CN109689894A - 在人单倍体细胞中筛选化学疗法抗性 - Google Patents

在人单倍体细胞中筛选化学疗法抗性 Download PDF

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Abstract

公开了选择用于治疗对象的疾病的药剂的方法，其包括鉴定单倍体人胚胎干(ES)细胞中导致对细胞毒性药剂产生抗性的基因。一旦基因被鉴定，该方法包括分析对象的细胞样本中该基因的序列和/或表达，其中与该基因在对照样本中的序列和/或表达相比，该基因的序列和/或表达水平的改变表明药剂应当作为用于治疗对象中疾病的单一疗法被排除。

Description

在人单倍体细胞中筛选化学疗法抗性
技术领域和背景技术
本发明在其一些实施方式中涉及个性化医学，并且更具体地涉及选择用于治疗对象中疾病的适合疗法从而最小化抗药性的机会的方法。
恶性肿瘤的化学疗法本质上基于前瞻性、随机化、双盲III期研究的结果和相应的临床指导。虽然从临床研究已知在大批患者内治疗成功的统计学概率，然而，个别患者的临床反应仍保持不确定。肿瘤的分子结构和生物学行为在不同患者之间并且即使在相同肿瘤内不同。在肿瘤细胞的不同亚群之间存在大的异质性。
抗药性是癌症化学疗法失败的主要原因。在当前临床实践中，抗药性仅仅能够在治疗的较大时期内被认识到。因此，在开始利用抗肿瘤物质治疗之前，确定抗性对于每个单独的患者将具有极大的价值。在几乎50％的所有癌症病例中，在药物治疗之前已经存在对化学疗法的抗性。同时，各种抗性机制的知识随着岁月而增加。虽然肿瘤细胞对靶向抗癌药物(例如靶向HER2或雌激素受体的小分子)的反应性可以通过它们的相应靶标的治疗前确定来预测，但是对于临床上长期建立的细胞毒性药物，情况更复杂，其中分子靶标没有被明确定义或者其具有更宽的作用模式。
人单倍体胚胎干细胞已经在Sagi et al.2016.,Nature,532,107–111中公开。此文公开了这些细胞作为用于功能丧失遗传筛选的平台的实用性。
另外的背景技术包括Pettitt et al.,PLoS One.2013；8(4):e61520和美国专利号20140342369。
发明内容
根据本发明的一些实施方式的方面，提供了选择用于治疗对象的疾病的药剂的方法，其包括：
(a)将多种单倍体人胚胎干(ES)细胞暴露于细胞毒性疗法，其中所述多种单倍体ES细胞的至少一部分包括独特的人工灭活的或过度活化的基因；
(b)选择对所述细胞毒性疗法显示抗性的所述多种单倍体人胚胎干(ES)细胞中的细胞；
(c)鉴定在所述细胞中所述独特的人工灭活的基因；和
(d)分析所述独特的人工灭活的基因或活化的基因在对象的细胞样本中的序列和/或表达，其中与所述基因在对照样本中的序列和/或表达相比，所述基因的序列和/或表达水平的改变表明药剂应当作为用于治疗对象中疾病的单一疗法被排除。
根据本发明的一些实施方式的方面，提供了排除利用化学治疗剂治疗对象中的癌症的方法，其包括分析对象的肿瘤样本中复制定时调节因子1(Replication TimingRegulatory Factor 1)(RIF1)和/或PIN2/TERF1相互作用端粒酶抑制剂1(PINX1)的序列和/或表达，其中与所述RIF1和/或PINX1在对照样本中的序列和/或表达相比，所述RIF1和/或PINX1的序列和/或表达水平的改变表明化学治疗剂应当作为用于治疗对象中癌症的单一疗法被排除。
根据本发明的一些实施方式的方面，提供了选择用于治疗疾病的药剂的方法，其包括：
(a)将多种人单倍体细胞暴露于细胞毒性疗法，其中所述细胞由分离的单倍体人胚胎干(ES)细胞分化，并且其中所述多种细胞的至少一部分包括独特的人工灭活的或过度活化的基因；
(b)选择对所述细胞毒性疗法显示抗性的所述多种细胞中的细胞；和
(c)鉴定在所述细胞中所述独特的人工灭活的或过度活化的基因。
根据本发明的一些实施方式的方面，提供了试剂盒，其包括特异性地检测复制定时调节因子1(RIF1)的第一检测剂和特异性地检测PIN2/TERF1相互作用端粒酶抑制剂1(PINX1)的第二检测剂。
根据本发明的一些实施方式，所述多种单倍体ES细胞的至少一部分包括独特的人工灭活的基因。
根据本发明的一些实施方式，单倍体人ES细胞包括导致基因灭活的基因捕获载体。
根据本发明的一些实施方式，基因捕获载体编码用于鉴定所述人工灭活的基因的报告多肽。
根据本发明的一些实施方式，单倍体人ES细胞包括导致所述基因灭活或活化的CRISPR系统的组分。
根据本发明的一些实施方式，在单个容器中实现暴露多种单倍体人胚胎干(ES)细胞。
根据本发明的一些实施方式，在多个容器中实现暴露多种单倍体人胚胎干(ES)细胞，其中所述多个容器中的每个容器包括具有相同人工灭活基因的单倍体人胚胎干(ES)细胞。
根据本发明的一些实施方式，疾病是癌症。
根据本发明的一些实施方式，细胞样本是肿瘤样本。
根据本发明的一些实施方式，细胞毒性疗法包括药剂。
根据本发明的一些实施方式，药剂是化学治疗剂。
根据本发明的一些实施方式，化学治疗剂是抗菌剂。
根据本发明的一些实施方式，抗菌剂是蒽环类抗生素或色霉素。
根据本发明的一些实施方式，抗菌剂选自阿霉素、柔红霉素、米托蒽醌、伊达比星、放线菌素D、普卡霉素、丝裂霉素和博来霉素。
根据本发明的一些实施方式，抗菌剂是博来霉素。
根据本发明的一些实施方式，细胞毒性疗法包括放射疗法。
根据本发明的一些实施方式，通过对所述细胞的DNA测序实现鉴定。
根据本发明的一些实施方式，单倍体人ES细胞通过如下生成：
(a)鉴定来自ES细胞群的样本中的单倍体中期细胞，其中ES细胞衍生自人工活化的人卵母细胞；和
(b)基于细胞倍性分选ES细胞群以产生单倍体人ES细胞群。
根据本发明的一些实施方式，该方法进一步包括在培养物中维持富集的ES细胞群持续至少三次传代。
根据本发明的一些实施方式，通过中期散布分析(metaphase spread analysis)或亚-2c细胞分选鉴定样本中的单倍体中期细胞。
根据本发明的一些实施方式，通过流式细胞术、着丝粒蛋白免疫荧光染色(centromere protein immunofluorescence staining)、或DNA荧光原位杂交鉴定样本中的单倍体中期细胞。
根据本发明的一些实施方式，分选步骤包括至少一个周期的荧光活化细胞分选术(fluorescence-activated cell sorting)(FACS)。
根据本发明的一些实施方式，化学治疗剂是抗菌剂。
根据本发明的一些实施方式，抗菌剂是蒽环类抗生素或色霉素。
根据本发明的一些实施方式，抗菌剂选自阿霉素、柔红霉素、米托蒽醌、伊达比星、放线菌素D、普卡霉素、丝裂霉素和博来霉素。
根据本发明的一些实施方式，抗菌剂是博来霉素。
根据本发明的一些实施方式，该方法进一步包括利用抗癌疗法(其不是所述化学疗法)治疗对象。
根据本发明的一些实施方式，检测试剂和/或所述第二检测剂是抗体或核酸。
根据本发明的一些实施方式，该方法进一步包括分析患有疾病的对象的细胞样本中所述独特的人工灭活的基因的序列和/或表达，其中与所述基因在对照样本中的序列和/或表达相比，所述基因的序列和/或表达水平的改变表明药剂应当作为用于治疗对象中疾病的单一疗法被排除。
根据本发明的一些实施方式，单倍体细胞是多能细胞。
根据本发明的一些实施方式，单倍体细胞是最终分化的细胞。
根据本发明的一些实施方式，多种细胞的至少一部分包括独特的人工灭活的基因。
根据本发明的一些实施方式，单倍体细胞包括导致所述基因灭活的基因捕获载体。
除非另外限定，本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然与本文描述的那些类似或等价的方法和材料可以用于实践或测试本发明的实施方式，但是下面描述了示例性方法和/或材料。在冲突的情况下，以本专利说明书为准，包括定义。另外，材料、方法和实例仅是示例性的并且不意欲是必定限制性的。
附图说明
在此仅通过举例参照附图描述了本发明的一些实施方式。现在详细地具体参照附图，要强调的是示出的细节是举例说明并且出于说明性讨论本发明的实施方式的目的。在这方面，与附图一起阅读说明书使得本领域技术人员可以如何实践本发明的实施方式变得显而易见。
在附图中：
图1A-G示出了单倍体人ES细胞系的衍生。图1A示出了单性生殖卵母细胞活化及在所产生的ES细胞系中的潜在单倍性的示意图。在未经受精下MII中的第二极体(PB)挤出产生单倍体1-细胞期胚胎且单倍体细胞由于二倍体化而逐渐被消除。图1B示出了理论二倍体化概率为10％的单倍体卵的二倍体化速率模型，与指数衰减拟合重叠(红色曲线)。指示了不同ES细胞系衍生阶段的大致细胞周期数。图1C示出了在1c-细胞的反复分选和富集之后单倍体富集的人ES细胞系h-pES10的建立。c：染色体拷贝。从上到下：未分选的二倍体细胞、在第四次分选时的部分纯化的单倍体细胞及在第六次分选时的大部分纯化的单倍体细胞的DNA含量分布。图1D示出了在4轮单倍体细胞富集和扩增之前和之后pES10的二倍体和单倍体核型。图1E示出了通过流式细胞术在7次传代中的h-pES10的二倍体化动力学，与数据的指数拟合重叠(红色曲线)。误差棒表示标准偏差(s.d.)。图1f示出了DNA FISH且图1g示出了在单倍体富集的和未分选的二倍体pES10细胞中的着丝粒染色。放大插图示出了具有单或双杂交信号(图1F)及分别23或46个着丝粒(图1G)的代表性单倍体和二倍体核。白色箭头指向二倍体核。比例尺＝10μm。
图2A-I示出了单倍体人ES细胞展示多能性干细胞的经典特征且能够实现功能丧失遗传筛选。图2A示出了单倍体富集的和匹配二倍体细胞系的集落形态。比例尺为50μm。图2B示出了h-pES10和h-pES12的碱性磷酸酶染色。比例尺＝50μm。图2C示出了在集落分辨率(上图；比例尺＝50μm)和单细胞分辨率(下图；比例尺＝10μm)下在h-pES10中的多能性标记(红色)、着丝粒(绿色)和DNA(蓝色)的共染色。放大插图示出了具有23个着丝粒的代表性单倍体细胞。图2D示出了在针对G1中的单倍体细胞的选通(gating)之后，通过共染色DNA和细胞表面标记TRA-1-60和CLDN6的h-pES10的流式细胞术分析。图2E示出了在G1中的单倍体(1n)和二倍体(2n)pES10和pES12细胞的多能基因的平均表达水平±s.d.(对于各组，n＝4，每个细胞系有两个生物平行测定(replicate)，对数尺度)。RPKM：每百万作图片段每千碱基的读数。图2F示出了在G1中的一式两份的单倍体(1n)和二倍体(2n)pES10和pES12细胞以及对照成纤维细胞(Fib)在多能基因下的DNA甲基化水平。图2G示出了在单倍体人ES细胞中的全基因组基因捕获的示意概图及针对6-TG抗性基因的筛选。图2H示出了在3个6-TG-抗性克隆中检测的NUDT5插入物(红色箭头)。上图示出了基因结构。下图示出了内含子插入位点(由TTAA所示)和上游外显子序列(在框中)的基因组序列。图中的序列在SEQ ID NO:5中陈述。图2I示出了导致经由NUDT5介导的PRPP产生的6-TG毒性的代谢途径的示意图。ADP：腺苷二磷酸；AMP：腺苷一磷酸。
图3A-J示出了单倍体和二倍体ES细胞的分子和细胞比较。图3A示出了用于比较分析的单倍体和二倍体ES细胞分离的实验方案。图3B示出了与2n pES12-衍生的胚状体(EB)样本相比，在G1的等基因单倍体(1n)和二倍体(2n)细胞的基于RNA-Seq的分级聚类分析(每细胞系两个生物平行测定)。图3C示出了在单倍体对比二倍体ES细胞中在常染色体和X染色体上的相对下调和上调基因的饼形图表示。图3D示出了通过X染色体基因的分级聚类分析。图3E-H示出了在单倍体和二倍体ES细胞中的差别X染色体灭活(XCI)状态。图3E示出了全基因组基因表达移动中值图(相对于通过RNA-Seq在G1中的二倍体的平均值，窗口大小＝100个基因)。图3F示出了XIST表达水平。(1)和(2)表示生物平行测定。图3G示出了H3K27me3染色。比例尺＝10μm。图3h示出了在X染色体上的DNA甲基化水平。图3I示出了在G1-分选的单倍体与二倍体ES细胞之间的相对总RNA、细胞体积及线粒体DNA(mtDNA)与基因组DNA(gDNA)的比率。平行测定的数量在括号中示出。误差棒代表s.d.。图3J示出了核(上图)和线粒体氧化磷酸化基因(下图)的平均表达水平±平均值标准误差(s.e.m.)，在单倍体ES细胞中相对于二倍体ES细胞上调(对于各组，n＝4，如图2e中)，及它们在此途径中结构的示意图。IMS：膜间间隙。*P<0.05；**P<0.01(双尾未配对学生t检验)。
图4A-P示出了单倍体人细胞的分化潜力。图4A示出了来自单倍体富集的和二倍体pES12细胞的21天EB的代表性图像。比例尺＝100μm。图4B示出了从图4a中的单倍体富集的EB解离的细胞的单倍体核型(图10a中示出的铺板细胞)。图4C示出了h-pES10EB细胞的DNA含量分布。图4D示出了组织特异性和多能特异性基因在G1-分选的单倍体(1n)和二倍体(2n)ES和EB pES10细胞)中的表达。图4E示出了NCAM1-阳性h-pES10-衍生的神经祖细胞(NPC)的DNA含量分布。图4F示出了神经特异性和多能特异性基因(分别在左图和右图)在G1-分选的单倍体pES10ES细胞和NPC中的表达。颜色编码的标度示出了相对于在NPC样本和ES细胞重复中的平均值的表达。图4G示出了在单倍体和二倍体pES10-衍生的EB和NPC中的差别XCI状态，如由全基因组基因表达移动中值图(窗口大小＝200个基因)所示。示出了在h-pES12-衍生的TUJ1-阳性神经元(图4H)、TNNT2-阳性心肌细胞(图4I)、FOXA2-阳性确定的内胚层细胞(图4k)及PDX1-阳性和NKX6.1-阳性PPC(图4l)中的着丝粒和分化标记共染色。放大插图示出了代表性单倍体和二倍体核。比例尺＝10μm。示出了分化为心肌细胞(图4J)和PDX1-阳性PPC(图4M)的h-pES12细胞的DNA含量分布。图4N示出了在h-pES12-衍生的畸胎瘤中的TUJ1(外胚层)、α-SMA(中胚层)、AFP(内胚层)及OCT4(多能性)染色。比例尺＝50μm。图4O示出了h-pES10-衍生的畸胎瘤的DNA含量分布。图4P示出了通过苏木精和曙红染色的组织学(左图；比例尺＝20μm)和DNA FISH(右图；比例尺＝20μm)分析的连续h-pES12-衍生的畸胎瘤切片。放大插图示出了代表性单倍体核(比例尺＝5μm)。
图5A-E示出了单倍体人ES细胞系h-pES12的衍生。图5A示出了在使用Hoechst33342染色对1c-细胞进行重复分选和富集之后由pES12细胞建立单倍体富集的人ES细胞系。从上到下示出了未分选的二倍体细胞、在第三次分选时的部分纯化的单倍体细胞、及在第五次分选时的大部分纯化的单倍体细胞的DNA含量分布。c：染色体拷贝。图5B示出了在富集和传代过程中的核型和单倍体中期百分比。图5C示出了DNA FISH且图5D示出了在h-pES12中的着丝粒蛋白免疫荧光染色。放大插图示出了分别具有单杂交信号(图5C)和23个着丝粒(图5D)的代表性单倍体核。比例尺＝10μm。图5E示出了比较单倍体(1n)pES10和pES12细胞与它们的未分选的二倍体(2n)配对物(对数尺度)的基于单核苷酸多态性(SNP)阵列的拷贝数变异(CNV)分析。
图6A-F示出了通过着丝点(centromere foci)的量化在单细胞水平下的倍性测定。图6A示出了与倍性相关的着丝粒的计数数目。1n：在第四次分选之后生长4代的单倍体富集的pES10细胞(n＝33；通过此测定法测定的76％单倍体)；2n：未分选的二倍体pES10细胞(n＝34)；3n：soPS2细胞35(n＝27)；4n：杂交1细胞36(n＝27)。黑色水平线表示平均值±s.e.m.且虚线标记出预期的染色体数目。图6B示出了通过图6a中的单倍体富集的(n＝152；通过此测定法测定的73％单倍体)和二倍体(n＝135)细胞中的DNA FISH对单倍体(1n)和二倍体(2n)细胞的量化。图6C示出了图6a中的单倍体富集的细胞的DNA含量分布(通过此测定法测定的73％单倍体)。c：染色体拷贝。着丝粒与磷酸组蛋白3(pH3，Ser10)(图6D)或5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)(图6E)的共染色区分了在单倍体pES12细胞中分裂间期的不同阶段。DNA染色以蓝色示出。比例尺＝5μm。图6F示出了在图6D和图6E中所示的不同细胞周期阶段中着丝粒计数的定量。n以括号示出。黑色水平线表示平均值±s.e.m.。
图7示出了在单倍体pES12细胞中的多能性干细胞标记。示出了在集落分辨率(上图；比例尺＝50μm)和单细胞分辨率(下图；比例尺＝10μm)下在h-pES12中的多能性标记NANOG、OCT4、SOX2、SSEA4及TRA-1-6(红色)、着丝粒(绿色)和DNA(蓝色)的共染色。放大插图示出了具有23个着丝粒的代表性单倍体细胞。
图8A-E示出了在单倍体人单性生殖ES细胞中的亲本印记和基因捕获诱变的分析。图8A和图8B示出了二倍体(2n)体外受精(IVF)ES细胞及G1-分选的单倍体(1n)和二倍体单性生殖ES(pES)细胞通过印记基因的表达水平(n＝75，参见表6)(图8A)和在印记差异甲基化区域处的DNA甲基化水平(iDMR，n＝35)37(图8B)的分级聚类分析。(1)和(2)表示生物平行测定。图8C示出了在图8a(RPKM比率)中所示的样本中在7个染色体中的代表性父本表达的印记基因的相对平均表达水平±s.e.m.。图8D示出了在图8B中所示的样本中代表性父本甲基化和母本甲基化iDMR(通常在双亲本对照细胞中是中等甲基化的，且在单性生殖细胞中分别是甲基化不足和过度甲基化的)的平均DNA甲基化水平±s.e.m.。β值的范围从完全甲基化不足(0)至完全过度甲基化(1)。图8E示出了piggyBac基因捕获系统的示意概图。基因捕获载体52侧接有piggyBac反向末端重复(ITR)和FRT位点，并且携带5′剪接受体(SA)、内部核糖体进入位点(IRES)元件，之后是无启动子嘌呤霉素抗性基因(PuroΔtk)和3′聚(A)信号(pA)。在PiggyBac转座酶(在单独的质粒上编码53)存在下，基因捕获载体经历向基因组中的随机转座。向转录活性基因中的插入造成内源性转录物的截短及嘌呤霉素抗性的引入。ITR：反向末端重复；FRT：flox位点。
图9A-I示出了等基因单倍体与二倍体人ES细胞的比较分析。图9A示出了在G1中的单倍体(1n)和二倍体(2n)ES细胞的分选纯度。图9B示出了在单倍体与二倍体人ES细胞之间的相对差异基因表达的对数标度的火山图，分成以下各图：所有基因(上)、常染色体基因(中)及X染色体基因(下)。Q：假发现率(FDR)。在单倍体细胞中的显著下调和上调基因(>2倍变化，Q<0.05)分别以红色和蓝色标记，且它们的总量在右侧示出。注意XIST是在单倍体细胞中最下调的转录物。图9C示出了所有表达的基因、所有表达的常染色体基因及所有表达的X染色体基因的1n/2n基因表达比率的平滑分布(表达阈值，平均RPKM>0.1)。图9D示出了通过表达微阵列分析得到的在G1中的单倍体与二倍体pE10细胞之间的基因表达比率的全基因组移动中值图(窗口大小＝100个基因)。图9E和图9F示出了如由差别XCI状态所推断的单倍体人ES细胞中的全基因组常染色体基因水平降低的模型。图9E示出了单倍体(Xa)和二倍体(XaXi)人ES细胞中的DNA含量、相对于总RNA的RNA表达水平、及绝对X染色体基因剂量的假定相等使得能够实现每单倍体细胞的总RNA水平的估计。Xa和Xi分别表示有活性(蓝色)和无活性的(红色)X染色体。A：常染色体；X：X染色体；R：总RNA。图9F示出了在图9e中所示的细胞中的相对和绝对RNA水平的示意性全基因组表示。图9G示出了G1-分选的单倍体和二倍体ES细胞的平均直径及计算的表面积和体积。误差棒代表s.d.(n＝4-8)。*P<0.01(双尾非配对Student t检验)。图9H和图9I示出了与二倍体ES细胞相比在单倍体ES细胞中相对下调基因和差异甲基化区(DMR)(图9H)以及相对上调基因(图9I)的功能注解富集分析。
图10A-C示出了单倍体人ES细胞的EB分化。图10A示出了从h-pES12-衍生的21天EB解离的铺板细胞的代表性图像，其核型呈现于图4b中。比例尺＝100μm。图10B示出了衍生自单倍体富集的和二倍体pES12细胞的解离的EB的DNA含量分布。c：染色体拷贝。图10C示出了在未分化的(ES)和分化的(EB)G1-分选的单倍体(1n)pES10细胞中组织特异性和多能特异性基因的表达水平(RPKM)。
