CN105164269A - 与端粒延伸相关的化合物、组合物、方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于在细胞中瞬时表达外源端粒酶活性的化合物和组合物。与编码端粒酶逆转录酶的核糖核酸相关的化合物和组合物在需要此类处理的细胞的端粒延伸中是有用的。此类细胞包括例如含有缩短的端粒的细胞和来自可从端粒延伸受益的受试者，例如患有年龄相关疾病或其它疾病或处于患所述疾病的风险中的受试者的细胞。还提供了通过向动物细胞体外或体内施用提供的化合物和组合物来延伸端粒的方法，以及包括所述化合物和组合物以及使用说明书的试剂盒。

Description

与端粒延伸相关的化合物、组合物、方法和试剂盒
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年2月22日提交的美国临时申请号61/768,047的权益，该临时申请的公开内容通过引用整体并入本文。
发明背景
端粒在线性染色体的末端包含重复DNA序列，所述DNA序列，当充分长时，允许每一个染色体末端形成防止末端形成双链或单链DNA断裂的环。Artandi&DePinho(2010)Carcinogenesis31:9-18。端粒随时间推移而缩短，部分因为氧化损伤和不完全DNA复制，最终导致不能形成保护环的关键短的端粒、染色体末端的暴露、染色体-染色体融合、DNA损伤反应和细胞衰老、细胞凋亡或恶性肿瘤。O'Sullivan和Karlseder(2010)Nat.Rev.Mol.CellBiol.11:171-181；Calado等(2012)Leukemia26:700-707；Artandi和DePinho(2010)Carcinogenesis31:9-18。
酶复合物端粒酶延伸端粒并且包含两个基本组分：端粒酶逆转录酶(TERT)，和称为端粒酶RNA组分(TERC)的RNA组分。端粒酶复合物的其它组分包括蛋白TCAB1、角化不良蛋白、Gar1、Nhp2、Nop10和RHAU。Brouilette等.(2003)Arteriosclerosis,Thrombosis,andVascularBiology23:842-846。TERT是端粒酶复合物的限制组分，从而增加TERT的治疗可增强端粒酶活性。端粒酶活性通常使用端粒重复扩增法(TRAP)测定来测量，所述测定定量细胞裂解物或其它样品延伸合成端粒样DNA序列的能力。
如可因端粒长度维持在防止细胞衰老和细胞凋亡以及导致的细胞功能障碍中的重要性而预期的，TERT和TERC的基因突变与端粒维持不足的致命性遗传病(包括特发性肺纤维化、先天性角化不良和再生障碍性贫血)相关联。这些疾病中因短的端粒而引起的早熟细胞衰老和细胞凋亡的作用本身是破坏性的，并且可因增加的患癌风险而进一步恶化。Artandi和DePinho(2010)Carcinogenesis31:9-18；Alter等Blood113:6549-6557。除了使短的末端与癌症相联系的丰富的相关数据(Wentzensen等(2011)CancerEpidemiol.BiomarkersPrev.20:1238-1250)外，再生障碍性贫血提供了一些第一直接证据：在人中关键短的端粒和导致的染色体不稳定性使细胞易于恶性转化(Calado等(2012)Leukemia26:700-707)。有证据表明短的端粒在致命性与非致命性肌肉萎缩之间产生差异(Sacco等(2010)Cell143:1059-1071)，并且端粒延伸防止内皮细胞衰老(Matsushita等(2001)Circ.Res.89:793-798)，所述内皮细胞老化与动脉粥样硬化、高血压和心脏病相关(Perez-Rivero等(2006)Circulation114:309—317)。除了牵涉这些和其它疾病以外，短的端粒还限制用于细胞疗法和生物工程应用的细胞扩增。Mohsin等(2012)JournaloftheAmericanCollegeofCardiologydoi：10.1016/j.jacc.2012.04.0474。
天然产物来源的端粒酶激活剂已由T.A.Sciences,Inc作为营养食品商业售卖。Harley等(2011)RejuvenationResearch14:45-56。该化合物据称打开内源hTERT基因，从而激活天然端粒酶的表达。然而，不清楚该处理如何克服天然端粒酶活性的正常调控。
已用编码人TERT(hTERT)的载体转染几乎无或无端粒酶活性的人细胞。参见，例如，Bodnar等(1998)Science279:349-352。发现转染的细胞表达端粒酶，展示延长的端粒，强劲地分裂，以及展示相较于缺乏端粒酶的细胞减缓的衰老，但因该处理引起的基因组修饰增加了风险，从而限制该方法的实用性。
有限的复制能力是大多数正常细胞的定义特征之一。该受限的复制过程的终点是衰老，一种其中细胞保持活力但不再分裂的停滞状态。衰老细胞的特征通常在于改变的基因表达模式、改变的形态学和减弱的或消除的进行它们的正常功能的能力。
端粒的缩短在衰老过程中在动物组织的细胞衰老中起着直接作用。此外，有越来越多的证据表明短的端粒存在于多种疾病，包括上述那些疾病中。通过端粒延伸预防疾病的前景刺激对在体内和/或体外于动物细胞中延伸端粒的安全有效的处理的需要。此外，存在对在用于细胞疗法、细胞组织工程和再生医学的细胞中安全快速地延伸端的需要。
然而，同时，存在端粒酶活性的连续激活的危险。事实上对于细胞疗法应用，避免细胞永生化的风险是最重要的。为此目的，瞬时而非组成型的端粒酶活性对于安全性可以是有利的，尤其当升高的端粒酶活性不仅是短暂的而且足够快速地延伸端粒以使治疗不需要连续重复时。目前延伸端粒的方法包括处于诱导型启动子之下的TERT的病毒递送、使用基于腺病毒和腺相关病毒的载体的TERT的递送以及端粒酶的小分子激活物。这些方法具有插入诱变、端粒酶活性的连续升高或这两种情况的风险。
因此，强烈期望开发这样的疗法，所述疗法安全地延伸端粒以潜在地预防、延迟、改善或治疗这些和其它病症和疾病，潜在地预防、延迟、改善或治疗伴随自然衰老的身体形式以及功能和心理功能的逐渐衰退，以及使得能够进行细胞疗法和再生医学。此类疗法在所有动力包括人、宠物、牲畜、动物园动物和濒危物种的动物的复壮中具有巨大作用。
发明概述
本发明通过提供另一选择来解决这些和其它问题，所述另一选择提供与快速端粒延伸组合的端粒酶活性的高度瞬时增强的益处，以使得治疗不必是连续的或甚至频繁的，并且无基因组插入诱变的风险。具体地，本发明提供用于通过在细胞中瞬时翻译外源端粒酶活性来延伸端粒的组合物、方法和试剂盒。
在一个方面，本发明提供用于延伸端粒的化合物，其包含：
包含至少一个经修饰的核苷和编码端粒酶逆转录酶的合成核糖核酸；
其中端粒在利用所述化合物处理的细胞内被延伸。
在一些实施方案中，所述端粒酶立逆转录酶是哺乳动物、禽类、爬行类动物或鱼的端粒酶逆转录酶或保留端粒酶的催化活性的变体，并且在具体的实施方案是人端粒酶逆转录酶。
在一些实施方案中，核酸包含5'帽、5'非翻译区、3'非翻译区和多聚腺苷酸尾。5'帽可以是非免疫原性的并且5'帽已用磷酸酶处理。
在优选实施方案中，所述多聚腺苷酸尾增强核糖核酸的稳定性。
在其它优选实施方案中，5'非翻译区或3'非翻译区包含来自稳定的mRNA或经高效翻译的mRNA的序列，或它们都包含来自稳定的mRNA或经高效翻译的mRNA的序列。
在其它优选实施方案中，5'帽、5'非翻译区或3'非翻译区使核糖核酸稳定，增加核糖核酸的翻译率或调节核糖核酸的免疫原性。
在高度优选实施方案中，所述至少一个经修饰的核苷调节核糖核酸的免疫原性。
在一些实施方案中，所述核糖核酸是纯化的合成核糖核酸。
在优选实施方案中，纯化所述合成核糖核酸以除去免疫原性组分。
在某些具体实施方案中，所述核糖核酸编码人、猫、狗、小鼠、马、牛、绵羊、猪、非洲象、鸡、大鼠、斑马鱼、日本青鳉或黑猩猩的端粒酶逆转录酶，或与所述端粒酶逆转录酶具有至少95％序列同一性的多肽。
在另一个方面，本发明提供包含本发明的化合物和端粒酶RNA组分的组合物，所述组分，在一些实施方案中，是哺乳动物、禽类、爬行类动物或鱼的端粒酶RNA组分。在更具体的实施方案中，所述端粒酶RNA组分是人端粒酶RNA组分。在一些实施方案中，本发明的化合物和组合物还包含递送媒介物。
在一些实施方案中，所述递送媒介物是外来体、脂质纳米颗粒、多聚体纳米颗粒、天然或人工脂蛋白颗粒、阳离子脂质、蛋白质、蛋白质-核酸复合物、脂质体、病毒体或聚合物。在具体的实施方案中，所述递送媒介物是阳离子脂质。
在优选实施方案中，所述递送媒介物是非免疫原性的。在其它优选实施方案中，所述递送媒介物具有部分免疫原性。具体地，在某些情况下，可能需要媒介物来保留一些免疫原性。
根据本发明的另一个方面，提供了延伸端粒的方法，其包括向动物细胞施用任何公开的化合物或组合物的步骤，其中至少一个端粒在细胞内被延伸。
在一些方法的实施方案中，细胞在所述施用步骤之前具有至少一个缩短的端粒。
在一些实施方案中，所述细胞来自或存在于受试者中，所述受试才患有年龄相关疾病、年龄相关病症或功能或外貌的年龄相关衰退或处于发生所述疾病、病症或衰退的风险中。
在一些实施方案中，所述细胞来自或存在于受试者中，所述受试者患有癌症、心脏病、中风、糖尿病、糖尿病性溃疡、阿尔茨海默病、骨质疏松症、体能或外貌上的衰退、身体创伤或长期生理压力、精神创伤或长期心理压力、降低的免疫功能、免疫衰老或黄斑变性或处于发生所述疾病的风险中。
在一些实施方案中，所述细胞是内胚层、中胚层或外胚层谱系的细胞或生殖细胞系或胚胎细胞。
在一些实施方案中，所述细胞是诱导性多能干细胞或用于产生诱导性多能干细胞的细胞。
在一些实施方案中，所述细胞是转分化细胞或用于产生转分化细胞的细胞。
在一些实施方案中，所述细胞是分离的细胞，并且施用步骤持续不超过48小时。在其它实施方案中，所述细胞是分离的细胞，并且施用步骤持续至少2小时。
在一些实施方案中，所述细胞是分离的细胞，并且进行施用步骤不超过4次。在其它实施方案中，所述细胞是分离的细胞，并且进行施用步骤至少2次。
在一些实施方案中，所述细胞是分离的细胞，并且所述方法还包括测量细胞中的端粒酶活性的步骤。在具体实施方案中，施用步骤增强细胞中的端粒酶活性，并且在甚至更具体的实施方案中，端粒酶活性被瞬时增强至少5％。在其它具体实施方案中，增强的端粒酶活性的半衰期不超过48小时。
在一些实施方案中，所述方法还包括测量细胞中的端粒长度的步骤。在具体实施方案中，平均端粒长度增加至少0.1kb。
在一些实施方案中，所述细胞是分离的细胞，并且所述方法还包括测量细胞的群体倍增能力的步骤。在具体实施方案中，所述群体倍增能力在一些情况下增加至少一个群体倍增。
在优选实施方案中，所述细胞来自或存在于受试者中，并且在甚至更优选实施方案中，所述细胞来自或存在于人受试者中。
在一些实施方案中，所述细胞是分离的细胞，并且在其它实施方案中，所述细胞不是分离的细胞。在一些实施方案中，所述施用步骤包括电穿孔。在一些实施方案中，所述至少一个端粒在细胞内被瞬时延伸。
根据本发明的另一个方面，提供了用于延伸动物细胞的端粒的试剂盒，所述试剂盒包含任何上述化合物和组合物以及使用化合物或组合物延伸端粒的说明书。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含包装材料。在一些具体的实施方案中，所述包装材料是气密性的。在一些具体的实施方案中，所述包装材料包含金属箔容器。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含干燥剂、培养基或RNA酶抑制剂。
在一些实施方案中，组合物是无菌的。在一些实施方案中，试剂盒包含本发明的化合物、使用所述组合物延伸端粒的说明书以及端粒酶RNA组分、递送媒介物或端粒酶RNA组分和递送媒介物。
在另一个方面，本发明提供治疗方法，包括向需要端粒延伸或可从端粒延伸受益的动物受试者施用本发明的化合物或组合物。在一些实施方案中，动物受试者患有因缩短的端端引起的疾病或病症或处于发生所述疾病或病症的风险中。
附图简述
图1.利用编码TERT但非无催化活性TERT(CITERT)的经修饰的核糖核酸(modRNA)转染MRC-5细胞瞬时地增强端粒酶活性，(a)用于这些研究的modRNA构建体和方法的示意图。modRNA构建体编码人TERT并且具有赋予稳定性的5'和3'UTR，诸如来自P-珠蛋白mRNA的5'和3'UTR。CITERT具有单碱基对突变，(b)TERT或CITERTmodRNA的转染导致在被处理的细胞而非未处理的对照中高于内源TERTRNA水平的升高的外源TERTmodRNA水平，(c)在用编码TERT或CITERT(分别为P<0.03或0.01)的modRNA转染后24小时，被抗-TERT抗体识别的蛋白质的水平在MRC-5细胞中显著高于未处理的或仅用媒介物处理的细胞中的所述水平，(d)利用编码TERT而非CITERT的modRNA的处理引起MRC-5细胞中的端粒酶活性的瞬时增强。
图2.外来体用作用于核糖核酸治疗剂的递送媒介物的用途。
图3.多种快速和瞬时端粒酶处理在细胞的端粒延伸中的用途的图示说明。
