CN1922307A - 胚胎干细胞系及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种从通过将人体细胞的细胞核移植入去核的人卵母细胞制备的核移植卵母细胞上衍生的胚胎干细胞系，可分化成各种希望的细胞类型。

Description

胚胎干细胞系及其制备方法
发明领域
本发明涉及胚胎干细胞系及其制备方法，更具体地说，涉及通过将人体细胞的细胞核转入去核的人卵母细胞、培养所得的核移植卵母细胞以形成胚泡、并培养分离自所述胚泡的内细胞团而制备的胚胎干细胞系，及其制备方法。
发明背景
干细胞通常指能分化成组成身体的所有类型的成熟功能细胞的未分化细胞。例如，造血干细胞能分化成多种血球细胞(corpuscularcell)。从胚胎衍生的胚胎干细胞(ES cell)具有分化和发育成形成身体的所有类型的器官、组织和细胞的多能性。
1981年构建的小鼠ES细胞系已经为培育人ES细胞提供了技术和范例。已经利用小鼠畸胎癌，即在相近育种(closely bred)的小鼠品系的生殖腺出现的肿瘤，研究了ES细胞的发育(Evans & Kaufman，Nature，292：154-156(1981))。
Bongso等人报道了对从衍生自体外受精的人胚胎分离的细胞进行短期培养和维持的方法(Bongso等，Human Reproduction，9：2110-2117(1994))。Bongso等人分离的细胞具有在多能干细胞中预期的形态学；然而，由于没有使用合适的饲养层(feeder layer)，它们显然不能被长期培养。
从猕猴和绒猴的胚泡中已经制备灵长类ES细胞。灵长类ES细胞是二倍体的，很类似于人ES细胞。
尽管就表型而言，来自猴和人类的ES细胞与小鼠的ES细胞有些不同，但是从猴和人制备的ES细胞的研究已经提示多能干细胞可以衍生自人胚泡(Thomson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：7844-7848(1995))。
1998年Thomson等人培育的人多能ES细胞特有的特征如下列所示(Thomson等，Science，282：1145-1147(1998))：
(1)表达阶段特异性胚胎抗原-3(SSEA-3)、阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)、肿瘤排斥抗原1-60(TRA-1-60)、肿瘤排斥抗原1-81(TRA-1-81)和碱性磷酸酶；
(2)高端粒酶活性；
(3)当注射入小鼠时，分化成三种类型的胚盘细胞；
(4)依赖于饲养细胞；和
(5)对人白血病抑制因子(hLIF)无应答。
Thomson等人从由一对在进行不育治疗的夫妇捐赠的胚泡获得上述ES细胞。具体地说，通过免疫手术(immunosurgically)除去已知抑制ES细胞形成的滋养外胚层，将内细胞团(inner cell mass，ICM)铺在衍生自小鼠胚胎的成纤维细胞饲养层，在短期的附着和扩展后，将ICM重铺在另一饲养层上。就培养基或培养系统而言，Thomson的方法并不明显异于小鼠ES细胞方案；并仍然获得相对较高的成功率。
人多能ES细胞的分离和在哺乳动物中体细胞核移植(SCNT)的突破(Solter，Nat.Rev.Genet.，1：199-207(2000))已经提高了实施人SCNT以生产实际上不受限制的未分化细胞的来源以用于研究的可能性，这种可能性在组织修复和移植药物中具有潜在应用。这个被称为“治疗性克隆”的概念利用了将体细胞的细胞核移植入去核的卵母细胞中(Lanza等，Nat.Med.，5：975-977(1999))。以前对这种治疗性克隆的研究涉及牛ES样细胞的生产(Cibelli等，Nat.Biotechnol.，16：642-646(1998))和来自被克隆胚泡的ICM的小鼠ES细胞的生产(Munsie等，Curr.Biol.，10：989-992(2000)；Wakayama等，Science，292：740-743(2001))，以及直至8至10细胞期的克隆人胚胎的发育(Cibelli等，J.Regen.Med.，2：25-31(2001))。
尽管一些报道指出使用非人哺乳动物的卵母细胞可建立ES细胞系，但仍未报道利用核移植技术从人卵母细胞培育出ES细胞系。
发明概述
然而，经过深入研究和开发工作，本发明人通过培养核移植的人卵母细胞已经成功建立ES细胞系。
因此，本发明的一个目的是提供一种从通过将人体细胞的细胞核移植入去核的人卵母细胞制备的核移植卵母细胞中衍生的ES细胞系。
本发明的另一个目的是提供一种制备ES细胞系的方法，包括步骤：
(1)培养人体细胞以制备核供体细胞；
(2)将人卵母细胞去核以制备受体卵母细胞；
(3)通过将所述核供体细胞的细胞核移植入所述受体卵母细胞并使核供体细胞的细胞核与受体卵母细胞融合来制备核移植卵母细胞；
(4)将所述核移植卵母细胞进行重新编程(reprogramming)、激活和体外培养以形成胚泡；和
(5)从所述胚泡分离ICM并在未分化状态培养ICM以建立ES细胞系。
本发明另外的目的是提供适于体外培养通过将人体细胞的细胞核移植入去核的人卵母细胞而制备的核移植卵母细胞的培养基。
本发明另一个目的是还提供分化自ES细胞系的神经细胞或神经祖细胞(neuro progenitor)，其中该ES细胞系衍生自通过将人体细胞的细胞核移植入去核的人卵母细胞而制备的核移植卵母细胞。
本发明另外目的是还提供一种制备分化自ES细胞系的神经祖细胞的方法，该ES细胞系衍生自通过将人体细胞的细胞核移植入去核的人卵母细胞而制备的核移植卵母细胞，所述方法包括步骤：
(1)培养ES细胞系以形成胚状体；
(2)在存在适于所述胚状体的细胞分化成神经祖细胞的活性物质时培养所述胚状体；和
(3)选择表达神经祖细胞的标记的细胞并培养所选择的细胞以获得神经祖细胞。
附图简述
通过下列本发明的说明书连同所跟随的附图将说明本发明的上述和其它目的及特征，其中：
图1显示根据本发明的衍生自核移植卵母细胞的ES细胞的未分化集落的照片(A：x100，B：x200)；
图2表示根据本发明从通过加入胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠和纤连蛋白混合物得到的未分化集落中分化的神经祖细胞的荧光染色照片(x400)；
图3描述用持定吸液管(1)和切割吸液管(2)切割处理卵母细胞(3)的透明带；
图4表示显示用持定吸液管(1)和切割吸液管(2)除去卵母细胞的第一极体和细胞核(3)的照片；
图5提供显示用持定吸液管(1)和转移吸液管(4)将核供体细胞移植入去核的受体卵母细胞(3)的照片；
图6A至6D图解概括衍生自根据本发明制备的核移植卵母细胞的ES细胞系的核型分析结果以及从一名女性获得的体细胞的核型分析结果，所述体细胞提供用于建立所述ES细胞系的细胞核；
图7显示在通过将根据本发明获得的未分化细胞集落注射入免疫缺陷型小鼠的生殖腺中而形成的畸胎瘤之中所鉴定的三种类型的胚盘细胞(A：软骨，B：肠道，C：神经管(A、B、C：x200))；和
