KR20120045555A - 라파마이신을 포함하는 포유동물 수정란의 배지 조성물 및 이를 이용한 포유동물 수정란 배양 방법 - Google Patents

라파마이신을 포함하는 포유동물 수정란의 배지 조성물 및 이를 이용한 포유동물 수정란 배양 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 포유동물 수정란의 배반포 발달률 향상을 위한 체외배양용 배지조성물 및 상기 배지 조성물을 이용한 포유동물 수정란의 체외배양 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 라파마이신을 포함하는 체외배양용 배지 조성물 및 수정란 배양시 상기 배지 조성물을 이용하여 질적으로 개선된 포유동물 수정란을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

라파마이신을 포함하는 포유동물 수정란의 배지 조성물 및 이를 이용한 포유동물 수정란 배양 방법 {Composition for Culturing Mammalian Embryos and Method of Culturing Mammalian Embryos Using Thereof}
본 발명은 라파마이신을 포함하는 체외배양용 배지 조성물 및 수정란 배양시 상기 배지 조성물을 이용하여 질적으로 개선된 포유동물 수정란을 생산하는 방법에 관한 것이다
수정란이식(embryo transfer)이란 동물(공란축; donor)의 생식기로부터 착상 전의 수정란을 회수하거나 체외에서 수정시킨 수정란 또는 난자의 핵을 치환하여 발생한 수정란을 배양하여 다른 동물(수란축; recipient)의 생식기에 이식하여 착상, 임신, 분만케 하는 생명공학기술이다.
포유동물 수정란 이식 기법은 종자 개량 및 대량 생산이라는 목적으로 개발되었다. 소 및 돼지의 개량은 지난 30년간 종모우 및 종모돈의 정액을 이용한 인공수정 기법에 의해 수행되었고, 그 결과 우수한 수소의 이용을 통한 개량이 진행되었으나 우수한 암소의 능력은 가축 개량에 이용되지 못함으로 인해 개량 속도가 상당 부분 지연되었다. 그러나, 포유동물 수정란 이식기술을 이용하게 되면 인공수정 기술보다 개량 속도가 약 3배 이상 빠르고, 특히 우량 송아지 및 우량 돼지를 조기에 대량 생산이 가능하다. 이미 선진국에서는 우량 종축 생산에 포유동물 수정란 이식기술을 이용하고 있다.
포유동물의 수정란을 체외에서 배양할 수 있다는 것은 가축 등의 포유동물 증식 및 개량에 있어서 매우 유용한 기술이 된다. 특히 최근에는 동물 형질전환기술 및 복제동물 생산 기술의 유용성이 전 세계적으로 인정되면서 포유동물의 수정란을 체외에서 조작하는 것이 필수적인 과정이 되었다. 상기 체외조작은 체외배양을 전제로 하여 이루어지는 과정이기에, 보다 간편하고 안정적인 체외배양기법을 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.
특히, 포유동물 수정란 생산률을 증대시킬 수 있는 배양 조건을 확립하고자 다양한 연구들이 진행되어 왔다. 많은 연구자들이 산소의 농도, 난구세포의 유무, 난자의 크기 차이에 따른 배 발달률 조사를 수행하였는데, 이는 배양이 되는 외부 환경 차이에 따라서도 배 발생률의 차이가 나기에 적합한 조건을 확립하고자 하는데 그 목적이 있다. 또한 여러 가지 배양방법 및 배양액의 각각의 물질들에 대한 여러 가지 실험들이 수행되었다.
그러나 상기와 같은 많은 연구들에도 불구하고, 수정란의 체외배양환경을 최적화시켜 배반포 발달률을 증대시키는 미지의 발달 인자들이 완전하게 밝혀지지 않은 상태이다. 그러므로, 보다 개선된 수정란 배양조건을 확립하여 배반포 발달률이 향상된 수정란을 생산하는 방법이 필요한 실정이다.
따라서 본 발명은 보다 개선된 수정란 배양조건을 확립하여 배반포 발달률이 향상된 수정란을 생산하는 방법을 제공하고자 한다.
