KR20060105041A

KR20060105041A - 배아 줄기 세포주 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20060105041A
Application number: KR1020067013149A
Authority: KR
Inventors: 노성일; 황우석; 이병천; 강성근; 류영준; 이유진; 김순웅; 권대기; 권희선; 구자민; 박을순; 황윤영; 문신용; 오선경; 안규리; 윤현수; 박종혁; 김선종; 최양규
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2003-12-30
Filing date: 2004-12-30
Publication date: 2006-10-09
Also published as: US8647872B2; DE602004025623D1; US20140154800A1; US20120083032A1; EP1711599A1; BRPI0418310A; US20110065192A1; ATE458038T1; RU2006127446A; EP1711599A4; AU2004309300A1; AU2004309300B8; JP2007516720A; US9476064B2; KR20160139045A; WO2005063972A1; EP1711599B1; CN1922307A; CA2551266C; AU2004309300B2

Abstract

인간의 체세포 핵을 탈핵된 인간 난자에 이식함으로써 제조된 핵이식란으로부터 유래된 배아 줄기 세포주는 다양한 원하는 세포 유형으로 분화될 수 있다.

배아 줄기 세포, 신경 전구세포, 핵이식란, 리프로그래밍, 활성화, 생체외 배양, 순차 배양, G1.2 배지, SNUnt-2 배지

Description

배아 줄기 세포주 및 이의 제조방법{EMBRYONIC STEM CELL LINE AND METHOD FOR PREPARING THE SAME}

본 발명은 배아 줄기 세포주 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인간의 체세포 핵을 탈핵된 인간 난자에 이식하여 형성된 핵이식란을 배반포까지 배양하고, 상기 배반포로부터 분리한 내세포괴를 배양하여 수득한 배아 줄기 세포주 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

일반적으로, 줄기 세포(stem cell)는 인체를 구성하는 모든 종류의 성숙한 기능성 세포로 분화할 수 있는 미분화 세포를 말한다.　 예를 들면, 조혈모세포(hematopoietic stem cell)는 최종적으로 여러 타입의 혈구 세포들 중 어느 하나로 분화할 수 있다.　 배아 줄기(embryonic stem, ES) 세포는 배아로부터 유래된 다능성(pluripotent) 세포이므로 인체를 구성하는 모든 종류의 기관, 조직, 세포로 분화, 발달할 수 있는 능력을 가지고 있다.

1981년에 행해진 마우스 ES 세포주의 수립은 사람 ES 세포의 발달을 위한 상당한 기술 및 범례(paradigm)를 제공하였다.　 ES 세포의 발달은 마우스의 기형암종(teratocarcinoma, 일부 동종번식된 계통(strain)의 생식선에서 발생하는 종양)에 대한 연구로부터 전개되었다(Evans and Kaufman et al., Nature, 292:154-156, 1981).

봉소 등은 생체 외에서 수정된 사람 배아로부터 나온 세포의 단기간 배양 및 유지 방법에 대하여 보고하였다(Bongso et al., Human Reproduction, 9:2110-2117, 1994). 봉소 등에 의해서 분리된 세포들은 다능성 줄기 세포에서 예상되는 형태(morphology)를 가지고 있었지만, 이러한 초기 연구는 적절한 영양 세포층(feeder cell layer)을 이용하지 못했기 때문에 장기간 배양하는 것은 불가능하였다.

붉은 털 원숭이(rhesus monkey) 또는 비단 원숭이(marmoset monkey)의 배반포로부터 영장류의 ES 세포 제조가 보고되었다.　 이러한 영장류의 ES 세포는 이배체(diploid)이지만, 이들의 가장 가까운 상대자인 사람의 ES 세포와 매우 유사하였다.　 원숭이 및 사람의 ES 세포에 대한 연구로부터 이들의 ES 세포는 마우스 ES 세포와 표현형에서 다소 상이하지만, 다능성 줄기 세포가 사람의 배반포로부터 유래될 수 있다는 것을 시사하였다(Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92:7844-7848, 1995).

1998년 톰슨 등에 의해서 개발된 다능성 인간 줄기 세포주의 특성은 다음과 같다(Thomson et al., Science, 282:1145-1147 (1998)):

(1) SSEA-3 (stage-specific embryonic antigen-3), SSEA-4 (stage-specific embryonic antigen-4), TRA 1-60 (tumor rejection antigen 1-60), TRA-1-81 (tumor rejection antigen 1-81) 및 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)를 발현함;

(2) 높은 텔로머라제 활성;

(3) 마우스에 주입시 3 배엽 세포들로 분화함;

(4) 영양 세포에 의존함;

(5) 인간의 백혈병 억제 인자(hLIF)에 반응하지 않음.

톰슨 등은 불임 치료 중인 커플로부터 기증받은 잉여 배반포로부터 ES 세포를 수득하였다. 구체적으로, ES 세포 확립을 억제하는 것으로 예상되었던 영양외배엽(trophectoderm)을 면역수술(immunosurgery)적 방법으로 제거하였고, 내세포괴(inner cell mass; ICM)를 마우스의 배아에서 유래된 섬유아 영양 세포층에 플레이팅(plating)하고, 짧은 부착 및 확장 기간 후, 또 다른 영양 세포 층상에 다시 플레이팅하였다.　 마우스 ES 세포 프로토콜과는 배지 또는 배양 시스템에서 커다란 차이는 없었지만 상대적으로 높은 성공률이 달성되었다.

인간에서의 다능성 ES 세포의 분리 및 포유동물에서의 체세포 핵전달 기술의 발전 (Solter, Nat. Rev. Genet., 1, 199-207, 2000)은 인간에서도 체세포 핵전달을 이용하여 조직 복구 및 이식용 의약 연구에 응용될 수 있는 미분화 세포의 무한 원천을 제공할 수 있다는 가능성을 증가시켰다. 이러한 "치료적 복제"의 개념은 체세포의 핵을 탈핵된 난자에 전달하는 것을 의미한다 (Lanza et al., Nat Med., 5, 975-977, 1999). 소에서의 ES-유사 세포 생산 (Cibelli et al., Nat. Biotechnol., 16: 642-646, 1998) 및 복제된 배반포의 내세포괴로부터 마우스 ES 세포의 생산 (Munsie et al., Curr. Biol., 10:989-992, 2000; Wakayama et al., Science, 292: 740-743, 2001), 그리고 복제된 인간 배아를 8 내지 10 세포기까지 발달 (Cibelli et al., J. Regen. Med., 2:25-31, 2001)시킨 것에 대한 이전의 보고들은 세포 치료적 복제의 가능성을 제공하였다.

비록 인간이 아닌 포유류의 난자를 이용하여 ES 세포주가 제조될 수 있다는 것이 다수의 논문에 기재되어 있지만, 아직까지 핵이식 기술분야에서 인간 난자로부터 ES 세포주를 제조하였다는 보고는 없다.

하지만, 본 발명자들은 예의 연구한 결과, 특정하게 선택된 조건 하에서 핵이식된 인간 난자를 성공적으로 배양할 수 있고, 이로부터 배아 줄기 세포주를 확립할 수 있다는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 인간의 체세포 핵을 탈핵된 인간 난자에 이식하여 형성된 핵이식란으로부터 유래된 배아 줄기 세포주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은,

(1) 인간의 체세포를 배양하여 공여핵 세포를 준비하는 단계;

(2) 인간 난자를 탈핵하여 수핵 난자를 준비하는 단계;

(3) 상기 공여핵 세포의 핵을 상기 수핵 난자에 이식하고, 상기 공여핵 세포의 핵과 상기 수핵 난자를 융합시킴으로써 핵이식란을 제조하는 단계;

(4) 상기 핵이식란을 리프로그래밍, 활성화 및 생체외 배양시켜 배반포를 형성하는 단계 및

(5) 상기 배반포로부터 내세포괴를 분리하고, 상기 내세포괴를 미분화상태로 배양하여 배아 줄기 세포주를 확립하는 단계를 포함하는, 배아 줄기 세포주의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따라 제조된 핵이식란의 생체외 배양에 적합한 배지를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 인간의 체세포 핵을 탈핵된 인간 난자에 이식하여 형성된 핵이식란으로부터 유래된 배아 줄기 세포주에서 분화된 신경 세포 또는 신경 전구세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은,

(1) 배아 줄기 세포주를 배양하여 배아체를(embryoid body)를 형성하는 단계;

(2) 상기 배아체를 상기 배아체의 세포를 신경 전구세포로 분화시키기에 적합한 제제의 존재하에 배양하는 단계; 및

(3) 신경 전구세포의 마커를 발현하는 세포를 선별 및 배양하여 신경 전구세포를 얻는 단계를 포함하는,

인간의 체세포 핵을 탈핵된 인간 난자에 이식하여 형성된 핵이식란으로부터 유래된 배아 줄기 세포주에서 분화된 신경 세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 상기 및 다른 목적과 특징은 첨부된 도면과 함께 하기 본 발명의 설명으로부터 명확해질 것이다:

도 1은 본 발명에 따른 핵이식란으로부터 유래한 ES 세포의 미분화 콜로니의 사진이다(A;x100, B;x200);

도 2는 본 발명에 따라 수득된 미분화 콜로니에 ITSF(즉, 인슐린, 트랜스페린, 소듐 셀레나이트 및 피브로넥틴)를 첨가하여 분화된 신경 전구세포의 형광염색 사진이다(x400);

도 3은 고정용 피펫(1)과 절개용 피펫(2)으로 난자(3)의 투명대를 절개하는 과정을 나타낸 사진이다;

도 4는 고정용 피펫(1)과 절개용 피펫(2)으로 난자(3)의 제 1극체와 핵을 제거하는 과정을 나타낸 사진이다;

도 5는 고정용 피펫(1)과 이식용 피펫(4)으로 탈핵된 수핵 난자(3)에 체세포를 이식하는 과정을 나타낸 사진이다;

도 6A 내지 6D는 본 발명에 따라 제조된 핵이식란으로부터 유래된 배아 줄기 세포주의 핵형과 상기 배아 줄기 세포주를 확립하기 위해 사용된 핵을 제공한 여성 환자의 체세포의 핵형을 분석한 결과를 나타낸 사진이다;

도 7은 본 발명에 따른 미분화 세포 콜로니를 면역이 결핍된 마우스의 고환에 주입한 후 형성된 테라토마 내에서 확인된 3배엽 세포 사진이다(A: 연골, B: 장관, C: 신경관 (A,B,C;x200)); 및

도 8은 본 발명에 따른 배아 줄기 세포주로부터 배아체의 형성 여부를 확인 한 결과를 나타낸 사진이다(A,B,C: 내배엽; D,E,F: 중배엽; G,H,I: 외배엽; A) 알파-1-페토단백질; B) 사이토케라틴; C) HNF-2-알파 ; D) BMP-4; E) 미오 D; F) 데스민(Desmin); G) 뉴로필라멘트(Neurofilament); H) S-100; I) NCAM).

