CN1391605A - 多能细胞和细胞系的单雌生殖或单雄生殖产生,及其产生分化细胞和组织的用途 - Google Patents

多能细胞和细胞系的单雌生殖或单雄生殖产生,及其产生分化细胞和组织的用途 Download PDF

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Abstract

提供了由孤雌生殖的胚胎(特别是灵长类动物的)获得多能(胚胎干)细胞的方法。这些细胞可用于生产分化的细胞、组织和器官，特别是人和非人灵长类动物的细胞、组织和器官。

Description

多能细胞和细胞系的单雌生殖或单雄生殖产生， 及其产生分化细胞和组织的用途
                   发明领域
本发明提供一种产生多能哺乳动物细胞系和由它们衍生的分化细胞、组织和器官的新型方法。与以前报道的产生多能细胞的方法不同，所述多能细胞将通过单雌生殖或单雄生殖方法产生，即，其中由只含雄性或雌性来源的DNA、因而含有全部雌性来源的或雄性来源的DNA的卵母细胞衍生多能细胞的方法。在一个优选实施方案中，卵母细胞含有灵长类动物(如人)来源的雄性或雌性来源的DNA。
                   发明背景
排卵后，大多数哺乳动物的卵母细胞仍被阻止在减数分裂的第二个中期，并将最终退化，除非发生精子穿入。精子进入激活卵母细胞中的全系列事件，导致受精和新个体的发育。激活过程中卵母细胞中能被识别的最早改变是减数分裂的完成，没有第二极体，释放皮质颗粒。随后形成含有各自单倍体染色体组的雄性和雌性前核。DNA合成阶段在两组染色体缩短并一起出现于第一次分裂的有丝分裂纺锤体上之前发生。双细胞胚胎的核中二倍体染色体组复原后，完成受精。
然而，也已知在特定条件下(在受控条件下可在体内或在体外自发发生)，含有全部雄性或雌性来源的DNA的卵母细胞可能由于被激活而导致胚胎的产生。这种胚胎一般不发育为后代，而是在胚胎发育极早期停止发育。
含有全部雄性或雌性来源的DNA的卵母细胞的激活和胚胎的发育一般作为一种研究胚胎发育的方法。例如，含有全部雌性来源的DNA的卵母细胞的激活(没有雄配子的任何作用)和由它们产生胚胎被称为“孤雌生殖(parthenogenesis)”。该方法已经被许多研究人员使用，作为一种体外研究胚胎发育的方法。
孤雌生殖是一种单雌生殖(gynogenesis)。单雌生殖通常被定义为含有全部雌性DNA的卵母细胞被激活并产生胚胎的现象。单雌生殖包括孤雌生殖以及精子激活卵母细胞完成减数分裂、但不能为产生的胚胎提供任何遗传物质的激活方法。如在孤雌生殖中，激活的卵母细胞不含有雄性来源的DNA。然而，不同于孤雌生殖，雄配子起一定作用，即，刺激卵母细胞激活。
单雄生殖可以被认为是相对于单雌生殖。它是指含有完整雄性来源的DNA的卵母细胞的产生和激活，和由它们发育为胚胎。
通常，由含有全部雌性或雄性来源的DNA的卵母细胞产生的胚胎只发育到特定的点，然后停止发育。假设例如在保持减数分裂阻断时在老化的未受精卵母细胞的不稳定孤雌生殖胚胎情况下发生。事实上，孤雌生殖激活的卵母细胞可引起在完成减数分裂过程中发生的多种异常，这可导致不同遗传结构的胚胎的产生。
众所周知，哺乳动物卵母细胞(包括含有所有雄性或雌性来源的DNA的卵母细胞)的人工激活能用多种物质和化学刺激诱导。这些方法的实例在下表中列出。
                        表1
  能诱导哺乳动物卵母细胞激活的物理和化学刺激列表
    物理             化学
1.机械(a)刺穿(b)体外卵母细胞操作 1.酶胰蛋白酶、链霉蛋白酶、透明质酸酶2.渗透
2.热(a)冷却(b)加热 3.离子(a)二价阳离子(b)钙离子载体
3.电 4.麻醉剂(a)全身——乙醚、乙醇、戊巴比妥、氯仿、阿弗丁(b)局部——狄布卡因、丁卡因、利多卡因、普鲁卡因5.酚噻嗪、安定剂硫利达嗪、三氟拉嗪、氟奋乃静、氯丙嗪6.蛋白质合成抑制剂环己亚胺、嘌呤霉素7.磷酸化抑制剂(例如DMAP)8.Inisitol 1，4，5-三磷酸(Ins P3)
实际上，孤雌生殖卵母细胞的激活在文献中已经有很多报道。例如，Ware等人，Gamete Research，22：265-275(1989)讲述了利用Ca++、Mg++-H+离子载体(A23187)或电休克对牛卵母细胞进行孤雌生殖激活的能力。另外，Yang等人，Soc.Study Reprod.46：117(1992)讲述了利用环己亚胺和电脉冲处理对牛卵泡卵母细胞的激活。Graham C.F.，Biol.Rev.，49：399-422(1979)描述了现有的激活孤雌生殖哺乳动物胚胎的方法。此外，Matthew H.Kaufman，Prog.in Anat.，1：1-34，R.G.Harrison和R.L.Holmes编写，Cambridge Press，London，UK(1981)综述了孤雌生殖和激活方法。Ozil，Jean Pierre，Devel.109：117-127(1990)；Kubiak，Jacek，Devel.Biol.136：537-545(1989)；Onodera等人，Gamete Research，22：277-283(1989)；Siracusa等人，J.Embryol.Exp.Morphol.，43：157-166(1978)；和Szollosi等人，Chromosoma，100：339-354(1991)也公开了兔和小鼠卵母细胞的孤雌生殖激活。另外，Steinhardt等人，Nature，252：41-43(1974)和Whitaker，M.，Nature，342：636-639(1984)公开了未受精的海胆卵的激活。也报道了人卵母细胞的孤雌生殖激活。(参见，例如，De Sutter等人，J.Associated Reprod.Genet.，9(4)：328-336(1992))。
在生物学研究中，特别是在胚胎发育和参与卵母细胞激活的机理的研究中，通常知道这些人工卵母细胞激活方法的目的。
最近几年，许多研究小组的重要目的是确定可有效和重复产生多能或胚胎干细胞(ES细胞)和ES或多能细胞系的方法。ES细胞由于它们能产生任何分化细胞型的多能性因而是特别希望的。ES细胞也可用于生产嵌合动物，并作为体外模型用于分化研究，特别是对参与早期发育的基因的研究。
由早期植入前小鼠胚胎在体外产生胚胎干(ES)细胞系的方法众所周知。(参见，例如，Evans等人，Nature，29：154-156(1981)；Martin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：7634-7638(1981))。ES细胞能以未分化的状态传代，假定存在成纤维细胞饲养层(Evans等人，同上)或分化抑制来源(Smith等人，Dev.Biol.121：1-9(1987))。
以前报道ES细胞具有大量用途。例如，曾经报道ES细胞能用作分化的体外模型，特别是用于研究参与早期发育调节的基因。小鼠ES细胞当导入植入前小鼠胚胎中时能产生种系嵌合体，从而证明了它们的多能性(Bradley等人，Nature，309：255-256(1984))。
由于它们能将基因组传递给下一代的能力，ES细胞具有利用含或不含希望的遗传修饰的ES细胞对家畜进行种系操作的潜在用途。而且，对于家畜如有蹄类动物，来自植入前家畜胚胎的核支持去核卵母细胞发育(Smith等人，Biol.Reprod.，40：1027-1035(1989)；Keefer等人，Biol.Reprod.，50：935-939(1994))。这不同于来自小鼠胚胎的核，据报道后者在转移后超过8细胞阶段之外不支持去核卵母细胞的发育(Cheong等人，Biol.Reprod.，48：958(1993))。因此，来自家畜的ES细胞是特别希望的，因为它们可以为核移植方法提供遗传操作的或其它的全能供体核的潜在来源。
一些研究小组报道了所说的多能胚胎细胞系的分离。例如，Notarianni等人，J.Reprod.Fert.Suppl.43：255-260(1991)报道了所说的来自猪和绵羊胚泡的稳定、多能细胞系的建立，它们显示与从绵羊胚泡中免疫手术分离的内细胞团初级培养物细胞相似的形态和生长特征。Notarianni等人，J.Reprod.Fert.Suppl.41：51-56(1990)也公开了来自猪胚泡的推断多能胚胎细胞系的培养保存和分化。Gerfen等人，Anim.Biotech，6(1)：1-14(1995)公开了从猪胚泡中分离胚胎细胞系。这些细胞在不使用条件培养基的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层中稳定保存，据报道在培养中可分化为几种不同的细胞型。
此外，Saito等人，Roux’s Arch.Dev.Biol.，201：134-141(1992)报道了培养的牛胚胎干细胞样细胞系，它们经三次传代仍存活，但在第四次传代后死亡。Handyside等人，Roux’s Arch.Dev.Biol.，196：185-190(1987)公开了在允许分离来自小鼠ICM的小鼠ES细胞系的条件下，免疫手术分离的羊胚胎内细胞团的培养。Handyside等人报道，在这些条件下，羊ICM附着、扩散并扩大ES细胞样和内胚层样细胞的面积，但在延长培养后，只有内胚层样细胞是明显的。