상기 과제의 해결을 위해, 본 발명은 라파마이신을 포함하는 포유동물 수정란의 체외배양용 배지 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 포유동물 수정란을 상기 배지에서 배양시작 시부터 2 내지 4일간 배양하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 포유동물 수정란의 체외배양 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 라파마이신을 포함하는 체외배양용 배지 조성물은 체외수정란의 배반포 발달률을 증대시키고, 수정란 세포의 세포사멸을 억제시켜 내부세포괴 영약막 세포를 포함한 전체 세포수를 증가시킴으로써 배양된 포유동물 수정란을 질적으로 향상시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 포유동물 수정란의 채외배양 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 라파마이신을 수정란 배양 전기간 처리한 경우의 배반포률에 관한 그래프이다.
도 3은 라파마이신을 수정란 배양 초기에만 처리한 경우의 배반포률에 관한 그래프이다.
도 4는 라파마이신을 수정란 배양 후기에만 처리한 경우의 배반포률에 관한 그래프이다.
도 5는 시험예 2에 따른 라파마이신을 수정란 배양 전기간 처리한 경우의 결과 사진이다.
도 6은 시험예 2에 따른 라파마이신을 수정란 배양 초기에만 처리한 경우의 결과 사진이다.
도 7은 시험예 2에 따른 라파마이신을 수정란 배양 후기에만 처리한 경우의 결과 사진이다.
도 8은 라파마이신을 수정란 배양 전기간 처리한 경우 각 실험군별 내부세포와 영양막 세포수의 결과 그래프이다.
도 9는 라파마이신을 수정란 배양 초기에만 처리한 경우 각 실험군별 내부세포와 영양막 세포수의 결과 그래프이다.
도 10은 라파마이신을 수정란 배양 후기에만 처리한 경우 각 실험군별 내부세포와 영양막 세포수의 결과 그래프이다.
도 11은 시험예 3에 따른 라파마이신을 수정란 배양 전기간 처리한 경우의 결과 사진이다.
도 12는 시험예 3에 따른 라파마이신을 수정란 배양 초기에만 처리한 경우의 결과 사진이다.
도 13은 시험예 3에 따른 라파마이신을 수정란 배양 후기에만 처리한 경우의 결과 사진이다.
도 14는 라파마이신을 수정란 배양 전기간 처리한 경우 각 실험군별 세포사멸수 및 세포사멸율의 결과 그래프이다.
도 15는 라파마이신을 수정란 배양 초기에만 처리한 경우 각 실험군별 세포사멸수 및 세포사멸율의 결과 그래프이다.
도 16은 라파마이신을 수정란 배양 후기에만 처리한 경우 각 실험군별 세포사멸수 및 세포사멸율의 결과 그래프이다.
본 발명은 라파마이신을 포함하는 포유동물 수정란의 체외배양용 배지 조성물을 제공한다.
라파마이신은 mTOR 유전자를 저해하여 자가포식작용을 유발하는 것으로 알려진 물질로, 라파마이신의 표적유전자인 mTOR이 결손된 수정란은 초기배 발달 중에 사멸하는 것으로 알려져 있어 라파마이신은 세포 분화 및 사멸과 밀접한 관련을 가지며, 특히 수정란의 배반포 형성을 저해할 수 있는 것으로 알려져 왔다.
그러나 본 발명의 발명자들은 이러한 라파마이신을 초기에 일정량만 처리한 경우 기존 보고와는 달리 수정란의 배반포기 발달률이 증대되고 내부세포괴 및 영양막 세포수가 증가할 뿐만 아니라, 수정란의 세포사멸이 억제되어 세포사멸이 일어나는 배반포가 양적으로 감소된다는 것을 밝힘으로써, 라파마이신을 수정란의 배양에 이용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 배지 조성물에 포함되는 라파마이신은 하기 화학식 1의 구조를 가질 수 있으며, 수정란에 대해 동등한 작용을 나타내는 한, 이들 화합물뿐만 아니라 이의 염 또는 유도체를 사용할 수 있다.
