DE60224338T2

DE60224338T2 - Verfahren zur Sammlung von Zellen in der M oder G1 Phase und zum Kerntransfer mit diesen Zellen

Info

Publication number: DE60224338T2
Application number: DE60224338T
Authority: DE
Inventors: Manami Kato-gun Urakawa; Yoshito Kato-gun Aoyagi
Original assignee: Japanese Research Association for Animal Embryo Transfer Technology
Current assignee: Japanese Research Association for Animal Embryo Transfer Technology
Priority date: 2001-08-14
Filing date: 2002-07-25
Publication date: 2008-12-18
Anticipated expiration: 2022-07-26
Also published as: EP1284285A2; EP1284285A3; JP2003052369A; US20030044974A1; DE60224338D1; EP1284285B1; JP3842597B2; ATE382682T1; US7335811B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Zellen in M-Phase (mitotischer Phase) oder G₁-Phase sowie ein Verfahren zur Kerntransplantation unter Verwendung dieser Zellen.
Es ist wichtig, eine Population von Zellen im jeweils selben Zellzyklus zu gewinnen, um die biochemischen Reaktionen, die im jeweiligen Zellzyklus auftreten, den Mechanismus der Zellproliferation und dergleichen aufzuklären. Von den Verfahren zur Synchronisation des Zellzyklus in der Metaphase der Zellteilung nutzt das Schüttelverfahren von Terashima et al.¹⁾ die Tatsache, dass die Zellen in der Metaphase der Zellteilung sphärisch sind und ihre Adhäsionsfähigkeit an der Kulturplatte gering ist, sodass sie einfach davon abgelöst werden können, was eine Gewinnung der Zellen, die in der Metaphase der Zellteilung synchronisiert wurden, ohne Änderung des physiologischen Zustands ermöglicht. In ihrem Verfahren wird ein Teil des Kulturmediums mit einer Pipette leicht auf die Oberfläche des Kulturmediums aufgeblasen und die Zellen, die dadurch abgelöst werden, werden gewonnen. Von den so gewonnenen Zellen liegen 76,6 bis 87,4% in der M-Phase des Zellzyklus vor, eine Population von Zellen, die zur Gänze in der Metaphase vorliegen, kann durch ihre Verfahren allerdings nicht gewonnen werden.
Andererseits werden zur Synchronisation des Zellzyklus in der Metaphase üblicherweise Colchicin²⁾³⁾, Colcemid⁴⁾, Nocodazol⁵⁾ oder dergleichen verwendet. Zieve et al.⁶⁾ behandelten die Zellen mit Nocodazol und gewannen Zellen durch das Schüttelverfahren, wobei Zellen in einem Ausmaß von 25 bis 34% in der Metaphase erhalten wurden. Allerdings ist die Effizienz der Gewinnung von Zellen in Metaphase somit gering.
Durch die jüngste Kerntransplantationstechnologie, die somatische Zellen verwendet, wurde unter Verwendung der Kerne von Zellen, die durch Serumentzug zur G₀/G₁-Phase induziert wurden, erfolgreich eine lebensfähige Nachkommenschaft hergestellt. Diese Technologie ist auch zur Untersuchung des Verhaltens von Kernen von Embryos, deren Kerne aus Zellen in einem bestimmten Zellzyklus transplantiert wurden, und zur Aufklärung des Entwicklungsmechanismus nützlich. 1997 konnten nämlich Wilmut et al. durch Kerntransplantation unter Verwendung somatischer Zellen⁷⁾ erfolgreich eine lebensfähige Nachkommenschaft erzeugen. In ihrem Verfahren werden die Zellzyklen der Zellen, die als Kernspender zu verwenden sind, in der G₀/G₁-Phase synchronisiert, indem Schafs-Brustdrüsenzellen gezüchtet werden und die Serumkonzentration im Kulturmedium nach Züchtung der Zellen von 5% auf 0,05% verringert wurde, wodurch die Zellen Serumentzug unterworfen werden. Dieses Verfahren wird weit verbreitet zur Herstellung von Kernspendern verwendet. Allerdings hat dieses Verfahren insofern einen Nachteil, als die Fragmentierung von DNA in den Zellen, die Serumentzug unterworfen werden, häufiger auftritt als in Zellen, die nicht Serumentzug unterworfen werden^8),9), sodass der Prozentsatz der Leihmütter, deren Schwangerschaft nicht fortgesetzt werden kann, hoch ist¹⁰⁾, wenn die Zellen, die Serumentzug unterworfen werden, als Kernspender verwendet werden. Als Ergebnis ist die Effizienz der Produktion von somatischen Klonen gering, was problematisch ist.
Dementsprechend ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Gewinnung von Säugetierfibroblastenzellen in M-Phase oder G₁-Phase herzustellen, durch welches der Anteil an Zellen in der gewünschten Phase höher ist, als jener, der durch herkömmliche Verfahren erzielt wird. Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Kerntransplantation bereitzustellen, durch das der Prozentsatz an regenerierten Embryos, die zumindest bis zu verfestigter Morula heranwachsen, höher ist als jener, der durch herkömmliche Verfahren erzielt wird.
Die vorliegenden Erfindung haben intensive Untersuchungen durchgeführt und festgestellt, dass der Prozentsatz an Zellen in M-Phase in der gewonnenen Population von Zellen stark erhöht werden kann durch: (1) Kultivierung von Säugetierzellen auf einem Träger in Gegenwart eines Mittels zur Synchronisation des Zellzyklus in der Metaphase; (2) Schütteln des Trägers und Gewinnung der Zellen, die vom Träger abgelöst werden; und (3) Gewinnung von Zellen mit einem Durchmesser von weniger als 20 μm aus den in Schritt (2) gewonnenen Zellen. Die vorliegenden Erfinder entdeckten auch, dass der Prozentsatz an Zellen in der G₁-Phase in der gewonnenen Zellpopulation durch (1) Kultivierung von Säugetierzellen auf einem Träger in Gegenwart eines Mittels zur Synchronisation des Zellzyklus in der Metaphase; (2) Schütteln des Trägers und Gewinnung der Zellen, die vom Träger abgelöst werden; (3) Kultivieren der in Schritt (2) gewonnenen Zellen in Abwesenheit eines Mittels zur Synchronisation des Zellzyklus in der Metaphase; und (4) Gewinnung von Zellen mit einem Durchmesser von nicht mehr als 15 μm aus den in Schritt (3) kultivierten Zellen, stark erhöht wird. Weiters haben die vorliegenden Erfinder intensive Untersuchungen durchgeführt und festgestellt, dass der Prozentsatz der rekonstruierten Embyros, die zumindest bis zu verfestigter Morula heranwachsen, signifikant erhöht wird, indem G₁-Phasenzellen als Kernspender bei der Kerntransplantation in entkernte Oozyten verwendet werden.
Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Gewinnung von Säugetierfibroblastenzellen in M-Phase bereit, das die folgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge umfasst:

(1) Kultivieren der Säugetierzellen auf einem Träger in Gegenwart eines Mittels zur Synchronisation des Zellzyklus in der Metaphase;
(2) Schütteln des Trägers und Gewinnen der Zellen, die vom Träger abgelöst wurden; und
(3) Gewinnen der Zellen mit einem Durchmesser von nicht weniger als 20 μm und nicht mehr als 30 μm aus den in Schritt (2) gewonnenen Zellen.

Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Gewinnung von Säugetierfibroblastenzellen in der G₁-Phase bereit, das die folgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge umfasst:

(1) Kultivieren der Säugetierzellen auf einem Träger in Gegenwart eines Mittels zur Synchronisation des Zellzyklus in der Metaphase;
(2) Schütteln des Trägers und Gewinnen von Zellen, die von diesem Träger abgelöst wurden;
(3) Kultivieren der in Schritt (2) gewonnenen Zellen in Abwesenheit eines Mittels zur Synchronisation des Zellzyklus in der Metaphase; und
(4) Gewinnen von Zellen mit einem Durchmesser von nicht mehr als 15 μm und nicht weniger als 12 μm aus den in Schritt (3) kultivierten Zellen.

Die vorliegende Erfindung stellt weiters ein Verfahren zur Gewinnung von Säugetierfibroblastenzellen in der G₁-Phase bereit, das die Kultivierung der durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung gewonnenen Zellen in der M-Phase umfasst, um jeder der Zellen zu ermöglichen, sich in zwei Zellen zu teilen; sowie das getrennte Gewinnen von einheitlich geteilten Zellen.
Die vorliegende Erfindung stellt weiters ein Verfahren zur Kerntransplantation bereit, welches das Transplantieren einer durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung gewonnenen nichtmenschlichen Säugetierfibroblastenzelle oder zumindest deren Kerns in eine entkernte nichtmenschliche Oozyte sowie das Kultivieren der resultierenden Zelle umfasst, um ihr zu ermöglichen, sich zu teilen.
Hierin wird auch ein Verfahren zur Produktion eines somatischen Säugetierzellklons bereitgestellt, das die Gewinnung geteilter Zellen durch das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung sowie den Schritt umfasst, ein Säugetier geteilte Zellen, die befruchtet werden sollen, empfangen zu lassen, wobei das Säugetier, das befruchtet werden soll, zur selben Spezies gehört wie das Säugetier, von dem der Embryo stammte.
Durch die vorliegende Erfindung werden Verfahren zur Gewinnung von Zellen in der M-Phase oder G₁-Phase bereitgestellt, durch die der Prozentsatz an M-Phasen- oder G₁-Phasen-Zellen höher ist als jener, der durch herkömmliche Verfahren erzielt wurde. Weiters wird durch die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Kerntransplantation bereitgestellt, durch das der Prozentsatz an rekonstruierten Embryos, die zumindest bis zu verfestigter Morula heranwachsen, signifikant erhöht wird und durch das die Zellen keinem Serumentzug unterworfen werden. Da eine Zellpopulation, deren Zellzyklen in der M-Phase oder G₁-Phase im Wesentlichen synchronisiert wurden, durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten werden kann, ist die vorlie gende Erfindung für Studien der biochemischen Reaktionen, die während des jeweiligen Zellzyklus auftreten, und für Studien des Mechanismus des Zellwachstums sehr nützlich. Im Verfahren der vorliegenden Erfindung ist es nicht notwendig, die Zellen Serumentzug zu unterwerfen, sodass die Zellen nicht durch Serumentzug negativ beeinflusst werden. Weiters wird, da die Wahrscheinlichkeit, dass die rekonstruierten Embryos, die zumindest bis zu verfestigter Morula heranwachsen, durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung signifikant gesteigert wird, erwartet, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung einen großen Beitrag zur Produktion von somatischen Klonen leistet.
Das Verfahren zur Gewinnung von M-Phasenzellen wird nun zuerst beschrieben. Die Zellen, die dem Verfahren der vorliegenden Erfindung unterzogen werden, sind Säugetierfibroblastenzellen. Die Spezies der Säugetiere sind nicht eingeschränkt. Beispiele für Säugetiere umfassen Großvieh, wie z. B. Rinder, Schweine, Schafe, Ziegen und Pferde, Nagetiere wie z. B. Mäuse und Ratten, und Primaten wie z. B. Affen, aber die Säugetiere sind nicht auf die oben angeführten beschränkt. Das Säugetier kann ein nichtmenschliches Säugetier sein. Zellen, in die fremde Gene eingeführt worden sind, oder Zellen, in denen ein spezielles Gen ausgeschaltet wurde, können ebenfalls verwendet werden. In Fällen, wo auf die Produktion eines Klontiers, in das ein fremdes Gen eingeführt wird, abgezielt wird, werden zur leichteren Einführung des Fremdgens Fibroblastenzellen verwendet.
In Schritt (1) des Verfahrens zur Gewinnung von Zellen in derM-Phase gemäß der vorliegenden Erfindung werden Säugetierfibroblastenzellen auf einem Träger in Gegenwart eines Mittels zur Synchronisation des Zellzyklus in der Metaphase kultiviert. Der Begriff „auf einem Träger kultiviert" steht hierin dafür, dass die Zellen in einem Zustand kultiviert werden, in dem sie an den Träger gebunden sind. Mit Ausnahme eines Typs von Zellen, wie z. B. Blutzellen, die nicht die Eigenschaft haben, sich im an den Träger gebundenen Zustand zu vermehren, vermehren sich Säugetierzellen im an den Träger gebundenen Zustand natürlich, wenn sie durch ein übliches Verfahren auf dem Träger kultiviert werden. Als Träger können Petrischalen, die aus Kunststoff oder Glas bestehen, verwendet werden, aber der Träger ist nicht darauf beschränkt.
Das Kulturmedium, das für die Kultur in Schritt (1) verwendet wird, enthält ein Mittel zur Synchronisation des Zellzyklus in der Metaphase (das Mittel wird hierin nachstehend kurz als „Metaphasensynchronisationsmittel" bezeichnet). Das Metaphasensynchronisationsmittel ist nicht eingeschränkt, und es kann ein beliebiges bekanntes Metaphasensynchronisationsmittel verwendet werden. Bevorzugte Beispiele für das Metaphasensynchronisationsmittel umfassen 2-Methoxyöstradiol^11),12), Colchicin^2),3), Colcemid⁴⁾ und Nocodazol⁵⁾. Davon ist 2-Methoxyöstradiol besonders bevorzugt, aber das Metaphasensynchronisationsmittel ist nicht auf die oben angeführten beschränkt. Die Konzentration des Metaphasensynchronisationsmittels ist nicht eingeschränkt und kann auf geeignete Weise abhängig vom Typ des Metaphasensynchronisationsmittels gewählt werden. Beispielsweise kann im Fall von 2-Metoxyöstradiol die Konzentration etwa 0,5 μM bis 1,5 μM betragen, vorzugsweise etwa 0,8 bis 1,2 μM. Die geeignete Konzentration eines Metaphasensynchronisationsmittels kann einfach durch Routineversuche unter Einsatz einer Vielzahl von Konzentrationen des Metaphasensynchronisationsmittels bestimmt werden (siehe Vergleichsbeispiel 2).
Das Kulturmedium, das in Schritt (1) verwendet wurde, kann ein Kulturmedium sein, das üblicherweise in der Kultur der Säugetierzellen verwendet wird, mit der Ausnahme, dass es das Metaphasensynchronisationsmittel umfasst. Beispiele für das Kulturmedium umfassen Minimalmedium (MEM); Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (D-MEM) und 10% fötales Rinderserum (FBS) enthaltendes Minimalmedium (S-MEM), aber das Kulturmedium ist nicht auf die oben angeführten beschränkt. Diese Kulturmedien für die Kultivierung von Säugetierzellen sind kommerziell verfügbar, und kommerziell verfügbare Produkte können vorzugsweise verwendet werden.
