KR101374190B1

KR101374190B1 - 돼지배아줄기세포 및 돼지 미성숙 난자로부터 돼지배아줄기세포를 제조하는 방법

Info

Publication number: KR101374190B1
Application number: KR1020110036195A
Authority: KR
Inventors: 차상호; 소병재; 나진주; 조은영; 정수경; 김현정; 구나연; 이희수
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2011-04-19
Filing date: 2011-04-19
Publication date: 2014-03-17
Also published as: KR20120118676A

Abstract

본 발명은 돼지배아줄기세포주, 및 단위생식(parthenogenesis)법을 이용하여 돼지 미성숙 난자로부터 배반포(blastocyst)를 생산하고, 생산된 배반포를 부화시켜 돼지배아줄기세포를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 방법으로 돼지배아줄기세포를 보다 효율적으로 제조할 수 있다.

Description

돼지배아줄기세포 및 돼지 미성숙 난자로부터 돼지배아줄기세포를 제조하는 방법{Porcine embryonic stem cell and the method for preparing porcine embryonic stem cell from porcine immature oocytes comprising thereof}

본 발명은 돼지배아줄기세포, 및 단위생식(parthenogenesis)법을 이용하여 돼지 미성숙 난자로부터 배반포(blastocyst)를 생산하고, 생산된 배반포를 부화시켜 돼지배아줄기세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.

돼지배아줄기세포는 돼지 난자에서 유래된 배반포의 내괴 세포(inner cell mass, ICM)로부터 분리된 전능(pluripotency) 분화능을 가지고 있는 세포이다. 지금까지 일반적으로 돼지배아줄기세포는 체외수정(in vitro fertilization, ITF), 체내수정(in vivo fertilization, IVF), 체세포 핵이식(somatic nuclear transfer, NT) 등을 사용하여 생산된 배반포로부터 제조되어 왔다.

이러한 체내수정 혹은 체외수정, 체세포 핵이식 기술을 이용한 배반포 유도는 이미 국내외에서 공식적으로 보고되어 있다. 그러나, 체내수정 혹은 체외수정, 체세포 핵이식 등의 기술은 배반포를 만드는 과정이 복잡하고 많은 난자가 필요한 반면, 배반포 생산효율이 낮아서 이들 방법을 이용한 최종 돼지배아줄기세포의 제조시 성공률이 상당히 떨어진다는 문제점이 있다.

또한, 제조된 배아줄기세포는 각 실험실의 배양조건(배양온도, 배지종류, 성장인자(growth factor)의 종류, 계대배양주기, 피더셀(feeder cell) 종류 등)에 따라 특성이 다르며, 줄기세포의 전능 분화능(pluripotency)에서도 크게 차이가 날 수 있어 세포의 효용성이 상이할 수 있다.

이에 본 발명자들은 보다 효율적이고 효용성이 높은 돼지 유래의 배아줄기세포를 제조하기 위해 방법을 찾고자 노력한 결과 단위생식법을 이용하여 돼지의 미성숙 난자로부터 배반포를 만들고, 부화가 안 된 배반포를 적절히 처리하여 부화시킴으로써 돼지배아줄기세포를 제조할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 보다 효율적인 방법으로 돼지 유래의 배반포를 생산하고 이로부터 돼지배아줄기세포로 배양하는데 있어서 성공률을 높일 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) 돼지의 미성숙 난자를 배양하여 난자를 성숙시키는 단계; 2) 성숙된 난자를 전기자극으로 활성화하여 단위생식시키는 단계; 3) 활성화된 난자를 배반포(blastocyst)로 배양하며 부화시키는 단계; 및 4) 부화된 배반포에서 유래된 내세포괴(Inner cell mass: ICM) 세포를 배양하여 난자 유래 배아줄기세포를 생산하는 단계를 포함하는 돼지배아줄기세포의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 돼지배아줄기세포를 제공한다.

