KR102142400B1

KR102142400B1 - 돼지 만능성 줄기세포 배양용 배지 조성물

Info

Publication number: KR102142400B1
Application number: KR1020180070478A
Authority: KR
Inventors: 이창규; 최광환; 이동경
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2018-06-19
Filing date: 2018-06-19
Publication date: 2020-08-07
Also published as: EP3812454A4; KR20190143033A; WO2019245278A1; EP3812454A1; US20210102163A1

Abstract

본 발명은 돼지 만능성줄기세포용 배지 조성물에 대한 것으로, bFGF, 액티빈(Activin) A, CHIR99021 및 IWR-1를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 만능성줄기세포용 배지 조성물이다. 본 발명에 따른 조성물은 불특정적인 성분을 제외하고 특정 성분으로 제조되어 품질관리가 용이하며, 이에 따라 돼지 만능성줄기세포의 연구에 적합하다. 본 발명은 또한 상기 조성물을 이용한 기형종의 형성능을 가진 돼지 만능성줄기세포의 배양, 유지 및 보존 방법을 제공한다.

Description

돼지 만능성 줄기세포 배양용 배지 조성물{Medium composition for culturing porcine pluripotent stem cell}

본 발명은 돼지 만능성 줄기세포 배양, 유지 및 보존용 배지에 관한 것이다.

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줄기세포는 자가생식능력과 다양한 세포로의 분화능을 가진 세포를 지칭한다. 여기서 분화능은 그 단계에 따라 다양한 수준으로 나뉜다. 그 중 우리몸의 모든 세포로 분화가 가능한 만능성을 지닌 만능성줄기세포는 세계적으로 많은 연구가 진행중이다. 만능성 줄기세포에는 현재까지 배아줄기세포, 배아생식선줄기세포, 유도만능줄기세포가 확립이 되었다. 만능성 줄기세포는 다양한 세포와 조직으로 분화가 가능하기 때문에 재생의학과 세포치료의 도구로써 각광을 받고 있다. 이러한 만능성줄기 세포주의 분화능은 테라토마와 키메라 형성을 통해 검증할 수 있다. 만능성 줄기세포를 다양한 세포로 분화를 시켜 사람의 질병을 치료하기 위해서는 동물을 이용한 전임상 연구가 필수적이다. 전임상 연구는 소동물인 설치류를 시작으로 개, 말, 돼지 등과 같은 대동물 그리고 사람과 가까운 영장류의 순서로 진행이 된다. 하지만 현재까지 설치류 및 영장류의 만능성 줄기세포만 확립이 되고 대동물의 만능성 줄기세포가 확립되지 않아 전임상 연구는 난항을 겪고 있다.
최초로 확립이 된 사람과 생쥐의 배아 줄기 세포주는 소태아혈청을 기초로 한 배양액으로부터 얻어졌다. 하지만 미확인된 동물 유래의 성분은 배양도중 줄기세포의 분화를 유도하고 임상적용에 있어 장애물로 작용을 하는 문제점이 있다. 이에 줄기세포 연구와 임상적용을 위해 화학적으로 최적화된 배아줄기 세포주 배양액의 개발이 요구되고 있었다.
돼지의 경우, 전임상 모델 구축을 위하여 1990년부터 다양한 배양물질들을 통해 배아줄기세포주 확립을 시도하여왔다. 신호 전달 물질로는 LIF, FGF2, IL, OSM, CNTF, EGF, ACT A, SCF 들이 사용이 되었지만 테라토마 및 키메라 형성능을 지니는 배아줄기세포의 확립에는 실패하였다. 다만 약간의 분화된 형태의 유사배아줄기세포주는 다양한 실험실에서 배양에 성공을 하였는데, 이 세포들은 체내에서 분화능을 가지 않았다
다양한 대동물 중에서 돼지는 사람과 장기의 생리학적 해부학적 유사성 때문에 중요한 전임상연구를 위한 동물모델로 사용이 되어왔다. 때문에 1990년대부터 돼지의 배아를 이용하여 배아줄기세포주를 확립하기위해 많은 연구가 진행이 되었다. 하지만 현재까지 체내분화능 (테라토마, 키메라 형성능)을 가지는 돼지 배아줄기세포주는 확립이 되지 않았다.