Die Kultivierungszeit in Schritt (1) ist nicht eingeschränkt und kann vorzugsweise etwa 15 min bis 1 h betragen, noch bevorzugter etwa 20 bis 40 min. Die Kultivierungstemperatur kann vorzugsweise die Körpertemperatur des Säugetiers sein oder nahe dieser liegen (vorzugsweise ±3°C). in der vorliegenden Erfindung kann die Kultivierungstemperatur, wenn nicht anders angegeben, in beliebigen Kultivierungsschritten vorzugsweise die Körpertemperatur des Säugetiers sein oder nahe dieser liegen.
Der Schritt (1) kann vorzugsweise durch Ersetzen des Kulturmediums von Säugetierzellen, die zuvor auf einem Träger kultiviert wurden, durch ein das Metaphasensynchronisationsmittel enthaltendes Kulturmedium durchgeführt werden. In diesem Fall kann die Zellpopulation vor Ersetzen des Kulturmediums durch jenes, welches das Metaphasensynchronisationsmittel enthält, vorzugsweise Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase umfassen. In Fällen, wo Schritt (1) durch Ersetzen des Kulturmediums durchgeführt wird, ist die oben beschriebene Erklärung von Schritt (1) jene für die Kultur nach Ersetzen des Kulturmediums. Die Kultivierung vor Ersetzen des Kulturmediums kann durch ein herkömmliches Verfahren erfolgen.
Im nachfolgenden Schritt (2) wird ein Teil der Zellen durch Schütteln des Trägers, an dem die Zellen während der Kultivierung in Schritt (1) anhaften, dazu gebracht, sich vom Träger abzulösen. Da M-Phasenzellen im Wesentlichen sphärisch sind und die Adhäsion am Träger schwach ist, werden sie durch eine Schüttelbehandlung wahrscheinlich vom Träger abgelöst. Daher ist der Prozentsatz an M-Phasenzellen in der Zellpopulation, die vom Träger abgelöst wird, beträchtlich höher als jene in der Zellpopulation auf dem Träger. Der Begriff „Schüttelbehandlung" hierin steht für eine Behandlung zur Beschleunigung der Zellen auf dem Träger in paralleler Richtung zum Träger (d. h. in horizontaler Richtung, wenn der Träger horizontal gehalten wird), indem der Träger bewegt wird, und umfasst eine reziproke lineare Bewegung, eine zirkuläre Bewegung und andere willkürliche Bewegungen. Die Bedingungen der Schüttelbehandlung sind nicht eingeschränkt, solange M-Phasenzellen abgelöst werden. Die Schüttelbehandlung kann vorzugsweise mit einer Beschleunigung in zum Träger paralleler Richtung von etwa 0,001 bis 30 g („g” steht hierin für die Erdbeschleunigung), noch bevorzugter etwa 0,2 bis 30 g, noch bevorzugter vorzugsweise 3 bis 30 g, noch bevorzugter 10 g bis 20 g erfolgen, und die Behandlungszeit kann vorzugsweise etwa 10 s bis 2 min umfassen, noch bevorzugter 30 s bis 1 min und 30 s. Die Schüttelbehandlung kann beispielsweise durch lineares oder kreisförmiges Schütteln des Trägers mit einer Schüttelweite (im Fall einer linearen reziproken Bewegung die Entfernung von einem Ende zum anderen Ende der Bewegung; und im Fall einer runden Bewegung der Durchmesser jedes Kreises) von 1 bis 10 mm bei einer Umdrehungszahl von 1000 bis 5000 U/min (im Fall von linearer reziproker Bewegung 1000 bis 5000 Umkehrungen), vorzugsweise mit einer Schüttelweite von 2 bis 4 mm bei einer Umdrehungszahl von 2500 bis 3500 U/min, sodass die Beschleunigung innerhalb des bevorzugten oben angeführten Schutzumfangs liegt. Die Schüttelbehandlung kann durch Schütteln des Trägers mit einer bloßen Hand durchgeführt werden (insbesonders in Fällen, wo die Beschleunigung nicht mehr als 0,1 g beträgt). In Fällen, wo die Schüttelbehandlung mit einer Beschleunigung von nicht weniger als 0,2 g durchgeführt wird, was bevorzugter ist als oben erwähnt, um die Anzahl der gewonnenen M-Phasenzellen zu erhöhen, kann die Schüttelbehandlung durch Befestigung des Trägers (Petrischale oder dergleichen) auf einer Schüttelmaschine, wie z. B. einem im Handel erhältlichen Mischer, durchgeführt werden. Wenn der Träger mit der bloßen Hand und einer Beschleunigung von weniger als 0,2 g geschüttelt wird, werden die Zellen nicht nur einer Beschleunigung in zum Träger paralleler Richtung, sondern auch Wasserdruck durch das Kulturmedium aufgrund der Bewegung des Kulturmediums ausgesetzt. Deshalb können M-Phasenzellen durch geeignete Anpassung der Größe (in Fällen, wo der Träger eine Petrischale ist, des Durchmessers) des Trägers und der Menge an Kulturmedium sogar bei geringer Beschleunigung vergleichsweise effizient gewonnen werden. Die Größe des Trägers und die Menge an Kulturmedium können in geeigneter Weise durch routinemäßige Versuche gewählt werden. Beispielsweise kann in Fällen, wo der Träger eine Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm ist, die Menge an Kulturmedium vorzugsweise 4 bis 6 ml betragen. Es ist anzumerken, dass jedoch die Anzahl der gewonnenen M-Phasenzellen größer ist, wenn sich eine stärkere Beschleunigung ergibt, indem eine Schüttelmaschine, wie z. B. ein Mischer, verwendet wird. Die Zellen, die vom Träger abgelöst werden, können einfach gewonnen werden, beispielsweise durch Zentrifugation des Überstands.
Im nachfolgenden Schritt (3) werden Zellen mit einem Durchmesser von nicht weniger als 20 μm und nicht mehr als 30 μm aus der Zellpopulation gewonnen, die in Schritt (2) gewonnen wurde. Die Zellen, die in Schritt (3) gewonnen werden sollen, können vorzugsweise jene sein, die eine klare Begrenzung durch die Zellmembran haben und die im Wesentlichen sphärisch sind. In Fällen, wo die Zelle nicht sphärisch ist, steht der Begriff „Durchmesser" hierin für den kürzeren Durchmesser. Die Gewinnung der Zellen kann durch Absaugen der Zellen nacheinander mit einer Pipette unter einem Mikroskop durchgeführt werden. Die Pipette kann vorzugsweise einen Innendurchmesser von etwa 20 μm haben, und die Zellen mit dem oben angeführten Durchmesser können durch Gewinnung der Zellen gewonnen werden, die unter leichter Verformung die Pipette passieren. Diese Operation kann vorzugsweise durch Platzieren der Zellen, die in Schritt (2) gewonnen wurden, in ein Kulturmedium, welches das Metaphasensynchronisationsmittel enthält und Gewinnung der Zellen, während die Zellen im Kulturmedium gehalten werden, durchgeführt werden. Die Operation kann vorzugsweise innerhalb von 1 h durchgeführt werden, noch bevorzugter innerhalb von 45 min. Die Temperatur des Kulturmediums während des Gewinnungsvorgangs kann 10 bis 25°C, vorzugsweise 15 bis 20°C betragen.
