KR20240023413A - 체외 소형 난소 형성 방법 - Google Patents
체외 소형 난소 형성 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 체외 소형 난소 형성 기술에 관한 것으로서, 효소 및 소정 크기의 메쉬를 이용해 균일한 크기의 난소 및 난자를 형성하는 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 체외에서 생식선(gonad)으로부터 적정 크기의 난소를 형성하고, 그 난소로부터 성숙된 난자를 획득하는 기술에 관한 것이다.
최근, 불임으로 인한 환자가 증가되고 있는 가운데, 저출산 시대 극복 및 난임 환자 치료를 위해 체외 인간 난자 생산에 관한 연구는 생식의학 분야에 있어서 매우 중요한 연구과제이다. 등록특허 제2096522호에서는 분리된 원시 난포 (primordial follicle)를 인슐린, KO-SR (knockout serum replacement) 및 bFGF (basic fibroblast growth factor)를 포함하는 조성물에서 배양하여 성숙 난자를 제조하는 방법을 개시한다.
여성 불임의 원인은 난소 기능 감소 및 배란 장애 등 여러 가지 요인이 있는 것으로 확인되었다. 여성이 평생 배란할 수 있는 난자의 개수는 300-500개 정도로 정해져 있다. 노화가 시작되는 시점인 35-37세부터는 난자의 개수 또한 크게 줄고 대부분 50세 무렵이면 폐경에 이른다. 이러한 문제로 많은 양의 난자를 생성하기 어려운 문제가 있으며, 윤리적인 문제로 난자취득의 어려움이 있다. 체외에서 많은 양의 건강한 난자를 얻을 수 있다면, 인공수정에 있어서도 높은 확률의 수정률과 인공수정에 들어가는 비싼 비용을 절감할 수 있어 난임과 저출산 문제에 해결책이 될 수 있다.
지구온난화와 같은 기후변화, 환경오염 등으로 많은 동물들이 멸종위기를 맞고 있다. 멸종위기의 희귀 동물들을 후세에까지 보존할 수 있는 방법으로 난자 생성이 중요하다. 체외에서 건강한 난자를 많이 생성하고 보존할 수 있다면, 짝짓기를 통한 수정이 아니더라도 멸종위기의 동물들을 구해낼 수 있고 생태계 보존에도 큰 역할을 할 수 있다. 또한, 산업동물이나 가축의 번식에서도 우량 동물을 선발적으로 선택하여 수정시킬 수 있다.
따라서, 인간이나 동물의 체외에서 많은 양의 정상적인 성숙 난자를 효율적으로 획득할 수 있는 방법의 개발이 절실하다.
체외에서 난소를 형성할 때 생식선을 그대로 배양을 하거나 만능성 줄기세포 유래 원시생식세포와 배아 유래 생식선 체세포와 공동 배양을 한다. 그러나, 이와 같은 방법으로 체외 난소를 형성하면 많은 난자들이 포함되어 있어서, 인슐린 주사바늘을 이용하거나 효소 처리를 하는 등으로 난자를 하나하나 분리하여야 하는데, 이 과정에서 많은 난자들이 소실되거나 손상되어 건강하고 성숙된 난자를 얻는데 어려움이 있다.
따라서, 본 발명은 체외에서 건강한 성숙 난자를 효율적으로 생산하는 방법을 제공하는 것을 해결과제로 한다.
본 발명의 일 목적은 분리된 생식선(gonad)으로부터 적정 크기의 체외 난소를 형성하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 목적은 최소한의 난자를 생산할 수 있는 균일한 적정 크기의 체외 난소를 형성하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 목적은 체외에서 난자의 손실을 최소화하여 많은 양의 정상적인 난자를 획득하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 목적은 분리된 생식선으로부터 적정 크기의 체외 난소를 형성시키기 위한 키트를 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 발명자들은 생쥐 배아의 생식선을 분리하여 분화 배양액을 사용하여 체외에서 배양하여 체외 난소가 형성되는 것을 확인하였다(도 1 및 도 2). 형성된 체외 난소로부터 단일 난포를 분리하고 성장 배양액을 사용하여 배양하여 난자의 성장을 유도하는데 성공하였으며, 체외에서 생쥐 배아의 생식선으로부터 난자를 생산하는 것이 가능하다는 것을 확인하였다.
본 발명의 발명자들은 하나 또는 적은 수의 난자를 포함하는 난소를 형성하기 위하여 암컷 생쥐 배아의 생식선을 트립신-EDTA를 처리하여 단일 세포 형태로 만든 후 Matrigel, trans-well 및 U-bottom 등 다양한 배양접시에서 배양하더라도 난포형성이 어렵다는 것을 발견하였다(도 3 내지 도6).
본 발명의 발명자들은 이러한 문제점을 해결하기 위하여 다방면으로 연구한 결과, 놀랍게도 생쥐 배아의 생식선을 소정의 크기의 세포 덩어리로 분리하여 체외 난포 형성을 유도하면 난자가 포함된 난포의 형성이 성공적으로 이루어 진다는 것을 발견하였다. 특히, 상기 생식선에 콜라게나아제 IV를 적정시간 처리하면 10~20개의 세포 덩어리의 분리가 가능하고, 이를 100 ㎛ 및/또는 70 ㎛의 구멍 크기를 가지는 메쉬로 필터링하여 메쉬를 통과하는 세포 덩어리를 제외시키고 나머지를 배양하면 적은 수의 난포가 형성되며, 단일 난포도 형성되는 것을 확인할 수 있었다(도 7 내지 도 11).