본 발명은 돼지 유래 미성숙 난자만을 이용하여 돼지배아줄기세포를 효율적으로 생산할 수 있는 방법을 제공하며, 상기 방법으로 생산된 돼지배아줄기세포는 다른 일반적인 방법을 이용하여 얻은 배반포로부터 유래된 돼지배아줄기세포 등과 유사한 전능 분화능(pluripotency)을 가지고 있다. 따라서, 본 발명에 의한 방법을 이용함으로써 돼지배아줄기세포를 보다 효율적으로 생산할 수 있으며, 질병연구, 질병모델, 형질전환 동물(transgenic animal) 생산 및 독성평가 등 다양한 목적으로 활용할 수 있다.

도 1은 미성숙 난자를 배양하여 형성된 성숙난자를 보여주는 사진이다.
도 2는 성숙된 난자를 단위생식으로 배양하여 배반포로 유도한 것을 보여주는 사진이며, a는 부화하지 않은 배반포이고, b는 부화한 배반포이다.
도 3은 돼지배반포로부터 돼지줄기세포를 분리, 배양하기 위한 모식도이다.
도 4는 돼지배아줄기세포(pPAES-8D)의 형태 및 알칼라인 포스파타제 활성 모습을 나타낸 것이다. a는 내세포괴로부터 배양된 배아줄기세포가 둥글고 단층의 세포군을 형성하며 자란 것을 보여주고, b는 알칼라인 포스파타제 활성을 나타내는 것을 보여준다.
도 5는 제조된 돼지배아줄기세포(pPAES-8D)의 전능분화능 마커인 Nanog, SSEA4, Oct3/4가 발현되고 있음을 면역염색법으로 확인한 것을 보여준다.
도 6은 제조된 돼지배아줄기세포(pPAES-8D)의 전능분화능을 검증한 결과를 나타낸 것이다. a 및 b는 각각 배아줄기세포가 배상체 및 신경유사세포로 분화한 것을 나타낸 것이고, c는 배상체에서의 전능분화능을 확인한 것을 나타낸 것으로, 외배엽(ectoderm) 인자인 NF-H(Neurofilament-H), 중배엽(mesoderm) 인자인 BMP4(Bone morphogenetic protein4), 및 내배엽(endoderm) 인자인 a-아밀라아제의 mRNA 발현여부를 보여준다. d는 외배엽인자인 비멘틴(Vimentin), 중배엽인자인 데스민(Desmin), 내배엽인자인 시토케라틴(Cytokeratin17)의 단백질이 발현되고 있음을 보여주고 있다.

본 발명은 단위생식으로 돼지 유래 미성숙 난자를 배반포로 배양하고, 배반포의 내세포괴를 외부로 노출시킨 후, 마우스 태아 섬유소세포(mouse embryonic fibroblast, MEF)에 아무런 처리 없이 씨딩(seeding)하여 돼지배아줄기세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.

배반포 부화(hatching)는 일반적으로 시험관 체외수정(혹은 인공수정) 후 자궁 내 배반포의 착상을 위해 거치는 과정이다. 배반포의 부화시에는 배반포의 내부에 있던 내세포괴(inner cell mass, ICM)가 부화된 배반포의 표면에 존재하게 된다. 기존의 돼지줄기세포 제조 방법에서는 체세포 핵이식법, 체내 수정법 및 체외 수정법으로 난자를 배반포로 유도한 후, 배반포를 타이로드 산(Tyrode's acid(TA), pH 5.0), 프로나제(pronase) 혹은 면역절제술(immunosurgery)로 배반포의 투명대 (zona pellucida)를 제거하고 내세포괴를 분리하는 방법이 널리 이용되고 있다.

그러나 체세포 핵이식법은 난자와 정자 혹은 난자로의 핵이식을 위한 공여세포가 필요하고, 전처리 과정이 복잡하며 배반포 생성율이 매우 낮다는 문제점이 있다. 또한, 체외수정은 정자가 필요하며, 처리과정이 복잡하고 배반포 생성율이 낮다는 문제점이 있다. 반면, 단위생식법은 난자만 이용되고 과정이 상대적으로 간편하며, 배반포 생성율이 매우 높다.