图8提供确定来自根据本发明的ES细胞系的胚状体的形成的照片(A、B、C：内胚层；D、E、F：中胚层；G、H、I：外胚层；A：α-1-胎蛋白；B：细胞角蛋白；C：HNF-2-α；D：BMP-4；E：Myo D；F：结蛋白；G：神经丝；H：S-100；和I：NCAM)。
发明详述
本文所用的术语“核移植(nuclear transfer)”指将体细胞(或称为“核供体细胞”)的细胞核移植入去核的卵母细胞(或称为“受体卵母细胞”)的过程。通过核移植得到的细胞称为“移植细胞核的卵母细胞”或“核移植卵母细胞”。本文所用的术语“体细胞”指具有两组染色体(2n)并组成身体的任何细胞，但排除具有一组染色体(n)的生殖细胞。
本文所用的术语“自体核移植卵母细胞”指通过将体细胞的细胞核移植入去核的卵母细胞所得的移植细胞核的卵母细胞，其中所述体细胞从期望接受衍生自移植细胞核的卵母细胞的干细胞或从所述干细胞分化的特定细胞或组织的人中分离。
因此，本发明的一个突出优势或好处归于下列事实：接受衍生自自体核移植卵母细胞的特定细胞或组织的人将不会出现免疫排斥或遭受副作用，因为这样的细胞或组织携带该人的遗传特征。
术语“胚胎干细胞(ES细胞)”指衍生自胚胎的未分化细胞，其具有分化成各种类型成熟细胞的能力。本文中，“胚胎”指受精后直到八(8)周的受精卵或处于相应发育期的核移植卵母细胞。通过所述受精卵或核移植卵母细胞的反复分裂可制备包含含有ICM和滋养外胚层的胚泡的胚胎。
术语“衍生自自体核移植卵母细胞的ES细胞系”或“自体核移植的ES细胞系”指从自体核移植卵母细胞分离的ICM衍生的干细胞系。
术语“神经祖细胞”指可以分化成包括神经元和神经胶质，例如星形细胞、少突胶质细胞、神经膜细胞(schwann cell)、卫星细胞、室管膜细胞和小胶质在内的神经细胞的细胞。
根据本发明的一个方面，提供制备ES细胞系的方法，包括步骤：
(1)培养人体细胞以制备核供体细胞；
(2)将人卵母细胞去核以制备受体卵母细胞；
(3)通过将所述核供体细胞的细胞核移植入所述受体卵母细胞并使核供体细胞的细胞核与受体卵母细胞融合来制备核移植卵母细胞；
(4)将所述核移植卵母细胞进行重新编程、激活和体外培养以形成胚泡；和
(5)从所述胚泡分离ICM并在未分化状态培养ICM以建立ES细胞系。
在下文详细描述根据本发明制备ES细胞系的方法。
步骤1：核供体细胞的制备
培养人体细胞以作为核供体细胞。
来自人的体细胞作为所述的核供体细胞，并将其细胞核移植入去核的人卵母细胞。
对于体细胞的类型或来源并没有限制，只要它是来自于人，并且还可使用从为商业目的保藏人细胞的研究所获得的体细胞。优选示范性体细胞包括真皮细胞、神经细胞、卵丘细胞、输卵管上皮细胞，等等。
如果根据本发明制备自体核移植卵母细胞，从期望接受衍生自所述核移植卵母细胞的干细胞或从所述干细胞分化的特定细胞或组织的个体中采集核供体细胞。
通过用Mather和Barnes法(Animal Cell Culture Methods：vol.57of Methods in Cell Biology(Mather & Barneseds.，Academic Press，1998))培养体细胞以建立细胞系。
根据本发明的优选实施方案，将子宫液体和含有P/S抗生素(青霉素10,000IU，链霉素10mg)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)加到体细胞。离心并洗涤该体细胞，并在含有人血清、非必需氨基酸(NEAAs)和P/S抗生素的DMEM培养基中在例如39℃、5％CO2的环境下培养。
特别地，如果用卵丘细胞作为核供体细胞，可以通过用透明质酸酶处理卵丘-卵母细胞复合物以分离卵母细胞周围的卵丘细胞层、将胰蛋白酶-EDTA溶液加到所述卵丘细胞层并将所得溶液放置在例如饱和湿度下、39℃、5％CO2的环境中制备卵丘细胞。离心和洗涤后，在上述相同的条件下培养收集的卵丘细胞。
步骤2：受体卵母细胞的制备
本发明用到的受体卵母细胞指缺少其自身的细胞核并接受来自人体细胞的外源细胞核的卵母细胞。
可以通过从人卵巢收集超数排出的卵母细胞(superovulatedoocyte)或从为商业目的保藏人卵母细胞的研究所获得卵母细胞并用本领域公知方法培养卵母细胞，从而制备成熟的卵母细胞(Yuzpe等，J.Reprod.Med.，34：937-942(1989))。例如，通过在补充了5％人血清白蛋白(HSA)的购自瑞典歌德堡市Vitro Life公司的G1.2培养基中在例如5％CO2的条件下培养卵母细胞4小时，卵母细胞得到成熟。
然后，通过从卵母细胞周围除去卵丘细胞并去除透明带部分和含有第一极体的细胞质，以制备去核的受体卵母细胞。
根据本发明优选的实施方案，按如下实施去核过程。
将成熟卵母细胞置于含有透明质酸酶的洗涤溶液中，物理除去卵丘细胞。然后，用G1.2培养基洗涤成熟卵母细胞。随后，刺破卵母细胞的透明带以在其中形成一个小孔。从所述小孔除去含有第一极体的、相当于总细胞质的10至15％的细胞质部分，以使卵母细胞去核。去核后，用G1.2培养基洗涤去核的卵母细胞，并置于G1.2培养基中用于培养。
可以使用UV检测器检测用Hoechst 33342(Sigma Co.，St.Louis，MO，美国)染色的细胞质，以确认去核。
步骤3：核移植卵母细胞的制备和电融合
将步骤1制备的核供体细胞移植入步骤2中得到的去核受体卵母细胞，并通过电融合处理核移植卵母细胞。
通过将体细胞的细胞核或整个体细胞移植入受体卵母细胞，来实现体细胞到受体卵母细胞的核移植。
根据本发明的优选实施方案，按如下实施核移植和电融合。
首先，用G1.2培养基洗涤去核的卵母细胞。在植物凝集素-P(PHA-P)溶液中，使用转移吸液管(transfer pipette)将核供体细胞经过透明带中形成的小孔注射入去核的卵母细胞，以生成核移植卵母细胞。然后，用G1.2培养基洗涤得到的核移植卵母细胞，并置于相同的培养基中。
随后，在细胞操作器(cell manipulator)的帮助下将核移植卵母细胞进行电融合处理。将甘露醇溶液加入含有核移植卵母细胞的G1.2培养基。将所得的含有核移植卵母细胞的甘露醇溶液置于细胞操作器的两电极之间，并放在适当的位置使得核供体细胞朝向(+)电极。用间隔例如1秒、每次10至15μs的0.75至2.00kV/cm范围的直流电处理1至5次，进行电融合核移植卵母细胞。
用甘露醇溶液和G1.2培养基洗涤融合的核移植卵母细胞。该步骤用到的甘露醇溶液通过将牛血清白蛋白(BSA)和甘露醇溶解在pH范围7.2至7.4的4-(2-羟乙基)-1-甲呱丙嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液中制备。
步骤4：核移植卵母细胞的重新编程、激活和体外培养
为使步骤3中制备的核移植卵母细胞经历如同由于精子和卵母细胞之间的融合形成的普通受精卵母细胞一样的发育过程，应审慎选择一些重要因素，如重新编程时间、激活方法和体外培养条件。