图4.利用TERTmodRNA的处理在MRC-5细胞中快速延伸端粒，(a)这些研究中使用的处理和测定方案。处理持续5小时，(b)TRFSouthern印迹的图像(插图)和其定量，其中将化学发光信号针对每单位端粒长度的探针数目的计数标准化，以及将每一个凝胶泳道中每一个像素行的平均强度相对端粒长度绘图(对于每一个处理，n＝3个生物重复)，(c)图4b中的端粒长度分布的平均值，显示利用TERTmodRNA处理的细胞中的端粒比未处理的或仅用媒介物处理的对照中的显著(P<0.014)更长，(d)长于任意阈值(4.2kb)的端粒的比例在利用TERTmodRNA处理的细胞中比在未处理的和仅用媒介物处理的对照中的更大，(e)比较端粒长度的定量原位杂交(Q-FISH)中使用的MRC-5成纤维细胞的中期扩散的代表性荧光显微照片，显示端粒探针(光亮的，点状的)和DNA(平滑着色(smoothshading))，(f)处理的和对照细胞中的端粒长度的Q-FISH测量的定量(对于每一个处理的两个生物学重复的每一个，n＝15个细胞)，显示了处理的细胞的快速端粒延伸。(注意，TRF测量端粒和亚端粒DNA的长度，而Q-FISH只测量端粒DNA，从而解释Q-FISH与TRF结果的差异)，(g)(i)关于从供应商接收后MRC-5细胞的累积群体倍增对比如使用Q-FISH测量的端粒长度的标准曲线，该曲线定量每细胞平均总端粒探针荧光，所述荧光与端粒长度成线性正比，(g)(ii)利用TERTmodRNA以48小时的间隔处理3次的MRC-5细胞的每细胞平均端粒长度的定量，如使用Q-FISH测量的。
图5.利用TERTmodRNA的短暂处理以剂量依赖性方式增强MRC-5细胞的复制能力，但不永生化所述细胞。(a)用TERTmodRNA处理1、2或3次，或在3次处理后于第1次处理后8周再处理一次的细胞的生长曲线。对照包含无处理，或仅用媒介物或或CITERT处理4次。(对于每一个处理，n＝3)，(b)用1:5摩尔比的TERTmodRNA和TERCRNA处理的细胞的生长曲线(n＝3)。(c)用TERTmodRNA处理1、2或3次以剂量依赖性方式赋予MRC-5细胞超过未处理细胞的复制能力的额外复制能力。由第2和第3次处理(在第1次处理后48小时递送的)赋予的增殖能力的递增增强不如由第1次处理赋予的增殖能力的增加大；然而，在前3次处理后数周进行的另外的第4次处理赋予与第1次处理一样多的额外增殖能力，这表明处理的时间安排对于最优化由处理赋予的增殖能力的量是重要的。以1:5的摩尔比用TERTmodRNA和TERCmodRNA一起处理3次赋予比用单独的TERTmodRNA处理3次更大的增殖能力。只用媒介物或CITERTmodRNA的处理未赋予额外的复制能力。(n＝3)。
图6.用编码核GFP(nGFP)的modRNA处理的MRC-5细胞的转染的高效率。(a)具有高于未处理细胞的平均值超过2个SD的荧光的细胞的百分比(n＝10000)。(b)平均荧光(n＝10000)。(c)用DAPI复染的转染的MRC-5细胞中的nGFP的荧光显微照片。
图7.端粒酶活性的剂量-反应。
图8.TERTmodRNA处理延迟MRC-5细胞的细胞肿胀，(a)早期代(左)中的MRC-5细胞的面积比晚期代(右)中的细胞小数倍，如PD2和PD53未处理的细胞的典型显微照片中显示的(如在血细胞计数器上看到的)。(b)早期(PD2)和中期(PD35)代MRC-5细胞几乎未展示肿胀，被确定为具有大于25微米的直径，如在血细胞计数器上目视测量的(其中一个小方块为50微米宽)，然而显著更大的分数的晚期代(PD53)细胞是肿胀的。相反地，已用TERTmodRNA处理的PD53细胞，但非用CITERTmodRNA处理的那些细胞(在PD40)几乎未显示肿胀。
图9.人真皮微血管内皮细胞(HMDEC)的生长曲线。
图10.TERTmodRNA处理对HMDEC的细胞数目的作用。CO：对照处理；hTERT-CI：无催化活性hTERT；hTERT-WT：野生型hTERT。
图11.TERTmodRNA处理对HMDEC的生长的作用。UT：未处理的；CO：对照处理；CI：无催化活性hTERT；WT：野生型hTERT。
图12.TERTmodRNA处理对HMDEC的衰老的作用。NT：未处理的；hTERT-CI：无催化活性hTERT；hTERT-WT：野生型hTERT。
图13.在经修饰的TERTmRNA递送后TERT蛋白和端粒酶活性的增强。(A)使用经修饰的核苷酸假尿苷和5-甲基胞苷合成的包含侧翼连接HBB的非翻译区(UTR)和151nt多聚腺苷酸尾的TERT的全长功能形式或TERT的无催化活性(CI)形式的编码序列的经修饰的mRNA的示意图。(B)转染后24小时通过流式细胞术测量的用0.8μg/ml经修饰的编码GFP的mRNA处理的成肌细胞(n＝2,000)的转染效率超过95％(另外的曲线图在图16A中)。(C)通过定量免疫印迹测量的总TERT蛋白水平(图框C，左；图17)。用1μg/ml的TERT或CITERTmRNA转染后24小时的TERT蛋白水平的定量(n＝3)。通过流式细胞术在单细胞水平上测量的响应不同剂量的mRNA的TERT蛋白的量(n＝10,000)(图框C，右)。*P<0.05，**P<0.01与未处理的细胞相比较的。误差条代表s.e.m。(D)用1μg/ml经修饰的TERTmRNA转染的成纤维细胞和成肌细胞中的端粒酶活性的检测，如使用端粒重复扩增法(TRAP)测量的。箭头表示PCR效率的内部对照。
图14.在经修饰的TERTmRNA(modRNA)递送后端粒长度和增殖能力的增加。(A)未处理的成纤维细胞的平均端粒长度在培养中随时间推移减少，如通过MMqPCR和通过SpectraCell测量的(相关系数0.97，P<0.001)。重复实验2次，每个实验使用4个技术重复。(B)用1μg/mlTERTmodRNA、CITERTmRNA或仅媒介物以48小时的间隔连续地转染1、2或3次的成纤维细胞中的平均端粒长度。重复实验2次，每一个实验使用4个技术重复。**P<0.01，***P<0.001，与仅用媒介物处理的细胞相比较的。(C)如(B)中处理的成肌细胞的平均端粒长度。重复实验2次，每一个实验使用4个技术重复。***P<0.001，与仅用媒介物处理的细胞相比较的。(D)(B)中处理的成纤维细胞的生长曲线，绿色箭头表示处理时间。重复生长曲线2次，以一式三份重复培养每一个群体。复制能力以剂量依赖性方式增强(右图框)。*P<0.05，**P<0.01，与仅用媒介物处理的细胞相比较的。(E)如(B)中处理的成肌细胞的增殖能力(绿色箭头)。重复生长曲线2次，以一式三份重复培养每一个群体。所有数据表示为平均值±s.e.m。
图15.在经修饰的TERTmRNA递送后衰老相关标志物的瞬时减少。(A)在以48小时的间隔连续进行经修饰的TERTmRNA转染3次后β-gal表达性成纤维细胞的定量(绿色箭头)。对照细胞(包括未处理的，仅用媒介物处理的和CITERTmRNA-处理的群体)，在PD53终止扩增，而TERTmodRNA-处理的群体在PD80终止扩增。每一个实验进行2次，对每样品>50个细胞进行手工评分。代表性图像显示在PD53(顶)和PD80(底)的β-gal-染色的TERTmodRNA-处理的成纤维细胞。比例尺长度为200微米。(B)如(A)中处理的成肌细胞的β-gal表达的定量。对照如(A)中的一样。对照和TERTmodRNA-处理的群体分别在PD8和PD11终止扩增。每一个实验进行2次，对每样品>50个细胞进行手工评分。代表性图像显示PD2(顶)的成肌细胞和PD11(底)的TERTmodRNA-处理的成肌细胞。(C)与用经修饰的TERTmRNA转染3次的成纤维细胞的复制性衰老相关的扩大的细胞的定量。群体平台是如(A)中的一样。对照是单独的媒介物和CITERTmRNA-处理的。每一个实验进行2次，对每样品>50个细胞进行手工评分。代表性图像显示PD2(顶)和PD53(底)的未处理的成纤维细胞。所有数据表示为平均值±s.e.m。比例尺长度为200微米。
图16.经修饰的mRNA至人成肌细胞内的高效率转染。(A,B)如在处理开始后24小时通过流式细胞术测量的用0.1-0.8μg/ml的编码GFP的经修饰的mRN转染的GFP荧光成肌细胞(n＝2000)的定量。(C)响应递增剂量的经修饰的GFPmRNA-处理的成肌细胞的平均荧光。(D)用1μg/ml的TERT或CITERTmodRNA转染后24小时成纤维细胞中的外源TERTmodRNA的定量，如使用RT-qPCR测量的。使用Pfaffl法，利用RPL37A和GAPDH作为参照基因计算TERT对CITERT的比率(n＝3)。(E)在用1μg/ml的TERT或CITERTmodRNA转染后24小时成纤维细胞中的内源TERTmodRNA的定量，如使用qPCR测量的，如(D)中一样计算的。所有数据表示为平均值±s.e.m。
图17.TERT在经修饰的mRNA递送后的TERT的表达。通过多路红外免疫印迹测量在利用1μg/mlTERTmodRNA的处理开始后24小时收获的成纤维细胞中的TERT蛋白表达。将总蛋白质的系列稀释物用于产生标准曲线来比较TERT蛋白与对照的相对量。此处使用的TERT抗体的特异性已被广泛地测试(Wu,2006)。
图18.TRAP凝胶显示在200V、25uF、1000Ohm的设置下，在具有10ul细胞悬浮液和TERTmodRNA的1mm样品池中，利用TERTmodRNA电穿孔的单核细胞中的增强的端粒酶活性。热处理的样品泳道含有所述方法的引物二聚体人工假象，如由梯型的第四梯级上的强带所指示的。
图19.在用编码GFP的modRNA电穿孔后发荧光的单核细胞的显微图像。
图20.GFPmodRNA至人白细胞(单核细胞)内的电穿孔导致高转染效率。
图21.来自TRAP测定的凝胶的图像显示利用递增剂量的TERTmodRNA电穿孔的成纤维细胞中的递增的端粒酶活性。
图22.荧光显微镜显示利用CD3/CD28激活的和利用GFPmodRNA电穿孔的CD8+T细胞表达GFP活性。黑点是CD3/CD28涂覆的珠粒。
图23.利用TERTmodRNA对人角质形成细胞的电穿孔导致端粒酶活性的表达。
图24.在体内递送至啮齿类动物后荧光素酶modRNA的表达。
发明详述
端粒是染色体末端上的DNA序列，其保护染色体的末端，但随着时间推移其缩短。关键短的端粒可引起细胞停止正确地运行或死亡。关键短的端粒还可导致染色体融合，这可转而导致癌症。即使在特定的诊断的疾病不存在的情况下，短的端粒牵涉精神和身体机能的逐渐下降以及衰老的出现。
然而，同时，端粒缩短可起着抗癌(例如在其中细胞获得使其比正常细胞更快增殖的突变的情况下)的保护作用。在该情况下，端粒缩短阻止细胞无限增殖和引起癌症。因此，连续延伸端粒不一定是有益的。
在哺乳动物中，端粒包含序列TTAGGG的串联重复，在其它动物诸如鸟类、爬行类动物和鱼中，所述重复序列变化。在所有这些类型的动物中，端粒是具有许多千碱基(kb)的双链。平均端粒长度在如表1中显示的物种间是不同的。
表1：不同物种的成体成纤维细胞的平均端粒长度
物种 平均端粒长度(kb)
牛 18
绵羊 18
猪 15
马 14
狗 15
熊猫 25
虎 50
家鼠 40
索诺拉鹿鼠 9
挪威大鼠 40
裸鼹鼠 16
欧洲白兔 50
黑尾杰克兔 25
蜘蛛猴 7
松鼠猴 9
恒河猴 16
猩猩 10
矮黑猩猩 10
人 9
印度象 15
非洲象 14
猫 11
在人中，端粒在出生关始于15-20kb的长度，并且在出生时具有12-15kb的长度。端粒在儿童期快速缩短，随后在成年期平均每年缩短约0-100bp，根据细胞类型、对心理或氧化应激的暴露以及其它因素而变化的速率。
端粒是端粒复合物的部分，其保护染色体的末端。端粒复合物还包含一组统称为端粒保护复合体(Shelterin)的蛋白质。端粒复合蛋白包括POT1、TPP1、ATM、DAT、TRF1、TRF2、Rap1、Rif1、TIN2、NBS、MRE17和RAD50以及不同哺乳动物物种中的其同源物。Podlevsky和Chen(2012)Mutat.Res.730:3-11。在许多物种中，端粒终止于单链3’悬突，所述3’悬突将其自身插入双链区域，与端粒复合蛋白结合，从而在端粒复合物内形成环。