Cherny等人，Theriogenology，41：175(1994)报道了长期培养保存的多能牛原始生殖细胞衍生的细胞系。这些细胞在培养约7天后产生ES样集落，它们对碱性磷酸酶(AP)染色阳性，显示可形成胚状体的能力，并且自发分化为至少两种不同的细胞型。据报道这些细胞也表达转录因子OCT4、OCT6和HES1的mRNA，这是被认为只由ES细胞表达的同源框基因的一种模式。
Campbell等人，Nature，380：64-68(1996)报道了通过培养的胚盘(ED)细胞的核移植产生活的羔羊，胚盘细胞来自在促进小鼠ES细胞系分离的条件下培养的第9天绵羊胚胎。作者的结论是通过核移植来自第9天绵羊胚胎的ED细胞是全能的，并且这种全能性在培养中保持。
Van Stekelenburg-Hamers等人，Mol.Reprod.Dev.，40：444-454(1995)报道了从牛胚泡内细胞团中分离和表征所述永久细胞系。作者在不同条件下从第8或第9天的牛胚泡中分离并培养了ICM，以确定哪些饲养细胞和培养基最有效地支持牛ICM细胞的附着和生长。它们的结论是，使用STO(小鼠成纤维细胞)饲养细胞(代替牛子宫上皮细胞)和使用活性炭-清除的血清(而不是正常血清)补充培养基能提高培养的ICM细胞的附着和生长。但是，Van Stekelenburg等人报道，他们的细胞系类似于上皮细胞胜过多能ICM细胞。
Smith等人于1994年10月27日公开的WO94/24274、Evans等人于1990年4月5日公开的WO90/03432和Wheeler等人于1994年11月24日公开的WO94/26889报道了据说可用来获得转基因动物的动物干细胞的分离、选择和繁殖。Evans等人也报道了由猪和牛种衍生所述多能胚胎干细胞，它们据说可用于生产转基因动物。此外，Wheeler等人于1994年11月24日公开的WO94/26884公开了据称可用于生产嵌合和转基因有蹄类动物的胚胎干细胞。然而，据发明者所知，这项工作从未在任何同行审查的杂志中报道过。
最近，两个研究小组同时报道了纯化非人灵长类动物和人ES细胞的产生。这些ES细胞系来源于非人灵长类动物和人胚胎。这些ES细胞系据报道是SSEA-1阴性、SSEA-4和SEA-3阳性、TRA-1-60和TR-A-1-81阳性、碱性磷酸酶阳性的，可发育为所有三种胚胎胚层(内胚层、中胚层和外胚层)，甚至在长期培养后仍保持正常核型，并在体外以未分化状态无限增殖。
也是最近，马萨诸塞州大学和Advanced Cell Technology的一群科学家报道了通过将人分化细胞的核种间移植到牛卵母细胞中产生“人胚胎”，和它们在生产人ES细胞中的潜在用途。但是，尽管已经报道，但获得ES细胞的改良方法和在体外无限期保存这些细胞的方法将是非常有用的。
                         发明目的
因此，本发明的一个目的在于提供一种产生多能细胞和细胞系(即ES细胞)的新型方法。
更具体而言，本发明的一个目的在于提供一种获得含有雌性来源的或雄性来源的DNA的多能细胞或细胞系的方法。
再更具体而言，本发明的一个目的在于提供一种获得含有灵长类动物雌性来源的或雄性来源的DNA、人源雄性或雌性DNA的多能细胞或细胞系的方法。
与之相关，本发明的一个目的在于提供与雄性或雌性供体(例如人供体)等基因的多能细胞或细胞系。
另外，本发明的一个目的在于利用含有全部雌性来源或雄性来源的DNA的多能细胞生产分化的细胞、组织和器官。
本发明的一个相关目的在于使用多能细胞或细胞系，优选地人多能细胞或细胞系，通过诱导含有全部雄性或雌性来源的DNA的多能细胞或细胞系分化，产生灵长类动物、优选地人的分化细胞、组织或器官。
此外，本发明的一个目的在于使用含有全部雌性来源的或雄性来源的DNA的多能细胞产生嵌合动物。
本发明的另一个更具体的目的是通过下列方法产生含有全部雄性来源的或雌性来源的DNA的多能细胞：
(i)产生一种优选地处于中期II的细胞，优选地含有全部雄性或雌性来源的DNA的卵母细胞或卵裂球；
(ii)在(1)不导致第二极体排出或(2)抑制极体排出或(3)抑制第一次分裂事件的条件下激活该卵母细胞或卵裂球；从而产生含有雄性或雌性来源的DNA二倍体的活化卵母细胞；
(iii)在可产生含有滋养外胚层和内细胞团的胚胎的条件下培养产生的活化卵母细胞或卵裂球；和
(iv)在可使这些细胞保持未分化、多能状态的条件下体外培养来源于所述内细胞团的细胞。
本发明的另一个更具体的目的是通过下列方法产生含有全部雄性来源的或雌性来源的DNA的多能细胞：
(i)移植含有两个雄性或雌性来源的单倍体核的去核卵母细胞或卵裂球；
(ii)激活该卵母细胞或卵裂球；
(iii)在可产生含有滋养外胚层和内细胞团的胚胎的条件下培养所述激活的卵母细胞或卵裂球；和
(iv)在可使这些细胞保持未分化、多能状态的条件下体外培养由所述内细胞团获得的细胞。
本发明的另一个目的在于：(i)利用上述任何方法产生含有全部雄性或雌性来源的DNA的胚胎，它含有可辨别的内细胞团和滋养外胚层；(ii)选择来自内细胞团的细胞，或从内细胞团中分离并在可使这些细胞保持未分化、多能状态的条件下培养的细胞；和(iii)证实这些选择的细胞的多能性。
这可通过多种方法实现，例如：检测多能性特有的特定分子标记物的存在；用所述细胞产生嵌合动物，并通过注射到SCID小鼠中检测该细胞对嵌合动物的不同细胞的遗传作用，并观察不同分化细胞型的产生；观察这些细胞在组织培养中分化为胚状体和其它类型的分化细胞。
本发明的另一个目的在于提供理论上无限的等基因多能细胞的供应，方法是：(i)产生一种由全部雄性或雌性DNA衍生的胚胎，它含有可辨别的滋养外胚层和内细胞团；(ii)在可使细胞保持多能、未分化状态的条件下培养该胚胎的至少内细胞团或其部分。这优选地通过在使这些细胞或内细胞团保持与饲养层(例如胎成纤维细胞)接触的条件下培养内细胞团或其部分来实现。当需要使这些细胞保持希望的多能状态时，将这些培养的多能细胞转移到新饲养层上。
本发明的另一个目的在于产生含有希望的DNA修饰的多能细胞。这可通过产生含有全部雄性或雌性来源的DNA的卵母细胞实现，其中该DNA含有希望的修饰；在产生具有可辨别的滋养外胚层和内细胞团的胚胎的条件下激活这些卵母细胞；在抑制分化并使细胞保持含有希望的DNA修饰的多能状态的条件下培养来自该内细胞团的细胞或整个细胞团。
本发明的另一目的在于产生含有希望的DNA修饰的分化细胞或组织，包括：
(i)产生含有全部雄性或雌性雌性来源的DNA的卵母细胞，其DNA含有至少一种修饰；
(ii)在产生含有可辨别的滋养外胚层和内细胞团的胚胎的条件下激活该卵母细胞；
(iii)在使这些细胞保持未分化、多能状态的条件下培养至少该内细胞团或其部分；和
(iv)利用培养的细胞产生含有至少一种DNA修饰的分化细胞。这能如下实现：改变细胞培养方法，例如加入促进分化的生长因子；取出饲养层，注射到合适的动物如SCID小鼠中，由此由该细胞体内产生分化的细胞和/或组织；或利用它们产生一种嵌合动物或胎，其含有表达雄性或雌性DNA的基因型的分化细胞，含有至少一种DNA修饰。
本发明的另一个目的在于提供含有任选地可被遗传修饰的多能细胞的细胞培养物，其中该多能细胞来源于利用单雄生殖或单雌生殖方法产生的胚胎。
本发明的另一个目的在于提供由多能细胞衍生的分化细胞和组织，多能细胞本身来源于利用单雄生殖或单雌生殖方法产生的胚胎。
本发明的另一个目的在于使用任选地可被遗传修饰的所述多能细胞或其衍生的分化细胞，用于细胞和基因治疗，组织和器官移植，或用于研究胚胎发育和分化。例如，能实现特定DNA修饰对胚胎发育或特定类型的分化细胞的影响。
本发明的另一个目的是利用可诱导多能细胞分化为特定分化细胞型的激素、细胞因子和生长因子的不同组合及其比例，培养根据本发明产生的多能细胞和细胞系。
本发明的另一个目的在于用根据本发明产生的多能细胞或由它们产生的分化细胞作为核移植的核供体，产生具有特定基因型的克隆动物。
本发明的另一个目的在于利用来自具有希望的特征(如优选的农业特征)的动物的精子或卵母细胞，产生多能细胞和细胞系。这些多能细胞或分化细胞可用作核移植供体。
本发明的另一个目的在于提供一种新型商业方法，利用产生的精子或卵母细胞产生具有希望的基因型的克隆农畜，用于产生具有相同基因型的多能细胞或细胞系。
本发明的一个优选目的是，多能细胞或它们衍生的分化细胞将通过激活只含男性或女性来源的DNA的卵母细胞或卵裂球获得，该DNA任选地被遗传修饰产生含有可辨别的滋养外胚层和内细胞团的胚胎，其中内细胞团或其部分在使细胞保持多能、未分化状态的条件下培养；这些多能细胞在体内(例如在SCID小鼠中)或当在适当条件下培养时产生分化的细胞型。
                      附图简述
图1(标记为31-11)：以100×放大倍数拍摄的胚状体。由直接平板接种于培养皿(不含小鼠胎成纤维细胞饲养层)上的外植体形成。原始集落(1023981-3)由以前激活的胚泡接种。光线偏转显示细胞的脂含量。
图2(标记为31-18)：以100×放大倍数拍摄的胚状体。由直接平板接种于培养皿(不含小鼠胎成纤维细胞饲养层)上的外植体形成。原始集落(1023981-3)由一周前激活的胚泡接种。
图3(标记为31-25)：以100×放大倍数拍摄的胚状体。由直接平板接种于培养皿(不含小鼠胎成纤维细胞饲养层)上的外植体形成。原始集落(1023981-3)由一周前激活的胚泡接种。
图4(标记为32-1)：以40×放大倍数拍摄的移植干细胞集落的边缘。原始集落(1023981-3)由一周前激活的胚泡接种。干细胞集落在左上角，小鼠胎成纤维细胞饲养层在右下角。