本发明提供有益于激活和培养核移植卵母细胞的独特受精和发育方法。具体地说，将步骤3中电融合制备的核移植卵母细胞进行重新编程、激活和体外培养以形成胚泡。
重新编程时间(reprogramming time)是指电融合和激活之间经过的时间，重新编程的时长可影响核移植卵母细胞的发育能力(具体地说，胚泡形成率)。要求该重新编程时间允许体细胞的基因表达模式变成核移植卵母细胞发育所适宜的和必需的模式。所述的重新编程时间在染色质重塑(chromatin remodeling)中起决定作用，且已知它可决定核移植卵母细胞在体内和体外的发育能力。
本发明的重新编程时间可以是20小时或更低，优选是6小时或更低，更优选是3小时或更低，并且最优选是约2小时。
重新编程后，可以通过各种化学、物理和机械刺激例如钙离子载体、离子霉素、乙醇、Tyrode溶液(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，美国)、嘌呤霉素等等来激活核移植卵母细胞。本发明中，优选通过钙离子载体处理核移植卵母细胞以用于激活。更优选用钙离子载体并随后用6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)处理核移植卵母细胞。特别地，使用浓度范围5至15μM的、优选约10μM的钙离子载体。此外，使用浓度范围1.5至2.5mM的、优选约2.0mM的6-DMAP。如果钙离子载体和6-DMAP的浓度在以上各自范围中，可以有效地激活核移植卵母细胞。优选钙离子载体和6-DMAP都溶于体外培养基中。
体外培养基的代表性实例是包含NaCl、KCl、NaHCO3、NaH2PO4、CaCl2、乳酸钠、葡萄糖、酚红、BSA、卡那霉素、必需氨基酸(EAAs)、NEAAs和谷氨酸盐的G1.2培养基(Vitro Life，Goteborg，瑞典)。
另外，为了核移植卵母细胞的有效体外培养，优选在培养基中补充本领域已知的多种能量底物或采用使用了具有适于胚胎发育各个时期的不同组成的至少两种培养基的连续培养系统。本发明中有用的连续培养系统可以是任何一种可商购的培养系统。优选地，通过连续使用彼此具有不同组成的两种培养基例如G 1.2和G 2.2培养基(VitroLife，Goteborg，瑞典)实施所述体外培养。
所述体外培养基优选含有具有氨基酸的人改良的合成输卵管液体(hmSOFaa)，称其为“SNUnt-2培养基”。通过对具有氨基酸的改良合成输卵管流体(mSOFaa)(Choi等，Theriogenology，58：1187-1197(2002))分别补充HSA和果糖而不是BSA和葡萄糖制备hmSOFaa。mSOFaa培养基已经广泛用于培养牛胚。
特别地，SNUnt-2培养基包含95至110mM NaCl、7.0至7.5mMKCl、20至30mM NaHCO3、1.0至1.5mM NaH2PO4、3至8mM乳酸钠、1.5至2.0mM CaCl2·2H2O、0.3至0.8mM MgCl2·6H2O、0.2至0.4mM丙酮酸钠、1.2至1.7mM果糖、6至10mg/ml人血清白蛋白、0.7至0.8μg/ml卡那霉素、1.5至3％EAAs、0.5至1.5％NEAAs、0.7至1.2mM L-谷氨酸盐，以及0.3至0.7％的胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠混合物。优选地，SNUnt-2培养基包含如表1所列的成分。
               表1
  成分   浓度
  NaCl   99.1～106mM
  KCl   7.2mM
  NaHCO3   25mM
  NaH2PO4   1.2mM
  乳酸钠   5mM
  CaCl2·2H2O   1.7mM
  MgCl2·6H2O   0.5mM
  丙酮酸钠   0.3mM
  果糖   1.5mM
  HSA   8mg/ml
  卡那霉素；   0.75μg/ml
  EAAs   2％
  NEAAs   1％
  L-谷氨酸盐   1mM
  ITS*   0.5％
*ITS：1.0g/L胰岛素、0.55g/L转铁蛋白和0.67mg/L亚硒酸钠的混合物。
本发明的连续培养系统可采用不同培养基的任意组合。例如，在两步培养系统中，在G 1.2培养基中进行第一次培养，在SNUnt-2培养基中进行第二次培养。
步骤5：除去透明带或其部分
为了获得衍生自步骤4中得到的胚泡的ES细胞，不得不从胚泡上除去透明带或其部分。可以通过用本领域已知的方法例如链霉蛋白酶处理、在酸性Tyrode溶液中温育，或物理方法例如激光切割实施该除去过程。优选使用溶于适宜培养基例如PBS、G2培养基(Vitro Life，Goteborg，瑞典)或S2培养基(Scandinavian IVF Sciences，Goteborg，瑞典)中的链霉蛋白酶。在优选的实施方案中，将链霉蛋白酶溶于等体积的PBS和S2培养基的混合物中。用0.1％链霉蛋白酶处理胚泡约1至2分钟，优选1至1.5分钟，以除去其中的透明带。
步骤6：滋养层的去除和ICM的分离
如上所述一旦从胚泡除去透明带，便露出滋养层。优选从ICM完全分离滋养层。使用本领域中一种已知方法，例如利用抗体的免疫手术法，或使用吸液管的机械方法从ICM分离滋养层。
在优选的实施方案中，通过免疫手术法除去滋养层，其使用相应于滋养层表面的抗原的抗体处理滋养层。更优选地是联合补体处理来实施免疫手术。如果这样，可独立或同时使用抗体和补体。在抗体和补体之间的优选组合可包括抗胎盘碱性磷酸酶抗体(anti-AP)和幼兔补体，或抗人血清抗体和豚鼠补体。
用适宜的培养基例如SNUnt-2、G2.2或S2培养基稀释抗体和补体。优选地，可以用S2培养基以1∶20比例稀释抗-AP；且以1∶1比例稀释其它抗体和补体。
优选用抗体并随后用补体处理被除去透明带的胚泡。优选地，用抗体处理胚泡约30分钟，用适宜的培养基洗涤，如NUnt-2、G2.2和S2培养基，然后用补体处理约30分钟。
此外，通过用适宜的培养基例如NUnt-2、G2.2或S2洗涤胚泡，以从胚泡除去滋养层或其部分。如果这样，可通过本领域已知的机械方法如使用小口径的吸液管吸取含有滋养层的溶液除去滋养层。
通过这些步骤，从胚泡除去滋养层；并获得ICM，即其中的剩余部分。
步骤7：在成纤维细胞饲养层上培养ICMs
由于当在成纤维细胞饲养层上进行培养时ICMs可维持它们的未分化状态，所以将步骤6中分离的ICMs培养在成纤维细胞饲养层上。有时候，人们提出hLIF可用于替代饲养层维持ICMs的未分化形态。然而，不使用成纤维细胞饲养层而维持人细胞的未分化状态实际上是不可能的。因此，不诱导ES细胞胚外分化和凋亡的条件通常要求在成纤维细胞饲养层上培养。
优选采用小鼠源和/或人源成纤维细胞用于制备成纤维细胞饲养层。可单独或混和使用它们。更优选地使用从衍生自人自体核移植卵母细胞的ES细胞所分化的细胞作为饲养层(该饲养层被称为“自体饲养层”)。最优选地使用从衍生自个体的自体核移植卵母细胞的ES细胞所分化的成纤维细胞。使用所述饲养层细胞可防止其它外源细胞污染ES细胞。