발명의 상세한 설명

본원 명세서에서 사용된 용어 "핵 이식"은 체세포 (또는 "공여핵 세포"로 표기함)의 핵을 탈핵된 난자 (또는 "수핵 난자"로 표기함)에 이식하는 과정을 의미하며, 이러한 과정에 의해서 수득된 세포를 "핵이식란"이라고 한다. 본 명세서에 사용된 용어 "체세포"는 단일의 염색체(n)를 갖는 생식세포를 제외하고 2배체(diploid)의 염색체(2n)를 갖는, 인체를 구성하는 모든 세포를 의미한다.

본원 명세서에서 사용된 용어 "자가 핵이식란"이란, 체세포의 핵을 탈핵된 난자에 이식하여 수득한 핵이식란으로서, 상기 핵이식란으로부터 유래된 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 특정 세포 또는 조직을 받을 것으로 예상되는 환자로부터 분리된 체세포의 핵을 탈핵된 난자에 이식하여 수득한 핵이식란을 의미한다.

자가 핵이식란으로부터 유래된 특정 세포 또는 조직을 받는 환자는 그러한 세포 또는 조직이 환자 자신의 유전자형을 가지기 때문에 면역거부반응을 나타내지 않을 것으로 예상된다.

본원 명세서에서 사용된 용어 "배아 줄기 세포(ES cell)"는 배 아(embryo)로부터 유래되어 다양한 세포 타입으로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있는 미분화 세포를 말한다.　 일반적으로 "배아"는 수정 후 약 8주 까지의 수정란 또는 그에 대응되는 발생 단계에 있는 핵이식란을 말한다.　 배아는 수정란의 반복적인 분할(division)에 의해 발생하며, 일반적으로 내세포괴(inner cell mass, ICM) 및 외부 영양막 세포(outer trophectoderm)를 함유하는 배반포(blastocyst) 단계를 포함한다.

따라서 본원 명세서에 사용된 용어 "자가 핵이식란으로부터 유래한 배아 줄기 세포주 또는 자가 핵이식된 배아 줄기 세포주"는 자가 핵이식란으로부터 분리된 내세포괴에서 유래된 줄기 세포주를 의미한다.

본원 명세서에서 사용된 용어 "신경 전구세포(neuro progenitors)"는 뉴런과 성상교세포(astrocytes), 희돌기교세포(oligodendrocytes), 슈완세포(schwann cells), 위선세포(satellite cells), 상의세포(ependymal cells) 및 마이크로글리아의 글리아 등의 신경세포로 분화되는 세포를 말한다.

본 발명은

(2) 인간 난자를 탈핵하여 수핵 난자를 준비하는 단계;

(5) 상기 배반포로부터 내세포괴를 분리하고, 상기 내세포괴를 미분화상태로 배양하여 배아 줄기 세포주를 확립하는 단계를 포함하는, 배아 줄기 세포주의 제조방법을 제공한다.

이하에서는, 본 발명에 따른 배아 줄기 세포주의 제조방법을 구체적으로 기술한다.

제1 단계 : 공여핵 세포의 준비

본 발명에서는 인간의 체세포를 배양하여 공여핵 세포로 준비한다. 여성 또는 남성의 체세포가 모두 공여핵 세포로 이용될 수 있으며, 이들 체세포는 탈핵된 인간 난자에 핵을 공여하게 된다.

인간으로부터 얻을 수 있는 체세포라면 모두 공여핵 세포로 이용될 수 있다. 또한, 상업적 목적으로 인간 세포를 저장하는 기관으로부터 얻어진 체세포를 이용할 수도 있다. 예를 들어, 인간의 피부 세포, 신경세포, 난관상피세포 또는 난구 세포 등이 공여핵 세포로 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 자가 핵이식란을 제조하는 경우에, 체세포는 상기 핵이식란으로부터 유래된 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 특정 세포 또는 조직을 이식받을 환자로부터 분리된 것을 이용하는 것이 바람직하다.

이들 공여핵 세포는 예를 들면, 마더(Mather) 및 바네스(Barnes) 방법(참조 : Mather & Barnes eds., Methods in Cell Biology, Vol.57, Animal Cell Culture Methods, Academic Press, 1998)을 응용하여 배양함으로써 세포주로 작제할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 배양의 한 양태는 수득한 체세포에 자궁관류액 및 P/S 항생제(페니실린 10,000IU, 스트렙토마이신 10mg)가 함유된 인산염 완충 식염수(PBS)를 첨가하고, 원심 분리하여 세척한 다음, 인간 혈청(HS, human serum), 비필수 아미노산(NEAA, non-essential amino acid) 및 P/S 항생제가 첨가된 DMEM (Dulbeccoo's modified Eagle medium)에서 39℃에서 5%, CO₂의 조건으로 배양하는 것이다.

특히, 난구 세포를 공여핵 세포로 이용하는 경우, 난구-난모세포 복합체(cumulus-oocyte complex)를 하이알루로니다제로 처리하여 난자를 둘러싸고 있는 난구 세포층을 분리하고, 난구 세포층에 트립신-EDTA 용액을 첨가하여 39℃, 5% CO₂의 포화습도 배양기 내에 정치시킨 후, 원심 세정하고 상기 조건에서 배양하여 공여핵 세포로 이용한다.

제2 단계 : 수핵 난자의 준비

본 발명에서 수핵 난자라 함은 자신(즉, 난자)의 핵을 결여하고, 외부로부터 체세포의 핵을 수여받는 난자를 말한다.

본 발명에서는 당업계에 공지된 방법(Yuzpe et al., J. Reprod. Med., 34:937-42, 1989)에 따라 사람의 난소에서 과배란 난자를 채취하거나 상업적 목적으로 인간 난자를 저장하는 기관으로부터 난자를 입수한 후 배양하여 성숙한 난자를 준비할 수 있다. 예를 들어, 5% 인간혈청알부민(HSA)이 첨가된 G1.2 배지 (Vitrolife, Goteborg, Sweden)에서 5% CO₂의 조건 하에 약 4 시간 동안 배양함으로써 난자를 성숙시킬 수 있다.

다음으로, 상기 성숙한 난자로부터 그를 둘러싸고 있는 난구 세포(cumulus cell)를 제거한 다음, 난자의 투명대의 일부를 제거하고 제 1 극체를 포함한 세포질을 제거하여 탈핵된 수핵 난자를 작제할 수 있다.

본 발명에서는 한 양태로서 다음과 같이 탈핵이 수행될 수 있다. 성숙한 난자를 하이알루로니다제가 용해된 세정용 배양액에 넣고, 난구 세포를 물리적으로 제거한 후, 상기 G1.2 배지로 세정한다.　 그 다음, 난구 세포가 제거된 난자의 투명대를 절개하여 절개창을 형성시킨 후, 이를 통하여 난자의 전체 세포질의 10 내지 15%에 해당하는 양의 제 1 극체를 포함한 세포질을 제거하여 탈핵시킨다.　 이어, 탈핵된 난자를 상기 G1.2 배지로 세정하고, 상기 G1.2 배지에 정치시킨다.

탈핵 후, 예를 들면 UV 검출기를 이용하여 Hoechst 33342(Sigma Co., St. Louis, MO, U.S.A.)로 염색된 세포질체를 관찰함으로써 탈핵 여부를 재확인하는 것이 바람직하다.

제3 단계 : 핵이식란의 제조 및 전기 융합

상기 제1 단계에서와 같이 준비된 공여핵 세포를 제2 단계에서 준비된 탈핵된 수핵 난자에 이식하고, 곧 이어 전기융합시켜 핵이식란을 작제한다.

체세포 핵을 수핵 난자로 이식하기 위하여, 체세포의 핵만을 수핵 난자로 이식할 수도 있고, 체세포 전체를 수핵 난자로 이식할 수도 있다.

본 발명에서 핵 이식 및 전기 융합은 다음의 양태로 수행될 수 있다.

먼저, 상기 제 2단계에서 수득한 G1.2 배지에 정치된 탈핵된 난자를 G1.2 배지로 세정하고, 이식용 피펫을 사용하여 공여핵 세포를 PHA-P (phytohemagglutin-P)용액에 있는 탈핵 난자의 투명대에 형성된 절개창으로 주입시켜서 핵이식란을 작제한다.　 이어, 그 결과된 핵이식란을 G1.2 배지로 세정하고 그 배지에 정치시킨다.

이어서, 상기 정치된 핵이식란을 세포 조작기를 이용하여 전기 융합시킨다.　 핵이식란이 있는 G1.2 배지에 만니톨 용액을 첨가한 후, 핵이식란을 함유하는 만니톨 용액을 세포 조작기에 연결시킨 2개 전극 사이에 넣은 다음, 체세포(공여핵 세포)가 (+)전극을 향하도록 핵이식란을 위치시킨다. 그런 다음, 전압은 0.75 내지 2.00kV/cm, 시간은 10 내지 15㎲, 횟수는 약 1초 간격으로 1 내지 5회의 조건으로 직류전류를 통전하여 핵이식란을 전기 융합시킨다.

마지막으로, 융합된 핵이식란을 만니톨 용액과 G1.2 배지로 세정한다.　 이때 사용하는 만니톨 용액은 HEPES 완충용액에 BSA (소 혈청 알부민) 및 만니톨이 용해 된 pH 7.2 내지 7.4의 용액이다.