본 발명자들은 종래 미확인된 동물 유래 성분이 포함된 소태아혈청을 사용하지 않고 돼지 줄기세포를 배양, 유지 및 보존하는데 성공하고 이 줄기세포가 체내분화능을 가지는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

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본 발명의 제 1 의 목적은 돼지 만능성 줄기세포 배양용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 제 2 의 목적은 돼지 만능성 줄기세포 유지용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 제 3 의 목적은 돼지 만능성 줄기세포 보존용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 제 4 의 목적은 돼지 만능성 줄기세포의 배양, 유지 및 보존 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

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상기한 목적을 위해서 본 발명의 제 1 의 형태는 돼지 줄기세포 배양용 배지에 있어서, bFGF, 액티빈(Activin) A, CHIR99021 및 IWR-1를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 만능성 줄기세포용 배지 조성물을 제공한다. 바람직하게는 상기 배지는 KSR(Knockout^TM serum replacement; Gibco), LC(lipid concentrate), 글루타맥스(Glutamax^TM, Gibco), MEM 비필수 아미노산(MEM nonessential amino acids; Gibco), 항균제, 항진균제, 베타-머캡토에탄올를 포함하는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium; DMEM) 배지와 이에 추가적으로 bFGF, 액티빈(Activin) A, CHIR99021 및 IWR-1를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 만능성줄기세포용 배지 조성물이다
보다 바람직하게는 상기 배지는 상기 bFGF의 허용 농도는 3.03 x 10^-4~6.06 x 10^-3 μM 이고, 상기 액티빈 A의 농도는 1.50 x 10^-4~5.40 x 10^-4 μM 이고, 상기 CHIR99021의 농도는 0.5 ~ 2.50 μM 이고, 상기 IWR-1의 농도는 1.20 ~3.00 μM 인 것을 특징으로 하는 돼지 만능성줄기세포용 배지 조성물이다. 보다 더 바람직하게는 상기 배지는 20% (v/v) Knockout^TM 혈청 대체제 (Knockout^TM serum replacement(KSR); Gibco); 0.1% (v/v) 화학적으로 확정된 지질 농축액(chemically defined lipid concentrate(LC); Gibco); 1% (v/v) 글루타맥스(Glutamax; Giboco); 1% (v/v) MEM 비필수 아미노산(Gibco); 1% (v/v) 항균-항진균제(antibiotics-antimycotics; Gibco); 0.1mM

-머캡토에탄올 (Gibco) ; 6.06 x 10-⁴μM 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor; bFGF); 3.85 x 10-⁴ μM 액티빈 A(Activin A; Act A); 0.5 μM CHIR99021; 및 1.5 μM IWR-1를 포함 하는 Knockout^TM 둘베코 변형 이글 배지 (KO-DMEM; Gibco) 배양액 조성물인 것을 특징으로 하는 돼지 만능성줄기세포 배양용 배지 조성물이다.
본 발명의 제 2 의 형태는 줄기세포 유지용 배지에 있어서, bFGF, 액티빈(Activin) A, CHIR99021 및 IWR-1를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 만능성 줄기세포용 배지 조성물을 제공한다. 바람직하게는 상기 배지는 KSR(Knockout^TM serum replacement; Gibco), LC (lipid concentrate; Gibco), 글루타맥스(Glutamax^TM, Gibco), MEM 비필수 아미노산(MEM nonessential amino acids; Gibco), 항균제, 항진균제 및 베타-머캡토에탄올을 포함하는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium; DMEM) 배지와 이에 추가적으로 bFGF, 액티빈(Activin) A, CHIR99021 및 IWR-1를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 만능성줄기세포용 배지 조성물이다. 보다 바람직하게는 상기 배지는 상기 bFGF의 허용 농도는 3.03 x 10^-4~6.06 x 10^-3 μM 이고, 상기 액티빈 A의 농도는 1.50 x 10^-4~5.40 x 10^-4 μM 이고, 상기 CHIR99021의 농도는 0.5 ~ 2.50 μM 이고, 상기 IWR-1의 농도는 1.20 ~3.00 μM 인 것을 특징으로 하는 돼지 만능성줄기세포용 배지 조성물이다. 보다 더 바람직하게는 상기 배지는 15% (v/v) Knockout^TM 혈청 대체제 (Knockout^TM serum replacement(KSR); Gibco); 0.1% (v/v) 화학적으로 확정된 지질 농축액(chemically defined lipid concentrate(LC); Gibco); 1% (v/v) 글루타맥스(Glutamax; Giboco); 1% (v/v) MEM 비필수 아미노산(Gibco); 1% (v/v) 항균-항진균제(antibiotics-antimycotics; Gibco); 0.1mM

