KR101490229B1 - 소의 배아줄기세포 배양액 및 이를 이용한 배양방법 - Google Patents

소의 배아줄기세포 배양액 및 이를 이용한 배양방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 소의 배아줄기세포 확립을 위한 배양액 및 이를 이용한 소의 배아줄기세포의 배양방법에 관한 것이다. 본 발명의 소의 배아줄기세포 확립을 위한 배양액은 분화와 관련된 신호체계를 억제하고 부착능력과 생존율을 향상 시킴으로써, 배반포로부터의 소 배아줄기세포 확립 및 장기 계대가 가능할 뿐만 아니라, 배아줄기세포의 보존성이 증가하며, 장기 계대에도 불구하고 미분화 상태의 전능성 줄기세포로서의 특성을 우수하게 발현하므로 소 배아줄기세포의 배양액으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

소의 배아줄기세포 배양액 및 이를 이용한 배양방법{Culture medium,and method for bovine embryonic stem cell establishment}
본 발명은 소의 배아줄기세포 배양액 및 이를 이용한 소의 배아줄기세포의 배양방법에 관한 것이다.
배아줄기세포는 초기 배아발달단계 중 착상 전 배반포 단계의 내부세포괴 (inner cell mass)에서 얻을 수 있는 세포로, 자가증식력 및 모든 세포로 분화할 수 있는 전능성을 가지고 있다. 확립된 배아줄기세포는 영구적으로 계대가 가능할 뿐만 아니라, 세포동결법을 통해 기존 배아보다 쉽고 효율적으로 영구 보존할 수 있다.
소의 경우, 고능력 고품질 우의 도축 또는 폐사 이전에, 이들의 수정란 또는 체세포를 확보하고 이로부터 얻은 수정란유래 배반포 또는 체세포 핵이식 유래 배반포 단계에서 배아줄기세포를 확립할 수 있다면, 우수한 동일 유전자원의 영구적 계대 및 동결 보존이 가능하다. 또한, 보존된 줄기세포는 필요 시 핵이식 기법을 이용해 복제 소를 생산하여 동일 유전자원을 복원하거나, 형질전환동물 생산에 필요한 형질전환세포 선발에 활용하여 우수한 품질의 형질전환 소를 효율적으로 생산할 수도 있다.
현재까지 알려진 대표적인 배아줄기세포는 사람 및 마우스의 배아줄기세포이고, 이들을 제외한 다른 종의 동물에서 배아줄기세포를 확보하고자 할 때는 마우스배아줄기세포의 배양 방법을 변형하여 사용해왔지만, 기존의 마우스 배아줄기세포의 배양방법을 변형한 배양방법은 자가증식력 및 체내외전능력(pluripotent)을 갖는 배아줄기세포를 배양할 수 없어 소를 포함한 다른 동물 종에서는 큰 효과를 나타내지 않았다.
그 이유 중 하나는 배아줄기세포의 초기증식 및 계대배양을 통한 대량증식을 하기 위한 적절한 배양액이 개발되지 못했기 때문으로, 마우스 배아줄기세포 배양액을 기본으로 변형한 기존의 배양기법을 이용해 성공한 사례의 보고는 있지만, 대부분 타 유사동물 종, 동일 동물 종 내의 다른 계통(strain)에서도 성공 가능성이 매우 낮아 적용의 한계가 있는 실정이다.
특히, 소의 배아줄기세포는 배양환경에 매우 민감하고, 배반포로부터 배아줄기세포초기 콜로니를 형성하는 단계나 계대 시 세포를 배양접시에서 떼어내는 과정에서 쉽게 분화가 진행되며, 배양접시에서 떼어내어 새롭게 부착시키고자 할 경우에도 부착이 용이하지 않다. 실례로 기존의 배양액을 사용할 경우, 배반포로부터 소 배아줄기세포 초기 콜로니를 얻는 효율은 20-50% 정도이고, 이의 대부분이 15계대를 넘기지 못하였으며 50계대 이상의 장기배양에 성공한 사례는 전무하다.
따라서, 소배아줄기세포를 높은 효율로 확립하고 안정적으로 장기간 유지할 수 있는 소 배아줄기세포의 배양을 위한 고유의 배양액 개발이 절실히 요구된다.
본 발명자들은 기존의 배아줄기세포 유지에 관련된 물질을 포함하는 배양액 대신, 배아줄기세포의 성장 및 분화를 억제하는 소분자 물질을 포함하는 배양액을 이용한 결과, 배반포로부터의 소 배아줄기세포 확립 및 장기계대가 가능할 뿐만 아니라, 배아줄기세포의 보존성이 증가하며, 장기 계대에도 불구하고 줄기세포로서의 특성을 우수하게 발현하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 소의 배아줄기세포 배양액 및 이를 이용한 소의 배아줄기세포의 배양방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 소의 배아줄기세포 배양액 및 이를 이용한 소의 배아줄기세포의 배양방법을 제공한다.