[화학식 1]
Figure pat00001

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 라파마이신은 5 내지 50nM, 5 내지 25nM 또는 8 내지 15nM 의 농도로 배지 조성물에 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 라파마이신을 통상적인 포유동물 수정란 배양에 이용되는 기본 배지에 첨가하여 사용할 수 있다. 본 발명에서 '기본 배지'는 포유동물의 종에 따라 차이가 있으나, 무기염류, 탄소원, 아미노산, 소 혈청 알부민 및 보조인자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하며, 당업자에게 알려진 일반적인 배지를 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 무기염류로는 NaCl, KCl, 및 NaHCO3 등을 사용할 수 있고, 탄소원으로는 글루코즈, 나트륨, 피루베이트 및 젖산칼슘염 등을 사용할 수 있으며, 아미노산으로는 글루타민을 비롯한 필수아미노산 및 비필수아미노산, 보조인자로는 기타 미량원소 및 완충액 등을 사용할 수 있다.
또한 상기 '기본 배지'는 항생제를 추가로 포함할 수 있으며, 바람직한 실시예로서 상기 기본 배지로는 포유동물세포 배양용으로 공지되어 상업화된 여러 배지, 예를 들어 CR1-aa (Rosenkrans, CF Jr., et al ., Biol . Reprod ., 49(3);459-462, 1993), TCM (tissue culture medium of medium199, Gibro, USA; Yue, C., et al ., Development , 121:2645-2654, 1995), CZB (Chatot -Ziomek-Bavister medium; Chatot, C.L., et al ., J. Reprod . Fert ., 86:679-688, 1989) 등을 그대로 사용할 수 있으며, 소의 경우 CR1-aa를 사용하는 것이 좋으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명의 배지 조성물을 적용시킬 수 있는 포유동물 수정란은 체외에서 배양될 수 있는 수정란이라면 모두 이에 해당하나, 보다 구체적으로는 체외 배 발생정지현상을 보이는 인간을 제외한 포유동물의 수정란, 바람직하게는 가축, 더욱 바람직하게는 소의 수정란이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 수정란은 체외수정란 또는 복제수정란을 모두 대상으로 할 수 있으며, 바람직하게는 초기 성숙란을 수정시켜 제조한 체외수정란을 대상으로 할 수 있다. 여기서 '체외수정란'이란 난자와 정자를 채취하여 체외에서 수정시킨 것을 말하고, '복제수정란'이란 체세포 공여핵을 유전물질이 제거된 수핵 난자에 주입한 후 물리적 또는 화학적 방법으로 융합시킨 것을 의미한다.
본 발명의 체외배양이란 수정란이 체내에서 자라는 상태와 구분되는 방법으로, 실험실의 인큐베이터(incubator)에서 체내 자궁의 환경과 유사한 조건으로 배양하는 일련의 실험실 과정을 의미하는 것으로, 본 발명의 배지 조성물은 이러한 체외배양에 최적화된 배지 조성물이다.
또한, 본 발명은 포유동물 수정란을 상기 체외배양용 배지에서 배양시작 시부터 2 내지 4일간 배양하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 포유동물 수정란의 체외배양 방법을 제공한다.
도 1은 본 발명의 포유동물 수정란의 채외배양 방법의 한 구체예를 나타낸 모식도이다.
이하의 실시예를 통하여 확인 할 수 있듯이, 본 발명의 체외배양 방법에 따르면 수정란의 배반포기 발달률이 증대되어 수정란 이식이 용이하다.
본 발명에서 용어 "배반포"는 수정란이 난할을 거듭하여 자라는 과정에서 치밀화된 상실배 이후에 배반포강을 형성하여 태아로 분화할 내부세포괴(inner cell mass)와 태반으로 분화할 영양외배엽(trophectoderm)으로 구분이 될 정도로 발육된 상태의 수정란을 의미한다.
체외수정란이 자궁에 착상하기 위해서는 배반포의 영양외배엽 세포에 존재하는 착상관련 단백질 효소가 필요하지만, 통상적으로 체외수정란이 난분열을 조기에 멈추게 되어 착상이 어렵게 되므로, 배반포 할구의 세포사멸을 억제시킴으로써 발달 증대 및 영양외배엽 세포 확보를 가능케하여 보다 용이하게 자궁 착상이 유도될 수 있게 된다.