제4 단계 : 핵이식란의 리프로그래밍, 활성화 및 생체 외 배양

상기 제3 단계에서 제조된 핵이식란이 정자와 난자가 합쳐져서 형성된 통상적인 수정란과 같은 발달 과정을 거치도록 하기 위해서는 리프로그래밍 시간, 활성화 방법 및 체외 배양 배지와 같은 몇몇 중요한 요소를 적합하게 설정해야 한다.

본 발명에서는 체세포의 핵이 이식된 상기 핵이식란을 활성화시키고 배양함으로써 정상적인 수정 및 발달 과정과 유사한 환경을 제공한다. 즉, 상기 제3 단계에서 전기 융합시킨 핵이식란을 리프로그래밍 시간을 거친 다음 활성화시키고 배반포 단계까지 생체 외 배양한다.

리프로그래밍 시간은 수핵 난자와 공여핵 세포를 전기 융합시킨 후 활성화시키기 전까지 핵이식란을 정치해 놓는 시간을 말하는 것으로, 핵이식란의 발달 능력(특히, 배반포 형성률)에 영향을 미칠 수 있다.　 상기 리프로그래밍 시간은 체세포의 유전자 발현 패턴을 핵이식란의 발달에 적합하고 필요한 패턴으로 되돌리는데 필요하다. 이러한 시간은 크로마틴 리모델링 (chromatin remodeling)에 중요한 역할을 하며, 생체내(in vivo) 와 생체외(in vitro) 에서 핵이식란의 발달 능력을 결정하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 리프로그래밍 시간은 20시간 이하, 바람직하게는 6 시간 이하, 보다 바람직하게는 3 시간 이하, 가장 바람직하게는 약 2시간이다.

상기의 리프로그래밍 시간이 경과한 후 핵이식란을 활성화시키는데, 본 발명에서 이용 가능한 활성화 방법은 칼슘 이온 운반체(calcium ionophore), 이오노마이신(ionomycin), 에탄올, 타이로드 용액(Tyrode's solution, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, U.S.A.) 및 퓨로마이신(puromycin)과 같은 화학물질(chemical)에 의한 화학적 자극 또는 물리적인 자극 등을 포함한다.　 본 발명에서는 리프로그래밍 시간이 경과된 핵이식란에 칼슘 이온 운반체를 처리하는 활성화 방법이 적합하며, 칼슘 이온 운반체를 처리한 다음 6-디메틸아미노퓨린(6-DMAP)을 처리하는 활성화 방법이 바람직하다. 여기서, 상기 칼슘 이온 운반체의 농도는 5 μM 내지 15 μM인 것이 바람직하고, 약 10 μM인 것이 보다 바람직하다. 또한, 6-DMAP의 농도는 1.5 mM 내지 2.5 mM인 것이 바람직하며, 약 2.0 mM인 것이 보다 바람직하다. 상기 칼슘 이온 운반체 및 6-DMAP의 농도가 상기 각 범위 내에 속하는 경우, 상기 핵이식란은 효과적으로 활성화될 수 있다.

이때, 6-DMAP 및 칼슘 이온 운반체 둘다 체외 배양용 배지에 용해시켜 사용하는 것이 바람직하다.　 체외 배양용 배지로는 NaCl, KCl, NaHCO₃, NaH₂PO₄, CaCl₂, Na-락테이트, 포도당, 페놀 레드, BSA, 카나마이신(Kanamycin), 필수 아미노산(EAA, essential amino acid), 비필수 아미노산(NEAA, non-essential amino acid), 글루타민 등을 포함하는 G1.2 배지(Vitro Life, Goteborg, Sweden)를 사용하는 것이 바람직하다.

추가로, 핵이식란의 효율적인 생체 외 배양을 위해서 당업계에 공지된 바와 같이 다양한 에너지 기질(substrate)로 배양 배지를 보충하거나 배아 발달의 단계별로 효과적인 성분들을 함유한 둘 이상의 배지를 이용한 순차적인(sequential) 배양 시스템을 사용하는 것이 바람직하다.　 본 발명에서 이용 가능한 순차적인 배양 시스템은 상업적으로 입수할 수 있는 배양 시스템일 수 있다. 예를 들면, G1.2 / G2.2 배지(Vitro Life, Goteborg, Sweden)와 같은 서로 조성이 다른 두 배지를 순차적으로 이용함으로써 수행될 수 있다.

바람직한 생체 외 배양 배지에는 아미노산을 갖는 "인간 변형 합성 난관액(human modified synthetic oviductal fluid with amino acids; hmSOFaa) 배지"가 포함되는데, 이 배지를 "SNUnt-2 배지"라 명명하였다. 상기 hmSOFaa 배지는 mSOFaa 배지 (Choi et al, Theriogenology, 58, 1187-1197 (2002))의 에너지 물질인 글루코오스를 프룩토오스로 대체하고 소 혈청 알부민 (BSA) 대신 사람 혈청 알부민(human serum albumin; HSA)을 첨가함으로써 제조된 것이다. 여기서, mSOFaa 배지는 소 배아 배양에 광범위하게 이용되고 있다.

구체적으로, 상기 "SNUnt-2 배지"는 (1) 95 내지 110mM NaCl, (2) 7.0 내지 7.5mM KCl, (3) 20 내지 30mM NaHCO₃ _,(4)1.0 내지 1.5mM NaH₂PO₄ _,(5) 3 내지 8mM Na-락테이트, (6) 1.5 내지 2.0mM CaCl₂·2H₂O, (7) 0.3 내지 0.8mM MgCl₂·6H₂O, (8) 0.2 내지 0.4mM Na-피루베이트, (9) 1.2 내지 1.7mM 프룩토오스, (10) 6 내지 10㎎/㎖ HSA, (11) 0.7 내지 0.8㎍/㎖ 카나마이신, (12) 1.5 내지 3% 필수아미노산, (13) 0.5 내지 1.5% 비필수아미노산, (14) 0.7 내지 1.2mM L-글루타민 및 (15) 0.3 내지 0.7% ITS (인슐린: 1.0 g/L, 트랜스페린: 0.55 g/L 및 소듐 셀레나이트: 0.67 mg/L의 혼합물)로 이루어져 있다. 바람직하게 "SNUnt-2 배지"는 표 1에 정리된 바와 같은 함량의 성분들로 이루어져 있다.

성 분	농 도
NaCl	99.1∼106mM
KCl	7.2mM
NaHCO₃	25mM
NaH₂PO₄	1.2mM
Na-락테이트	5mM
CaCl₂·2H₂O	1.7mM
MgCl₂·6H₂O	0.5mM
Na-피루베이트	0.3mM
프룩토오스	1.5mM
HAS	8㎎/㎖
카나마이신	0.75㎍/㎖
필수아미노산	2%
비필수아미노산	1%
L-글루타민	1mM
ITS*	0.5%

* ITS: 인슐린 1.0 g/L, 트랜스페린 0.55 g/L 및 소듐 셀레나이트 0.67 mg/L의 혼합물

한편, 본 발명에 따른 순차 배양 시스템은 서로 다른 배지의 조합을 이용할 수 있다. 예컨대, 1차 배양은 G1.2 배지에서, 2차 배양은 SNUnt-2 배지에서 배양하는 2단계 배양 시스템인 것이 바람직하다.

제5 단계 : 투명대 또는 이의 일부분의 제거

상기 제4 단계에서 얻은 배반포로부터 유래된 배아 줄기 세포를 수득하기 위해서는 전술한 과정으로 배양된 배반포의 투명대(zona pellucida) 또는 이의 일부분을 제거해야 한다.

본 발명에서 배반포로부터 투명대 또는 이의 일부분을 제거하는 방법은 통상적으로 이용되는 방법을 모두 사용할 수 있다.　 이러한 예에는 프로나아제(pronase) 처리, 산성 타이로드 용액(acid Tyrode's solution) 및 레이저 절개(dissection)와 같은 물리적인 방법 등을 포함한다.

바람직하게는 프로나아제를 이용하는 것이다.　 프로나아제는 PBS, G2 배지(Vitro Life, Goteborg, Sweden) 또는 S2 배지(Scandinavian IVF Sciences, Goteborg, Sweden)에 용해하여 이용한다.　 한 양태로 PBS와 S2 배지를 1:1로 혼합한 배지에 프로나아제를 용해하여 이용할 수 있다.　 배반포로부터 투명대를 제거하기 위해서 약 0.1% 프로나아제를 투명대가 제거되기에 충분한 시간 동안 적용시킨다.　 바람직하게는 약 1-2분, 더욱 바람직하게는 1-1.5분 동안 적용시킨다.

제6 단계 : 영양막 세포의 제거 및 ICMs의 분리

상기에서와 같이, 투명대가 일단 제거되면, 영양막 세포가 노출된다.　 이 영양막 세포는 ICMs로부터 완전히 분리되는 것이 바람직하다.　 본 발명에서는 영양막 세포를 ICMs로부터 분리하는데 통상적으로 이용되는 방법, 예컨대, 항체를 이용하는 면역 수술적 방법 또는 피펫을 이용하는 기계적인 방법이 모두 도입될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서는 영양막 세포의 표면에 있는 에피토프에 반응하는 항체를 영양막 세포에 처리하여 영양막 세포를 분리하는 면역수술(immuno-surgery)적 방법을 이용한다. 더욱 바람직하게는 보체 처리를 상기 면역수술적 방법과 함께 병행하는 것이다.　이러한 경우에, 항체 및 보체 처리는 개별적으로 또는 동시에 실시할 수 있다.　 바람직한 항체 및 보체의 조합(combination)은 항-태반 알칼라인 포스파타제 항체(anti-placental alkaline phosphatase antibody) (anti-AP) 및 베이비 래빗 보체 (Baby Rabbit complement) 또는 항-사람 혈청 항체(anti-human serum antibody) 및 기니아 피그 보체(Guinea Pig complement) 등을 포함한다.