본 발명의 소의배아줄기세포 배양액은 분화와 관련된 신호체계를 억제하고 부착능력과 생존율을 향상 시킴으로써, 배반포로부터의 소 배아줄기세포 확립 및 장기 계대가 가능할 뿐만 아니라, 배아줄기세포의 보존성이 증가하며, 장기 계대에도 불구하고 미분화 상태의 전능성 줄기세포로서의 특성을 우수하게 발현하므로 소 배아줄기세포의 배양액으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 다양한 방법으로 제조된 소 배반포로부터 배아줄기세포를 확립하는 과정을 모식적으로 나타낸 도이다.
도 2는 소 체세포 핵이식란의 제조과정을 시계열적으로 나타낸 도이다.
도 3은 소의 배반포로부터 소 배아줄기세포를 확립하는 과정을 시계열적으로 나타낸 도이다.
도 4는 장기 배양된 소 배아줄기세포를 광학현미경으로 관찰한 도이다.
도 5는 장기 배양된 소 배아줄기세포에서 줄기세포 특이적인 마커 유전자들(Oct4, Nanog, SSEA-4, TRA-1-60)의 발현여부를 확인하기 위하여, 배아줄기세포를 면역염색하여 관찰한 도이다.
도 6은 장기 배양된 소 배아줄기세포의 핵형을 나타낸 도이다.
본 발명은 FGF(fibroblast growth factor) 신호경로 억제제, MEK(MAP kinase 또는 ERK kinase) 신호경로 억제제, GSK3 β (glycogen synthase kinase-3β) 신호경로 억제제, 및 Rock(RhoA/Rho-associated proteinKinase) 신호경로 억제제를 유효성분으로 포함하는 소의 배아줄기세포 배양액 및 이를 이용한 소의 배아줄기세포의 배양방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서, 줄기세포란 다양한 계통발생의 세포를 생성할 수 있는 세포로서, 전능성, 만능성, 또는 다능성을 가지고 있으며, 자가증식 능력을 가진 세포를 말한다. 또한, 본 발명의 내용에서 배아줄기세포란 포유동물의 배아가 형성한 배반포의 내부세포괴(inner cell mass)로부터 얻은 줄기세포를 말한다.
본 발명의 소 배아줄기세포 배양액은 분화와 관련된 신호를 억제하는 물질을 포함하며, 보다 상세하게는 FGF 신호경로 억제제, MEK 신호경로 억제제, GSK3 β 신호경로 억제제를 포함한다.
또한, 본 발명의 소 배아줄기세포 배양액은 세포의 부착과 관련된 신호를 억제하는 물질을 포함하며, 보다 상세하게는 Rock 신호경로 억제제를 포함한다.
본 발명에서 상기 FGF 신호경로 억제제는 SU5402, PD166866, PD173074, Sprouty4일 수 있고, 바람직하게는 SU5402이나, 이에 제한되는 것은 아니다. FGF 신호경로 억제제의 농도는 바람직하게는 1~50 μM이고, 더욱 바람직하게는 1~5 μM이며, 가장 바람직하게는 2 μM이다.
또한, 상기 MEK 신호경로 억제제는 PD98059, AZD6244, PD0325901, CI-1040, PD184352, PD318088, BIX 02188, AS703026 등일 수 있고, 바람직하게는 PD184352이나, 이에 제한되는 것은 아니다. MEK 신호경로 억제제의 농도는 바람직하게는 0.1~20 μM이고, 더욱 바람직하게는 0.5~5 μM이며, 가장 바람직하게는 0.8 μM이다.
또한, 상기 GSK3 β 신호경로 억제제는 BIO, B216763, CHIR-99021 (CT99021), CHIR-98014, TWS119, SB415286 일 수 있고, 바람직하게는 CHIR-99021이나, 이에 제한되는 것은 아니다. GSK3 β 신호경로 억제제의 농도는 바람직하게는 1~10 μM이고, 더욱 바람직하게는 1~5 μM이며, 가장 바람직하게는 3 μM이다.
한편, 상기 Rock 신호경로 억제제는 티아조비빈(Thiazovivin), Y-27632, GSK429286A 일 수 있고, 바람직하게는 티아조비빈(Thiazovivin)이나, 이에 제한되는 것은 아니다. Rock 신호경로 억제제의 농도는 바람직하게는 0.5~10 μM이고, 더욱 바람직하게는 1~5 μM이며, 가장 바람직하게는 2 μM이다.
본 발명에 따른 발명은 FGF 신호경로 억제제, MEK 신호경로 억제제, GSK3 β 신호경로 억제제, 및 Rock 신호경로 억제제는 하기와 같이 각각의 신호경로를 억제함으로써 배아줄기세포를 효과적으로 확립할 수 있다.