본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 제조방법을 적용시킬 수 있는 포유동물 수정란은 체외에서 배양될 수 있는 수정란이라면 모두 이에 해당하나 보다 구체적으로는 체외 배 발생정지현상을 보이는 인간을 제외한 포유동물의 수정란, 바람직하게는 가축, 더욱 바람직하게는 소의 수정란이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명의 제조방법에서 사용되는 배지는 상기에서 상술한 바와 같이, 공지의 기본 배지에 라파마이신을 포함시킨 배지이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 포유동물 수정란의 배양 기간은 수정란이 배반포기 상태로 충분히 발달될 정도이면 특별히 제한되지는 않으나, 총 6 내지 8일간 배양하는 것이 적당하고, 이중 초기 2 내지 4일, 또는 3일간만 상기 라파마이신이 포함된 배지를 사용하고, 나머지 기간은 라파마이신을 포함하지 않은 공지의 기본 배지를 사용하는 것이 좋다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 포유동물 수정란은 인간을 제외한 포유동물로부터 난포란을 채취하는 단계; 상기 난포란에서 미성숙 난자를 회수하는 단계; 상기 회수된 미성숙 난자를 체외 성숙시키는 단계; 및 성숙된 난자와 정자를 체외 수정시키는 단계를 통해 제조될 수 있다.
상기 포유동물 수정란의 제조는 당업계에 알려진 공지의 방법으로 수행할 수 있으며, 구체적으로는 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 포유동물이 소인 경우, 미성숙 난자를 체외 성숙시키는 단계는 미성숙 난자를 18 내지 24시간, 또는 18 내지 22시간 동안 성숙 배양하는 것이 좋다.
[실시예]
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
본 명세서 및 도면중의 데이터는 평균 ± SD으로 표현한다. 이원 분산 분석법(ANOVA)을 사용하여 매개변수적으로 통계적 비교를 수행하고, 군 비교의 경우 일원 ANOVA는 스튜턴트 t-검정을 따랐다. 통계적 유의 수준은 P<0.05로 설정 하였다.
< 실시예 1> 소 미성숙란의 체외 성숙
도축장에서 암소의 난소를 적출 후 25℃, 0.9% 생리식염수에 보관하여 실험실로 옮긴 다음, 18 게이지(gage) 주사기를 사용하여 직경 2 ~ 6 mm 난포로부터 난포액을 회수하였고, 0.1% 소 혈청 알부민이 함유된 TL-Hepes 배양액(Voelkel, S.A., and Hue, Y.X. Theriogenology 37:1117-1131, 1992)에 희석하여 실체 현미경(SZ60, OLYMPUS, JAPAN) 하에서 미성숙 난포란을 선별하였다. 선별 기준은 세포질이 고루 분포하고 3겹 이상의 난구세포층이 치밀하게 붙어있는 미성숙 난포란이다.
상기 선별한 미성숙 난포란은 10% 소 태아 혈청이 함유된 TCM-199 배양액(Gibro, USA; Yue, C., et al ., Development 121:2645-2654, 1995)에 1 ㎍/㎖ 에스트라디올(estradiol; Sigma, USA)과 1 ㎍/㎖ FSH-P(Schering-Plough Animal Health, USA)를 첨가하여 사용하며 4 웰 디쉬에 한 웰 당 500 ㎕씩 분주하여 38.5℃, 5% CO2 배양기에서 20시간 동안 배양하였고, 그 결과 제1극체가 방출되는 성숙 난자를 얻었다.
< 실시예 2> 소 체외 수정란 제조
실시예 1에서 20시간 동안 체외 성숙된 난자를 0.6% 소 혈청 알부민(BSA: Bovine Albumin Serum, Sigma, USA)과 10 ㎍/㎖ 헤파린(heparin)(Sigma, USA)이 함유된 체외 수정용 Fert-TALP (http://www.specialtymedia.com/5Resources/ Protocols/ivfprotocol.htm)으로 3회 세척 후, 44 ㎕ 소적(medium droplets)당 15개씩을 첨가하여 수정 전까지 준비하였다.