이렇게 형성된 난포에 포함된 체외 형성된 난자는 잘 성숙되었으며, Oct4, Ddx4, GDF9을 발현하고, Ddx4가 발현되는 난자 주위로 난포의 형성이 잘 되어 있는 것을 확인하였다(도 12 내지 15).
상기와 같은 실험결과를 바탕으로 본 발명은 일 측면에서, (a) 분리된 암컷의 생식선(gonad)을 세포 덩어리로 분리하는 단계; (b) 상기 세포 덩어리를 소정 크기의 구멍을 가진 메쉬(mesh)로 거르는 필터링 단계; 및 (c) 상기 메쉬를 통과하지 않은 소정 크기의 세포 덩어리를 배양하는 단계를 포함하는 체외 소형 난소를 형성하는 방법을 제공한다.
본 발명은 일 측면에서, 상기 단계 (a)에서 효소를 사용하는 것을 특징으로 하는 체외 소형 난소를 형성하는 방법을 제공한다.
본 발명은 일 측면에서, 상기 단계 (a)에서 콜라게나아제 IV 효소를 사용하는 것을 특징으로 하는 체외 소형 난소를 형성하는 방법을 제공한다.
본 발명은 일 측면에서, 상기 단계 (a)에서 효소 및 물리적인 방법을 함께 사용하는 것을 특징으로 하는 체외 소형 난소를 형성하는 방법을 제공한다.
본 발명은 일 측면에서, 상기 단계 (b)에서 100 ㎛ 또는 70 ㎛의 구멍 크기를 가지는 메쉬를 사용하는 것을 특징으로 하는 체외 소형 난소를 형성하는 방법을 제공한다.
본 발명은 일 측면에서, 단계 (c)에서 aMEM-체외 분화 배양액을 사용하는 것을 특징으로 하는 체외 소형 난소를 형성하는 방법을 제공한다.
본 발명은 일 측면에서, 단계 (c)에서 전반에 aMEM-체외 분화 배양액을 사용하고 후반에 StemPro-체외 분화 배양액을 사용하는 것을 특징으로 하는 체외 소형 난소를 형성하는 방법을 제공한다.
본 발명은 일 측면에서, (a) 분리된 암컷의 생식선(gonad)을 세포 덩어리로 분리하는 단계; (b) 상기 세포 덩어리를 소정 크기의 구멍을 가진 메쉬로 거르는 필터링 단계; 및 (c) 상기 메쉬를 통과하지 않은 소정 크기의 세포 덩어리를 체외 분화 배양액에서 배양하는 단계를 포함하는 체외 난포를 형성하는 방법을 제공한다.
본 발명은 일 측면에서, (a) 분리된 암컷의 생식선(gonad)을 세포 덩어리로 분리하는 단계; (b) 상기 세포 덩어리를 소정 크기의 구멍을 가진 메쉬로 거르는 필터링 단계; (c) 상기 메쉬를 통과하지 않은 소정 크기의 세포 덩어리를 체외 분화 배양액에서 배양하는 단계를 포함하는 체외 난포를 형성하는 단계; 및 (d) 형성된 체외 난포를 난포 발달 및 난자 성숙 배양액을 사용하여 배양하는 단계를 포함하는 체외 난자 형성 방법을 제공한다.
본 발명은 일 측면에서, 상기 기술한 방법을 포함하는 방법으로 제조되는 체외 소형 난소, 체외 난포 또는 난자를 제공한다.
본 발명은 일 측면에서, 분리된 암컷의 생식선(gonad)으로부터 체외 소형 난소, 체외 난포 또는 체외 난자를 제조하기위한 키트로서, 생식선, 난포, 난소 또는 난자의 배양액, 세포간의 결합을 절단하기 위한 효소, 소정 크기의 메쉬로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명에 의하면 적은 수의 난자를 형성하는 난소를 체외에서 균일하고 규격화된 크기로 형성할 수 있다. 체외 난소마다 적은 개수의 난자가 형성되므로, 난자를 하나하나 분리하는 과정이 필요 없거나 적어지므로, 이에 따라 난포를 분리하는 과정에서 일어나는 난자의 손실을 막을 수 있으며, 손상이 없고 정상적으로 발달한 건강한 난자를 얻을 수 있다. 또한, 난포 생성에 대한 기작을 이해할 수 있으며, 효율적인 난자 생산 시스템 개발이 가능하다.
또한 본 발명의 체외 난소 형성 방법은 간편하고 용이하며, 건강하고 성숙한 난자를 다량으로 생산할 수 있다. 그럼으로써, 본 발명은 난임의 어려움, 높은 비용 및 낮은 수정률을 해결하는데 큰 역할을 할 수 있으며, 인간 난소 형성에 관여하는 기작을 체외에서 확인이 가능하다. 나아가 모계 유전병 연구에도 도움이 될 수 있다. 또한 산업적인 동물의 우수한 종을 짝짓기 없이 빠르게 번식할 수 있도록 하고, 많은 동물들을 멸종으로부터 구해낼 수 있으며, 가축 번식학 연구에 응용이 가능하다.