FGF 신호경로는 growth factor binding protein 2 (Grb2), Ras, Raf 신호경로를 거쳐 세포증식과 사멸을 조절한다. 배아줄기세포에서 FGF 신호경로는 자가증식력을 억제하고 분화를 유도하는데 특히 내배엽 분화에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는 이러한 FGF 신호경로를 SU5402 처리로 억제함으로써 배아줄기세포가 내배엽으로 분화하는 것을 막아 전능성을 유지하고자 한다.
MEK 신호경로는 FGF의 여러 신호경로 중 하나로 일반 세포에서는 생장, 증식 및 생존에 영향을 주지만 배아줄기세포에서 자가증식력을 억제하고 분화를 유도한다고 알려져 있다. 특히 마우스에서는 MEK 억제는 배아줄기세포 확립 효율을 증가시키지만 자가증식력에는 직접적으로 영향을 주지 않는 것으로 보고 되어있다. 본 발명에서는 이러한 MEK 신호경로를 PD184352 처리로 억제함으로써 배아줄기세포가 분화하는 것을 억제해 전능성을 유지하고자 한다.
베타카테닌 (β-catenin) 은 세포 내에서 많은 역할을 갖고 있는데, 특히 배아줄기세포에서는 전능성관련 유전자인 OCT4, SOX2, NANOG 및 Rex1의 조절자로 알려져 있다. GSK3 β 신호경로는 이러한 베타카테닌을 제어하는 경로로 활성 시 세포질 내 베타카테닌을 인산화시켜 분해(degradation)을 유도하게 되고, 그 결과 전능성 관련 전자조절 인자 활성을 잃어 버린 배아줄기세포는 분화된다. 본 발명에서는 이러한 GSK3 β 신호경로를 CHIR-99021 처리로 억제함으로써 배아줄기세포 내 전능성 관련 전사조절 인자인 베타카테닌을 활성화시켜 배아줄기세포가 분화하는 것을 막고 전능성을 유지하고자 한다.
배아줄기세포를 장기 배양하는데 있어 또 다른 문제는 바로 세포의 생존능력이다. 특히 배아줄기세포의 경우 배양조건이 조금만 변화하여도 세포가 쉽게 분화하거나 세포사멸(아폽토시스; apoptosis) 과정을 거쳐 사멸한다. 세포에서 세포사멸은 세포부착분자들과 매우 긴밀한 연관이 있다. 세포부착능력이 사라지면 Rho-Rock 신호경로가 활성화되어 myosin 관련 신호가 비이상적으로 증가해 세포사멸을 유도한다. 티아조비빈(thiazovivin)은 Rock 특이적인 억제제로서 Rock 신호경로를 억제해 세포부착능력을 잃어도 세포의 생존능력을 유지해주는 역할을 한다. 최근 몇몇 보고에 의하면 마우스에서뿐만 아니라 인간 배아줄기세포에서도 그 기능이 보고 되었다. 본 발명에서는 기존에 배아줄기세포 분화와 생존에 중요하게 알려진 FBS, LIF를 제거하고 분화 신호경로를 억제제를 처리하여 약해진 세포의 생존능력을, 티아조비빈 처리를 통해 증가시킴으로써 배아줄기세포의 세포사멸 유도 억제 및 생존능력을 향상을 유도하고자 한다.
Figure 112012103860386-pat00001
본 발명에 따른 소의 배아줄기세포 배양액은 체내 회수, 체외수정, 단위발생, 및 체세포 핵이식 등 소의 배반포 획득 방법에 관계 없이, 다양한 방법으로 생산된 소의 배반포로부터 배아줄기세포를 확립할 수 있다.
또한, 본 발명의 소 배아줄기세포 배양액은 유효성분인 FGF 신호경로 억제제, MEK 신호경로 억제제, GSK3 β 신호경로 억제제, 및 Rock 신호경로 억제제와 함께 소 배아줄기세포 배양에 사용되는 공지의 유효물질을 1종 이상 포함할 수 있고, 기존의 포유동물 세포의 배양용 배양액인 DMEM, DMEM/F12 glutmax, α-MEM, KO, neurobasal medium, N2, B27 등에 첨가되어 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시 예에 따르면, 세포의 분화와 관련된 신호를 억제하는 FGF 신호경로 억제제, MEK 신호경로 억제제, 및 GSK3 β 신호경로 억제제 중, 1종 내지 2종의 신호 경로 억제제를 조합하여 사용한 경우에 비하여, 상기 3종의 신호경로 억제제를 모두 조합하여 사용한 경우에 소 배아줄기세포의 확립효율이 우수하다.
또한, 세포의 부착과 관련된 신호를 억제하는 상기 3종의 신호경로 억제제를 모두 조합하여 사용한 경우와, 상기 3종의 신호경로 억제제 및 세포의 부착과 관련된 신호를 억제하는 Rock 신호경로 억제제를 조합하여 사용한 경우를 비교한 결과, 소 배아줄기 세포의 확립 및 보존 효율에 있어서는 상호 유사한 효과가 나타나나, 계대 후 콜로니 재형성 효율에 있어서는 Rock 신호경로 억제제를 조합하여 사용한 경우에서 약 30% 정도 상승하는 효과가 나타난다.