액체질소에서 보관된 소의 동결 정액이 든 관(straw)을 공기 중에서 10초간 방치 후 37℃ 항온수조에서 2분간 해동시켰다. 해동된 정액을 37℃로 가열한 90%와 45%의 농도 구배된 퍼콜(percoll) 용액(Sigma, USA) 위에 올리고 2,000 rpm, 20분간 원심분리하여 정자를 그 외의 부분과 분리하였다. 이후 정자만을 분리하기 위하여 피펫을 이용하여 퍼콜 용액을 제거한 후, 정자를 세척할 수 있는 Sp-TALP(sperm-Tyrode's medium with albumin, lactate and pyruvate: http://www.specialtymedia.com /05Resources/Protocols/ ivfprotocol. htm) 5 ㎖의 용액에 가라앉은 정자 50 ㎕를 첨가하여 1,000 rpm, 10분간 원심분리하였다. 원심분리 후 침지된 정자만을 회수하여 난자 15개씩 들어있는 소적(medium droplets)당 1×106/ml 농도로 주입하여 20시간 동안 공배양에 의해 체외 수정을 수행하였다.
< 시험예 1> 소의 체외 수정란 배발달 조사
상기 실시예 2에서 제작한 체외 수정란을 1 mM 글루타민, 0.2 mM 피루베이트 및 라파마이신(rapamycin 0, 1, 10, 100 μM)가 첨가된 0.3% 소혈청 알부민(BSA)-CR1-aa 배양액에서 배양하였다.
라파마이신의 체외배양기간 중 첨가기간은 수정 후 3일, 7일 간 또는 수정 후 4일부터 7일 간 배양액에 첨가하여 50 ㎕ 체외 배양액 소적(medium droplets)에서 38.5℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
체외배양 전체기간동안 라파마이신을 첨가하여 배양된 수정란의 배발달률은 수정 7일 후에 배반포기 배의 형성이 관찰되었으며, 표 1과 같은 체외 발달률을 나타냈다. 하기 표 1 과 같이, 라파마이신(1 nM)가 처리된 배양액에서 배양된 수정란의 배반포기까지의 발달률이 32.7%로 관찰된 반면, 처리하지 않은 대조군에서는 25.3%로 관찰되었다. 이를 도 2에 도식화하였다. 통계처리프로그램(SAS: Statistical Analysis System)에 의해 두 실험의 결과가 유의적 차이가 있음을 확인하였다.
라파마이신이 체외 소 수정란의 발달에 미치는 영향(전기간 처리시)
구분
(처리별농도 nM)		 사용된 난자수 난할률
평균±표준오차		 배반포률
평균±표준오차
대조군 101 82.5±4.2 27.0±2.7
실험군 (1) 114 75.5±10.0 33.7±6.9
실험군 (10) 96 87.0±5.7 17.5±3.4
실험군 (100) 109 84.4±8.6 14.7±2.4
하기 표 2는 수정란의 배양기간 중 배양 1일에서 3일까지 라파마이신을 농도별로 처리한 결과이다. 수정후 1일에서 3일까지 라파마이신을 처리한 그룹에서는 라파마이신 10 nM을 처리한 그룹이 37.0%의 발달률을 보인반면 처리하지 않은 대조군에서는 27.0%의 발달률을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 이를 도 3에 도식화하였다. 이러한 결과는 통계처리를 통해 유의적인 차이가 있음을 확인하였다(* P<0.05).
라파마이신을 배양초기 처리시 체외 소 수정란의 발달에 미치는 영향
구분
(처리별농도 nM)		 사용된 난자수 난할률
평균±표준오차		 배반포률
평균±표준오차
대조군 108 81.3±5.4 27.0±1.1
실험군 (1) 111 82.0±7.5 26.4±1.7
실험군 (10) 116 85.7±11.3 37.0±4.8*
실험군 (100) 116 83.7±8.6 35.6±10.0*
하기 표 3에서는 체외배양중 4일에서 7일까지 라파마이신을 처리하여 배발달률의 결과를 관찰한 것으로 라파마이신이 1nM이 첨가되었을때 소수정란의 배발달률이 향상되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 도 4에 도식화하였다.