-머캡토에탄올 (Gibco); 1.21 x 10-³μM 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor; bFGF); 3.85 x 10-⁴ μM 액티빈 A(Activin A; Act A); 1.5 μM CHIR99021; 및 2.5 μM IWR-1를 포함 하는 Knockout^TM 둘베코 변형 이글 배지 (KO-DMEM; Gibco) 배양액 조성물인 것을 특징으로 하는 돼지 만능성줄기세포 유지용 배지 조성물이다.
본 발명의 제 3 의 형태는 10% (v/v) DMSO, 10% (v/v) 에틸렌 글리콜, 80% (v/v) 상기 돼지 만능성줄기세포 유지용 조성물을 포함하는 만능세포보존용 조성물이다.

본 발명의 제 4 의 형태는 20% (v/v) DMSO, 20% (v/v) 에틸렌 글리콜, 0.5M 설탕, 60% (v/v) 상기 돼지 만능성줄기세포 유지용 조성물을 포함하는 돼지 만능성줄기세포 보존용 조성물이다.

본 발명의 제 5 의 형태는 상기 돼지 만능성줄기세포 배양용 조성물을 이용한 돼지 만능줄기세포 배양 방법이다.

본 발명의 제 6 의 형태는 상기 돼지 만능성줄기세포 유지용 조성물을 이용한 돼지 만능줄기세포 유지 방법이다.

본 발명의 제 7 의 형태는 상기 상기 돼지 만능성줄기세포 보존용 조성물을 이용한 돼지 만능줄기세포 보존 방법이다.

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본 발명에 따라 제조된 배양액은 체내분화능 (테라토마 형성능)을 가진 돼지 배아줄기세포의 확립 및 배양에 사용이 가능하다. 이렇게 확립된 돼지 배아줄기세포는 체내분화능을 바탕으로 대동물에 있어 전임상 모델구축에 활용가능하고, 또한 키메라 형성을 통한 형질전환동물 생산에 이용이 가능하다. 또한 돼지 유도만능줄기세포 및 배아생식선줄기세포주 확립에 활용이 가능하며 또한 아직 배아줄기세포주가 확립되지 않은 다른 종 (개, 소, 말 등) 에 본 기법이 적용 가능하다.

도 1은 다양한 혈청대체제를 이용하여 돼지의 내부세포괴를 배양하여 SOX2의 발현을 확인한 자료이다. 축적 = 200 μm
도 2는 각각의 배양액에서 돼지 내부세포괴를 장기간 배양하여 얻은 군집의 모습이다. 축적= 400μm
도 3은 화학적으로 특정된 배지에서 유래된 돼지 배아줄기세포의 형태를 보인다. 새로운 배아줄기세포는 FGF2+ActA+CH+IWR가 보충된 KSR+LC 배지에서 형성되었다(A, B). 새롭게 유도된 배아줄기세포의 콜로니는 편평한 형태를 보였으며, 이것의 하나의 세포는 높은 핵 대 세포질 비율을 가진 상피적 형태를 보였다. (C) 돼지의 배아줄기세포는 알카라인 포스파타아제의 활성을 보였다. 스케일 바 = 400μm.
도 4 는 돼지 배아줄기세포에서 만능성 유전자의 발현을 보인다. OCT4, SOX2, NANOG, SSEA1, SSEA4, TRA-1-60 및 TRA-1-81을 포함하는 만능성 유전자가 면역염색법으로 측정하였을 때 돼지의 배아줄기세포에서 발현되었다. 스케일 바 = 200μm.
도 5는 A는 돼지 배아줄기세포를 nude 생쥐에 주입하였을 때 기형종이 형성됨을 확인한 사진이고, B는 이를 조직학적 분석법으로 확인한 사진이다
도 6은 돼지 배아줄기세포를 신경세포로 유도분화한 사진이다. A는 원시 신경세포의 특징적인 모습을 나타낸 사진이며, B는 신경 로제트 (neural rosette)의 마커 중 하나인 ZO1으로 염색을 한 사진이다.
도 7은 돼지 배아줄기세포를 심근세포로 유도분화한 사진이다. 좌측사진은 이완기의 상태를 나타낸 사진이고 우측사진은 수축이의 상태를 나타낸 사진이다.