항체 및 보체는 SNUnt-2, G2.2 또는 S2 배지 등에 희석하여 이용한다.　바람직하게는, 항-태반 알칼라인 포스파타제 항체(anti-AP)는 S2 배지로 1:20의 비율로 희석하여 사용하고, 다른 항체 및 보체는 1:1로 희석하여 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서는 투명대가 제거된 배반포에 항체를 처리한 다음 보체를 처리하는 것이 바람직하다.　 배반포는 항체로 약 30분 동안 처리하는 것이 바람직하다.　 항체에 노출시킨 후, 배반포는 SNUnt-2, G2.2 또는 S2 배지 등으로 세정한 다음 보체로 처리하는 것이 바람직하며, 적용 시간은 약 30분 정도가 적합하다.

상기 배반포를 SNUnt-2, G2.2 또는 S2 배지로 세정하여 영양막 세포 또는 이의 일부분을 배반포로부터 분리해낼 수 있다.　 이 때, 영양막 세포의 분리는 물리적인 수단에 의해 달성될 수 있으며, 바람직하게는 이러한 분리는 작은 보어(bore)를 가진 피펫을 통한 배반포 함유 용액의 피페팅(pipetting)과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해서 실시될 수 있다.

이러한 과정을 통하여 투명대 및 영양막 세포를 제거하고 ICMs 즉, 남겨진 부분을 수득한다.

제7 단계 : 섬유아 영양 세포층에서의 ICMs 세포의 배양

상기 제6 단계에서 분리된 ICMs 세포들은 그들의 미분화 상태를 유지하도록 섬유아 영양 세포층(fibroblast feeder layer)에서 배양한다.　 몇몇 경우에 hLIF(백혈병 억제인자, leukemia inhibitory factor) 는 영양 세포층을 대신하여 ICMs를 미분화 상태로 유지하는데 이용되기도 하지만, 사람 세포의 경우에, 고농도 LIF의 경우에도 섬유아 영양 세포층이 없는 경우에는 세포를 미분화 상태로 유지할 수 없다.　 따라서 통상적으로 배아 줄기 세포와 관련된 배외(extraembryonic) 분화 및 세포 사멸을 유도하지 않는 조건은 섬유아 영양 세포층 상에서 배양하는 것을 말한다.

섬유아 영양 세포층을 제조하기 위하여, 마우스 및/또는 사람의 섬유아세포를 이용하는 것이 바람직하다.　 이들은 단독으로 또는 혼합하여 이용할 수 있다. 더욱 바람직한 것은 환자의 자가 핵 이식란으로부터 유래한 배아 줄기 세포로부터 분화된 세포를 영양 세포층(feeder)으로 이용하는 것이다 (본 발명자는 이를 자가 영양 세포층(auto feeder layer)이라 명명하고자 한다). 가장 바람직하게는 자가 핵 이식란으로부터 유래된 배아 줄기 세포로부터 섬유아세포로 분화된 세포를 영양 세포층으로 이용하는 것이다. 이러한 세포의 이용을 통하여 궁극적으로 수득하고자 하는 자가 핵 이식된 배아 줄기 세포가 다른 세포 즉, 유래가 다른 섬유아 영양 세포층을 구성하는 세포들에 의하여 오염되는 것을 방지할 수 있다.

사람 유래의 섬유아세포는 마우스 섬유아세포와 적합하게 혼합하여 최적의 줄기 세포 생장 및 분화 억제를 달성할 수 있다.

섬유아세포 층의 세포 밀도가 그들의 안정성 및 성능에 영향을 미친다.　 세포 밀도는 cm²당 약 2.5 ×10⁴ 개의 사람 섬유아세포와 7.0 ×10⁴ 개의 마우스 섬유아세포가 가장 바람직하다.　 마우스 섬유아세포 단독으로 이용될 때에는 7.5 ×10⁴- 1.0 ×10⁵ 세포/cm² 밀도가 적합하다.　 이러한 영양 세포층은 ES 세포의 첨가 6-48시간 이전에 확립되는 것이 바람직하다.

바람직하게는 마우스 또는 사람의 섬유아세포들은 계대수가 적은(low passage number) 세포들이다.　 섬유아세포의 질(quality)은 줄기 세포를 지지하는 능력에 영향을 미친다.　 배아의 섬유아세포가 특히 바람직한데, 마우스 섬유아세포의 경우에 이들은 13.5일 된 태아(fetus)로부터, 그리고 사람의 섬유아세포는 배아 또는 태아 조직으로부터 수득할 수 있으며, 통상적인 세포 배양 프로토콜을 이용해서 배양할 수 있다.

마우스 배아의 섬유아세포를 취급하는데 있어서, 기본적인 가이드라인은 트립신의 이용을 최소화하고 과밀화(overcrowding)를 억제하는 것을 포함한다.　 이렇게 취급되지 않은 배아의 섬유아세포들은 미분화된 ES 세포의 생장을 지지할 수 없다.　 새로이 제조된 마우스 배아의 섬유아세포의 각 배치(batch)는 이들이 줄기 세포의 지지 및 유지에 적합한지를 확인하기 위해서 먼저 테스트되어야 한다.

새로운 일차(primary) 배아 섬유아세포가 냉동-해동된 섬유아세포와 비교했을 때 줄기 세포 소생(renewal)을 지지하는데 더욱 적합하다.　 그러나 몇몇 배치들은 반복적 냉동 및 해동 후에도 그들의 지지 잠재력을 보유하게 되기도 한다.　

일부 마우스 계통(strain)은 다른 계통 보다 줄기 세포의 유지에 더욱 적합한 배아 섬유아세포를 생산할 수 있다.　 예를 들면, 동종번식된 129/Sv 또는 CBA 계통 또는 129/Sv 와 C57/B16 계통의 교잡으로 생산된 마우스에서 유래된 섬유아세포가 줄기 세포 유지에 가장 적합한 것으로 입증되어 왔다.

한편, 영양 세포들은 이들의 성장은 저지되도록 처리되는 것이 바람직하다.　 몇 가지 방법이 이용될 수 있는데 예를 들면, 방사선 조사 또는 미토마이신 C와 같은 화학물질을 처리하는 것이다.　 가장 바람직한 것은 영양 세포들을 미토마이신 C로 처리하는 것이다.

이러한 섬유아 영양 세포층은 일반적으로 젤라틴으로 처리된 디쉬 상에서 배양하며 바람직하게는 0.1% 젤라틴으로 처리된 것이다.

섬유아 영양 세포층은 ES 배지에서 유지될 수 있다.　 적합한 ES 배지는 DMEM/F12 배지에 20% 혈청 대체물(serum replacement), 0.1mM 베타-메르캅토에탄올, 1% 비필수 아미노산(NEAA), 2mM 글루타민 및 페니실린(100 units/ml), 스트렙토마이신(100㎍/ml), 인간 재조합 섬유아세포 성장 인자(4 ng/ml, fibroblast growth factor, FGF)가 보충된 배지이다.

ES 배지는 추가적으로 줄기 세포의 성장 또는 생존을 촉진하거나 줄기 세포 분화를 억제할 수 있는 수용성 생장인자를 보충할 수 있다.　 이러한 인자들에는 예를 들면 사람의 다능성 줄기 세포 인자 또는 배아 줄기 세포 소생 인자 등을 포함한다.

분리된 ICMs는 적어도 6일 이상 배양될 수 있으며,　이 단계에서 세포의 콜로니가 발생한다.　 이 콜로니는 원칙적으로는 미분화된 줄기 세포로 이루어져 있다.　 미분화된 줄기 세포의 분리(isolation)는 당업계에 공지된 방법들 중 어느 하나 이상에 의해서 달성될 수 있다.　 마이크로 피펫을 이용하는 것이 바람직하다.　 이러한 물리적인 분리는 Ca²⁺/Mg²⁺ 없는 PBS 배지 또는 디스파제(dispase)와 같은 세포의 분리(dissociation)에 도움이 되는 효소 처리와 병행해서 실시할 수도 있다.

제8 단계 : 배아 줄기 세포의 계대 배양

상기 제7 단계에서 배양된 줄기 세포를 영양 세포층에서 떼어내서 새로운 영양 세포층으로 옮긴 다음 이를 형태학적으로 미분화된 상태로 증식하기에 충분한 시간동안 배양할 수 있다.

이 때에, 세포들은 5-7일 동안 배양하는 것이 바람직하다.　 그 이후에, 미분화된 줄기 세포 콜로니가 관찰되었다.　 줄기 세포는 높은 핵/세포질 비율, 현저한 인(nucleoli), 응축된 콜로니 형성 및 뚜렷한 세포 경계에 의하여 형태학적으로 확인될 수 있다.

미분화된 줄기 세포의 증식 방법은 줄기 세포 콜로니로부터 미분화된 줄기 세포 응집체(clump)를 분리하는 것에서 시작된다.　 이러한 분리(isolation)는 화학적 또는 물리적인 수단과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해서 수행될 수 있다.　 보다 바람직하게는 줄기 세포들은 Ca²⁺/Mg²⁺ 없는 PBS 배지로 세정하거나 물리적인 방법 또는 두 방법을 조합하여 콜로니로부터 분리할 수 있다. 보다 바람직하게는 물리적 방법으로 조각내어 계대하는 것이다.

본 발명의 한 구체예에서, Ca²⁺/Mg²⁺ 없는 PBS 배지가 세포간의 부착력을 감소시키는데 이용될 수 있다.　 상기 배지에서 약 15-20분간 배양한 후에 세포들은 점진적으로 영양 세포층으로부터 서로 분리되기 시작하여 목적한 크기의 응집체(clump)로 분리될 수 있다.　 세포 분리가 불충분할 때에는, 마이크로 피펫의 예리한 가장자리를 이용하는 물리적인 분리가 응집체의 분리 및 절단에 유용할 수 있다.

선택적인 화학적 방법은 효소의 이용을 포함한다.　 효소는 단독으로 또는 물리적인 방법과 함께 사용될 수 있으며, 효소는 디스파제(dispase)를 이용하는 것이 바람직하다.

또 다른 구체예에서는 콜로니의 물리적인 절단 이후에 디스파제를 이용하여 상기 콜로니로부터 응집체를 분리하는 혼합된 방식이다.　 콜로니의 절단은 Ca²⁺/Mg²⁺를 함유하는 PBS 배지에서 실시한다.　 마이크로 피펫의 예리한 가장자리는 콜로니들을 약 100개 세포를 포함하는 응집체로 절단하는데 이용될 수 있다.　 응집체가 분리되자마자, 이들을 넓은 구멍 마이크로-피펫으로 집어서 Ca²⁺/Mg²⁺ 함유 PBS 배지로 세정한 다음 새로운 섬유아 영양 세포층으로 옮긴다.