또한 이들 체세포 핵이식법, 체외수정 및 체내수정법을 통해 생산되는 배아줄기세포간에는 단위생식에 의해 생산되는 배아줄기세포와 성격이 서로 다를 수 있다. 예로, 모든 배반포 활성방법에 의하여 유도되어지는 신생줄기세포의 유전자 발현양상의 변화부분에 있어서 차이가 있고, 체세포 핵이식시에는 비 탈핵 현상이 발생할 수 있어 세포변형의 문제점이 있으며, 체외수정에 의할 경우에는 유전적 변이성의 가능성이 있다. 따라서, 상기와 같은 문제점을 고려할 때 순수한 난자의 단위생식을 통한 방법인 단위생식법이 안전하며, 나아가 단위생식법을 이용한 배아줄기세포는 환자 맞춤형 줄기세포로의 활용이 가능하다는 장점이 있다.

본 발명에서는 돼지 유래 미성숙 난자로부터 단위생식법을 사용하여 배반포를 생산하고, 생산된 배반포를 부화하여 돼지배아줄기세포를 제조하는 방법을 제공하며, 구체적으로는 하기의 단계를 포함한다.

1) 돼지의 미성숙 난자를 배양하여 난자를 성숙시키는 단계;

2) 성숙된 난자를 전기자극으로 활성화하여 단위생식시키는 단계;

3) 활성화된 난자를 배반포(blastocyst)로 배양하며 부화시키는 단계; 및

4) 부화된 배반포에서 유래된 내세포괴(Inner cell mass: ICM) 세포를 배양하여 난자 유래 배아줄기세포를 제조하는 단계.

본 발명에서 사용하는 돼지의 미성숙 난자의 배양 및 성숙시키는 과정은 당업계에서 일반적으로 사용하는 방법으로 이루어진다.

본 발명에서 사용되는 성숙된 난자는 제1차 혹은 제2차 성숙 난자이며, 상기 성숙된 난자는 단위생식시키기 위하여 전기자극으로 활성화시킨다. 난자를 활성화시킴으로써 난자의 극체를 내부로 삽입시켜 난자의 분열을 유도하여, 배반포로 발전하게 된다.

배반포를 생산한 후, 배반포 유도 배지에 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)을 첨가하여 배반포를 부화시켜 내세포괴를 외부로 노출시킨 후, 피더셀인 마우스 태아섬유소 세포에 씨딩하여 피더셀의 표면에 내세포괴를 부착시킨다. 그 후, 피더셀에 부착한 내세포괴 세포를 배양하여 배아줄기세포를 제조할 수 있다. 이 때, 내세포괴 세포는 성장을 촉진시키기 위하여 LIF(Leukemia inhibitory factor), bFGF(basic fibroblast growth factor) 및 SCF(stem cell factor) 중 1종 이상의 성장인자를 포함하는 배지에서 배양하는 것이 바람직하다.

이 때, 본 발명에 따라 배지에 우태아 혈청을 첨가하여 부화시켜 내세포괴를 노출시킨 경우가 종래의 방법인 미부화 배반포를 타이로드 산(Tyrode's acid(TA), pH 5.0) 또는 프로나제(pronase)의 처리로 내세포괴를 노출시킨 경우보다 내세포괴의 피더셀로의 부착(attachment) 비율 및 배아줄기세포로의 배양 비율이 훨씬 높다.

본 발명으로 제조된 배아줄기세포는 특히, pPAES-17, pPAES-10G 또는 pPAES-8D의 돼지배아줄기세포주의 것임을 특징으로 하며, 세포형태(morphology)가 단층의 구형(monolayered-round shape)의 세포군(colony)을 형성하며 자라고, 50회 이상 계대 배양동안 미분화 상태를 유지하며, 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase, ALP) 활성(activity)이 있고, 전능분화능 마커(pluripotent marker)인 Oct-3/4, Sox-2, Nanog, Rex-1, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4 및 TRA-1 등을 발현하고, 배상체(embryoid body, EB)를 형성하여 내배엽, 중배엽, 외배엽 등으로 분화가 가능한 전능 분화능을 가지고 있어, 지금까지 기존의 방법으로 제조된 돼지배아줄기세포와 매우 유사한 것으로 증명되었다.