라파마이신을 배양후기 처리시 체외 소 수정란의 발달에 미치는 영향
구분
(처리별농도 nM)		 사용된 난자수 배반포률
평균±표준오차
대조군 50 47.1±6.2*
실험군 (1) 49 63.1±6.8**
실험군 (10) 47 25.9±6.4
실험군 (100) 48 27.6±10.9
* P<0.05
상기 실험 결과를 통해 처리시간과 농도에 따라 라파마이신이 수정란의 발달에 영향을 미침을 확인하였다
< 시험예 2> 소 배반포의 내부세포괴 및 영양막 세포 수 조사
체외 수정란을 각각의 배양액(전기간 라파마이신 처리/ 초기 3일 라파마이신 처리/ 후기 4일 라파마이신 처리)에서 7일 동안 배양한 후 7일째 배반포가 형성된 배만을 선별해 이중염색법을 통해 내부세포괴(inner cell mass : 이하 “ICM”이라 칭함)와 영양막(trophoblast : 이하 “TE”라 칭함)의 세포수를 조사하여 질적인 측면에서 조사하였다. 각각의 배반포기의 배는 0.5% 프로나아제(pronase)에 1분간 처리하여 투명대를 제거하였다. 처리 후 1 ㎎/㎖ 폴리비닐 알코올이 함유된 TL-Hepes 배양액을 이용하여 세척하였다. 투명대가 제거된 배를 TL-Hepes(Tyrodes lactate)와 1:5의 비율로 희석된 항 돼지 전체 혈청(anti-pig whole serum)을 이용하여 38.5℃, 5% CO2 조건에서 1시간 동안 처리하였다. 이후 처리된 배를 TL-Hepes 배양액으로 5회 세척하였다. 세척 후 상기 배를 10㎍/㎖ PI(propidium iodide)와 10㎍/㎖ 비즈벤즈아미드(bisbenzimide)가 첨가된 기니아 피그 보체(guinea pig complement)가 TL-Hepes 배양액과 1:5의 비율로 희석된 완충액에서 1시간 동안 처리하였다. 1 시간 동안 처리된 배반포를 0.1% PVA-PBS 완충용액으로 3회 이상 세척한 후 형광현미경 하에서 세포의 수를 조사하였다. ICM은 푸른색으로 염색되며 TE는 붉은 색으로 염색이 된다. 도 5, 도 6 및 도 7는 이의 실험 결과 사진에 관한 것이고, 도 5는 전기간 라파마이신 처리시 결과 사진, 도 6는 초기 3일 라파마이신 처리시 결과 사진, 도 7은 후기 라파마이신 처리시 결과 사진이다. 이를 통해 조사된 각각의 세포수 결과를 하기 표 4, 표 5 및 표 6에 나타내었다.
라파마이신 처리가 체외 소 수정란 유래 배반포의 세포수 증가에 미치는 영향(전기간 처리시)
구분 (처리별농도 nM) 대조군 실험군(1) 실험군(10) 실험군(100)
사용된 배반포수 16 10 7 11
배반포의 세포수
(평균)		 내부세포 32.0 ± 7.8 27.5 ± 10.1 35.0 ± 13.5 38.4 ± 10.6
영양막 70.6 ± 33.4 70.8 ± 33.4 50.9 ± 14.4 61.0 ± 19.2
전체세포수 102.6 ± 33.1 98.3 ± 41.4* 85.9 ± 25.4 99.4 ± 22.7
* P<0.05
상기 실험군에 따른 내부세포와 영양막 세포수를 도 8에 나타내었다.
라파마이신 배양초기 처리가 체외 소 수정란 유래 배반포의 세포수 증가에 미치는 영향
구분 (처리별농도 nM) 대조군 실험군(1) 실험군(10) 실험군(100)
사용된 배반포수 15 10 12 11
배반포의 세포수
(평균)		 내부세포 34.5 ± 11.5 41.5 ± 11.2 29.4 ± 13.9 34.8 ± 12.8
영양막 70.5 ± 34.7 100.7 ± 38.6* 112.4 ± 39.7* 92.2 ± 21.4
전체세포수 105.0 ± 37.6 142.2 ± 49.1* 141.8 ± 43.5* 127.0 ± 25.0
* P<0.05
상기 실험군에 따른 내부세포와 영양막 세포수를 도 9에 나타내었다.
