einer gereinigten Zellfraktion sind ebenfalls gemäß dem Stand der Technik bekannt und etwa in [28, 32, 34] beschrieben. Das Ergebnis der Aufbereitung sind Spenderzellen 6 (Fig. 2), die unterschiedlichen Differenzierungsgrad aufweisen und multipotente/pluripotente oder auch differenzierte Zellen umfassen können, wobei in einer Probe adulter Zellen eines Spenderorganismus in der Regel eine relativ große Anzahl an differenzierter oder kaum mehr differenzierfähiger Zellen anzufinden sein wird und lediglich eine geringe Anzahl an Zellen noch über multipotenten/pluripotenten Charakter verfügt. Das Differenzierungspotential ist für einige Typen adulter Stammzellen gemäß dem Stand der Technik bekannt [z.B. 29, 30, 31, 34] .

Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist nun vorgesehen, die Spenderzellen 6 nicht mithilfe ausreichend langer Kultivierungsperioden hinsichtlich der Differenzierfähigkeit der enthaltenen Zellen zu synchronisieren, sondern sie in Morulae 7 oder Blastozysten 1 einzubringen, deren Zellen 2, bei Blastozysten jene der inneren Zellmasse 4, nun aufgrund der herbeigeführten Tetraploidie über eine im Vergleich zur Wildtyp-Morula bzw. Wildtyp-Blastozyste eingeschränkte Überlebensfähigkeit -verfügen (Fig. 3) . Wie bereits erwähnt wurde, üben die Zellen 2 der Wirtsmorula 7 bzw. der inneren Zellmasse 4 der Wirtsblastozyste 1 offenbar eine entscheidende Funktion darin aus, eingefügte Stammzellen zum Wiedereintritt in ein embryonales Differenzierungsprogramm zu induzieren. Wie nun überraschend festgestellt wurde, ist es aufgrund der durch die Zellen der inneren Zellmasse 4, aber auch durch die Zellen 2 der Morula 7, gegebenen "reprogrammierenden" Zellmatrix möglich, auch bei nicht-embryonalen Stammzellen eine "Dedifferenzierung" hinsichtlich einer größeren Differenzierfähigkeit zu bewirken. Wie bereits erwähnt wurde, mag es treffender sein, von einer "Transdifferenzierung" der zugeführten Spender-Stammzellen 6 zu sprechen, wobei durch deren Einbettung in eine entsprechend stimulierende zelluläre Umgebung deren Plastizität zur Entfaltung gebracht wird. Es liegt der vorliegenden Erfindung somit die Vorstellung zugrunde, dass mögliche Defizite hinsichtlich ihrer Differenzierfähigkeit von Stammzellen, die nicht aus Präembryos oder frühen Embryos gewonnen wurden, durch deren Kontakt mit einer entsprechenden reprogrammierenden Zellmatrix kompensiert werden können, wobei darauf Bedacht genommen werden muss, dass hinsichtlich einer optimierten Ausbeute von neugebildeten Zelllinien die Zellen der inneren Zellmasse 4 der Blastozyste 1 bzw. die Zellen 2 der Morula 7 über eine im Vergleich zur Wildtyp-Blastozyste bzw. Wildtyp-Morula eingeschränkte Überlebensfähigkeit verfügen. Somit unterstützen die Zellen der inneren Zellmasse 4 bzw. die Zellen 2 der Morula 7 zwar die erwünschte Reprogrammierung der zugeführten Spender-Stammzellen 6, wenngleich durch deren eingeschränkte Überlebensfähigkeit ihr Anteil an den Zellen des sich entwickelnden Organismus laufend abnimmt.

Wie ebenfalls in Fig. 3 angedeutet ist, können dabei die Zellen 2 der Morula 7 in einer Kulturschale 8 aufbereitet sein. Alternativ dazu können auch die Zellen- -der inneren Zellmasse 4 der Blastozyste 1 in einer Kulturschale 10 aufbereitet sein. Des weiteren ist es denkbar, die Ko- Kultivierung auch in einer Kulturschale 9 mithilfe von entsprechend aufbereiteten Blastozysten 1 durchzuführen. Techniken zur Ko-Kultivierung von Stammzellen mit anderen Zelltypen sind etwa in [35, 36] beschrieben.