본 발명의 효과는 이런 문언적 기재에만 한정되지 않고, 통상의 기술자가 본 발명을 통해 유추할 수 있는 것까지 모두 포함한다.
도 1은 생쥐 배아로부터 생식선을 분리한 후 체외 난소형성 과정을 보여주는 모식도이다.
도 2는 생쥐 배아의 생식선으로부터 체외에서 생성된 체내 모사 난소의 사진이다. 상단의 두 사진은 a-MEM만으로 배양한 사진이며, 하단의 두 사진은 a-mem배양액 4일 사용 후 stempro 배양액으로 배양한 사진이다.
도 3은 생쥐 배아의 생식선을 Matrigel에서 배양한 결과(좌측, 12.5 gonad) 및 생식선을 트립신-EDTA로 처리하여 단일세포로 분리한 후 Matrigel에서 배양한 결과(우측, Single cell)의 사진이다.
도 4는 생쥐 배아의 생식선을 단일세포로 분리 후 trans-well 배양접시에서 배양한 결과의 사진이다.
도 5는 생쥐 배아의 생식선을 단일세포로 분리 후 trans-well 배양접시에서 배양된 생식선 세포를 Oct4 및 Ddx4 항체를 이용하여 발현 패턴을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 6은 생쥐 배아의 생식선을 단일 세포로 분리 후 3D 배양접시에서 배양체의 형성을 유도한 결과의 사진이다. 상단의 두 사진은 단일세포로 배양접시 올려놓은 후 사진이며, 하단의 두 사진은 그 이후 난소를 형성하지 못한 결과를 보여주는 사진이다.
도 7은 생쥐 배아의 생식선을 콜라게나아제 IV를 처리하여 10~20개의 세포덩어리로 분리한 후 trans-well에서 체외 배양하여 난포가 생산된 것을 보여준다(좌측). 콜라게나아제 IV의 처리 시간이 짧은 경우 생식선의 분리가 되지 않았음을 보여준다(우측). 화살표가 가르키는 것이 난포이다.
도 8은 생쥐 배아의 생식선을 콜라게나아제 IV 처리한 후 다양한 크기의 구멍을 가진 메쉬에 통과시켜 균일한 세포 덩어리를 얻는 과정의 모식도이다.
도 9는 도 8의 과정을 각각 100 ㎛, 70 ㎛, 40 ㎛의 구멍크기를 가지는 메쉬를 차례로 통과시킨 후 4~6주간 배양한 결과의 사진이다. 100 ㎛ 크기(a), 100~70 ㎛ 크기(b), 70~40 ㎛ 크기(c), 40 ㎛ 보다 작은 크기(d)로 분리된 세포 덩어리를 trans-well 배양접시에서 난포 형성 배양액에서 4~6주간 배양을 유도하였다.
도 10은 생쥐 배아의 생식선을 시험관내 배양을 통한 미니 난소를 형성을 보여주는 사진이다. 상단의 세 사진은 transwell에서 배양하였을 때 적게는 4개에서부터 15개 정도의 난소에 난자가 형성되어 있는 것을 보여주는 사진이며, 하단의 두 사진은 feeder 세포 위에서 배양하였을 때도 미니 난소가 잘 형성되는 것을 보여주는 사진이다.
도 11은 생쥐 배아의 생식선으로부터 분리된 다양한 크기의 세포 덩어리로부터 형성된 난포의 개수를 나타낸 그래프이다.
도 12는 생쥐 배아의 생식선으로부터 체외 형성된 난포를 면역염색으로 특징을 분석한 결과이다.
도 13은 생쥐 배아의 생식선으로부터 체외 형성된 난자를 면역염색으로 특징을 분석한 결과이다.
도 14는 생쥐 배아의 생식선으로부터 trans-well 배양접시에 올려 놓은 후 형성된 체외 난포를 하나하나 분리시킨 직후 난포 발달 배양액을 사용시의 결과를 보여주는 사진이다. 좌측은 40배확대해서 본 사진이고, 우측은 100배 확대 사진이다.
도 15는 생쥐 배아의 생식선으로부터 trans-well 배양접시에 올려 놓은 후 형성된 체외 난포를 하나하나 분리시킨 후 난포 발달 배양액 10일 배양 후 결과를 보여주는 사진으로서, 난포를 하나하나 200배 확대하여 잘 발달한 것을 보여준 것이다.
도 2는 생쥐 배아의 생식선으로부터 체외에서 생성된 체내 모사 난소의 사진이다. 상단의 두 사진은 a-MEM만으로 배양한 사진이며, 하단의 두 사진은 a-mem배양액 4일 사용 후 stempro 배양액으로 배양한 사진이다.