图5(标记为32-3)：以100×放大倍数拍摄的移植干细胞集落的边缘。原始集落(1023981-3)由一周前激活的胚泡接种。干细胞集落在左上角，小鼠胎成纤维细胞饲养层在右下角。
图6(标记为32-5)：以100×放大倍数拍摄的移植干细胞集落的中心。原始集落(1023981-3)由一周前激活的胚泡接种。
图7(标记为32-12)：以200×放大倍数拍摄的移植干细胞集落的中心。原始集落(1023981-3)由一周前激活的胚泡接种。
图8(标记为35-6)：以40×放大倍数拍摄的移植干细胞集落的边缘。原始集落(0106992-2)由一周前激活的胚泡接种。干细胞集落在右上角。小鼠胎成纤维细胞饲养层在左下角。光线偏转显示干细胞集落与小鼠成纤维饲养层的细胞之间脂含量的差异。
图9(标记为35-8)：以40×放大倍数拍摄的移植干细胞集落的边缘。原始集落(0106992-2)由一周前激活的胚泡接种。干细胞集落在上部。小鼠胎成纤维细胞饲养层在下部。光线偏转显示干细胞集落与小鼠成纤维饲养层的细胞之间脂含量的差异。
图10(标记为35-19)：以200×放大倍数拍摄的移植干细胞集落的边缘。原始集落(0106992-2)由一周前激活的胚泡接种。干细胞集落在左侧。小鼠胎成纤维细胞饲养层在右侧。照片显示干细胞集落边缘处细胞的分化。
图11显示发育第8天的三种猴胚泡。
图12显示由图11所示的三种猴胚泡之一获得的一种细胞系(Cyno1)，在免疫手术之前。
图13显示免疫手术之后的Cyno 1细胞系。
图14显示在成纤维细胞饲养层上平板接种5天后的Cyno 1细胞系。
图15显示在小鼠成纤维细胞层上生长的、来源于单雌生殖激活的Cynomolgous猴卵母细胞的一种多能细胞系(称为Cyno 1)。这些饲养细胞显示多能细胞的形态学特征，例如小核胞质比和可检测的胞质颗粒。
图16显示证明分化PPSC中多种体细胞型分化的RT-PCR结果：Brachy：Brachyury(T)蛋白，MYH2：骨骼肌球蛋白重多肽2，烯醇化酶：人神经元特异的烯醇化酶2，SHH：声猬(Sonic Hedgehog)的人同源物。
图17显示用或不用反转录酶利用来自猴成纤维细胞的mRNA，和用或不用反转录酶利用PPSC的mRNA获得的RT-PCR结果。
                     发明详述
在详细描述本发明之前，定义下列术语。否则，本说明书中的所有术语具有本领域公认的含义。
A.定义
单雌生殖——在本发明中是指含有可辨别的滋养外胚层和内细胞团的胚胎的产生，它在激活含有全部雌性来源(优选地女性来源)的哺乳动物DNA(例如人或非人灵长类动物卵母细胞DNA)的细胞、优选地卵母细胞或其它胚胎干细胞型后产生。这些雌性哺乳动物DNA可被遗传修饰，例如通过至少一种DNA序列的插入、缺失或置换，或者可以不被修饰。例如，可以通过插入或缺失希望的编码序列或促进或抑制胚胎发育的序列修饰DNA。这种胚胎一般可通过体外激活含有全部雌性来源的DNA的卵母细胞获得。单雌生殖包含于以下定义的孤雌生殖中。也包括激活方法，其中精子或它衍生的因子起始或参与激活，但精子DNA不能贡献激活的卵母细胞中的DNA。
单雄生殖——在本发明中是指含有可辨别的滋养外胚层和内细胞团的胚胎的产生，它在激活含有全部雄性来源的DNA(例如人精子DNA)的卵母细胞或其它胚胎细胞型(如卵裂球)后产生。任选地，全部雄性来源的DNA可被遗传修饰，例如通过至少一种DNA序列的插入、缺失或置换(如上对于单雌生殖所述)。
孤雌生殖——在没有精子穿入的情况下发生卵母细胞激活的过程。在本发明中，孤雌生殖是指通过激活含有全部雌性来源的DNA的卵母细胞或胚胎细胞(例如卵裂球)获得的、含有滋养外胚层和内细胞团的早期胚胎的发育。
多能细胞——在本发明中是指来源于通过激活含有全部雌性或雄性来源DNA的细胞产生的胚胎的细胞，它们能在体外长期、理论上无限期保持未分化状态，能产生不同的分化组织型，即，内胚层、中胚层和外胚层。优选地通过在适当条件下培养通过单雄生殖或单雌生殖方法产生的胚胎的内细胞团或来源于内细胞团的细胞，优选地通过在成纤维细胞饲养层或另一种饲养层或包含白血病抑制因子的培养物上培养，保持该细胞的多能状态。培养的细胞的多能状态能用多种方法证实，例如：(i)证实多能细胞特有的标记物的表达；(ii)产生含有表达该多能细胞基因型的细胞的嵌合动物；(iii)向动物如SCID小鼠中注射细胞，体内产生不同的分化细胞型；和(iv)观察所述细胞(例如当在不含饲养层或LIF的情况下培养时)在体外分化为胚状体和其它分化细胞型。
二倍体细胞——在本发明中，一般是指含有全部雄性或雌性来源的二倍体DNA内容物的细胞，如卵母细胞或卵裂球。
单倍体细胞——在本发明中，一般是指含有全部雄性或雌性来源的单倍体DNA内容物的细胞，如卵母细胞或卵裂球。
激活——受精或未受精的卵母细胞(优选地处于减数分裂中期II)经历一个过程，该过程一般包括染色单体对的分离、第二极体的排出，产生含有单倍体数量的染色体的卵母细胞，均含有一个染色单体。在本发明中，激活是指诱导含有全部雄性或雌性来源的DNA的细胞发育为含有可辨别的内细胞团和滋养外胚层的胚胎的方法，该胚胎可用于产生多能细胞，但其本身不能发育为存活的后代。优选地，在本发明中，优选地在下列条件之一下实现激活：(i)不引起第二极体排出的条件；(ii)引起极体排出但极体排出被抑制的条件；或(iii)抑制单倍体卵母细胞第一次细胞分裂的条件。本发明也包括已经移植了两个雄性或两个雌性单倍体核的卵母细胞或卵裂球的激活。
中期II——细胞发育阶段，其中细胞的DNA内容物由单倍体数量的染色体组成，每个染色体由两个染色单体代表。
胚胎——在本发明中一般是指在激活一种细胞，例如含有全部雄性或雌性来源的DNA(任选地可被修饰)的卵母细胞或其它胚胎细胞后产生的胚胎，其含有可辨别的滋养外胚层和内细胞团，不能产生存活的后代，其中DNA是全部雄性或雌性来源的。内细胞团或其中所含的细胞可用于产生前述多能细胞。
内细胞团——可产生胎组织的胚胎的内部部分。在此，用这些细胞在体外提供多能细胞的连续来源。在本发明中，内细胞团是指由单雄生殖或单雌生殖产生的胚胎(即在激活含有全部雄性或雌性来源的DNA的细胞后产生的胚胎)的内部部分。优选地，这种DNA是人DNA，例如人卵母细胞或精子DNA，任选地被遗传修饰。
滋养外胚层——可产生胎盘组织的早期胚胎的其它部分。在本发明中，滋养外胚层是由单雄生殖或单雌生殖产生的胚胎(即在激活含有全部雄性或雌性来源的DNA的细胞(例如人卵母细胞或精子)后产生的胚胎)的滋养外胚层。
分化的细胞——具有特定分化的(即非胚胎)状态的非胚胎细胞。三种最早期的分化细胞型是内胚层、中胚层和外胚层。
B.详述
本发明提供获得多能细胞和细胞系的新型方法，其中DNA通过单雄生殖或单雌生殖来源于单个个体，即，雄性或雌性。
在天然环境中，来自卵巢的未成熟的卵母细胞(卵)经历导致从减数分裂发展到减数分裂中期II的成熟过程。卵母细胞然后停止在中期II。在中期II时，细胞的DNA内容物由单倍体数量的染色体组成，每一个均由两个染色单体代表。
卵母细胞正常地在这一阶段排卵，并被精子受精。精子以一种称为激活的过程起始减数分裂的完成。在激活过程中，染色单体对分开，第二极体排出，卵母细胞保留单倍体数量的染色体，每一个均含有一个染色单体。精子提供另一个单倍体染色体组，与一个染色单体形成完整的双倍体细胞。染色体然后在第一个细胞循环中经过DNA合成。这些细胞然后发育为胚胎。
相反，在本发明中，胚胎通过人工激活细胞(一般是含有全部雄性或雌性来源的DNA的哺乳动物卵母细胞或卵裂球)发育。如发明背景中所述，文献中报道了许多人工激活未受精的卵母细胞的方法。这些方法包括物理方法，例如机械方法，如刺穿、对培养的卵母细胞的操作，热方法，如冷却和加热，重复电脉冲，酶处理，如胰蛋白酶、链霉蛋白酶、透明质酸酶，渗透处理，离子处理，如使用二价阳离子和钙离子载体，使用麻醉剂，如乙醚、乙醇、丁卡因、利多卡因、普鲁卡因、酚噻嗪，安定剂，如硫利达嗪、三氟拉嗪、氟奋乃静、氯丙嗪，使用蛋白质合成抑制剂，如环己亚胺、嘌呤霉素，使用磷酸化抑制剂，例如蛋白激酶抑制剂，如DMAP，它们的组合，以及其它方法。
这些激活方法在本领域中众所周知，在我们以前的专利申请美国专利号5,945,577中有描述。该申请书在此引用作为参考。
在本发明中，利用公知的实现卵母细胞人工激活或核移植融合的方法人工激活哺乳动物细胞，优选地处于中期II的细胞，一般是含有全部雄性或雌性来源的DNA的卵母细胞或卵裂球。根据该激活方法，细胞可排出第二极体或保留第二极体。
在本发明的一个实施方案中，利用不导致第二极体排出的激活方法激活哺乳动物细胞，优选地处于中期II的细胞，例如含有全部雄性或雌性来源的单倍体DNA的哺乳动物卵母细胞。这能用多种方法实现，包括使用磷酸化抑制剂，如DMAP，或使用微丝抑制剂，如松胞菌素B、C或D，或其组合。由此，获得含有雄性或雌性来源的二倍体DNA的细胞，它们可发育为含有可辨别的滋养外胚层和内细胞团的胚胎，不会产生存活的后代。内细胞团或其中的细胞用来产生含有多能细胞的培养物，它们本身可用于生产分化的细胞和组织。
在本发明的第二个实施方案中，在可产生含有可辨别的滋养外胚层和内细胞团的胚胎的条件下，激活一种单倍体细胞，优选地处于中期II的细胞，一般是含有全部雄性或雌性DNA的卵母细胞或卵裂球，但其中第一次分裂事件被阻止，由此产生一种二倍体细胞，它可发育为不能产生后代的胚胎。