当与鼠源成纤维细胞进行适当混和时，所述人源成纤维细胞能诱导ES细胞的最适生长和分化抑制。
成纤维细胞饲养层的细胞密度可影响其稳定性和能力。如果使用鼠和人成纤维细胞的混合物，则优选保持人成纤维细胞处于例如2.5×104细胞/cm2的密度和鼠成纤维细胞处于例如7.0×104细胞/cm2的密度。如果只使用鼠成纤维细胞，则优选使用密度范围7.5×104至1.0×104细胞/cm2的相同细胞。优选在向其中加入ES细胞之前6至48小时建立所述饲养层。
另外，优选使用具有低传代数的鼠或人成纤维细胞。成纤维细胞的质量可影响支持ES细胞的能力。优选使用从胚胎分离的成纤维细胞。优选从13.5天龄胎获得鼠成纤维细胞，和优选从胚胎或胎组织获得人成纤维细胞。可以通过使用本领域已知的细胞培养法培养这些成纤维细胞。
在处理鼠胚胎成纤维细胞中，关键是尽量减少胰蛋白酶的使用并阻止细胞过密。否则，小鼠胚胎成纤维细胞不能支持未分化ES细胞的生长。不得不首先测试所制备的每批小鼠胚胎成纤维细胞以确定其是否适于支持和维持ES细胞。
在新的原始胚胎成纤维细胞和经受过冻融处理的成纤维细胞之间，通常认为前者是更适于支持ES细胞的恢复(renewal)。然而，即使在重复冻融后某些批次也表现出它们支持ES细胞的能力。
某些小鼠品种比其它品种可产生更适于支持ES细胞的胚胎成纤维细胞。例如，已经证实从通过近亲交配129/Sv或CBA品系或通过杂交129/Sv和C57/B16品系而生产的小鼠中衍生的成纤维细胞更适于支持ES细胞。
此外，优选通过使用本领域已知的任意一种方法包括辐射和化学处理来抑制饲养层细胞的生长。在优选的实施方案中，用丝裂霉素C处理所述细胞。
将由此制备的成纤维细胞饲养层培养在包被了明胶，优选0.1％明胶的培养皿上。
将成纤维细胞饲养层维持在ES培养基中。一种适宜的ES培养基是包含20％血清替代物、0.1mM β-巯基乙醇、1％NEAAs、2mM谷氨酸盐、100μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素以及4ng/ml人重组成纤维细胞生长因子(FGF)的DMEM/F12培养基。
另外，所述ES培养基可补充能刺激干细胞生长或生存或者能抑制其分化的可溶性生长因子。所述生长因子的代表性实例是人多能干细胞因子、ES细胞恢复因子，等等。
可以将分离的ICM培养6天或更久，并从中产生细胞克隆。所述克隆一般包括未分化的干细胞。可以通过用本领域中一种已知方法分离未分化的干细胞。优选使用微量吸液管以分离未分化的干细胞。可用无Ca2+/Mg2+的PBS培养基或利于细胞解离的酶例如分散酶处理来补充所述的机械分离。
步骤8：ES细胞的亚培养
将步骤7中培养的ES细胞从饲养层上分开，并转入新鲜的饲养层。然后，可以进一步培养ES细胞使其以形态学未分化状态繁殖。
如果这样，优选培养ES细胞5至7天。在培养的约第二天开始观察到未分化的干细胞集落。所述干细胞的明显特征是高细胞核与细胞质比例、清晰的核仁、稠密的克隆形成和可区别的细胞边缘。
通过从干细胞集落分离未分化的干细胞团，使得未分化干细胞开始繁殖。可以通过用本领域中一种已知方法例如化学或机械方法实施所述分离。优选地，通过用无Ca2+/Mg2+的PBS培养基洗涤、一种机械方法或其组合从所述集落分离干细胞。更优选从所述集落机械分离干细胞。
在优选的实施方案中，可用无Ca2+/Mg2+的PBS培养基减少细胞间的附着力。在以上培养基温育约15至20分钟后，细胞自身开始逐步从饲养层分开，并最终以具有预期大小的细胞团(clump)得以分离。如果证明所述细胞分离是不充分的，使用微量吸液管的尖锐边缘的机械方法可以更有效地用于分离和切割所述细胞团。
也可使用利用酶的化学方法。可单独使用或组合机械方法使用酶，优选分散酶。
在另一个优选的实施方案中，在机械切割集落后，通过用分散酶处理，有可能从所述集落分离细胞团。在含有Ca2+/Mg2+的PBS培养基中进行集落切割。在微量吸液管尖锐边缘的帮助下，可以将集落机械切割成细胞团，每个细胞团含有约100个细胞。一旦分离了细胞团，就用较宽口径的微量吸液管挑取细胞团，用含有Ca2+/Mg2+的PBS培养基洗涤，并转入新鲜的成纤维细胞饲养层。
需要确定在这些培养过程中干细胞是否维持它们的未分化状态。可以通过检查上述干细胞的典型形态学特有特征鉴定未分化干细胞。也可通过检测细胞标记或测量特异于多能细胞的基因表达鉴定所述干细胞。
特异于多能干细胞或典型谱系的基因的代表性实例包括但不限于可用作干细胞标记的碱性磷酸酶、Octamer-4(Oct-4)、SSEA-3和SSEA-4。特异于干细胞的其它示范性基因包括genesis、GDF-3和cripto。通过用本领域中一种已知方法，包括反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、分化基因表达法、微阵列分析等等，可分析这些基因的表达谱。
优选地，可以通过与人多能干细胞标记例如SSEA-4、生殖细胞肿瘤标记-2(GCTM-2)抗原、TRA-1-60等等进行免疫反应鉴定干细胞。特别地，干细胞可表达作为转录因子的Oct-4并维持正常的二倍体核型。
可以通过定量测量特异于干细胞的、分泌到培养基中的蛋白质，或通过用酶联免疫吸附测定法分析固定的细胞制备物而监控干细胞的生长进展和它们的分化或未分化状态的维持状况。特异于干细胞的蛋白质的代表性实例是可溶类型的CD抗原和GCTM-2抗原，并且可以通过检测细胞标记或测量基因表达监控这些蛋白质。
根据本发明的另一方面，从衍生自核移植卵母细胞的ES细胞系分化神经细胞或神经祖细胞，其中通过将人体细胞的细胞核移植入去核的人卵母细胞而制备所述核移植卵母细胞。
根据本发明的另外方面，提供了用于制备从衍生自核移植卵母细胞的ES细胞系分化的神经细胞或神经祖细胞的方法，其中通过将人体细胞的细胞核移植入去核的人卵母细胞而制备所述核移植卵母细胞，所述方法包括步骤：
(1)培养ES细胞系以形成胚状体；
(2)在存在适于所述胚状体的细胞分化成神经祖细胞的活性物质时培养所述胚状体；和
(3)筛选表达神经祖细胞标记的细胞并培养所筛选的细胞以获得神经祖细胞。
以下详细描述从ES细胞系制备神经祖细胞的发明方法。
步骤A：胚状体的制备
将衍生自核移植卵母细胞的ES细胞(称为“核移植胚胎干细胞”或“ntES细胞”)分化成神经祖细胞的第一个步骤是通过培养所述ES细胞产生胚状体。可以通过用本领域中一种已知方法(Zhang等，Nat.Biotechnol.，19：1129-1133(2001))从ES细胞制备所述胚状体。
在优选的实施方案中，通过将培养的ntES细胞集落转入含有补充了20％血清替代物的DMEM/F12培养基的非附着培养皿中并培养3至5天获得胚状体。一般地，在培养开始后约一天开始出现漂浮的胚状体(约40至60胚状体/皿)。这时，优选将所述胚状体转入新培养皿，同时除去任何剩余饲养细胞。然后，将所述胚状体置于包被了聚鸟氨酸/层粘连蛋白的附着培养皿中。
步骤B：通过一种活性物质诱导分化成神经祖细胞