도 3은 생쥐 배아의 생식선을 Matrigel에서 배양한 결과(좌측, 12.5 gonad) 및 생식선을 트립신-EDTA로 처리하여 단일세포로 분리한 후 Matrigel에서 배양한 결과(우측, Single cell)의 사진이다.
도 4는 생쥐 배아의 생식선을 단일세포로 분리 후 trans-well 배양접시에서 배양한 결과의 사진이다.
도 5는 생쥐 배아의 생식선을 단일세포로 분리 후 trans-well 배양접시에서 배양된 생식선 세포를 Oct4 및 Ddx4 항체를 이용하여 발현 패턴을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 6은 생쥐 배아의 생식선을 단일 세포로 분리 후 3D 배양접시에서 배양체의 형성을 유도한 결과의 사진이다. 상단의 두 사진은 단일세포로 배양접시 올려놓은 후 사진이며, 하단의 두 사진은 그 이후 난소를 형성하지 못한 결과를 보여주는 사진이다.
도 7은 생쥐 배아의 생식선을 콜라게나아제 IV를 처리하여 10~20개의 세포덩어리로 분리한 후 trans-well에서 체외 배양하여 난포가 생산된 것을 보여준다(좌측). 콜라게나아제 IV의 처리 시간이 짧은 경우 생식선의 분리가 되지 않았음을 보여준다(우측). 화살표가 가르키는 것이 난포이다.
도 8은 생쥐 배아의 생식선을 콜라게나아제 IV 처리한 후 다양한 크기의 구멍을 가진 메쉬에 통과시켜 균일한 세포 덩어리를 얻는 과정의 모식도이다.
도 9는 도 8의 과정을 각각 100 ㎛, 70 ㎛, 40 ㎛의 구멍크기를 가지는 메쉬를 차례로 통과시킨 후 4~6주간 배양한 결과의 사진이다. 100 ㎛ 크기(a), 100~70 ㎛ 크기(b), 70~40 ㎛ 크기(c), 40 ㎛ 보다 작은 크기(d)로 분리된 세포 덩어리를 trans-well 배양접시에서 난포 형성 배양액에서 4~6주간 배양을 유도하였다.
도 10은 생쥐 배아의 생식선을 시험관내 배양을 통한 미니 난소를 형성을 보여주는 사진이다. 상단의 세 사진은 transwell에서 배양하였을 때 적게는 4개에서부터 15개 정도의 난소에 난자가 형성되어 있는 것을 보여주는 사진이며, 하단의 두 사진은 feeder 세포 위에서 배양하였을 때도 미니 난소가 잘 형성되는 것을 보여주는 사진이다.
도 11은 생쥐 배아의 생식선으로부터 분리된 다양한 크기의 세포 덩어리로부터 형성된 난포의 개수를 나타낸 그래프이다.
도 12는 생쥐 배아의 생식선으로부터 체외 형성된 난포를 면역염색으로 특징을 분석한 결과이다.
도 13은 생쥐 배아의 생식선으로부터 체외 형성된 난자를 면역염색으로 특징을 분석한 결과이다.
도 14는 생쥐 배아의 생식선으로부터 trans-well 배양접시에 올려 놓은 후 형성된 체외 난포를 하나하나 분리시킨 직후 난포 발달 배양액을 사용시의 결과를 보여주는 사진이다. 좌측은 40배확대해서 본 사진이고, 우측은 100배 확대 사진이다.
도 15는 생쥐 배아의 생식선으로부터 trans-well 배양접시에 올려 놓은 후 형성된 체외 난포를 하나하나 분리시킨 후 난포 발달 배양액 10일 배양 후 결과를 보여주는 사진으로서, 난포를 하나하나 200배 확대하여 잘 발달한 것을 보여준 것이다.
본 발명은 일 측면에서, (a) 분리된 암컷의 생식선(gonad)을 세포 덩어리로 분리하는 단계; (b) 상기 세포 덩어리를 소정 크기의 구멍을 가진 메쉬(mesh)로 거르는 필터링 단계; 및 (c) 상기 메쉬를 통과하지 않은 소정 크기의 세포 덩어리를 배양하는 단계를 포함하는 체외 소형 난소를 형성하는 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 생식선(gonad)이라는 용어는 난자나 정자와 같은 성세포를 생산하는 기관으로 수컷의 고환, 암컷의 난소를 말한다. 생식선은 포유동물로부터 유래하는 것을 이용한다. 포유동물로서는 예를 들어 돼지, 소, 말, 양, 염소, 개, 고양이, 토끼, 햄스터, 래트, 생쥐 또는 사람을 들 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 생식선은 배아 유래의 것이 바람직하나 이로 제한되지 않는다. 예를 들어 생쥐의 경우 11.5 내지 13.5, 바람직하게는 12.5 일령의 배아 유래의 생식선을 사용할 수 있다. 또한, 당업자라면 본원 명세서의 개시 및 해당 기술 분야에서의 기술 상식으로부터 유래하는 동물종에 따라 적절히 바람직한 시기의 생식선을 선택할 수 있다. 생식선은 동결 보존한 것을 이용할 수도 있다. 동결 보존 방법은 공지의 방법에 의해 행할 수 있다.