이러한 배양 과정에서 줄기 세포가 미분화 상태를 유지하고 있는지 여부를 확인할 필요가 있다.　 미분화된 배아 줄기 세포는 앞서 기재된 바와 같이 특징적인 형태학적 특성을 가지고 있다.　 줄기 세포를 확인할 수 있는 또다른 방법은 세포 마커 또는 다능성 세포의 특징적인 유전자의 발현을 측정함으로써 가능하다.

다능성 세포의 특징적인 유전자 또는 특유의 계통(lineage)의 예에는 이에 제한되는 것은 아니지만, 줄기 세포의 마커로서 알칼라인 포스파타제(AP), Oct-4(Octamer-4), SSEA-3, SSEA-4를 포함한다.　 줄기 세포에 특징적인 다른 유전자들은 제네시스(genesis), GDF-3 및 크립토(Cripto)를 포함한다.　 그러한 유전자 발현 프로필은 역전사-중합효소 체인 리액션(RT-PCR), 분화 유전자 발현 방법 및 마이크로 어레이 분석 등의 공지의 방법에 의해서 달성될 수 있다

바람직하게는 줄기 세포는 SSEA-4, GCTM-2 항원, TRA 1-60을 포함한 사람 다능성 줄기 세포 마커와의 면역반응 여부에 의해서 확인될 수 있다.　 바람직하게는 이러한 세포들은 전사 인자로 Oct-4를 발현하며 또한 정상 이배체 핵형(normal diploid karyotype)을 유지하고 있다.

줄기 세포의 진행(progress) 및 이들의 분화 또는 미분화 상태 유지는 배양 배지에 분비되는 줄기 세포 특이적인 단백질들의 정량 측정 또는 ELISA 또는 관련된 기술을 이용하여 세포의 고정된 현미표본(preparation)의 분석에 의해 모니터링될 수 있다. 이러한 줄기 세포 특이적인 단백질들은 CD 항원의 가용성 형태 또는 GCTM-2 항원을 포함하며 또한 이들 단백질들은 세포 마커를 검출하거나 또는 유전자 발현을 측정함으로써 모니터할 수 있다.

한편, 본 발명은 인간의 체세포 핵을 탈핵된 인간 난자에 이식하여 형성된 핵이식란으로부터 유래된 배아 줄기 세포주에서 분화된 신경 세포 또는 신경 전구세포를 제공한다.

또한, 본 발명은

(3) 신경 전구세포의 마커를 발현하는 세포를 선별하고 배양하여 신경 전구세포를 얻는 단계를 포함하는,

인간의 체세포 핵을 탈핵된 인간 난자에 이식하여 형성된 핵이식란으로부터 유래된 배아 줄기 세포주에서 분화된 신경 전구세포를 제조하는 방법을 제공한다.

이하에서는 본 발명에 따른 인간의 체세포 핵을 탈핵된 인간 난자에 이식하여 형성된 핵이식란으로부터 유래된 배아 줄기 세포주에서 분화된 신경 전구세포를 제조하는 방법을 단계별로 구체적으로 기술하고자 한다.

단계 A : 배아체(embryonic body)의 생성

앞서 수득한 자가 핵이식란으로부터 유래된 배아 줄기 세포주(핵 전달 배아 줄기세포, 또는 ntES 세포)를 신경 전구세포로 분화하기 위한 첫 단계는 ntES 세포를 배아체로 생성시키는 것이다. 줄기 세포로부터 배아체를 형성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(Zhang et al., Nat. Biotechnol, 19:1129-1133 (2001)).

구체적으로, 본 발명은 한 양태로서 배양된 ntES 세포 콜로니를 비접착성의 배양 디쉬로 옮겨서 3일 내지 5일 동안 20% 혈청 대체물(serum replacement)이 첨가된 DMEM/F12 배지에서 배양함으로써 배아체를 생성할 수 있다. 상기 배양시 통상 하루가 경과한 후에 부유하는 배아체(약 40 내지 60개의 배아체/디쉬)가 자라나기 시작한다. 이 때에, 상기 배아체를 새로운 디쉬로 옮기면서 잔류하는 영양 세포들을 제거하는 것이 바람직하다. 그 다음 이렇게 생성된 배아체는 (폴리오르니틴/라미닌으로 코팅된) 접착성의 디쉬에 플레이트한다.

단계 B : 제제에 의한 신경 전구세포로의 분화 유도

본 발명에 있어서, 상기 단계 A에서 수득한 배아체들을 신경 전구세포로 분화할 수 있도록 유도하는 화학물질에는 이에 제한되는 것은 아니지만 예를 들면, ITSF(Insulin, Transferrin, Sodium selenite, Fibronectin의 혼합물), 레티노산(Retinoic Acid), 아스코빅산(Ascorbic acid), 니코틴아마이드, N-2 보충제(N-2 supplement, 100X; 17502-048, Gibco, Grand Island, NY, U.S.A.) 및 B-27 보충제(B-27 supplement, 50X; 17504-044, Gibco, Grand Island, NY, U.S.A.) 등이 있다. 이들을 배지에 첨가하여 계속 배양하여 확장(expansion) 및 분화를 유도함으로써 ntES로부터 분화된 신경 전구세포를 수득할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일구체예에 있어서, 앞서 단계 A에서 생성된 배아체를 하루 더 배양한 후에, ITSF 즉, 인슐린 (약 25μg/ml), 트랜스페린 (약 100μg/ml), 소듐 셀레나이트 (약 30nM) 및 피브로넥틴 (약 5μg/ml)으로 보충된 DMEM/F12 배지에서 5일 내지 10일 동안 배양하여 ntES 세포의 신경 전구세포로의 분화를 유도할 수 있다.

단계 C : 신경 전구세포 마커를 발현하는 세포의 선별 및 배양

상기 단계 B에서 분화된 세포들 중에서 신경 전구세포 마커, 예를 들면, 네스틴(nestin)을 발현하는 세포를 선별한 다음 이들을 배양함으로써 자가 핵 이식된 배아 줄기 세포주로부터 분화된 신경 전구세포를 수득할 수 있다. 또한, 수득된 신경 전구세포로부터 특정의 원하는 신경세포 타입으로 분화유도될 수 있으며, 이 분화유도는 화학물질을 사용한 유도 등의 통상의 방법으로 수행될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 신경 전구세포 마커 양성인 세포를 선별하고, N-2 보충제, 라미닌(laminin), bFGF로 보충된 DMEM/F12 배지에서 5 내지 7일 배양하여 세포의 확장을 유도하고, 그런 다음 이들을 bFGF가 제외된 N-2 보충제 및 라미닌만으로 보충된 DMEM/F12 배지에서 8일 내지 14일 동안 배양한다.

배아 줄기 세포 세포를 어떤 타입의 세포로도 분화시킬 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 따라서 본 발명에 의한 배아 줄기 세포주는 다양한 유형의 세포를 제공하는 좋은 공급원이 될 수 있다. 예컨대, 배아줄기 세포는, 세포 분화에 적합한 배지 및 조건 하에서 배양함으로써, 조혈모세포, 신경 세포, 베타 세포, 근육 세포, 간 세포, 연골 세포, 상피 세포 등으로 분화 유도될 수 있다. 그러한 배지 및 조건은 당업계에 잘 알려져 있다.

따라서 본 발명에 의한 배아 줄기 세포주는 수많은 치료적 및 진단적 응용을 가질 수 있다. 특히, ES 세포는 당뇨병, 파킨슨씨병, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 대뇌 마비 및 암과 같은 수많은 질환의 치료를 위한 세포 이식 치료법에 이용될 수 있다. 더 나아가, 자가 핵이식란으로부터 유래된 자가 배아 줄기 세포는 치료 도중이나 그 이후에 면역 거부 반응의 부작용이 없으므로, 세포 이식 치료법에서 더욱 유용하게 사용될 수 있다.　　

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다.　 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

아래 실시예에서 사용된 G1.2 배지 및 G1 ver.3 배지 (Vitro Life, Goteborg, Sweden)는 달리 언급이 없는 한 5% HSA가 첨가된 배지이다.

<실시예 1>

난자 및 공여핵 세포의 준비

난자 기증자들을 신체 및 정신 검사를 통해서 자세하게 스크리닝한 후 여포자극 호르몬(follicle stimulation hormone, FSH)을 연속적으로 주입하여 과배란(superovulation)을 유도하였다.　

사람의 융모성생식선자극호르몬(human chorionic gonadotropin, hCG)을 난자 기증자에게 주입한 후 36시간째에, 난구-난모세포 복합체(cumulus-oocyte complex, COCs)를 회수하여 G1.2배지(Vitro life, Goteborg, Sweden)에서 37℃, 5% CO₂의 포화습도 배양기에서 40분 동안 배양하였다.　 COC는 히알루로니다제(0.1% (w/v), hyaluronidase; Sigma Co., Saint Louis, MO, U.S.A.)로 1시간 동안 처리해서 난구세포(cumulus cell)를 분산시켰다.　

난자는 COC로부터 난구세포를 분산시킴으로써 얻어졌다. 이후 마우스 피펫을 이용하여 난구세포를 벗겨낸 후, G1.2 배지로 세정하였다. 여기에서, 형태 지름(modal diameter)이 직경 : 10-12㎛인 난구세포가 공여핵 세포로서 선택되었다.

<실시예 2>

난자의 탈핵 및 세포 융합

실시예 1에서 수득한 난자를 G1.2 배지에서 1 내지 2시간 동안 배양함으로써 탈핵하기 앞서 핵의 성숙을 유도하였다.　 이어지는 탈핵, 핵 이식 및 전기 융합을 다음과 같이 실시하였다.