此外，本发明包括如下实施方案：去核细胞，例如哺乳动物卵母细胞或卵裂球，或其它哺乳动物胞质体，移植有两个雄性或雌性单倍体核，例如来自卵母细胞或精子的核，并用合适的激活方法激活，产生一种含有可辨别的滋养外胚层和内细胞团的胚胎，它不能产生存活的后代。另外，内细胞团或其衍生的细胞可用于获得可在组织培养中长期保存的多能细胞。
在所有情况中，激活的二倍体细胞，例如卵母细胞，可发育为含有滋养外胚层和内细胞团的胚胎。这能用周知的方法和利于胚泡发育的培养基实现。其实例在我们较早的专利申请美国专利号5,945,577中公开，并在文献中有详细报道。适于胚胎培养和成熟的培养基众所周知，包括Ham’s F-10+10％胎牛血清、组织培养基、199(TCM-199)+10％胎牛血清、Tyrodes-白蛋白-乳酸盐-丙酮酸盐(TALP)、Dulbecco’s磷酸盐缓冲液(PBS)、Eaglets和Whitten’s培养基和CR1培养基。用于牛胚胎的一种优选培养基是含Earl盐、10％胎牛血清、0.2mM丙酮酸钠和50μg/ml硫酸庆大霉素的TCM-199。用于培养猪胚胎的一种优选培养基是NCSU23。
用于培养灵长类动物胚胎如人和非人灵长类动物胚胎的优选培养基包括补充了1ml/L合成血清替代物(SSR-2，Medl-Cult，丹麦)和10mg/mlHSA的改良Ham’s F-10培养基(Gibco，目录号430-1200EB)；含20％胎牛血清、0.1mM β-巯基乙醇和1％非必需氨基酸原液的80％ Dulbecco’s改良Eaglet’s培养基(DMEA，不含丙酮酸盐，高葡萄糖制剂，Gibco BRL)，使用Jones等人，Human Reprod.13(1)：169-177(1998)；Thomson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：7894-7898(1995)；Thomson等人，Science，282：1145-1147(1998)所公开的方法和培养基；以及可从Irvine Scientific，Santa Anna，California获得的两种培养基，即，用于培养前三天的被称为P-1(目录#99242)的第一种培养基，随后是第二种培养基P-2(目录#99292)，直到胚泡期。
此处可用的适用于人卵母细胞的激活条件包括下列：
1.用离子霉素和DMAP激活
(i)
a.将卵母细胞置于含2mM DMAP的离子霉素(5μM)中4分钟。
b.将卵母细胞移到含2mM DMAP的培养基中4个小时。
c.漂洗4次并置于培养基中。
(ii)
a.将成熟后22-28小时的卵母细胞置于2mM DMAP中。
b.一小时后，转移到5μM离子霉素中。
c.3-5分钟后，转移到5μg/ml松胞菌素B和10μg/ml环己亚胺中并温育8个小时。
2.用离子霉素、DMAP和roscovitin激活
a.将卵母细胞置于含2mM DMAP的离子霉素(5μM)中4分钟。
b.将卵母细胞移到含2mM DMAP和200μM Roscovitin的培养基中3个小时。
c.漂洗4次并进行培养。
3.通过接触离子霉素随后接触松胞菌素和环己亚胺激活
a.将卵母细胞置于离子霉素(5μM)中4分钟。
b.将卵母细胞移到含5μg/ml松胞菌素B和5μg/ml环己亚胺的培养基中5个小时。
c.漂洗4次并进行培养。
4.通过电脉冲激活
a.将卵置于含100μM CaCl2的甘露糖醇培养基中。
b.释放三次1.0kVcm-1、20μ秒的脉冲，每次脉冲22分钟间隔。
c.将卵母细胞移到含5μg/ml松胞菌素B的培养基中3个小时。
5.通过接触乙醇随后接触松胞菌素和环己亚胺激活
a.将卵母细胞置于7％乙醇中1分钟。
b.将卵母细胞移到含5μg/ml松胞菌素B和5μg/ml环己亚胺的培养基中5个小时。
c.漂洗4次并进行培养。
6.通过显微注射adenophostin激活
a.向卵母细胞中注射10-20皮升含有10μM adenophostin的溶液。
b.培养卵母细胞。
7.通过显微注射精子因子激活
a.向卵母细胞中注射10-20皮升分离自灵长类动物、猪、牛、绵羊、山羊、马、小鼠、大鼠、兔或仓鼠的精子因子。
b.对卵进行培养。
8.通过显微注射重组精子因子激活
在培养单雄生殖或单雌生殖胚胎产生可辨别的滋养外胚层和内细胞团后，可用内细胞团的细胞产生希望的多能细胞系。这能通过将来自内细胞团的细胞或整个内细胞团转移到可抑制分化的培养物上来实现。优选地如下实现，将该内细胞团转移到可抑制分化的饲养层上，例如成纤维细胞或上皮细胞，如来自鼠、有蹄类动物、鸡的成纤维细胞，如小鼠或大鼠成纤维细胞，570和SI-m220饲养细胞、BRL细胞等，或产生LIF的其它细胞。优选地，在小鼠胎成纤维细胞或产生白血病抑制因子的其它细胞上，或在白血病抑制因子存在下培养内细胞团细胞。在使细胞长期、理论上无限期地保持未分化的多能状态的条件下进行培养。
在我们较早的专利美国专利号5,945,577以及美国专利号5,905,042中也描述了培养多能细胞特别是来自有蹄类动物内细胞团的多能细胞的合适条件，均在此引用作为参考。
如上所述，本发明将产生含有只是雄性或雌性来源的DNA的多能细胞，它们可用来产生不同的分化细胞型。
在一个优选实施方案中，这种唯一的雄性或雌性DNA可在激活含有它们的细胞(例如人卵母细胞)之前或之后遗传修饰。
实现遗传修饰的方法与材料众所周知，包括显微注射、使用病毒DNA、同源重组等。由此获得含有希望的DNA修饰，例如含有希望的编码序列的多能细胞。
本发明的新颖性在于含有雌性或雄性来源的DNA的多能细胞的产生。就发明者所知，对于任何物种这尚未报道。已经用多能和全能胚胎干细胞在小鼠中进行了大量工作，但它们全部来源于正常胚胎细胞或原始生殖细胞。这些细胞型都含有父本和母本DNA。也用含有雄性来源或雌性来源的DNA的胚胎进行了工作。这些研究表明，为了胚胎完全发育成熟，细胞必须含有雄性和雌性来源的DNA。减数分裂中DNA的印刻产生一些失活的染色体片段。有趣的是，如果细胞与正常胚胎细胞在嵌合体中结合，它们具有在体内形成所有不同细胞型的能力。对任何物种尚未做的工作是只含雌性或雄性来源的DNA的多能细胞系的产生。此外，没有人说明这些细胞能在培养中分化。
这些细胞的一个重要特征是它们是免疫学相似的，尽管不同于提供DNA的个体。因此，它们也是最具免疫相容性的细胞，不利用克隆即可由一个个体获得。此外，它们不会引起使用正常胚胎将产生的伦理问题，因为它们可能含有来自一个个体的DNA，而不能形成后代。
然而，这些细胞和细胞系和它们衍生的分化细胞的另一个预期用途是作为核移植的供体细胞，例如通过美国专利5,945,577或Roslin研究所的专利和专利申请书所报道的方法。这些方法实质上不同，因为ACT克隆法使用增殖的供体细胞，例如哺乳动物体细胞，如成纤维细胞，而Roslin研究所的方法使用休眠的供体细胞。
本发明产生的细胞的多能状态能用多种方法证实。
例如，能检测细胞是否存在特有的ES细胞标记物。对于人ES细胞，这些标记物的实例如上所述，包括SSEA-4、SSEA-3、TRA-1-60和TRA-1-81，它们在本领域中周知。
也能通过将细胞注射到合适的动物如SCID小鼠中，并观察分化细胞和组织的产生来证实多能性。证实多能性的另一种方法是使用多能细胞产生嵌合动物，并观察导入的细胞对不同细胞型的贡献。产生嵌合动物的方法在本领域中众所周知，在我们的相关申请书中有描述，在此引用作为参考。
培养多能性的另一种方法是观察它们在利于分化的条件下(例如除去成纤维细胞饲养层)培养时分化为胚状体和其它分化细胞型。该方法已经在本发明中使用，已经证实所述多能细胞在组织培养中产生胚状体和不同的分化细胞型。例如，显示此处产生的Cynomolgous多能细胞系在通过培养细胞系至汇合使其分化时，产生搏动的心肌细胞和其它细胞。
产生的多能细胞和细胞系，优选地人多能细胞和细胞系，由完整雄性或雌性来源的DNA衍生，具有大量的治疗和诊断用途。最特别地，这些多能细胞可用于细胞移植治疗或基因治疗(如果遗传修饰)。人ES细胞具有治疗许多病症的用途。
就此而言，周知小鼠胚胎干(ES)细胞能分化为几乎任何细胞型，例如造血干细胞。因此，根据本发明产生的人或其它哺乳动物多能(ES)细胞应当具有相似的分化能力。根据本发明的多能细胞将按照周知的方法被诱导分化，获得希望的细胞型。例如，根据本发明产生的人ES细胞，通过在分化培养基中并在引起细胞分化的条件下培养这些细胞，可被诱导分化为造血干细胞、肌细胞、心肌细胞、肝细胞、软骨细胞、上皮细胞、尿道细胞等。引起ES细胞分化的培养基和方法及合适的培养条件在本领域中众所周知。
例如，Palacios等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：7530-7537(1995)讲述了通过对干细胞实施诱导方法由胚胎细胞系产生造血干细胞，该方法包括最初在缺乏视黄酸的悬浮培养基中培养这些细胞的集合体，随后在含有视黄酸的相同培养基中培养，随后将细胞集合体转移给便于细胞附着的底物。
此外，Pedersin，J.Reprod.Fertil.Dev.，6：543-552(1994)是一篇综述性文章，它参考了大量公开体外分化胚胎干细胞产生不同分化细胞型(其中包括造血细胞、肌、心肌、神经细胞)的方法的文章。