图11A-I示出了单倍体人ES细胞的定向分化。图11A和图11B示出了在神经分化之后于h-pES10细胞中具有DNA和NCAM1共染色的流式细胞术分析。图11A示出了基于阴性第二抗体染色的对照样本(左图)对NCAM1-阳性细胞(右图)的选通。图11B示出了整个细胞群的DNA含量分布(与图4e有关)。c：染色体拷贝。图11C示出了在G1-分选的单倍体(1n)pES10ES细胞和NPC中神经特异性基因的表达水平(RPKM)。图11D示出了在单倍体和二倍体(2n)pES10-衍生的EB和NPC中的XIST表达水平。图11E示出了在h-pES12-衍生的神经元中的TUJ1染色。比例尺＝100μm。图11F示出了在图11E中所示的神经元上的DNA FISH。放大插图示出了分别具有单和双杂交信号的代表性单倍体和二倍体核。比例尺＝10μm。图11G示出了在G1-分选的单倍体pES12-衍生的心肌细胞中的TNNT2染色。比例尺＝10μm。图11H和图11I示出了在胰腺分化之后于h-pES10细胞中具有DNA和PDX1共染色的流式细胞术分析。图11H示出了基于阴性第二抗体染色的对照样本(左图)对PDX1-阳性细胞(右图)的选通。图11I示出了整个细胞群的DNA含量分布(与图4m有关)。c：染色体拷贝。
图12A-B示出了单倍体人ES细胞的体内分化。图12A示出了衍生自h-pES10和h-pES12的畸胎瘤的苏木精和曙红组织切片。比例尺＝50μm。图12B示出了在h-pES10-衍生的畸胎瘤中的TUJ1(外胚层)、α-SMA(中胚层)、AFP(内胚层)及OCT4(多能性)染色。DNA染色以蓝色显示。注意不存在核OCT4染色。比例尺＝100μm。
图13表示基因的富集的分析：它们的突变赋予对博来霉素的抗性。
图14是图解基因缺失(赋予对博来霉素的抗性)的多种肿瘤的分析的图。
具体实施方式
本发明在其一些实施方式中涉及个性化医学，并且更具体地涉及选择用于治疗对象中的疾病的适合疗法从而最小化抗药性的机会的方法。
在详细解释本发明的至少一个实施方式之前，应当理解，本发明不一定将其应用限制于下面的描述中陈述的或由实施例所示例的细节。本发明能够具有其它实施方式或者能够以不同方式实践或实施。
癌症死亡率通常由不能治愈的抗药性癌症引起。虽然在过去的二十年在抗癌药物研发中已经取得了巨大进步，但是癌症医学仍面临与选择对于个体患者有效治疗相关联的空前挑战。
本发明人提出利用人单倍体胚胎干细胞(ESC)和由其分化的细胞，来选择以个性化方式治疗癌症的疗法。具体地，本发明人提出了使用利用这些细胞的正向遗传筛选以发现引起对化学治疗剂的抗性的基因候选者。利用该知识，本发明人提出分析用于表达这些基因的对象的肿瘤以便于避免无效药物的治疗。而且，该知识可以帮助在临床试验中进行患者群分层。
在减少本发明实践的同时，本发明人发现了一组大约20种与博来霉素抗性相关联的基因。这些基因中的两种(RIF1和PINX1)在DNA损伤反应和端粒酶长度中涉及(图13)。
本发明人然后分析了多种肿瘤并且显示它们中的一些呈现这两种基因的缺失和/或不存在这两种基因的表达，这表明这些特定肿瘤对博来霉素将是有抗性的(图14)。
因而，根据本发明的第一方面，提供了选择用于治疗对象的疾病的药剂的方法，其包括：
(a)将多种单倍体人胚胎干(ES)细胞暴露于细胞毒性疗法，其中所述多种单倍体ES细胞的至少一部分包括独特的人工灭活的或过度活化的基因；
(b)选择对所述细胞毒性疗法显示抗性的所述多种单倍体人胚胎干(ES)细胞中的细胞；
(c)鉴定在所述细胞中所述独特的人工灭活的基因或过度活化的基因；和
(d)分析所述独特的人工灭活的基因或活化的基因在对象的细胞样本中的序列和/或表达，其中与所述基因在对照样本中的序列和/或表达相比，所述基因的序列和/或表达水平的改变表明药剂应当作为用于治疗对象中疾病的单一疗法被排除。
根据本发明的另一方面，提供了选择用于治疗疾病的药剂的方法，其包括：
(a)将多种人单倍体细胞暴露于细胞毒性疗法，其中所述细胞由单倍体人胚胎干(ES)细胞分化，并且其中所述多种细胞的至少一部分包括独特的人工灭活的或过度活化的基因；
(b)选择对所述细胞毒性疗法显示抗性的所述多种细胞中的细胞；和
(c)鉴定在所述细胞中所述独特的人工灭活的或过度活化的基因。
如本文所使用，短语“干细胞”指的是如此的细胞：其能够在培养物中保持在未分化状态(例如，多能(pluripotent,multipotent)干细胞)持续延长的时间段，直到被诱导分化为具有特定、专有功能的其它细胞类型(例如，完全分化的细胞)。
短语“胚胎干细胞”指的是如此的多能胚胎细胞：其能够分化为所有三种胚胎胚层(即，内胚层、外胚层和中胚层)的细胞，或者保持在未分化状态。短语“胚胎干细胞”可以包括由在胚胎的植入之前(即，植入前胚泡)在怀孕之后(即，胚泡)形成的胚性组织获得的细胞，由植入后/原肠胚形成前阶段胚泡获得的扩展的胚泡细胞(EBC)(参见WO2006/040763)和在怀孕期间的任何时间(优选地在怀孕10周之前)由胎儿的生殖器组织获得的胚胎生殖(EG)细胞。
如本文所使用，“单倍体细胞”指的是具有单倍体DNA含量的细胞，例如卵母细胞、卵裂细胞(blastomer)、胚胎干细胞或分化的胚胎干细胞，其中单倍体DNA具有所有雄性或所有雌性起源，优选地雌性起源。类似地，单倍体(单性生殖)卵裂细胞、桑椹胚或胚泡、或本发明的胚胎干细胞或细胞系或细胞群的特征在于单倍体DNA含量。如本文所使用，“单倍体DNA”指的是人中所有男性或所有女性起源的23种染色体。如在下面的实施例中所示出的，单倍体人胚胎干细胞可以由人工活化的人卵母细胞生成。单倍体ES细胞然后基于细胞倍性分化从而产生富集的单倍体人ES细胞群。
如本文所使用，术语“分离的细胞”或“分离的(单倍体)胚胎干细胞”一般指不与一种或多种细胞或一种或多种细胞组分(其在体内与细胞相关联)相关联的细胞。例如，分离的细胞可以从其天然环境去除，或者可以起因于已经从其天然环境去除的细胞的繁殖，例如离体繁殖。
如本文所使用的术语“卵母细胞”意思是在生殖中涉及的雌性配子体或生殖细胞。卵母细胞可以是未成熟的卵子或卵细胞。卵母细胞在雌性胚子形成期间产生于卵巢中。用于分离卵母细胞的方法是本领域中熟知的。本质上，这将包括从卵巢或雌性对象的生殖系分离卵母细胞(参见，例如，"Principles and Practice of Fertility Preservation",Cambridge University Press 2011，J.Donnez和S.S.Kim编著)。
在本发明的背景下使用的卵母细胞获得自人女性对象。卵母细胞可以是未受精的且未成熟的卵母细胞，或未受精的且成熟的卵母细胞。优选地，卵母细胞是未受精的且未成熟的卵母细胞。所述未成熟的卵母细胞可以通过文献中描述的方法在体外成熟(示例性地参见Krotz et al.2010)。
在本发明的方法的一个实施方式中，未受精的和未成熟的卵母细胞被分离，然后在体外成熟，然后活化。
如本文所使用，短语“卵母细胞的活化”指的是如此的过程：其中未受精的卵母细胞(优选地外源地)活化，使得其经历通常包括染色单体对的分离和第二极体的挤出的过程，导致卵母细胞具有单倍体数目的染色体，每个具有一个染色单体等。“活化”还包括如此的方法：包含所有雌性起源的DNA的细胞由此被诱导以发育成具有可辨别的内细胞团和滋养外胚层的胚胎，其对于产生多能胚胎干细胞是有用的。本发明的实施方式还包括卵母细胞或卵裂细胞比如内细胞团细胞或滋养层细胞的活化，卵母细胞或卵裂细胞已经植入雄性(雄核发育)或雌性单倍体核(雌核发育)。
如本文所使用的“活化的卵母细胞”指的是已经单性生殖地活化或产雄性征地(androgenetically)活化的未受精的且任选地成熟的卵母细胞。单性生殖技术涉及使用电脉冲、钙离子载体、激酶抑制剂、翻译抑制剂或这些的组合对卵母细胞的活化。例如，人卵母细胞可以如在本文下面的实施例章节中描述的进行活化。产雄性征技术涉及利用精子对无核卵母细胞的受精，通常通过卵胞浆内单精子显微注射技术(intracytoplasmic sperminjection)。在卵母细胞的受精之前或之后去除卵母细胞的基因组以生成仅包含精子基因组的细胞。对于单性生殖，卵母细胞可以暴露于活化刺激物。
在活化之后，卵母细胞开始以程序化方式分裂和分化，直到生成具有5天胚胎的结构的胚泡。
本领域描述了用于生成衍生自活化的卵母细胞的桑椹胚或胚泡的适合培养条件(例如Sagi et al.,Nature 532,pages 107-111,2016)。
然后例如通过免疫外科从胚泡去除(分离)内细胞团，其中通过温和移液模式从完整的ICM裂解和去除滋养外胚层细胞。然后将ICM在包含能够使其派生的适合培养基的组织培养瓶中铺板。在9至15天之后，通过机械解离或通过酶促降解将ICM衍生的派生解离为簇，然后将细胞在新鲜组织培养基上再铺板。通过微量移液管单独地选择显示未分化的形态学的集落，机械地解离为簇，并再铺板。
在本文下面的实施例章节中和在Sagi et al.,Nature 532,pages 107-111,2016中提供了生成人单倍体ES细胞的进一步细节。
一旦生成，在培养物中维持单倍体人ES细胞。优选地，从培养物选择或在培养物中分选单倍体细胞。单倍体细胞可以通过中期传播分析或分选具有小于2个染色体拷贝的细胞来鉴定。在一些实施方式中，分选步骤基于细胞倍性或细胞表面标记，并且包括至少一个周期的流式细胞术，优选地荧光活化细胞分选术(FACS)。单倍体细胞还可以通过流式细胞术、着丝粒蛋白免疫荧光染色或DNA荧光原位杂交(FISH)鉴定。本领域中已知的其他细胞分选技术，例如磁活化细胞分选术(MACS)，也可以在本发明的方法中使用。
本发明的单倍体人ES细胞和细胞系可保持“在培养物中”，例如在标准人ES细胞生长条件下。根据一个实施方式，在含有补充有15％Knockout血清替代物(KSR；Gibco,LifeTechnologies)、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、青霉素和链霉素(分别为50单位mL–1和50μg mL–1)、0.1mMβ-巯基乙醇及8ng mL–1碱性成纤维细胞生长因子的KnockoutDulbecco改良的Eagle培养基(Gibco,Life Technologies)的培养基中在凝胶包被的板中在停滞的小鼠胚胎成纤维细胞的饲养细胞层上进行培养。细胞可维持在37℃和5％CO2下的湿润培养箱中并且使用无EDTA的胰蛋白酶溶液A每3–5天进行传代。优选地，单倍体人ES细胞维持在培养物中至少二代、三代、至少四代、至少五代、至少七代、至少十代、至少二十代或至少三十代。优选地，单倍体人ES细胞维持在培养物中至少约十天、至少约二十天、至少约三十天、至少约四十五天、至少约六十天、至少约三个月、至少约四个月或至少约六个月。
术语“细胞系”是指可在培养物中生长许多代且可通过细胞分选富集单倍体细胞的细胞。根据本发明的一个实例，将细胞系在标准人ES细胞生长条件下培养且通过每3至5次传代分选偶尔富集单倍体级分。
如本文所用，术语“富集群”是指在总细胞群中大于1％，优选大于5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％的单倍体细胞的百分比。通常，富集群可在单个分选(如FACS)周期之后获得。
术语“基本上纯的”是指在总细胞群中大于90％，优选大于91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的单倍体细胞的百分比。最优选地，基本上纯的群为单倍体细胞的汇合群。
任选地，人单倍体胚胎干细胞可以沿着特定细胞谱系(离体)分化。本发明人已经证明分化的细胞可以由从单倍体人ES细胞分化的胚体，或者通过单倍体人ES细胞朝向特定谱系的定向分化产生。
下面是用于诱导EB分化为谱系特异性细胞的多个程序和途径的非限制性描述。
神经前体细胞
为了将本发明的一些实施方式的EB分化为神经前体细胞，将四天龄的EB在组织培养皿中培养5-12天，该组织培养皿包括含有5mg/ml胰岛素、50mg/ml转铁蛋白、30nM氯化硒和5mg/ml纤连蛋白的DMEM/F-12培养基(ITSFn培养基，Okabe,S.et al.,1996,Mech.Dev.59:89-102)。得到的神经前体细胞可以进一步被移植以在体内生成神经细胞(Brüstle,O.et al.,1997.In vitro-generated neural precursors participate inmammalian brain development.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.94:14809-14814)。将领会，在其移植之前，神经前体细胞在0.1％DNase的存在下被胰蛋白酶化并磨碎至单细胞悬浮液。
少突胶质细胞和成髓鞘细胞
通过在改良的SATO培养基中培养细胞，本发明的一些实施方式的EB可以分化至少突胶质细胞和成髓鞘细胞，改良的SATO培养基即含有牛血清白蛋白(BSA)、丙酮酸、孕酮、腐胺、甲状腺素、三碘甲状腺氨酸(triiodothryonine)、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、氨基酸、神经营养蛋白3、睫状神经营养因子和4-羟乙基哌嗪乙磺酸的DMEM(Bottenstein,J.E.&Sato,G.H.,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76,514-517；Raff,M.C.,Miller,R.H.,&Noble,M.,1983,Nature 303:390-396]。简言之，EB使用0.25％胰蛋白酶/EDTA解离(37℃下5min)并且磨碎至单细胞悬浮液。将悬浮的细胞在烧瓶中铺板，烧瓶包含补充有5％马血清和5％胎牛血清(FCS)的SATO培养基。培养4天之后，温和地摇动烧瓶以松散地(loosely)悬浮粘附细胞(主要是少突胶质细胞)，同时星形胶质细胞保持粘附至烧瓶并进一步产生条件培养基。将初生少突胶质细胞转移至包含SATO培养基的新烧瓶，持续另外两天。总共培养6天之后，将少突胶质前体细胞(oligosphere)部分地解离并重悬在SATO培养基中，用于细胞移植，或者完全地解离并在衍生自前面的摇动步骤的少突胶质前体细胞条件培养基中铺板[Liu,S.et al.,(2000).Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytesand myelinate in culture and after spinal cord transplantation.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97:6126-6131]。
肥大细胞
对于肥大细胞分化，将本发明的一些实施方式的两周龄EB转移至组织培养皿，该组织培养皿包括补充有10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素、100mg/ml链霉素、20％(v/v)WEHI-3细胞条件培养基和50ng/ml重组大鼠干细胞因子的DMEM培养基(rrSCF,Tsai,M.et al.,2000.In vivo immunological function of mast cells derived fromembryonic stem cells:An approach for the rapid analysis of even embryoniclethal mutations in adult mice in vivo.Proc Natl Acad Sci USA.97:9186-9190)。通过转移细胞至新烧瓶并且替换一半培养基，使培养物每周扩展。
血-淋巴细胞
为了由本发明的一些实施方式的EB生成血-淋巴细胞，在7.5％CO2和5％O2存在下使用具有可调节的氧含量的培养箱将2-3龄EB转移至透气培养皿。分化15天之后，收获细胞并通过利用胶原酶(0.1单位/mg)和分散酶(0.8单位/mg)的温和消化解离，这两种酶可得自F.Hoffman-La Roche Ltd,Basel,Switzerland。使用抗-CD45单克隆抗体(mAb)M1/9.3.4.HL.2和缀合至山羊抗-大鼠免疫球蛋白的顺磁性微珠(Miltenyi)分离CD-45阳性细胞，如在Potocnik,A.J.et al.,(Immunology Hemato-lymphoid in vivo reconstitutionpotential of subpopulations derived fromin vitro differentiated embryonicstem cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1997,94:10295-10300)中描述的。使用单次传代在MACS柱(Miltenyi)上进一步富集分离的CD-45阳性细胞。
将领会，由于EB具有复杂的结构，因此EB分化为特异性分化的细胞、组织或器官可能需要从EB分离谱系特异性细胞。
可以通过经由荧光活化细胞分选仪(FACS)分选EB的细胞或机械分离EB内包含的细胞、组织和或组织样结构来实现这种分离。
本领域已知经由FACS分析来分离EB衍生的分化的细胞的方法。根据一种方法，使用胰蛋白酶和EDTA (分别为0.025％和0.01％)的溶液分解EB，利用在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的5％胎牛血清(FBS)洗涤，并且利用针对对于特异性细胞谱系的细胞表面抗原特性的荧光标记的抗体在冰上培育30min。例如，通过附着针对血小板内皮细胞粘附分子-1(PECAM1)的抗体(比如可得自PharMingen(PharMingen,Becton Dickinson Bio Sciences,San Jose,CA,USA)的荧光标记的PECAM1抗体(30884X))分离内皮细胞，如在Levenberg,S.et al.,(Endothelial cells derived from human embryonic stem cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2002.99:4391-4396)中描述的。使用荧光标记的抗体比如CD34-FITC、CD45-PE、CD31-PE、CD38-PE、CD90-FITC、CD117-PE、CD15-FITC、I类-FITC(全部IgG1可得自PharMingen)、CD133/1-PE(IgG1)(可得自MiltenyiBiotec,Auburn,CA)和血型糖蛋白A-PE(IgG1)(可得自Immunotech(Miami,FL))分离造血细胞。利用PC-LYSIS或CELLQUEST软件通过使用碘化丙啶排除死细胞在FACScan(Becton Dickinson Bio Sciences)上分析活细胞(即，没有固定)。将领会，使用磁标记的第二抗体和磁分离柱(MACS,Miltenyi)可以进一步富集分离的细胞，如由Kaufman,D.S.et al.,(Hematopoietic colony-forming cellsderived from human embryonic stem cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001,98:10716–10721)描述的。
在Xu等人的美国专利申请号20030022367中公开了从EB机械分离搏动的心肌细胞的实例。简言之，将本发明的一些实施方式的四天龄EB转移至明胶包被的板或腔式载玻片并允许附着和分化。自发地收缩细胞(其从分化的第8天观察到)被机械地分离并收集入包含低钙培养基或PBS的15-mL管。根据胶原酶活性，在37℃下使用胶原酶B消化60-120分钟解离细胞。然后将解离的细胞重悬在分化KB培养基(85mM KCI、30mM K2HPO4、5mM MgSO4、1mMEGTA、5mM肌酸、20mM葡萄糖、2mM Na2ATP、5mM丙酮酸和20mM牛磺酸，缓冲至pH 7.2，Maltsevet al.,Circ.Res.75:233,1994)并在37℃下培育15-30min。在解离之后，将细胞接种入腔式载玻片并在分化培养基中培养以生成能够搏动的单一心肌细胞。
将领会，适合于分离的谱系特异性细胞的分化和扩展的培养条件包括各种组织培养基、生长因子、抗生素、氨基酸等，并且在本领域技术人员的能力内的是确定应当应用哪种条件以便于扩展和分化具体细胞类型和/或细胞谱系[在Fijnvandraat AC,et al.,Cardiovasc Res.2003；58:303-12；Sachinidis A,et al.,Cardiovasc Res.2003；58:278-91；Stavridis MP and Smith AG,2003；Biochem Soc Trans.31(Pt 1):45-9中综述]。
可以通过本领域已知的方法使EB衍生的细胞无限增殖产生本发明的一些实施方式的细胞系，所述方法包括例如在细胞中表达端粒酶基因(Wei,W.et al.,2003.Mol CellBiol.23:2859–2870)或利用NIH 3T3hph-HOX11逆转录病毒生产细胞共培养细胞(Hawley,R.G.et al.,1994.Oncogene 9:1-12)。
下面是培养条件的非限制性实例，其适合于由本发明的单倍体胚胎干细胞分化和/或扩展谱系特异性细胞。