생식선을 세포 덩어리로 분리하는 단계는 세포층간의 결합을 부분적으로 절단하기 위하여 예를 들어 효소 처리 및/또는 물리적 처리에 의해 행할 수 있다. 효소 처리로는 예를 들어, 트립신, 콜라게나아제 등을 사용할 수 있으며, 이로 제한되는 것은 아니다. 효소는 L15, PBS, M2 등의 공지의 배지에서 용해, 희석하여 사용할 수 있다. 예를 들어 생식선을 소정의 크기의 세포 덩어리로 분리하기 위해서는, 예를 들어 1 % 콜라게나아제 IV를 함유하는 aMEM 중에서 37 oC, 5초간 처리함으로써 행할 수 있다.
물리적 처리로는 예를 들어 유리 모세관 혹은 피펫을 이용한 피펫팅에 의해 행할 수 있으며, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 세포 덩어리를 소정 크기의 구멍을 가진 메쉬(mesh)로 거르는 필터링 단계는 예를 들어 100 ㎛ 또는 70 ㎛의 구멍 크기를 가지는 메쉬를 사용할 수 있으며, 이로 제한되는 것은 아니다. 메쉬는 철과 같은 금속제일 수 있으며, 세포나 조직에 영향을 미치지 않아 이들을 다룰 때 통상적으로 사용되는 재질이면 어떤 것을 사용하여도 좋다.
본 명세서에서 생식선, 난포, 난자, 세포를 배양할 때 사용되는 배양액은 대상과 목적에 맞는 범위에서 통상적으로 사용되는 배양액이 사용될 수 있다. 예를 들어, 공지의 기본 배지를 포함시킬 수 있는데, 예를 들어 a-MEM, PRM11640, 199, StemPro-34 SFM등의 배지를 들 수 있다. 예를 들어 세포 덩어리로부터 난포를 형성하기 위하여 배양할 때, aMEM에 FBS가 첨가되어 있는 체외 분화 배양액에서 배양을 진행할 수도 있고, 또는 전반의 배양에 aMEM을 기본 배지로 이용하고, 후반의 배양에 StemPro을 기본 배지로 이용할 수도 있다.
예를 들어 난자의 성숙을 위한 배양을 위해서는 a-MEM, 199 배지 등의 생식세포 계열을 배양하는 공지의 배지를 기본 배지로 하여 피루브산 나트륨이나 항생물질 등의 필수 요소를 더하고 추가로 성선자극호르몬, 성장인자, 혈청, 난포액 등이 적절히 첨가될 수 있다. 이러한 성숙 배양에 바람직한 배양조건은 당해 기술분야에서 공지이다.
본 발명은 일 측면에서, 분리된 암컷의 생식선(gonad)으로부터 체외 소형 난소, 체외 난포 또는 체외 난자를 제조하기위한 키트로서, 생식선, 난포, 난소 또는 난자의 배양액, 세포간의 결합을 절단하기 위한 효소, 소정 크기의 메쉬로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 키트를 제공한다. 여기서 사용되는 배양액, 효소는 당 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 것을 사용할 수 있다.
본 발명에서 체외 형성된 난포 및 난자의 특성을 분석하기 위해 다양한 항체들을 이용하여 면역염색을 실시할 수 있다. 예를 들어, Oct4, Ddx4, GDF9 등에 대한 항체를 비롯하여 당 기술분야에서 통상적으로 사용되는 항체를 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따른 체외 소형 난소, 난포, 난자를 제조하는 방법에 대해 구체적 실시예를 첨부한 도면을 참조하여 자세히 설명한다. 다만, 이는 발명의 하나의 예시로서 제시되는 것으로, 이에 의해 발명의 권리범위가 한정되는 것은 아니며, 발명의 권리범위 내에서 구현예에 대한 다양한 변형이 가능함은 당업자에게 자명하다.
종래기술과 다르지 않은 부분으로서 본 발명의 기술적 사상을 이해하는데 필요하지 않은 사항은 설명에서 제외한다. 본 발명의 실시예는 통상의 기술자에게 쉽게 설명하기 위하여 제공되며, 본 발명이 이런 실시예에 한정되지는 않는다. 본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용되었으며, “포함한다” 또는 “가지다” 등의 용어는 구성이 존재한다는 것을 의미한다.
<실시예 1> 생쥐 배아의 생식선으로부터 체외 난소의 형성
생쥐(ICR 암컷 마우스)의 생식선을 배양하여 체외에서 난자를 생산하는 것이 가능한지 검증하였다 (도 1의 대조군).
실험에 사용한 생쥐(ICR 마우스)는 샘타코로부터 분양받아 1 주일 이상 적응시킨 후 사용하였다. 실험동물은 온도 22~24 oC, 상대습도 45~55 %의 환경에서 사육하였으며, 사료는 실험 동물용 분말사료를 자유로 섭취시켰고 물도 자유로이 섭취시켰다.
생쥐의 배아에서 생식선을 분리하고, trans-well에서 분화 배양액 aMEM으로 4일, 이후 stempro 배양액을 사용하여 37 oC CO2 5%에서 배양하였다.