Der Prozentsatz der normalen M-Phasenzellen in der Zellpopulation, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung gewonnen werden, kann weiter erhöht werden, indem zwischen den Schritten (1) und (2) weitere Schritte des Schüttelns des Trägers, Verwerfens der vom Träger abgelösten Zellen gemeinsam mit dem Kulturmedium sowie Kultivierung der auf dem Träger verbleibenden Zellen in Gegenwart des Metaphasensynchronisationsmittels durchgeführt werden. Diese weiteren Schritte können zumindest einmal durchgeführt werden, und der Zellzyklus der weiteren Schritte kann wiederholt werden. Die weiteren Schritte können vorzugsweise insgesamt ein- bis dreimal durchgeführt werden. Die bevorzugten Bedingungen der Schüttelbehandlung, die in den weiteren Schritten durchgeführt wird, können dieselben sein wie die oben erwähnten bevorzugten Bedingungen der Schüttelbehandlung in Schritt (2), und die bevorzugten Bedingungen der Kultivierung auf dem Träger in Gegenwart des Metaphasensynchronisationsmittels sind dieselben wie die oben erwähnten bevorzugten Bedingungen der Kultivierung in Schritt (1). Der Grund, warum der Prozentsatz der M-Phasenzellen mittels Durchführung der weiteren Schritte weiter erhöht wird, wird wie folgt vermutet. Durch die zumindest einmalige Durchführung der zusätzlichen Schritte werden die meisten Zellen, die in M-Phase vorlagen, bei der Vollendung der Kultivierung in Schritt (1) gemeinsam mit dem Kulturüberstand verworfen, und die Zellen, die auf dem Träger verbleiben, liegen in G₁- bis G₂-Phase vor. Da Zellen in der G₁-Phase nach der Metaphase in den verbleibenden Zellen im Wesentlichen nicht existieren, wird der Prozentsatz an M-Phasenzellen zum Zeitpunkt der Gewinnung nach der Kultivierung weiter erhöht.
Durch das oben beschriebene Verfahren kann der Prozentsatz an M-Phasenzellen in der Population von gewonnen Zellen extrem erhöht werden. In den nachstehend beschriebenen Beispielen betrug der Prozentsatz an M-Phasenzellen in der Population der gewonnenen Zellen 99,1%.
Nun wird das Verfahren zur Gewinnung von G₁-Phasenzellen gemäß vorliegender Erfindung beschrieben. Wie für den Typ von Säugetierzellen, die diesem Verfahren unterzogen werden und wie für Schritt (1) und (2) können genau die obigen Ausführungen zum Verfahren zur Gewinnung von M-Phasenzellen angewendet werden. Deshalb können die Operationen bis zu Schritt (2) auf dieselbe Weise wie oben beschrieben durchgeführt werden. In diesem Verfahren ist es ebenfalls bevorzugt, zusätzlich zumindest einmal, vorzugsweise ein- bis dreimal, Schritte des Schüttelns des Trägers, des Verwerfens der vom Träger abgelösten Zellen gemeinsam mit dem Kulturmedium und des Kultivierens der auf dem Träger vefbleibenden Zellen in Gegenwart des Metaphasensynchronisationsmittels durchzuführen.
In Schritt (3) des Verfahrens zur Gewinnung von G₁-Phasenzellen gemäß vorliegender Erfindung werden die Zellen in Schritt (2) in Abwesenheit des Metaphasensynchronisationsmittels kultiviert. Diese Kultivierung kann nach einem herkömmlichen Verfahren zur Kultivierung von Säugetierzellen durchgeführt werden. Daher kann die Kultivierung in einem oben erwähnten, fachbekannten Medium zur Kultivierung von Säugetierzellen bei einer Temperatur durchgeführt werden, die dieselbe ist wie die Körpertemperatur des Säugetiers, oder bei einer Temperatur, die dieser nahe kommt. Die Kultivierungszeit kann vorzugsweise etwa 15 min bis 1 h betragen, noch bevorzugter etwa 20 bis 40 min. Durch diese Kultivierung gehen die M-Phasenzellen in Schritt (2) in die G₁-Phase über.
Im nachfolgenden Schritt (4) werden Zellen mit einem Durchmesser von nicht weniger als 12 μm und weniger als 15 μm aus der Population kultivierter Zellen gewonnen. Die Zellen, die in Schritt (4) gewonnen werden sollen, können vorzugsweise jene sein, die eine klare Begrenzung durch die Zellmembran aufweisen und im Wesentlichen sphärisch sind. In Fällen, wo die Zelle nicht sphärisch ist, steht der Begriff „Durchmesser" hierin für den kürzeren Durchmesser. Die Gewinnung der Zellen kann durch Absaugen der Zelle nacheinander mit einer Pipette unter einem Mikroskop erfolgen. Die Pipette kann vorzugsweise einen Innendurchmesser von etwa 15 μm umfassen, und die Zellen mit dem oben beschriebenen Durchmesser können durch Gewinnung der Zellen gewonnen werden, die gleichmäßig die Pipette passieren, ohne deformiert zu werden. Diese Operation kann durchgeführt werden, während die Kultur nach Schritt (3) unter einem Mikroskop beobachtet wird. Die Operation kann vorzugsweise innerhalb von 1 h durchgeführt werden, noch bevorzugter innerhalb von 45 min. Die Temperatur des Kulturmediums während des Gewinnungsvorgangs kann 10 bis 25°C betragen, vorzugsweise 15 bis 20°C.
Durch das oben beschriebene Verfahren kann der Prozentsatz an G₁-Phasenzellen in der Zellpopulation extrem erhöht werden. In den nachstehend beschriebenen Beispielen betrug der Prozentsatz an G₁-Phasenzellen in der Population von gewonnenen Zellen 97,9%.
Eine Zellpopulation in der G₁-Phase kann auch durch Kultivierung der Zellen in M-Phase, die durch das oben beschriebene Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung gewonnen werden, um jeder der Zellen zu ermöglichen, sich in zwei Zellen zu teilen, und durch einheitliche Gewinnung der geteilten Zellen erhalten werden. In diesem Fall kann das Kultivieren nach einem herkömmlichen Verfahren unter Verwendung des ursprünglichen Kulturmediums, das kein Metaphasensynchronisationsmit tel enthält, durchgeführt werden. Die Kultivierungsdauer kann vorzugsweise etwa 15 min bis 1 h betragen, noch bevorzugter etwa 20 bis 40 min.
In der Population von M-Phasenzellen oder G₁-Phasenzellen, die durch das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung gewonnen werden, werden die Zellzyklen der Zellen in der Population im Wesentlichen synchronisiert. Deshalb sind sie für Studien, welche biochemische Reaktionen während eines spezifischen Zellzyklus auftreten, und für Studien des Mechanismus der Zellproliferation sehr gut geeignet.