端粒因氧化破坏和姊妹染色质交换以及还因末端复制问题(其中染色体的末端在有丝分裂过程中被不完全复制)而随时间推移而缩短。当端粒变成关键短时，端粒复合物不再能够保护染色体末端，并且染色体末端变成"脱帽的"。染色体末端的脱帽可导致染色体-染色体融合，这可转而导致癌症。O'Sullivan和Karlseder(2010)Nat.Rev.Mol.CellBiol.11:171-181；Calado等(2012)Leukemia26:700-707；Artandi和DePinhoCarcinogenesis31:9-18。脱帽还可导致染色体末端被识别为受损的DNA，从而激活DNA损伤应答和触发细胞凋亡或衰老。衰老是其中细胞保持存活但不再分裂的停滞状态，并且衰老细胞通常充分或完全停止进行它们的正常的衰老前的有用功能。因此端粒缩短导致组织功能障碍、身体能力和年轻外貌的丧失、心智能力的丧失以及部分归因于衰老细胞的积累和部分归因于细胞凋亡导致的细胞损失的疾病。事实上，具有短的端粒的老年人大致200-750％地更可能发生心肌梗塞(200％)(vonZglinicki等(2000)LaboratoryInvestigation；aJournalofTechnicalMethodsandPathology80:1739-1747)、血管性痴呆(200％)(Testa等(2011)DiabeticMedicine28:1388-1394)、糖尿病并发症(400％)(Blackburn等(2010)CancerPreventionResearch3:394-402)、癌症(Stem和Bryan(2008)CytogeneticandGenomeResearch122:243-254)、中风、阿尔茨海默病、感染(750％)、特发性肺纤维化和其它疾病。在一种组织中具体短的端粒的人可能在大多数它们的其它组织中也具有短的端粒，从而短的端粒与一个个体中的增加的发生许多疾病的风险相关。Takubo等(2010)GeriatrGerontolInt.10增刊1:S197-206；doi:10.1111/j.1447-0594.2010.00605.x。短的端粒还限制细胞复制能力，这反过来限制细胞疗法和再生疗法。相反地，使用基于病毒的基因工程方法在具有短的端粒的小鼠中增加端粒长度使所述小鼠在几个参数(包括皮肤厚度和弹性、肝功能和嗅觉)上变年轻。Jaskelioff(2011)Nature469:102-107。
由于端粒酶延伸端粒，延伸端粒的有用方法是升高细胞中的端粒酶活性水平。已报导了许多在细胞中增强端粒酶活性的试剂和条件，包括表2中所列的试剂和条件。
表2：增强端粒活性的试剂和条件的实例
然而，表2的治疗实例并非不具有不希望的作用。例如，利用生长因子、激素或细胞因子的治疗可能会引起副作用，可能激活多个信号通路，可能会导致不希望的细胞复制，可能触发免疫应答，并且通常是非特异性的。使用质粒或病毒的基因治疗具有通过插入诱变产生的基因组修饰的风险和癌症的风险。利用未经修饰的RNA进行的转染导致强免疫反应，并且未显示延伸端粒。物理治疗可破坏基因组DNA。已经发现利用来自植物的小分子的治疗只在一些受试者和细胞中仅延伸端粒，仅非常慢地延伸端粒，并且需要长期递送，因此具有患癌的风险。
编码hTERT和TERC的核酸序列在细胞中的表达以及这些组分本身的用途已被提出用于人疾病的诊断、预后和治疗(参见，例如，美国专利号5,583,016和6,166,178)，但以快速和瞬时，从而因上述原因而为潜在安全的方式进行的端粒延伸还未被证实。Saebe-Larssen等(2002)。J.Immunol.Methods259:191-203报导了用编码hTERT的mRNA对树突状细胞的转染，以及此类细胞获得端粒酶活性，但转染使用标准mRNA并且导致强的hTERT细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答而非端粒的延伸。
此外，所有现存的小分子治疗很大程度上是无效的并且是缓慢的(Harley等(2011)RejuvenationResearch14:45-56)，主要是因为它们通过端粒酶催化组分TERT起作用，所述TERT很大程度上受翻译后调控，从而限制现有治疗对小亚组的细胞的作用，并排除间期或G0期中的细胞，诸如许多干细胞和祖细胞。Cifuentes-Rojas和Shippen(2012)Mutat.Res.730:20-27；doi:10.1016/j.mrfmmm.2011.10.003；Cong等(2002)MicrobiologyandMolecularBiologyReviews66:407-425。该调控部分由端粒酶复合物、端粒复合物的组分与其它分子之间的相互作用介导。例如TERT在多个位点被多种激酶和磷酸酶磷酸化或脱磷酸化，并且在一些位点上，磷酸化导致增强的端粒酶活性(例如通过Akt的磷酸化)，然而在其它位点上，磷酸化降低端粒酶活性(例如，通过Src1或cAb1的磷酸化)。同样地，TERT在特定的位点被遍在蛋白化或去遍在蛋白化。TERT还在TERT上特定位点上与其它蛋白相互作用，并且这些相互作用可使TERT失活(例如与Pinx1或cAb1的相互作用)，或将TERT从染色体移走(例如，与CRM1和Pinx1的相互作)，阻止或减缓端粒延伸。此外，一些蛋白质结合于端粒或端粒复合物，从而阻断TERT(例如POT1)，阻止端粒延伸。此外，一些蛋白质间接地帮助端粒延伸，例如解螺旋酶和UPF1。归因于调控机制，端粒酶活性在细胞周期的S期达到高峰，从而快速分裂的细胞可倾向于从增强端粒酶活性的治疗更多地获益。然而，通常期望使细胞保持缓慢分裂或非分裂状态；例如，干细胞或祖细胞通常是缓慢分裂的，从而可将它们的大部分时间花在间期或或G0期。因此，现有治疗是缓慢的并且在通常在大多数细胞类型中以及在处于间期和G0期中的所有细胞类型中是无效的。缓慢的治疗不太安全，因为它们需要更长时间的治疗。由于端粒缩短提供了抗逃跑细胞增殖(run-awaycellproliferation)(诸如在癌症中)的保护性安全性机制，因此快速延伸端粒的治疗通常更安全，因为其可在短时间内被低频递送，从而允许正常端粒缩短完全性机制保持有效，持续大部分时间。因此，需要能够瞬时克服端粒酶调控以在短暂治疗过程中快速延伸端粒的方法。
TERT调控数百个基因，包括表3中所列的那些基因。
表3.被TERT调控的基因和途径的实例
在许多情况下，调节表3中的基因或途径是不期望的，因为这样做可引起不想要的细胞变化。例如，TERT激活表观遗传学调节剂，其可改变细胞表型或干扰用于治疗目的的重编程或转分化细胞。TERT激活生长增强子，但通常增殖是不期望的，例如通常地具有最大再生潜能的干细胞是分裂缓慢的那些干细胞。TERT调节细胞命运和分化的调节剂，这可削弱将细胞分化成特定细胞类型的努力。TERT还激活原癌基因，这可导致癌症。因此，期望使人为升高TERT水平(包括使用TERT延伸端粒的任何治疗)所经历的时间量减少至最少。因此需要仅通过瞬时地增强端粒酶活性来延伸端的治疗。
在一些细胞类型中，已显示TERT影响其它基因的表达(Young等(2003)J.Biol.Chem.278:19904-19908；Perrault等(2005)Biochem.Biophys.Res.Commun.335:925-936)，并且这在一些情况下可能是不期望的。因此，需要使升高TERT水平所经历的时间量减少至最少的治疗。
化合物
本发明通过在一个方面提供用于在细胞中瞬时表达外源端粒酶的新型化合物解决了这些问题。所述化合物包含含有至少一个经修饰的核苷并且编码端粒酶逆转录酶(TERT)的合成核糖核酸，其中端粒在用所述化合物处理的细胞中被延伸。
合成核糖核酸
用于根据本发明的不同方面的TERT的瞬时表达的核糖核酸包含编码TERT蛋白的核糖核酸。所述核糖核酸通常还包含影响核糖核酸在细胞中的表达和/或稳定性的序列例如，如图1a中显示的，所述核糖核酸可含有5'帽和在编码序列的5'和/或3'侧的非翻译区(UTR)。所述核糖核酸还可含有3'尾，诸如多聚腺苷酸尾。多聚腺苷酸尾可以例如增强核糖核酸的稳定性。在一些实施方案中，所述多聚腺苷酸尾为至少75个核苷酸、100个核苷酸、125个核苷酸、150个核苷酸或甚至更长。
在一些实施方案中，所述核糖核酸的5’帽是非免疫原性帽。在一些实施方案中，5’帽可增加核糖核酸的翻译。在一些实施方案中，可用磷酸酶处理5’帽以调节核糖核酸的先天免疫原性。在一些实施方案中，5’帽是防倒转帽类似物(“ARCA”)，诸如3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)GRNA帽结构类似物。
如在本领域中是公知的，上述特征或其它特征可增加由核糖核酸编码的TERT蛋白的翻译，可改善核糖核酸本身的稳定性，或可实现两者。在一些实施方案中，5′UTR和/或3′UTR来自具有非常稳定的mRNA和/或可被快速翻译的mRNA(例如α-珠蛋白或β-珠蛋白、c-fos或烟草蚀刻病毒)的基因。在一些实施方案中，5′UTR和3′UTR来自不同的基因，或来自除将向其中递送组合物的物种外的不同物种。UTR也可以是来自没基因的mRNA的UTR的部分的装配体，其中所述部分被选择来实现稳定性的某些组合和翻译的效率。
本发明的核糖核酸优选是核苷经修饰的RNA(″modRNA″)。真核细胞中的大多数成熟RNA分子含有为经典的未经修饰的RNA核苷腺嘌呤、胞苷、鸟苷和尿苷的经修饰的形式的核苷。那些修饰可防止RNA被识别为外来RNA。Karikó等(2005)Immunity23：165-175。使用某些核苷产生的合成RNA分子的免疫原性远低于未经修饰的RNA。免疫原性甚至可通过例如通过使用高效液相色谱(HPLC)纯化合成modRNA来进一步降低。经修饰的核苷可以例如选自表4中显示的核苷。在一些实施方案中，核苷是假尿苷、2-硫代尿苷或5-甲基胞苷。在某些情况下，可能期望经修饰的RNA保留一些免疫原性。
表4：在真核RNA中发现的经修饰的核苷
符号 通用名称
m1A 1-甲基腺苷
m6A N6-甲基腺苷
Am 2′-O-甲基腺苷
i6A N6-异戊烯腺苷
io6A N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷
ms2io6A 2-甲硫基-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷
g6A N6-苷氨酰氨甲酰基腺苷
t6A N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷
ms2t6A 2-甲硫基-N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷
Ar(p) 2′-O-核糖基腺苷(磷酸)
m6 2A N6，N6-二甲基腺苷
m6Am N6，2′-O-二甲基腺苷
m6 2Am N6，N6，2′-O-三甲基腺苷
m′Am 1，2′-O-二甲基腺苷
m3C 3-甲基胞苷
m5C 5-甲基胞苷
Cm 2′-O-甲基胞苷
ac4C N4-乙酰胞苷
f5C 5-甲酰胞苷
m4C N4-甲基胞苷
hm5C 5-羟甲基胞苷
f5Cm 5-甲酰基-2′-O-甲基胞嘧啶
M1G 1-甲基鸟苷
m2G N2-甲基鸟苷
m7G 7-甲基鸟苷
Gm 2′-O-甲基鸟苷
m2 2G N2，N2-二甲基鸟苷
Gr(p) 2′-O-核糖基鸟苷(磷酸)
yW 怀丁苷
o2yW 过氧怀丁苷
OHyW 羟基怀丁苷
OHyW* 修饰不足的羟基怀丁苷
imG 丫苷
m2，7G N2，7-二甲基鸟苷
m2，2，7G N2，N2，7-三甲基鸟苷
I 肌苷
m1I 1-甲基肌苷
Im 2′-O-甲基肌苷
Q Q苷
galQ 半乳糖苷-Q苷
manQ 甘露糖苷-Q苷
ψ 假尿苷
D 二氢尿苷
m5U 5-甲基尿苷
Um 2′-O-甲基尿苷
m5Um 5，2′-O-二甲基尿苷
m1ψ 1-甲基假尿苷
ψm 2′-O-甲基假尿苷
s2U 2-硫代尿苷
ho5U 5-羟基尿苷
chm5U 5-(羧基羟基甲基)尿苷
mchm5U 5-(羧基羟基甲基)尿苷甲酯
mcm5U 5-甲氧基羰基甲基尿苷
mcm5Um 5-甲氧基羰基甲基-2′-O-甲基尿苷
mcm5s2U 5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷
ncm5U 5-氨甲酰基甲基尿苷
ncm5Um 5-氨甲酰基甲基-2′-O-甲基尿苷
cmnm5U 5-羧基甲基氨基甲基尿苷
m3U 3-甲基尿苷
m1acp3ψ 1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷
cm5U 5-羧基甲基尿苷
m3Um 3，2′-O-二甲基尿苷
m5D 5-甲基二氢尿苷
τm5U 5-牛磺甲基尿苷
τm5s2U 5-牛磺甲基-2-硫代尿苷
不期望受理论束缚，经修饰的核苷的存在使得modRNA能够避免由各种受体(包括Toll样受体和RIG-1)介导的免疫应答的活化。非免疫原性modRNA一直在小鼠中被用作(经局部递送)治疗剂。Kormann等(2011)NatureBiotechnology29：154-157。核苷酸经修饰的mRNA的发现有利于RNA-编码的治疗性蛋白或其突变体至细胞的递送和那些蛋白在细胞中的表达。
因此，在一些实施方案中，本发明组合物的核糖核酸包含假尿苷、2-硫代尿苷、5-甲基胞苷或来自表4的核苷。在一些实施方案中，所述核糖核酸包含不止一种上述核苷或上述核苷的组合。在高度优选的实施方案中，所述核糖核酸包含假尿苷和5-甲基胞苷。
在一些实施方案中，针对modRNA的免疫应答可能是期望的，并且所述RNA被修饰来诱导最佳水平的先天性免疫。在其它实施方案中，针对modRNA的免疫应答可能是不期望的，并且所述RNA可被修饰来使此类反应降至最低。可针对任一情形修饰所述RNA。
本发明的核糖核酸优选地是合成核糖核酸。如本文中所用，术语"合成"意指在一些实施方案中在人的指导下使用分子生物学的工具制备核糖核酸，例如如下文中描述的。合成核糖核酸可以例如使用细胞提取物或纯化的酶和核酸模板，通过体外合成来制备。合成核糖核酸在一些实施方案中可通过化学合成(部分或完全地)来制备。或者，或此外，合成核糖核酸可在一些实施方案中通过在细胞中工程表达，随后破裂细胞和至少部分纯化核糖核酸来制备。然而，合成核糖核酸不是天然存在的核糖核酸，因为其在未经修饰的细胞中表达而未进行提取或纯化。