(2-1) 난자의 탈핵 및 체세포의 핵 이식

난자를 G1.2 배지로 1회 세정하고, 5ml의 G1.2 배지에 하이알루로니다제 0.05g을 용해시킨 용액 111μl과 G1.2 배지 1ml을 혼합하여 최종 농도를 0.1%(w/v)로 적정한 하이알루로니다제 용액 내에 난자를 옮긴 다음, 난구 세포를 제거하고 G1.2 배지로 3회 세정하고 정치시켰다.　 이어, 7.5㎍/ml의 농도가 되도록 DMSO에 사이토칼라신 B(cytochalasin B)를 용해시킨 용액 1㎕와 10% 소 태아 혈청(FBS)이 첨가된 G1.2 배지 1ml을 혼합한 사이토칼라신 B 용액으로 난자를 옮기고, 미세조작기로 정치된 난자의 투명대를 절개하여 절개창을 형성시킨 후, 이를 통하여 전체 세포질의 10 내지 15%에 해당하는 양의 제1극체를 포함하는 난자의 세포질을 제거함으로써 난자를 탈핵시켰다.

도 3은 고정용 피펫(1)과 절개용 피펫(2)으로 난자(3)의 투명대를 절개하는 과정을 나타낸다.　 도 4는 난자의 제 1극체와 핵을 제거하는 탈핵과정을 나타낸다.　 도 4에서 보듯이, 난자(3)를 회전시켜 절개창을 수직으로 위치시키고, 고정용 피펫(1)을 난자의 밑 부위에 위치시켜 난자가 아래쪽으로 움직이지 못하도록 지지한 다음, 절개용 피펫(2)을 난자의 위에서 가볍게 눌러 난자를 탈핵시켰다.　 이처럼 탈핵된 난자를 G1.2 배지로 3회 세정하고, G1.2 배지에 정치시켰다.

그런 다음, 1% BSA가 첨가된 PBS로 만든 4 ㎕ 미소적에 존재하는 공여핵 세포를 400 ㎕의 G1.2 배지와 100 ㎕의 PHA-P 용액 (10 ml의 G1.2 배지에 5mg의 PHA-P를 용해시킨 용액)을 혼합하여 제조한 용액으로 만든 4 ㎕ 미소적에 존재하는 탈핵 난자에 고정용 피펫과 이식용 피펫을 사용하여 이식하였다. 공여핵 세포와 탈핵 난자를 함유하는 상기 미소적을 증발 방지를 위하여 미네랄 오일로 도포하였다.

도 5는 탈핵된 난자에 공여핵 세포를 이식하는 과정을 나타낸다.　 도 5에서 보듯이, 탈핵된 난자(3)가 고정용 피펫(1)으로 고정되고, 이식용 피펫(4)이 탈핵 난자의 절개창으로 주입된 후, 유압으로 공여핵 세포를 주입하여 핵이식란을 작제하였다.　 이처럼, 작제된 핵이식란을 G1.2 배지로 3회 세정한 후, 동일한 배지에 정치시켰다.

(2-2) 전기 융합에 의한 핵이식란의 작제

BTX-전자 세포 조작기(electro cell manipulator)(BTX Inc., San Diego, CA, U.S.A.)를 사용하여 핵이식란을 전기 융합시켰다.

0.5mM HEPES 완충용액(pH 7.2)에 0.1mM MgSO₄, 0.05% BSA 및 0.28mM 만니톨을 용해시켜 얻어진 만니톨 용액 20㎕의 미소적, G1.2 배지 10㎕와 상기 만니톨 용액 10㎕를 혼합한 20㎕의 미소적, 그리고 G1.2 배지 20㎕의 미소적을 준비하였다. 상기 (2-1)에서 제조한 핵이식란을 먼저 G1.2 배지 10㎕와 상기 만니톨 용액 10㎕를 혼합한 20㎕의 미소적에서 1분간 정치시킨 후, 마우스 피펫을 이용하여 상기 핵이식란을 상기 만니톨 용액 20㎕의 미소적으로 옮기고 1분간 정치시켰다. 이어, 핵이식란을 BTX-전자 세포 조작기에 연결시킨 2개 전극 사이에 분주된 만니톨 용액에 넣고, 공여핵 세포가 (+) 전극을 향하도록 핵이식란을 위치시켰다.　 전압은 1kV/cm, 시간은 15μs, 횟수는 1초 간격으로 2회의 조건에서 직류전류를 통전하여 핵이식란을 전기융합시켰다.　 융합된 핵이식란을 G1.2 배지 10㎕와 상기 만니톨 용액 10㎕를 혼합한 20㎕의 미소적에서 1분간 정치시킨 후, G1.2 배지 20㎕의 미소적으로 옮긴 후, G1.2 배지로 3회 세정하였다.

<실시예 3>

핵이식란의 리프로그래밍, 활성화 및 생체 외 배양

실시예 2에서 수득한 핵이식란은 정상적인 배 발생을 유도하는데 있어 주요인자 중의 하나인 정자에 의한 활성화를 받지 못하기 때문에 인공적인 자극이 필요하다. 인위적 배발생을 위한 최적의 조건을 설정하기 위해서, 표 2 내지 4에 기재된 바와 같이, 핵이식란을 리프로그래밍 시간이 경과한 이후에 여러 방법으로 활성화시키고 또한 생체 외 배양하였다.

먼저, 리프로그래밍 시간이 배반포 형성률에 미치는 영향을 확인하고자 리프로그래밍 시간을 각각 약 2, 4, 6, 20시간으로 변화시키고 활성화 방법 및 생체외 배양 조건을 표 2와 같이 동일하게 설정하였다. 이를 통하여 리프로그래밍 시간이 약 2시간일 때 최고의 배반포 형성률이 나타남을 알 수 있었다.

리프로그래밍 시간 (hour)	활성화 조건		생체외 배양		난자의 개수	하기 각 단계까지 발생한 핵이식란의 개수
리프로그래밍 시간 (hour)	활성화 조건		1차 배지	2차 배지	난자의 개수	2-세포기	상실배	배반포
2	10μM ionophore^*	2.0mM 6-DMAP	G1.2	SNUnt-2	16	16	4	4
4	10μM ionophore^*	2.0mM 6-DMAP	G1.2	SNUnt-2	16	15	1	0
6	10μM ionophore^*	2.0mM 6-DMAP	G1.2	SNUnt-2	16	15	1	1
20	10μM ionophore^*	2.0mM 6-DMAP	G1.2	SNUnt-2	16	9	1	0

* 칼슘 이온 운반체 A23187

또한, 활성화 방법이 배반포 형성률에 미치는 영향을 확인하고자 고정된(약 2시간) 리프로그래밍 시간이 경과된 핵이식란을 표 3에 나타난 바와 같이 G1.2 배지에서 37℃, 5분 동안 칼슘 이온운반체 A23187 (5 또는 10μM; Sigma) 또는 이오노마이신(5 또는 10μM; Sigma, Co., St. Louis, MO, U.S.A.) 중 어느 하나로 처리한 다음 G1.2 배지로 수차례 세정하고, 2.0 mM 6-디메틸아미노퓨린(6-dimethylaminopurine, 6-DMAP; Sigma, Co., St. Louis, MO, U.S.A.)을 포함하는 G1.2 배지에 옮겨서 37℃, 5% CO₂, 5% O₂ 및 90% N₂에서 4시간 동안 활성화시켰다. 그런 다음 이들을 동일한 배양 조건에서 생체외 배양하였다. 표 3에 나타난 바와 같이, 10μM 칼슘 이온 운반체를 처리하고 그 다음에 2.0 mM 6-DMAP를 순차적으로 처리하는 활성화 방법이 최고의 배반포 형성률을 나타냄을 확인할 수 있었다.

리프로그래밍 시간 (hour)	활성화 조건		생체외 배양 조건		난자의 개수	아래 단계까지 발생한 핵이식란의 개수
리프로그래밍 시간 (hour)	활성화 조건		1차 배지	2차 배지	난자의 개수	2-세포기	상실배	배반포
2	5μM ionophore^*	2.0mM 6-DMAP	G1.2	SNUnt-2	16	11	0	0
2	10μM ionophore^*	2.0mM 6-DMAP	G1.2	SNUnt-2	16	16	5	3
2	5μM ionomycin	2.0mM 6-DMAP	G1.2	SNUnt-2	16	9	0	0
2	10μM ionomycin	2.0mM 6-DMAP	G1.2	SNUnt-2	16	12	0	0

* 칼슘 이온 운반체 A23187

아울러, 생체 외 배양 조건이 배반포 형성률에 미치는 영향을 확인하고자 상기 최적의 리프로그래밍 시간 및 활성화 후에 핵이식란을 G1.2 배지로 세차게 세정하고 10㎕ G1.2 배지 미소적(drop) 또는 SNUnt-2 배지에서 37℃, 5% CO₂, 5% O₂ 및 90% N₂ 조건에서 48시간 동안 배양하였다.　 배양 후 분리한 핵이식란을 새로운 G2.2 배지 또는 SNUnt-2 배지로 옮겨서 또 다시 6일 동안 배양하였다.

리프로그래밍 시간 (hour)	활성화 조건		생체외 배양 조건		난자의 개수	아래 단계까지 발생한 핵이식란의 개수
리프로그래밍 시간 (hour)	활성화 조건		1차 배지	2차 배지	난자의 개수	2-세포기	상실배	배반포
2	10μM ionophore^*	2.0mM 6-DMAP	G1.2	SNUnt-2	16	16	4	3
2	10μM ionophore^*	2.0mM 6-DMAP	G1.2	G2.2	16	16	0	0
2	10μM ionophore^*	2.0mM 6-DMAP	SNUnt-2	SNUnt-2	16	16	0	0

* 칼슘 이온 운반체 A23187

표 4에 나타난 바와 같이, G1.2 배지에서 일차 배양하고 SNUnt-2 배지에서 이차 배양함으로써 최고의 배반포 형성률을 보이는 것을 확인할 수 있었다.

결국, 핵이식란은 2시간의 리프로그래밍 시간을 거친 다음 10μM 칼슘 이온 운반체를 처리하고 2.0mM 6-DMAP를 처리하여 활성화 한 다음 G1.2 배지에서 일차 배양하고 SNUnt-2 배지에서 이차 배양함으로써 최적의 배 발생을 달성할 수 있었다.