라파마이신 배양후기 처리가 체외 소 수정란 유래 배반포의 세포수 증가에 미치는 영향
구분 (처리별농도 nM) 대조군 실험군(1) 실험군10 실험군100
사용된 배반포수 16 8 8 11
배반포의 세포수
(평균)		 내부세포 32.1 ± 7.0* 31.0 ± 14.0* 15.4 ± 6.6 18.8 ± 4.1
영양막 70.8 ± 25.9 85.0 ± 23.4 57.3 ± 21.9 73.6 ± 19.0
전체세포수 102.9 ± 28.6* 116.0 ± 33.2* 72.6 ± 27.7 92.4 ± 22.2
* P<0.05
상기 실험군에 따른 내부세포와 영양막 세포수를 도 10에 나타내었다.
< 시험예 3> 소 배반포의 세포사멸량 조사
소 체외 수정란을 각각의 배양액(전기간 라파마이신 처리/ 초기 3일 라파마이신 처리/ 후기 4일 라파마이신 처리)에서 7일 동안 배양하여 발달된 배반포를 TUNEL (Terminal uridine deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) 이라는 세포사멸탐지 염색을 통해 전체 세포수에서 세포사멸이 일어난 세포를 조사하였다. 각각의 배반포를 PBA-PBS 완충용액을 이용하여 3회 세척한 후 PVA-PBS 완충용액에 PFA가 4% 첨가된 고정액 (Paraformaldehyde)를 이용하여 1시간 동안 실온에서 보관한 후 PVA-PBS 완충용액을 이용하여 3회 세척하였다. 세척된 배반포를 PVA-PBS 완충용액에 Triton X-100 이 0.5% 첨가된 침투 용액을 이용하여 38.5℃, 5% CO2 조건에서 1시간 동안 배양하고 PVA-PBS 완충용액을 이용하여 3회 세척하였다. 다시 항체반응을 확인하기 위해 TUNEL assay kit을 이용 하는데 이때 38.5℃, 5% CO2 조건에서 1시간 동안 배양한 후 세포사멸이 일어나는 부분은 녹색으로 염색시키고 다시 PVA-PBS 완충용액을 이용하여 3회 세척하였다. 이후에 전체 세포수를 확인하고 세포에 정확하게 세포사멸이 일치하는지 확인하기 위해 핵 염색을 하는데 이때 propidium iodide (PI) 이용하여 38.5℃, 5% CO2 조건에서 1시간 동안 배양한 후 확인하였으며 이는 빨강색으로 염색된다. 이후 PVA-PBS 완충용액을 이용하여 3회 세척하고 형광현미경을 이용하여 관찰하였다. 형광 현미경에서 빨강색으로 관찰되는 부분은 세포이며 녹색으로 관찰되는 부분은 세포사멸이 일어난 부분이다. 이것을 한 장에 사진으로 겹쳐서 확인할 때 정확하게 일치하는 부분은 색의 혼합에 의해 노란색으로 보인다. 결과 사진을 도 11, 도 12 및 도 13에 나타내었다. 도 11은 전기간 라파마이신 처리시 결과 사진, 도 12는 초기 3일 라파마이신 처리시 결과 사진, 도 13은 후기 4일 라파마이신 처리시 결과 사진이다. 상기 사진으로부터 도출된 세포사멸수 및 세포사멸율을 도 14, 도 15 및 도 16에 나타내었다. 도 14은 전기간 라파마이신 처리시 결과 그래프, 도 15는 초기 3일 라파마이신 처리시 결과 그래프, 도 16은 후기 4일 라파마이신 처리시 결과 그래프이다.
하기 표 7은 소 체외 수정란을 라파마이신이 첨가된 배양액에서 7일간 배양시켜 형성된 배반포와 일반 배양액에서 배양시켜 형성된 배반포의 세포사멸 수를 조사한 결과를 나타낸다. 하기의 결과와 같이, 라파마이신을 소 수정란 배양 전기간동안 첨가하였을 때 10, 100 nM의 그룹의 세포들은 50% 정도가 세포사멸이 되는 것을 확인할수 있었고, 1 nM의 경우 대조군과 차이점을 보이지 않는 것을 확인할수 있었다.