CD73阳性和SSEA-4阴性的间充质干细胞可以通过机械地增加在hESC的培养物中形成的成纤维细胞样分化的细胞的部分由hESC生成，基本上如在Trivedi P and HemattiP.Exp Hematol.2008,36(3):350-9中描述的。简言之，为了诱导hESC的分化，培养基改变之间的间隔增加至3-5天，并且在ESC集落的外周处的细胞变为梭状成纤维细胞样(looking)细胞。在这些条件下9-10天之后，当培养物中大约40-50％的细胞获得成纤维细胞样外观时，ESC集落的未分化部分被物理地去除并且剩余的分化细胞在相同条件下传代至新培养板。
为了诱导hESC分化为多巴胺能(DA)神经元，细胞利用小鼠基质细胞系PA6或MS5共培养，或者可以利用基质细胞衍生因子1(SDF-1/CXCL12)、多效生长因子(PTN)、胰岛素样生长因子2(IGF2)和肝配蛋白B1(EFNB1)的组合培养，基本上如在Vazin T,et al.,PLoSOne.2009Aug 12；4(8):e6606中；和在Elkabetz Y.,et al.,Genes Dev.2008January 15；22:152–165中描述的。
为了生成中脑多巴胺(mesDA)神经元，hESC可以被遗传修饰以表达转录因子Lmx1a(例如，使用含有PGK启动子和Lmx1a的慢病毒载体)，基本上如在Friling S.,et al.,ProcNatl Acad Sci U S A.2009,106:7613–7618中描述的。
为了由hESC生成肺上皮细胞(II型肺细胞)，可以在商业可得的细胞培养基(SmallAirway Growth Medium；Cambrex,College Park,MD)的存在下，或可选地，在从肺细胞系(例如，A549人肺腺癌细胞系)收集的条件培养基的存在下培养ESC，如在Rippon HJ.,etal.,Proc Am Thorac Soc.2008；5:717–722中描述的。
为了诱导hESC或人iPS细胞分化为神经细胞，可以在补充有TGF-b抑制剂(SB431542，Tocris；例如，10nM)和Noggin(R&D；例如，500ng/ml)的血清置换培养基的存在下培养多能干细胞，持续大约5天，其后在500ng/mL Noggin的存在下，利用增加量(例如，25％、50％、75％，每两天改变)的N2培养基(Li XJ.,et al.,Nat Biotechnol.2005,23:215-21)培养细胞，基本上如在Chambers SM.,et al.,Nat Biotechnol.2009,27:275–280中描述的。
在分化期间，可以监测干细胞的分化状态和或倍性情况。可以在检查对于指示分化已知的细胞或组织特异性标记之后确定细胞分化。例如，灵长类动物ES细胞可以表达阶段特异性胚胎抗原(SSEA)4、肿瘤排斥抗原(TRA)-1-60和TRA-1-81。
可以使用本领域中熟知的免疫学技术检测组织/细胞特异性标记[Thomson JA etal.,(1998).Science 282:1145-7]。实例包括但不限于流式细胞术(对于膜结合标记)、免疫组织化学(对于细胞外和细胞内标记)和酶促免疫分析(对于分泌的分子标记)。
也可以经由碱性磷酸酶活性的测量实现ES细胞分化的测定。未分化的人ES细胞具有碱性磷酸酶活性，其可以通过利用4％多聚甲醛固定细胞并利用Vector Red底物试剂盒根据制造商的说明书显影来检测(Vector Laboratories,Burlingame,California,USA)。
可以在体外通过胚体(EB)的形成以及在体内经由畸胎瘤的形成监测胚胎干细胞的多能性。
从ESC分离谱系特异性细胞
如本文所使用，短语“分离谱系特异性细胞”指的是培养物中具有主要显示与特异性谱系表型相关联的至少一种特性的细胞的混合细胞群的富集。将领会，所有细胞谱系衍生自三种胚胎胚层。因而，例如，肝细胞和胰细胞衍生自胚胎内胚层，骨、软骨、弹性组织、纤维结缔组织、肌细胞、心肌细胞、骨髓细胞、血管细胞(即内皮细胞和平滑肌细胞)和造血细胞由胚胎中胚层分化，并且神经细胞、视网膜细胞和表皮细胞衍生自胚胎外胚层。
可以通过在适合于特异性细胞谱系的分化的培养条件下直接诱导扩展的、未分化的ESC获得谱系特异性细胞。
因而，在一个实施方式中，人单倍体胚胎干细胞分化为最终分化的细胞(例如，皮肤细胞、神经元细胞、肝细胞、胰细胞、卵巢细胞、乳腺细胞、视网膜细胞)或分化至具有有限分化潜能的细胞(例如，限制于特异性细胞谱系的前体细胞)。
在一些实施方式中，人单倍体胚胎干细胞可以分化为多能单倍体细胞。
本发明的“多能”单倍体人细胞是祖细胞或干细胞，其具有发育为多种，但不是全部细胞类型的潜能。神经干细胞、造血干细胞和间充质干细胞是多能细胞的非限制性实例。
一旦生成，将本发明的单倍体人细胞暴露于诱变剂以生成单倍体人干细胞的突变体群(例如，单倍体人胚胎干细胞)。在一个实施方式中，突变体群是突变体文库。
适合于在本发明中使用的诱变剂包括物理诱变剂，比如离子辐射(X射线、γ射线、紫外线等)；化学诱变剂，比如烷化剂；和生物学试剂，比如质粒、噬菌体或病毒载体。生物学试剂的实例包括插入载体，例如，基因捕获载体，和用于顶点诱变的技术，比如锌指核酸酶(ZFN)、转录活化剂样效应核酸酶(transcription activator-like effector nuclease)(TALEN)，或CRISPR/Cas9系统。
本发明人考虑突变体文库的生成，其中文库的细胞的至少一部分(例如5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)具有至少一种独特的、人工灭活的或活化的基因。在一个实施方式中，文库的细胞的至少一部分具有一种人工灭活的或活化的基因。在另一个实施方式中，文库的细胞的至少一部分具有多于一种(例如2、3、4、5或更多种)人工灭活的或活化的基因。
群(例如文库)中细胞的数目可以改变。在一些实施方式中，诱变处理的细胞的数目在104和1013个细胞之间。在一些实施方式中，细胞的数目可以是至少大约105、106、107、108、109、1010、1011、1012个细胞，或更多。在一些实施方式中，诱变处理的或筛选的细胞的数目在105和1012个细胞之间，例如，至少106、107、108、109、1010、1011和高达1012个。在一些实施方式中，诱变处理或筛选使用多种细胞群执行和/或重复多次。在一些实施方式中，检查或评估的细胞的数目在105和1012个细胞之间，例如106、107、108、109、1010、1011、高达大约1012个。在一些实施方式中，使用更少数目的细胞，例如1-104个细胞。在一些实施方式中，细胞群包含在单独容器中，例如培养容器，比如培养板、烧瓶或孔。在一些实施方式中，细胞群包含在多个容器中。在一些实施方式中，合并两种或多种细胞群以形成较大的群。在一些实施方式中，单倍体人细胞群包括在细胞中存在的至少50％、至少75％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％的基因中共同具有插入的细胞。
术语“灭活基因”指的是具有导致其表达下调的人工变更的核酸序列(例如突变)的基因。在一个实施方式中，基因的人工变更的核酸序列确保基因的功能蛋白产物根本不表达。在另一个实施方式中，基因的人工变更的核酸序列确保基因的功能蛋白产物的表达水平与没有暴露于人工灭活该基因的试剂的对照人单倍体ESC中的水平相比，下调至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。
术语“活化基因”指的是具有导致其表达上调的人工变更的核酸序列(例如突变)的基因。在一个实施方式中，基因的人工变更的核酸序列确保与没有暴露于人工灭活该基因的试剂的对照人单倍体ESC中的水平相比，基因的功能蛋白产物的表达水平上调至少50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更多。
根据一个实施方式，可以使用工程化内切酶执行基因组编辑以灭活或活化基因。该途径指的是反向遗传学方法，其使用人工地工程化核酸酶在基因组的期望位置(一个或多个)处切割和创建特异性双链断裂，然后通过细胞内源性过程比如同源定向修复(HDS)和非同源末端连接(NFfEJ)来修复。NFfEJ直接地连接双链断裂中的DNA末端，同时HDR利用同源序列作为用于再生断裂点处缺少的DNA序列的模板。为了将特异性核苷酸修饰引入基因组DNA，在HDR期间必须存在包含期望序列的DNA修复模板。不能使用传统的限制性内切核酸酶执行基因组编辑，因为大多数限制酶识别DNA上的几个碱基对作为它们的靶标和可能性非常高的是，识别的碱基对组合将在跨越基因组的多个位置中发现，导致不限于期望位置的多次切割。为了克服该挑战和创建位点特异性单链或双链断裂，迄今为止已经发现并生物工程化几个不同的核酸酶种类。这些包括大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录活化剂样效应核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas系统。
大范围核酸酶–大范围核酸酶通常被分为四个家族：LAGLIDADG家族、GIY-YIG家族、His-Cys box家族和HNH家族。这些家族的特征在于结构基序，其影响催化活性和识别序列。例如，LAGLIDADG家族的成员的特征在于具有一个或两个拷贝的保守的LAGLIDADG基序。关于保守的结构元件，和因此DNA识别序列特异性和催化活性，大范围核酸酶的四个家族广泛地彼此分开。大范围核酸酶通常发现于微生物物种中并且具有非常长的识别序列的(>14bp)的独特性质，因而使得它们对于在期望位置处的切割天然具有非常强的特异性。这可以被利用以在基因组编辑中制造位点特异性双链断裂。本领域技术人员可以使用这些天然存在的大范围核酸酶，但是这种天然存在的大范围核酸酶的数目被限制。为了克服这个挑战，诱变和高通量筛选方法已经被用于创建识别独特序列的大范围核酸酶变体。例如，各种大范围核酸酶已经被融合以创建识别新序列的杂交酶。可选地，大范围核酸酶的DNA相互作用氨基酸可以被变更以设计序列特异性大范围核酸酶(参见例如，US专利8,021,867)。可以使用在例如Certo,MT et al.Nature Methods(2012)9:073-975；美国专利号8,304,222；8,021,867；8,119,381；8,124,369；8,129,134；8,133,697；8,143,015；8,143,016；8,148,098；或8,163,514中描述的方法设计大范围核酸酶，其每篇的内容通过引用以其全部被并入本文。可选地，具有位点特异性切割特性的大范围核酸酶可以使用商业可得的技术获得，例如Precision Biosciences'Directed Nuclease EditorTM基因组编辑技术。
ZFN和TALEN–两种不同种类的工程化核酸酶(锌指核酸酶(ZFN)和转录活化剂样效应核酸酶(TALEN))都已经被证明在产生靶向的双链断裂中是有效的(Christian et al.,2010；Kim et al.,1996；Li et al.,2011；Mahfouz et al.,2011；Miller et al.,2010)。
从根本上说，ZFN和TALEN限制性内切核酸酶技术利用与特异性DNA结合结构域(分别地一系列锌指结构域或TALE重复)连接的非特异性DNA切割酶。通常，选择DNA识别位点和切割位点彼此分开的限制酶。裂解部分被分离并且然后连接至DNA结合结构域，从而获得对期望序列具有非常高的特异性的内切核酸酶。具有这种性质的示例性限制酶是Fokl。另外，Fokl具有需要二聚以具有核酸酶活性的优势，并且这意味着特异性急剧增加，因为每个核酸酶配偶体识别独特的DNA序列。为了增强该效应，已经工程化Fokl核酸酶，其仅可以起异二聚体的功能并且具有增加的催化活性。起核酸酶功能的异二聚体避免不需要的同源二聚体活性的可能性并且因而增加双链断裂的特异性。
因而，例如为了靶向特异性位点，ZFN和TALEN被构建为核酸酶对，其中该对的每个成员被设计以结合靶位点处的相邻序列。在细胞中瞬时表达之后，核酸酶结合至其靶位点并且FokI结构域异二聚化以创建双链断裂。这些双链断裂通过非同源末端连接(NHEJ)途径的修复最通常导致小的缺失或小的序列插入。由于由NHEJ进行的每种修复是独特的，因此单个核酸酶对的使用可以产生在靶位点处具有一系列不同缺失的等位基因系列。缺失通常是从长度为几个碱基对到几百个碱基对的任何范围，但是在细胞培养中通过同时使用两对核酸酶已经成功地生成较大缺失(Carlson et al.,2012；Lee et al.,2010)。另外，当对靶向区域具有同源性的DNA的片段连同核酸酶对一起被引入时，双链断裂可以经由同源定向修复进行修复以生成特异性修饰(Li et al.,2011；Miller et al.,2010；Urnovet al.,2005)。
虽然ZFN和TALEN二者的核酸酶部分具有类似的性质，但是这些工程化核酸酶之间的区别在于它们的DNA识别肽。ZFN依赖于Cys2-His2锌指，和TALEN依赖于TALE。这些DNA识别肽结构域都具有如下特征：它们以组合天然地发现于它们的蛋白质中。Cys2-His2锌指通常发现于相距3bp的重复中，并且发现于以多种核酸相互作用蛋白质的不同组合中。另一方面，TALE发现于氨基酸和识别的核苷酸对之间以一对一识别比的重复中。因为锌指和TALE二者以重复模式发生，因此可以尝试不同组合以创建多种序列特异性。用于制造位点特异性锌指内切核酸酶的途径包括例如模块化组装(其中与三联体序列相关联的锌指连续地附接以覆盖需要的序列)、OPEN(肽结构域对三联体核苷酸的低严格度选择，然后肽组合对细菌系统中最终靶标的高严格度选择)和锌指文库的细菌一杂交筛选，等。ZFN也可以由例如Sangamo BiosciencesTM(Richmond,CA)设计和商业获得。
在例如Reyon et al.Nature Biotechnology 2012May；30(5):460-5；Miller etal.Nat Biotechnol.(2011)29:143-148；Cermak et al.Nucleic Acids Research(2011)39(12):e82和Zhang et al.Nature Biotechnology(2011)29(2):149–53中描述了用于设计和获得TALEN的方法。通过梅约诊所(Mayo Clinic)引入被称为Mojo Hand的最近研发的基于网络的程序，该程序用于为基因组编辑应用设计TAL和TALEN构建体(可以通过www.talendesign.org访问)。TALEN也可以由例如Sangamo BiosciencesTM(Richmond,CA)设计和商业获得。
CRISPR-Cas系统–许多细菌和古细菌包含基于内源性RNA的适应性免疫系统，其可以降解侵入噬菌体和质粒的核酸。这些系统由产生RNA组分的成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)基因，和编码蛋白质组分的CRISPR相关的(Cas)基因构成。CRISPR RNA(crRNA)包含对特定病毒和质粒具有同源性的短的延伸并且充当引导Cas核酸酶降解相应病原体的互补性核酸的指导。酿脓链球菌的II型CRISPR/Cas系统的研究已经表明三种组分形成RNA/蛋白质复合物并且一起对于序列特异性核酸酶活性是充分的：Cas9核酸酶、包含对靶序列具有同源性的20个碱基对的crRNA、和反式活化crRNA(tracrRNA)(Jinek etal.Science(2012)337:816–821)。进一步证明，由crRNA与tracrRNA之间的融合体组成的合成嵌合指导RNA(gRNA)可以引导Cas9在体外裂解与crRNA互补的DNA靶标。还证明，Cas9连同合成gRNA的瞬时表达可以被用于产生多种不同种类的靶向的双链断裂(Cho et al.,2013；Cong et al.,2013；DiCarlo et al.,2013；Hwang et al.,2013a,b；Jineket al.,2013；Mali et al.,2013)。
用于基因组编辑的CRIPSR/Cas系统包含两种不同的组分：gRNA和内切核酸酶，例如Cas9。
gRNA通常是20个核苷酸的序列，其编码靶同源序列(crRNA)和内源细菌RNA的组合，所述内源细菌RNA在单个嵌合转录物中连接crRNA至Cas9核酸酶(tracrRNA)。通过gRNA序列和补体基因组DNA之间的碱基配对将gRNA/Cas9复合物募集到靶序列中。为了成功结合Cas9，基因组靶序列还必须就在靶序列后含有正确的Protospacer Adjacent Motif(PAM)序列。gRNA/Cas9复合物的结合将Cas9定位于基因组靶序列，使得Cas9可以切割DNA的两条链，导致双链断裂。与ZFN和TALEN一样，CRISPR/Cas产生的双链制动器可以进行同源重组或NHEJ。
Cas9核酸酶具有两个功能性结构域：RuvC和HNH，每个切割不同的DNA链。当这两个结构域都有活性时，Cas9在基因组DNA中引起双链断裂。
CRISPR/Cas的一个显著优点是该系统的高效率与易于产生合成gRNA的能力相结合能够同时靶向多个基因。此外，携带突变的大多数细胞在靶基因中呈现双等位基因突变。
然而，gRNA序列和基因组DNA靶序列之间的碱基配对相互作用的明显灵活性允许与待由Cas9切割的靶序列的不完美匹配。
含有单个无活性催化结构域(RuvC-或HNH-)的Cas9酶的修饰形式称为‘切口酶’。只有一个活性核酸酶结构域，Cas9切口酶仅切割靶DNA的一条链，产生单链断裂或‘切口’。通常使用完整的互补DNA链作为模板，通过HDR途径快速修复单链断裂或切口。然而，由Cas9切口酶引入的两个近端、相对的链切口被处理为双链断裂，其通常被称为‘双切口’CRISPR系统。根据对基因靶标的预期作用，可以通过NHEJ或HDR修复双切口。因此，如果特异性和减少的脱靶效应是至关重要的，则使用Cas9切口酶通过设计具有紧密靠近基因组DNA和基因组DNA的相对链上的靶序列的两条gRNA来形成双切口将降低脱靶效应，因为单独的任一gRNA将导致不改变基因组DNA的切口。
含有两个无活性催化结构域的Cas9酶(死Cas9或dCas9)的修饰形式没有核酸酶活性，同时仍能够基于gRNA特异性结合DNA。dCas9可用作DNA转录调节因子的平台，通过将无活性酶与已知的调节结构域融合来活化或抑制基因表达。例如，单独的dCas9与基因组DNA中的靶序列的结合可以干扰基因转录。
存在许多公开可用的工具可用于帮助选择和/或设计靶序列以及对不同物种中的不同基因的生物信息学确定的独特的gRNA的列表例如Feng Zhang实验室的TargetFinder、Michael Boutros实验室的Target Finder(E-CRISP)、RGEN工具：Cas-OFFinder、CasFinder：灵活的算法(用于识别基因组中的特异性Cas9靶标)和CRISPR Optimal TargetFinder。
为了使用CRISPR系统，gRNA和Cas9都应在靶细胞中表达。插入载体可以在单个质粒上含有两个盒，或者盒由两个单独的质粒表达。CRISPR质粒是可商购的，例如来自Addgene的px330质粒。
“一打即跑(hit and run)”或“进出(in-out)”-涉及两步重组程序。在第一步中，含有双阳性/阴性可选择标记盒的插入型载体用于引入所需的序列变更。插入载体含有与靶基因座同源的单个连续区，并被修饰以携带感兴趣的突变。该靶向构建体在同源区内的一个位点用限制酶线性化，电穿孔到细胞中，并进行阳性选择以分离同源重组体。这些同源重组体含有局部复制，其通过包括选择盒的间插载体序列分开。在第二步中，对靶向的克隆进行阴性选择，以通过复制的序列之间的染色体内重组鉴定失去选择盒的细胞。局部重组事件去除了重复，并且取决于重组位点，等位基因保留引入的突变或恢复为野生型。最终结果是引入所需的修饰而不保留任何外源序列。
“双替代”或“标记和交换”策略-涉及类似于一打即跑方法的两步选择过程，但需要使用两种不同的靶向构建体。在第一步中，使用具有3'和5'同源臂的标准靶向载体在要引入突变的位置附近插入双阳性/阴性可选择的盒。在电穿孔和阳性选择后，鉴定出同源靶向的克隆。接下来，将含有与所需突变同源的区的第二靶向载体电穿孔到靶向克隆中，并应用阴性选择以除去选择盒并引入突变。最终的等位基因含有所需的突变，同时消除不需要的外源序列。
根据具体实施方式，通过插入诱变产生突变体群。在一些实施方式中，通过将基因捕获载体引入本发明的单倍体人细胞中来实现插入诱变。
术语“基因捕获载体”是指包括能够插入并潜在地灭活内源细胞基因的核酸构建体的载体，内源细胞基因例如哺乳动物细胞核中的基因。通常，将核酸构建体插入基因既破坏基因又促进其鉴定和/或分离。具有这种插入的细胞被认为是“突变细胞”。插入的核酸用作“分子标记物”，其可用于分离或以其他方式鉴定位于附近的内源基因组DNA，如下文进一步讨论的。在一些实施方式中，核酸构建体包含编码报道分子(“报道基因”)的DNA，所述报道分子在表达时允许鉴定含有插入其基因组中的构建体的细胞。这种DNA可称为“报告基因”。在一些实施方式中，报道分子促进含有构建体的细胞的检测和/或分离。在一些实施方式中，构建体缺乏遗传元件，例如启动子或多腺苷酸化(polyA)序列，该元件通常是表达所需的或显著增加表达，使得在将载体引入细胞后报道基因的有效表达只有当构建体插入内源基因时才会发生。本文讨论了报道基因的实例。例如，在一些实施方式中，可以使用易于检测的蛋白质，例如荧光蛋白质或酶。在一些实施方式中，使用可选择标记。在一些实施方式中，报道基因的活性被用于鉴定在内源基因中具有基因捕获构建体插入的细胞。