本发明中可以使用的、用于诱导步骤A中得到的胚状体分化成神经祖细胞的代表性活性物质包括但不限于视黄酸；抗坏血酸；烟碱；N-2添加物(100X，17502-048；Gibco，Grand Island，NY，美国)；B-27添加物(50X，17504-044，Gibco，Grand Island，NY，美国)；以及胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠和纤连蛋白的混合物(ITSF)。通过在补充了这些活性物质的培养基中培养胚状体并诱导它们的扩展和分化，可制备分化自ntES细胞的神经祖细胞。
在优选的实施方案中，将步骤A制备的胚状体另外培养1天，随即在补充了ITSF，即胰岛素(约25μg/ml)、转铁蛋白(约100μg/ml)、亚硒酸钠(约30nM)和纤连蛋白(约5μg/ml)的DMEM/F12培养基中培养5至10天，从而诱导ntES细胞分化成神经祖细胞。
步骤C：选择和培养表达神经祖细胞标记的细胞
通过在步骤B中得到的分化细胞中选择表达神经祖细胞标记例如巢蛋白的细胞并且培养它们，可以得到分化自ntES细胞的神经祖细胞。
另外，可以将得到的神经祖细胞分化成所希望的特定类型的神经细胞。可以通过常规方法例如化学诱导等实现分化成神经细胞。
在优选的实施方案中，选择对神经祖细胞标记呈现阳性信号的细胞；通过在补充了N-2添加物、层粘连蛋白和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的DMEM/F12培养基中培养5至7天诱导所选择的细胞的扩展；并然后将它们在只补充了N-2添加物和层粘连蛋白的DMEM/F12培养基中另外培养8至14天。
众所周知ES细胞能分化成几乎任何类型的细胞。因此，本发明的ES细胞系可以是提供各种类型细胞的良好来源。例如，通过在适于细胞分化的条件下在培养基中培养，ES细胞可被诱导分化成造血细胞、神经细胞、β细胞、肌细胞、肝细胞、软骨细胞、上皮细胞等等。所述的培养基和条件是本领域中众所周知的。
因此，本发明的ES细胞系可以具有众多的治疗和诊断用途。特别地，所述的ES细胞系可用于多种疾病的细胞移植疗法，所述疾病例如糖尿病、帕金森氏症、阿耳茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、大脑性麻痹和癌症。另外，衍生自自体核移植卵母细胞的ES细胞系可有利地用于细胞移植疗法中，因为在治疗过程之中和之后不出现免疫排斥副作用。
下列实施例是用来进一步说明本发明而不是限制其范围。
除非另外指明，这些实施例所用的G1.2培养基或G1 ver.3培养基(Vitro Life，Goteborg，瑞典)补充了5％HSA。
实施例1：卵母细胞和核供体细胞的制备
通过身体和心理检查，仔细筛选志愿的卵母细胞提供者，并施用卵泡刺激素(FSH)以诱导超数排卵。
在对提供者施用人绒膜促性腺激素(hGG)后约36小时，回收卵丘-卵母细胞复合物(COC)并用恒温箱于37℃、5％CO2和饱和湿度下在G1.2培养基中培养40分钟。用0.1％(w/v)透明质酸酶(Sigma Co.，St.Louis，MO，美国)将所述的COC处理1小时，以分散卵丘细胞。
通过从COC分离所述卵丘细胞获得卵母细胞。通过开口吸液管分离所得到的卵丘细胞，并用G1.2培养基洗涤。选择这些形式上的直径范围在10至12mm的卵丘细胞作为核供体细胞。
实施例2：卵母细胞的去核和细胞融合
将实施例1中得到的卵母细胞之一在G1.2培养基中培养1至2小时，以便诱导其细胞核的成熟。此后，如下述实施去核、核移植及其电融合。
(2-1)卵母细胞的去核和来自体细胞的核移植
用G1.2培养基将卵母细胞洗涤一次。将所述卵母细胞转入透明质酸酶溶液，其通过将1ml G1.2培养基与111μl溶液混合制得，其中0.05g透明质酸酶溶解于5ml G1.2培养基中，并调整透明质酸酶浓度至0.1％(w/v)。剥去卵母细胞上的任何残留的卵丘细胞，用G1.2培养基洗涤3次并置于相同的培养基中。然后，将卵母细胞转入细胞松弛素B溶液，其通过将补充了10％胎牛血清(FBS)的G1.2培养基与在二甲基亚砜中溶解细胞松弛素直至浓度7.5μg/ml的1μl溶液混和而制备。通过显微操作器切割卵母细胞的透明带以形成小孔，并通过从小孔除去含有第一极体的、相当于总细胞质的10至15％的细胞质部分使卵母细胞去核。
图3显示通过持定吸液管(holding pipette)(1)和切割吸液管(incision pipette)(2)对卵母细胞(3)的透明带的切割处理。图4显示从卵母细胞除去第一极体和细胞核的去核过程，其中通过位于卵母细胞下面的持定吸液管(1)持定具有竖直方位开口的卵母细胞，然后通过切割吸液管(2)轻压卵母细胞，以将其去核。用G1.2培养基将所述的去核的卵母细胞洗涤三次并置于相同的培养基中。
随后，用持定吸液管和转移吸液管将补充了1％BSA的4μl PBS液滴中的核供体细胞移植入通过混合400μl G1.2培养基与100μlPHA-P溶液而制备的4μl溶液液滴中的去核卵母细胞，其中在10mlG1.2培养基中溶解5mg PHA-P制备所述PHA-P溶液。用矿物油包被含有核供体细胞和去核卵母细胞的液滴，以防止液滴的蒸发。
图5描述用于将核供体细胞移植入去核卵母细胞的过程。如图5所示，将去核卵母细胞(3)固定在持定吸液管(1)，通过小孔将转移吸液管(transfer pipette)(4)刺入卵母细胞(3)，并随后将核供体细胞注射入去核的卵母细胞(3)以获得核移植卵母细胞。用G1.2培养基洗涤该核移植卵母细胞三次，并置于相同的培养基。
(2-2)通过电融合制备核移植卵母细胞
通过BTX-电细胞操作器(BTX Inc.，San Diego，CA，美国)将核移植卵母细胞进行电融合。
制备20μl甘露醇溶液液滴(其通过将0.1mM MgSO4、0.05％BSA和0.28mM甘露醇溶于0.5mM HEPES缓冲液(pH 7.2)进行制备)、20μl含有10μl G1.2培养基和10μl上述甘露醇溶液的混和液滴以及20μlG1.2培养基液滴。
首先，将实施例(2-1)得到的核移植卵母细胞在20μl混和溶液液滴中温育1分钟。然后，将核移植卵母细胞通过开口吸液管转入20μl甘露醇溶液液滴并在其中温育1分钟。随后，将核移植卵母细胞转入具有上述组分的甘露醇溶液，并置于连接BTX电细胞操作器的两电极之间，并放在适当的位置使得核供体细胞朝向(+)电极。通过施加间隔1秒的、每次15μs的1kV/cm的两次直流电，使核移植卵母细胞电融合。
将融合的核移植卵母细胞在20μl混和溶液液滴中温育1分钟，转入20μl G1.2培养基液滴中并随后用G1.2培养基洗涤三次。
实施例3：核移植卵母细胞的重新编程、激活和体外培养
由于在实施例2中得到的核移植卵母细胞缺乏作为正常胚胎发育中一个主要因素的精子介导的激活，因此需要人工刺激代替。因此为确定用于人工胚胎形成的最适条件，根据如表2至4所示的多种条件重新编程、激活和体外培养核移植卵母细胞。