라파마이신 처리가 체외 소 수정란 유래 배반포의 세포사멸 감소에 미치는 영향(전기간)
구분
(처리농도)		 사용된 배반포 세포사멸수 조사
세포사멸수
평균± 표준오차		 세포사멸율
평균± 표준오차
대조군 10 3.1 ± 1.6* 2.5 ± 1.3*
실험군(1 nM) 11 3.4 ± 1.4* 2.8 ± 1.6*
실험군(10 nM) 5 44.2 ± 16.1 46.9 ± 18.3
실험군(100 nM) 9 56.1 ± 23.5 52.1 ± 14.7
* P<0.05
그러나 하기 표 8에서는 체외배양 1일에서 3일간 라파마이신을 첨가하였을때 라파마이신을 처리한 실험군 (10 nM)은 세포사멸수가 1.3 ± 0.7개로, 라파마이신을 처리하지 않은 대조군 2.7 ± 1.6 에 비해 세포사멸수가 유의적으로 감소되는 것을 확인하였다. 또한 라파마이신을 초기배양시 체외배양액에 첨가하였을때 세포사멸율 또한 감소되는 것을 확인하였다.
배양초기시 라파마이신 처리가 체외 소 수정란 유래 배반포의 세포사멸 감소에 미치는 영향
구분
(처리농도)		 사용된 배반포 세포사멸수 조사
세포사멸수
평균± 표준편차		 세포사멸율
평균± 표준편차
대조군 10 2.7 ± 1.6 2.3 ± 1.4
실험군(1 nM) 10 2.0 ± 1.6 1.7 ± 1.1
실험군(10 nM) 14 1.4 ± 0.7* 1.1 ± 0.6*
실험군(100 nM) 15 1.9 ± 2.1 1.7 ± 2.3
* P<0.05
또한 표 9를 참조하면, 후기배양시 라파마이신의 1 nM 첨가는 대조군에 비해 유의적으로 세포사멸수를 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
배양후기시 라파마이신 처리가 체외 소 수정란 유래 배반포의 세포사멸 감소에 미치는 영향
구분
(처리농도)		 사용된 배반포 사멸세포수 조사
세포사멸수
평균± 표준편차		 세포사멸율
평균± 표준편차
대조군 9 3.1 ± 2.3 2.8 ± 1.7
실험군(1 nM) 13 1.4 ± 1.3* 1.8 ± 2.1
실험군(10 nM) 8 1.4 ± 1.2 1.7 ± 1.5
실험군(100 nM) 16 2.2 ± 0.8 2.1 ± 1.0
* P<0.05
이를 통해 종래 소 수정란의 문제점이었던 비정상적인 배반포에서 일어나는 세포사멸 수가 라파마이신을 수정란 배양 초기에 10 nM 처리함으로써 감소됨을 알 수 있었고, 이로 인해 배반포의 질적 개선이 이루어짐을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (8)

  1. 라파마이신을 포함하는 포유동물 수정란의 체외배양용 배지 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 라파마이신의 농도는 5 내지 50nM인 것인 배지 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 배지 조성물은 무기염류, 탄소원, 아미노산, 소 혈청 알부민 및 보조인자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 배지 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 포유동물은 소인 것인 배지 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 수정란은 체외수정란 또는 복제수정란인 것인 배지 조성물.
  6. 포유동물 수정란을 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 배지에서 배양시작 시부터 2 내지 4일간 배양하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 포유동물 수정란의 체외배양 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 포유동물은 소인 것인 인간을 제외한 포유동물 수정란의 체외배양 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 포유동물 수정란은
    인간을 제외한 포유동물로부터 난포란을 채취하는 단계;
    상기 난포란에서 미성숙 난자를 회수하는 단계;
    상기 회수된 미성숙 난자를 체외 성숙시키는 단계; 및
    성숙된 난자와 정자를 체외 수정시키는 단계를 통해 제조되는 것인 인간을 제외한 포유동물 수정란의 체외배양 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113755428A (zh) * 2020-06-02 2021-12-07 江苏省农业科学院 一种改善家畜胚胎体外发育质量的培养方法

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