在各种实施方式中可以使用各种不同设计的基因捕获载体。在WO/2011/006145中描述了各种基因捕获载体，其内容并入本文。在一些实施方式中，基因捕获载体包含核酸构建体，其包含侧翼为上游剪接受体(SA)位点和下游多腺苷酸化序列的无启动子报告基因。换句话说，无启动子报道基因位于剪接受体位点的下游和polyA序列的上游(也称为“polyA位点”或“polyA信号”)。当插入表达基因的内含子时，基因捕获构建体以融合转录物的形式从该基因的内源启动子转录，其中插入位点上游的外显子(一个或多个)框内剪接至报告基因。这种基因捕获载体可以称为“启动子捕获”基因捕获载体。转录在插入的polyA位点过早终止，使得所得的融合转录物编码与报道基因融合的细胞蛋白的截短和非功能形式。报道基因允许鉴定基因捕获载体已插入活性转录基因座的细胞。这种基因捕获载体均在插入位点灭活并报告捕获基因的表达，并提供允许快速鉴定被破坏基因的核酸标记物。在一些实施方式中，基因捕获载体不编码报告基因，而是编码不同的蛋白质。在一些实施方式中，基因捕获载体不编码蛋白质，而是简单地导致插入内源基因的polyA位点的过早终止。
在各种实施方式中，多种剪接受体位点可用于基因捕获载体。在一些实施方式中，SA位点是腺病毒SA位点。在一些实施方式中，使用来自40型腺病毒的长纤维基因的SA(Carette等，2005The Journal of Gene Medicine 7(8)1053-1062)。其他强腺病毒SA位点是衍生自不同腺病毒血清型的纤维或六邻体基因的那些。多种polyA序列可用于基因捕获载体。在一些实施方式中，polyA序列是牛生长激素polyA序列。
在一些实施方式中，基因捕获载体是polyA捕获载体。polyA捕获载体包含核酸构建体，其包含(i)报告基因，所述报告基因包含编码报道基因的核酸序列，其可操作地连接于启动子；(ii)位于报告基因下游的剪接供体(SD)位点。基因捕获载体缺乏polyA序列，使得只有当载体插入内含子并且通过剪接到下游外显子提供polyA位点时才能有效合成报道基因。当插入内源基因的内含子时，从基因捕获启动子表达的转录物被剪接到内源基因的下游外显子，其大多数3'包含polyA序列，导致融合转录物终止于内源基因的polyA序列。由于融合转录物是从插入的启动子表达的，因此polyA捕获载体独立于内源基因是否表达而捕获基因。报道分子允许鉴定基因捕获载体已插入内含子中的细胞，并且插入的DNA可用于鉴定靠近插入位点的基因组序列。在本发明的一些实施方式中，腺病毒SD位点中的SD位点。在一些实施方式中，polyA捕获载体还包含报告基因的终止密码子下游和剪接供体位点上游的IRES序列。
可以使用多种不同的启动子，例如，在包含启动子的基因捕获载体中。本领域普通技术人员可以选择能够指导在其中使用基因捕获载体的单倍体人细胞中表达的启动子。在一些实施方式中，启动子是RNA聚合酶II启动子(即，通过RNA聚合酶II指导转录的启动子)。在一些实施方式中，启动子是组成型启动子。在一些实施方式中，启动子是在多种哺乳动物细胞类型中有活性的强启动子，例如CMV立即早期启动子或主要中早期启动子，其他哺乳动物病毒启动子，例如单纯疱疹病毒(HSV)启动子SV40，或其他多瘤病毒启动子，或腺病毒启动子。在一些实施方式中，启动子是哺乳动物启动子，例如延伸因子-1α(EF1α)、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)、组蛋白或hTERT启动子。在一些实施方式中，启动子是可调节的，例如可诱导的或可抑制的。可调节启动子的实例包括热休克启动子、金属硫蛋白启动子和包含对小分子如四环素或相关化合物(例如多西环素)或激素有反应的元件的启动子。例如，在一些实施方式中，诱导型启动子包含激素反应元件，其使启动子对激素受体的配体起反应。激素受体包括例如雌激素、孕酮和糖皮质激素受体。配体包括生理学配体，例如雌激素、孕酮或皮质醇，和非生理学配体，例如他莫昔芬、地塞米松。应当理解，在各种实施方式中，细胞表达或被修饰以表达或含有适当的反式作用蛋白，其通常包含DNA结合结构域、活化或抑制结构域和配体结合结构域，其使启动子对配体有反应。
在一些实施方式中，基因捕获载体包含分别含有第一和第二报告基因的第一和第二核酸构建体。报告基因通常是不同的。第一核酸构建体包含与在感兴趣的近单倍体哺乳动物细胞中有活性的启动子可操作地连接的报告基因。另一种核酸构建体包含无启动子基因捕获构建体或polyA捕获构建体，例如上述那些。由第一报告基因编码的报道基因被用于鉴定其中基因捕获载体已整合到基因组中的细胞。由第二报告基因编码的报道基因被用于鉴定在内源基因中发生这种整合的细胞。在一些实施方式中，第一报告基因编码可选择的标记，并且第二报告基因编码可检测的标记。
在一些实施方式中，使用包含转座子的基因捕获载体在人单倍体细胞中进行插入诱变。在一些实施方式中，转座子是piggyBac转座子。piggyBac转座子系统描述于Wang,W.,et al.,Genome Res.2009 19:667-673中。它含有剪接受体(SA)β-geo或SA-T2A-β-gal-T2A-Neo基因捕获盒，其侧翼为59和39PB末端DNA重复序列(59PBTR和39PBTR)。
在一些实施方式中，基因捕获载体的插入是可逆的，即插入的核酸构建体可以容易地切除并且插入位点被修复。例如，在一些实施方式中，位点特异性重组酶(例如LoxP或FRT)的识别位点在基因捕获盒的两端插入，使得整合的载体可以用相应的重组酶(例如，Cre或Flp)切除。在使用转座子的实施方式中，相应的转座酶可用于逆转插入。在一些实施方式中，发生插入的基因捕获构建体的精确切除，而在一些实施方式中，切除后保留少量异源DNA(例如，LoxP位点)。在一些实施方式中，在切除基因捕获构建体后突变细胞的表型的逆转证实了插入是造成该表型的原因。
基因捕获构建体可以使用重组DNA技术和基因工程的标准方法制备，并且可以使用各种类型的载体引入细胞中。在某些实施方式中，基因捕获载体是病毒载体，例如逆转录病毒(例如，慢病毒)、腺病毒或疱疹病毒载体，其包含基因捕获构建体，例如作为其基因组的一部分。病毒载体可以是病毒(病毒颗粒)，其用于感染细胞，从而引入基因捕获构建体。感染后，至少一部分病毒基因组或其拷贝整合到细胞基因组中，通常在细胞DNA内的随机位点。在某些实施方式中，使用逆转录病毒载体将基因捕获构建体递送至近单倍体哺乳动物细胞。逆转录病毒载体和使用逆转录病毒将外源DNA引入哺乳动物细胞的方法是本领域熟知的。逆转录病毒载体通常包含LTR，其可以衍生自各种类型的逆转录病毒。可以对LTR(一个或多个)进行遗传修饰以提供所需的性质，并且病毒基因组可以修饰为例如缺乏启动子活性和/或包含适于在细菌中繁殖和选择的调节元件，例如复制起点和抗生素抗性标记。基因捕获构建体位于LTR之间。通过使用标准方法将包含基因捕获构建体的逆转录病毒质粒转染到逆转录病毒包装细胞系中，可以产生感染性、有复制能力的逆转录病毒基因捕获颗粒。培养包装细胞，并收集释放到培养基中的病毒颗粒(例如，作为上清液)用于随后的使用，例如，以感染哺乳动物近(hear)单倍体细胞。在一些实施方式中，基因捕获载体是质粒。在一些实施方式中，质粒基因捕获载体在将其引入细胞之前被线性化。
在一些实施方式中，本文所述的人单倍体细胞在适于摄取载体和将构建体插入基因组的条件下与基因捕获载体接触。可以使用多种方法将基因捕获载体引入人单倍体细胞。实例包括病毒感染(例如，逆转录病毒感染)、转染(例如，使用磷酸钙或基于脂质的转染试剂)、电穿孔、显微注射等。本领域技术人员可以基于例如载体和细胞的性质选择适合的方法。应当理解，通常，并非所有与基因捕获载体接触的细胞都将摄取载体，并且构建体在基因组中的稳定插入可能不会在摄取载体的所有细胞中发生。在一些实施方式中，进行插入诱变使得每个细胞的平均插入数在0.1和2之间，例如在0.5和1之间。例如，通过使用适当的细胞与载体比可以控制平均插入数。
在一些实施方式中，在鉴定、分离或评估已经将构建体引入其基因组的细胞之前，在适于摄取和插入构建体的条件下与基因捕获载体接触的单倍体人细胞在培养物中维持一段时间。例如，可以在鉴定、分离或表征之前培养细胞1至约20天。鉴定或分离在一些实施方式中已摄取构建体和在一些实施方式中构建体已插入其基因组中的细胞。在一些实施方式中，至少部分地基于报道基因鉴定或分离细胞，所述报道基因例如由基因捕获载体编码并插入基因组中的报道基因。例如，可以在选择性条件下对细胞进行分选或培养，以消除至少例如95％、98％、99％、99.9％或更多不表达报道基因的细胞。在一些实施方式中，不进行基于报道基因的选择步骤。在一些实施方式中，例如，在无启动子基因捕获载体的情况下，省略基于报道基因的选择可以扩增诱变的细胞群以包括基因捕获插入的类型(其否则可能不太容易鉴定)，例如不良表达的基因。
在一些实施方式中，将细胞培养为单细胞，以产生突变的单倍体人干细胞的克隆群(或同质群)。在该实施方式中，每个克隆群体在单独的容器(例如培养皿)中培养。
在其他实施方式中，异质的单倍体人干细胞群在单个培养皿中培养。因此，具有不同灭活基因的细胞在同一培养皿中培养。
通过用细胞毒性疗法暴露(例如接触)细胞群来进行本发明的分析。
使用的术语“细胞毒性疗法”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏(细胞死亡)，和/或发挥抗肿瘤/抗增殖作用——例如，直接或间接地阻止肿瘤性肿瘤细胞的发育、成熟或扩散——的疗法。在一个实施方式中，细胞毒性疗法引起细胞抑制效应。
在一个实施方式中，细胞毒性疗法是指放射疗法-其非限制性实例包括X射线、γ射线、带电颗粒疗法、近距离放射疗法、α颗粒和放射性同位素。
在另一个实施方式中，细胞毒性疗法是指物质-例如化学或生物药剂。
示例性物质包括小分子药剂、抗体、肽、核酸试剂和其他化学物质。
在一个实施方式中，候选药剂是化学治疗剂。
示例性的化学治疗剂在下文的表1A中提供。
表1A：化学治疗剂的实例
可筛选的其他抗癌药物包括但不限于阿西维辛；阿柔比星；盐酸阿考达唑(acodazole hydrochloride)；阿克罗宁；阿霉素；阿多来新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；醋酸阿美蒽醌；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；氨茴霉素；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派(Azetepa)；固氮霉素；巴马司他；苄替哌；比卡鲁胺；盐酸比生群；双奈法德(Bisnafide Dimesylate)；比折来新；硫酸博来霉素；布喹那钠；溴匹立明；白消安；放线菌素C；卡普睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；瘤可宁；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；甲磺酸克雷斯托(Crisnatol Mesylate)；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；放线菌素D；盐酸柔红霉素；地西他滨；右奥马铂；地扎胍宁；甲磺酸地扎胍宁；地吖醌(Diaziquone)；多西紫杉醇；阿霉素；盐酸阿霉素；屈洛昔芬；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；偶氮霉素；依达曲沙；盐酸依氟鸟氨酸；依沙芦星；恩洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；盐酸表柔比星；厄布洛唑；盐酸依索比星；雌氮芥；雌氮芥磷酸钠；依他硝唑；依托泊苷；磷酸依托泊苷；艾托卜宁(Etoprine)；盐酸法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；氟尿苷；磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶；氟西他宾；磷喹酮；福司曲星钠；吉西他滨；盐酸吉西他滨；羟基脲；盐酸伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-n1；干扰素α-n3；干扰素β-I a；干扰素γ-I b；异丙铂；盐酸伊立替康；醋酸兰瑞肽；来曲唑；醋酸亮丙瑞林；盐酸利阿唑；洛美曲索钠；罗氮芥；盐酸洛索蒽醌；马索丙考(masoprocol)；美登素；盐酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美仑孕酮；美法仑；美诺立尔；巯嘌呤；氨甲喋呤；氨甲喋呤钠；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；Mitocarcin；丝裂红素(Mitocromin)；米托菌素；丝裂马菌素(Mitomalcin)；丝裂霉素；丝裂帕菌素；米托坦；盐酸米托蒽醌；霉酚酸；诺考达唑；诺加霉素；奥马铂；奥昔舒仑；紫杉醇；培门冬酶；培利霉素；戊氮芥；硫酸培来霉素；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；盐酸吡罗蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟菲尔钠；甲基丝裂霉素；松龙苯芥；盐酸甲基苄肼；嘌呤霉素；盐酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；洛太米特；沙芬戈；盐酸沙芬戈；司莫司汀；辛曲秦；磷乙酰天冬氨酸钠；稀疏霉素；盐酸螺旋锗(SpirogermaniumHydrochloride)；螺莫司汀；螺铂；链黑菌素；链脲菌素；磺氯苯脲；他利霉素；紫杉醇；替可加兰钠；替加氟；盐酸替洛蒽醌；替莫泊芬；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；硫咪嘌呤；巯鸟嘌呤；塞替派；Tiazofuirin；拉扎明；盐酸拓扑替康；柠檬酸托瑞米芬；醋酸曲托龙；磷酸曲西瑞宾；曲美沙特；葡萄糖醛酸曲美沙特；曲普瑞林；盐酸妥布氯唑；乌拉莫司丁；乌瑞替哌；伐普肽；维替泊芬；硫酸长春花碱；硫酸长春新碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春匹定；硫酸长春苷酯；硫酸长春罗辛；酒石酸长春瑞滨；硫酸长春罗定；硫酸长春利定；氟氯唑；折尼铂；净司他丁；盐酸佐柔比星。另外的抗肿瘤剂包括在Antineoplastic Agents(PaulCalabresi和Bruce A.Chabner)第52章和引入其的Goodman和Gilman的"ThePharmacological Basis of Therapeutics"，第八版，1990，McGraw-Hill,Inc.(HealthProfessions Division)的1202-1263中公开的那些。
用候选疗法暴露细胞可以在任何体外条件下进行。当候选疗法是药剂时，候选药剂可以与细胞直接接触。根据本发明的一些实施方式，利用候选药剂培育细胞。选择用于培育细胞的条件持续一定时间段/细胞的浓度/候选药剂的浓度/细胞和候选试剂之间的比等，这使得候选药剂能够诱导细胞变化，例如转录的变化和/或特异性基因的翻译率、增殖率、分化、细胞死亡、坏死、凋亡等。
在将细胞暴露于候选疗法之后，通过使用基于细胞存活的选择途径选择细胞，继续该方法。可以分离在候选疗法存在下存活的细胞，并鉴定在一种或多种细胞中突变的一种或多种基因(例如使用已知的测序方法)。在一些实施方式中，在暴露于候选疗法之前将已经与基因捕获载体接触的细胞维持在培养物中一段时间以允许基因表达和基因产物水平的变化，其起因于发生和潜在地引起抗性表型的突变。
在一些实施方式中，显示对候选药剂活性的抗性的细胞在分离或鉴定后，例如在存活于基于存活的选择后，在培养物中扩展。在一些实施方式中，细胞扩展2至30天。
可以使用多种方法鉴定已经灭活或过度活化的基因(例如，具有基因捕获载体或插入其中的其部分的基因)。在一些实施方式中，反向PCR用于鉴定侧翼具有插入的基因组序列。在一些实施方式中，使用splinkerette PCR(Horn,C.,et al.,Nat.Genet.,39:807-8,2007)。在一些实施方式中，5'-RACE(cDNA末端的快速扩增)被用于扩增在基因捕获融合转录物中包含的细胞序列(参见，例如Nature Methods,2(8),2005)。还参见Stanford,W.,et al.Methods in Enzymology,Vol.420,2006)。鉴定使用基因捕获载体诱变的基因的实例描述于WO/2011/006145中。在一些实施方式中，使用“高通量”、“下一代”或“大规模并行”测序，同时从大细胞群中回收和测序侧翼具有插入的序列。此类测序技术可包括通过合成测序(例如，使用Solcxa技术)、通过连接测序(例如，使用来自Applied Biosystems的SOLiD技术)、454技术或焦磷酸测序。在一些实施方式中，并行进行数千、数万或更多的测序反应，每次“运行”产生数百万或甚至数十亿的DNA序列的碱基。参见，例如，Shendure J&JiH.Nat.Biotechnol.,26(10):1135-45,2008,Mardis E R(2008)Next-generation DNAsequencing methods.Annu Rev Genomics Hum Genet.9:387-402；和/或Metzger,M.,NatRev Genet.2010；11(1):31-46，用于非限制性讨论这些技术中的一些。应当理解，测序技术正在迅速发展和改进。在一些实施方式中，使用通过合成的大规模并行测序。在一些实施方式中，使用线性扩增介导的PCR(LAM-PCR)，然后使用ssDNA接头连接和大规模并行测序。选择对候选药剂的活性具有抗性的细胞群，并鉴定富集的基因组区的插入。这些区含有感兴趣表型中涉及的候选遗传元件，例如基因。在一些实施方式中，分析10,000或更多，例如10,000和100,000之间；10,000和500,000之间；或者10,000和100万、500万、1000万、2000万、5000万、1亿之间的插入或更多。一旦分离了DNA，并且在一些实施方式中扩增，就可以将其克隆到载体和/或进行测序。DNA可以用作探针以鉴定位于基因组附近的进一步的序列，例如通过探测cDNA或基因组文库。序列可以被用于搜索序列数据库，例如公共可得的数据库比如通过国家生物技术信息中心网站(National Center for BiotechnologyInformation website)(www.ncbi.nlm.nih.gov/)的Entrez可得的那些，例如基因库、参考序列、蛋白质和核苷酸。由于人基因组被完全测序，因此基于相对少量的部分序列数据容易地鉴定大多数基因通常将是可能的。可以使用适当的软件将序列与人基因组比对。加利福尼亚大学圣克鲁兹分校(UCSC)基因组浏览器网站(genome.ucsc.edu/)提供了一个公共可得的序列和注释数据的大型数据库，以及一个集成的工具集，可用于例如检查生物体的基因组，对齐序列与基因组，并进行各种其他分析(Rhead B,et al.The UCSC GenomeBrowser database:update 2010.Nucleic Acids Research.2010；38:D613-D619)。在一些实施方式中，使用Bowtie比对软件(Langmead B,et al.Genome Biology.2009；10)。插入位点可以被鉴定为位于注释为包含基因的基因组区中。
在一些实施方式中，分析方法集中于在给定筛选中获得的存在于基因中的插入，并将它们与存在于单倍体人ES细胞的未选择的诱变群中的插入进行比较(例如，与细胞经历筛选同时诱变的群)。特定筛选中特定基因的富集可以通过比较该基因在筛选中突变的频率与通过分析未选择群中的插入位点获得的对照数据集中基因携带插入的频率进行比较来计算。可以使用合适的统计检验来计算p值(任选地针对错误发现率进行校正)，例如单侧Fisher精确检验。在一些实施方式中，分析包括获得给定插入的接近度指数作为与其相邻插入位点的平均距离的逆值。根据给定插入与两个相邻上游插入和两个接下来的下游插入位点之间的平均距离(以碱基对计)计算逆值。该分析方法鉴定富含插入的区，并包括有义和反义插入，并有助于鉴定未注释的元素。
一旦鉴定出对候选药剂产生抗性的基因(一种或多种)，本发明人就考虑在对象的细胞样本中分析基因序列和或其表达。
分析可以进行一次或在多个场合进行(即，在癌症治疗过程中定期进行)。在一个实施方式中，分析在新化疗周期开始之前进行。