(실시예 1) 돼지 배아줄기세포 확립 및 유지에 사용하는 배양액 조성

배아줄기세포는 배반포의 내부세포괴를 체외에서 장기간 배양을 통해 확립이 된다. 돼지 배아줄기세포 유지를 위한 배양액 개발을 위해 다양한 혈청 대체제 및 신호전달 물질들을 사용하였다. 소 태아 혈청이 세포배양에 다양하게 사용이 되고 있지만, 확인이 되지 않은 물질들을 많이 함유 하고 있기 때문에 배양액 최적화를 위하여 KSR, N2/B27, LC (지질 복합물) 등의 혈청대체제를 사용하였다.

사용되어진 혈청 대체제의 조성은 표 1 내지 5에 나타내었다

먼저, 돼지 배아의 성장에 적합한 혈청 대체제를 찾기 위하여 KSR, N2/B27, KSR+N2/B27, KSR+LC가 포함된 배양액을 사용하였다. 각각의 배양액은 돼지 배반포를 피더세포에 부착을 시켜 줄기세포 유도 과정중에 처리하여 7일간 배양후, 만능성 마커인 SOX2로 염색을 통해 체외에서 내부세포괴의 성장을 관찰하였다. 그 결과 KSR 과 KSR+LC를 처리한 군에서 SOX2가 발현하는 내부세포괴가 빠르게 성장하는 것을 확인하였다(도 1). 두 번째로 내부세포괴의 장기간 배양을 위하여 신호전달물질을 다양한 조합으로 처리해 보았다(표 6 및 표 7)

KSR 혹은 KSR+LC가 포함된 기본 배지에 신호전달 물질을 넣어 배양을 시도해 보았다. 혈청대체제 4가 포함된 배양액에 FGF2, Activin A, CHIR99021이 포함된 배양액에서 돼지 배아줄기세포가 확립이 되었습니다 (표 6과 7, 도면 2). 또한 CHIR99021의 안정화를 위하여 IWR-1를 첨가하여 돼지 배아줄기세포의 장기간배양 및 유지를 위한 조성을 확립하였고, 각각 표 8 및 표 9에 나타내었다.

(표8계속)

(표9계속)

만능성을 지닌 내부세포괴가 형성되는 초기 배아발달과정은 종마다 특이성을 지닌다. 특히 돼지는 사람과 생쥐와 다르게 이 기간이 매우 길어 서로 다른 세포신호 전달체계와 대사 물질들이 내부세포괴 형성과 유지에 관여를 한다. 때문에 이 내부세포괴를 체외에서 배양하여 배아줄기세포주를 확립하기 위해서는 돼지 특이적 신호전달 물질과 대사물질을 포함한 배양액의 개발이 필수적이다. 이 연구에서 일련의 실험을 통하여 돼지 배아줄기세포주가 유지 가능한 KSR+LC가 포함된 기본배지에 FGF2, ACT A, CHIR99021, IWR-1이 포함된 배지를 개발하였다.

기존 연구 결과에 따르면 ACT A는 사람의 배아줄기세포의 유지에 중요한 역할을 하고, CHIR99021은 사람과 생쥐의 배아줄기세포 배양에 사용을 하면 만능성 유지에 도움이 된다는 것이 밝혀졌지만 생쥐와 사람의 배아줄기세포 배양에 있어 필수적인 요소는 아니었다. 그러나 본 발명자들은 돼지에서는 FGF2를 비롯하여 ACT A와 CHIR99021, IWR-1과 같은 신호 전달 물질이 배아줄기세포 배양에 필수적인 것을 확인하였다. 또한 지질 대사가 내부세포괴의 성장과 배아줄기세포의 유지에 필수적인 것을 확인하였다. 결과적으로 돼지의 배아줄기세포주의 배양에는 추가적인 신호전달 물질과 대사 물질이 필수적인 것을 확인하였다.

1. 확립 배양액 조성

20% (v/v) KnockoutTM serum replacement (KSR; Gibco), 0.1% (v/v) chemically defined lipid concentrate (LC; Gibco), 1% (v/v) Glutamax (Giboco), 1% (v/v) MEM nonessential amino acids (Gibco), 1% (v/v) antibiotics-antimycotics (Gibco), 0.1mM β-mercaptoethanol (Gibco), 10 ng/ml basic fibroblast growth factor (bFGF), 5 ng/ml Activin A (Act A), 0.5 μM CHIR99021, 1.5 μM IWR-1를 포함 하는 KnockoutTM Dulbecco's modified Eagle's Medium (KO-DMEM; Gibco)을 기본 배양액으로 하여 돼지 배아줄기세포 유도에 사용한다.