따라서, 본 발명의 세포 분화와 관련된 신호를 억제하는 FGF 신호경로 억제제, MEK 신호경로 억제제, 및 GSK3 β 신호경로 억제제, 및 세포부착과 관련된 신호를 억제하는 Rock 신호경로 억제제를 모두 포함하는 배양액은 소 배아줄기세포의 확립을 위한 배양 및 장기계대 배양에 있어 유용하게 사용될 수 있으며, 특히 본 발명에 따른 SU5402, PD184352, CHIR-99021, 및 티아조비빈(Thiazovivin)을 모두 조합하여 사용하는 경우에 소 배아줄기세포의 배양 효과가 뛰어나다.
또한, 본 발명은 소의 투명대를 제거한 배반포 및 배반포 유래세포를 상기 소의 배아줄기세포 배양액과 접촉시키는 단계를 하나 이상 포함하는 소의 배아줄기세포의 배양방법을 제공한다.
소의 투명대를 제거한 배반포 및 배반포 유래세포를 상기 소의 배아줄기세포 배양액과 접촉시키는 단계는 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
(a) 소 배반포의 내부세포괴(inner cell mass)로부터 배아줄기세포를 분리하는 단계; 및
(b) 상기 분리된 배아줄기세포를 상기 배양액에 침지한 영양세포층 위에 식립하여 배양하는 단계.
이때 초기발생단계의 할구(blastomere)를 통해서도 배아줄기세포의 확립이 가능하므로(Geens M, I Mateizel, K Sermon, M De Rycke, C Spits, G Cauffman, P Devroey, H Tournaye, I Liebaers and H Van de Velde. (2009). Human embryonic stem cell lines derived from single blastomeres of two 4-cell stage embryos. Hum Reprod 24:2709-17.), 상기 내부세포괴로부터 분리한 배아줄기세포 대신, 초기발생단계의 할구를 이용할 수 있다.
배양조건은 36.5~39.5℃, 3~7% CO2 대기 하에 배양할 수 있으나, 바람직하게는 38.5℃, 5% CO2 대기조건이다.
상기 영양세포층은 배아줄기세포의 생장에 필요한 인자들을 제공하고, 배아줄기세포가 이들에 잘 부착하여 안정적으로 생장할 수 있도록 배아줄기세포의 하부에 배열하는 세포층이다.
상기 영양세포로는 마우스, 토끼, 돼지, 산양, 면양, 소, 말 등 다양한 동물 군으로부터 채취한 1종 이상의 섬유아세포(fibroblast)를 사용할 수 있고, 바람직하게는 마우스의 섬유아세포이며, 더욱 바람직하게는 마우스 태아의 섬유아세포이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이때 상기 영양세포는 증식억제물질로 처리된 것일 수 있으며, 증식억제물질은 MMC (Mitomycin C)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
영양세포에 MMC (Mitomycin C) 등의 증식억제물질을 처리하면, 영양세포의 증식은 억제되고 최소한의 대사 상태만을 유지하게 때문에 배아줄기세포의 성장에 필요한 인자들을 효율적으로 제공할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 다양한 방법을 통한 소 배반포의 입수
본 발명의 소 배아줄기세포 배양액의 효능 실험에 사용되기 위한 소 배반포를 하기와 같이 다양한 방법으로 입수하였다.
1. 난자의 체외성숙
도축되는 암소의 난소를 수집하여 18G 주사기로 직경 2-5 mm의난포에서 난구세포-난자 복합체(cumulus-oocyte complex; COC) 흡입, 채취하고 0.5ml (4-well dish 기준) 체외성숙용 배양액(medium 199 with Earle? salts and L-glutamine (TCM199, Invitrogen, USA), 10% FBS (Invitrogen), 10 μg/ml 농도의 FSH-P (Foll-tropin-V, Veterpharm, UK), 0.2 mM sodium pyruvate, 1 μg/ml estradiol-17β, 및 10 ng/ml 농도의 EGF)을 이용하여 20 내지 22시간동안 체외성숙을 유도하였다.
배양 20 내지 22시간 후, 감수분열 중기2기 (metaphase II; MII)로 성숙된 난구세포-난자 복합체(COC)는 곧바로 체외수정에 공여하거나 히알루로니다제(hyaluronidase)를 이용하여 난구세포(cumulus cell)를 제거한 후 하기의 체세포 핵이식(nuclear transferation), 또는 단위발생(parthenogenesis) 유도에 공여하였다.
체외수정(IVF, in vitro fertilization), 체세포 핵이식(SCNT, somatic cell nuclear transfer), 단위발생(Parthenogenesis)을 통한 소 배반포의 입수과정은 도 1에 나타내었다.