本发明的核糖核酸可使用多种标准技术来制备，如本领域普通技术人员可理解的。在一些实施方案中，核糖核酸可通过体外合成来制备，如例如在美国专利申请公开号2009/0286852和2011/0143397中描述的。在一些实施方案中，核糖核酸可通过化学合成来制备。在一些实施方案中，核糖核酸可通过体外合成和化学合成的组合来制备。如上文中描述的，术语"合成的"应当理解为包括通过化学合成，通过体外合成，通过体内表达和至少部分纯化，或通过此类或其它化学或分子生物学方法的组合制备的核糖核酸。
在一些实施方案中，可纯化本发明的核糖核酸。如上文中所指出的，纯化可降低核糖核酸的免疫原性，并且在一些情况下可以是有利的。也参见美国专利申请公开号2011/0143397。在优选实施方案中，核糖核酸通过HPLC或通过亲和捕获和洗脱来纯化。
TERT的蛋白质结构包括至少3个不同的结构域：含有保守结构域和非结构化的接头区域的氨基末端上的长的延伸部分(N末端延伸，NTE)；在一级序列中间催化逆转录酶结构域，其包括7个保守的RT基序；和在羧基末端上的短的延伸(C末端延伸，CTE)。Autexier和Lue(2006)AnnuRevBiochem.75:493-517。在一些实施方案中，本发明的核糖核酸编码全长TERT。在一些实施方案中，核糖核酸编码TERT的催化逆转录酶结构域。在一些实施方案中，核糖核酸编码具有TERT活性的多肽。
由本发明的核糖核酸编码的TERT优选是哺乳动物、禽类、爬行类动物或鱼的TERT。更优选地，TERT是哺乳动物TERT，诸如人TERT。Meyerson等(1997)Cell90:785-795；Nakamura等(1997)Science277:955-959；Wick等(1999)Gene232:97-106。两种人TERT同种型的氨基酸序列可作为NCBI参照序列：NP_937983.2和NP_001180305.1来获得。有用地由本发明组合物的核糖核酸编码的其它非限定性示例性氨基酸序列包括来自猫(NCBI参照序列：XP_003981636.1)、狗(NCBI参照序列：NP_001026800.1)、小鼠(NCBI参照序列：NP_033380.1)、牛(NCBI参照序列：NP_001039707.1)、绵羊NCBI参照序列：XP_004017220.1)、猪(NCBI参照序列：NP_001231229.1)、非洲象(NCBI参照序列：XP_003408191.1)、鸡(NCBI参照序列：NP_001026178.1)、大鼠(NCBI参照序列：NP_445875.1)、斑马鱼(NCBI参照序列：NP_001077335.1)、日本青鳉(NCBI参照序列：NP_001098286.1)和黑猩猩(NCBI参照序列：XP_003950543.1和XP_003950544.1)的TERT。
应当理解，本发明的核糖核酸可编码任何上文所列的氨基酸序列的变体，特别地保留端粒酶催化活性的变体，包括截断的变体。在一些实施方案中，本发明组合物的核糖核酸编码上文所列的氨基酸序列之一或与该序列具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本发明组合物的核酸编码上文所列的氨基酸序列之一或与该序列具有至少98％、99％、99.9％或甚至更高序列同一性的序列。
还应理解，本发明的核糖核酸可对应于编码上文所列的TERT蛋白的天然基因序列或可对应于因遗传密码的冗余性而可能产生的变体，如本领域普通技术人员可理解的。在一些实施方案中，可使用本领域普通技术人员已知的算法和方法来最优化密码子选择以最优化蛋白质表达。Fath等(2011)PLoSONE6:3。
组合物
在另一个方面，本发明提供用于在细胞中延伸端粒的组合物，所述组合物包含本发明的化合物(如上文中描述的)和其它组分。在一些实施方案中，所述组合物还包含端粒酶RNA组分(TERC)。(也参见下文中的表6)。在一些实施方案中，所述组合物还包含递送媒介物。
递送媒介物
正如所指出的，本公开内容的组合物还可包含用于核糖核酸的递送媒介物。所述递送媒介物可在一些情况下有利于所述组合物的核糖核酸至靶细胞的靶向和吸收。具体地，本公开内容的组合物可包含本领域中已知的任何基因递送媒介物，例如纳米颗粒、脂质体、基因枪弹道颗粒、病毒、阳离子脂质、商业产品，诸如RNAiMax或其它媒介物。在一些实施方案中，所述递送媒介物是外来体、脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、天然或人工脂蛋白颗粒、阳离子脂质、蛋白质、蛋白质-核酸复合物、脂质体、病毒体或聚合物。在一些优选实施方案中，所述递送媒介物是阳离子脂质制剂。然而，通常不进行病毒递送，因为其可导致插入诱变。
在一些优选实施方案中，所述递送媒介物是外来体、脂质纳米颗粒或聚合物纳米颗粒。在高度优选实施方案中，所述递送媒介物是外来体。外来体是直径为40-100nm的天然存在的脂双层小囊泡。外来体含有一组特别丰富的特殊蛋白质，包括膜蛋白Lamp-1和Lamp-2。Lakhal和Wood(2011)BioEssays:NewsandReviewsinMolecular,CellularandDevelopmentalBiology33:737-741.In2007，外来体经发现是RNA和蛋白质(包括超过1,300种mRNA和121种非编码microRNA)的天然载体。外来体还可在物种之间传递mRNA：人细胞对具有小鼠mRNA的小鼠外来体的暴露导致小鼠mRNA在人细胞中的翻译。
作为用于RNA、蛋白质或DNA的递送媒介物，外来体具有许多优于可选择的媒介物的有利方面。具体地，可从患者自已的细胞产生外来体，使它们成为非免疫原性的-它们因而不被抗体、补体、凝固因子或调理素攻击。此外，可通过电穿孔用核酸加载外来体，并且它们可以是人细胞之间的具有mRNA和蛋白质的媒介物。外来体在运输过程中保护它们的RNA和蛋白货物，并且所述货物被直接递送进胞质溶胶。它们可从血流外渗至血管外组织，甚至穿过血脑屏障，以及它们可被靶向。此外，外来体避免积累在未被靶向的器官诸如肝中。外来体从而可用作细胞来源的"脂质体"以在疾病的治疗中递送治疗性mRNA或其它货物。Mizrak等(2013)MolecularTherapy21:101-108；doi:10.1038/mt.2012.161。外来体将mRNA递送至细胞的图解说明示于图2中。也参见vandenBoorn等(2011)NatureBiotechnology29:325-326。
大多数细胞类型据信能够产生外来体，并且在大多数生物液体，包括血液、唾液、尿、脑脊髓液、奶和羊水中发现外来体。外来体由大多数细胞类型以不同丰度产生。缺乏T细胞激活物的丰富外来体可来源于未成熟的树突状细胞，其存在于人血液中。O’Doherty等(1994)Immunology82:487-493。外来体还可人工产生，例如通过将重组外来体蛋白与脂质和磷脂(诸如在外来体膜中发现的)组合来产生。或者，外来体可通过脂质体与一个亚组的外来体表面蛋白的体外自组装来构建。
外来体的药物递送潜能最早于2011年被证实。Alvarez-Erviti等(2011)NatureBiotechnology29:341-345。具体地，从经工程化以表达融合于来自狂犬病病毒糖蛋白(RVG)的28个氨基酸的靶向配体的Lamp2B融合物的树突状细胞收获外来体，随后将siRNA电穿孔进入外来体，将外来体注射进与他们从其获得树突状细胞的小鼠免疫相容的小鼠。外来体从而是自体的，并且不产生免疫应答，如通过IL-6、IP-10、TNF-α和IFN-α水平测量的。此外，重复给药一个月以上引发类似的应答，从而证明也不存在适应性免疫应答。
如上文中所述，外来体可以是自体的，从而具有低免疫原性。由于modRNA也具有低免疫原性，因此modRNA如核糖核酸与外来体如本公开内容的组合物中的递送媒介物的组合是特别优选的。在这些实施方案中，本公开内容从而提供使用外来体将mRNA或modRNA递送至细胞或组织的新方法。此类递送提供了通过静脉内或局部注射在体内使用于外来体中递送的RNA(特别地在编码TERT的RNA的递送中)来暂时升高细胞中的任何蛋白质的水平的有用方法。因此，在优选实施方案中，本发明组合物的递送媒介物是非免疫原性的。然而，在某些情况下，可能期望媒介物保留一些免疫原性。
另外的组分
本文中公开的组合物还可包含增强大组合物至靶细胞的递送，增强端粒在细胞内的延伸或这两者的另外的组分。例如，组合物还可包含表2的一种或多种化合物和条件。如本领域普通技术人员可理解的，活性成分的组合通常展示对所需活性诸如外源端粒酶活性在细胞中的瞬时表达的协同作用，并且此类组合被理解落在本发明的范围内。可包含在本公开内容的组合物中的蛋白质的其它实例列于表5中。应当理解，组合物可包括蛋白质本身，或编码这些蛋白质或保留所列蛋白质的活性的具有高序列同一性的蛋白质的核酸序列，优选地RNA或modRNA。
表5：有用地与TERT组合递送的蛋白质
可有用地包含在本公开内容的组合物中的试剂的其它实例列于表6中。
表6：有用地与TERT组合递送的其它试剂
由于TERT在细胞周期的某些时期中最活跃，因此本公开内容的组合物还可任选地包括细胞增殖的一种或多种瞬时激活物，以增强TERT治疗的功效。此类试剂可包括，例如，在细胞中瞬时减少细胞周期抑制剂诸如Rb或P19/Arf的量的RNAi试剂。细胞增殖的其它瞬时激活物可被有用地包含在本发明的组合物中，如本领域普通技术人员可理解的。
延伸端粒的方法和治疗方法
在另一个方面，本公开内容提供了延伸端粒的方法，其包括向具有缩短的端粒的细胞施用任何上述化合物或组合物的步骤，其中端粒在细胞内被延伸。本公开内容这提供治疗方法，其包括向需要端粒延伸或可从端粒延伸受益的动物受试者施用任何上述化合物或组合物的步骤。
在优选实施方案中，向细胞施用所述化合物或组合物，其中所述细胞是分离的细胞或为细胞培养物的部分，分离的组织培养物，分离的器官等(即，施用是体外的)。
在其它优选实施方案中，施用所述化合物或组合物而无需从受试者分离细胞、组织或器官(即，施用是体内施用)。在这些实施方案中的一些中，将所述化合物或组合物递送至受试者身体的所有或几乎所有细胞。在一些实施方案中，将所述化合物或组合物递送至受试者身体的特定细胞或组织中。
在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物、鸟类、鱼或爬行类动物。在优选实施方案中，所述受试者是哺乳动物，更具体地人。在其它优选实施方案中，所述受试者是宠物动物、动物园动物、牲畜或濒危物种动物。优选受试者物种的实例列于表7中。
表7：受试动物物种
狗(家犬)
绵羊(家养绵羊)
驯化猪(家猪)
驯化山羊(家山羊)
牛(原牛金牛)
瘤牛(Bos primigenius indicus)
猫(家猫)
鸡(泰和鸡)
豚鼠(天竺鼠)
驴(非洲野驴)
驯化鸭(家鸭)
水牛(亚洲水牛)
马(家马)
驯化蚕(家蚕)
家养鸽(家鸽)
家养鹅(欧洲家鹅)
美洲驼(大羊驼)
羊驼(小羊驼)
驯化珍珠鸡(普通珠鸡)
雪貂(蒙眼貂)
环颈斑鸠(家养环鸽)
巴厘牛(Bos javanicus domestica)
大额牛(大额牛(Bos frontalis))
驯化火鸡(普通火鸡)
金鱼(黄金鲫)
家兔(欧洲野兔)
家养金丝雀(Serinus canaria domestica)
水牛(Bubalus bubalis carabenesis)
暹罗斗鱼(泰国斗鱼)
锦鲤(黑龙江鲤)
驯养银狐(赤狐)
驯养刺猬(四趾刺猬)
群居织布鸟(十姊妹)
牦牛(野牦牛)
花式大鼠和实验室大鼠
驯养的单峰骆驼(单峰骆驼)
驯养的双峰驼(双峰骆驼)
孔雀鱼(孔雀鱼的某些品系)
花式鼠标
对于体外应用，可使用适当的技术来施用所述化合物或组合物，如细胞生物学、细胞培养、组织培养、器官培养等领域中的普通技术人员可理解的。对于体内应用，有用地通过注射、局部施用、吸入或任何其它合适的施用技术来施用所述化合物或组合物，如医学领域等普通技术人员可理解的。
如上所述，根据本公开内容的方法小心处理的细胞包括受试者中(对于体内施用)的或来自受试者(对于体外施用)的细胞，所述受试者可从端粒延伸受益。由于短的端粒在大多数动物中影响几乎所有细胞类型，因此端粒延伸对于大多数动物可以是有益的。瞬时和短暂的端粒延伸治疗具有安全性潜能，如上文中描述的。使用如本文中公开的瞬时治疗的端粒延伸从而可作为预防措施(例如以预防或延迟其中牵涉短的端粒的许多疾病和病症的发作)或作为那些疾病和病症的治疗措施用于所有或大多数个体。所述治疗可有益于处于发生年龄相关疾病或病症的风险中，或已患有此类疾病的受试者，并且还可有益于已经历，正在经历身体创伤或长期躯体应激诸如艰苦锻炼或体力劳动，或心理创伤或长期心理应激或处于经历所述创伤或应激的风险中的受试者，因为所有这些病症引起端粒缩短；躯体应邀或创伤需要细胞分裂以修复所造成的损害，从而缩短端粒，并且这些病症还可引起氧化应激，其也缩短端粒。此类疾病和病症包括，例如，代谢综合征、糖尿病、糖尿病性溃疡、心脏病、许多形式的癌症、血管性痴呆、阿尔茨海默症、中风、老年性黄斑变性、免疫衰老、骨髓衰竭、消化道溃疡、肝硬化、疝气、感染如继发于受损的免疫功能的肺炎、慢性感染、轻度或严重认知障碍、行动不便、骨质疏松症、骨关节炎、类风湿关节炎、年龄相关焦虑、平衡障碍、耳鸣、贝尔氏麻痹、白内障、COPD、角膜擦伤、冠状动脉疾病、外周动脉疾病、结膜炎、霰粒肿、脱水、抑郁症、肺气肿、各种眼疾、无法茁壮成长、流感、广泛性焦虑症、青光眼、听力损失、味觉减退、食欲不振、髋关节脱位、记忆力减退、帕金森氏病、椎管狭窄、尿失禁、脊椎骨折等等。