상기 최적 조건 하에서, 부가적으로, 66개의 핵이식란을 리프로그래밍, 활성화 및 생체외 배양하여 19개의 배반포(29%)를 얻었다. 배반포로 발생된 본 발명에 따른 핵이식란의 상기 비율은, 소(약 25%)(Kwun et al., Mol. Reprod. Dev., 65:167-174(2003)) 및 돼지(약 26%)(Hyun et al., Biol. Reprod., 69:1060-1068(2003); Kuhholzer et al., Biol. Reprod. 64:1635-1698(2004))에서 확립된 SCNT 방법에서 관찰된 것에 필적할만 하다. 　

<실시예 4>

투명대의 제거 및 영양막 세포의 제거와 ICM의 분리

상기 실시예 3으로부터 수득한 배반포를 0.1% 프로나제(pronase; Sigma, Co., St. Louis, MO, U.S.A.)를 1분 동안 적용하여 투명대를 제거한 다음, 100% 항-사람 혈청 항체(anti-human serum antibody; Sigma, Co., St. Louis, MO, U.S.A.)를 20분 동안 처리하고, 37℃, 5% CO₂에서 10μM 기니아 피그 보체(Life Technologies, Rockville, MD, U.S.A.)에 추가로 30분 동안 노출시킴으로써 영양막 세포를 제거하고 ICMs를 분리하였다.

<실시예 5>

ICMs의 배양

실시예 4에서 분리된 ICMs는 0.1% 젤라틴으로 코팅된 조직 배양 디쉬에서 미토마이신 C로 비활성화된 일차 마우스 (C57BL breed) 배아의 섬유아세포 영양 세포층 (7.5 x 10⁴세포/㎠) 에서 배양하였다.　 배양 배지는 DMEM/F12 배지(Life Technologies, Rockvile, MO, U.S.A.)에 20% 혈청 대체물(Serum Replacement), 0.1mM 베타-메르캅토에탄올, 1% 비필수 아미노산, 2 mM 글루타민, 페니실린(100 units/ml), 스트렙토마이신(100 ㎍/ml), 섬유아세포 성장 인자(4 ng/ml, basic fibroblast growth factor, bFGF; Life Technologies, Rockville, MD, U.S.A.)가 보충된 배지를 이용하였다.　 초기 ES 세포 배양 동안에, 배지는 사람 재조합 백혈병 억제 인자 (leukemia inhibitory factor, LIF; Chemicon, Temecula, CA, U.S.A.) (100 units/ml)로 보충하였다.　 상기 배양은 미분화된 ntES 세포 콜로니가 나타날 때까지 6일 이상 수행되었다. ntES 세포 콜로니 형성 이후, 5일 또는 7일에 한번씩 마이크로 피펫을 이용하여 기계적으로 ntES 세포를 분리하였다.

이러한 과정으로 수득한 자가 핵이식란으로부터 유래된 배아 줄기 세포를 "hntES"로 명명하였고, 2003년 12월 29일자로 부다페스트 협약하의 국제기탁기관인 한국세포주 연구재단(KCLRF 대한민국 서울시 종로구 연건동 28번지, 서울대학교 의대암연구소내 소재)에 기탁하고 수탁번호 KCLRF-BP-00092를 부여받았다.

<실험예 1>

핵형 분석에 의한 실시예 5에서 얻어진 인간 ntES 세포의 확인

앞서 실시예 5에서 수득한 미분화된 ntES 세포의 콜로니들을 0.1 mM Ca²⁺ 및 0.1 mM Mg²⁺를 함유하는 PBS로 세정한 후, 시트레이트-아세톤-포름알데히드로(혼합비: 25:65:8 (v/v/v)) 4℃에서, 1시간 동안 고정하고 0.1 Mm의 Ca² ⁺ 및 0.1Mm의 Mg²⁺를 포함하는 PBS로 한차례 세정하였다.　 ntES 세포의 알카라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 활성도를 검증하기 위해서 AP 키트(Sigma, Co., St. Louis, MO, U.S.A.)를 사용하였다.　ntES 세포의 특이적 표면 항원을 확인하기 위하여 하기 단일클론 항체를 일차 항체로 사용하여 면역조직화학 분석 (immunohistochemical assay)을 수행하였다: Oct-4(SC-5279; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, U.S.A.); SSEA-1(MC480), SSEA-3(MC631) 및 SSEA-4(MC-813-70; Developmental Studies Hybridoma Bank, lowa City, IA, U.S.A.); TRA-1-60 및 TRA-1-80(Chemicon, Temecula, CA, U.S.A.).　

상기 일차 항체를 바이오티닐래이티드 이차 항체 및 아비딘-호스라디쉬 퍼옥시다제 접합체를 함유하는 Vectastatin ABC 키트 (Vector laboratory, Burlingame, CA, U.S.A.)로 탐지하였다.

게놈 DNA 및 사람의 STR (Short Tanderm Report) 마커에 대하여 자동화된 ABI 310 Genetic Analyzer(Applied Biosystems, Foster city, CA, U.S.A.)상에서 STR AMP FLSTR PROFILER 키트(Applied Biosystems, Foster city, CA, U.S.A.)를 이용해서 DNA 지문법(finger printing) 분석을 실시하였다. 이의 분석 결과를 도 6A 내지 도 6D에 나타내었다.

도 6A 내지 도 6D에 따르면, 상기 실시예 1 내지 5에서 수득한 핵이식란으로부터 유래한 배아 줄기 세포주의 핵형 분석 결과와 상기 배아 줄기 세포주에 핵을 제공한 여성의 체세포 핵형 분석 결과가 동일한 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에서 수득한 배아 줄기 세포주는 단위생식에 의해 활성화된 난자로부터가 아닌, 한 여성의 체세포 핵을 이식하여 제조된 핵이식란으로부터 유래된 것임을 알 수 있다.

<실험예 2>

teratoma 분석을 통한 인간의 ntES 세포의 확인

실시예 5에서 얻은 미분화 ntES 세포 100개 콜로니를 배양 디쉬에서 분리하여 1 ml 주사기에 넣어 SCID mouse (KRIBB, Korea)의 고환(testis)에 주입한 후 8주간 배양하였다. 형성된 테라토마(teratoma)를 파라핀으로 고정하여 면역 조직화학검사를 시행하여 3배엽의 세포가 생성되었는지 확인하였다. 이의 분석 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 따르면, 실시예 5에서 수득한 ntES 세포는 고환(testis)에 3배엽 (연골(A): 내배엽, 장관(B): 중배엽, 및 신경관(C): 외배엽)을 형성하는 것을 볼 수 있다. 따라서, 본 발명에서 수득한 ntES 세포는 다양한 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 다능성 배아 줄기 세포임을 알 수 있다.

<실험예 3>

면역 조직 화학염색에 의한 배아체 형성 확인

상기 실시예 5에서 얻어진 사람 ntES 세포 콜로니를 0.1% 트립신/1mM EDTA로 처리하여 분리한 다음 플라스틱 페트리 디쉬로 옮겼다.　 사람 ntES 세포는 hLIF 및 bFGF 없이 DMEM/DMEM F12 배지에서 14일 동안 배양하였다.　 파라핀 고정을 위해서, ntES 세포는 PBS에 용해된 1% 저용융 온도 아가로스에 옮기고 42℃까지 냉각시켰다.　그 결과 ntES 세포를 포함하는 고체화된 아가로스를 PBS에 용해된 4% 파라포름알데히드에 고정시키고 파라핀에 심어넣었다.　파라핀에 심은 세포를 개개의 6-mm 섹션을 슬라이드에 배치하고 면역조직화학 분석을 수행하였다.　 사용된 항체는 다음과 같다: 알파-1-페토단백질(18-0003), 사이토케라틴(18-0234), 데스민(18-0016), 뉴로필라멘트(18-0171) 및 S-100(18-0046)은 Zemed사(South San Francisco, CA, U.S.A.)로부터 구입하였고 HNF-2-알파(SC-6556), BMP-4(SC-6896), Myo D(SC-760) 및 NCAM(SC-7326)은 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, U.S.A.)사로부터 구입하였다.　 상기 항체를 일차 항체로 사용하고, 바이오티닐래이티드 항-래빗, 항-마우스 또는 항-고오트 항체를 이차 항체로 사용하였다. 상기 면역반응을 스트렙타비딘-접합 호스라디쉬 퍼옥시다제 및 디아미노벤지딘 크로마겐으로 탐지하였다. 이의 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 따르면, 실시예 5에서 수득한 ntES 세포에서 내배엽 마커 단백질인 알파-1-페토단백질(A), 사이토케라틴 7(B) 및 HNF-2-알파(C)와, 중배엽 마커 단백질인 BMP-4(D), 미오 D(E) 및 데스민(F), 그리고, 외배엽 마커 단백질인 뉴로필라멘트(G), S-100(H) 및 NCAM(I)가 발현됨을 확인할 수 있었으며, 따라서, 상기 ntES 세포가

배아체를 형성할 수 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명에서 수득한 세포는 배아 줄기 세포임을 알 수 있었다.

<실시예 6>

신경 전구세포로의 분화

(6-1) 미분화된 ES 세포의 확장

앞서 실시예 5에서 얻어진 인간의 미분화된 ntES 세포를 37℃, 5% CO₂에서 2% 젤라틴으로 코팅된 배양 플레이트에 충진된, 세포분열이 불활성화된 마우스 배아의 섬유아세포 영양 세포층에서 배양하였다. 상기 배양 시에 DMEM F/12(1:1), 20% 넉아웃 혈청 대체물(knock-out serum replacement), 0.1mM 비필수 아미노산, 0.1mM 베타-메르캅토에탄올, 1mM L-글루타민 및 항생제(100 U/ml 페니실린 G, 100μg/ml 스트렙토마이신, 4ng/ml의 bFGF)로 이루어진 배지를 이용하며, 매일 교환해주었다.