2. 체외수정(In vitro fertilization)
체외수정용 배양액(IVF-TALP, in vitro fertilization-Tyrode? Albumin Lactate Pyruvate)으로 미소적을 만든 배양접시에 미네랄오일을 도포하여 준비한 후, IVF-TALP로2회 세정한 성숙난자를 각 미소적 당 10개씩 넣었다.
체외수정을 위한 정자는, 먼저 15ml 튜브에 전배양(pre-incubation)한 45% 및 90% 퍼콜(percoll)용액을 차례로 분주하여 층을 형성하고, 동결정액 스트로(straw)를 37℃에서 1분간 융해한 후,층이 나누어진 퍼콜(percoll)의 위쪽으로 융해된 스트로 내 정액을 분주하였다.그 다음, 1,500 rpm으로 20 분간 원심분리를 하여 정자와 동결용 희석액을 분리한 다음, 상층액을 제거하였다. 남아있는 정자 펠렛은 정자처리용 배양액(sperm-TALP)으로 2회 세정한 후, 최종 농도를 1×106/ml 로 맞추어 난자가 준비된 체외배양용 미소적에 주입하여, 20 내지 24 시간 동안 체외수정 배양하였다.
체외수정을 위한 배양이 끝난 후에는, 난자 주변의 정자 및 잔존 난구세포를 제거하고 체외배양용 배양액(CR2-C culture medium (114.7mMNaCl, 3.1mMKCl, 26.2mM NaHCO3, 5mM Hemi Ca-lactate (Sigma, L4388), 0.4mM Na-pyruvate, 1mM glutamine, 1X BME amino actid (Sigma, B-6766), 1X MEM monessentiatal amino acid (Gibco, 15240-062), 1X Penicillin G (Gibco), 0.3% fatty acid-free BSA (ff-BSA), 1% v/v insulin, 1X ITS )으로 옮겨 3일간 체외배양하고, CR2-B 배양액(114.7mMNaCl, 3.1mM KCl, 26.2mM NaHCO3, 5mM Hemi Ca-lactate (Sigma, L4388), 0.4mM Na-pyruvate, 1mM glutamine, 1X BME amino actid (Sigma, B-6766), 1X MEM monessentiatal amino acid (Gibco, 15240-062), 1X Penicillin G (Gibco), 0.15% fatty acid free-BSA, 5% fetal bovine serum (FBS), 1% v/v insulin, 1X ITS )으로 옮겨 추가로 4-5일간 배양하여 소 배반포를 획득하였다.
3. 단위발생
성숙난자의 난구세포-난자복합체(cumulus-oocyte complex; COC)를 0.1% 히알루론산(hyaluronic acid) 처리를 통해 제거한 후 10 μM농도의 Ca-ionophore CR2-P 배양액(114.7mM NaCl, 3.1mM KCl, 26.2mM NaHCO3, 5mM Hemi Ca-lactate (Sigma, L4388), 0.4mM Na-pyruvate, 1mM glutamine, 1X BME amino actid (Sigma, B-6766), 1X MEM monessentiatal amino acid (Gibco, 15240-062), 1X Penicillin G (Gibco), 0.1% PVA) 내에서 5분간 처리하여 단위발생을 유도하고, 2uM 6-디메틸아미노퓨린(6-DMAP)의 CR2-C 를 3시간 동안 처리하여 2배체 단위발생란의 발달을 유도하였다. 이후 활성화된 난자를 CR2-C 배양액으로 옮겨 상기 2의 체외수정란의 배양과 동일한 방법을 적용하여 소 배반포를 획득하였다.
4. 체세포 핵이식
4-1. 체세포의 준비
소의 귀 또는 기타 피부조직에서 5mm X 5mm 크기의 조직을 확보하고 당 업계에 알려진 일반적인 세포배양기법을 이용하여 배양 및 동결보존을 실시하였다. 핵이식에 공여 시에는 3~7계대 사이의 세포를 단일세포로 분리되도록 처리하여 제공하였다.
4-2. 탈핵 난자의 제조
준비된metaphase II 단계의 성숙난자를 10% FBS 및 0.5mM HEPES 함유 TCM-199로 만든 미소적에 분주하고 미세조작기에 부착된 스퀴징피펫(squeezing pipette)을 이용해 제1극체 주변의 투명대를 절개한 후 부드럽게 압박하여 제1극체 및 난핵을 제거하여 탈핵 난자를 제조하였다.
4-3. 탈핵 난자에 체세포 이식
먼저, 3~7 계대의 소 체세포를 트립신 처리하여 각각 하나의 세포로 분리하고 공여핵 일시 보존용 미소적에 분주한 다음, 핵주입용 미세피펫으로 체세포를 흡입하였다. 탈핵 난자가 있는 미소적으로 체세포를 흡입한 미세피펫을 이동시켜, 상기 4-2에서탈핵 난자의 투명대에 낸 절개창으로, 탈핵 난자의 세포질과 투명대 사이공간(perivitelline space)에 체세포를 도입하였다. 이때 도입된 체세포가 다시 나오지 않도록 피펫으로 투명대 절개창 부위를 부드럽게 눌러 복원시켰다.