根据本方法小心处理的细胞还可包括患有年龄相关疾病或病症或处于患有此类疾病或病症的风险中的受试者中的或来自其的细胞。此类年龄相关疾病和病症可包括其中编码端粒酶复合物或端粒复合物的组分的基因被突变，从而导致短的端粒的遗传病。此类疾病包括，例如，特发性肺纤维化、先天性角化不良和再生障碍性贫血的形式。
在遗传疾病的情况下，组合物从而还可包括另外的核酸，诸如受此类疾病影响的基因的编码序列的正常的具有功能的形式，例如DKC1、TINF2、NOP10、NHP2、TERC或其它基因。此类基因的实例列于表8中。也参见Armanios(2009)Ann.Rev.GenomicsHum.Genet.10：45-61。
表8：与年龄相关疾病相关的基因
此外，所述治疗可有益于患有其中短的端粒可起作用的其它类型的遗传疾病诸如例如肌营养不良症或处于发生所述疾病的风险中的受试者。在此类疾病中，对解决由基因突变引起的问题的细胞复制的需要比正常情况更快速地缩短端粒，从而导致比正常情况更快速的端粒缩短，这反向来耗尽了细胞的复制能力，从而导致组织功能障碍、恶化或额外的症状、失能以及通常死亡。此外，不同类型的癌症可通过利用本发明的化合物的治疗来预防或延迟，并且事实上由关键短的端粒引起的染色体-染色体融合据信是癌症的原因。还可在个体的健康细胞中选择性延长端粒，而不在癌细胞中延长端粒，这可允许本发明的化合物、组合物和待使用的方法例如延长免疫系统的端粒，以增强其抵抗癌症的能力。此外，可从个体收获免疫系统的细胞以使用本发明进行离体处理，随后将其再引入所述个体。
在一些实施方案中，根据本方法处理的细胞来自受试者，其中所述受试者的疾病状态还未表现出来但其中所述受试者处于发生牵涉短的端粒的病症或疾病的风险中，或其中所述细胞含有缩短的端粒。在一些实施方案中，年龄相关疾病只是老年。本发明的治疗还可用作美容助剂(cosmeticaid)，来预防、延迟或改善皮肤、头发的外观、骨结构、姿势、眼清澈度或其它随变老而衰退的性状的年龄相关退化。例如，所述治疗可用于帮助维持皮肤弹性、厚度、光滑和外观，因为端粒延伸改善这些参数。在身体创伤诸如骨折或组织挤压或割伤或烧伤的情况下，本发明可用于增加参与愈合创伤的细胞中的端粒的长度，以增强它们的复制能力。在引起端粒缩短原长期躯体应激的情况下，利用本发明的治疗可延长受累细胞中的端粒，从而增强它们的复制能力和修复组织损伤的能力。由于端粒缩短代代积累(例如在具有端粒酶组分诸如hTR或hTERT的单倍剂量不足的人中)，Armanios(2009)Annu.Rev.GenomicsHum.Genet.10:45-61，因此本公开内容的治疗可用于生殖系细胞诸如卵子、精子或它们的前体，或用于受精卵或胚胎，例如在体外受精方法的过程中。所述治疗还可用于帮助不同疾病或病症的其它治疗，例如体内细胞的转分化。所述治疗法还可在手术或化疗或放射疗法之前或期间使用，以增强细胞复制的能力来修复由这些方法导致的损伤。
所述方法还可用于体外治疗细胞以用于各种应用，包括自体或异种细胞疗法、生物工程、组织工程、人造器官的生长、诱导性多能干细胞(iPSC)的产生和细胞分化、去分化或转分化。在这些应用中，细胞可被需要来分裂许多次，这可导致端粒长度的丢失，这可在所述应用之前、期间或之后通过本发明来抵消。
此外，不同类型的癌症可被认为是年龄相关疾病，特别地当癌细胞含有短的端粒时。在一些情况下，根据本方法处理的细胞来自其中疾病状态尚未表现但其中细胞含有缩短的端粒的受试者。在一些实施方案中，年龄相关疾病只是通常与人的老年年龄相关的改变的形式和功能。
被按照本发明方法小心地施予本公开内容的化合物或组合物的细胞包括来自任何组织或细胞类型，所述组合或细胞类型可遭受缩短的端粒的影响或可以以任何方式受益于细胞的端粒的延长。细胞可包括体细胞或生殖细胞，以及干细胞和它们的祖细胞和/或未分化的细胞。细胞可包括肿瘤细胞和非肿瘤细胞。
被按照本发明方法小心地施予化合物或组合物的细胞的实例包括主要来源于内胚层的细胞、主要来源于外胚层的细胞和主要来源于中胚层的细胞。主要来源于内胚层的细胞包括例如外分泌分泌上皮细胞和激素分泌细胞。主要来源于外胚层来源的细胞包括例如，皮肤系统(例如，角化上皮细胞和湿分层屏障上皮细胞)和神经系统(例如，感官传感器细胞、自主神经元细胞、感觉器官和外周神经元支撑细胞、中枢神经系统神经元和神经胶质细胞，以及晶状体细胞)的细胞。主要来源于中胚层的细胞包括，例如，代谢和储藏细胞、屏障功能细胞(例如，肺、肠、外分泌腺和泌尿生殖道的细胞)、细胞外基质的细胞、收缩性细胞、血液和免疫系统的细胞、生殖细胞、滋养细胞和间质细胞。因此，在本方法的一些实施方案中，被施予所述组合物的细胞是内胚层、中胚层或外胚层谱系的体细胞。在一些实施方案中，所述细胞是生殖细胞或胚胎细胞。
可被按照本发明方法施予化合物或组合物的细胞的具体实例包括，例如唾液腺粘液细胞、唾液腺浆液细胞、舌中的冯·埃布纳腺细胞、乳腺细胞、泪腺细胞、耳中的耵聍腺细胞、小汗腺汗腺暗细胞、小汗腺汗腺清除单元格、顶泌汗腺细胞、眼睑中的腺体莫尔细胞、皮脂腺细胞、鼻中的鲍曼腺细胞、十二指肠中布伦纳腺细胞、精囊细胞、前列腺细胞、尿道球腺细胞、前庭大腺细胞、尿道腺细胞(glandofLittrecell)、子宫内膜细胞、呼吸道和消化道的分离的杯状细胞腺、胃衬粘液细胞、胃腺产酶细胞、胃腺泌酸细胞、胰腺腺泡细胞、小肠的帕内特细胞、肺的Ⅱ型肺泡细胞、肺的克拉拉细胞、垂体前叶细胞(细胞例如、亲躯体细胞、垂体催乳素细胞、促甲状腺细胞、促性腺激素和促皮质激素细胞)、中间垂体细胞(例如、分泌促黑素细胞激素的那些细胞)、大细胞神经分泌细胞(例如、分泌催产素或加压素的那些细胞)、肠道和呼吸道细胞(例如，分泌血清素、内啡肽、生长抑素、胃泌素、促胰液素、缩胆囊素、胰岛素、胰高血糖素或蛙皮素的那些细胞)、甲状腺细胞(例如，甲状腺上皮细胞和滤泡旁细胞)、甲状旁腺细胞(例如，甲状旁腺主细胞和嗜酸性细胞)、肾上腺腺细胞(例如，嗜铬细胞和分泌甾体激素如盐皮质素类和糖皮质激素的细胞)、睾丸间质细胞、卵泡的卵泡膜内膜细胞、破裂卵泡的黄体细胞、颗粒黄体细胞、卵泡膜黄体细胞、肾小球旁细胞、肾的致密斑细胞、肾的极周细胞、肾的系膜细胞、表皮角质形成细胞、表皮基底细胞、手指甲和脚趾甲的角质形成细胞、甲床基底细胞、髓毛干细胞、皮质毛干细胞、表皮毛干细胞、表皮毛根鞘细胞、赫胥黎层的毛根鞘细胞、Henle层的毛根鞘细胞、外毛根鞘细胞、毛基质细胞、角膜、舌、口腔、食道、肛管、远端尿道和阴道的复层鳞状上皮的表面上皮细胞、角膜、舌、口腔、食道、肛管、远端尿道和阴道的上皮的基底细胞、尿道上皮细胞(例如、膀胱内衬和泌尿道)、柯蒂氏器的听觉内毛细胞、柯蒂氏器的听觉外毛细胞、嗅觉上皮的基底细胞、冷敏感初级感觉神经元、热敏感初级感觉神经元、表皮的默克尔细胞、嗅觉受体神经元、疼痛敏感初级感觉神经元、眼中视网膜的感光细胞(例如、感光体视杆细胞、光感受体蓝色敏感视锥细胞、光感受体绿色敏感锥细胞以及感光体红色敏感视锥细胞)、本体初级感觉神经元、触摸敏感初级感觉神经元、I型和II颈动脉体细胞、耳的前庭器官的I型和II毛细胞、I型味蕾细胞、胆碱能神经细胞、肾上腺素能神经细胞、肽能神经细胞、柯蒂氏器的内柱和外柱细胞、内、柯蒂氏器的内指和外指骨细胞、柯蒂氏器的边缘细胞、柯蒂氏器的汉森细胞、前庭器官的支持细胞、味蕾支持细胞、嗅上皮支持细胞、许旺细胞、卫星神经胶质细胞、肠神经胶质细胞、星形胶质细胞、神经元细胞、少突胶质细胞、纺锤体神经元、前晶状体上皮细胞、含晶状体蛋白晶状体纤维细胞、肝细胞、脂肪细胞(例如、白色脂肪细胞和棕色脂肪细胞)、肝脂肪细胞、肾壁细胞、肾小球足细胞、肾近曲小管刷状缘细胞、亨利袢细段细胞(loopofHenlethinsegmentcell)、肾远曲小管细胞、肾集合管细胞、I型肺泡细胞、胰管细胞、无横纹管细胞(例如，主细胞和闰细胞)、管细胞(精囊、前列腺等的)、肠刷状缘细胞(具有微绒毛)、外分泌腺纹状管细胞、胆囊上皮细胞、输精小管无纤毛细胞、附睾主细胞、附睾基底细胞、成釉细胞上皮细胞、耳的前庭器官的半月面上皮细胞、柯蒂氏器齿间上皮细胞、疏松结缔组织的成纤维细胞、角膜成纤维细胞(角膜基质细胞)、肌腱成纤维细胞、骨髓的网状组织成纤维细胞、其他非上皮成纤维细胞、周细胞、椎间盘的髓核细胞、成牙骨质细胞/牙骨质细胞、成牙质细胞/牙质细胞(odontocyte)、透明软骨软骨细胞、纤维软骨软骨细胞、弹性软骨软骨细胞、成骨细胞/骨细胞、骨祖细胞、眼的玻璃体的玻璃体细胞、耳的外淋巴空间的星状细胞、肝星状细胞(伊腾细胞)、胰腺星状细胞、骨骼肌细胞(例如，红色骨骼肌细胞(慢)和白骨骼肌细胞(快))、中间骨骼肌细胞、肌梭的核袋细胞、肌梭的核链细胞、卫星细胞、心脏肌肉细胞(例如，普通心肌细胞、淋巴结心肌细胞和Purkinje纤维细胞、平滑肌细胞(各种类型)、虹膜的肌上皮细胞、外分泌腺的肌上皮细胞、红细胞、巨核细胞、单核细胞、结缔组织巨噬细胞(各种类型)、表皮朗格汉斯细胞、破骨细胞、树突状细胞、小神经胶质细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞粒、杂交瘤细胞、肥大细胞、辅助T细胞、抑制性T细胞、细胞毒性T细胞、天然杀伤T细胞、B细胞、天然杀伤细胞、网织红细胞、血液和免疫系统的干细胞和定向祖细胞(各种类型)、卵原细胞/卵母细胞、精细胞、精母细胞、精原细胞、精子、滋养细胞、卵泡细胞、支持细胞、胸腺上皮细胞和间质肾细胞。
在优选实施方案中，被按照本发明方法施予化合物或组合物的细胞是干细胞或祖细胞，因为这些细胞产生身体的其它细胞。在另一个优选实施方案中，被处理的细胞是其中端粒比在其它细胞类型中更快速地缩短的细胞，诸如内皮细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、免疫系统的细胞(包括甲状腺细胞和甲状旁腺细胞及其祖细胞)、肠、肝的细胞、粘膜细胞(例如在食道和结肠中)以及齿龈和牙髓的细胞。
因此，在一些实施方案中，所述细胞是成纤维细胞、角质形成细胞、内皮细胞、上皮细胞或血细胞。
取决于所需端粒延伸的量，可进行施用步骤1次或多次。在本发明方法的一些实施方案中，所述细胞是分离的细胞，并且施用步骤持续不超过96小时，不超过72小时，不超过48小时，不超过36小时，不超过24小时，不超过18小时，不超过12小时，不超过8小时，不超过4小时或甚至更短的时间。在一些实施方案中，施用步骤持续至少2小时、至少4小时、至少8小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少36小时、至少48小时或甚至更长时间。在优选实施方案中，施用步骤持续不超过48小时，不超过96小时或不超过1周。在其它优选实施方案中，施用步骤持续至少2小时。应当理解，在其中通过转染进行施用的情况下，用于施用的时间包括用于细胞从转染法恢复的时间。
在本发明方法的一些实施方案中，所述细胞是分离的细胞，并且进行施用步骤不超过6次、不超过5次、不超过4次、不超过3次、不超过2次或甚至不超过1次。在一些实施方案中，进行施用步骤不少于2次、不少于3次、不少于4次、不少于5次、不少于6次或甚至更频繁。
在一些实施方案中，在相对短暂的时期进行施用步骤一次或数次，以再延伸端粒，随后长时间不进行端粒延伸，直至端粒需要再进行延伸。可无限重复该循环。此类治疗方案允许端粒被周期性再延伸，在施用步骤之间的间隔伴随端粒缩短。周期治疗法可根据需要通过体内施用或通过体外施用来进行。在一些实施方案中，进行这样的系列中的施用步骤不超过6次、不超过5次、不超过4次、不超过3次、不超过2次或甚至不超过1次。在一些实施方案中，进行施用步骤不少于2次、不少于3次、不少于4次、不少于5次、不少于6次或甚至更频繁。通过改变进行施用步骤的次数和我们的使用的本发明的组合物的化合物的剂量，可控制获得的端粒延伸的量。
在一些实施方案中，本公开内容的方法还包括在特定基质，优选弹性基质上培养细胞的步骤。已知此类基质防止通常会在其它基质上发生的细胞的不想要的变化(因那些基质的非生理弹性而导致的)。参见PCT国际公开号WO2012/009682，其通过引用整体并入本文。弹性基质可额外地促进细胞存活。
本公开内容的化合物或组合物的施用导致细胞中端粒酶活性的瞬时表达。增强的活性通过各种测定，诸如，例如RT端粒酶检测试剂盒(Millipore)来容易地测量，所述试剂盒提供使用端粒酶活性的荧光检测和定量的灵敏的实时体外测定，尽管其它测量技术也是可能的。在一些实施方案中，端粒酶活性增强至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少50％或甚至更多。在优选实施方案中，端粒酶活性增强至少5％。
如先前指出的，本发明技术的有利方面之一是端粒酶活性的表达在被处理的细胞中是瞬时的。具体地，此类瞬时表达与先前的技术相反，在所述先前的技术中，端粒酶逆转录酶基因被插入细胞的基因组序列或另外地永久性改变靶细胞的遗传组成，并导致核酸序列的组成型活性。