따라서, 본 발명으로 제조되는 배아줄기세포는 기존의 방법으로 제조된 배아줄기세포와 동일하게 면역세포화학(immunocytochemistry), 키메라 형성(chimera formation), 핵형분석(karyotyping) 등에 이용되어 질병연구, 질병모델, 형질전환 동물(transgenic animal) 생산 및 독성평가 등 다양한 목적으로 활용될 수 있을 것이다.

이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위하여 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니고, 당업계에 통상적으로 주지된 변형이 가해질 수 있으며, 이에 대한 것도 본 발명의 범위에 포함된다.

[실시예 1] 난자추출, 배반포의 생산 및 부화

교잡(cross-bred) 암퇘지의 난소를 적출하고 이로부터 난자를 추출한 후, 최상질의 난구-난자 복합체(cumulus-oocyte complexes, COCs)만을 골라 TLH-PVA(0.1% (w/v) 폴리비닐 알코올(PVA; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)을 포함하는 헤페스 버퍼 타이로드(Hepes buffered Tyrode's) 배지) 및 AM199(난포액과 시스테인을 포함하는 M199 배지)에서 세척하였다. 그 후, AM199 배지에서 상기 난구-난자 복합체를 여포자극 호르몬(follicle stimulating hormone, FSH)으로 처리하고 39℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 22시간 동안 배양하여 난자를 성숙시켰다. 그리고, 호르몬이 없는 AM199 배지에서 22시간 동안 2차 배양을 하였다. 그 후, 난자를 모아서 히알루로니다아제(hyaluronidase, HA)를 이용하여 난자표면의 난구 세포(cumulus cell)를 제거하고(denuding), 극체(polar body)를 가지고 있는 1차 혹은 2차 성숙 난자(도 1)를 골라 내었다. 골라낸 성숙한 난자를 TLH(헤페스 버퍼 타이로드(Hepes buffered Tyrode's)) Ca+ BSA(bovine serum albumin) 배지에서 씻은 후 돼지 접합체 배지(porcine zygote medium, PZM)내에서 전기충격(electronic activation)을 30μs 동안 2.2kV/cm의 세기로 가하여 난자의 분열을 유도하였다. 그 후, PZM 배지에서 7~9일간 배양하여 난자가 배반포(도 2a)를 형성하게 하였고, 배반포를 부화시키기 위해서 PZM 배지에 우태아 혈청을 첨가하였다. 그 후, 5~6일간 배양하여 난자가 부화된 배반포(도 2b)를 형성하게 하였다.

부화가 안 된 배반포는 타이로드 산(TA) 또는 프로나제를 처리하여 내세포괴를 분리하여 배아줄기세포를 제조하였으나, 부화된 배반포는 아무런 처리 없이 바로 배아줄기세포 제조에 이용하였다.

[실시예 2] 내세포괴의 분리 및 배아줄기세포의 배양

내세포괴의 분리 및 이를 이용한 배아줄기세포 제조에 관련한 전체적인 과정을 도 3에 나타내었다. 피더셀로 사용되는 마우스 태아 섬유소세포는 임신연령 13.5일의 마우스로부터 태아를 분리하고, 태아의 몸통을 잘게 조각 낸 후, 트립신처리하여 배양하였다. 이렇게 배양된 초대배양(Passage 0) 세포는 액체질소에 보관하면서 1번째 계대배양(Passage 1)부터 3번째 계대(passage 3)까지만 줄기세포 제조에 사용하였다. 줄기세포 제조 혹은 줄기세포의 계대배양에 사용하기 위해서는, 마우스 태아 섬유소 세포를 내세포괴 분리 혹은 줄기세포 씨딩 하루 전에 배양하고 미토마이신을 4시간 동안 처리하여 세포가 더 이상의 분열되지 않도록 하였다.