4-4. 세포 융합
탈핵난자의 세포질과, 도입된 체세포의 융합을 위하여,체세포를 도입시킨 탈핵난자를 융합배지(0.28 M sucrose, 0.5 mM Mg(C2H3O2)2·4H2O, 0.1 mMCa(C2H3O2)2, 1.0 mM K2HPO4, 0.1 mM glutathione)로 이동하였다. 1.8-2.3 kV/cm, 20 μsec의 필드 값으로 맞추어 1-2회의 전기자극을 가하여 세포융합을 유도하였다. 그 후, 광학현미경으로 보아 도입된 체세포와 탈핵난자의 세포질 융합이 확인된 재구축란만 선별하여 상기 2의 체외수정란과 동일한 방법을 적용하여 소 배반포를 획득하였다.
상기 4-1 내지 4-4의 소 체세포 핵이식란의 제조과정은 도 2에 나타내었다.
실시예 2. 소 배아줄기세포 배양액의 제조
소 배아줄기세포의 배양을 위한 배양액들은 하기의 표 1의 조성으로 제조하였다.
Figure 112012103860386-pat00002
실시예 3. 각 배양액의, 배반포로부터 소배아줄기세포의 초기 콜로니 확립능력의 비교
각 배양액의, 배반포로부터 소 배아줄기세포의 초기 콜로니를 확립하는 능력을 비교하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
먼저 상기 실시 예 1의 2 내지 4의 방법을 통하여 체외배양 7일차에 정상 단계로 발달한 배반포를 선별하였다. 다음으로 직경 60-70 μm의마우스피펫(mouth pipette)을 이용, 배반포의 투명대를 물리적으로 제거한 후, 배반포의 이동성을 줄이고 영양세포층에 잘 안착하도록 ICM(inner cell mass)에서 가장 먼 영양막세포(TE, tropectoderm) 측을 19-21 gauge 주사바늘로 찢었다. 이렇게 준비된 배반포를 증식억제제인 MMC(mitomycin C)로 처리된 영양세포층(mouse fibroblast feeder layer) 위에 식립하였다. 식립된 배반포는 38.5℃, 5% CO2포화습도 환경에서 상기 1에서 제조한 각각의 배양액을 사용하여 배양하였으며, 배양액은 매일 주기로 교체하였다. 배양 8-10일 후 소 배아줄기세포의 초기 콜로니 형성 여부를 확인하였다.
각 배양액에 따른 소 배아줄기세포의 초기 콜로니 형성 능력은 표 2에 나타내었다.
Figure 112012103860386-pat00003
* SU5402, PD184352, CHIR-99021 첨가배양액
** SU5402, PD184352, CHIR-99021, 티아조비빈(Thiazovivin)첨가배양액
표 2에 나타낸 바와 같이, 세가지 억제제와 티아조비빈(Thiazovivin)을 첨가한 군(3i+Tz)의 부착력 및 초기 콜로니 형성 효율은 기존의 배양액보다 월등하게 향상되었으나, 세가지 억제제 만을 첨가한 군(3i)은 기존의 배양액들과 비슷한 효율을 나타내었다.
실시예 4. 각 배양액의, 소 배아줄기세포의 계대, 장기 배양 가능여부 및 장기배양 효율의 비교
각 배양액에 따른 소 배아줄기세포의 계대, 장기배양 가능여부 및 장기배양 효율을비교하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 상기 2에서 소 배아줄기세포의 초기 콜로니를 획득하여 매 4-5일 마다 계대를진행하였다. 계대방법은 소 배아줄기세포 콜로니를 19-21 게이지(gauge)주사바늘을 이용해 4-8조각으로 나누어 잘라낸 다음, 각각의 배양액 및 새로운 영양세포층이 준비된 배양접시로 옮겨 38.5℃, 5% CO2,포화습도 환경 아래에서 배양하였다. 배양액은 매일 주기로 교체하였으며,0, 3, 5, 11, 15 번째 계대 후 소 배아줄기세포의 개수를 계수하였다.
각 배양액에 따른 계대횟수별 소 배아줄기세포의 장기배양 가능 여부는 표 3에 나타내었고, 이에 따른 장기배양 효율은 표 4에 나타내었다.
또한, 계대 후 재부착능 및 새로운 콜로니를 형성하는 효율은 표 5에 나타내었다.
Figure 112012103860386-pat00004
* SU5402, PD184352, CHIR-99021 첨가배양액
** SU5402, PD184352, CHIR-99021, 티아조비빈(Thiazovivin)첨가배양액
Figure 112012103860386-pat00005
O: 콜로니가 다음계대까지 유지됨.