另外，Bain等人，Dev.Biol.，168：342-357(1995)讲述了胚胎干细胞体外分化产生具有神经元性质的神经细胞。这些参考文献是所报道的由胚胎或干细胞获得分化细胞的代表性方法。这些参考文献，特别是此处与分化胚胎干细胞的方法有关的公开内容，在此引用作为参考。
因此，利用公知的方法和培养基，本领域技术人员可培养所述ES细胞，包括遗传工程或转基因ES细胞，以获得希望的分化细胞型，例如神经细胞、肌细胞、造血细胞等。
可以利用本发明产生的多能细胞获得任何希望的分化细胞型。分化的人细胞的治疗用法是不平行的。例如，人造血干细胞可以在需要骨髓移植的医学治疗中使用。这些方法用于治疗许多疾病，例如晚期癌症，如卵巢癌和白血病，以及损害免疫系统的疾病，如AIDS。造血干细胞能如下获得：例如，将来自雄性或雌性癌症或AIDS患者的雄性或雌性DNA掺入去核卵母细胞中，获得如上所述的多能细胞，在利于分化的条件下培养这些细胞，直到获得造血干细胞。这些造血细胞可用于治疗包括癌症和AIDS在内的疾病。
此外，所述多能细胞也可用于治疗神经紊乱患者，方法是在产生神经细胞系的分化条件下培养这些细胞。可通过移植这些人神经细胞治疗的特殊疾病包括，例如，帕金森氏症、阿尔兹海默氏病、ALS和大脑性瘫痪。对于帕金森氏症，已经证明移植的胎脑神经细胞与周围细胞的适当连接，产生多巴胺。这能导致帕金森氏症症状的长期好转。
本发明的最大的优点是它可基本上无限地供应能用于产生适于移植的分化细胞的多能、优选地多能人细胞。这些细胞应能缓解与当前的移植方法有关的重要问题，即，由于宿主抗移植物或移植物抗宿主排斥而可发生的移植组织排斥。施用抗排斥药如环孢菌素通常能防止或减少排斥。然而，这些药物具有明显的副作用，例如免疫抑制、致癌特性，以及极其昂贵。本发明可消除，或者至少大大减少对抗排斥药的需要。
可通过细胞疗法治疗的其它疾病和病症包括，例如，脊髓损伤、多发性硬化症、肌营养不良、糖尿病、肝病，即高胆固醇血症、心脏病、软骨置换、烧伤、足溃疡、胃肠疾病、血管疾病、肾病、尿道疾病和老化相关疾病。
该方法能用来替换缺陷基因，例如，缺陷免疫系统基因、囊性纤维化基因，或导入引起治疗上有用的蛋白质如生长因子、淋巴因子、细胞因子、酶等表达的基因。例如，可以向根据本发明产生的人多能细胞中导入编码脑源性生长因子的基因，细胞分化为神经细胞，将细胞移植到帕金森患者中，延缓疾病中神经细胞的损失。
以前，用BDNF转染的细胞型从初级细胞到无限增殖化细胞系、神经或非神经(成肌细胞和成纤维细胞)衍生的细胞不同。例如，已经利用反转录病毒载体用BDNF基因转染了星形胶质细胞，并将该细胞移植到帕金森氏症大鼠模型中(Yoshimoto等人，Brain Research，691：25-36(1995))。
这种来自体内的治疗在大鼠中使帕金森氏症样症状在移植32天后减少了高达45％。将酪氨酸羟化酶基因置入星形胶质细胞中也获得类似的结果(Lundberg等人，Develop.Neurol.，139：39-53(1996)，在此引用作为参考)。
然而，这些来自体内的系统也存在问题。特别是，当前使用的反转录病毒载体在体内是下调的，并且转基因只是瞬时表达(Mulligan，Science，260：926-932(1993)综述)。这些研究也使用具有有限寿命且缓慢复制的初级细胞，星形胶质细胞。这些特性不利地影响转染率，并且妨碍选择稳定转染的细胞。而且，繁殖在同源重组技术中使用的大批基因导向初级细胞是几乎不可能的。相反，使用此处所述的方法能消除与反转录病毒系统有关的困难。
可导入多能细胞的基因包括，例如，表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经胶质衍生的神经营养生长因子、胰岛素样生长因子(I和II)、神经营养因子-3、神经营养因子-4/5、睫状神经营养因子、AFT-1、细胞因子基因(白介素、干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子(α和β)等)，编码治疗酶的基因，等等。
除了在细胞、组织和器官移植中使用人多能细胞和它们衍生的细胞外，本发明也包括在治疗人类疾病中使用非人类细胞。例如，当细胞、组织或器官移植得到保证时(假定较少考虑灵长类动物和人类免疫原性的系统发生相关性)，根据本发明产生的非人灵长类动物多能细胞可用于治疗人类疾病。根据本发明产生的多能细胞和它们衍生的分化细胞通常能在相同种内(自体、同系或同种移植)或种间(异种移植)使用。例如，由牛或猪多能细胞衍生的脑细胞可用来治疗帕金森氏症。
多能ES细胞，优选人细胞，也可作为体外分化模型，特别用于研究参与早期发育调节的基因。利用ES细胞产生的分化细胞、组织和器官也可在药物研究中使用。
另外，ES细胞或它们衍生的分化细胞也可作为核供体用于产生其它ES细胞和细胞集落，或者在非人类细胞中，用于产生克隆动物。
另外，根据本发明获得的多能细胞也可用来鉴定参与胚胎发育的蛋白质和基因。其实现方法可能是，例如差异表达，即比较根据本发明产生的多能细胞表达的mRNA与当这些细胞分化为不同细胞型(例如，神经细胞、心肌细胞、其它肌细胞、皮肤细胞等)时表达的mRNA。由此，确定何种基因参与了特定细胞型的分化是可能的。
另外，本发明的另一个目的在于使根据本发明产生的多能细胞系暴露于不同生长因子的混合物，以确定诱导希望的细胞型产生和增殖的条件。
为了更清楚地描述本发明，提供了下列实施例。
                   实施例1
通过激活含有雌性来源DNA的牛卵母细胞的多能细胞产生
本实施例描述了一种通过单雄生殖或单雌生殖激活和产生胚胎生产多能细胞的方法。特别是，本实施例描述了由孤雌生殖激活的牛卵母细胞(利用离子霉素和DMAP实现的含有全部雌性DNA的牛卵母细胞的单雌生殖激活)产生多能细胞。如下所述，并经图1-10证实，该方法导致产生含有可辨别的滋养外胚层和内细胞团的胚胎，其内细胞团当在小鼠胎成纤维细胞饲养层上培养时产生可产生分化细胞的多能细胞(特别参见图10)。
         实施例中使用的材料与方法
              培养基与溶液
透明质酸酶(0.01％溶液)
透明质酸酶     (Sigma H-3506)     1mg
 DPBS     1ml
 TL Hepes
 NaCl     (Sigma S-5886)     666mg
 KCl     (Sigma P-5404)     24mg
 NaHCO3     (Sigma S-5761)     16.8mg
 NaH2PO4-H2O     (Sigma S-9638)     4.76mg
 Hepes     (Sigma H-9136)     240mg
 乳酸钠(60％糖浆)     (Sigma L-1375)     186μl
 酚红(0.5％溶液)     (Sigma P-0290)     100μl
 CaCl2-2H2O     (Sigma C-7902)     300mg
 MgCl26H2O     (Sigma M-2393)     5mg
 胚胎移植H2O     (Sigma W-1503) 足够形成100ml终体积
-调节pH为7.3-7.4。
-用0.2μm滤器过滤，置于50ml加盖的瓶中，标记并注明日期。
-在4℃下贮存缓冲液。
 HECM Hepes
 NaCl     (Sigma S-5886)     0.662g
 KCl     (Sigma P-5404)     0.0239g
 CaCl2-2H2O     (Sigma C-7902)     0.0294g
 MgCl2-6H2O     (Sigma M-2393)     0.0102g
 BME-氨基酸     (Sigma B-6766)     1ml
 乳酸钠     (Sigma L-1375)     1.4ml
 丙酮酸钠     (Sigma P-2256)     0.011g
 NaHCO3     (Sigma S-5761)     0.168g
 Hepes     (Sigma H-9136)     0.238g
 酚红     (Sigma P-0290)     0.1ml
 青霉素/链霉素     (Sigma P-3539)     1ml
 BSA级分V     (Sigma A-4503)     0.3g
 胚胎移植H2O     (Sigma W-1503) 足够形成100ml终体积
-摩尔渗透压浓度必须是275±10mOsm/kg。
-调节pH为7.3-7.4。
-用0.2μm滤器过滤，置于50ml加盖的瓶中，标记并注明日期。
-在4℃下贮存缓冲液。
 ACM培养基
 NaCl     (Sigma S-5886)     0.290g
 KCl     (Sigma P-5404)     0.011g
 CaCl2-2H2O     (Sigma C-7902)     0.002g
 NaHCO3     (Sigma S-5761)     0.105g
 乳酸钠     (Sigma L-4263)     7μl
 丙酮酸贮存液     1ml
 BME氨基酸     (Sigma B-6766)     1ml
 MEM氨基酸     (Sigma M-7145)     0.5ml
 L-谷氨酰胺     (Sigma G-5763)     7.3mg
 青霉素/链霉素     (Sigma P-3539)     0.5μl