2. 유지 배양액 조성

15% (v/v) KSR (Gibco), 0.1% (v/v) LC (Gibco), 1% (v/v) Glutamax, 1% (v/v) MEM nonessential amino acids, 1% antibiotic-antimycotic, 0.1mM β-mercaptoethanol, 20 ng/ml bFGF, 5 ng/ml Act, 1.5 μM CHIR99021, 2.5 μM IWR-1를 포함 하는 KO-DMEM을 기본 배양액으로 하여 돼지 배아줄기세포 배양에 사용한다.

3. 동결 배양액 조성

동결액 1: 10% (v/v) DMSO, 10% (v/v) 에틸렌 글리콜, 80% (v/v) 유지배양액

동결액 2: 20% (v/v) DMSO, 20% (v/v) 에틸렌 글리콜, 0.83M 설탕을 포함하는 60% (v/v) 유지배양액 (설탕의 최종 농도 0.5M); 동결액 2의 제조 방법은 다음과 같다. 메스실린더에 만능성줄기세포 유지용 조성물 40ml을 넣고 설탕 17.115g을 넣어 잘 녹여주고, 최종 부피가 60ml이 되도록 만능성줄기세포 유지용 조성물을 추가한 다음, DMSO 20ml, 에틸렌 글리콜 20ml을 더 추가한다.

(실시예 2) 돼지 만능성 줄기세포 배양액에서 성장인자의 농도의 영향

상기 실시예에서 확립된 돼지 만능성 줄기세포 배양액에서 성장인자의 농도에 따른 영향을 분석하였고, 그 결과를 표 10에 나타내었다.

(표 10) 성장인자 추가 농도에 의한 영향

성장인자의 농도가 낮은 경우에는 줄기세포의 성장이 저하되었고, bFGF를 제외한, 액티빈 A, CHIR99021 및 IWR-1의 농도가 높을 경우에는 세포가 사멸되었다. bFGF의 허용 농도는 3.03 x 10^-4~6.06 x 10^-3 μM 이었으며, 최적의 농도는 1.21 x 10^-3 μM 이었으며, 액티빈 A의 허용 농도는 1.50 x 10^-4~5.40 x 10^-4 μM 이었으며, 최적의 농도는 3.85 x 10^-4 μM 이었으며, CHIR99021의 허용농도는 0.5 ~ 2.50 μM 이었으며, 최적의 농도는 1.50 μM 이었으며, IWR-1의 허용농도는 1.20 ~3.00 μM 이었으며, 최적의 농도는 2.50 μM 이었다.

(실시예 3) 돼지 배반포로부터 배아줄기세포주를 유도

1. 미성숙 난자를 회수 및 체외 성숙 단계

도축장에서 도살된 암퇘지의 난소를 회수하여 25∼30℃의 생리식염수 용액에 넣어 실험실로 운반하여 직경이 3∼6 mm의 난포로부터 18 gauge 주사 바늘이 부착된 주사기로 난포액을 흡입하여 채란한다. 채취된 난자를 0.1% (w/v) polyvinyl alcohol(PVA)이 첨가된 TL-HEPES-PVA액으로 2번 세척한 뒤, 실체 현미경 하에서 난구 세포가 균일하고 세포질이 균질한 것만을 선별하여 난자 성숙에 사용한다. 난포란의 성숙배양을 위해 0.6 mM 시스테인, 10 ng/mL 상피 성장 인자(epidermal growth factor; EGF), 1 mg/ml 인슐린, 4 IU/ml Q6 말의 코리오닉 고나도트로핀(equine chorionic gonadotropin; eCG), 및 인간 코리오닉 고나도트로핀(human chorionic gonadotropin; hCG), 10%(v/v) 돼지 여포액(porcine follicular fluid; PFF)가 첨가된 TCM-199 에서, 22시간 배양하고, 이후 호르몬이 첨가되지 않은 배양액으로 옮겨 20시간 동안 배양한다.