Ｘ: 계대 후 부착이 이루어지지 않음.
△: 부착이 이루어졌으나 콜로니가 다음계대까지 유지되지 못함.
* SU5402, PD184352, CHIR-99021 첨가배양액
** SU5402, PD184352, CHIR-99021, 티아조비빈(Thiazovivin)첨가배양액
Figure 112012103860386-pat00006
표 3 및 4에 나타난 바와 같이,본 발명의 3i+Tz 배양액으로 배양한 군은 3i 배양액으로 배양한 군과 비슷하게 장기배양이 가능하였으나, 계대한 배아줄기세포의 숫자면에서 3i+Tz 배양액의 경우가 더 우수하였으며, 표 5에 나타낸 바와 같이, 계대 후 콜로니를 형성하는 능력 또한,각각 57.1%(3i 배양액), 88.5%(3i+Tz 배양액)로 티아조비빈(Thiazovivin)을 더 첨가한 군에서 소 배아줄기세포의 유지 효율이 30% 정도 향상된 것을 알 수 있었다.
실시예 5. 본 발명의 배양액으로 배양한 배아줄기세포의 동결 후 융해 시 생존율(보관 용이성) 비교
본 발명의 배양액으로 배양한 소 배아줄기세포의 보관 용이성을 알아보기 위하여, 배양액에 따른 소 배아줄기세포의 동결 후 융해 시의 생존율을 시험하였다.
동결방법은 계대 4-5일된 콜로니를 19-21 게이지(gauge)주사바늘을 이용해 4-8조각으로 나누어 잘라낸 다음, 10개를 동결전용 튜브에 모아 동결 용액과 함께 섞어 -80℃ 냉동고에서 2일간 보관 후, 질소탱크로 옮겨 영구 보존하였다. 여기서 사용된 동결 용액은 10% DMSO, 50% FBS가 포함된 DMEM 이었다. 2주 후 질소탱크에서 동결된 튜브를 꺼내어 36℃의 가온 수조에 넣어 1-2분 정도 융해 후, 동결 양의 두 배의 소 배아줄기세포 배양액을 첨가해 1500 rpm에 3분간 원심분리하였다. 배양액을 모두 제거하고 새로운 배양액을 첨가하여 새로운 영양세포층이 준비된 배양접시로 옮긴 뒤 38.5℃, 5% CO2, 포화습도 환경 아래에서 배양하였다. 배양액은 매일 주기로 교체하였으며 융해 후 2일째 생성된 콜로니 개수를 확인해 생존율을 측정하였다.
결과는 표 6에 나타내었다.
Figure 112012103860386-pat00007
*SU5402, PD184352, CHIR-99021 첨가 배양액
**SU5402, PD184352, CHIR-99021, 티아조비빈(Thiazovivin)첨가 배양액
표 6에 나타낸 바와 같이, 초저온보온 후 해동시의 소 배아줄기세포의 생존율은 세가지 억제제 및 티아조비빈(Thiazovivin)을 포함하는 배양액에서 월등히 우수한 것으로 나타나 장기배양뿐만 아니라 보관에도 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 6. 본 발명의 3i+Tz 배양액으로 배양한 배아줄기세포의 줄기세포 특성 유지 확인
본 발명의, 3가지 분화억제제 및 티아조비빈(Thiazovivin)을 포함하는 배양액(3i+Tz)으로 배양한 배아줄기세포가 줄기세포 특성인 전분화능(pluripotency)을 유지하는지 여부를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
6-1. 줄기세포의 형태적 특징 확인
각 배양액 별로 장기배양(12 계대)한 소 배아줄기세포의 형태적 특성을 광학현미경으로 관찰하였다.
결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, α-MEM 배양액으로 4일간 배양한 소 배아 줄기세포는 형태가 불규칙하고 부분적으로 세포가 사멸되어 분리되는 현상을 관찰할 수 있었으며(도 4A), 본 발명의 3가지 분화억제제 및 티아조비빈(Thiazovivin)을 포함하는 배양액(3i+Tz)으로 배양한 배아줄기세포의 경우 여전히 영양세포층(feeder layer)과 구별되어 콜로니를 유지하며 단단히 부착되어 자라는 모습을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 3i+Tz 배양액으로 배양된 소 배아줄기세포는 정상적인 형태로 장기 배양이 가능함을 알 수 있다.
6-2. 줄기세포 특이 마커 확인
본 발명의, 3가지 분화억제제 및 티아조비빈(Thiazovivin)을 포함하는 배양액(3i+Tz)으로 배양한 배아줄기세포가 줄기세포 특성을 유지하는지 여부를 확인하기 위하여 줄기세포 특이적인 전능성과 관련된 마커(Oct4, Nanog, SSEA-4, TRA-1-60)를 면역염색 하였다.