 BSA级分V     (Sigma A-4503)     150g
 胚胎移植H2O     (Sigma W-1503) 足够形成50ml终体积
-调节pH为7.3-7.4。-用0.2μm滤器过滤，置于50ml加盖的瓶中，标记并注明日期。-在4℃下贮存缓冲液。
丙酮酸贮存液
丙酮酸     (Sigma P-2256)     2.2mg
胚胎移植H2O     (Sigma W-1503)     1ml
-标记并以1ml等份贮存于-20℃下。
离子霉素
离子霉素   (Calbiochem 407952)或(Sigma I-0634)     1mg
二甲基亚砜   (Sigma D-8799)     267.6μl
-标记并以5μl等份贮存于-4℃下。Z1-TL Hepes+1mg/ml BSA(级分V)，pH7.2-7.4。-过滤，标记，在加盖容器中4℃贮存。
DMAP 200mM(100×贮存液)
 DMAP     (Sigma D-2629)     1g
 PBS     (Gibco 21600-051)     30ml
-在沸水浴中加热至溶解DMAP。
-等分20μl至小eppendorf管中，标记并注明日期。
-在-20℃下贮存等份。小鼠胎成纤维细胞饲养层
小鼠胎成纤维细胞γ射线照射5分钟，以1×106细胞/ml的密度平板接种于ALPHA-MEM培养基中。过夜或直到接种细胞并将培养基更换为希望的培养基。
ALPHA-MEM培养基
ALPHA-MEM     (Gibco 12-169F)     500ml
胎牛血清     (HyClone A-111-D)     50ml
抗生素/抗有丝分裂剂     (Sigma A-7292)     2ml
2-巯基乙醇     (Gibco 21985-023)     1.4ml
L-谷氨酰胺贮存液     5ml
酒石酸泰乐菌素(Tylosine Tartrate)     (Sigma G-5763)     0.5ml
 L-谷氨酰胺贮存液
L-谷氨酰胺     (Sigma G-5763)     1.5g
DPBS     50ml
-过滤，等分5.5-6.0ml于15ml管中。
-标记并冻存于规定地点。
                 方法-卵母细胞制备
在成熟18小时后用TL Hepes培养基中所含的0.01％透明质酸酶溶液(1mg/ml)剥离下牛卵母细胞。之后，用HECM Hepes或TL Hepes漂洗剥离的卵母细胞。然后贮存获得的剥离、漂洗的卵母细胞，或直接用于激活。例如能在37℃和5％CO2下在ACM中贮存直到激活。优选地，在用于卵母细胞贮存前，ACM在37℃和5％CO2下平衡约2-3小时。
                 卵母细胞激活
使用一种合适的激活方法，导致含有可辨别的滋养外胚层和内细胞团的胚胎的产生。如前所公开的，能使用多种方法。
特别是，发明者选择通过将卵母细胞(如上制备的)置于含5μM离子霉素的Z1培养基中4分钟实现激活。该培养基通过将2μl 5mM离子霉素稀释于2ml Z1培养基中而制备。
之后，用HECM Hepes洗涤卵母细胞，然后在DMAP/ACM培养基中温育3-4小时。该培养基通过将5μl 200mM DMAP在500μl ACM中稀释而制备，ACM/DMAP优选地在使用前在37℃和5％CO2下平衡2-3小时。
在DMAP/ACM中温育后，卵母细胞在HECM Hepes中洗涤4次。然后将洗涤的卵母细胞置于如上所述制备的小鼠成纤维细胞饲养层上的ACM中。ACM培养基在使用前再次在37℃和5％CO2下平衡2-3小时。
这导致含有可辨别的滋养外胚层和内细胞团的胚泡的产生(见图1-10)。激活7-9天后，用30规格/1英寸针头切开胚泡，并置于ALPHA-MEM组织培养基中的小鼠胎成纤维细胞饲养层上。细胞在之上在37℃和5％CO2下温育1周。
在温育当周后每2-3天更换培养基。
将细胞手工传代到新的饲养层上。这通过培养集落并将碎片直接移至新饲养层上实现。可通过更换培养基并重复无限传代来重复该方法，以产生可产生分化细胞的多能细胞。图1-10证实了所述方法的效能。特别是，图10显示了由通过上述单雌(孤雌)生殖激活产生的胚泡产生的多能细胞集落，产生含有在集落边缘观察到的分化细胞的多能(干细胞)集落。
                    实施例2
孤雌生殖的灵长类动物原始干细胞(PPSC)的产生
材料与方法
1-利用单次注射1000IU妊娠母马血清促性腺激素(PMSG)和4天后注射500IU人慢性绒毛膜促性腺激素(hCG)使Cynomolgous猴(Macacafascicularis)超排卵。
2-通过剖腹手术回收卵巢，从卵泡中取出卵母细胞，在36-48小时后(hCG)置于成熟培养基中。成熟培养基由补充了20％胎牛血清、10IU/ml PMSG、10IU/ml hCG、0.05mg/ml青霉素G和0.075mg/ml硫酸链霉素，含Earle’s平衡盐溶液的培养基-199(Gibco BRL)组成(Hong，1999)。
3-卵母细胞激活
待成熟40小时后，将中期II的卵置于10微摩尔离子霉素中，随后在200mM 6-DMAP(二甲基氨基嘌呤)中温育3-4小时。
4-胚胎培养。使用可购得的胚胎培养基“Cooks”(改良的SOF)。用有丝分裂灭活的小鼠胚胎成纤维细胞的共培养物作为饲养层培养胚胎。
5-内细胞团的分离
a-一旦发育为胚泡，即将胚胎置于0.3％链霉蛋白酶缓冲溶液中2分钟，以消化透明带。
b-然后在缓冲溶液中漂洗胚泡，并转移到G1培养基和多克隆抗体(抗人全血清)1∶3稀释液的溶液中30分钟。
c-在缓冲溶液中漂洗胚胎5次。
d-将胚胎转移到G1培养基和豚鼠补体1∶3稀释液的溶液中30分钟。
e-胚胎的剩余部分(死亡的滋养层细胞和ICM)在缓冲溶液中漂洗5次，分离内细胞团(ICM)，置于小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上部，用于原始干细胞(PSC)的分离和生长。
                         结果
我们总共获得了450个卵，在成熟后，224个仍处于生发泡期(GV＝未成熟)，79个死亡，56个处于中期I(MI)，91个处于中期II(MII)。
我们孤雌生殖激活了所有的卵。如预期的，GV组没有分裂，MI有32％分裂，MII有57％分裂。当进行培养时，7个胚胎发育至胚泡期(见图11)。
在试图建立ES样培养细胞后，4个内细胞团良好附着，1个立即分化，在其余3个中，获得一个细胞系。该细胞系被称为Cyno 1(图12)。图12和图13显示了免疫手术之前和之后的该细胞系。图14显示平板接种5天后的Cyno 1细胞系。
图15显示在小鼠成纤维细胞饲养层上面生长的Cyno 1细胞系。这些细胞显示多能胚胎细胞的典型形态学，如小核胞质比和胞质颗粒的存在。
这些细胞能保持未分化状态几个月。这一点通过在长期培养之后对于未分化细胞特有的细胞标记物——碱性磷酸酶的表达筛查这些细胞得到证实。如预期的，细胞在传代3次和传代5次时阳性。
这些细胞在被置于无饲养层的组织培养基后自发分化为许多分化细胞型也证实了它们保留多能性的事实。在随后几天，发现细胞分化为立方上皮、成纤维细胞、搏动心肌细胞和其它细胞。在4孔组织培养板的一个孔中发现搏动心肌细胞的两个集落。
为了确定从分化的PPSC中是否能观察到不同体细胞谱的分化细胞，我们从分化细胞培养物中提取了mRNA，用不同分化细胞型特异的人序列引物进行RT-PCR。如图16所示，观察到中胚层来源的转录物brachyury和骨骼肌肌球蛋白重多肽2的预测大小的转录物。观察到内胚层发育所必需的转录物声猬(sonic hedgehog)。另外还观察到神经元特异的外胚层标记物烯醇化酶，以及作为外胚层来源细胞标记物的角蛋白(未显示)。在小鼠饲养层对照中或在没有反转录酶时未观察到这些PCR产物。
为了明确孤雌生殖的PPSC的印刻状况不同于双亲PPSC，我们观察了几种印刻基因的表达。由父本等位基因单等位基因表达的基因预计在孤雌生殖的细胞中不表达，因为这些细胞只是来源于母本基因组。Snrpn基因在小鼠胚泡内细胞团中由父本等位基因单等位基因表达[Szabo，PE和Mann，JR；Gene & Development 9：3097-3108(1995)]。我们观察了该基因在孤雌生殖的Macaca facicularis PPSC中的表达，发现通过RT-PCR无法检测到其表达，而在相同条件下，该基因在相同种的成纤维细胞培养物中可容易地检测到。Snrpn基因预计在双亲PPSC中表达，因为这些细胞含有父本等位基因。在图17中，Snrpn基因的RT-PCR产生的预期大小为260bp。
尽管已经用特定具体实施方案叙述了本发明，但应当理解，本领域技术人员可在不背离本发明的精神的情况下对它们进行许多修改和改变。因此，附加的权利要求书旨在覆盖属于本发明真正精神和范围之内的所有修改和改变。

Claims (38)

1.一种生产能用来产生分化细胞和组织的多能(ES)细胞的方法，包括：
(a)获得一种处于中期II的单倍体细胞，其含有来自单个雄性或雌性个体的DNA，任选地可被遗传修饰；
(b)利用一种方法激活该单倍体细胞，该方法选自：(1)不导致第二极体排出的条件；(2)允许极体排出但存在一种可抑制极体排出的试剂的条件；和(3)阻止最初的分裂的条件，以及培养该激活的细胞，产生含有可辨别的滋养外胚层和内细胞团的单雌生殖或单雄生殖的胚胎；