Es wurde erstmals entdeckt, dass durch Durchführung von Kerntransplantation unter Verwendung der durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung gewonnenen Zellen als Kernspender die Wahrscheinlichkeit, dass die wiederhergestellten Embryos, die zumindest bis zu verfestigter Morula heranwachsen, signifikant erhöht wird. Daher stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Kerntransplantation bereit, das die Transplantation einer Zelle (einer nichtmenschlichen Säugetierzelle), die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung gewonnen wurde, oder zumindest ihres Kerns in eine entkernte nichtmenschliche Oozyte und Kultivierung der resultierenden Zelle umfasst, um ihr zu ermöglichen, sich zu teilen. Dieses Kerntransplantationsverfahren kann durch ein herkömmliches Verfahren ausgeführt werden, mit der Ausnahme, dass die Zellen, die durch das oben beschriebene erfindungsgemäße Verfahren gewonnen wurden, als Kernspender verwendet werden, und ein bevorzugtes Beispiel wird im Detail in den nachstehenden Beispielen beschrieben. Die Kerntransplantation kann nicht nur durch Transplantation der gesamten Zelle, die als Spenderzelle verwendet wird, wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben, erfolgen, sondern kann auch unter Transplantation zumindest des Nukleus der Zellen durchgeführt werden. Im letzteren Fall kann der Kern gemeinsam mit dem Zytoplasma transplantiert werden. Dadurch, dass ein nichtmenschliches Säugetier dazu gebracht wird, die geteilten Zellen zu empfangen, die zumindest bis zu verfestigter Morula herangewachsen sind, um das Säugetier zu befruchten, kann ein somatischer Zellklon erhalten werden. In diesem Fall gehört das Säugetier, das befruchtet werden soll, zur selben Spezies wie das Säugetier, aus dem der Embryo stammte. Die Be fruchtung des Säugetiers kann durch ein herkömmliches fachbekanntes Verfahren durchgeführt werden.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Beispielen detaillierter beschrieben. Bevor jedes einzelne Beispiel beschrieben wird, werden Verfahren zur Präparierung der Zellen, zur Synchronisation der Zellen in der Metaphase, zur Herstellung von Präparaten zur Untersuchung des Zellzyklus und zur Beobachtung der Präparate, zur statistischen Analyse und dergleichen beschrieben.
(1) Fötale Fibroblastenzellen
Als Rinderfibroblastenzellen (Japanese Black Cattle) wurden die Zellen aus einem Fötus an Tag 54 nach der Empfängnis verwendet. Der Fötus wurde unter sterilen Bedingungen zerkleinert und mit Trypsin verdaut. Die Zellsuspension wurde gewonnen und in Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM, Gibco BRL, Kat.-Nr. 11885-084, MD, USA) kultiviert, gefolgt von der Aufbewahrung gefrorener Zellen (eine Passage). Für Versuche werden die gefrorenen, gelagerten Zellen auf einer 10-cm-Kunststoff-Petrischale (Falcon, 353003) ausgesät und einmal subkultiviert, und auf logarithmische Wachstumsphase gezüchtete Zellen wurden verwendet.
(2) Synchronisation in der Metaphase
Zur Synchronisation in der Metaphase wurde 10% FBS enthaltendes Grundmedium (S-MEM, Kat.-Nr. 11385-036, Gibco BRL, MD, USA), das mit 2-Methoxyöstradiol (2-MeOE₂, Kat.-Nr. M6383, Sigma Chemical Co., MO, USA) in einer Konzentration von 0,5 M oder 1 μM ergänzt war, verwendet.
(3) Herstellung von Präparaten fötaler Fibroblastenzellen und deren Beobachtung
Fötale Fibroblastenzellen wurden durch Gewinnung des die Zellen enthaltenden Mediums in einem 15-ml-Teströhrchen und Zentrifugation des Mediums (180 g, 5 min) gewonnen. Nach der Zentrifugation wurde das Zellpräzipitat in einer kleinen Menge des Mediums resuspendiert, und die resultierende Zellsuspension wurde einheitlich auf einem Objektträger ausgestrichen. Der Objektträger wurde bei Raumtemperatur luftgetrocknet, und die Zellen wurden fixiert (99,9% Ethanol, 5 min), um Präparate herzustellen.
Jedes Präparat wurde mit Hoechst 33342 gefärbt (Sigma Chemical Co, MO, USA) und mit einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Nur die Zellen mit einer klaren Begrenzung durch die Zellmembran wurden für eine Beurteilung verwendet. In den Vergleichsbeispielen 1 und 2 wurden Zellen in der Prophase, Metaphase, Anaphase und Telophase des Zellzyklus als Zellen in mitotischer Phase (M-Phase) klassifiziert. Zellen, die nur einen Kern enthielten, der mit einer Kernmembran bedeckt war, wurden als Zellen in der Interphase klassifiziert. Zellen, in denen der Kern im Zytoplasma fragmentiert war, Zellen, die keinen Kern im Zytoplasma enthielten, und Zellen, die mehrere Kerne im Zytoplasma aufwiesen, wurden als abnorme Zellen klassifiziert. In Beispiel 1 und 2 wurden M-Phasenzellen weiters als normale Metaphasenzellen (der eine Kern in der Metaphase befand sich im Zytoplasma) und als abnorme Metaphasenzellen (die zwei oder mehr Kerne in Metaphase befanden sich im Zytoplasma) klassifiziert. Die Zellen in der Interphase wurden in normale Interphasenzellen (im Zytoplasma existierte nur ein Kern mit Kernmembran) und abnorme Interphasenzellen (zwei oder mehr Kerne mit Kernmembran lagen im Zytoplasma vor, oder der Kern im Zytoplasma war fragmentiert) klassifiziert.
(4) Statistische Analyse
Die Werte, die in den Vergleichsbeispielen 1 und 2 und in Beispiel 4 erhalten wurden, wurden mittels ANOVA analysiert und Werte mit einem Signifikanzgrad von nicht mehr als 5% wurden als signifikant beurteilt.
(5) Zellkultur
Sofern nicht anders angegeben, wurden Zellen bei 35 bis 40°C kultiviert. Die Auswahl von Zellen unter Verwendung einer Pipette erfolgte bei 10 bis 25°C.
Vergleichsbeispiel 1 – Schüttelbehandlung
Das D-MEM-Medium in einer Kunststoff-Petrischale (Durchmesser: 10 cm), das Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase enthielt, wurde durch 5 ml S-MEM ersetzt (das kein 2-MeOE₂ enthielt), und die Kultivierung der Zellen wurde fortgesetzt. Dreißig Minuten später wurde der gesamte Kulturüberstand, nachdem die Petrischale einer Schüttelbehandlung unterzogen wurde oder ohne Schüttelbehandlung, gewonnen. Die Schüttelbehandlung wurde gründlich durch festes Anbringen der Unterseite der Petrischale an einem Mischer (IKEDA RIKA, D-10) durchgeführt, und mit dem Mischer wurde die Petrischale 1 min lang im Kreis bewegt (3000 U/min, Durchmesser der Kreisbewegung: 0,3 cm). Die Anzahl an Zellen wurde unter Verwendung einer Aliquote des gewonnenen Kulturüberstands gezählt, und der übrige Kulturüberstand wurde zentrifugiert (1000 U/min, 5 min). Das Zellpellet wurde in einer kleinen Menge des Mediums resuspendiert und die erhaltene Zellsuspension wurde auf einem Objektträger ausgestrichen.
Der Einfluss der Schüttelbehandlung auf die Anzahl an Zellen, die an die Unterseite der Kunststoff-Petrischale anhafteten, und auf den Zellzyklus der Zellen wurde untersucht. Die Kunststoffpetrischale wurde nach Verwerfen des Kulturüberstands mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (hierin nachstehend als „PBS(–)" bezeichnet) gewaschen, und es wurde 0,25%ige Trypsinlösung hinzugefügt, wodurch die Zellen, die am Boden der Petrischale anhafteten, abgelöst wurden. Nach der Ablösung wurde die Anzahl der Zellen unter Verwendung einer Aliquote der Zellsuspension gezählt. Die übrige Suspension wurde zentrifugiert, und das Präzipitat wurde auf dieselbe Weise ausgestrichen wie oben für den Kulturüberstand beschrieben. Das Schmierpräparat wurde luftgetrocknet, fixiert, gefärbt und beobachtet.