细胞样本可以源自对象的任何组织或体液。本发明考虑的示例性体液包括但不限于血液、血清、血浆、尿液、唾液、汗液等。在一个实施方式中，细胞样本源自原发性肿瘤样本。另外或可选地，细胞样本可以源自转移的肿瘤。
在一个实施方式中，细胞样本(例如活体组织切片)取自患者的单一来源。在另一个实施方式中，细胞样本(例如活体组织切片)取自患者的多个区域。
根据具体实施方式，可以分析细胞样本中所鉴定基因的核酸变异。根据该实施方式，当鉴定的基因序列与健康对象中该基因序列不同时(或者与已知对该药剂的作用不具有抗性的对象中该基因的序列不同)，这是表明不应该使用候选疗法(至少作为单一疗法)来治疗疾病(例如，它可能完全被排除用于治疗该疾病，或者它可以被规定仅用于联合疗法，或者它可以被规定与敏化剂一起使用)。
这种核酸变异的非限制性实例包括：错义突变，即，这样的突变：由所鉴定的基因编码的蛋白质中的氨基酸残基改变为另一个氨基酸残基，并从而消除蛋白质的酶促活性；无义突变，即在由鉴定的基因编码的蛋白质中引入终止密码子，例如早期终止密码子的突变，其导致缺乏酶促活性的较短蛋白质；移码突变，即这样的突变：通常，缺失或插入核酸(一种或多种)，其改变由鉴定的基因编码的蛋白质的阅读框架，并且可以通过将终止密码子引入阅读框架而导致提前终止(例如，截短的蛋白质、缺乏酶促活性)，或导致较长的氨基酸序列(例如，通读蛋白质)，其影响蛋白质的二级或三级结构并导致非功能性蛋白质，缺乏“野生型”或非突变多肽的酶促活性；由于移码突变或修饰的终止密码子突变(即，当终止密码子突变成氨基酸密码子时)引起的通读突变，具有废除的酶促活性；启动子突变，即启动子序列中的突变，通常是5'到基因的转录起始位点，这导致特定基因产物的下调；调节突变，即上游或下游区内或基因内的突变，其影响基因产物的表达；缺失突变，即缺失基因序列中编码核酸的突变，其可导致移码突变或框内突变(在编码序列内，缺失一个或多个氨基酸密码子)；插入突变，即将编码或非编码核酸插入基因序列中的突变，其可导致一个或多个氨基酸密码子的移码突变或框内插入；倒位，即导致反向编码或非编码序列的突变；剪接突变(即，导致异常剪接或剪接不良的突变)；和复制突变，即导致重复编码或非编码序列的突变，其可以在框内或可以引起移码。
为了确定所鉴定基因中的序列变更[例如，单核苷酸多态性(SNP)]，首先从测试对象的细胞样本中获得DNA。
一旦获得样本，使用本领域熟知的方法提取DNA，包括组织切碎、细胞裂解、蛋白质提取和DNA沉淀，其使用2至3体积的100％乙醇，在70％乙醇中漂洗，造粒，干燥并重新悬浮于水或任何其它合适的缓冲液(例如Tris-EDTA)中。优选地，按照这样的程序，例如通过测量260nm处样本的光密度(OD)(其中1单位OD＝50μg/ml DNA)测定DNA浓度。
为了测定DNA溶液中蛋白质的存在，测定OD 260/OD 280比率。优选地，只有OD260/OD 280比率为1.8-2的DNA制剂用于下文所述的下列步骤。
可以使用多种方法鉴定本发明的一些实施方式的序列变更(或SNP)。一种选择是测定PCR反应产物的完整基因序列(参见下文的序列分析)。可选地，给定的核酸区段可以在若干其他水平上表征。在最低分辨率下，通过与在相同凝胶上运行的已知标准品比较，可以通过电泳确定分子的大小。可以通过在电泳之前用限制酶的组合进行切割来实现分子的更详细的图片，以允许构建有序图谱。可以通过标记探针的杂交来检测片段内特定序列的存在，或者可以通过部分化学降解或通过在链终止核苷酸类似物存在下的引物延伸来测定精确的核苷酸序列。
限制性片段长度多态性(RFLP)：该方法使用单个核苷酸(SNP核苷酸)的变化，其修饰限制酶的识别位点，导致RFLP的产生或破坏。DNA异源双链体中的单核苷酸错配也被一些化学物质识别和切割，提供了检测单碱基置换的可选策略，通常称为“错配化学裂解”(MCC)(Gogos et al.,Nucl.Acids Res.,18:6807-6817,1990)。然而，这种方法需要使用四氧化锇和哌啶，这两种高毒性化学品不适合在临床实验室中使用。
优选地在测定序列变更之前扩增DNA样本，因为许多基因分型方法需要扩增携带感兴趣的序列变更的DNA区。
在任何情况下，一旦获得DNA，使用通常涉及使用与鉴定的基因中的核酸序列变更特异性杂交的寡核苷酸的方法来实现确定鉴定的基因中序列变更的存在，例如上文所述的那些。
术语“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物的单链或双链寡聚体或聚合物。该术语包括由天然存在的碱基、糖和共价核苷间键(例如骨架)组成的寡核苷酸，以及具有非天然存在部分的寡核苷酸，该非天然存在部分的功能类似于各自的天然存在部分。
根据本发明的一些实施方式的教导设计的寡核苷酸可以根据本领域已知的任何寡核苷酸合成方法产生，例如酶促合成或固相合成。用于进行固相合成的设备和试剂可从例如Applied Biosystems商购获得。也可以采用这种合成的任何其他合成手段；寡核苷酸的实际合成完全在本领域技术人员的能力范围内，并且可以通过已建立的方法完成，如在例如“Molecular Cloning:A laboratory Manual"Sambrook et al.,(1989)；"CurrentProtocols in Molecular Biology"Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubelet al.,"Current Protocols in Molecular Biology",John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"A Practical Guide to Molecular Cloning",JohnWiley&Sons,New York(1988)和"Oligonucleotide Synthesis"Gait,M.J.,ed.(1984)中详述的，其利用固相化学，例如氰乙基亚磷酰胺，然后脱保护、脱盐和通过例如自动化三甲苯基在线方法(automated trityl-on method)或HPLC的纯化。
本发明的一些实施方式的寡核苷酸具有与上文所述的序列变更特异性地可杂交的至少17、至少18、至少19、至少20、至少22、至少25、至少30或至少40个碱基。
检测序列变更的其他方法涉及通过测序分析、基于酶的错配检测分析或杂交分析直接测定变更位点处核苷酸的身份。以下是可以由本发明的一些实施方式使用的一些优选方法的描述。
测序分析-使用染料-终止子(未标记的引物和标记的双脱氧核苷酸)或染料-引物(标记的引物和未标记的双脱氧核苷酸)循环测序方案对分离的DNA进行自动化双脱氧终止子测序反应。对于染料-终止子反应，使用未标记的PCR引物进行PCR反应，然后在引物、脱氧核苷酸和标记的双脱氧核苷酸混合物之一的存在下进行测序反应。对于染料-引物反应，使用与通用或反向引物(每个方向一个)缀合的PCR引物进行PCR反应，然后在四个单独的混合物(对应于A、G、C、T核苷酸)存在下进行测序反应，四个单独的混合物各自含有对通用或反向序列和相应的未标记的双脱氧核苷酸具有特异性的标记引物。
微量测序分析-该分析可以通过对鉴定的基因的特定区进行微量测序反应来实现，所述特定区域可以通过如上所述的扩增反应(PCR)获得。然后使用ddNTP(每种ddNTP的特异性荧光)和适当的寡核苷酸微量测序引物对基因组或cDNA扩增产物进行自动化微量测序反应，所述引物可以在感兴趣的变更位点的正上游杂交。一旦使用互补荧光双脱氧核苷酸类似物(热循环)通过DNA聚合酶在3'末端特异性延伸，沉淀引物以除去未引入的荧光ddNTP。然后在测序仪(例如ABI 377)上通过电泳分析其中引入了荧光ddNTP的反应产物，以确定引入的碱基的身份，从而鉴定本发明一些实施方式的鉴定的基因的序列变更。
应当理解，延伸的引物也可以通过MALDI-TOF质谱法分析。在这种情况下，变更位点处的碱基通过添加到微量测序引物上的质量来鉴定[参见Haff and Smirnov,(1997)Nucleic Acids Res.25(18):3749-50]。
最近开发的固相微量测序反应可用作上述微量测序方法的替代方案。固相微量测序反应使用寡核苷酸微量测序引物或固定化的感兴趣DNA片段的PCR扩增产物。固定化可以例如通过生物素化的DNA和链霉亲和素包被的微量滴定孔或抗生物素蛋白包被的聚苯乙烯颗粒之间的相互作用来进行。
在这种固相微量测序反应中，引入的ddNTP可以被放射性标记[参见Syvanen,(1994),]Clin Chim Acta 1994；226(2):225-236]或连接至荧光素(参见Livak和Hainer,(1994)Hum Mutat 1994；3(4):379-385]。放射性标记的ddNTP的检测可以通过基于闪烁的技术实现。荧光素连接的ddNTP的检测可以基于与碱性磷酸酶缀合的抗荧光素抗体的结合，然后与发色底物(例如asp-磷酸硝基苯酯)一起培育。
其他报道基因-检测缀合物包括：连接至二硝基苯基(DNP)的ddNTP和抗DNP碱性磷酸酶缀合物[参见Harju et al.,(1993)Clin Chem 39:2282-2287]；和生物素化的ddNTP和辣根过氧化物酶缀合的链霉亲和素，其中邻苯二胺作为底物(参见WO 92/15712)。
基于缀合有碱性磷酸酶的抗荧光素抗体的荧光素连接的ddNTP的诊断试剂盒可从GamidaGen Ltd(PRONTO)商购获得。
Nyren et al.(1993)Anal Biochem 208(1):171-175和Pastinenet al.(1997)Genome Research7:606-614描述了微量测序方案的其他变型。
基于聚合酶和连接酶的错配检测分析-“寡核苷酸连接分析”(OLA)使用两种寡核苷酸，其设计为能够与靶分子的单链的邻接序列杂交。其中一种寡核苷酸是生物素化的，而另一种是可检测地标记的。如果在靶分子中发现精确的互补序列，则寡核苷酸将杂交，使得它们的末端邻接，并产生可被捕获和检测的连接底物。OLA能够检测单核苷酸多态性并且可以有利地与PCR组合，如Nickerson et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:8923-8927描述的。在该方法中，PCR被用于实现靶DNA的指数式扩增，其然后使用OLA检测。
其他特别适用于检测单核苷酸多态性的扩增方法包括LCR(连接酶链反应)，GapLCR(GLCR)。LCR使用两对探针以指数方式扩增特定目标。选择每对寡核苷酸的序列以允许该对与靶标的相同链的邻接序列杂交。这种杂交形成模板依赖性连接酶的底物。根据本发明的一些实施方式，LCR可以用具有双等位基因标记位点的相同链的近端和远端序列的寡核苷酸进行。在一个实施方式中，寡核苷酸将被设计为包括双等位基因标记位点。在这样的实施方式中，选择反应条件使得只有当靶分子含有或缺少与寡核苷酸上的双等位基因标记互补的特定核苷酸时，才能将寡核苷酸连接在一起。在一个可选实施方式中，寡核苷酸将不包括双等位基因标记，使得当它们与靶分子杂交时产生“缺口”，如WO 90/01069中所述。然后用互补的dNTP(由DNA聚合酶介导)或通过另外一对寡核苷酸“填充”该间隙。因此，在每个周期结束时，每个单链具有能够在下一个周期期间用作靶标的互补序列，并获得所需序列的指数式等位基因特异性扩增。
连接酶/聚合酶介导的Genetic Bit AnalysisTM是用于测定核酸分子中预选位点处核苷酸的同一性的另一种方法(WO 95/21271)。该方法涉及将与预选位点处存在的核苷酸互补的核苷三磷酸引入引物分子的末端，并随后将其连接至第二寡核苷酸。通过检测附着在反应的固相上的特定标签或通过在溶液中检测来监测反应。
杂交分析方法-允许检测单碱基变更的基于杂交的分析依赖于使用寡核苷酸，所述寡核苷酸可以是10、15、20或30至100个核苷酸长，优选10至50个核苷酸，更优选40至50个核苷酸。通常，寡核苷酸包括与鉴定的基因的多态性位点互补的中心核苷酸和侧翼核苷酸序列，所述侧翼核苷酸序列跨越中心核苷酸的每侧并且基本上与跨越多态性位点每侧的鉴定的基因的核苷酸序列互补。可以通过在严格杂交反应下将本发明的一些实施方式的寡核苷酸与模板序列杂交来检测序列变更。
举例来说，短核酸的杂交(长度为200bp以下，例如长度为17-40bp)可以取决于所需的严格性通过以下杂交方案实现：(i)6×SSC和1％SDS或3M TMACI、0.01M磷酸钠(pH6.8)、1mM EDTA(pH 7.6)、0.5％SDS、100μg/ml变性鲑鱼精子DNA和0.1％脱脂奶粉的杂交溶液，杂交温度比Tm低1-1.5℃，3M TMACI、0.01M磷酸钠(pH 6.8)、1mM EDTA(pH 7.6)、0.5％SDS在低于Tm 1-1.5℃下的最终洗涤溶液；(ii)6×SSC和0.1％SDS或3M TMACI、0.01M磷酸钠(pH6.8)、1mM EDTA(pH 7.6)、0.5％SDS、100μg/ml变性鲑鱼精子DNA和0.1％脱脂奶粉的杂交溶液，杂交温度比Tm低2-2.5℃，3M TMACI、0.01M磷酸钠(pH 6.8)、1mM EDTA(pH7.6)、0.5％SDS在低于Tm 1-1.5℃下的最终洗涤溶液，6×SSC的最终洗涤溶液，和在22℃下的最终洗涤；(iii)6×SSC和1％SDS或3M TMACI、0.01M磷酸钠(pH 6.8)、1mM EDTA(pH7.6)、0.5％SDS、100μg/ml变性鲑鱼精子DNA和0.1％脱脂奶粉的杂交溶液，杂交温度。
杂交双链体的检测可以通过许多方法进行。通常，将杂交双链体与未杂交的核酸分开，然后检测与双链体结合的标签。此类标签是指本领域标准使用的放射性、荧光、生物学或酶促标记物或标签。标签可以与寡核苷酸探针或衍生自生物学样本(靶标)的核酸缀合。例如，本发明的一些实施方式的寡核苷酸可以在合成之后通过引入生物素化的dNTP或rNTP或一些类似的手段(例如，将生物素的补骨脂素衍生物光交联到RNA)，然后添加标记的链霉亲和素(例如，藻红蛋白缀合的链霉亲和素)或等价物来标记。可选地，当使用荧光标记的寡核苷酸探针时，荧光素、丽丝胺，藻红蛋白，罗丹明(Perkin Elmer Cetus)、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、FluorX(Amersham)和其他[例如，Kricka et al.(1992),AcademicPress San Diego,Calif]可以与寡核苷酸附接。
传统杂交分析包括PCR、RT-PCR、RNA酶保护、原位杂交、引物延伸、DNA印迹、RNA印迹和斑点印迹分析。
本领域技术人员将理解，可以采用洗涤步骤来洗去过量的靶DNA或探针以及未结合的缀合物。此外，标准的异源分析形式适合于使用寡核苷酸引物和探针上存在的标签检测杂交体。
最近开发的两种分析允许基于杂交的等位基因辨别，不需要分离或洗涤[参见Landegren U.et al.,(1998)Genome Research,8:769-776]。TaqMan分析利用Taq DNA聚合酶的5'核酸酶活性来消化特异性退火至累积扩增产物的DNA探针。TaqMan探针用供体-受体染料对标记，其通过荧光能量转移相互作用。在扩增期间通过推进聚合酶(advancingpolymerase)C1切割TaqMan探针使供体染料与猝灭受体染料解离，大大增加了供体荧光。检测两种等位基因变体所需的所有试剂可以在反应开始时组装，并且实时监测结果[参见Livak et al.,1995Hum Mutat 3(4):379-385]。在可选的基于均相杂交的程序中，分子信标用于等位基因辨别。分子信标是发夹形寡核苷酸探针，其报告在均相溶液中特定核酸的存在。当它们与其靶标结合时，它们经历构型重组，其恢复内部猝灭荧光团的荧光(Tyagiet al.,(1998)Nature Biotechnology.16:49]。
应当理解，可以有用地采用各种对照来提高杂交分析的准确性。例如，样本可以与无关的探针杂交并在杂交前用RNA酶A处理，以评估错误杂交。
美国专利号5,451,503提供了寡核苷酸构型的几个实例，其可用于检测模板DNA或RNA中的SNP。
与寡核苷酸阵列的杂交-芯片/阵列技术已在许多情况下成功应用。例如，在BRCA1基因、酿酒酵母突变株和HIV-1病毒的蛋白酶基因中进行了突变筛选[参见Hacia et al.,(1996)Nat Genet 1996；14(4):441-447；Shoemaker et al.,(1996)Nat Genet 1996；14(4):450-456；Kozal et al.,(1996)Nat Med 1996；2(7):753-759]。
将包含待分析的候选区的核酸样本分离、扩增并用报告基团标记。该报告基团可以是荧光基团，例如藻红蛋白。然后使用流控站(fluidics station)将标记的核酸与固定在芯片上的探针一起培育。例如，Manz et al.(1993)Adv in Chromatogr 1993；33:1-66描述了在硅和玻璃基板中制造流控装置，特别是微毛细管装置。
一旦反应完成，将芯片插入扫描仪中并检测杂交模式。收集杂交数据，作为已经引入核酸中的报告基团发出的信号，其现在与附着于芯片的探针结合。与核酸样本序列完全匹配的探针通常比具有错配的那些产生更强的信号。由于固定在芯片上的每个探针的序列和位置是已知的，因此可以确定与给定探针杂交的核酸的身份。
对于单核苷酸多态性分析，通常设计四组寡核苷酸探针(每种碱基类型一组)，优选两组寡核苷酸探针(双等位基因标记的每种碱基类型一组)，其跨越在核酸样本中发现的候选区的一部分的每个位置，仅在多态性碱基的同一性方面不同。在特定位置与每个探针系列杂交的相对强度允许鉴定对应于探针的多态性碱基的碱基。
应当理解，直流电场控制的使用改善单碱基突变的辨别(Nanogen)。正场增加带负电荷的核酸的输送率并导致杂交率的增加10倍。使用该技术，单碱基对错配在少于15秒内被检测到[参见Sosnowski et al.,(1997)Proc Natl Acad Sci U S A 1997；94(4):1119-1123]。
集成系统-可用于分析序列变更的另一种技术包括多组分集成系统，其在单一功能装置中使诸如PCR和毛细管电泳反应的过程小型化和区分。这种技术的例子在美国专利号5,589,136中公开，其描述了PCR扩增和毛细管电泳在芯片中的集成。
优选地，集成系统与微流体系统一起使用。这些系统包括设计在微芯片上包括的玻璃、硅、石英或塑料晶片上的微通道模式。样本的运动由跨越微芯片的不同区施加的电力、电渗力或流体静力控制，以产生功能性微观阀和泵，而不移动零件。改变电压控制微机械通道之间的交叉处的液体流动并改变液体流速以穿过微芯片的不同部分泵送。
当鉴定序列变更时，微流体系统可以整合核酸扩增、微量测序、毛细管电泳和诸如激光诱导荧光检测的检测方法。在第一步中，优选通过PCR扩增DNA样本。然后使用ddNTP(每种ddNTP的特异性荧光)和适当的寡核苷酸微量测序引物对扩增产物进行自动化微量测序反应，所述引物在靶向的多态性碱基的正上游杂交。一旦3'末端的延伸完成，通过毛细管电泳将引物与未引入的荧光ddNTP分离。用于毛细管电泳的分离介质可以是例如聚丙烯酰胺、聚乙二醇或葡聚糖。通过荧光检测鉴定单核苷酸引物延伸产物中引入的ddNTP。该微芯片可用于并行处理96至384个样本。它可以使用ddNTP的典型的四色激光诱导荧光检测。
等位基因特异性寡核苷酸(ASO)：在该方法中，设计等位基因特异性寡核苷酸(ASO)以在多态性核苷酸附近杂交，使得引物延伸或连接事件可用作匹配或错配的指示。与放射性标记的等位基因特异性寡核苷酸(ASO)的杂交也已经应用于特异性SNP的检测(Conner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,80:278-282,1983)。该方法基于单个核苷酸不同的短DNA片段的解链温度的差异。严格杂交和洗涤条件可以区分突变体和野生型等位基因。
变性/温度梯度凝胶电泳(DGGE/TGGE)：另外两种方法依赖于检测响应微小的序列变化的电泳迁移率的变化。称为“变性梯度凝胶电泳”(DGGE)的这些方法之一基于以下观察：当在梯度凝胶上电泳式分辨时，略微不同的序列将显示不同的局部解链模式。以这种方式，可以区分变体，因为单核苷酸不同的同源双链体和异源双链体的解链特性的差异可以检测靶序列中SNP的存在，因为它们的电泳迁移率发生了相应的变化。待分析的片段，通常是PCR产物，在一端被一段长的G-C碱基对(30-80)“夹紧(clamp)”，以使感兴趣序列完全变性而不完全解离链。GC“夹”与DNA片段的附接增加了DGGE可识别的突变部分(Abrams etal.,Genomics 7:463-475,1990)。将GC夹附接到一种引物对于确保扩增的序列具有低解离温度是至关重要的(Sheffield et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,86:232-236,1989；和Lerman and Silverstein,Meth.Enzymol.,155:482-501,1987)。已经使用温度梯度开发了该技术的变型(Wartellet al.,Nucl.Acids Res.,18:2699-2701,1990)，并且该方法也可以应用于RNA：RNA双链体(Smith et al.,Genomics 3:217-223,1988)。