배아줄기세포 제조 효율에 있어 부화된 배반포와 부화되지 않은 배반포를 비교하기 위해, 부화가 안 된 배반포는 TA와 프로나아제를 3~6분간 처리함으로써 투명대를 제거하여 내세포괴를 분리하고, 부화된 배반포는 본 발명에서 기술한대로 준비하여 상기에서 만들어진 피더셀에 씨딩하였다. 씨딩 후 내세포괴는 LIF, bFGF 및 SCF가 모두 포함된 ES(embryonic stem cell) 배지에서 배양하였으며, 배양 7~14일 후에 전형적인 돼지배아줄기세포 형태의 콜로니로 자라났다. 제조된 돼지배아줄기세포는 매일 배지를 갈아주며 4~5일 간격으로 신선하게 준비된 피더셀에서 계대배양을 해 주었으며, 이와 같은 과정으로 돼지배아줄기세포주 pPAES-8D를 얻었다.

시험결과, 부화된 배반포 유래의 내세포괴가 마우스 태아 섬유소세포에 붙어 자라는 비율이 부화되지 않은 배반포 유래의 내세포괴보다 상당히 높게 나타났다. 또한 부화된 배반포 유래의 내세포괴는 줄기세포로 배양이 된 비율이 7.4%에 달한 반면, 부화되지 않은 배반포 유래의 내세포괴는 줄기세포로 배양이 되지 않았다. 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다.

	배반포수	피더셀 부착수 (%)	줄기세포로의 배양수 (%)
부화 (hatching)	350	189 (54)	26 (7.4)
미부화 (non-hatching)	406	90 (22)	0 (0.0)

[실시예 3] 제조된 돼지배아줄기세포의 특성분석

본 발명에서 제조된 돼지배아줄기세포(pPAES-8D)의 특성을 기존의 방법으로 유도된 배반포를 이용하여 제조된 돼지배아줄기세포와 비교, 분석하기 위해, 기존의 방법으로 유도된 배반포로 제조된 돼지배아줄기세포가 보여준 형태, 알칼라인 포스파타제 활성, 전능분화능 마커 발현여부에 대한 시험을 본 발명에 따라 제조된 돼지배아줄기세포로 수행하였다. 도 4a에서 보는 바와 같이, 부화된 배반포에서 제조된 줄기세포를 역상현미경(phase contrast image)에서 관찰한 결과, 배양된 줄기세포는 콜로니 형태가 둥근 모양으로 단층을 형성하고 있음을 알 수 있었다.

이들 세포의 알칼라인 포스파타제 활성을 보기위해 세포들을 4% 포름알데히드로 상온에서 30분간 고정하고 PBS(phosphate buffered saline)로 두 번 세척하였다. 다음 염색용액(BCIP/NBT 알칼라인 포스파타제 기질(Alkaline phosphatase substrate))을 고정된 세포와 1시간 동안 반응시켜 염색여부를 판명하였다. 실험결과 이들 세포는 줄기세포의 특징인 알칼라인 포스파타제 활성(도 4b)을 보였다.

덧붙여 줄기세포의 전능분화능 마커(Oct-3/4, SSEA1/4, Nanog)의 발현을 보기위해 면역형광염색법을 수행하였다. 우선 돼지배아줄기세포(pPAES-8D)를 4% 포름알데히드로 상온에서 30분간 고정한 후, 0.4% Triton X-100으로 1시간 동안 상온에서 침투(permeabilization)를 시키고 5% BSA를 포함한 PBS로 1시간 동안 상온에서 차단하였다. 이후 전능분화능 마커(Oct-4, SSEA1/4, Nanog)에 대한 항체를 5% BSA를 포함하는 PBS에 1:100의 비율로 희석한 후, 돼지배아줄기세포를 4℃에서 15시간 처리하고, 형광물질이 함유된 이차항체를 상온에서 1시간 반응시켜 형광현미경으로 관찰하였다. 실험결과 돼지배아줄기세포는 전능분화능 마커를 발현(도 5)하는 것으로 나타나, 기존의 방법으로 유도된 배반포를 이용하여 제조된 돼지배아줄기세포와 매우 유사한 것으로 판명되었다.