Als Ergebnis wurden im Fall, wo die Zellen ohne Schüttelbehandlung aus dem Kulturüberstand gewonnen wurden, 0,03 × 10⁶ Zellen gewonnen. Von den Zellen lagen 13,7% in der M-Phase und 66,5% in der Interphase vor, und 19,8% waren abnorme Zellen. Andererseits wurden im Fall, wo die Zellen nach Durchführung einer Schüttelbehandlung aus dem Kulturüberstand gewonnen wurden, 0,19 × 10⁶ Zellen gewonnen, d. h. etwa 6-mal so viele wie ohne Schüttelbehandlung. Unter den gewonnenen Zellen lagen 26,1% in der M-Phase und 66,7% in der Interphase vor, und 7,3 % waren abnorme Zellen. Daher wurde durch Durchführung der Schüttelbehandlung der Prozentsatz an M-Phasenzellen im Kulturüberstand signifikant erhöht (P < 0,05). Obwohl der Prozentsatz der normalen Interphasenzellen durch die Schüttelbehandlung nicht geändert wurde, waren abnorme Zellen signifikant verringert (P < 0,05) (Tabelle 1).
Was die am Boden der Petrischale anhaftenden Zellen betrifft, die mittels Verdau mit Trypsin gewonnen wurden, wurden 4,87 × 10⁶ Zellen gewonnen, und 98,1% davon waren Interphasenzellen, wenn die Schüttelbehandlung nicht durchgeführt wurde. Andererseits wurden im Fall, wo die Schüttelbehandlung durchgeführt wurde, 3,60 × 10⁶ Zellen gewonnen, und 98,5% davon waren Interphasenzellen. Ein Einfluss der Schüttelbehandlung auf die Anzahl der am Boden der Kunststoffpetrischale anhaftenden Zellen und auf den Prozentsatz der Zellen im jeweiligen Zellzyklus wurde nicht beobachtet (P > 0,05) (Tabelle 2).
Vergleichsbeispiel 2 – Kombination von Metaphasensynchronisationsmittel und Schüttelbehandlung
Unter 3-maliger aufeinanderfolgender Wiederholung des Schritts der Schüttelbehandlung und der nachfolgenden Gewinnung wurde untersucht, wie sich die Zellzyklen der aus dem Kulturüberstand gewonnenen Zellen durch eine Kombination von Metaphasensynchronisationsmittel (2-MeOE₂) und Schüttelbehandlung änderten. Das heißt, D-MEM-Medium in einer Petrischale, die Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase enthielt, wurde mit 5 ml S-MEM-Medium ersetzt (das 0,5 μM oder 1,0 μm 2-MeOE₂ enthielt), und die Kultivierung wurde fortgesetzt. Dreißig Minuten später wurde die Schüttelbehandlung wie in Vergleichsbeispiel 1 durchgeführt, und der Kulturüberstand wurde zentrifugiert (1000 U/min, 5 min), um Zellen zu gewinnen (erstmalig gewonnene Zellen). Zur Kunststoff-Petrischale wurden nach Verwerfen des Kulturüberstands 5 ml frisches S-MEM-Medium hinzugefügt (das 0,5 μM oder 1,0 μM 2-MeOE₂ enthielt), und die Kultivierung wurde weitere 30 min lang fortgesetzt. Dreißig Minuten später wurde wie beim ersten Mal eine Schüttelbehandlung durchgeführt, und der Kulturüberstand wurde zentrifugiert, um Zellen zu gewinnen (zum zweiten Mal gewonnene Zellen). Zur Kunststoff-Petrischale wurden nach Verwerfen des Kulturüberstandes 5 ml frisches S-MEM-Medium hinzugefügt (das 0,5 μM oder 1,0 μM 2MeOE₂ enthielt), und die Kultivierung wurde weitere 30 min lang fortgesetzt. Dreißig Minuten später wurde eine Schüttelbehandlung wie beim ersten und zweiten Mal durchgeführt, und der Kulturüberstand wurde zentrifugiert, um Zellen zu gewinnen (zum dritten Mal gewonnene Zellen). Die unter Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen des Metaphasensynchronisationsmittels und zu verschiedenen Gewinnungszeitpunkten erhaltenen Zellen wurden in einer kleinen Menge des Mediums resuspendiert, und es wurden Schmierpräparate hergestellt. Die Schmierpräparate wurden luftgetrocknet, fixiert, gefärbt und beobachtet.
Durch Kombination der Synchronisation des Zellzyklus mit 2-MeOE₂ und der Schüttelbehandlung wurde der Prozentsatz an M-Phasenzellen im Vergleich zum Fall, wo nur eine Schüttelbehandlung ohne Behandlung mit 2-MeOE₂ durchgeführt wurde (Vergleichsbeispiel 1, 26,1%) erhöht (28,8 bis 81,2%) (Tabelle 3). Der Prozentsatz an M-Phasenzellen war bei den erstmalig, zum zweiten Mal und zum dritten Mal gewonnenen Zellen jeweils signifikant höher (P < 0,05), wenn die Konzentration von 2-MeOE₂ 1,0 μM betrug, als wenn die Konzentration von 2-MeOE₂ 0,5 μM betrug. In Fällen, wo die Zellen mit 0,5 μM 2-MeOE₂ 30 min lang behandelt wurden, war der Prozentsatz an M-Phasenzellen bei den zum zweiten und zum dritten Mal gewonnenen Zellen signifikant höher (P < 0,05) als bei den erstmalig gewonnenen Zellen (Tabelle 3). Andererseits stieg der Prozentsatz an M-Phasenzellen in Fällen, wo die Zellen mit 1,0 μM 2-MeOE₂ 30 min lang behandelt wurden, mit der Anzahl der Gewinnungen der Zellen signifikant an (P < 0,05). Andererseits waren die Prozentsätze an normalen Interphasenzellen und abnormen Zellen bei den zum zweiten und zum dritten Mal gewonnenen Zellen signifikant geringer als bei den erstmalig gewonnenen Zellen, unabhängig davon, ob die Konzentration von 2-MeOE₂ 0,5 μM oder 1,0 μM betrug.
Beispiel 1 – Gewinnung von M-Phasenzellen
D-MEM-Medium in einer Petrischale, das Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase enthielt, wurde durch 5 ml S-MEM-Medium ersetzt, das 1,0 μM 2-MeOE₂ enthielt, und die Kultur wurde fortgeführt. Dreißig Minuten später wurde eine Schüttelbehandlung wie in Vergleichsbeispiel 1 durchgeführt, und der Kulturüberstand wurde verworfen. Zur Petrischale wurde nach Verwerfen des Kulturüberstands frisches S-MEM-Medium, das 1 μM 2-MeOE₂ enthielt, hinzugefügt, und die Kultur wurde weitere 30 min lang fortgeführt. Dreißig Minuten später wurde eine Schüttelbehandlung wie oben beschrieben durchgeführt, und der Kulturüberstand wurde zentrifugiert (1000 U/min, 5 min lang), um Zellen (zum zweiten Mal gewonnene Zellen) zu gewinnen. Eine Aliquote der gewonnenen Zellen wurde auf D-MEM-Medium übertragen, das 1 μM 2-MeOE₂ enthielt, und im Wesentlichen sphärische Zellen mit einer klaren Zellmembrangrenze und einem geringfügig größeren Durchmesser als 20 μm wurden innerhalb von 30 min unter Verwendung einer Glaspipette (COOK, Kat.-Nr. PBBP-2000) mit einem Innendurchmesser von 20 μM ausgewählt. Die ausgewählten Zellen wurden unmittelbar auf phosphatgepufferte Kochsalzlösung (D-PBS) übertragen, die Hoechst 33342 und 1 μM 2-MeOE₂ enthielt, und die Zellzyklen wurden unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop bestimmt.