首先，为检查重新编程时间对胚泡形成率的影响，分别设定重新编程时间为约2、4、6和20小时，同时如表2所示提供用于激活和体外培养的相同条件。结果，当重新编程时间约2小时，可得到最高的胚泡形成率。
                                          表2
  重新编程时间(小时) 激活条件   体外培养条件   卵母细胞编号  核移植卵母细胞发育成
  第一培养基   第二培养基  2细胞期的数目   桑葚胚的数目   胚泡的数目
  2   10μM离子载体*   2.0mM6-DMAP   G 1.2   SNUnt-2   16   16   4   4
  4   10μM离子载体*   2.0mM6-DMAP   G 1.2   SNUnt-2   16   15   1   0
  6   10μM离子载体*   2.0mM6-DMAP   G 1.2   SNUnt-2   16   15   1   1
  20   10μM离子载体*   2.0mM6-DMAP   G 1.2   SNUnt-2   16   9   1   0
*钙离子载体A23187
然后，为寻找胚泡形成的最适激活条件，如表3所示，在G1.2培养基中用钙离子载体A23187(5或10μM；Sigma Co.，St.Louis，MO，美国)或离子霉素(5或10μM，Sigma Co.，St.Louis，MO，美国)将进行了约2小时重新编程时间的核移植卵母细胞处理5分钟。用G1.2培养基将所述核移植卵母细胞洗涤几次，转入含有2.0mM6-DMAP(Sigma Co.，St.Louis，MO，美国)的G1.2培养基，并随后于37℃、5％CO2、5％O2和90％N2下培养4小时。在这些激活步骤后，根据相同条件体外培养该核移植卵母细胞。如表3所示，当用10μM钙离子载体和2.0mM 6-DMAP连续处理卵母细胞，可观测到最高的胚泡形成率。
                                        表3
  重新编程时间(小时)   激活条件   体外培养条件 卵母细胞编号  编号的核移植卵母细胞发育成
  第一培养基   第二培养基  2细胞期   桑葚胚   胚泡
  2   5μM离子载体*   2.0mM6-DMAP   G 1.2   SNUnt-2   16  11   0   0
  2   10μM离子载体*   2.0mM6-DMAP   G 1.2   SNUnt-2   16  16   5   3
  2   5μM离子载体*   2.0mM6-DMAP   G 1.2   SNUnt-2   16  9   0   0
  2   10μM离子载体*   2.0mM6-DMAP   G 1.2   SNUnt-2   16  12   0   0
*钙离子载体A23187
最后，如下确定最适的体外培养条件：用G1.2培养基剧烈洗涤经受上述最适重新编程和激活条件的核移植卵母细胞，并在10μl G1.2培养基或SUNnt-2培养基液滴中于37℃、5％CO2、5％O2和90％N2环境中培养48小时。所述培养后，将核移植卵母细胞转入新鲜的SNUnt-2培养基或G2.2培养基并另外培养6天。体外培养的培养基的代表性实例是G2.2培养基(Vitro Life，Goteborg，瑞典)，包含丙氨酸、丙氨酰谷氨酸盐、精氨酸、天冬酰氨、天冬氨酸、氯化钙、泛酸钙、氯化胆碱、胱氨酸、叶酸、葡萄糖、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、人血清白蛋白、肌醇、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、硫酸镁、甲硫氨酸、烟碱、青霉素G、苯丙氨酸、氯化钾、脯氨酸、盐酸吡哆醛、核黄素、丝氨酸、碳酸氢钠、氯化钠、磷酸二氢钠、乳酸钠、丙酮酸钠、硫胺、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸和水。
如表4所示，当先将卵母细胞在G1.2培养基中并随后在SNUnt-2培养基中培养，可检测到最高的胚泡形成率。
                                         表4
  重新编程时间(小时)   激活条件   体外培养条件   卵母细胞编号  编号的核移植卵母细胞发育成
  第一培养基   第二培养基  2细胞期   桑葚胚   胚泡
  2   10μM离子载体*   2.0mM6-DMAP   G 1.2   SNUnt-2   16  16   4   3
  2   10μM离子载体*   2.0mM6-DMAP   G 1.2   G 2.2   16  16   0   0
  2   5μM离子载体*   2.0mM6-DMAP   SNUnt-2   SNUnt-2   16  16   0   0
*钙离子载体A23187
基于以上结果，通过将卵母细胞设定2小时重新编程、用10μM钙离子载体和2.0mM 6-DMAP的系列处理进行激活、以及在G1.2培养基和SNUnt-2培养基中连续培养，获得了核移植卵母细胞的最适胚胎形成。
根据以上最适条件，对其它66个核移植卵母细胞进行重新编程、激活和体外培养从而产生19个胚泡(相当于29％)。根据本发明的发育成胚泡的核移植卵母细胞的百分比与在牛(约25％)(Kwun等，Mol.Reprod.Dev.，65：167-174(2003))和猪(约26％)(Hyun等，Biol.Reprod，69：1060-1068(2003)；Kuhholzer等，Biol.Reprod，64：1635-1698(2004))中已建立的SCNT法中所观察到的百分比相当。
实施例4：除去透明带和滋养层，分离ICM
用0.1％链霉蛋白酶(Sigma Co.，St.Louis，MO，美国)将实施例3得到的胚泡处理1分钟以除去其透明带。然后，用100％抗人血清抗体(Sigma Co.，St.Louis，MO，美国)处理20分钟，并在37℃、5％CO2中暴露于10μl豚鼠补体(Life Technologies，Rockville，MD，美国)30分钟以除去其滋养层并从其分离ICM。
实施例5：培养ICM
将实施例4得到的ICM在包被了0.1％明胶的组织培养皿中培养，所述培养皿含有用丝裂霉素C失活的原代小鼠(C57BL品种)胚胎成纤维细胞的饲养层(7.5×104细胞/cm2)。将包含20％血清替代物、0.1mMβ-巯基乙醇、1％NEAAs、2mM谷氨酸盐、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM/F12培养基(Life Technologies，Rockville，MD，美国)和4ng/ml bFGF(Life Technologies，Rockville，MD，美国)用作培养基。
在培养ICM中的ES细胞的早期，将培养基补充hLIF(100单位/ml；Chemicon，Temecula，CA，美国)。进行培养超过6天直到出现未分化的ntES细胞集落。在所述集落形成后，每五或七天用微量吸液管从集落机械分离ntES细胞。