2. 체외성숙된 난자를 이용한 단위발생란 생산

체외 성숙 배양 후 난포란을 0.1% hyaluronidase에 넣고 3분간 교반(vortexing)하여 난구세포를 제거한다. 성숙한 난자를 PBS-BSA (Posphate buffered saline-(Bovine serum albumin) 배지에서 씻은 후 만니톨이 포함된 배지 내에서 전기충격(electronic activation)을 30μs 동안 2.2kV/cm의 세기로 가하여 난자의 분열을 유도한다. 그 후, 6-디메틸아미노퓨린(6-DMAP) 이 포함된 PZM-3 배지에서 4시간 배양 후 6-DMAP 이 제거된 PZM-3에서 7일간 배양하여 배반포를 얻는다. 배반포를 부화시키기 위해서 분열 유도 4일후 PZM-3 배지에 혈청을 첨가한다.

3. 체외 수정란의 생산

체외 성숙 배양 후 난포란을 0.1% 히알루로니다아제(hyaluronidase)에 넣고 3분간 교반(vortexing)하여 난구세포를 제거한다. 성숙한 난자를 PBS-BSA (Posphate buffered saline-(Bovine serum albumin) 배지에서 씻은 후 체외수정에 이용한다. 체외수정용 정액은 원심분리(500 × g) 후 상층액을 제거하고 0.04% BSA가 첨가된 PBS 액으로 3회 세척한 후, 변형된 Tris-완충 배지(mTBM)액으로 희석하여 체외수정용 배지에 5 × 10⁵ 정자/ml가 되도록 정자를 주입하여 체외수정을 유도(4시간)한다. 이후 돼지 접합자 배지(porcine zygote medium; PZM-3)로 옮겨 5% CO₂, 5% O₂및 39℃의 조건 하에서 7일간 배양하여 배반포를 얻는다. 배반포를 부화시키기 위해서 분열 유도 4일후 PZM 배지에 혈청을 첨가한다.

4. 생쥐 배아섬유아세포를 이용한 영양세포 (feeder cells) 생산

생쥐 배아섬유아세포 (embryonic fibroblasts)는 임신 14일령 생쥐의 태아로부터 분리하였다. 적출된 태아는 머리, 사지, 내부 장기를 제거하고 작게 조각내었다. 조각난 태아의 조직은 10% (v/v) 소혈청, 1% (v/v) 글루타맥스, 1% (v/v) antibiotic-antimycotic, 0.1mM β-머캅토에탄올이 포함된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's Medium; DMEM; Welgene)으로 배양하였다. 충분히 자란 생쥐 배아섬유아세포는 마이토마이신 C와 같은 항 유사분열제를 처리하여 4-6 x 10⁵ /cm²(배양접시 넓이)의 농도로 준비를 한다.

5. 체외 생산된 배반포 (단위발생란, 체외수정란)을 이용한 돼지 배아줄기세포주의 확립

앞서 생산된 부화한 배반포를 유지 배양액을 이용하여 영양세포와 함께 5% CO₂, 5% O₂, 38 ℃의 조건에서 이틀 동안 배양을 한다. 초기 배양 이틀 동안은 배양액을 교체하지 않는다. 배양 3일째 새로운 유지 배양액으로 교체를 해주고 5% CO₂, 37 ℃의 조건으로 옮겨 추가적으로 5-6일 동안 배양을 한다. 충분히 자란 초기 배아줄기세포의 군집은 계대배양을 하여 추가 실험을 진행한다. 확립된 돼지 배아줄기세포주는 단일세포층으로 군집을 이루어 자라고, 세포의 모양은 핵과 세포질의 비율이 높아 분열이 빠른 배아줄기세포주의 특징을 보였다(도 3).

확립이 된 돼지 배아줄기세포주는 사람의 배아줄기세포주와 비슷하게 평평한 단일 세포층의 모양을 가지고 있었고, OCT4, SOX2, NANOG, SSEA1, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81, AP 의 만능성 유전자를 발현하였다. 새로이 확립된 돼지 배아줄기세포주는 사람의 배아줄기세포주와 유사한 단일세포층의 군집 모양을 띠었으며, OCT4, SOX2, NANOG 등의 만능성 유전자를 띠고 있었다(도4). 또한 돼지 배반포에 존재하는 내부세포괴에서 특이적으로 발현하는 SOX2와 SSEA1이 강하게 발현하는 것을 통해 이 세포가 내부세포괴로부터 유래한 것임을 확인 할 수있었다.