对DGGE实用性的限制包括要求必须针对每种待测试的DNA的类型来优化变性条件。此外，该方法需要专门的设备来制备凝胶并在电泳期间保持所需的高温。对于每个待测试的序列，在一个寡核苷酸上合成夹紧尾的相关费用也是主要考虑因素。此外，DGGE需要长运行时间。DGGE的长运行时间在DGGE的变型中被缩短，该变型称为恒定变性凝胶电泳(CDGE)(Borrensenet al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8405,1991)。CDGE要求在不同的变性条件下进行凝胶以达到检测SNP的高效率。
类似于DGGE的技术，称为温度梯度凝胶电泳(TGGE)，使用热梯度而不是化学变性梯度(Scholz,et al.,Hum.Mol.Genet.2:2155,1993)。TGGE需要使用专门的设备，这些设备可以产生相对于电场垂直取向的温度梯度。TGGE可以检测相对小DNA片段中的突变，因此扫描大基因片段需要在运行凝胶之前使用多种PCR产物。
单链构型多态性(SSCP)：另一种称为“单链构型多态性”(SSCP)的常用方法由Hayashi、Sekya及其同事开发(由Hayashi,PCR Meth.Appl.,1:34-38,1991综述)并且基于观察到单链核酸可以在非变性条件下呈现特征性构型，并且这些构型影响电泳迁移率。互补链呈现足够不同的结构，一条链可以与另一条链分离。片段内序列的变化也将改变构型，从而改变迁移率并允许其用作序列变异的分析(Orita,et al.,Genomics 5:874-879,1989；Orita et al.1989,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:2776-2770)。
SSCP过程涉及使两条链上标记的DNA区段(例如，PCR产物)变性，然后在非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行缓慢电泳分离，以便在运行期间可以形成分子间相互作用并且不被干扰。该技术对凝胶组成和温度的变化极为敏感。该方法的严重限制是在比较明显相似条件下在不同实验室中产生的数据时遇到的相对难度。
双脱氧指纹法(ddF)：双脱氧指纹法(ddF)是另一种开发用于扫描基因是否存在突变的技术(Liu and Sommer,PCR Methods Appli.,4:97,1994)。ddF技术将Sanger双脱氧测序的组分与SSCP相结合。使用一种双脱氧终止子进行双脱氧测序反应，然后将反应产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，以检测终止链段的迁移率的变化，如SSCP分析中那样。虽然ddF在提高灵敏度方面是对SSCP的改进，但ddF需要使用昂贵的双脱氧核苷酸，并且该技术仍局限于分析适合SSCP的大小的片段(即，用于突变的最佳检测的200-300个碱基的片段)。
除了上述限制之外，所有这些方法都受限于可以分析的核酸片段的大小。对于直接测序方法，大于600个碱基对的序列需要克隆，具有随之发生的延迟和消除亚克隆或引物步移的费用，以覆盖整个片段。SSCP和DGGE具有甚至更严重的尺寸限制。由于对序列变化的敏感性降低，这些方法不适用于较大的片段。尽管据报道SSCP能够在200个碱基对片段内检测到90％的单碱基置换，但对于400个碱基对片段，检测率下降至小于50％。类似地，DGGE的灵敏度随着片段长度达到500个碱基对而降低。ddF技术，作为直接测序和SSCP的组合，也受到可筛选的相对较小DNA尺寸的限制。
焦磷酸测序TM分析(Pyrosequencing,Inc.Westborough,MA,USA)：该技术基于在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和腺苷三磷酸双磷酸酶以及腺苷5'磷酰硫酸(APS)和荧光素底物存在下测序引物与单链、PCR扩增的、DNA模板的杂交。在第二步中，将四个脱氧核苷三磷酸(dNTP)中的第一个加入反应中，并且如果DNA聚合酶与模板链中的碱基互补，则DNA聚合酶催化脱氧核苷三磷酸引入DNA链中。每个引入事件伴随着焦磷酸盐(PPi)的释放，其量与引入的核苷酸的量等摩尔。在最后一步中，ATP硫酸化酶在腺苷5'磷酰硫酸存在下将PPi定量地转化为ATP。该ATP驱动荧光素酶介导的荧光素转化为氧化荧光素，其产生的可见光的量与ATP的量成比例。荧光素酶催化反应中产生的光通过电荷耦合器件(CCD)照相机检测并且在pyrogramTM中被视为峰。每个光信号与引入的核苷酸数成比例。
AcycloprimeTM分析(Perkin Elmer,Boston,Massachusetts,USA)：该技术基于荧光偏振(FP)检测。在PCR扩增含有感兴趣SNP的序列后，通过用虾碱性磷酸酶(SAP)和外切核酸酶I培育除去过量的引物和dNTP。一旦酶被热灭活，Acycloprime-FP过程使用热稳定聚合酶添加两种荧光终止子中的一种至就在SNP位点上游结束的引物。添加的终止子(一种或多种)通过其增加的FP鉴定并代表原始DNA样本中存在的等位基因(一种或多种)。Acycloprime过程使用AcycloPolTM，一种来自Archeon家族的新型突变体热稳定聚合酶，以及一对标记有R110和TAMRA的AcycloTerminatorsTM，代表了感兴趣的SNP的可能等位基因。AcycloTerminatorTM非核苷酸类似物具有多种DNA聚合酶的生物活性。与2',3'-双脱氧核苷酸-5'-三磷酸类似，非环状类似物起链终止子的作用。该类似物通过DNA聚合酶以碱基特异性方式引入DNA链的3'-末端上，并且由于没有3'-羟基，因此不能在进一步的链延长中起作用。已经发现，与各种Taq突变体对于衍生化的2',3'-双脱氧核苷酸终止子具有的亲和力和特异性相比，AcycloPol对衍生化的AcycloTerminators具有更高的亲和力和特异性。
反向斑点印迹：该技术使用标记的序列特异性寡核苷酸探针和未标记的核酸样本。活化的伯胺缀合的寡核苷酸共价附接到羧化尼龙膜。杂交和洗涤后，可以使用寡聚体限制释放标记的探针或探针的标记片段，即用限制酶消化双链体杂交体。在杂交之后通过使用链霉亲和素辣根过氧化物酶培育，然后使用四甲基联苯胺和过氧化氢发育，或在用抗生物素蛋白碱性磷酸酶缀合物和对酶活化敏感的发光底物(例如CSPD)培育后通过化学发光，随后暴露于x射线胶片，通过比色法可视化圆形斑点或线条。
应当理解，SNP检测领域的进步提供了额外的准确、简便且廉价的大规模SNP基因分型技术，例如动态等位基因特异性杂交(DASH,Howell,W.M.et al.,1999.Dynamicallele-specific hybridization(DASH).Nat.Biotechnol.17:87-8)；微板阵列对角线凝胶电泳(microplate array diagonal gel electrophoresis)[MADGE,Day,I.N.et al.,1995.High-throughput genotyping using horizontal polyacrylamide gels withwells arranged for microplate array diagonal gel electrophoresis(MADGE).Biotechniques.19:830-5]；TaqMan系统(Holland,P.M.et al.,1991.Detection ofspecific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'→3'exonucleaseactivity of Thermus aquaticus DNA polymerase.Proc Natl Acad Sci U S A.88:7276-80)；以及各种DNA“芯片”技术比如基因芯片微阵列(例如，Affymetrix SNP芯片)，其在Lipshutz,et al.2001的美国专利申请号6,300,063中公开，其通过引用被完全并入本文；Genetic Bit Analysis(GBATM)，其由Goelet,P.et al.(PCT Appl.No.92/15712)描述；肽核酸(PNA,Ren B,et al.,2004.Nucleic Acids Res.32:e42)和锁定的核酸(LNA,Latorra D,et al.,2003.Hum.Mutat.22:79-85)探针；分子信标(Abravaya K,et al.,2003.Clin Chem Lab Med.41:468-74)；嵌入染料[Germer,S.和Higuchi,R.Single-tubegenotyping without oligonucleotide probes.Genome Res.9:72–78(1999)]；FRET引物(Solinas A et al.,2001.Nucleic Acids Res.29:E96)；AlphaScreen(Beaudet L,etal.,Genome Res.2001,11(4):600-8)；SNPstream(Bell PA,et al.,2002.Biotechniques.Suppl.:70-2,74,76-7)；多重微测序(Curcio M,et al.,2002.Electrophoresis.23:1467-72)；SnaPshot(Turner D,et al.,2002.HumImmunol.63:508-13)；MassEXTEND(Cashman JR,et al.,2001.Drug MetabDispos.29:1629-37)；GOOD分析(Sauer S和Gut IG.2003.Rapid Commun.Mass.Spectrom.17:1265-72)；微阵列微测序(Liljedahl U,et al.,2003.Pharmacogenetics.13:7-17)；阵列引物延伸(APEX)(Tonisson N,et al.,2000.Clin.Chem.Lab.Med.38:165-70)；微阵列引物延伸(O'Meara D,et al.,2002.Nucleic Acids Res.30:e75)；标记物阵列(Fan JB,et al.,2000.Genome Res.10:853-60)；模板定向引入(Template-directed incorporation)(TDI)(Akula N,et al.,2002.Biotechniques.32:1072-8)；荧光偏振(Hsu TM,et al.,2001.Biotechniques.31:560,562,564-8)；比色寡核苷酸连接分析(Colorimetricoligonucleotide ligation assay)(OLA,Nickerson DA,et al.,1990.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87:8923-7)；序列编码的OLA(Gasparini P,et al.,1999.J.Med.Screen.6:67-9)；微阵列连接、连接酶链式反应、Padlock探针、滚环扩增、侵入物分析(在Shi MM.2001.Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection and genotyping technologies.Clin Chem.47:164-72中综述)；编码的微球(Rao KV et al.,2003.Nucleic Acids Res.31:e66)；MassArray(Leushner J,Chiu NH,2000.Mol Diagn.5:341-80)；异源双链体分析、错配裂解检测和其他常规的技术，如在Sheffield et al.(1991)、White et al.(1992)、Grompe et al.(1989and 1993)中描述的；核酸外切酶抗性核苷酸衍生物(美国专利号4,656,127)。
如提及的，还可以在测试对象的样本中分析鉴定的基因的表达水平。当该表达水平与该基因在健康对象中的表达水平(或与该基因在已知不对药剂的作用产生抗性的对象中的表达水平)不同(上调或下调，例如至少10％、20％、30％、40％、50％、100％、200％或更多)时，表明不应该使用候选疗法(至少作为单一药剂)来治疗疾病(例如，其可以完全被排除用于治疗该疾病，或者其可以被规定仅用作联合治疗，或者其可以被规定与敏化剂一起使用)。
可以使用本领域已知的方法测定由鉴定的基因编码的RNA的表达水平。这些包括例如RNA印迹分析、RT-PCR分析、RNA原位杂交染色、原位RT-PCR染色、DNA微阵列/DNA芯片、寡核苷酸微阵列。
可以使用本领域已知的方法测定由鉴定的基因编码的蛋白质的表达水平。这些包括例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、放射免疫测定(RIA)、荧光激活细胞分选(FACS)、免疫组织化学分析、原位活性测定和体外活性测定。
使用上面公开的测定，本发明人已经鉴定了两种基因：复制定时调节因子1(RIF1)和PIN2/TERF1相互作用端粒酶抑制剂1(PINX1)，其与化学治疗剂的抗性相关。
因此，根据本发明的另一方面，提供了在对象中排除用化学治疗剂进行癌症治疗的方法，包括分析复制定时调节因子1(RIF1)和/或PIN2/TERF1相互作用端粒酶抑制剂1(PINX1)在对象的肿瘤样本中的序列和/或表达，其中所述RIF1和/或PINX1的序列和/或表达水平与所述RIF1和/或PINX1在对照样本中的序列和/或表达相比的改变表明化学治疗剂应当被排除用于治疗对象中的癌症。
人RIF1的示例性mRNA序列在NM_001177663.1、NM_001177664.1、NM_001177665.1、NM_018151.4和XM_005246665.2中提供。
人PINX1的示例性mRNA序列在NM_001284356.1和NM_017884.5中提供。
在上文中提供了可以使用上述测定排除的示例性化学治疗剂。根据具体实施方式，化学治疗剂是抗生素-例如博来霉素。
在上文描述了分析序列变更和/或表达水平的方法。
在一个实施方式中，当对象的肿瘤样本中的RIF1或PINX1的序列与该基因在健康对象中的序列(或与该基因在已知不对药剂的作用产生抗性的对象中的序列)不同时，表明候选药剂不应该被用于治疗疾病(即其应被排除用于治疗该疾病)。
在另一个实施方式中，当对象的肿瘤样本中的RIF1或PINX1的表达水平与该基因在健康对象中的表达水平(或与该基因在已知不对药剂的作用产生抗性的对象中的表达水平)不同(上调或下调，例如至少10％、20％、30％、40％、50％、100％、200％或更多)时，表明不应该使用候选药剂来治疗疾病(即，其应当被排除用于治疗该疾病)。
将理解，一旦候选化学治疗剂被排除，本发明人考虑利用已知对治疗该类型的肿瘤有用的可选药剂(或另外的药剂)治疗对象。
可以用于测定RIF1和PINX1的表达水平的药剂可以在试剂盒中提供，用于测定对象是否有可能对细胞毒性疗法的作用产生抗性的目的。试剂盒可以包括如何实施分析。
试剂盒可以包括特异性地结合至编码RIF1和PINX1的DNA/RNA(例如，与其杂交的核酸)的药剂或特异性地结合至蛋白质自身(例如抗体)的药剂。
如本文所使用，术语“大约”指±10％。
术语“包括”、“包含”、“具有”和其同源词意思是“包括但不限于”。
术语“由……组成”意思是“包括并限于”。
应理解，为了清楚起见，在单独实施方式的背景下描述的本发明的某些特征也可以以单个实施方式中的组合提供。相反，为了清楚起见，在单个实施方式的背景下描述的本发明的各个特征也可以单独提供或以任何适合的子组合提供或适合于在本发明的任何其他描述的实施方式中提供。在各个实施方式的背景下描述的某些特征将不被视为那些实施方式的基本特征，除非实施方式在不含这些要素的情况下是无效的。
上文描绘的和权利要求书中要求保护的本发明的各个实施方式和方面在下列实施例中找到实验依据。
实施例
现在参照下列实施例，其与上面的描述一起以非限制性方式阐明本发明的一些实施方式。
一般而言，本文中使用的命名法和本发明中利用的实验室程序包括分子学、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中被充分阐明。参见，例如，"MolecularCloning:A laboratory Manual"Sambrook et al.,(1989)；"Current Protocols inMolecular Biology"Volumes I-III Ausubel,R.M.编著(1994)；Ausubel et al.,"Current Protocols in Molecular Biology",John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"A Practical Guide to Molecular Cloning",John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson et al.,"Recombinant DNA",Scientific AmericanBooks,New York；Birren et al.(eds)"Genome Analysis:A Laboratory ManualSeries",Vols.1-4,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1998)；在美国专利号4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057中陈述的方法；"CellBiology:A Laboratory Handbook",Volumes I-III Cellis,J.E.,ed.(1994)；"Cultureof Animal Cells-A Manual of Basic Technique"by Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994)，第三版；"Current Protocols in Immunology"Volumes I-III Coligan J.E.编著(1994)；Stites et al.(编著),"Basic and Clinical Immunology"(8th Edition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell和Shiigi(编著),"Selected Methods inCellular Immunology",W.H.Freeman及合作者，New York(1980)；在专利和科学文献中广泛描述的可利用的免疫分析，参见，例如美国专利号3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521；"OligonucleotideSynthesis"Gait,M.J.,ed.(1984)；“Nucleic Acid Hybridization"Hames,B.D.和HigginsS.J.编著(1985)；"Transcription and Translation"Hames,B.D.和Higgins S.J.编著(1984)；"Animal Cell Culture"Freshney,R.I.编著(1986)；"Immobilized Cells andEnzymes"IRL Press,(1986)；"A Practical Guide to Molecular Cloning"Perbal,B.,(1984)以及"Methods in Enzymology"Vol.1-317,Academic Press；"PCR Protocols:AGuide To Methods And Applications",Academic Press,San Diego,CA(1990)；Marshaket al.,"Strategies for Protein Purification and Characterization-A LaboratoryCourse Manual"CSHL Press(1996)；其全部通过引用被并入，如同完全在本文中陈述。其他一般参考文献遍及本文提供。本文中的过程被认为在本领域中是熟知的并且为了读者的便利而提供。其中包含的所有信息通过引用被并入本文。
实施例1.方法