도 2는 13.5일령의 생쥐의 생식선으로부터 체외에서 생성된 체내 모사 난소의 사진이다. 상단은 a-MEM만으로 배양한 사진이며, 하단은 a-MEM 배양액 4일 배양 후 stempro 배양액으로 배양한 결과이다.
체외 배양 14일째부터 초기 난포 형성을 관찰할 수 있었으며, 난포 안에 초기 난자가 존재하는 것을 확인할 수 있었다.
체외 형성 난소에서 단일 난포를 분리하여 체외 성장 배양액 (A-MEM + FBS 2% + Penicillin streptomycin + glutamax + L-ascorbic acid + B- mercaptoethanol에서 4일 배양 후 Stempro + FBS 10% + Penicillin streptomycin + glutamax + L-ascorbic acid + B- mercaptoethanol 배양액으로 배양 )에서 단일 난포 배양을 하여 난자의 성장을 유도하였다.
위 결과로부터 생쥐 배아의 생식선으로부터 체외 난자 생산이 가능하다는 것을 확인하였다.
<비교예 1> 생쥐 배아의 생식선을 단일세포로 분리한 후 Matrigel에서의 난포 형성 유도
생쥐 배아의 생식선을 단일세포로 분리한 후 Matrigel®에서 배양을 하였을 때, 난포 생산이 가능한 지 확인하였다. 생식선을 트립신-EDTA 0.25%를 처리하여 단일세포로 분리하고(도 1), Matrigel에서 배양하였다. 그 결과, 3차원 구조를 형성하지만 난포의 생산 효율이 매우 낮은 것으로 나타났다(도 3, 우측).
Matrigel에서 생식선의 단일세포를 배양할 경우, 난포의 형태가 유지되지 못하고 세포들이 조직 주위로 뻗어 나가는 것이 확인되었다(도 3, 좌측).
<비교예 2> 생쥐 배아의 생식선을 단일세포로 분리한 후 trans-well 배양 접시에서의 난포 형성 유도
생쥐 배아의 생식선을 트립신-EDTA 0.25%를 처리하여 단일세포로 분리한 후, trans-well 배양 접시 위에서 난포 형성을 유도하였다(A-MEM + FBS 2%+Penicillin streptomycin + glutamax + L-ascorbic acid +B- mercaptoethanol 4일 배양 후 Stempro + FBS 10% + Penicillin streptomycin + glutamax + L-ascorbic acid +B- mercaptoethanol 배양액으로 배양).
3~4 주간 배양을 시도하였으나 3차원 구조를 확인할 수 없었고, 6주간 배양 후 확인하였을 때 체외 형성된 난포를 확인할 수 없었다(도 4).
상기 단일세포로부터 배양된 생식선 세포의 변화 및 생식세포의 유무를 확인하기 위하여 Oct4 및 Ddx4 항체를 이용하여 발현 패턴을 확인하였다. 단일세포로부터 배양된 세포에서 Oct4의 발현을 확인되지 않았지만 Ddx4 유전자가 발현하는 난모세포들을 확인할 수 있었다(도 5). 이로부터 생식선으로부터 단일 세포로 분리된 생식선 체세포와 원시 생식세포의 공동배양은 3차원 배양 및 난포 형성이 안된다는 것을 확인하였지만, 원시생식세포의 유지 및 분화를 확인할 수 있었다.
<비교예 3> 생쥐 배아의 생식선을 단일세포로 분리한 후 U-bottom 배양 접시에서의 난포 형성 유도
생식선 체세포와 원시생식세포의 효율적인 공동배양을 위해, 줄기세포를 이용한 미니 장기 형성에 효율적으로 사용되는 U-bottom 배양 접시를 사용하여 배양체를 형성하고자 하였다 (A-MEM + FBS 2%+Penicillin streptomycin + glutamax + L-ascorbic acid +B- mercaptoethanol 4일 배양 후 Stempro + FBS 10% + Penicillin streptomycin + glutamax + L-ascorbic acid +B- mercaptoethanol 배양액으로 배양).
단일세포의 생식선 체세포와 원시생식세포는 U-bottom 배양 접시에서 효율적으로 하나의 배양체로 합쳐졌지만 더 이상 발달하지 못하였다(도 6). 도6의 상단의 두 사진은 단일세포로 배양접시 올려놓은 후 사진이며, 하단의 두 사진은 그 이후 난소를 형성하지 못하였음을 보여주는 사진이다.
위 결과를 통하여 단일 세포로 분리하여 3차원 구조의 형성을 유도하더라도 체외 난포 형성이 어렵다는 것이 확인되었다.
<실시예 2> 생쥐 배아의 생식선으로부터 분리된 세포덩어리로부터 난포 형성 유도
비교예 1 내지 3으로부터 원시생식세포를 생식선으로부터 단일세포로 분리하면 난포 형성이 되지 않는 것을 확인하고, 생식선을 난포 형성을 할 수 있는 세포 덩어리로 분리하여 체외 난포 형성의 유도를 진행하였다.
생쥐 배아의 생식선을 세포 덩어리로 분리하기 위하여 콜라게나아제 IV (collagenase IV)1%를 37 oC에서 5~7초 처리하였다.