(6-2) 배아체(embryonic body)의 생성

배양된 ntES 세포 콜로니를 수집하여 비접착성의 배양 디쉬로 옮겨서 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다. 배양 배지는 4 ng/ml bFGF가 없는 것을 제외하고는 상기 (6-1)에서 사용한 배지와 동일한 배지를 이용하였다. 하루가 경과한 후에, ES 세포 콜로니들은 부유하는 배아체(~50/디쉬)로 자라나기 시작하였다. 이 때, 배아체를 새로운 디쉬로 옮기면서 잔류하는 영양 세포들은 모두 제거하였다. 추가로 4일 동안 배양한 후에, 생성된 배아체는 (폴리오르니틴/라미닌으로 코팅된)접착성의 디쉬에 플레이트하였다.

(6-3) 네스틴-양성인 세포의 선별

접착성 디쉬에서 1일 동안 배양한 후에, 분화하는 배아체를 ITSF(인슐린:25μg/ml, 트랜스페린:100μg/ml, 소듐 셀레나이트:30nM 및 피브로넥틴:5μg/ml)로 보충된 DMEM/F12에 옮겨서 37℃에서 6일 동안 배양하였다. 이렇게 배양된 세포는 네스틴 항체(chemicon)를 0.01M PBS, 1% BSA, 5mM EDTA 함유 용액으로 1/1000로 희석한 용액에서 40분 동안 37℃에서 배양하였다. 새로운 상기 DMEM/F12 배지로 세정한 다음 세포들을 피코에리스린(phycoerythrine, PE)-접합된 이차 항체(Chemicon, Temecula, CA, U.S.A.)로 추가로 30분 동안 배양한 후 새로운 상기 DMEM/F12 배지로 3차례 세정하여 네스틴-양성 세포를 선별하였다.

(6-4) 네스틴-양성 세포의 확장(expansion)

상기 실시예 (6-3)에서 선별된 네스틴-양성 세포를 N-2 보충제, 라미닌(1ng/ml), bFGF(10ng/ml)로 보충된 DMEM/F12 배지에서 6일 동안 배양함으로써, 확장하였다.

(6-5) 신경 전구세포로의 분화

그런 다음, 네스틴-양성인 세포들을, bFGF를 제거하고 N-2 보충제 및 라미닌(1ng/ml)으로 보충된 DMEM/F12 배지에서 10일 동안 37℃에서 배양하여 분화를 유도하였다.

본 발명에 따른 자가 핵이식란으로부터 유래한 줄기 세포에서 분화된 신경 전구세포를 도 2에 나타내었다.

본 발명은 상기 특정 구체예에 관하여 기술되었으나, 첨부된 특허청구범위에 의해 정의된 발명의 범위 내에서 당업자들에 의해서 다양한 변형 및 변경이 행해질 수 있음은 자명한 것이다.

기탁된 미생물 또는 다른 생물학적 물질에 관한 언급

Claims

인간의 체세포의 핵을 탈핵된 인간 난자에 이식함으로써 얻어진 핵이식란으로부터 유래된 배아 줄기 세포.
제1항에 있어서, 수탁번호 제 KCLRF-BP-00092호로 기탁된 세포주인 것을 특징으로 하는 배아 줄기 세포.
하기 단계들을 포함하는 배아 줄기 세포주의 제조방법:

(1) 인간의 체세포를 배양하여 공여핵 세포를 준비하는 단계;

(2) 인간 난자를 탈핵하여 수핵 난자를 준비하는 단계;

(3) 상기 공여핵 세포의 핵을 상기 수핵 난자에 이식하고, 상기 공여핵 세포의 핵과 상기 수핵 난자를 융합시킴으로써 핵이식란을 제조하는 단계;

(4) 상기 핵이식란을 리프로그래밍, 활성화 및 생체외 배양시켜 배반포를 형성하는 단계; 및

(5) 상기 배반포로부터 내세포괴를 분리하고, 상기 내세포괴를 미분화상태로 배양하여 배아 줄기 세포주를 확립하는 단계.
제3항에 있어서, 상기 배아 줄기 세포주는 수탁번호 제 KCLRF-BP-00092호로 기탁된 세포주인 것을 특징으로 하는 배아 줄기 세포주의 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 (4) 단계의 리프로그래밍은 20시간 이하의 시간동안 수행되는 것을 특징으로 하는 배아 줄기 세포주의 제조방법.
제 3항에 있어서, 상기 (4)단계의 리프로그래밍은 6시간 이하의 시간동안 수행되는 것을 특징으로 하는 배아 줄기 세포주의 제조방법.
제 3항에 있어서, 상기 (4)단계의 리프로그래밍은 3시간 이하의 시간동안 수행되는 것을 특징으로 하는 배아 줄기 세포주의 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 (4)단계의 리프로그래밍은 2시간 이하의 시간동안 수행되는 것을 특징으로 하는 배아 줄기 세포주의 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 (4)단계의 활성화는 상기 핵이식란을 칼슘 이온 운반체로 처리한 다음 6-디메틸아미노퓨린으로 처리하여 수행되는 것을 특징으로 하는 배아 줄기 세포주의 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 칼슘 이온 운반체의 농도는 5μM 내지 15μM인 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포의 제조방법.
제 9항에 있어서, 상기 칼슘 이온 운반체의 농도는 약 10μM인 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포의 제조방법.
제 9항에 있어서, 상기 6-디메틸아미노퓨린의 농도는 1.5mM 내지 2.5mM인 것을 특징으로 하는 배아 줄기 세포주의 제조방법.
제 9항에 있어서, 상기 6-디메틸아미노퓨린의 농도는 약 2.0mM인 것을 특징으로 하는 배아 줄기 세포주의 제조방법.
제 3항에 있어서, 상기 (4)단계의 생체외 배양은 적어도 둘 이상의 배지를 이용하여 연속적으로 수행되며, 상기 각 배지는 서로 다른 조성을 갖는 것임을 특징으로 하는 배아 줄기 세포주의 제조방법.
제 14항에 있어서, 상기 생체외 배양은 서로 다른 조성을 갖는 두 종류의 배지를 연속적으로 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 배아 줄기 세포주의 제조방법.
제 15항에 있어서, 상기 생체외 배양은 G1.2 배지 및 SNUnt-2 배지를 순차적으로 이용함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 배아 줄기 세포주의 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 (4) 단계는 20시간 이하의 시간동안 핵이식란을 리프로그래밍하고, 상기 핵이식란을 5μM 내지 15μM 농도의 칼슘 이온 운반체를 처리한 후 1.5mM 내지 2.5mM 농도의 6-디메틸아미노퓨린을 처리한 다음, G1.2 배지 및 SNUnt-2 배지에서 상기 핵이식란을 생체외 배양함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 배아 줄기 세포주의 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 내부 세포괴는 하기 단계들을 포함하는 방법에 의해 (5) 단계의 배반포로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 배아 줄기 세포주의 제조방법:

(1) 배반포로부터 투명대 또는 그 일부를 제거하는 단계; 및

(2) 그 결과된 배반포로부터 영양막을 제거하여 내부 세포괴를 분리하는 단계.
제3항에 있어서, 상기 (5) 단계의 내부 세포괴는 제1항에 따른 배아 줄기 세포주로부터 분화된 세포를 포함하는 영양 세포층 상에서 배양되는 것을 특징으로 하는 배아 줄기 세포주의 제조방법.
인간의 체세포 핵을 탈핵된 인간 난자로 이식함으로써 제조된 핵이식란으로부터 유래된 배아 줄기 세포주로부터 분화된 신경 전구세포.
제20항에 있어서, 상기 배아 줄기 세포주는 수탁번호 제 KCLRF-BP-00092호로 기탁된 것임을 특징으로 하는 신경 전구세포.
제20항의 신경 전구세포를 제조하는 방법으로서,

(1) 배아 줄기 세포주를 배양하여 배아체를(embryoid body)를 형성하는 단계;

(2) 상기 배아체를 상기 배아체의 세포를 신경 전구세포로 분화시키기에 적합한 제제의 존재하에 배양하는 단계; 및

(3) 신경 전구세포의 마커를 발현하는 세포를 선별 및 배양하여 신경 전구세포를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 신경 전구세포의 제조방법.
제22항에 있어서, 상기 배아 줄기 세포주는 수탁번호 제 KCLRF-BP-00092호로 기탁된 것임을 특징으로 하는 신경 전구세포의 제조방법.
제22항에 있어서, 상기 (2)단계의 제제는, 레티노산(Retinoic Acid); 아스코르브산(Ascorbic acid); 니코틴아마이드; N-2 보충제; B-27 보충제; 및 인슐린, 트랜스페린, 소디움 셀레나이트 및 피브로넥틴의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 신경 전구세포의 제조방법.
제3항의 (4) 단계에서의 생체외 배양을 수행하기 위해 사용하는 배지로서,

95 내지 110mM NaCl; 7.0 내지 7.5mM KCl; 20 내지 30mM NaHCO₃ _,;1.0 내지 1.5mM NaH₂PO₄; 3 내지 8mM 소디움 락테이트; 1.5 내지 2.0mM CaCl₂·2H₂O; 0.3 내지 0.8mM MgCl₂·6H₂O; 0.2 내지 0.4mM 소디움 파이루베이트; 1.2 내지 1.7mM 프럭토오즈; 6 내지 10㎎/㎖ 인간 혈청 알부민; 0.7 내지 0.8㎍/㎖ 카나마이신; 1.5 내지 3% 필수아미노산; 0.5 내지 1.5% 비필수아미노산; 0.7 내지 1.2mM L-글루타민; 및 0.3 내지 0.7%의 인슐린, 트랜스페린 및 소듐 셀레나이트의 혼합물을 포함하는 배지.
제25항에 있어서, 상기 배지는,

99.1 내지 106mM NaCl; 7.2mM KCl; 25mM NaHCO₃ _,;1.2mM NaH₂PO₄; 5mM 소디움 락테이트; 1.7mM CaCl₂·2H₂O; 0.5mM MgCl₂·6H₂O; 0.3mM 소디움 파이루베이트; 1.5 mM 프럭토오즈; 8㎎/㎖ 인간 혈청 알부민; 0.75㎍/㎖ 카나마이신; 2% 필수아미노산; 1% 비필수아미노산; 1mM L-글루타민; 및 0.5%의 인슐린, 트랜스페린 및 소듐 셀레나이트의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 배지.