[실시예 4] 제조된 돼지배아줄기세포의 전능 분화능 조사

배상체 형성을 위하여, 피더셀로부터 분리해 낸 돼지배아줄기세포(pPAES-8D)를 37℃, 20% O₂, 5% CO₂ 조건에서 5 분간 아큐타아제(accutase)를 사용하여 단일세포로 분리하였다. 각각의 단일세포는 40㎕의 분화용 배지(0.1mM b-메르캅토에탄올, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1% 비필수 아미노산, 20% 제한된(defined) FBS를 포함하는 DMEM/F10 배지)에 3000개의 세포가 분주되도록 희석하여 35mm 페트리디쉬의 안쪽 뚜껑에 약 10개의 방울로 분주하고 조심스럽게 페트리디쉬 위로 뚜껑을 덮어 37℃, 20% O₂, 5% CO₂ 조건에서 2일간 배양시켰다. 이러한 방법으로 2일간 배양 후 단일세포였던 배아줄기세포는 40㎕ 분화를 위한 배양배지(0.1mM b-메르캅토에탄올, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1% 비필수 아미노산, 20% 제한된(defined) FBS를 포함하는 DMEM/F10 배지) 안에서 배상체를 형성하였다(도 6a). 형성된 배상체의 일부는 조직배양용디쉬로 옮겨져 분화배지(0.1mM b-메르캅토에탄올, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1% 비필수 아미노산, 20% 제한된(defined) FBS를 포함하는 DMEM/F10 배지) 안에서 5일간 배양한 결과 근육세포 또는 신경세포의 세포형태와 유사한 모습을 나타내는 세포형태학적 변이를 보이는 것을 관찰 할 수 있었고(도 6b), 별도로 수집한 배상체에 대하여, 4ml의 분화배지(0.1mM b-메르캅토에탄올, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1% 비필수 아미노산, 20% 제한된(defined) FBS를 포함하는 DMEM/F10 배지)가 첨가된 페트리디쉬에서 6일간 분화를 더 진행시킨 다음, 외배엽(Ectoderm) 인자인 NF-H(Neurofilament-H), 중배엽(Mesoderm) 인자인 BMP4(Bone morphogenetic protein4)와 내배엽(Endoderm) 인자인 a-아밀라아제(amylase)의 mRNA 발현여부를 확인한 결과, 배상체 형성이 유도된 세포에 대하여 이들 삼배엽 마커가 모두 발현이 유도 되었다(도 6c). 또한, 외배엽인자인 비멘틴(Vimentin), 중배엽인자인 데스민(Desmin), 내배엽인자인 시토케라틴(Cytokeratin17)에 대한 단백질의 발현여부를 확인한 결과 배상체 형성이 유도된 세포에 대하여 이들 삼배엽 마커가 모두 발현이 유도 되었다(도 6d).

Claims

1) 돼지의 미성숙 난자를 배양하여 난자를 성숙시키는 단계;
2) 성숙된 난자를 전기자극으로 활성화하여 단위생식시키는 단계;
3) 활성화된 난자를 배반포(blastocyst)로 배양하며 부화시키는 단계;
4) 부화된 배반포에서 유래된 내세포괴(Inner cell mass: ICM) 세포를 피더셀인 마우스 태아섬유소 세포에 이식하여 SCF(Stem cell factor)가 포함된 배지에서 배양하는 단계;
5) 배양 후 자라난 내세포괴 유래 세포를 다시 피더셀에 이식하여 배양하는 단계; 및
6) 계대 배양을 거듭하여 돼지 난자 유래의 돼지배아줄기세포를 생산하는 단계;
를 포함하는 돼지배아줄기세포의 제조 방법.

제1항에 있어서, 상기 2) 단계의 제 1차 또는 제 2차 난자인 것을 특징으로 하는 돼지배아줄기세포의 제조 방법.

제1항에 있어서, 상기 3) 단계의 배반포 배양은 우태아 혈청(FBS)이 포함된 배지에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 돼지배아줄기세포의 제조 방법.

제1항에 있어서, 상기 4) 단계의 내세포괴 배양은 LIF(Leukemia inhibitory factor) 및 bFGF(basic fibroblast growth factor) 중 1종 이상을 더 포함하는 배지에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 돼지배아줄기세포의 제조 방법.

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