如此从通过将女性体细胞的细胞核移植入去核的人卵母细胞而制备的核移植卵母细胞中分离的ntES细胞被称为“hntES”，并根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约于2003年12月29日保藏在韩国细胞系研究联盟(Korean Cell Line ResearchFoundation，KCLRF；地址：首尔国立大学医学院癌症研究所，28，Yongon-dong，Chongno-gu，首尔110-744，大韩民国)，保藏号为KCLRF-BP-00092。
试验实施例1：通过核型分析鉴定实施例5中得到的人ntES细胞
用含有0.1mM Ca2+和0.1mM Mg2+的PBS洗涤实施例5中得到的未分化ntES细胞集落，用柠檬酸盐-丙酮-甲醛(混合体积比是25∶65∶8)于4℃固定1小时，并用含有0.1mM Ca2+和0.1mM Mg2+的PBS再次洗涤。通过AP试剂盒(Sigma Co.，St.Louis，MO，美国)确定ntES细胞的碱性磷酸酶活性。另外，为了鉴定ntES细胞上的特异表面抗原，通过用购自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA，美国)的单克隆抗体Oct-4(SC-5279)、购自Developmental Studies Hybridoma Bank(lowa City，IA，美国)的SSEA-1(MC480)、SSEA-3(MC631)和SSEA-4(MC813-70)、以及购自Chemicon(Temecula，CA，美国)的TRA-1-60和TRA-1-80作为一级抗体，来实施免疫组化分析。通过用含有生物素化二级抗体和亲和素-辣根过氧化物酶缀合物的Vectastatin ABC试剂盒(Vector laboratory，Burlingame，CA，美国)检测所述的一级抗体。
对于基因组DNA和人短串联重复序列(STR)标记，使用STRAMP FLSTR PROFILER试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA，美国)和ABI 310遗传自动分析仪(Applied Biosystems，Foster City，CA，美国)实施DNA指纹分析。结果如图6A至6D所示。
如图6A至6D所示，观察到从根据以上实施例1至5制备的核移植卵母细胞衍生的ntES细胞的核型与核供体细胞的核型相同。该结果表明本发明的ntES细胞已经真正地衍生自通过将女性体细胞的细胞核移植入去核的卵母细胞而制备的核移植卵母细胞而不是衍生自激活的单性生殖的卵母细胞。
试验实施例2：通过畸胎瘤分析法鉴定人ntES细胞
从培养皿分离实施例5中得到的未分化ntES细胞的100个集落，用1ml注射器注入SCID小鼠(韩国生物科学和生物技术研究所，韩国)的睾丸并培养8周。将由此形成的畸胎瘤进行石蜡固定并通过免疫组化分析法进行检测，以检查是否形成三种真皮细胞。结果如图7所示。
如图7所示，发现实施例5中得到的ntES细胞在睾丸中形成三种真皮细胞(软骨(A)：内胚层；肠道(B)：中胚层；神经管(C)：外胚层)。该结果表明所述ntES细胞是具有分化成各种组织能力的多能ES细胞。
试验实施例3：通过免疫组化分析检查胚状体形成
用0.1％胰蛋白酶/1mM EDTA处理实施例5中得到的人ntES细胞集落，以分离ntES细胞，然后将其转入塑料培养皿。在缺乏hLIF和bFGF的DMEM/DMEM F12培养基中将人ntES细胞培养14天。为了石蜡固定，将所述ntES细胞转入溶解于PBS的1％低融点温度的琼脂糖并冷却至42℃。通过溶解于PBS的4％多聚甲醛固定所得到的含有ntES细胞的固态琼脂糖，并包埋在石蜡中。将每个石蜡包埋细胞的6mm切片置于载玻片上并进行免疫组化分析。使用购自Zemed(South San Francisco，CA，美国)的α-1-胎蛋白(18-0003)、细胞角蛋白(18-0234)、结蛋白(18-0016)、神经丝(18-0171)和S-100(18-0046)和购自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA，美国)的HNF-2-alpha(SC-6556)、BMP-4(SC6896)、Myo D(SC-760)和NCAM(SC-7326)作为一级抗体。生物素化的抗兔、抗小鼠或抗山羊抗体被用作二级抗体，并通过链霉亲和素缀合的辣根过氧化物酶和二氨基联苯胺呈色检测所述反应。结果如图8所示。
如图8所示，根据实施例5中得到的ntES细胞表达内胚层的标记蛋白(即，α-1-胎蛋白(A)、细胞角蛋白(B)和HNF-2-α(C))、中胚层的标记蛋白(即，BMP-4(D)、Myo D(E)和结蛋白(F))和外胚层的标记蛋白(即，神经丝(G)、S-100(H)和NCAM(I))的事实，确定所述ntES细胞可形成胚状体。该结果表明本发明中得到的细胞落入ES细胞的范围内。
实施例6：分化成神经祖细胞
(6-1)未分化的ES细胞的扩展
将实施例5中得到的人未分化ntES细胞于37℃、5％CO2环境下培养在未激活细胞分裂的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上，所述饲养层包含在用2％明胶包被的培养平板中。该培养基由DMEM/F12(1∶1)、20％敲除(knock-out)血清替代物、0.1mM NEAA、0.1mM β-巯基乙醇、1mM L-谷氨酸盐、100U/ml青霉素G、100μg/ml链霉素和4ng/mlbFGF组成；并每日更换。
(6-2)胚状体的形成
收集以上培养的ntES细胞集落并于37℃、5％CO2环境中培养在非附着培养皿上。除其中省去4ng/ml bFGF之外，该培养基与实施例(6-1)中的相同。一天后，所述集落开始长成漂浮的胚状体(约50胚状体/皿)。此时，将胚状体转入新培养皿，同时完全除去任何剩余的饲养细胞。在另外培养4天后，将由此形成的胚状体置于包被了聚鸟氨酸/层粘连蛋白的附着皿上。
(6-3)选择巢蛋白阳性细胞
在附着皿上培养1天后，将处于分化过程中的胚状体转入补充了胰岛素(25μg/ml)、转铁蛋白(100μg/ml)、亚硒酸钠(30nM)和纤连蛋白(5μg/ml)的DMEM/F12培养基，并于37℃培养6天。将得到的细胞在用含0.01M PBS、1％BSA和5mM EDTA的溶液将抗巢蛋白抗体(Chemicon，Temecula，CA，美国)稀释了1000倍的溶液中于37℃培养40分钟。用DMEM/F12培养基洗涤所述细胞，用藻红蛋白(PE)缀合的二级抗体(Chemicon，Temecula，CA，美国)处理30分钟，并然后用DMEM/F12培养基洗涤三次，从而选择巢蛋白阳性细胞。
(6-4)巢蛋白阳性细胞的扩展