생식선에 콜라게나아제 IV의 처리시간이 10초 이상 진행되면 단일 세포로 분리되었으며, 5초동안 처리하고 파이펫을 이용하여 생식선 한 개에서 10~20개 세포 덩어리로 분리가 가능하였으며, 처리 시간이 너무 짧으면 생식선의 덩어리가 크게 되어 단일 난포 형성이 어려웠다.
상기 분리된 10~20개의 세포 덩어리를 Trans-well에서 aMEM에 FBS가 첨가되어 있는 체외 분화 배양액에서 배양을 진행하면 난포형성이 가능하였고 난자가 포함되어 있었다.
난포 형성에 aMEM 배양액만으로 체외 분화 배양액을 21일 처리한 것과 4일 동안 aMEM 배양액으로 체외 분화 배양액에서 배양된 후 StemPro-체외 분화 배양액에서 14일 배양된 것을 비교하였다. 도2의 상단의 두 사진은 aMEM 21일 처리한 결과이고 하단의 두 사진은 aMEM 4일/StemPo 14일 처리한 결과이다.
도 7은 모두 aMEM 4일/StemPo 14일 처리한 결과이며 좌측 사진은 콜라게나아제 IV 처리 후 여러 덩어리로 분리되있는 사진이며, 우측 사진은 콜라게나아제를 너무 짧게 처리하며 생식선이 잘 분리되지 않고 배양된 것을 보여주는 사진이다.
생식선을 세포 덩어리로 분리하여 배양할 경우 aMEM-체외 분화 배양액 4일 배양한 후 StemPro-체외 분화 배양액에서 배양될 경우 난포 형성 효율이 증가되었다.
<실시예 3> 생쥐 배아의 생식선으로부터 크기가 균일화된 세포덩어리를 확보하는 시스템의 확립
생식선을 콜라게나아제 IV로 처리하여 세포 덩어리를 형성하여 난포 형성을 할 수 있었지만 형성된 미니 장기에 포함된 난포의 수가 균일하지 않았으며, 1개 난포가 형성된 생식선부터 40개 이상 난포를 포함한 미니 난소가 확인되었다.
또한, 생식선을 동일한 조건에서 콜라게나아제 IV를 처리하더라도 물리적 힘 및 생식선 차이에 의해 분리된 세포 덩어리의 크기가 다양하게 분리되는 것이 확인되었다.
생식선으로부터 균일한 세포 덩어리의 분리 및 형성된 난포의 효율을 측정하기 위하여 생식선을 콜라게나아제 IV를 처리한 후, 분리된 세포 덩어리를 다양한 크기의 구멍을 가진 메쉬(mesh)에 통과시켜 균일한 세포 덩어리를 얻고자 하였다. 여기서 사용된 메쉬의 구멍 크기는 100 ㎛, 70 ㎛, 40 ㎛이었으며, 각각의 메쉬를 통과시키면서 100 ㎛ 크기, 100~70 ㎛ 크기, 70~40 ㎛ 크기, 40 ㎛ 보다 작은 세포 덩어리를 각각 분리하였다(도 8). 각각 분리된 생식선 세포 덩어리를 trans-well 배양접시에서 난포 형성 배양액에서 4~6주간 배양을 유도하였다.
70~40 ㎛ 크기, 40 ㎛이하 크기의 생식선 세포 덩어리는 난포 형성이 되지 않는 것을 확인하였다. 100 ㎛ 크기의 생식선 세포 덩어리로부터 효율적으로 난포 형성이 되는 것을 확인하였고, 100~70 ㎛ 크기에서도 난포가 형성되었다. 도 9는 도 8의 과정을 각각 100 ㎛, 70 ㎛, 40 ㎛의 구멍크기를 가지는 메쉬를 차례로 통과시킨 후 4~6주간 배양한 결과의 사진이다. 100 ㎛ 크기(a), 100~70 ㎛ 크기(b), 70~40 ㎛ 크기(c), 40 ㎛ 보다 작은 크기(d)로 분리된 세포 덩어리를 trans-well 배양접시에서 난포 형성 배양액에서 4~6주간 배양을 유도하였다.
도 9의 상단의 사진은 feeder 세포 위에서 배양하였을 때 2D 배양을 한 것이고, 하단의 사진은 trams-well에서 배양하였을 때 3D 배양을 한 결과를 보여준다.
도 10은 생쥐 배아의 생식선을 시험관내 배양을 통한 미니 난소를 형성을 보여주는 사진이다. 상단의 세 사진은 transwell에서 배양하였을 때 적게는 4개에서부터 15개 정도의 난소에 난자가 형성되어 있는 것을 보여주는 사진이며, 하단의 두 사진은 feeder 세포 위에서 배양하였을 때도 미니 난소가 잘 형성되는 것을 보여주는 사진이다.
100 ㎛ 크기의 생식선 세포 덩어리로부터 형성된 난포의 평균 개수는 14개이며, 몇몇의 덩어리에서는 단일 난포도 형성되는 것을 확인할 수 있었다(도 11).
<실시예 4> 체외 형성된 생쥐 난포의 형태학적 및 분자적 특징 분석
상기 체외 형성된 난포 및 난자의 특성을 분석하기 위해 다양한 항체들을 이용하여 면역염색을 실시하였다(도 12 및 도 13).