형광염색을 위해, 먼저 계대 후 4-5일 된 소 배아줄기세포를 PBS로 2번 세정한 후 4% PFA를 30분간 처리해 세포를 고정하였다. 고정액을 제거하기 위해 PBS로 3회 세정한 후 0.2% Triton-X를 약 10-15분간 처리해 세포막 투과성을 높여주었다(permeabilization). Triton-X를 제거하기 위해 PBS로 3회 세정한 다음, 비특이적 반응을 방지하기 위해 5% BSA (bovine serum albumin)가 첨가된 PBS를 1시간 동안 세포에 처리하여 블로킹(blocking) 하였다. 다음으로, 일차항체를 4℃에서 12-16시간 처리하였다. 처리 농도는 Oct4 (1:50), Nanog (1:250), SSEA-4 (1:25), TRA-1-60 (1:25)로 진행하였다. 일차항체를 PBS로 3번 세정하여 완전히 제거한 후, 30-60분 정도 이차항체를 처리하고 이후 PBS로 3회 세정하여 이차항체도 완전히 제거하였다. 준비된 시료는 세포 핵 염색과 형광을 보호하기 위해 Slow fade gold with DAPI로 처리하고 커버글라스를 덮어 형광현미경으로 전능성과 관련된 마커염색을 확인하였다.
결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 3i+Tz 배양액으로 배양한 소 배아줄기세포는 핵에서 줄기세포 특이적인 마커들(Oct4, Nanog, SSEA-4, TRA-1-60)을 잘 발현하여 줄기세포 특성을 잘 유지함을 확인하였다.
6-3. 줄기세포의 핵형(염색체)검사
본 발명의, 3가지 분화억제제 및 티아조비빈(Thiazovivin)을 포함하는 배양액(3i+Tz)으로 배양한 소 배아줄기세포가 안정적으로 증식하여 장기배양이 가능한지 여부를 확인하기 위하여 50 계대 이상 배양한 소 배아줄기세포의 핵형(염색체)검사를 실시하였다.
결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 3i+Tz 배양액을 사용하여 50 계대 이상 배양된 배아줄기세포는 정상 핵형을 나타내었으므로, 본 발명의 3i+Tz 배양액은 기존 배양액들과 달리, 정상적인 염색체 형태를 유지하면서 안정적으로 장기배양이 가능함을 알 수 있다.

Claims (16)

  1. FGF(fibroblast growth factor) 신호경로 억제제로 SU5402;
    MEK(MAP kinase 또는 ERK kinase) 신호경로 억제제로 PD184352;
    GSK3 β(glycogen synthase kinase-3β) 신호경로 억제제로 CHIR-99021; 및
    Rock(RhoA/Rho-associated protein Kinase) 신호경로 억제제로 티아조비빈(thiazovivin); 을 유효성분으로 포함하는 소의 배아줄기세포 배양액.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 FGF 신호경로 억제제의 농도는 1~50 μM인 것을 특징으로 하는, 소의 배아줄기세포 배양액.
  7. 제1항에 있어서, 상기 MEK 신호경로 억제제의 농도는 0.1~20 μM인 것을 특징으로 하는, 소의 배아줄기세포 배양액.
  8. 제1항에 있어서, 상기 GSK3 β 신호경로 억제제의 농도는 1~10 μM인 것을 특징으로 하는, 소의 배아줄기세포 배양액
  9. 제1항에 있어서, 상기 Rock 신호경로 억제제의 농도는 0.5~10 μM인 것을 특징으로 하는, 소의 배아줄기세포 배양액.
  10. 삭제
  11. 제1항, 제6항, 제7항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항의 배양액 및 소의 투명대를 제거한 배반포 및 배반포 유래세포를 접촉시키는 단계를 하나 이상 포함하는 소 배아줄기세포의 배양방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 배양방법의 배양조건은 36.5 내지 39.5℃, 3 내지 7% CO2인 것을 특징으로 하는, 소 배아줄기세포의 배양방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 배양액 및 소의 투명대를 제거한 배반포 및 배반포 유래세포를 접촉시키는 단계는 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 소 배아줄기세포의 배양방법:
    (a) 소 배반포의 내부세포괴(inner cell mass)로부터 배아줄기세포를 분리하는 단계; 및
    (b) 상기 분리된 배아줄기세포를 상기 배양액에 침지한 영양세포층 위에 식립하여 배양하는 단계.
  14. 제13항에 있어서, 상기 영양세포는 마우스, 토끼, 돼지, 산양, 면양, 소, 말로 이루어진 동물군으로부터 채취된 1종 이상의 섬유아세포인 것을 특징으로 하는, 소 배아줄기세포의 배양방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 영양세포는 증식억제물질로 처리된 것임을 특징으로 하는, 소 배아줄기세포의 배양방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 증식억제물질은 MMC(mitomycin C)인 것을 특징으로 하는, 소 배아줄기세포의 배양방법.

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