(c)分离所述内细胞团或它们产生的细胞，将该内细胞团或细胞转移到可抑制内细胞团分化的体外培养基中；和
(d)培养所述内细胞团细胞或它们衍生的细胞，使这些细胞保持未分化的多能状态。
2.权利要求1的方法，其中中期II细胞是一种卵母细胞或卵裂球。
3.权利要求2的方法，其中单倍体细胞是一种人、非人灵长类动物、牛、猪或羊卵母细胞或卵裂球。
4.权利要求3的方法，其中来自单个个体的单倍体DNA是人、牛、灵长类动物、羊或猪的。
5.权利要求4的方法，其中所述细胞是一种人或牛卵母细胞，单倍体DNA是人DNA。
6.权利要求1的方法，其中所述激活条件包括使用DMAP(磷酸化抑制剂)或可抑制第二极体排出的其它化合物。
7.权利要求1的方法，其中激活条件包括使用可抑制微丝或蛋白质产生的化合物。
8.权利要求7的方法，其中所述化合物是环己亚胺或松胞菌素B。
9.权利要求1的方法，其中单倍体DNA是雌性来源的。
10.权利要求1的方法，其中单倍体DNA是雄性来源的。
11.权利要求1的方法，其中单倍体细胞是含有人雄性或雌性DNA的人卵母细胞。
12.权利要求1的方法，其中使(d)所述的培养细胞分化。
13.权利要求1的方法，其中将所述细胞植入到体内将要移植细胞或组织的希望的部位。
14.权利要求13的方法，其中所述细胞植入无免疫应答的非人类动物中。
15.权利要求13的方法，其中所述部位是伤口、关节、肌肉、骨骼或中央神经系统。
16.权利要求1的方法，其中通过(d)获得的细胞被遗传修饰。
17.一种生产能用来产生希望的分化细胞型的多能(ES)细胞的方法，包括：
(i)通过植入两个来自同一雄性或雌性个体的单倍体核产生一个双倍体细胞，它任选地可被遗传修饰；
(ii)单雌生殖性或单雄生殖性激活该二倍体中期II细胞，产生含有可辨别的滋养外胚层和内细胞团的胚；
(iii)分离该内细胞团或其细胞，在可使细胞保持多能、未分化状态的体外培养基中培养该ICM或其细胞。
18.权利要求17的方法，其中二倍体细胞是一种哺乳动物卵母细胞或卵裂球，它含有与该哺乳动物卵母细胞或卵裂球相同或不同的种的两种相同的雄性或雌性单倍体基因组。
19.权利要求17的方法，其中二倍体细胞是一种已经植入两个相同的雄性或雌性单倍体核的哺乳动物卵母细胞或卵裂球。
20.权利要求19的方法，其中单倍体核是人、灵长类动物、猪或牛的核，哺乳动物卵母细胞或卵裂球是人或牛的卵母细胞或卵裂球。
21.权利要求19的方法，其中所述雄性单倍体核来自人精子。
22.权利要求17的方法，其中将步骤(iii)中获得的多能细胞转移到体外培养基中或体内部位，其中该多能细胞产生不同的分化细胞或组织。
23.权利要求22的方法，其中将所述多能细胞导入将要移植细胞或组织的体内部位。
24.权利要求22的方法，其中所述体内部位是骨骼、软骨、骨髓、肌肉、关节或创伤部位。
25.一种改进的细胞或组织治疗方法，其中改进包括使用根据权利要求22产生的细胞或组织。
26.由雄性或雌性来源的单倍体细胞衍生的多能细胞。
27.权利要求26的多能细胞，它是灵长类动物多能细胞。
28.权利要求27的多能细胞，它是人多能细胞。
29.由权利要求25的多能细胞衍生的分化细胞。
30.权利要求29的分化细胞，它是灵长类动物的。
31.权利要求30的分化细胞，它是人类的。
32.权利要求26的多能细胞，它通过特定DNA的插入、缺失或置换被遗传修饰。
33.利用权利要求1的方法产生的多能细胞。
34.权利要求33的多能细胞，它是灵长类动物的。
35.权利要求34的多能细胞，它是人类的。
36.一种鉴定可诱导分化为特定细胞型的生长因子的方法，包括：使多能细胞接触生长因子的不同组合，选择可导致分化为特定分化细胞型的生长因子组合。
37.权利要求36的方法，其中该方法包括使细胞接触不同组合和不同浓度的生长因子。
38.权利要求36的方法，该方法选择可诱导所述多能细胞分化为分化细胞的生长因子和培养条件，这些分化细胞选自：神经细胞、心细胞、骨细胞、造血细胞、红细胞、软骨、肠细胞、视网膜细胞、角膜细胞、食管细胞和胃细胞。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013143467A1 (zh) * 2012-03-27 2013-10-03 中国科学院上海生命科学研究院 孤雄单倍体干细胞系及其制法和应用
CN108048400A (zh) * 2017-12-26 2018-05-18 南开大学 一种猴子单倍体神经干细胞的获得方法
CN109689894A (zh) * 2016-06-19 2019-04-26 耶路撒冷希伯来大学伊萨姆研发有限公司 在人单倍体细胞中筛选化学疗法抗性

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030129745A1 (en) 1999-10-28 2003-07-10 Robl James M. Gynogenetic or androgenetic production of pluripotent cells and cell lines, and use thereof to produce differentiated cells and tissues
WO2001032015A1 (en) * 1999-11-02 2001-05-10 University Of Massachusetts, As Represented By Its Amherst Campus Use of haploid genomes for genetic diagnosis, modification and multiplication
US20020168763A1 (en) * 2000-11-30 2002-11-14 Yan Wen Liang Isolated homozygous stem cells, differentiated cells derived therefrom, and materials and methods for making and using same
NZ568250A (en) 2001-01-02 2009-07-31 Stemron Inc A method for producing a population of homozygous stem cells having a pre-selected immunotype and/or genotype, cells suitable for transplant derived therefrom, and materials and methods using same
AU2002360424A1 (en) * 2001-11-26 2003-06-10 Advanced Cell Technology, Inc. Methods for making and using reprogrammed human somatic cell nuclei and autologous and isogenic human stem cells
US20030113910A1 (en) * 2001-12-18 2003-06-19 Mike Levanduski Pluripotent stem cells derived without the use of embryos or fetal tissue
WO2003100018A2 (en) 2002-05-24 2003-12-04 Advanced Cell Technology, Inc. A bank of stem cells for transplantation
US20040091936A1 (en) 2002-05-24 2004-05-13 Michael West Bank of stem cells for producing cells for transplantation having HLA antigens matching those of transplant recipients, and methods for making and using such a stem cell bank
JP4275137B2 (ja) * 2003-08-05 2009-06-10 学校法人東京農業大学 核移植卵、単為発生胚および単為発生哺乳動物の作出方法
US7659443B2 (en) 2003-08-05 2010-02-09 Tokyo University Of Agriculture Educational Corporation Method of constructing nucleus-implanted egg, parthenogenetic embryo and parthenogenetic mammal
US7794704B2 (en) 2004-01-23 2010-09-14 Advanced Cell Technology, Inc. Methods for producing enriched populations of human retinal pigment epithelium cells for treatment of retinal degeneration