Insbesondere bei der Verwendung von humanen Spenderzellen 6 und beispielsweise deren Injektion in Schwein-Blastozysten 1 besteht über das erfindungsgemäße Verfahren die Möglichkeit, Zelllinien zu erzeugen, deren genetische Eigenschaften vergleichbar, im besten Fall ident zu jenen der ursprünglichen, humanen Spenderzellen 6 sind, obwohl die nach Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens sich entwickelnde Schweins-Blastozyste 1 keineswegs genetisch ident zu den Spenderzellen 6 ist. In einem späteren Entwicklungsstadium der Schweins-Blastozyste 1 können neue, differenzierfähige Zellen oder differenzierte Zelllinien mit genetischer Ähnlichkeit bzw. Identität zu den humanen Spenderzellen 6 und im Optimalfall auch immunologischer Kompatibilität zum Spenderorganismus isoliert werden, ohne dass dies den Einsatz humaner embryonaler Stammzellen erfordern würde. Aus diesen Zelllinien sind Präparate für eine Vielzahl an menschlichen Erkrankungen, wie in den Ansprüchen ausgeführt, herstellbar.

Bei Transfer der Schweins-Blastozyste 1 in ein Leihmuttertier ist es auch denkbar, die Entwicklung von Organen mit genetischer Ähnlichkeit bzw. Identität zu den humanen Spenderzellen 6 und im Optimalfall auch immunologischer Kompatibilität zum Spenderorganismus zu ermöglichen. So könnte mithilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens etwa aus menschlichen Spenderzellen 6, die ohne Verwendung eines Präembryos oder Embryos gewonnen wurden, unter Verwendung einer Schweins-Blastozyste ein Herz eines Schweines aus bis zu 100% menschlichen Zellen resultieren, ohne dabei Leiden des betreffenden Tieres zu verursachen. Das Herz stünde im Optimalfall unter völliger immunologischer Kompatibilität dem Spenderorganismus zur Verfügung.

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Claims

Patentansprüche :

1. Verfahren zur Erzeugung von Zelllinien oder einzelner Organe, wobei differenzierfähige Spenderzellen (6) einer nicht-humanen Morula (7) oder nicht-humanen Blastozyste

(1) zugeführt werden, die unter Bedingungen kultiviert werden, die eine weitere Entwicklung der Morula (7) oder Blastozyste (1) in Stadien, in denen neu gebildete Zelllinien mit höherem Differenzierungsgrad auftreten, gestatten, sowie die Isolierung dieser Zelllinien oder Weiterdifferenzierung dieser Zelllinien in Organe durch Transfer der Blastozyste (1) in ein Leihmuttertier umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen (2) der Morula (7) oder der inneren Zellmasse (4) der Blastozyste (1) über eine im Vergleich zum jeweiligen Wildtyp eingeschränkte Überlebensfähigkeit verfügen oder deren Überlebensfähigkeit durch geeignete Kultivierungsbedingungen herabgesetzt wird, und die der Morula (7) oder Blastozyste (1) zugeführten Spenderzellen (6) unterschiedlichen Differenzierungsgrad aufweisen sowie nicht-embryonalen Ursprungs sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Spenderzellen (6) natürlich vorkommende Stammzellen enthalten.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen (2) der Morula (7) oder der inneren Zellmasse (4) der Blastozyste (1) in einer Kulturschale (8, 9, 10) aufbereitet sind oder zur Aufbereitung einer löslichen Matrixfraktion dienen.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Spenderzellen (6) aus Nabelschnurblut gewonnen werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Spenderzellen (6) aus der Plazenta gewonnen werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Spenderzellen (6) aus dem Knochenmark gewonnen werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Spenderzellen (6) aus dem Fettgewebe gewonnen werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen (2) der Morula (7) oder der inneren Zellmasse (4) der Blastozyste (1) tetraploide Zellen sind.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen (2) der Morula (7) oder der inneren Zellmasse (4) der Blastozyste (1) Zellen aufweist, deren Genom Vektoren enthält, die im Vergleich zum jeweiligen Wildtyp eine letale Sensibilität gegenüber entsprechenden Kultivierungsbedingungen verursachen.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Genom der Spenderzellen (6) einen Vektor enthält, der eine Resistenz gegen Zusätze für Kulturmedien verursacht.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Überlebensfähigkeit der Zellen (2) der Morula (7) oder der inneren Zellmasse (4) der Blastozyste (1) durch Zusatz geeigneter Antikörper herabgesetzt wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Herabsetzung der Überlebensfähigkeit der Zellen (2) der Morula (7) oder der Zellen der inneren Zellmasse (4) der Blastozyste (1) in einer auf die unterschiedlichen Differenzierungsgrade der Spenderzellen (6) abgestimmten und zeitlich wohlgeordneten Weise erfolgt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Zuführen der Spenderzellen (6) in die Morula (7) oder der Blastozyste (1) die Spenderzellen (6) in Kulturschalen mit anderen Blastozysten oder aus anderen Blastozysten isolierten inneren Zellmassen in Kontakt gebracht werden, jene Spenderzellen mit relativ höherer Kontaktaffinität isoliert und der Morula (7) bzw. erstgenannten Blastozyste (1) zugeführt werden.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Zuführen der Spenderzellen