图3图解地举例说明本文中公开的化合物、组合物和方法的一些有利方面。具体地，利用这些化合物、组合物和方法可能产生的端粒延伸的速度使得端粒能够通过频率极低的TERTmodRNA递送来维持。表达的端粒酶活性在被周转之前在短暂的时期内快速延伸端粒，从而允许端粒缩短的保护性抗癌机制在大多数时间起作用。在处理之间，正常端粒酶活性和端粒缩短存在，从而防止不受控的增殖的端粒缩短的抗癌安全性机制保持原状，然而短的端粒相关疾病的风险保持很低。相反地，用于延伸端粒的最好的现有小分子治疗需要长期递送，从而存在长期癌症风险，因而甚至对端粒长度具有小的不一致的作用，在约一半的患者根本不存在对端粒长度的可检测作用。
因此，在本发明方法的一些实施方案中，端粒酶逆转录酶活性的表达，即端粒酶活性的半衰期，持续不超过48小时、不超过36小时、不超过24小时、不超过18小时、不超过12小时、不超过8小时、不超过4小时或甚至更短的时间。在一些实施方案中，端粒酶逆转录酶活性的表达持续至少2小时、至少4小时、至少8小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少36小时、至少48小时或甚至更长时间。在优选实施方案中，端粒酶逆转录酶活性的表达持续不超过48小时。在其它优选实施方案中，端粒酶逆转录酶活性的表达持续至少2小时。
在本发明方法的一些实施方案中，瞬时表达不依赖于细胞周期。
如上文中指出的，端粒酶逆转录酶的瞬时表达导致被处理的细胞中的缩短的端粒的延伸。滴粒长度可使用技术诸如末端限制性片段(TRF)长度分析、qPCR、MMqPCR和Q-FISH来容易地测量，如本领域普通技术人员可理解的。参见，例如，Kimura等(2010)NatProtoc.5:1596-607；doi；10.1038/nprot.2010.124。在一些实施方案中，本发明方法使被处理的细胞中的端粒长度延长至少0.1kb、至少0.2kb、至少0.3kb、至少0.4kb、至少0.5kb、至少1kb、至少2kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb或甚至更长。
本发明的化合物、组合物和方法的有利方面之一是通过这些技术实现的端粒延伸的快速。所述技术允许处理是短暂的，从而是安全的，因为正常的保护性端粒缩短机制在大多数时间保持完整。利用本文中公开的化合物和组合物的处理导致每细胞数十或数百拷贝的TERTmodRNA的递送(如通过绝对RT-qPCR测量)，这显著多于甚至在具有高端粒酶活性的细胞中发现的内源TERTmRNA的平均拷贝数。通常地，此类细胞具有每细胞少于一个拷贝的TERTmRNA(Yi等(2001)Nucl.AcidsRes.29:4818-4825)。因此，处理向细胞瞬时地引入大量拷贝的编码TERT的modRNA，从而导致快速端粒延伸。不希望受理论束缚，大量拷贝的编码TERT的modRNA可瞬时地间压制通常阻止TERT和端粒延伸的其它方示与本文中公开的化合物、组合物和方法一样快地延伸端粒的抑制性调控机制。
端粒酶逆转录酶的瞬时表达还导致被处理的细胞的增强的复制能力。可通过测量此类细胞的额外群体倍增来容易地监测接近复制衰老的细胞的增强的复制能力。通过在培养中传代或利用血清处理不能刺激衰老细胞分裂。衰老细胞的其它常见特征在于pH依赖性β-半乳糖苷酶活性的表达、细胞周期抑制剂p53和p19的表达以及其它改变的基因表达模式和扩大的细胞尺寸。在不用本公开内容的化合物和组合物处理的情况下，人肺成纤维细胞通常加倍50-60次。然而，在进行一组总共持续仅数天的1至3个处理的情况下，这些细胞获得了额外的16-28次群体倍增。如果数周后再次处理，则再次被赋予额外的增殖能力。该周期性再延伸端粒的间歇性处理方法可被应用额外次数，处理之间的间隔取决于因素诸如端粒缩短的速率、细胞分裂的速率和通过处理提供的端粒延伸的量。同样地，来自年老个体的人真皮微血管内皮细胞，在不用本发明组合物的处理的情况下，可仅获得1-2次群体倍增，然而被处理的细胞可获得3、4或甚至更多次群体倍增。
因此，在一些实施方案中，本发明的治疗方法使群体倍增的次数增加至少1、2、4或甚至更多次群体倍增。在一些实施方案中，所述治疗方法使群体倍增的次数增加至少5次、10次、15次、20次或甚至更多次群体倍增。
在本发明方法的实施方案的一些实施方案中，通过电穿孔向动物施用本发明的化合物或组合物。在具体实施方案中，在递送媒介物不存在的情况下通过电穿孔向动物细胞施用本发明的化合物。在其它具体实施方案中，通过电穿孔向动物细胞施用本发明的化合物和端粒酶RNA组分。
试剂盒
在另一个方面，本公开内容提供了用于在哺乳动物细胞中延伸端粒的即用型试剂盒。所述试剂盒包含任何上述化合物或组合物以及它们的使用说明书。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含包装材料。在优选实施方案中，所述包装材料是气密性的。在这些实施方案中，所述包装材料可任选地被充满惰性气体，诸如例如，氮气、氩气等。在一些实施方案中，所述包装材料包含金属箔容器，诸如，例如密封铝袋等。此类包装材料对于本领域普通技术人员来说是公知的。
在一些实施方案中，试剂盒还可包含干燥剂、培养基、RNA酶抑制剂或其它此类组分。在一些实施方案中，试剂盒还可包含不止一种的此类另外的组分的组合。在一些试剂盒实施方案中，试剂盒的组合物是无菌的。
其它方面
在另一个方面，本发明提供了根据下列编号的段落的新型化合物、组合物、试剂盒和方法：
1.一种用于端粒延伸的组合物，其包含：
含有至少一个经修饰的核苷并且编码端粒酶逆转录酶的核糖核酸；和
用于核糖核酸的递送媒介物；其中端粒在用所述组合物处理的细胞内被延伸。
2.段落1的组合物，其中所述端粒酶逆转录酶是哺乳动物、禽类、爬行类动物或鱼的端粒酶逆转录酶或保留端粒酶催化活性的变体。
3.段落2的组合物，其中所述端粒酶逆转录酶是人端粒酶逆转录酶。
4.段落1的组合物，其中所述核糖核酸包含5'帽、5'非翻译区、3'非翻译区和多聚腺苷酸尾。
5.段落4的组合物，其中所述多聚腺苷酸尾增强所述核糖核酸的稳定性。
6.段落4的组合物，其中所述5'非翻译区或3'非翻译区包含来自稳定的mRNA或经高效翻译的mRNA的序列。
7.段落4的组合物，其中所述5'非翻译区和3'非翻译区都包含来自稳定的mRNA或经高效翻译的mRNA的序列。
8.段落4的组合物，其中所述5'帽、5'非翻译区或3'非翻译区使所述核糖核酸稳定，增加核糖核酸的翻译速率，或减小所述核糖核酸的免疫原性。
9.段落1的组合物，其中所述至少一个经修饰的核苷残基减小所述核糖核酸的免疫原性。
10.段落1的组合物，其中所述核糖核酸是合成核糖核酸。
11.段落10的组合物，其中所述合成核糖核酸是纯化的合成核糖核酸。
12.段落11的组合物，其中所述合成核糖核酸经纯化除去免疫原性组分。
13.段落1的组合物，其中所述核糖核酸编码人、猫、狗、小鼠、马、牛、绵羊、猪、非洲象、鸡、大鼠、斑马鱼、日本青鳉或黑猩猩的端粒酶逆转录酶，或与所述端粒酶逆转录酶具有至少95％序列同一性的多肽。
14.段落1的组合物，其中所述组合物还包含端粒酶RNA组分。
15.段落14的组合物，其中所述端粒酶RNA组分是哺乳动物、禽类、爬行类动物或鱼的端粒酶RNA组分。
16.段落15的组合物，其中所述端粒酶RNA组分是人端粒酶RNA组分。
17.段落1的组合物，其中所述递送媒介物是外来体、脂质纳米颗粒、多聚体纳米颗粒、天然或人工脂蛋白颗粒、阳离子脂质、蛋白质、蛋白质-核酸复合物、脂质体、病毒体或聚合物。
18.段落17的组合物，其中所述递送媒介物是阳离子脂质。
19.段落1的组合物，其中所述递送媒介物是非免疫原性的。
20.一种延伸端粒的方法，其包括以下步骤：
向动物细胞施用段落1至19中任一项所述的组合物，其中至少一个端粒在细胞内被延伸。
21.段落20的方法，其中所述细胞在所述施用步骤之前具有至少一个缩短的端粒。
22.段落20的方法，其中所述细胞来自患有年龄相关疾病、年龄相关病症或功能或外貌的年龄相关衰退或处于发生所述疾病或病症的风险中的受试者。
23.段落20的方法，其中所述细胞来自受试者，所述受试者患有癌症、心脏病、中风、糖尿病、阿尔茨海默病、骨质疏松症、体能或外貌上的衰退、身体创伤或长期生理压力、或精神创伤或长期心理压力或处于发生所述疾病的风险中。
24.段落20的方法，其中所述细胞是内胚层、中胚层或外胚层谱系的体细胞或生殖系或胚胎细胞。
25.段落20的方法，其中所述细胞是诱导性多能干细胞或用于产生诱导性多能干细胞的细胞。
26.段落20的方法，其中所述细胞是转分化细胞或用于产生转分化细胞的细胞。
27.段落20的方法，其中所述细胞是分离的细胞，并且进行所述施用步骤不超过48小时。
28.段落20的方法，其中所述细胞是分离的细胞，并且进行所述施用步骤不超过4次。
29.段落20的方法，其中所述细胞是分离的细胞，并且所述方法还包括测量细胞的端粒酶活性的步骤。
30.段落29的方法，其中所述施用步骤增强细胞的端粒酶活性。
31.段落30的方法，其中所述端粒酶活性被瞬时增强至少5％。
32.段落30的方法，其中增强的端粒酶活性的半衰期持续不超过48小时。
33.段落20的方法，其中所述细胞是分离的细胞，并且所述方法还包括测量细胞的平均端粒长度的步骤。
34.段落33的方法，其中平均端粒长度增加至少0.1kb。
35.段落20的方法，其中所述细胞是分离的细胞，并且所述方法还包括测量细胞的群体倍增能力的步骤。
36.段落35的方法，其中所述群体倍增能力增强至少25％。
37.段落20的方法，其中所述细胞来自哺乳动物受试者。
38.段落37的方法，其中所述细胞来自人受试者。
39.段落20的方法，其中所述细胞来自是分离的细胞。
40.段落20的方法，其中所述细胞来自不是分离的细胞。
41.一种用于在动物细胞中延伸端粒的试剂盒，其包含：
段落1至19中任一项所述的组合物；和使用所述组合物延伸端粒的说明书。
42.段落41的试剂盒，其还包含包装材料。
43.段落42的试剂盒，其中所述包装材料是气密性的。
44.段落42的试剂盒，其中所述包装材料包含金属箔容器。
45.段落41的试剂盒，其还包含干燥剂。
46.段落41的试剂盒，其还包含培养基。
47.段落41的试剂盒，其还包含RNA酶抑制剂。
48.段落41的试剂盒，其中所述组合物是无菌的。
对于相关领域的普通技术人员来说很显然的是，对本文中描述的化合物、组合物、方法和试剂盒的其它适当的修饰和改造可在不背离本发明的范围或其任何实施方案的情况下产生。在现已详细描述本发明后，通过参考下列实施例更清楚地理解本发有，所述实施例仅出于举例说明的目的包括在其中并且无意限定本发明。
实施例
实施例1.使用经修饰的编码端粒酶的mRNA进行的人细胞的 高效端粒延伸
端粒长度维持不足的疾病和对用于细胞疗法和生物工程应用的增强的细胞增殖能力的需要激发用于端粒延伸的安全方法的开发。Blackburn等(2010)CancerPrevRes(Phila)3:394-402；Calado等(2012)Leukemia26:700-707；Alter等(2009)Blood113:6549-6557；Mohsin等(2012)JournaloftheAmericanCollegeofCardiologydoi:10.1016/j.jacc.2012.04.047。瞬时增加用于治疗应用的由mRNA编码的蛋白质的量的mRNA递送通过掺入减少免疫源性和增强稳定性的经修饰的核苷来促进。Karikó等(2005)Immunity23:165-175；Karikó等(2011)NucleicAcidsRes.39:e142；doi:10.1093/nar/gkr695。
为了成为治疗上有用的，端粒延伸治疗法应当理想地是非免疫原性的；特异性的；能够在端粒缩短至引起染色体的不稳定性和增加的患癌风险的关键短的长度之前被启动(Wentzensen等(2011)CancerEpidemiol.BiomarkersPrev.20:1238-1250；Calado等(2012)Leukemia26:700-707；Artandi和DePinho(2010)Carcinogenesis31:9-18)；瞬时和间断性的，以允许正常抗癌端粒缩短机制几乎连续地起作用；甚至在缓慢分裂的细胞诸如一些祖细胞和干细胞群体中是有效的；可使用非免疫原性媒介物体外和体内递送的；和有限的，仅使足够的额外细胞分裂以潜在地改善或预防端粒维持不足的疾病，或使得用于细胞疗法或生物工程应用的细胞充分扩增。现有治疗，包括使用小分子的治疗，不满足所有这些标准。Harley等(2011)RejuvenationRes.14:45-56。TERT的病毒递送(虽然可能地是可诱导的)具有插入诱变的风险，从而存在严重的安全性担忧。牵涉连续端粒酶过表达的治疗是潜在不安全的，因为在具有致癌突变的细胞中，归因于关键短的端粒和所造成的染色体不稳定性(O'Sullivan和Karlseder(2010)Nat.Rev.Mol.CellBiol.11:171-181)或另一个原因：组成型端粒酶表达(归因于第二突变或药物)，可通过使得能够无限增殖来支持恶性肿瘤。Artandi和DePinho(2010)Carcinogenesis31:9-18；Ding等(2012)Cell148:896-907。