So wurden die Zellen mittels 1 μM 2-MeOE₂ in der M-Phase synchronisiert, und die Zellen im Kulturüberstand der zweiten Kultur wurden nach Schüttelbehandlung gewonnen. Die Zellen mit einem Durchmesser von nicht weniger als etwa 20 μM wurden daraus ausgewählt und beobachtet. Als Folge waren 99,1% der gewonnenen Zellen M-Phasenzellen (Tabelle 4). Weiters waren die meisten (98,8%, 243/246) der gewonnenen Zellen normale Metaphasenzellen.
Beispiel 2 – Gewinnung von G₁-Phasenzellen (1)
Die zum zweiten Mal gewonnenen Zellen, die in Beispiel 1 erhalten wurden, wurden auf 10% FBS enthaltendes D-MEM-Medium (das kein 2-MeOE₂ enthielt) übertragen und 30 min lang in einem CO₂-Inkubator kultiviert. Dreißig Minuten später wurden im Wesentlichen sphärische Zellen mit einer klaren Zellmembrangrenze und einem geringfügig kleinerem Durchmesser als 15 μm innerhalb von 30 bis 45 min unter Verwendung einer Glaspipette (COOK, Kat.-Nr. PBBP-1500) mit einem Innendurchmesser von 15 μM ausgewählt. Die ausgewählten Zellen wurden unmittelbar mit Hoechst 33342 gefärbt, und die Zellzyklen wurden unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop bestimmt.
Somit betrug durch Gewinnung von Zellen im Kulturüberstand der zweiten Kultur in einem Medium, das kein 2-MeOE₂ enthielt, für 30 min und durch nachfolgende Auswahl von Zellen mit einem Durchmesser von nicht mehr als etwa 15 μm der Prozentsatz an Interphasenzellen 97,9%, und 95,5% (148/155) davon waren normale Interphasenzellen (Tabelle 5).
Beispiel 3 – Gewinnung von G₁-Phasenzellen (2)
D-MEM-Medium in einer Petrischale, die Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase enthielt, wurde durch 5 ml S-MEM-Medium ersetzt, das 1 μM 2-MeOE₂ enthielt, und die Kultivierung wurde fortgesetzt. Dreißig Minuten später wurde eine Schüttelbehandlung wie in Vergleichsbeispiel 1 durchgeführt, und der Kulturüberstand wurde verworfen. Zur Petrischale wurde nach Verwerfen des Kulturüberstands frisches S-MEM-Medium hinzugefügt, das 1 μM 2-MeOE₂ enthielt, und die Kultur wurde weitere 30 min lang fortgeführt. Dreißig Minuten später wurde eine Schüttelbehandlung wie oben beschrieben durchgeführt, und der Kulturüberstand wurde zentrifugiert (1000 U/Min, 5 min), um Zellen zu gewinnen (zum zweiten Mal gewonnene Zellen). Die gewonnenen Zellen wurden auf TCM199-Medium ausplattiert (Gibco BRL, Kat.-Nr. 12340-030, MD, USA, das 1 μM 2-MeOE₂ enthielt), das 5% fötales Rinderserum (FBS) enthielt, und im Wesentlichen sphärische Zellen mit einer klaren Zellmembrangrenze und einem geringfügig größeren Durchmesser als 20 μm wurden innerhalb von 60 min unter Verwendung einer Glaspipette (COOK, Kat.-Nr. PBBP-2000) mit einem Innendurchmesser von 20 μm ausgewählt (M-Phasenzellen). Die ausgewählten Zellen wurden in einem CO₂-Inkubator (5% CO₂ und 95% Luft) bei 38°C kultiviert und darin 30 min lang unter einer Atmosphäre inkubiert. Innerhalb von 30 min nach der Inkubation wurden Zellen, die einheitlich in zwei Zellen geteilt waren, ausgewählt, und die Zellen wurden nach Auftrennung der zwei Zellen zu einzelnen Zelle (G₁-Phasenzellen) gewonnen.
Beispiel 4, Vergleichsbeispiel 3
Unter Verwendung von Zellen, deren Zellzyklen nicht synchronisiert waren (Vergleichsbeispiel 3), oder von Zellen, die in der G₁-Phase synchronisiert waren und die in Beispiel 3 gewonnen wurden (Beispiel 4), als Kernspender wurde Kerntransplantation durchgeführt, und die Fusion von Membranen zwischen dem Kernspender und dem Zytoplasma der entkernten, gereiften Oozyte, die Spaltung zu einem Embryo im zweizelligen Stadium oder einem Embryo im achtzelligen Stadium sowie die Entwick lung bis zu verfestigter Morula oder weiter wurden verglichen. Die Zellen, deren Zellzyklen nicht synchronisiert waren, wurden durch Kultivierung von fötalen Fibroblastenzellen, bis die Zellen etwa 80% der Fläche des Bodens der Wells einer 96-Well-Platte besetzten (Nunc, 167008) (80% konfluente Zellen), und Behandlung der Zellen mit Trypsin gewonnen.
Entkernte Oozyten wurden durch reifende Rinderovarialfollikeleier in vitro (19 bis 20 h, 5% CO₂, 95% Luft); Entfernung von Kumuluszellen in mit 0,1% Hyaluronidase ergänztem PBS(–); Auswahl von Oozyten, die einen primären Polarkörper und ein einheitliches Zytoplasma aufwiesen; und Entfernung des Kerns der Oozyten unter Verwendung eins Mikromanipulators¹³⁾ hergestellt. Der Nachweis der Entfernung des Kerns erfolgte durch Inkubation des entfernten Zytoplasmas des Eis in einem Medium, das Hoechst 33342 enthielt, 20 bis 30 min lang bei 39°C und Beobachtung des Resultats unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop. Die entkernten Oozyten, deren Zytoplasma, das daraus entfernt wurde, einen Kern enthielt, wurden für die Versuche verwendet. Bei der Kerntransplantation wurde der Kernspender (die gesamte Zelle) in den pervitellinen Raum der entkernten Oozyte insertiert, und in 0,3 M Mannitlösung¹⁴⁾, die 0,05 M CaCl₂ und 0,1 mM MgSO₄ enthielt, wurde nach 23 bis 25 h nach In-vitro-Reifung ein Gleichstrom angelegt (30 V/150 μm, 10 μs, 1x). Danach wurde eine komplexe Aktivierungsbehandlung¹⁵⁾ unter Verwendung von Calonophor und Cycloheximid (Sigma Chemical Co., MO, USA) und Entwicklungskultivierung durch Co-Kultur mit Rinderoviduktepithel durchgeführt. Eine Aliquote der rekonstruierten Embryos wurde mit Hoechst 33342 30 min lang 19 h nach Anlegen des Gleichstroms (d. c.) gefärbt, und das Resultat wurde unter einem invertiertem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Jene, die einen Kern im Zytoplasma enthielten, wurden als fusionierte Embryos klassifiziert. Die Fusionsrate wurde durch Division der Anzahl an fusionierten Embryos durch die Anzahl an hergestellten kerntransplantierten Embryos berechnet. Unter Verwendung der übrigen kerntransplantierten Embryos wurde die Teilung zu zweizelligen oder achtzelligen Embryos am dritten Tag nach der Kerntransplantation beurteilt, und die Entwicklung bis zu verfestigter Morula wurde am sechsten Tag nach der Kerntransplantation beurteilt. Der Anteil an Embryos, die sich erfolgreich in zweizellige oder achtzellige Embryos geteilt hatten oder sich erfolgreich bis zu verfestigter Morula entwickelt hatten, wurde durch Division der Anzahl an Embryos, die sich erfolgreich in zweizellige oder achtzellige Embryos geteilt hatten oder sich erfolgreich bis zu verfestigter Morula entwickelt hatten, durch die geschätzte Anzahl an fusionierten Embryos berechnet. Die geschätzte Anzahl an fusionierten Embryos wurde durch Multiplikation der hergestellten kerntransplantierten Embryos mit der Fusionsrate berechnet.