将实施例(6-3)中选择的巢蛋白阳性细胞在补充了N-2添加物、层粘连蛋白(1ng/ml)和bFGF(10ng/ml)的DMEM/F12培养基中于37℃培养6天以扩展这些细胞。
(6-5)分化成神经祖细胞
将实施例(6-4)中扩展的巢蛋白阳性细胞在补充了N-2添加物、层粘连蛋白(1ng/ml)但缺乏bFGF的DMEM/F12培养基中于37℃培养10天以诱导它们分化成神经祖细胞。
图2显示从核移植卵母细胞分化的神经祖细胞，其中通过将女性体细胞的细胞核移植入去核的人卵母细胞而制备所述核移植卵母细胞。
当就以上具体实施方案描述本发明时，应当理解本领域技术人员可对本发明进行各种修饰和改动，这也落入所附权利要求所限定的本
发明的范围内。
涉及微生物或其它生物材料的保藏证明
国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
                        国际表格
原始保藏的接受
                        按照细则7.1公布
收件人：黄禹锡
首尔国立大学动物医学院
San 56-1，Shillim-dong，Gwanak-gu，首尔151-742，韩国
  I.微生物鉴定
  保藏人给定的鉴定参考：hntES   国际保藏机构给定的保藏号：KCLRF-BP-00092
  II.科学描述和/或建议的分类学名称
  根据以上I鉴定的微生物具有：[×]A科学描述[×]A建议的分类学名称(符合的位置用叉号表示)
  III.接受和受理
  国际保藏机构受理2003年12月29日接受的根据以上I鉴定的微生物
  IV.国际保藏机构
  名称：韩国细胞系研究联盟主任   签名：日期：2004.1.31
 地址：首尔国立大学医学院癌症研究所，28，Yongon-dong，Chongno-gu，首尔110-744，韩国
表格：BP/4(KCLRF表格17)    单页

Claims (26)

1.一种从通过将人体细胞的细胞核移植入去核的人卵母细胞而制备的核移植卵母细胞衍生的胚胎干细胞系。
2.权利要求1所述的胚胎干细胞系，其是保藏号为KCLRF-BP-00092的细胞系。
3.一种制备胚胎干细胞系的方法，包括步骤：
(1)培养人体细胞以制备核供体细胞；
(2)将人卵母细胞去核以制备受体卵母细胞；
(3)通过将所述核供体细胞的细胞核移植入所述受体卵母细胞并使核供体细胞的细胞核与受体卵母细胞融合来制备核移植卵母细胞；
(4)将所述核移植卵母细胞进行重新编程、激活和体外培养以形成胚泡；和
(5)从所述胚泡分离内细胞团并在未分化状态培养所述内细胞团以建立胚胎干细胞系。
4.权利要求3所述的方法，其中所述胚胎干细胞系是保藏号为KCLRF-BP-00092的细胞系。
5.权利要求3所述的方法，其中步骤(4)的重新编程进行多至20小时的时间。
6.权利要求3所述的方法，其中步骤(4)的重新编程进行多至6小时的时间。
7.权利要求3所述的方法，其中步骤(4)的重新编程进行多至3小时的时间。
8.权利要求3所述的方法，其中步骤(4)的重新编程进行约2小时的时间。
9.权利要求3所述的方法，其中通过用钙离子载体并随后用6-二甲基氨基嘌呤处理核移植卵母细胞来实施步骤(4)中的激活。
10.权利要求9所述的方法，其中所述钙离子载体的浓度范围是5μM到15μM。
11.权利要求9所述的方法，其中所述钙离子载体的浓度是约10μM。
12.权利要求9所述的方法，其中所述6-二甲基氨基嘌呤的浓度范围是1.5mM到2.5mM。
13.权利要求9所述的方法，其中所述6-二甲基氨基嘌呤的浓度是约2.0mM。
14.权利要求3所述的方法，其中通过连续使用至少两种彼此具有不同组成的培养基实施步骤(4)中的体外培养。
15.权利要求14所述的方法，其中通过连续使用两种彼此具有不同组成的培养基实施体外培养。
16.权利要求15所述的方法，其中通过连续使用G1.2培养基和SNUnt-2培养基实施体外培养。
17.权利要求3所述的方法，其中通过对核移植卵母细胞进行多至20小时的重新编程、用浓度范围5μM至15μM的离子载体并随后用浓度范围1.5mM至2.5mM的6-二甲基氨基嘌呤处理、以及在G1.2培养基和SNUnt-2培养基中连续体外培养核移植卵母细胞实施步骤(4)。
18.权利要求3所述的方法，其中通过包括以下步骤的过程从步骤(5)中的胚泡分离内细胞团：
(1)从胚泡除去透明带或其部分；和
(2)通过从得到的胚泡除去滋养层分离内细胞团。
19.权利要求3所述的方法，其中在步骤(5)中将内细胞团在包含从权利要求1所述胚胎干细胞系分化的细胞的饲养层上培养。
20.一种从衍生自核移植卵母细胞的胚胎干细胞系所分化的神经祖细胞，其中通过将人体细胞的细胞核移植入去核的人卵母细胞而制备所述核移植卵母细胞。
21.权利要求20所述的神经祖细胞，其中所述胚胎干细胞系是保藏号为KCLRF-BP-00092的细胞系。
22.一种制备权利要求20所述的神经祖细胞的方法，包括步骤：
(1)培养胚胎干细胞系以形成胚状体；
(2)在存在适于所述胚状体的细胞分化成神经祖细胞的活性物质时培养所述胚状体；和
(3)选择表达神经祖细胞标记的细胞并培养选择的细胞以获得所述神经祖细胞。
23.权利要求22所述的方法，其中所述胚胎干细胞是保藏号为KCLRF-BP-00092的细胞系。
24.权利要求22所述的方法，其中步骤(2)中使用的活性物质选自视黄酸、抗坏血酸、烟碱、N-2添加物、B-27添加物、以及胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠和纤连蛋白的混合物。
25.一种用于实施权利要求3所述的步骤(4)中的体外培养的培养基，包含：95至110mM NaCl、7.0至7.5mM KCl、20至30mM NaHCO3、1.0至1.5mM NaH2PO4、3至8mM乳酸钠、1.5至2.0mM CaCl2·2H2O、0.3至0.8mM MgCl2·6H2O、0.2至0.4mM丙酮酸钠、1.2至1.7mM果糖、6至10mg/ml人血清白蛋白、0.7至0.8μg/ml卡那霉素、1.5至3％必需氨基酸、0.5至1.5％非必需氨基酸、0.7至1.2mM L-谷氨酸盐，以及0.3至0.7％的胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠的混合物。
26.权利要求25所述的培养基，其包含：99.1至116mM NaCl、7.2mM KCl、25mM NaHCO3、1.2mM NaH2PO4、5mM乳酸钠、1.7mMCaCl2·2H2O、0.5mM MgCl2·6H2O、0.3mM丙酮酸钠、1.5mM果糖、8mg/ml人血清白蛋白、0.75μg/ml卡那霉素、2％必需氨基酸、1％非必需氨基酸、1mM L-谷氨酸盐，以及0.5％的胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠的混合物。
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