由最近的发现促进的基于RNA的方法满足安全端粒延伸的标准，所述发现是：在RNA中发现的某些天然存在的核苷，当外源RNA被递送至细胞时，增强外源RNA的稳定性和减小其免疫原性。Karikó等(2005)Immunity23:165-175。此类核苷的实例列于表4中。不希望受理论束缚，典型核苷的这些经修饰形式可允许先天性免疫系统的Toll样受体区分外源modRNA与不含这些核苷酸的外来RNA。含有这些非经典核苷的充分纯化的合成modRNA至细胞的递送导致modRNA的增强的稳定性和由modRNA编码的具有减小的或消除的免疫应答的蛋白质的瞬时升高。Karikó等(2011)NucleicAcidsRes.39:el42；doi:10.1093/nar/gkr695。因此，外源modRNA的递送为需要瞬时蛋白产生的应用提供了前所未有的机会。例如，仿生modRNA已被转移进成纤维细胞中，从而将它们重编程成多能干细胞。Yakubov等(2010)Biochem.Biophys.Res.Commun.394:189-193。仿生modRNA还已被注射进小鼠中以拯救肺表面活性蛋白缺乏的模型以及升高红细胞生成素和血细胞比容水平。Kormann等(2011)Nat.Biotechnol.29:154-157。如上所述，用于本文中使用的modRNA的核苷不仅被选择用来增强稳定性而且还减小或消除免疫原性，以及增加RNA的翻译效率。使用未经修饰的编码hTERT的mRNA转染树突状细胞，虽然导致细胞内端粒酶活性的增强，但也引发了强hTERT-特异性细胞毒性T淋巴细胞应答。Saeboe-Larssen等(2002)JournalofImmunologicalMethods259：191-203。使用经修饰的RNA的方法因而在于细胞中延伸端粒上不可能是有效的。
因此，编码TERT的modRNA至细胞的递送可用于使TERT蛋白和端粒酶活性的水平瞬时升高，足以延伸端粒和有限量地增强复制能力。升高的端粒酶活性的水平足够快地产生以使得能够产生短暂且低频的端粒延伸治疗(参见图1a和图3)。
为了证明该方法，使用赋予稳定性、高效翻译和减小的或消除的免疫原性的经典核苷与非经典核苷的比率合成TERTmodRNA。Yakubov等(2010)Biochem.Biophys.Res.Commun.394:189-193；Karikó等(2011)NucleicAcidsRes.39:e142；doi:10.1093/nar/gkr695。合成modRNA含有β珠蛋白mRNA的5'和3'UTR，其具有相对长的半衰期。为了进一步增强稳定性，modRNA具有长的151个核苷酸多聚腺苷酸尾。为了使用于体外转录反应以产生RNA的长TERTDNA模板的保真度最大化，使用基于质粒而非PCR的方法产生DNA模板。
为了区分真实端粒延伸与来自异源起始群体的具有长端粒的细胞的选择，合成编码具有单个残基突变D712A的TERT的无催化活性的形式(CITERT)的对照modRNA，其中逆转录酶结构域的催化部位上的金属络合型天冬酰胺的三联体中的一个被丙氨酸取代，从而消除了CITERT的催化活性，但使其结构保持完整至能够结合模板DNA的程度，并且与网织红细胞裂解物中的TERT一样稳定。Wyatt(2009)"Structure-FunctionAnalysisoftheHumanTelomeraseReverseTranscriptase"UniversityofCalgary,Ph.D.Thesis(http://dspace.ucalgary.ca/bitstream/1880/47511/1/2009_Wyatt_PhD.pdf)。
MRC-5人胎儿肺成纤维细胞在本实施例中被选择作为测试细胞，因为这些和其它人成纤维细胞品系数十年来一直在端粒领域中用作驮马，从而存在丰富的数据来提供实验设计和分析的信息。MRC-5细胞还具有相对低的外源端粒酶活性，并且展示端粒缩短和最终的衰老。由于氧化应激增加MRC-5细胞的端粒缩短速率(vonZglinicki等(2000)FreeRadic.Biol.Med.28:64-74)，并引起TERT定位于其中其不能延伸端粒的细胞质(Ahmed等(2008)。J.Cell.Sci.121:1046-1053)，因此将细胞培养在5％而非环境氧中。为了进一步增加成功的可能性，还将细胞培养基针对MRC-5细胞中的蛋白质产生最优化的培养基中(Wu等(2005)Cytotechnology49:95-107)。
基于modRNA的端粒延伸的效率受若干因素控制，包括转染、翻译的效率和至功能性端粒酶的折叠，以及至少瞬时逃避在许多细胞类型包括MRC-5细胞中抑制TERT和端粒酶的众多翻译后调控机制的能力。虽然在MRC-5细胞中利用更小的modRNA种类诸如nGFP(0.8kb)的转染效率通常高于90％(即使利用低浓度的modRNA)(图6)，但TERT的开放阅读框架相对较大(3399bp)，并且modRNATERT构建体包括UTR和多聚腺苷酸尾，从而使构建甚至更大(3751bp)。如图1b中显示的，TERT和CITERT都通过阳离子脂质被高效地转染进MRC-5细胞(如通过在处理结束时收获的来自用1ug/mlTERTmodRNA处理5小时的MRC-5细胞的mRNA的RT-PCR测量的)。此外，TERT或CITERTmodRNA的递送导致被抗-TERT抗体识别的蛋白质的量的等同和显著(分别为P<0.03和<0.01)的增加，所述蛋白质具有约122kDa的大小，与估计的127kDa的TERT的大小接近(图1c)。Wick等(1999)Gene232:97-106。通过定量红外荧光免疫印迹测量蛋白质水平。TERT蛋白水平在用TERT处理的细胞佤用CITERT处理的细胞之间没有显著差异(n＝3)。
为了形成功能性端粒酶，TERT必须正确折叠并与至少TERC形成复合物。端粒酶也严格受翻译后调控，包括通过细胞质定位和抑制性磷酸化。Cifuentes-Rojas和Shippen(2012)Mutat.Res.730:20-27；doi:10.1016/j.mrfmmm.2011.10.003。事实上并非所有表达TERT的细胞都能够维持端粒。Counter等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:14723-14728。TERTmodRNA的递送以剂量依赖性方式增强端粒酶活性，在约0.6ug/ml的浓度上达到最大(参见图7)，并且将1ug/ml的浓度用于随后的实验。端粒酶活性水平快速升高但在约48小时内返回基线水平，而CITERTmodRNA未引起端粒酶活性的变化(图1d)。通过基于qPCR的RT测定测量端粒酶活性(n＝3)。
由于TERT的翻译后调控部分地通过细胞质隐匿以剂量依赖性的方式介导，因此也研究TERT在被处理的和未被处理的细胞中的亚细胞定位。Cifuentes-Rojas等(2011)Mutat.Res.doi:10.1016/j.mrfmmm.2011.10.003。与免疫印迹结果一致，免疫细胞化学在未处理的MRC-5细胞中显示丰富的(尽管可能被抑制的)被TERT抗体识别的蛋白质，这使得难以区分外源与内源TERT(数据未显示)。
将在约10次复制衰老开始的群体倍增(PD)内的细胞用于测量TERTmodRNA处理对端粒长度和复制能力的作用。使用此类细胞的决定基于至少两个因素。第一，该阶段上的细胞具有相对短的端粒，并且由于端粒酶优先延伸短的端粒(包括在MRC-5细胞中)，因此该阶段的细胞的处理应当导致更大的，更容易测量的作用。Britt-Compton等(2009)FEBSLett.583:3076—3080。第二，通过处理该阶段的细胞，确定所述处理是否增强复制能力所需的时间量减少。在本条件下，复制衰老在从供应商接收MRC-5细胞后约50PD开始(关于详细内容参见方法)，从而决定在约PD40处理细胞。该阶段的MRC-5细胞具有约5-7kb的平均端粒长度，这取决于培养史和从供应商接收时的PD。Sitte等(1998)FreeRadic.Biol.Med.24:885-893；MacKenzie等(2000)Exp.CellRes.259:336-350.
在设计处理方案中已考虑了几个因素(图4a)。使用TERT至MRC-5细胞内的病毒转导获得的端粒延伸速率是变化的，但为每分裂大约0.2kb。MacKenzie等(2000)Exp.CellRes.259:336-350。MRC-5细胞中的端粒缩短速率随培养条件和实践而变化(Sitte等(1998)FreeRadic.Biol.Med.24:885-893；vonZglinicki等(2000)FreeRadic.Biol.Med.28:64-74)，但在环境氧中为约0.1kb/PD(Sitte等(1998)FreeRadic.Biol.Med.24:885-893)。将细胞培养在5％氧气中，因为MRC-5细胞端粒在较低氧化的条件下更慢地缩短，vonZglinicki等(2000)FreeRadic.Biol.Med.28:64-74。发现PD40MRC-5细胞中的PD时间为约33小时。鉴于这些数据，为了在端粒长度测量、端粒限制性片段(TRF)分析和定量荧光原位杂交(Q-FISH)的选择的方法的分辨率内检测端粒延伸，预期可能需要多个处理。处理之间的间隔被选择为48小时，因为发现端粒酶活性水平在单个处理后到该时间返回至基线水平。
如图3(b)-(d)中显示的，利用hTERTmodRNA处理MRC-5细胞导致在这些细胞中相较于未处理或仅用递送媒介物处理的细胞，端粒长度的显著增加。在处理后，中期MRC-5细胞的荧光显微照片显示端粒探针在这些细胞中的染色体上的定位(图4(e))。
对端粒长度的处理的作用还通过定量荧光原位杂交(Q-FISH)来测量(图4(f))，因为该技术提供相对高的分辨率(0.3kb)，而且还因为Q-FISH端粒探针的荧光与端粒长度直接成正比。Lansdorp等(1996)Hum.Mol.Genet.5:685-691；Martens等(1998)Nat.Genet.18:76-80。因为复制能力是作为延伸端粒的结果的增加中最感兴趣的功能参数，因此构建将MRC-5细胞的群体倍增数与如使用Q-FISH测量的端粒长度发生关系的标准曲线(图4(g)(i))。在用TERTmRNA以48小时的间隔对PD40MRC-5进行3次处理后，每细胞的平均总端粒长度增加56+/-5％(对于每一个处理的2个生物学重复的每一个，n＝15；误差棒代表s.e.m.)。被处理的PD40细胞的端粒长度与未处理的PD3细胞的端粒长度相似(图4(g)(ii))(上面的虚线)，从而处理使端粒延伸端粒在这些细胞中经历37PD所缩短的量。在标准曲线条件下在该数目的PD中，MRC-5端粒缩短>1kb。Sitte等(1998)FreeRadic.Biol.Med.24:885-893。与此一致地，56％的观察到的端粒长度的增加对应于约0.6-2.5kb的平均端粒长度的增加，基于PD40MRC-5细胞具有如使用TRF测量的约5-7kb的平均端粒长度的事实(Sitte等(1998)FreeRadic.Biol.Med.24:885-893；MacKenzie等(2000)Exp.CellRes.259:336-350)，这使端粒长度被估高约2.5-4kb，从而PD40MRC-5细胞中的实际平均端粒长度在1-4.5kb的范围内。Aubert等(2012)Mutat.Res.730:59-67。由于处理持续总共144小时并且细胞的群体倍增时间为约33小时，因此在该时间过程中，细胞经历了约4-5PD。因此，端粒延伸的速率为每PD约0.1-0.6kb，其上限达到在编码TERT的DNA的病毒转导后曾报导的最大速率，并且其下限可与使用病毒递送看到的常见速率相当。如所预期的，未处理细胞在标准曲线的产生过程中具有与PD40细胞相等的端粒长度(图4(g)中下方的虚线)。
随后，检查TERTmRNA处理对细胞复制能力的作用。如所预期的，未处理的和仅用媒介物处理的细胞在50-60PD的正常范围内衰老(图5a)。与之形成鲜明对比的是，利用TERTmRNA处理的细胞以剂量依赖性方式继续增殖，超过对照群体达到复制衰老所处的PD，每一个额外的处理赋予显著更多的额外PD。
利用TERTmRNA的3次处理导致28+/-1.5PD的复制能力的增强。该结果与端粒延伸>1kb的估计一致，因为在环境(20％)氧下MRC-5端粒每PD缩短约0.1kb(Sitte等(1998)FreeRadic.Biol.Med.24:885-893)，并且将处理细胞培养在5％氧气中，其中端粒缩短更慢。观察到的28PD的处理细胞的复制能力的增强等于在正常成纤维细胞在超过10年的正常人老化的过程中发生的复制能力的丢失。Takubo等(2010)GeriatrGerontolInt.10增刊1:S197-206；doi:10.1111/j.1447-0594.2010.00605.x.；Allsopp,R.C.等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:10114-10118.