SG10201912182UA (en) 2004-01-23 2020-02-27 Astellas Inst For Regenerative Medicine Improved modalities for the treatment of degenerative diseases of the retina
ES2836764T3 (es) 2005-08-03 2021-06-28 Astellas Inst For Regenerative Medicine Métodos mejorados de reprogramación de células somáticas animales
US7732202B2 (en) 2005-10-21 2010-06-08 International Stem Cell Corporation Oxygen tension for the parthenogenic activation of human oocytes for the production of human embryonic stem cells
CN101511307A (zh) * 2006-07-24 2009-08-19 国际干细胞公司 来自视网膜干细胞的人工角膜
WO2008033469A1 (en) * 2006-09-15 2008-03-20 Children's Medical Center Corporation Methods for producing embryonic stem cells from parthenogenetic embryos
EP3636748A1 (en) 2007-10-12 2020-04-15 Astellas Institute for Regenerative Medicine Improved methods of producing rpe cells and compositions of rpe cells
CA2781149A1 (en) 2009-11-17 2011-05-26 Advanced Cell Technology, Inc. Methods of producing human rpe cells and pharmaceutical preparations of human rpe cells
ES2629285T5 (es) * 2011-03-02 2020-07-23 Anton Wutz Células madre embrionarias haploides de mamífero
US10865383B2 (en) 2011-07-12 2020-12-15 Lineage Cell Therapeutics, Inc. Methods and formulations for orthopedic cell therapy
CN102268404B (zh) * 2011-07-20 2012-07-11 安徽农业大学 猪卵丘干细胞的分离方法
EP2599859A1 (en) 2011-11-30 2013-06-05 IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH Haploid cells
CA2914615C (en) 2013-06-05 2023-10-17 Biotime, Inc. Compositions and methods for induced tissue regeneration in mammalian species
US11078462B2 (en) 2014-02-18 2021-08-03 ReCyte Therapeutics, Inc. Perivascular stromal cells from primate pluripotent stem cells
US10240127B2 (en) 2014-07-03 2019-03-26 ReCyte Therapeutics, Inc. Exosomes from clonal progenitor cells
CA2993476A1 (en) * 2015-07-29 2017-02-02 New York Stem Cell Foundation, Inc. Haploid human embryonic stem cell lines and somatic cell lines and methods of making the same
CN108504691B (zh) * 2018-03-21 2021-09-03 陈子江 一种针对于雌性基因编辑的方法
WO2020168422A1 (en) * 2019-02-20 2020-08-27 The Semex Alliance Use of haploid embryonic cells to generate offspring with predetermined genomes

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ230723A (en) 1988-09-21 1992-07-28 Cambridge Animal Biotech Pluripotential embryonic stem cells isolated from an embryonic disc, methods of producing transgenic cells and a chimeric foetus
US5496720A (en) * 1993-02-10 1996-03-05 Susko-Parrish; Joan L. Parthenogenic oocyte activation
GB9308271D0 (en) 1993-04-21 1993-06-02 Univ Edinburgh Method of isolating and/or enriching and/or selectively propagating pluripotential animal cells and animals for use in said method
IT1264447B1 (it) 1993-05-14 1996-09-23 Ist Naz Stud Cura Dei Tumori Espressione di oncogeni derivati da ntrki in cellule di feocromocitoma pc12 ed utilizzo di questo sistema come screening di sostanze di
US5523226A (en) 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
US5905042A (en) 1996-04-01 1999-05-18 University Of Massachusetts, A Public Institution Of Higher Education Of The Commonwealth Of Massachusetts, As Represented By Its Amherst Campus Cultured inner cell mass cell lines derived from bovine or porcine embryos
US5945577A (en) 1997-01-10 1999-08-31 University Of Massachusetts As Represented By Its Amherst Campus Cloning using donor nuclei from proliferating somatic cells
AU2002360424A1 (en) * 2001-11-26 2003-06-10 Advanced Cell Technology, Inc. Methods for making and using reprogrammed human somatic cell nuclei and autologous and isogenic human stem cells

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013143467A1 (zh) * 2012-03-27 2013-10-03 中国科学院上海生命科学研究院 孤雄单倍体干细胞系及其制法和应用
CN103361304A (zh) * 2012-03-27 2013-10-23 中国科学院上海生命科学研究院 孤雄单倍体干细胞系及其制法和应用
CN103361304B (zh) * 2012-03-27 2015-09-30 中国科学院上海生命科学研究院 孤雄单倍体干细胞系及其制法和应用
CN109689894A (zh) * 2016-06-19 2019-04-26 耶路撒冷希伯来大学伊萨姆研发有限公司 在人单倍体细胞中筛选化学疗法抗性
CN108048400A (zh) * 2017-12-26 2018-05-18 南开大学 一种猴子单倍体神经干细胞的获得方法

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