人卵母细胞操纵和单性生殖ES细胞系衍生：人卵母细胞捐赠及pES和swaPS细胞系衍生程序先前已有描述。15,35简言之，使用钙离子载体和/或电脉冲活化成熟MII卵母细胞，之后是与嘌呤霉素一起的4小时培养。指示单倍性的极体挤出和单一原核的存在得到证实，且允许卵母细胞发育到胚泡阶段。在卵母细胞(其核基因组已与另一卵母细胞的核基因组交换)活化之后衍生出swaPS细胞。15ES细胞系通过滋养外胚层的激光消融38且将10μM的ROCK抑制剂Y-27632添加至衍生培养基中而衍生。35铺板之后2至3天，对剩余滋养外胚层细胞进行激光消融，且允许ICM细胞生长10-14天直到派生的手工挑取是可行的。
细胞培养：除非另外陈述，将人ES细胞在由补充有15％Knockout血清替代物(KSR,Thermo Fisher Scientific)、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、50单位mL-1青霉素、50μg mL-1链霉素、0.1mMβ-巯基乙醇及8ng mL-1碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的KnockoutDulbecco改良的Eagle培养基组成的标准人ES细胞培养基中在生长停滞的小鼠胚胎成纤维细胞的饲养细胞层上培养。细胞不含支原体并将其维持在37℃和5％CO2下的湿润培养箱中。使用无EDTA的胰蛋白酶溶液A(Biological Industries)在温和的胰蛋白酶化作用下以机械方式或在添加10μM ROCK抑制剂Y-27632(Stemgent)下使用TrypLE Express(ThermoFisher Scientific)以酶促方式进行传代持续分裂后1天或多至2天。单倍体ES细胞也可在无饲养细胞的条件下在mTeSR1(STEMCELL Technologies)或StemFitN.AK03(Ajinomoto)培养基中在Matrigel包被的板(Corning)上生长。派生的快速扩增允许在早至第三代时单倍体ES细胞的分离。
单倍体人ES细胞系的分离和维持。通过中期散布分析或亚-2c细胞分选(表1B和表2)鉴定第6-8代的人单性生殖ES细胞系中的单倍体细胞之后，通过分选1c细胞群来建立单倍体ES细胞系，其中二倍体细胞用作参照。每3-4代通过1c细胞分选的富集轮次进一步维持单倍体ES细胞培养物。
表1B：通过中期散布分析鉴定早期传代人单性生殖ES细胞系中的单倍体细胞
细胞系pES1–6的衍生先前已报道。15,35
表2：通过亚-2c细胞分选从早期传代人单性生殖ES细胞系中分离单倍体细胞
*swaPS细胞为在卵母细胞(其核基因组已与另一卵母细胞的核基因组交换)活化之后衍生出的单性生殖ES细胞。35
中期散布分析：对于有丝分裂停滞的引入，将生长中的细胞在100ng mL–1秋水仙酰胺(Biological Industries)存在下培育40min，在37℃和5％CO2下直接添加到湿润培养箱中的培养基中。然后将细胞胰蛋白酶化，在室温下在1000RPM下离心并温和地重悬浮于37℃-温低渗溶液(2.8mg mL–1KCl和2.5mg mL–1柠檬酸钠)中，之后在37℃下培育20-min。将细胞通过添加固定溶液(3:1甲醇:乙酸)来固定并在室温下培育5min。在离心并重悬浮于固定溶液中之后重复固定至少三次。在载玻片上制备中期散布并使用标准G-显带技术来染色。基于对至少80％分析的中期(每次分析最少20个中期)中的正常核型的观察，根据International System for Human Cytogenetic Nomenclature(ISCN)确定核型完整性。
通过DNA含量的活ES细胞分选：将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，使用TrypLESelect或TrypLE Express(Thermo Fisher Scientific)解离，并在37℃下在人ES细胞培养基中用10μg mL–1Hoechst 333422(Sigma-Aldrich)染色30min。离心之后，将细胞重悬浮于含有15％KSR和10μM ROCK抑制剂Y-27632的PBS中，经由70-μm细胞滤过器(Corning)过滤并在BD FACSAria III或BD Influx(BD Biosciences)中使用405nm激光来分选。对于继续生长，将分选的细胞用含有10μM ROCK抑制剂Y-27632的新鲜培养基铺板持续24小时。对于比较分析，将G1-期细胞从等基因单倍体富集的和未分选的二倍体培养物中分选。将最近在培养物(在单倍体细胞富集之后的3代内)中经历二倍体化的细胞通过分选单倍体富集的培养物中的G2/M-期峰来分离并与来自未分选的二倍体培养物的G2/M-期二倍体细胞相比较。注意到单倍体富集的培养物也是由G2/M-期单倍体与G1-期二倍体的混合群组成。通过经由仪器再运行分选样本的级分来证实分选纯度。
流式细胞术：基于利用Hoechst 33342染色的流式细胞术产生所有DNA含量分布。基于1c细胞的百分比及G1细胞关于细胞周期的其它期的相对贡献来估计单倍体细胞比例。二倍体化速率的估计是基于连续富集轮次之间的单倍体细胞比例以及通过在甲醇固定的及RNA酶处理的细胞中用碘化丙啶使用流式细胞术每次传代分析2-3个平行测定的DNA含量进行在全部7代(30天)中h-pES10二倍体化动力学的实验分析。通过将数据拟合至指数衰减曲线来估计二倍体化速率。对于DNA含量和细胞表面分子的同时流式细胞术分析，将细胞洗涤，解离并在10μg mL–1Hoechst 33342(Sigma-Aldrich)和1:200稀释的缀合的抗体或第二抗体存在下于冰上培育30min，之后利用第一抗体培育60min。对于DNA含量和细胞内PDX1的同时流式细胞术分析，将解离的细胞如免疫荧光程序中所述处理，其中Hoechst 33342用于DNA染色。第一抗体详述于表3中。在所有流式细胞术程序中，将样本经由70-μm细胞滤过器(Corning Life Sciences)过滤并在BD FACSAria III或BD Influx(BD Biosciences)中分析。
表3：实施例中使用的第一抗体
NA：不可用。IF：免疫荧光染色。FC：流式细胞术。
DNA荧光原位杂交：使用用于人染色体2和4的探针及用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的DNA染色如别处39所述进行DNA FISH。基于单或双杂交信号对每个核分别测定单倍性和二倍性。在分析之前将经历FISH的ES细胞在Matrigel包被的MATEK玻璃板上生长若干代。
碱性磷酸酶和免疫荧光染色：使用白细胞碱性磷酸酶试剂盒(Sigma-Aldrich)进行碱性磷酸酶染色。对于免疫荧光染色，将样本用PBS洗涤，用4％多聚甲醛固定10min，并透化处理并且在阻断溶液(在PBS中的0.1％Triton X-100和5％驴血清)阻断。将细胞利用在阻断溶液中1:500稀释的第一抗体(表3)和第二抗体培育，并将DAPI用于DNA染色。在固定及每次培育步骤之后将细胞用PBS洗涤两次。使用Zeiss LSM 510Meta共焦显微镜获取图像。通过手动计数沿Z轴的个别平面上的着丝点进行着丝粒量化。使用Click-iT EdU AlexaFluor 488成像试剂盒(Thermo Fisher Scientific)进行EdU染色。在分析之前将在图1G和图5D中经历着丝粒染色的ES细胞在Matrigel包被的MATEK玻璃板上生长若干代。
6-TG抗性筛选：为了生成基因捕获突变文库，使用Bio-Rad Gene Pulser(悬浮于800μL Opti-MEM中，4-mm小杯，320V，250μF)将4–5×106单倍体pES10细胞(在1c-细胞富集之后的1代内)的9个平行测定用20μg 5′-PTK-3′基因捕获载体52和20μg pCyL43piggyBac转座酶质粒53共转染，并再铺板于含有DR3MEF和ROCK抑制剂Y-27632的100×20mm培养皿中。从转染后48小时开始，使用0.3μg mL–1嘌呤霉素进行针对向所表达的基因座中的插入物的选择，之后汇集于由大约16,000个抗性克隆表示的单一文库中。仅用5′-PTK-3′的转染被用作阴性对照。为了针对6-TG-抗性突变体进行筛选，将突变文库在6μM6-TG(Sigma-Aldrich)存在下在DR4MEF上生长18天，期间6个抗性克隆被独立分离并表征。提取基因组DNA(NucleoSpin Tissue Kit,MACHEREY-NAGEL)并如先前所述使用splinkerette PCR检测插入位点，54接着PCR产物纯化和Sanger测序(ABI PRISM 3730xl DNA Analyzer(AppliedBiosystems))。使用UCSC BLAT搜索工具将序列作图成人基因组(GRCh38/hg38)。
总DNA和RNA的分离：使用NucleoSpin组织试剂盒(MACHEREY-NAGEL)分离总DNA。根据制造商方案，使用Qiagen RNeasy试剂盒分离总RNA。为了测定每个细胞的总RNA水平，通过分别分选1c(单倍体G1)和4c(二倍体G2/M)群从相同培养物中分离单倍体和二倍体细胞。生长2代之后，收获细胞并计数，且从来自每个细胞系及倍性状态(pES10和pES12，单倍体和二倍体；总计12个样本)的400,000个细胞的三个重复中分离出RNA。使用NanoDrop量化RNA的量。
基因组完整性分析：根据制造商方案，使用Infinium Omni2.5Exome-8BeadChip单核苷酸多态性(SNP)阵列(Illumina)，对G1-分选的单倍体和二倍体pES10和pES12细胞的DNA样本进行拷贝数变异(CNV)分析(表4)。使用Genome Studio Genotyping Module(Illumina)来处理原始数据以获得log R比率值用于使用R统计编程语言的分析。
表4：通过SNP阵列和DNA甲基化阵列分析的样本
*M：DNA甲基化分析。S：SNP阵列分析。
RNA测序：通过聚(A)+RNA的下拉就mRNA来富集总RNA样本(200ng–1μg，RNA完整性数目(RIN)>9)。根据制造商方案，使用TruSeq RNA Library Prep试剂盒v2(Illumina)制备RNA-Seq文库并使用Illumina NextSeq 500来测序以产生85bp单末端读数。表5提供了通过RNA-Seq所分析的样本的详细列表。
表5：通过RNA-Seq分析的样本
转录组分析：使用允许5个错配的TopHat(2.0.8b版)将RNA-Seq读数与人类参考基因组(GRCh37/hg19)比对。将每百万作图片段每千碱基的读数(RPKM)值使用Cuffquant来量化并使用Cuffnormin Cufflinks(2.1.1版)来归一化以产生相对基因表达水平。使用Pearson相关及平均联接对RPKM值进行分级聚类分析。在单倍体和二倍体人ES细胞(在各组中n＝4)中相对于总RNA的差异基因表达分析通过两个补充策略如下进行：首先，我们使用具有默认参数的Cuffdiff，将在FDR<0.05下>2倍的差异视为显著的；其次，为了鉴别可能细微但一致的转录差异，我们测试了在某个组的所有平行测定中的最低表达水平高于其它组的所有平行测定中它们的最高表达水平的基因。然后通过双尾非配对Student t检验确定统计学显著性。通过DAVID(使用Benjamini方法来确定统计学显著性)完成功能注解富集分析。印记分析包括75个人印记基因(参见Geneimprint网站)，列举于表6中。来自对照ES细胞系NYSCF1的RNA-Seq数据在别处公开37(GEO登记号GSE61657)。在通过定底线至1并设定超过1的表达阈值来除去平均参照二倍体样本中不表达的基因之后，使用R程序包zoo(1.7-12版)生成全基因组基因表达移动中值图。来自不同组织的RNA-Seq数据撷取自Genotype-Tissue Expression(GTEx)Portal。40图4d中的颜色编码标度对应于相对于组织(左侧标度)中及ES细胞重复和EB样本的各组(右侧标度)中的平均值的基因表达水平。通过使用Affymetrix人基因1.0ST阵列如先前41所述进行表达微阵列分析。
表6：用于分级聚类分析的印记基因
DNA甲基化分析：使用Infinium HumanMethylation450BeachChips(Illumina)，遵循先前所述的Infinium HD甲基化方案对来自表4中详述的样本的基因组DNA进行DNA甲基化分析。37来自对照ES细胞系NYSCF1的DNA甲基化数据在(GEO登记号GSE61657)之前公开。37通过使用阵列归一化(SWAN)内的亚集-分位数对数据进行处理和归一化并且使用R程序包ChAMP(1.4.0版)调节批次效应。如先前所述分析在与多能特异性基因和iDMR有关的CpG位点处的DNA甲基化水平。37对于X染色体上的DNA甲基化水平的分析，滤除具有小于0.4的平均β值的探针。使用默认设置，通过ChAMP中的lasso功能完成DMR分析。然后将DMR通过接近度指派给基因并使用DAVID(使用Benjamini方法来确定统计学显著性)分析功能注解富集。
细胞大小分析：在G1中的单倍体和二倍体细胞群的分选之后，通过CountessAutomated Cell Counter(Invitrogen)测量单个活细胞的直径(2r)并且将它们的表面积和体积分别计算为4πr2和4/3πr3。分析包括分别针对1n pES10、1n pES12、2n pES10及2npES12的7、4、8及4个技术平行测定。
线粒体DNA丰度分析：使用线粒体基因ND2的引物(正向引物：5′–TGTTGGTTATACCCTTCCCGTACTA–3′(SEQID NO:1)；反向引物：5′–CCTGCAAAGATGGTAGAGTAGATGA–3′(SEQ ID NO:2))，通过定量PCR(qPCR)分析相对mtDNA丰度并且通过使用核基因BECN1的引物(正向引物：5′–CCCTCATCACAGGGCTCTCTCCA–3′(SEQ IDNO:3)；反向引物：5′–GGGACTGTAGGCTGGGAACTATGC–3′(SEQ ID NO:4))如别处所述针对核DNA进行归一化。42使用具有PerfeCTa SYBR GreenFastMix的Applied Biosystems 7300实时PCR系统(Quanta Biosciences)进行分析。分析包括表4中详述的所有G1-分选的样本(对于各组n＝4，每个细胞系两个生物平行测定)。
所有高通量数据都以登记号GSE71458保藏于Gene Expression Omnibus(GEO)。
胚状体分化：通过用无EDTA的胰蛋白酶溶液A(Biological Industries)分离ES细胞克隆来进行EB分化，之后重悬浮并进一步在低附着板上在无bFGF的人ES细胞培养基中进一步培养细胞聚集体。在1c-细胞富集之后的2代内开始单倍体ES细胞的分化。21天之后，在解离并在37℃下用10μg mL–1Hoechst 33342(Sigma-Aldrich)染色30min之后，从G1中的未分选的和/或分选的EB细胞中提取EB RNA。对铺板于0.2％明胶上并在无bFGF的人ES细胞培养基中扩展的解离的EB细胞进行中期散布分析。
向神经祖细胞的分化：使用在稍微修改下的用于有效神经分化的10-天方案43获得NCAM1-阳性ES细胞衍生的NPC。44在1c-细胞富集之后的2代内开始分化。通过用Hoechst33342与1:200稀释的抗人NCAM-1/CD56第一抗体和Cy3-缀合的第二抗体(JacksonImmunoresearch Laboratories)共染色，从G1中的分选的单倍体NCAM1-阳性细胞中提取RNA。
神经元分化：向神经元的分化是基于有修改的SMAD信号传导的协同抑制46通过遵循公开方案45如下进行：在1c-细胞富集之后的2代内开始分化，其中通过用无bFGF且含有10μM SB431542(Selleckchem)和2.5μM LDN-193189(Stemgent)的人ES细胞培养基替换培养基将完全汇合的ES细胞于Matrigel包被的板上在mTeSR1中培养4天。随后，将细胞保持在补充有10μM SB431542和2.5μM LDN-193189的N2培养基45中持续4天，之后在补充有B-27(Thermo Fisher Scientific)和10μM DAPT(Stemgent)的N2培养基中持续2天。然后将细胞解离并在10μM ROCK抑制剂Y-27632(Selleckchem)存在下再铺板于0.01％聚-L-鸟氨酸-(Sigma-Aldrich)和层粘连蛋白包被的(4μg/ml，Thermo Fisher Scientific)板上，并且在无Y-27632的相同培养基中进一步培养接下来的4天。将神经元培养物维持在补充有B-27和20ng–1BDNF(R&D)的N2培养基中直到在第20天通过免疫染色和FISH进行分析。
心肌细胞分化：于Matrigel包被的板(Corning)上在mTeSR1(STEMCELLTechnologies)中生长的80–90％汇合ES细胞经历基于分别用CHIR99021和IWP-2(Selleckchem)的连续GSK3和WNT抑制的11-天方案47。在1c-细胞富集之后的2代内开始分化。在分化的第11天，对1c-细胞进行分选并铺板用于免疫染色。
向胰腺谱系的分化：基于若干近期的出版物开发了此处利用的方案。48–50通过使用STEMdiff Definitive Endoderm试剂盒(Stemcell Technologies)将在无饲养细胞的条件下生长的ES细胞分化为定形内胚层持续3-4天。通过涉及用重组人KGF/FGF7(R&DSystems)、LDN-193189(Stemgent)、KAAD-环杷明(Stemgent)及视黄酸(Stemgent)处理的逐步方案完成随后的特异化。在第8-11天，EGF(R&D System)被用于诱导胰腺祖细胞(PPC)。在1c-细胞富集之后的2代内开始分化。
畸胎瘤形成分析：动物中的所有实验程序都得到Hebrew University伦理委员会的认可。将ES细胞胰蛋白酶化并将大约2×106个细胞重悬浮于100μL人ES细胞培养基和100μL Matrigel(BD Biosciences)中，之后皮下注射到NOD-SCID Il2rg-/-免疫缺陷小鼠(Jackson Laboratory)中。注射之后8-12周，解剖肿瘤并经历进一步的分析。由使用LeicaCM1850低温恒温器(Leica Biosystems，10-μm切片)低温保存在O.C.T.化合物(SakuraFinetek)中的肿瘤切片制备组织载玻片，之后免疫染色、苏木精和曙红染色或FISH分析。对从新鲜解剖的肿瘤解离出的细胞进行伴有Hoechst 33342染色的流式细胞术。
实施例2.通过着丝点的量化测定单细胞水平下的倍性。
我们设计了一种基于着丝粒蛋白免疫荧光染色来测定单细胞分辨率下的倍性的方法。因为每个染色体通常具有一个着丝粒，所以推理出，能够检测和列举着丝粒将提供一种目测各个细胞中的倍性的手段，同时还允许通过对特异性标记的共染色来定义细胞特性。
我们首先在已知倍性的细胞系上测试此方法，所述细胞系包括单倍体富集的和二倍体pES10细胞、三倍体soPS2细胞35和四倍体杂交1细胞，36证明了倍性与着丝粒的计数数目之间的相关性(图6A)。着丝粒计数在染色体数目的预期范围内。76％的单倍体富集的细胞显示出15-25个着丝点，而剩余细胞显示出30-48个着丝点，类似于二倍体细胞中记录的范围(34-51)。重要的是，单倍体细胞的此百分比与通过DNA FISH(73％，图6B)和DNA含量流式细胞术(73％，图6C)估计的一致，说明着丝点量化是用于鉴别单倍体ES细胞的可靠方法。
计数着丝粒的准确度随着倍性增加而降低，这是由于着丝粒群集，其将导致个别着丝粒实际数目的低估，以及在单一细胞中计数大量着丝粒的困难。观察到与预期相比更高数目的着丝点可由在罕见细胞中的视觉假象或非整倍性来解释。为了弄清细胞周期进程是否改变着丝点数目或影响它们的量化，我们就着丝粒蛋白和磷酸-组蛋白3(pH3，Ser10)或5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)(标记细胞分别进入有丝分裂并经历DNA复制)对单倍体ES细胞进行共染色，以便量化在细胞周期的不同阶段的着丝粒数目(图6D-F)。显然，着丝点数目在DNA复制期间没有增加，证实了单倍体细胞可通过着丝粒染色在整个分裂间期被准确地检测。
实施例3.单倍体人ES细胞的衍生
我们生成并分析14个早期传代(传代≤9次)人pES细胞系的集合的单倍体细胞的持久性。所有细胞系来源于展现第二极体挤出和单一原核的活化的卵母细胞。我们开始使用通过中期散布和G-显带的染色体计数作为一种用于明确和定量发现罕见单倍体核的方法。在10个单独pES细胞系中，低比例的单倍体中期排它地见于单一细胞系pES10中(1.3％，表1B)。我们还使用在Hoechst 33342染色下的活FACS，目的在于将具有相当于小于两个染色体拷贝(2c)的DNA含量的细胞与另外4个细胞系分离，导致单倍体细胞从第二细胞系pES12中的成功富集(表2)。