도 12는 생쥐 배아의 생식선으로부터 체외 형성된 난포를 면역염색으로 특징을 분석한 결과이고, 도 13은 생쥐 배아의 생식선으로부터 체외 형성된 난자를 면역염색으로 특징을 분석한 결과이다.
체외 형성된 난자는 Oct4, Ddx4, GDF9을 발현하고 있었다. Ddx4가 발현되는 난자 주위로 난포의 형성이 잘 되어 있는 것을 확인하였다.
<실시예 5> 체외 형성된 생쥐 난포의 발달, 난자의 성장 및 성숙
상기 체외 형성된 난포들을 trans-well 배양 접시에 올려 놓은 후, 난포 발달 및 난자 성숙 배양액 (A-MEM + Glutamax + FBS 5% + PVP 2% + L-ascorbic acid + Penicillin streptomycin + sodium pyruvate + B-mercaptoethanol)을 사용하여 배양하였다.
도 14는 난포 분리 직 후 사진이며, 도 15는 성숙 배양액으로 10일간 배양한 사진이다.
도 14는 생쥐 배아의 생식선으로부터 trans-well 배양접시에 올려 놓은 후 형성된 체외 난포를 하나하나 분리시킨 직후 난포 발달 배양액을 사용시의 결과를 보여준다. 좌측은 40배확대해서 본 사진이고, 우측은 100배 확대 사진이다.
도 15는 생쥐 배아의 생식선으로부터 trans-well 배양접시에 올려 놓은 후 형성된 체외 난포를 하나하나 분리시킨 후 난포 발달 배양액 10일 배양 후 결과를 보여주는 사진으로서, 난포를 하나하나 200배 확대하여 잘 발달한 것을 보여준 것이다.
체외 형성 난포들을 각 난자 성숙 배양에서 배양을 할 때 난구세포들이 발달하여 팽창하는 것을 확인하였다.
이상에서는 본 발명을 설명하였으나, 본 발명은 개시된 실시예 및 첨부된 도면에 의하여 한정되지 않으며 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 이내에서 통상의 기술자에 의하여 다양하게 변형될 수 있다. 또한 본 발명의 실시예에서 설명한 기술적 사상은, 각각 독립적으로 실시될 수도 있고, 둘 이상이 서로 조합되어 실시될 수도 있다.
Claims (9)
- (a) 분리된 암컷의 생식선(gonad)을 10 내지 20개의 세포 덩어리로 분리하는 단계;
(b) 상기 세포 덩어리를 70 내지 100 ㎛의 구멍 크기를 가지는 메쉬로 거르는 필터링 단계; 및
(c) 상기 메쉬를 통과하지 않은 세포 덩어리를 배양하는 단계를 포함하는 체외 소형 난소를 형성하는 방법으로서,
상기 단계 (a)에서 효소를 사용하며,
상기 단계 (c)에서 전반에 aMEM-체외 분화 배양액을 사용하고 후반에 StemPro-체외 분화 배양액을 사용하는 것을 특징으로 하는 체외 소형 난소를 형성하는 방법.
- 제1항에 있어서,
콜라게나아제 IV 효소를 사용하는 것을 특징으로 하는 체외 소형 난소를 형성하는 방법.
- 제1항에 있어서,
단계 (a)에서 물리적인 방법을 함께 사용하는 것을 특징으로 하는 체외 소형 난소를 형성하는 방법.
- (a) 분리된 암컷의 생식선(gonad)을 효소를 사용하여 10 내지 20개의 세포 덩어리로 분리하는 단계;
(b) 상기 세포 덩어리를 70 내지 100 ㎛의 구멍 크기를 가지는 메쉬로 거르는 필터링 단계; 및
(c) 상기 메쉬를 통과하지 않은 세포 덩어리를 체외 분화 배양액에서 배양하는 단계를 포함하는 체외 난포를 형성하는 방법.
- (a) 분리된 암컷의 생식선(gonad)을 효소를 사용하여 10 내지 20개의 세포 덩어리로 분리하는 단계;
(b) 상기 세포 덩어리를 70 내지 100 ㎛의 구멍 크기를 가지는 메쉬로 거르는 필터링 단계;
(c) 상기 메쉬를 통과하지 않은 세포 덩어리를 체외 분화 배양액에서 배양하는 단계를 포함하는 체외 난포를 형성하는 단계; 및
(d) 형성된 체외 난포를 난포 발달 및 난자 성숙 배양액을 사용하여 배양하는 단계를 포함하는 체외 난자 형성 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 방법을 포함하는 방법으로 제조되는 체외 소형 난소.
- 분리된 암컷의 생식선(gonad)으로부터 체외 소형 난소, 체외 난포 또는 체외 난자를 제조하기 위한 키트로서, 생식선, 난포, 난소 또는 난자의 배양액, 세포간의 결합을 절단하기 위한 효소, 70 내지 100 ㎛의 구멍 크기를 가지는 메쉬로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 키트.
- 제4항의 방법으로 제조되는 체외 난포.
- 제5항의 방법으로 제조되는 체외 난자.
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