Als Ergebnis betrugen die Fusionsraten zwischen dem Kernspender und der entkernten Oozyte 78,7% (unter Verwendung von zu 80% konfluenten Zellen) bzw. 63,0% (unter Verwendung von G₁-Phasenzellen). Obwohl die Fusionsrate im Fall, wo zu 80% konfluente Zellen verwendet wurden, höher war, als im Fall, wo die G₁-Phasenzellen verwendet wurden, wurde kein signifikanter Unterschied beobachtet (P > 0,05) (Tabelle 6). Ob eine Synchronisation des Zellzyklus erfolgte oder nicht, beeinflusste die Rate an Embryos, die sich erfolgreich in zweizellige oder achtzellige Embryos geteil hatten, nicht. Allerdings war der Anteil an Embryos, die sich an Tag 6 erfolgreich bis zu verfestigter Morula entwickelt hatten, im Fall, wo die Synchronisierung des Zellzyklus erfolgte, signifikant höher (P < 0,05) als im Fall, wo keine Synchronisierung des Zellzyklus erfolgte.
Beispiel 4 – Befruchtung von jungen Kühen mit hergestellten Embryos
Eine Aliquote von Embryos, die sich erfolgreich zu Blastozyten entwickelt hatten, wurde in 10 junge Kühe transplantiert, sodass jede Kuh einen einzigen Embryo erhielt. Ob die Kühe befruchtet waren oder nicht, wurde unter Verwendung eines Ultraschalldiagnosegeräts nach 20 bis 26 Tagen nach der Transplantation überprüft (das entspricht 27 bis 33 Tage nach der Empfängnis). Als Ergebnis wurde die Trächtigkeit aller 10 Kühe bestätigt. An 54 bis 55 Tagen nach Transplantation (das entspricht 60 bis 63 Tage nach der Empfängnis) wurde die Trächtigkeit erneut überprüft. Als Ergebnis wurde die Trächtigkeit aller Kühe mit Ausnahme einer einzigen Kuh bestätigt.

Claims

Verfahren zur Gewinnung von Zellen in M-Phase, umfassend die folgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge: (1) Kultivieren von Säugetier-Fibroblastenzellen auf einem Träger in Gegenwart eines Mittels zur Synchronisation des Zellzyklus in der Metaphase; (2) Schütteln dieses Trägers und Gewinnen von vom Träger abgelösten Zellen, und (3) Gewinnen von Zellen mit einem Durchmesser von nicht weniger als 20 μm und nicht mehr als 30 μm aus den in Schritt (2) gewonnenen Zellen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin Schritt (3) durchgeführt wird, indem die Zellen mit diesem Durchmesser in einem Kulturmedium gesammelt werden, welches das Mittel zur Synchronisation des Zellzyklus in der Metaphase enthält.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, das weiters die zusätzlichen Schritte des Schütteln des Trägers; des Verwerfens von vom Träger abgelösten Zellen zusammen mit dem Kulturmedium; und des Kultivierens von Zellen, die auf dem Träger zurückbleiben, in Gegenwart des Mittels zur Synchronisation des Zellzyklus in der Metaphase zwischen Schritt (1) und Schritt (2) umfasst, wobei die zusätzlichen Schritte zumindest einmal durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 3, worin die zusätzlichen Schritte ein bis dreimal durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin Schritt (3) durchgeführt wird, indem die Zellen mit einer Pipette mit einem Innendurchmesser von 20 μm aufgesaugt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Mittel zur Synchronisation des Zellzyklus in der Metaphase 2-Methoxyöstradiol ist.
Verfahren zur Gewinnung von Zellen in G₁-Phase, umfassend die folgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge: (1) Kultivieren von Säugetier-Fibroblastenzellen auf einem Träger in Gegenwart eines Mittels zur Synchronisation des Zellzyklus in der Metaphase; (2) Schütteln des Trägers und Gewinnen von vom Träger abgelösten Zellen; (3) Kultivieren von in Schritt (2) gewonnenen Zellen in Abwesenheit eines Mittels zur Synchronisation des Zellzyklus in der Metaphase; und (4) Gewinnen von Zellen mit einem Durchmesser von nicht mehr als 15 μm und nicht weniger als 12 μm aus den in Schritt (3) kultivierten Zellen.
Verfahren nach Anspruch 7, das weiters die zusätzlichen Schritte des Schüttelns des Trägers; des Verwerfens von vom Träger abgelösten Zellen zusammen mit dem Kulturmedium; und des Kultivierens von auf dem Träger zurückbleibenden Zellen in Gegenwart des Mittels zur Synchronisation des Zellzyklus in der Metaphase zwischen Schritt (1) und Schritt (2) umfasst, wobei die zusätzlichen Schritte zumindest einmal durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 8, worin die zusätzlichen Schritte ein- bis dreimal durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, worin Schritt (4) durchgeführt wird, indem die Zellen mit einer Pipette mit einem Innendurchmesser von 15 μm aufgesaugt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, worin das Mittel zur Synchronisation des Zellzyklus in der Metaphase 2-Methoxyöstradiol ist.
Verfahren zur Gewinnung von Säugetier-Fibroblastenzellen in G₁-Phase, umfassend das Kultivieren der durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 gewonnenen Zellen in M-Phase, um jeder Zelle zu ermöglichen, sich in zwei Zellen zu teilen; und das separate Gewinnen von Zellen, die sich einheitlich geteilt haben.
Verfahren zur Kerntransplantation, umfassend das Gewinnen einer nichtmenschlichen Säugetier-Fibroblastenzelle durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12 und das Transplantieren der Zelle oder zumindest deren Kerns in einen entkernten nicht-menschlichen Oozyt; und das Kultivieren der resultierenden Zelle, um ihr zu ermöglichen, sich zu teilen.
Verfahren nach Anspruch 13, worin sich die Zelle, die als Kernspender verwendet wird, in G₁-Phase befindet.
Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, worin das Kultivieren fortgesetzt wird, bis die rekonstruierten Embryos zumindest zu verfestigten Morula anwachsen.