两个单独单倍体富集的ES细胞系由在5至6轮1c-细胞FACS富集和扩展内的pES10和pES12二者(下文中称为h-pES10和h-pES12)建立(图1C(pES10)，图5A(pES12))。这些细胞系在标准培养条件下生长30代以上，同时包括具有正常单倍体核型的细胞(图1D，图5B)。然而，由于二倍体化以每天3–9％细胞的速率出现(图1E)，因此需要每3至4代的细胞分选用于维持和分析单倍体细胞。此外，在粘附条件下倍性的目测通过DNA荧光原位杂交(FISH)(图1F，图5c)及着丝粒蛋白位点的量化(图1G，图5D；图6)而实现。除了它们的完整核型之外，单倍体ES细胞没有携带相对于它们未分选的二倍体配对物的显著拷贝数量的变异(CNV)(图5E)。重要的是，我们没有观察到在将产生伪二倍体的两个细胞系中特定区域的共同复制。因此，在整个单倍体细胞分离和维持过程中基因组完整性得以保留。如所预期，单核苷酸多态性(SNP)阵列分析证明了在所有染色体中二倍体pES10和pES12细胞的完整纯合性。
h-pES10和h-pES12都展现经典的人多能性干细胞特征，包括典型的集落形态和碱性磷酸酶活性(图2A，图2B)。单一单倍体ES细胞表达不同的标志性多能性标记(NANOG、OCT4、SOX2、SSEA4及TRA1-60)，如通过着丝点量化(>95％单倍体)在基本上纯的单倍体培养物中所证实(图2C，图7)。值得注意地，选择性流式细胞术使得能够验证两个人ES-细胞特异性细胞表面标记(TRA-1-60和CLDN618)在单一单倍体细胞中的表达(图2D)。而且，分选的单倍体和二倍体ES细胞显示出多能基因的高度相似的转录和表观遗传特征(图2E，图2F)。由于单倍体ES细胞衍生为孤雌生殖体，所以它们展示了母本印记的独特转录和表观遗传谱，因为不存在父本遗传的等位基因(图8)。
单倍体细胞对于功能丧失遗传筛选是有价值的，因为表型可选择的突变体可在单个等位基因破坏之后被鉴别。为了证明此原理在单倍体人ES细胞中的适用性，使用靶向转录活性位点的piggyBac转座子基因捕获系统生成全基因组突变文库(图2G，图8E)，并且就对嘌呤类似物6-硫代鸟嘌呤(6-TG)的抗性进行筛选。在六个分离和分析的6-TG-抗性克隆中，有三个携带定位在核苷二磷酸连接部分X-型基序5(NUDT5)常染色体基因处的基因捕获插入物(图2H)。最近证实NUDT5破坏通过对5-磷酸-D-核糖-1-焦磷酸(PRPP)的产生在上游发挥作用赋予人细胞中的6-TG抗性，51PRPP充当次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1(HPRT1)介导的6-TG向一磷酸硫代鸟苷(TGMP)转化中的磷酸核糖基供体(图2I)。由于常染色体突变所致的功能丧失表型的检测证实了遗传筛选在单倍体人ES细胞中是可行的。
实施例4.单倍体与二倍体ES细胞的分子和细胞比较
人ES细胞作为单倍体和二倍体存在的能力引导我们研究这两个倍性状态是否可在基因调节和细胞生物学的某些方面上不同。为了分析在细胞周期相同时期中的单倍体和二倍体ES细胞，我们使用FACS来分离G1-期单倍体细胞(1c)并将它们与来自未分选的二倍体培养物的等基因G1-期二倍体细胞(2c)进行比较(图3A，图9A)。我们首先目的在于通过使用RNA测序(RNA-Seq)比较单倍体与二倍体ES细胞的转录组揭示推定的倍性相关差异，考虑到表达水平的观察到的变化将相对于各倍性状态的总基因表达，而非表示绝对差异。在基因组规模上，未分化单倍体与二倍体ES细胞紧密地彼此群集并且与分化的胚状体(EB)分离，表明相似性延伸超出遗传背景的影响(图3B)。然而，总共565个差异表达的基因被鉴别(>2倍变化，假发现率(FDR)<0.05)，对应于在单倍体中与二倍体相比275个相对上调基因和290个相对下调基因(图9B)。
值得注意地，X染色体基因在相对上调的基因集中显著频繁表现(overrepresent)(40％，P<0.001，χ2拟合优度检验)(图3C)，且X染色体基因的表达水平单独清楚地区分单倍体与二倍体ES细胞；后者群集甚至比它们未分化的单倍体配对物更接近它们分化的衍生物(图3D)。这些数据与在单倍体和二倍体人ES细胞中的X染色体失活(XCI)的预期差别状态一致：虽然单倍体中的单一X染色体有转录活性(Xa)，但二倍体中的两个X染色体中的一个经常经历如雌性体细胞中的XCI(XaXi)19。实际上，单倍体人ES细胞通过RNA-Seq和表达微阵列分析两者展现出与二倍体相比X染色体基因表达的相对增加，及XCI-驱动的转录物XIST的缺乏表达(图3E，图3F，图9B-D)，如在二倍体XaXa人ES细胞中所观察到20。XCI是一种表观遗传现象，通过抑制组蛋白修饰和DNA甲基化来调节。H3K27me3位点在未分选的二倍体ES细胞中而没有在它们的单倍体富集的配对物中一致地观察到(图3G)。而且，甲基化组分析显示单倍体ES细胞的X染色体DNA甲基化特征类似于二倍体雄性ES细胞(XaY)，其单拷贝X染色体大部分低甲基化，与二倍体雌性细胞中低甲基化Xa和过度甲基化Xi的复合模式相反(图3H)。有趣的是，通过所有以上提及的分析，在二倍体化之后不久(在单倍体细胞富集之后的3代内)，近期二倍体化的ES细胞保留XaXa(图3A，图3E-H)。
常规相对基因表达分析所固有的总基因表达的归一化，21导致常染色体基因与二倍体ES细胞相比似乎相似的表达水平，但在单倍体中更高的X-连锁基因水平(图3E，图9C)。然而，假设在单倍体Xa和二倍体XaXi细胞中X-连锁基因的绝对表达是相等的，这些数据暗示在单倍体细胞中全基因组常染色体基因水平的降低(图9E，图9F)。支持这一观点，我们发现从单倍体ES细胞中分离的总RNA量显著低于从相同数量的二倍体细胞获得的那些(图3I)。总基因表达的总体降低意味着这些细胞的物理尺寸也被改变。实际上，G1中的分选的单倍体与二倍体ES细胞之间的平均直径比率为约0.8(分别为9.6和11.5μm)，对应于表面积约0.7和体积约0.6的单倍体：二倍体比率(图3I，图9G)。
我们随后关注在常染色体内的一致差别调节。基于转录和DNA甲基化分析，我们发现编码具有信号肽的蛋白质的基因的显著富集在单倍体ES细胞中相对下调(图9H)。值得注意的，我们还检测到在单倍体细胞中的氧化磷酸化所涉及的11种基因的微小但明显的相对上调，包括构成此途径的五个复合体中四个的代表性编码亚单位(图3J，图9I)。此外，氧化磷酸化中涉及的所有13种线粒体基因也在单倍体细胞中一致上调(图3J)，表明在这些核与线粒体基因之间的协同调节。这与在单倍体与二倍体之间的线粒体DNA(mtDNA)与核DNA比率的32％增加一致(图3I)，暗示相对于核DNA含量的线粒体丰度在单倍体细胞中相对较高。
实施例5.人单倍体ES细胞的分化
我们然后设法评价单性生殖来源的单倍体人ES细胞的分化潜力。虽然哺乳动物单性生殖发育由于亲本基因组的非等效性而受到限制，22,23但二倍体人单性生殖多能性干细胞在功能上是多能性的，如通过它们产生所有胚胎谱系的能力所看出。13,24,25为了弄清人单性生殖ES细胞是否能够作为单倍体多谱系分化，我们进行了若干分化测定，随后对所生成细胞的倍性和分化状态表征。通过单倍体富集的和二倍体ES细胞的自发分化生成的21日龄的EB不能由外观来区分(图4A)，且解离的单倍体细胞衍生的EB细胞的形态与分化一致(图10A)。值得注意地，中期散布分析揭示了单倍体核型(图4B；4/4中期)，且在h-pES10-和h-pES12-衍生的EB细胞中通过流式细胞术证实大部分单倍体DNA谱(～70％单倍体)(图4C，图10B)。我们然后比较G1-分选的单倍体ES与EB细胞的基因表达谱，关注在8个组织和多能性干细胞中显示明显特异性的18种基因。例如，我们的基因集包括CHRM1(胆碱能受体)、KRT17(角蛋白)、MYL1(肌球蛋白)、REN(肾素)、ALB(白蛋白)、CPA1(羧肽酶)、SFTPD(表面活性剂)及MALRD1(MAM和LDL受体)，它们分别在脑、皮肤、肌肉、肾脏、肝脏、胰腺、肺及肠中表达(图4D)。然而这些谱系特异性基因的表达在未分化的ES细胞中可忽略，全部都在单倍体和二倍体EB细胞中表达(图4D，图6C)。另外，单倍体和二倍体EB细胞显示多能特异性基因的不显著表达，与所有三个胚胎胚层的体细胞命运的有效分化和获取一致。
为了将此项分析扩展至更特异性且潜在更成熟的细胞类型，我们使单倍体ES细胞经历定向分化测定。经历向神经命运的定向分化持续10天的单倍体ES细胞保留单倍体，同时有效地产生神经细胞粘附分子1(NCAM1)-阳性神经祖细胞(NPC，～90％效率)(图4E，图11A，图11B)。分选的单倍体NPC表达多个神经谱系特异性基因，但不表达多能特异性基因(图4F，图11C)，表明在承担神经命运的同时从多能状态的稳健退出。XCI在二倍体分化的雌性细胞中是必不可少的，造成剂量补偿及X染色体与常染色体之间的1:2比率。由于单倍体ES细胞不能使它们的单拷贝X染色体失活，因此1:1的X：常染色体剂量失衡应当持续至分化状态。实际上，单倍体NPC和单倍体EB细胞两者都显示与二倍体EB细胞的XaXi特征相反的Xa特征，如由全基因组表达分析和XIST水平所指示(图4G，图11D)。
神经元分化不限于祖细胞阶段，因为细胞至第20天还以高效率(>90％)分化为成熟TUJ1(也称为β-微管蛋白III)-阳性神经元，有单倍体细胞的显著持久性，如通过着丝粒的共染色(图4H；47％单倍体，n＝104)和FISH分析(图11E，图11F；46％单倍体，n＝200)所示。类似地，在导致自发搏动集落的11-天方案期间单倍体细胞分化为表达心肌肌钙蛋白T型2(TNNT2)的心肌细胞(图4I；32％单倍体，n＝97)，并且从整个培养物(25％1c细胞)分选的39％(n＝31)单倍体细胞经证实为TNNT2-阳性的(图4J，图11G)。然后，我们将单倍体富集的培养物(～70％单倍体)分化为胰腺谱系，通过着丝点分析对分化的两个阶段进行分析，即特异化为定形内胚层且进一步分化为胰腺细胞。我们观察到单倍体和二倍体都稳健地分化(>90％)为分叉头框A2(FOXA2)-阳性定形内胚层细胞(图4K；56％单倍体，n＝112)，且分化为胰腺和十二指肠同源异型框1(PDX1)-阳性胰腺细胞(图4l；13％单倍体，n＝103)，其中一些还对NK6同源异型框1(NKX6.1)呈阳性。除了着丝粒分析之外，还通过流式细胞术证实单倍体PDX1-阳性细胞的持久性(图4M；10％PDX1-阳性1c细胞；图11H，图11I)。
最终，两种单倍体富集的人ES细胞系都产生包含外胚层、中胚层及内胚层起源的细胞类型的畸胎瘤，如通过TUJ1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及α-胎蛋白(AFP)的组织和免疫染色分析所示(图4N，图12A，图12B)，满足了人多能性在体内的最严格标准。重要的是，未能检测到残留的未分化OCT4阳性细胞(图4N，图12B)。解剖之后，DNA含量分析揭示相当大的h-pES10-衍生的畸胎瘤细胞群保留单倍体(图4O)。通过组织学和FISH对来自独立的h-pES12-衍生的畸胎瘤的系列切片的组合分析证实体内分化的单倍体人细胞的存在能够在响应于发育信号的同时促成组织化的组织结构(图4P)。值得注意的是，在所有分析的畸胎瘤中鉴别出单倍体细胞(n＝4)，尽管在可变的比例下，这可受到单倍体细胞的初始量和/或分化时间长度的影响。
实施例6.人单倍体ES细胞的分化
化疗是癌症的主要疗法。然而，对化疗的抗性已经成为化疗长期成功的主要障碍。已经提出许多不同途径参与建立对化疗的抗性。因此，本发明人试图鉴定其功能丧失将使得能够对主要化疗药物产生抗性的基因。因此，本文所述的功能丧失单倍体文库是针对基因来分析的，该基因的减损导致对化疗的抗性。鉴定了影响胚胎干细胞的不同化疗，并且将来自不同文库的细胞暴露于每种化疗以允许抗性细胞生长，然后鉴定导致抗性的基因。这种筛选将有助于全面分析化疗的抗性。
作为原理验证，本发明人已经将单倍体人ES细胞的基因捕获文库暴露于博来霉素并且在处理之前和之后从细胞中分离DNA。通过高通量测序分析DNA以鉴定特定基因的富集，其敲除使得细胞在博来霉素存在下存活。大约20种基因显示出显著的富集，其中有RIF1和PINX1，两种参与DNA损伤反应和端粒酶长度的基因(参见图13)。该分析证明了能够抵抗博来霉素的基因和途径，并且可以设计与化疗的药物组合以克服对药物的抗性。
此外，鉴定能够抵抗博来霉素的基因可以帮助我们识别其肿瘤对药物有抗性的患者。可以分析人肿瘤的拷贝数变异和基因表达，并且因此对于每种肿瘤，鉴定癌细胞中特定基因是否缺失是可能的。多种肿瘤的当前分析显示，一些肿瘤表现出RIF1或PINX1的缺失和/或缺乏，这两种基因的缺乏会赋予对药物的抗性(图14)。
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尽管已经结合本发明的具体实施方式描述了本发明，但很明显，许多替代方案、修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。因此，本发明旨在涵盖落入所附权利要求书的精神和广泛范围内的所有这些替代方案、修改和变化。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均在此通过引用以其全部并入本说明书中，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入本文。另外，本申请中任何参考文献的引用或标识不应被解释为承认这样的参考文献可用作本发明的现有技术。在使用章节标题的范围内，它们不应被解释为必然的限制。
序列表
<110> 耶路撒冷希伯来大学伊萨姆研发有限公司
N.本维尼斯
<120> 在人单倍体细胞中筛选化学疗法抗性
<130> 66519
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 1
tgttggttat acccttcccg tacta 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 2
cctgcaaaga tggtagagta gatga 25
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 3
ccctcatcac agggctctct cca 23
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 4
gggactgtag gctgggaact atgc 24
<210> 5
<211> 164
<212> DNA
<213> 智人
<400> 5
ctatgagtgt atcgttctgg tgaaacagtt ccgaccacca atggggggct actgcataga 60
gttccctgca ggtgagtcac tcaacatcga attgcttctt agggatgttg gcctgaacca 120
gggtaaagcc tgagaactgc aaagctcagc tctgcagttt ttaa 164

Claims (45)

1.一种选择用于治疗对象的疾病的药剂的方法，其包括：
(a)将多种单倍体人胚胎干(ES)细胞暴露于细胞毒性疗法，其中所述多种单倍体ES细胞的至少一部分包括独特的人工灭活的或过度活化的基因；
(b)选择对所述细胞毒性疗法显示抗性的所述多种单倍体人胚胎干(ES)细胞中的细胞；
(c)鉴定在所述细胞中所述独特的人工灭活的基因；和
(d)分析所述独特的人工灭活的基因或活化的基因在所述对象的细胞样本中的序列和/或表达，其中与所述基因在对照样本中的序列和/或表达相比，所述基因的序列和/或表达水平的改变表明所述药剂应当作为用于治疗对象中疾病的单一疗法被排除。
2.权利要求1所述的方法，其中所述多种单倍体ES细胞的至少一部分包括独特的人工灭活的基因。
3.权利要求2所述的方法，其中所述单倍体人ES细胞包括导致所述基因灭活的基因捕获载体。
4.权利要求3所述的方法，其中所述基因捕获载体编码用于鉴定所述人工灭活的基因的报告多肽。
5.权利要求1所述的方法，其中所述单倍体人ES细胞包括导致所述基因的灭活或活化的CRISPR系统的组分。
6.权利要求1所述的方法，其中在单个容器中实现所述暴露多种单倍体人胚胎干(ES)细胞。
7.权利要求1所述的方法，其中在多个容器中实现所述暴露多种单倍体人胚胎干(ES)细胞，其中所述多个容器中的每个容器包括具有相同人工灭活基因的单倍体人胚胎干(ES)细胞。
8.权利要求1所述的方法，其中所述疾病是癌症。
9.权利要求8所述的方法，其中所述细胞样本是肿瘤样本。
10.权利要求1所述的方法，其中所述细胞毒性疗法包括药剂。
11.权利要求10所述的方法，其中所述药剂是化学治疗剂。
12.权利要求11所述的方法，其中所述化学治疗剂是抗菌剂。
13.权利要求12所述的方法，其中所述抗菌剂是蒽环类抗生素或色霉素。
14.权利要求12所述的方法，其中所述抗菌剂选自阿霉素、柔红霉素、米托蒽醌、伊达比星、放线菌素D、普卡霉素、丝裂霉素和博来霉素。
15.权利要求14所述的方法，其中所述抗菌剂是博来霉素。
16.权利要求1所述的方法，其中所述细胞毒性疗法包括放射疗法。
17.权利要求1所述的方法，其中通过对所述细胞的DNA测序实现所述鉴定。
18.权利要求1所述的方法，其中所述单倍体人ES细胞通过如下生成：
(a)鉴定来自ES细胞群的样本中的单倍体中期细胞，其中所述ES细胞衍生自人工活化的人卵母细胞；和
(b)基于细胞倍性分选所述ES细胞群以产生单倍体人ES细胞群。
19.权利要求18所述的方法，进一步包括在培养物中维持富集的ES细胞群持续至少三次传代。
20.权利要求18所述的方法，其中通过中期散布分析或亚-2c细胞分选鉴定样本中的单倍体中期细胞。
21.权利要求18所述的方法，其中通过流式细胞术、着丝粒蛋白免疫荧光染色或DNA荧光原位杂交鉴定样本中的单倍体中期细胞。
22.权利要求18所述的方法，其中所述分选步骤包括至少一个周期的荧光活化细胞分选术(FACS)。
23.一种排除利用化学治疗剂治疗对象中癌症的方法，其包括分析所述对象的肿瘤样本中复制定时调节因子1(RIF1)和/或PIN2/TERF1相互作用端粒酶抑制剂1(PINX1)的序列和/或表达，其中与所述RIF1和/或PINX1在对照样本中的序列和/或表达相比，所述RIF1和/或PINX1的序列和/或表达水平的改变表明所述化学治疗剂应当作为用于治疗对象中癌症的单一疗法被排除。
24.权利要求23所述的方法，其中所述化学治疗剂是抗菌剂。
25.权利要求24所述的方法，其中所述抗菌剂是蒽环类抗生素或色霉素。
26.权利要求24所述的方法，其中所述抗菌剂选自阿霉素、柔红霉素、米托蒽醌、伊达比星、放线菌素D、普卡霉素、丝裂霉素和博来霉素。
27.权利要求26所述的方法，其中所述抗菌剂是博来霉素。
28.权利要求23所述的方法，进一步包括利用不是所述化学疗法的抗癌疗法治疗所述对象。
29.一种试剂盒，其包括特异性地检测复制定时调节因子1(RIF1)的第一检测剂和特异性地检测PIN2/TERF1相互作用端粒酶抑制剂1(PINX1)的第二检测剂。
30.权利要求29所述的试剂盒，其中所述第一检测剂和/或所述第二检测剂是抗体或核酸。
31.一种选择用于治疗疾病的药剂的方法，其包括：
(a)将多种人单倍体细胞暴露于细胞毒性疗法，其中所述细胞由分离的单倍体人胚胎干(ES)细胞分化，并且其中所述多种细胞的至少一部分包括独特的人工灭活的或过度活化的基因；
(b)选择对所述细胞毒性疗法显示抗性的所述多种细胞中的细胞；和
(c)鉴定在所述细胞中所述独特的人工灭活的或过度活化的基因。
32.权利要求31所述的方法，进一步包括分析患有所述疾病的对象的细胞样本中所述独特的人工灭活的基因的序列和/或表达，其中与所述基因在对照样本中的序列和/或表达相比，所述基因的序列和/或表达水平的改变表明药剂应当作为用于治疗所述对象中所述疾病的单一疗法被排除。
33.权利要求31所述的方法，其中所述单倍体细胞是多能细胞。
34.权利要求32所述的方法，其中所述单倍体细胞是最终分化的细胞。
35.权利要求31所述的方法，其中所述多种细胞的至少一部分包括独特的人工灭活的基因。
36.权利要求35所述的方法，其中所述单倍体细胞包括导致所述基因灭活的基因捕获载体。
37.权利要求36所述的方法，其中所述基因捕获载体编码用于鉴定所述人工灭活的基因的报告多肽。
38.权利要求31所述的方法，其中所述单倍体细胞包括导致所述基因的灭活或活化的CRISPR系统的组分。
39.权利要求31所述的方法，其中在单个容器中实现所述暴露多种单倍体人细胞。
40.权利要求31所述的方法，其中在多个容器中实现所述暴露多种单倍体人细胞，其中所述多个容器中的每个容器包括具有相同人工灭活基因的单倍体人细胞。
41.权利要求31所述的方法，其中所述疾病是癌症。
42.权利要求41所述的方法，其中所述细胞样本是肿瘤样本。
43.权利要求31所述的方法，其中所述细胞毒性疗法包括药剂。
44.权利要求31所述的方法，其中所述细胞毒性疗法包括放射疗法。
45.权利要求31所述的方法，其中通过对所述细胞的DNA测序实现所述鉴定。
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