(실시예 4) 확립된 돼지 배아줄기세포주를 유지

1. 돼지 배아줄기세포의 계대배양 및 유지

충분히 자란 돼지 배아줄기세포의 군집은 계대배양을 실시하여 새로운 영양세포로 옮겨 배양을 한다. 돼지 배아줄기세포에 10 μM의 Y-27632를 24시간 동안 처리한 후에 Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS; Welgene)로 세척한다. 세척한 배아줄기세포주는 0.25% 트립신/EDTA 용액을 4분 간 처리하고 피펫으로 조작을 통해 작게 쪼개준다. 원심분리 (2,000 rpm, 3분)를 통해 세포만 분리한 후 10 μM의 Y-27632가 포함된 유지 배양액을 이용하여 새로운 영양세포와 함께 5% CO2, 37 ℃의 조건에서 배양을 한다. 24시간후부터 Y-27632가 미포함된 유지 배양액을 4-6일간 매일 교환 해주며 추가배양을 진행한다.

(실시예 5) 돼지 배아줄기세포의 동결 보존

동결: 돼지 배아줄기세포에 10 μM의 Y-27632를 48시간 동안 처리한 후에 Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS; Welgene)로 세척한다. 세척한 배아줄기세포주는 0.25% 트립신/EDTA 용액을 4분 간 처리하고 피펫으로 조작을 통해 작게 쪼개준다. 원심분리 (2,000 rpm, 3분)를 통해 상층액을 제거하여 세포만 분리한 후 동결액1을 50μl로 재부유(resuspension) 시켜준다. 동결액 1을 넣고 1분후 250μl의 동결액2를 천천히 섞어가며 넣어준다. 동결액 2를 넣고 1분동안 정치후 액체질소에 넣어 동결시킨다.

해동: 동결될 돼지 배아줄기세포를 액체질소에서 꺼내어 37℃의 동결액2를 700μl 섞어 빠르게 녹인다. 여기에 37℃의 유지배양액 5ml을 천천히 잘 섞어가며 넣어준다. 원심분리 (2,000 rpm, 3분)를 통해 세포만 분리한 후 10 μM의 Y-27632가 포함된 유지 배양액을 이용하여 새로운 영양세포와 함께 5% CO2, 37 ℃의 조건에서 배양을 한다. 24시간후부터 Y-27632가 미포함된 유지 배양액을 4-6일간 매일 교환 해주며 추가배양을 진행한다.

또한 이 방법은 시중에 판매중인 mFreSRTM (Stem cell technology, 05855)를 통해 대체 가능하다

(실시예 6) 돼지 배아줄기세포에서 만능성 유전자의 발현 검증

돼지 배아줄기세포주는 4% 파라포름알데하이드로 30분간 고정한 뒤, DPBS로 두번 세척을 하였다. 고정된 세포에서 알칼라인 포스파타아제의 활성을 보기 위하여 BCIP/NBT용액을 30분간 처리하고 DPBS로 두번 세척후 현미경을 통해 관측하였다. 면역학적 염색법을 위해 고정된 세포를 0.1 % triton x-100을 15분간 처리하고 10% 염소혈청을 이용하여 상온에 1시간동안 처리하였다. 이후 만능성 유전자를 인식하는 1차 항체 (anti-OCT4, SOX2, NANOG, SSEA1, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81)을 1:200의 농도로 4 ℃에서 15시간동안 고정한 돼지 배아줄기세포와 반응을 시킨다. 1차 항체 처리 후 형광물질이 결합된 2차항체를 2시간동안 상온에서 처리를 한뒤 형광현미경으로 형광을 관찰한다. 관찰 결과 돼지 배아줄기세포주에서 알칼라인 포스파타아제의 발현을 확인하였고(도 3), 만능성 유전자인 OCT4, SOX2, NANOG, SSEA1, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81의 발현을 확인하였다(도 4).

(실시예 7) 돼지 배아줄기세포의 만능성 검증을 위한 기형종 (teratoma) 형성능 확인

돼지 배아줄기세포에 10 μM의 Y-27632를 3시간 동안 처리한 후에 유리 피펫을 이용하여 영양세포로부터 분리하여 Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS; Welgene)로 세척한다. 세척한 배아줄기세포주는 Gentle cell dissociation reagent (Stem cell technology)를 4분 간 처리하고 피펫으로 조작을 통해 작게 쪼개준다. 원심분리 (2,000 rpm, 3분)를 통해 세포만 분리한 후 20 μM의 Y-27632가 포함된 50μl 유지 배양액으로 재부유시켜 50 μl의 matrigel과 함께 섞어준다. 이 것을 주사기를 이용하여 nude 쥐의 피하에 조심스럽게 주입하고 3달뒤에 기형종 형성을 확인하였다(도 5).