(6) in die Morula (7) oder Blastozyste (1) die Spenderzellen (6) mit einem genetischen Marker ausgestattet werden, die eine Isolierung von Zellen mit niedrigerem Differenzierungsgrad und deren Zuführen in die Morula (7) oder Blastozyste (1) gestatten.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Morula (7) oder Blastozyste (1) um eine Maus-Morula oder Maus- Blastozyste handelt.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Morula (7) oder Blastozyste (1) um eine Schwein-Morula oder Schwein- Blastozyste handelt.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass bei Zufuhr der Spenderzellen (6) zu einer Blastozyste (1) die Zufuhr durch Injektion erfolgt.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass bei Zufuhr der Spenderzellen (6) zu einer Morula (7) die Zufuhr durch Aggregation erfolgt.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Spenderzellen (6) um humane Spenderzellen handelt.

20. Verwendung von gemäß Anspruch 19 erzeugten Zelllinien als Präparat zur diagnostischen und therapeutischen Intervention und für wissenschaftliche Zwecke bei Erkrankungen des Menschen.

21. Verwendung von gemäß Anspruch 19 erzeugten Zelllinien zur Erzeugung von Organstrukturen zur therapeutischen, diagnostischen oder wissenschaftlichen Anwendung bei Erkrankungen des Menschen.

22. Verwendung von gemäß Anspruch 19 erzeugten Zelllinien nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Erkrankungen des Menschen um Herz/Kreislauferkrankungen, neurologische Erkrankungen, Fortpflanzungsstörungen, Krebs, Augenerkrankungen, hormoneile Störungen, Lungenerkrankungen, metabolische Störungen, vererbte Erkrankungen, Erkrankungen des Bewegungs-, Stütz- und Bandapparates, Erkrankungen der Haut, des Knorpels und des Knochens, sowie Autoimmunstörungen handelt.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Spenderzellen (6) um Spenderzellen nicht-humaner Säugetiere handelt.

24. Verwendung von gemäß Anspruch 23 erzeugten Zelllinien als Präparat zur diagnostischen und therapeutischen Intervention und für wissenschaftliche Zwecke bei Erkrankungen nicht-humaner Säugetiere.

25. Verwendung von gemäß Anspruch 23 erzeugten Zelllinien zur Erzeugung von Organstrukturen zur therapeutischen, diagnostischen oder wissenschaftlichen Anwendung bei Erkrankungen nicht-humaner Säugetiere.

26. Verwendung von gemäß Anspruch 23 erzeugten Zelllinien nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Erkrankungen des Säugetiers um Herz/Kreislauferkrankungen, neurologische Erkrankungen, Fortpflanzungsstörungen, Krebs, Augenerkrankungen, hormoneile Störungen, Lungenerkrankungen, metabolische Störungen, vererbte Erkrankungen, Erkrankungen des Bewegungs-, Stütz- und Bandapparates Erkrankungen der Haut, des Knorpels und des Knochens, sowie Autoimmunstörungen handelt.