(실시예 8) 신경 및 심근 세포로의 유도분화

1. 신경 세포의 경우 STEMdiff 뉴우런 유도 배지(Stem cell technology)제품을 이용하였다.

2. 심근세포의 경우 “Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes, 2001” 논문을 참고하여 진행을 하였다.

기존에 사람줄기세포에서 확립된 프로토콜에 따라 분화를 진행한 결과 돼지 배아줄기세포는 신경과 심근 세포로 분화가 되었다. 신경세포 분화의 경우 신경 로제트 (neural rosette)의 꽃잎모양의 구조를 확인하였으며(도 6), 또한 뉴런의 구조도 확인이 되었다. 심근의 경우 분화를 진행하면서 자발적으로 수축과 이완을 반복하는 세포 군집을 발견 할 수 있었다. 이는 본 연구에서 확립한 돼지 배아줄기세포가 사람의 줄기세포와 유사한 특징을 지니며 전임상 연구에 활용가능성을 보여준다.

Claims

돼지 만능성 줄기세포 배양용 배지에 있어서, bFGF, 액티빈(Activin) A, CHIR99021 및 IWR-1를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 만능성 줄기세포 배양용 배지 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 배지는 KSR(Knockout^TM serum replacement), LC(lipid concentrate), 글루타맥스(Glutamax^TM), MEM 비필수 아미노산(MEM nonessential amino acids), 항균제, 항진균제 및 베타-머캡토에탄올을 포함하는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium; DMEM)과 이에 추가적으로 bFGF, 액티빈(Activin) A, CHIR99021 및 IWR-1를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 만능성 줄기세포 배양용 배지 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 bFGF의 허용 농도는 3.03 x 10^-4~6.06 x 10^-3 μM 이고, 상기 액티빈 A의 농도는 1.50 x 10^-4~5.40 x 10^-4 μM 이고, 상기 CHIR99021의 농도는 0.5 ~ 2.50 μM 이고, 상기 IWR-1의 농도는 1.20 ~3.00 μM 인 것을 특징으로 하는 돼지 만능성 줄기세포 배양용 배지 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 배지는 20% (v/v) Knockout^TM 혈청 대체제 (Knockout^TM serum replacement; KSR); 0.1% (v/v) 화학적으로 확정된 지질 농축액(Lipid concentrate; LC); 1% (v/v) 글루타맥스(Glutamax); 1% (v/v) MEM 비필수 아미노산; 1% (v/v) 항균-항진균제; 0.1mM
-머캡토에탄올; 6.06 x 10-⁴ μM 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor; bFGF); 3.85 x 10-⁴ μM 액티빈 A(Activin A; Act A); 0.5 μM CHIR99021; 및 1.5 μM IWR-1를 포함 하는 둘베코 변형 이글 배지인 것을 특징으로 하는 돼지 만능성 줄기세포 배양용 배지 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 배지는 15% (v/v) Knockout^TM 혈청 대체제 (Knockout^TM serum replacement; KSR); 0.1% (v/v) 화학적으로 확정된 지질 농축액(Lipid concentrate; LC); 1% (v/v) 글루타맥스(Glutamax); 1% (v/v) MEM 비필수 아미노산; 1% (v/v) 항균-항진균제; 0.1mM
-머캡토에탄올; 1.21 x 10-³ μM 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor; bFGF); 3.85 x 10-⁴ μM 액티빈 A(Activin A; Act A); 1.5 μM CHIR99021; 및 2.5 μM IWR-1를 포함 하는 둘베코 변형 이글 배지인 것을 특징으로 하는 돼지 만능성 줄기세포 배양용 배지 조성물.
10% (v/v) DMSO, 10% (v/v) 에틸렌 글리콜, 80% (v/v) 제 5 항에 따른 돼지 만능성 줄기세포 배양용 조성물을 포함하는 돼지 만능성 줄기세포 보존용 조성물.
20% (v/v) DMSO; 20% (v/v) 에틸렌 글리콜; 0.83M 설탕을 포함하는 60% (v/v) 제 5 항에 따른 돼지 만능성 줄기세포 배양용 조성물을 포함하는 돼지 만능성 줄기세포 보존용 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 이용한 돼지 만능성 줄기세포 배양 방법.
제 1 항 또는 제 2 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 이용한 돼지 만능성 줄기세포 유지 방법.
제 1 항 또는 제 2 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 이용한 돼지 만능성 줄기세포 보존 방법.