对于治疗性应用重要的是，迄今研究的所有处理细胞最终都会衰老，并且事实上比具有相同端粒长度的未处理细胞早几个PD衰老，这可被预期，因为处理细胞相较于具有相似端粒长度的未处理细胞已经历数打额外的PD，其中积累了非端粒DNA损伤或可能影响端粒缩短的速率或另外地支持复制衰老的诱导的其它损伤。
当MRC-5细胞达到并进入复制衰老时，它们催化向于肿胀至早期代的直径的数倍(图8a)。与复制衰老一样，该转变在用TERTmodRNA处理的细胞中，但非接受CITERTmodRNA或仅媒介物的细胞中被延迟(图8b)。
与CITERTmodRNA未引起端粒酶活性的增强的发现一致(图1d)，CITERTmodRNA处理相对于未处理细胞不改变端粒长度分布，并且CITERTmodRNA也不增强复制能力，尽管引起与由TERTmodRNA引起的TERT蛋白水平的升高等同的TERT蛋白水平的升高(图1c)。由于TERT与CITERT之间唯一的差异是消除CITERT将核苷酸转移至端粒酶的能力的单个残基取代，因此这些结果强有力地支持假说：在用TERTmodRNA处理的细胞中观察到的端粒长度和复制能力的增加归因于至少一些处理细胞中的真实端粒延伸，而非预先存在的具有更长端粒的细胞的亚群体的选择。
该实例的结果显示TERTmodRNA至人细胞中的递送瞬时增强端粒酶活性，快速地延伸端粒，和以有限的，从而安全的量增强复制能力。纯化的仿生modRNA也是低免疫原性的。Karikó等(2011)NucleicAcidsRes.39:el42；doi:10.1093/nar/gkr695。因此modRNA递送满足治疗性端粒延伸治疗的标准，并且还保证其它标准，包括特异性、靶向递送和克服翻译后调控的能力。关于特异性，TERT过表达也可影响其它基因诸如Wnt(Park等(2009)Nature460:66-72)，但此类作用可通过递送编码在因子的结合部位突变的TERT的modRNA来避免，所述结合部位介导任何非特异性作用。关于递送，在人中modRNA在外来体中通过血液和其它体液在细胞之间运输的最近发现使得基于外来体的modRNA递送能够用于端粒延伸和其它应用。Lakhal和Wood(2011)Bioessays33:737-741。外来体已被成功地用于将仿生modRNA体外递送至细胞(数据未显示)。关于翻译后调控，TERT的依赖于和不依赖于细胞周期的抑制性翻译后调控可通过递送编码在一个或多个介导那些活性的位点(诸如核输出序列)上突变的TERT的modRNA，或通过共递送编码端粒酶或端粒复合物的其它成员的modRNA来避免。这些方法使得甚至能够在缓慢分裂或非分裂细胞中延伸端粒，从而使TERTmodRNA处理适合用于静止的或缓慢分裂的干细胞和祖细胞群体。基于modRNA的端粒延伸从而立即用于增强用于研究和另外地用于细胞疗法、生物工程应用和体内治疗的细胞的复制能力，所述体内治疗解决了端粒维持不足的疾病和病症。
总之，在96小时内将编码人端粒酶逆转录酶(TERT)的modRNA递送至MRC-5人肺成纤维细胞3次。处理细胞中的端粒延伸>1kb，成纤维细胞端粒在平均超过10年的人的衰老过程中缩短的量。Takubo等(2010)GeriatrGerontolInt.10增刊1:S197-206；doi:10.1111/j.1447-0594.2010.00605.x。端粒酶活性在48小时内返回至处理前水平并且处理细胞中的复制能衰老的开始以剂量依赖性方式被延迟约30次群体倍增。因此，含经修饰的核苷的端粒酶RNA至细胞的递送允许是快速的和低免疫原性的或无免疫原性的，并且RNA是进行端粒延伸以用于不同应用的有用方法。
方法
modRNA模板产生和分析。用于产生用于modRNA合成的DNA模板的野生型(WT)人TERT的开放阅读框架(ORF)与NCBI人TERT转录物变体1参照序列NM_198253.2相同，并且通过对pBABE-neo-hTERT质粒(Addgene质粒1774)的ORF产生修饰G516D来产生。残基516存在TERT的N末端延伸的QFP基序(一个与TERT的多聚化和RNA结合相关的基序)中。通过引入突变D712A从WTTERT序列产生无催化活性TERT(CITERT)突变体。将WT和CITERTORF插入起始质粒的MSC，所述起始质粒含有T7启动子、人β珠蛋白(hBB)的5’UTR、MSC、hBB的3’UTR、151bp的多聚A序列和在多聚A序列之后的用于利用II类酶的线性化的限制性位点。以至少一式四份对所得的中间质粒进行测序，以确保保真度，将其线性化，并使用来自MEGAscriptT7试剂盒(Ambion,Austin,Texas)的RNA聚合酶和经典与非经典核苷酸的定制核苷酸混合物(TriLinkBioTechnologies)将其翻译成加帽的RNA，在所述混合物中每40ulIVT反应的终核苷酸浓度为7.5mM(对于腺苷-5’-三磷酸(ATP)、5-甲基胞苷-5'-三磷酸(m5C)和假尿苷-5'-三磷酸(ψ)的每一种)、1.5mM(对于鸟苷-5’-三磷酸(GTP))和6mM(对于帽类似物(ARCA,NEB))或1:1:1:0.2:0.8的ATP:m5C:ψ:GTP:ARCA摩尔比。为了进一步降低与具有5’-3P的级分(占总量的～20％)相关的mRNA的潜在免疫原性，用磷酸酶(AntarcticPhosphatase,NEB)处理IVT产物。使用变性琼脂糖凝胶电泳验证modRNA产物的大小和完整性。
细胞和细胞培养。从ATCC接收第14代(它们的库存配送的当前代数)的MRC-5人胎儿肺成纤维细胞(ATCCCCL-171)。由于ATCC示标示PD数值，因此本文中引用的PD值是指在接收来自ATCC的细胞后的PD数值，此处定义为PD0。为了在用于端粒延伸实验的制剂中缩短它们的端粒，使用ATCC指南在含有10％FBS的DMEM中，于环境氧和5％CO2中培养细胞。端粒延伸处理始于从ATCC接收细胞后约PD40。在modRNA处理开始前至少48小时，将细胞转移至5％的氧气和含有20％FBS和青霉素-链霉素的DMEM培养基中。在涂板后至少24小时和胰蛋白处理前24小时处理细胞。
modRNA转染。除非另外指出，否则使用LipofectamineRNAiMax(Invitrogen)(一种阳离子脂质)，在Opti-MEM减血清培养基(Invitrogen)用转染细胞0.4nMTERTmodRNA和2.0nMTERCRNA转染细胞，进行4-5小时，之后将它们返回至正常培养基。
端粒酶活性测量。在转染期开始后24小时，用PBS洗涤细胞，进行胰蛋白酶处理，以500g沉淀5分钟，再用PBS洗涤，再沉淀，随后按照TRAPezeRT试剂盒(Millipore)中的说明书进行裂解。在RocheLightCycler480II和ABI7900HT中进行反转录和qPCR步骤。将样品的端粒酶活性总是与随试剂盒一起提供的参照标准相比较，因为我们发现倍数增加易于高度变化，可能归因于MRC-5细胞中的低端粒酶活性。
免疫细胞化学。在转染期开始后24小时，用PBS洗涤细胞，将其在2％的多聚甲醛中固定20分钟，用PBS洗涤3次，在含有7.5％BSA和0.1％TritonX-100的PBS中封闭1小时，洗涤3次，将其在4℃于振荡器上在含有5％BSA的PBS中的抗-TERT抗体(ABCAM32020，以1:50或Rockland600-401-252S，以1:500)中孵育过夜，在第二抗体中孵育1小时，洗涤2次，随后再于振荡器上洗涤2次，每次3分钟，随后在0.1ug/mlDAPI中孵育3分钟，和在PBS中洗涤4次。
流式细胞术。在转染开始后22小时，对利用0.5-1.5ug/ml的TERTmodRNA处理的细胞和对照进行酶蛋白酶处理，洗涤，将所述细胞在2％多聚甲醛进行固定，在7.5％BSA中用0.1％TritonX-100透化20分钟，于PBS中洗涤3次，在7.4％BSA中封闭1小时，于含有5％BSA的PBS中的抗-TERT抗体(ABCAM32020，以1:50)中进行孵育，洗涤3次，于PBS中的第二抗体(1:200)中进行孵育，随后洗涤3次，重悬浮于FACS缓冲液中，并在AccuriC6流式细胞仪(BectonDickinson)上进行分析。将平均荧光强度计算为处理样品和对照样品中的所有细胞的平均荧光。使用CFlowPlus软件分析数据。
RT-PCR。使用RNeasyMini试剂盒(Qiagen)收获总RNA，随后使用High-CapacityRNA-to-cDNA试剂盒(Invitrogen)将其转化成cDNA。利用下列引物，使用PCR扩增cDNA：
hTERT-F：5’-GCCCTCAGACTTCAAGACCA(SEQIDNO:l)
3’-hBB-R：5’-AGGCAGAATCCAGATGCTCA(SEQIDNO:2)
GAPDH-F：5’-GTGGACCTGACCTGCCGTCT(SEQIDNO:3)
GAPDH-R：5’-GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT(SEQIDNO:4)
免疫印迹。通过用PBS洗涤细胞一次，随后于RIPA缓冲液裂解细胞来来收获蛋白质。在NuPAGENovexTris-Acetate凝胶上运行蛋白质，将其在35V下转移至PVDF膜进行2小时，随后在4℃与抗-α微管蛋白(Sigma，以1:10,000)和抗-TERT抗体(ABCAM32020，以1:1000或Rockland600-401-252S，以1:500)杂交过夜。使用红外(680nm和800nm)抗体(LI-COR)和Odyssey成像仪(LI-COR)进行第二检测。使用ImageJ分析图像。
Q-FISH。将细胞在0.1ug/ml秋水仙胺中孵育4小时，随后固定，和按照Lansdorp等41的方法制备中期染色体涂片。随后使用TelomerePNAFISHKit/FITC试剂盒(Dako,Denmark)，用AlexaFluor555-标记的端粒探针(Bio-Synthesis,USA)取代试剂盒探针来对载片进行染色。在使用SoftWoRx软件的DeltaVision(AppliedPrecision,Inc.,Washington)显微镜上，使用自动精密滑台，利用60X或100X油乳物镜以0.2微米的间隔在3微米的范围内对每一个细胞成像，并且将定制软件用于鉴定其中每一个端粒是焦点对准的图像并且将其强度整合进该焦点对准的图像。使用DeltaVision光传感器补偿光照强度的暂时变化，所述光传感器记录每一个图像的光照强度，并且通过分别获得平场像和暗场像来补偿空间强度和CCD暗电流的变化和读取错误。至少15个中期细胞构成每一个重复，并且在至少2个单独的实验中以至少一式二份重复测量每一个样品。
生长曲线。收获细胞，并在血细胞计数器上进行计数，因为当群体在直径上变得不均一(当群体进入复制衰老时)时自动计数器不能准确地计数细胞。图像被获得来允许测量细胞直径。将PD计算为代间每一个培养周期结束和开始时的细胞数目的比率的log2。
统计。使用MicrosoftExcel进行统计分析。误差条代表平均值±s.e.m。使用T-检验比较端粒长度，P<0.05(双尾)被认为是统计上显著的。
实施例2.TERTmodRNA处理对人内皮细胞的作用
TERTmodRNA处理的作用不限于成纤维细胞。如图9中显示的，人真皮微血管内皮细胞("HMDEC")展示典型的倍增曲线，衰老的早期起始大致在第12代，并且细胞在第17代完全衰老。如图10中显示的，在第18代用野生型hTERTmodRNA(每一个系列中的右条块)处理这些细胞导致衰老的逆转，然而对照处理(每一系列中的左条块)或利用突变型hTERTmodRNA(每一个系列中的中条块)的处理对细胞衰老无作用。
图11显示各种处理对HMDEC的生长的作用。具体地，在第10代与第11代之间利用野生型TERTmodRNA(WT)处理3次的细胞继续生长，然而未处理细胞(UT)、只用载体处理的细胞(CO)和用无催化活性TERT(CI)处理的细胞终止倍增。
图12显示在用WT和CImodRNA处理后第14代的HMDEC的β半乳糖苷酶(bGAL)染色的结果。该染色测量在pH6下的β半乳糖苷酶活性，该活性是在衰老前、静止或永生化细胞中未发现的衰老细胞的性质。参见Dimri等(1995)Proc.Nat'lAcad.Sci.USA92:9363-7。方法
使用12孔板格式建立HMDEC累积群体倍增曲线。在每一个时间点以一式三份将约105个HMDEC涂板，在先前涂板后第4天进行细胞计数。如图9中显示的，第12代被测定为HMDEC衰老的早期起始点。
如图10中显示的，在仅载体(CO,RNiMAX)对照存在的情况下，利用0.75mg的编码hTERT-CI和hTERT-WT的modRNA每隔一日转染约105个HMDEC两次。在第19、20和21代，每次在涂板后第5天进行细胞计数。
对图11中显示的实验，在第10与11代之间的间隔中(和，如上文中所指出的，第12代对应于HMDEC衰老的早期起始)，将每75cm3培养瓶约5x105个HMDEC培养在用EGM-2MV补充剂支持的EBM-2培养基(两者都来自Lonza,Walkersville,MDUSA，目录号分别为CC-3156和CC-4176)上。在未处理(UT)对照和仅载体(CO,RNAiMAX)对照培养瓶存在的情况下，每隔一日用5μg的编码hTERT-WT(WT)和hTERT-CI(CI)的modRNA转染微血管细胞3次。在每一个时间点上，将5x105个细胞涂板，并且始于第11代，在涂板后第5天通过血细胞计数器进行细胞计数。对于每一个时间点，以一式三份进行每一个实验条件。
对于图12中显示的实验，如图10中所述，处理约105个第14代的每一种NT、hTERT-CI和hTERT-WTHMDEC。随后将细胞经历衰老细胞分析(基于使用衰老细胞组织化学染色试剂盒(Sigma，目录号CS0030)在pH6下进行的β半乳糖苷酶活性的组织化学染色)。载片的左侧显示非处理(NT)细胞和利用hTERT-CI(CI)或hTERT-WT(WT)modRNA处理的细胞的代表性图像。所有图像都是在相同的图像获取条件下获得的。以一式三份进行每一个实验条件，并且将对于每一个条件呈β半乳糖苷酶活性阳性的细胞的百分比(如图解中所示的)计算为3个随机捕获的区域中的阳性细胞的平均值。
实施例3.TERTmodRNA处理对人细胞的作用的进一步表征
在本实施例中，通过阳离子脂质将mRNA转染进原代人成纤维细胞和成肌细胞中(图13A)，已知细胞具有有限增殖能力。Webster和Blau(1990)SomatCellMolGenet.16:557-565；Hayflick和Moorhead(1961)ExpCellRes.25:585-621；Yakubov等(2010)BiochemBiophysResCommun.394:189-193。在在递送GFPmRNA后使用流式细胞仪单细胞荧光定量测定转染效率，所述转染效率显示大多数细胞(>90％)甚至在相对低的经修饰的mRNA浓度(0.1μg/ml)下被转染(图13B和图16A-C)。利用等浓度的外源TERTmRNA或编码TERT的无催化活性(CI)形式的mRNA处理细胞导致相似量的mRNA的内化(图16D)，如在第一处理后24小时通过RT-qPCR测量的。CITERT在TERT的逆转录酶结构域的催化部位上的金属络合型天冬酰胺的三联体中的一个上具有取代突变。因此，CITERT不能将核苷酸添加至端粒，然而保持结构完整，能够结合模板DNA，并展示可与网织红细胞裂解物中的野生型TERT相当的稳定性。Wyatt(2009)Structure-FunctionAnalysisoftheHumanTelomeraseReverseTranscriptase。TERT和CITERTmRNA处理影响内源TERTmRNA相对于未处理细胞的水平，如通过RT-qPCR测量的(图16E)。利用1μg/ml的TERT或CITERTmRNA的转染导致成纤维细胞中TERT蛋白的量的等同50％的增加(分别地P<0.05和<0.01)(图13C，左图框)。Wick等(1999)Gene.232:97-106；Ahmed等(2008)JCellSci.121:1046-1053。内源TERT蛋白在几无内源端粒酶活性的细胞中的存在与许多细胞类型中TERT的无活性剪接变体的相对丰度和如先前由其他人报导的TERT活性的广泛翻译后抑制性调控一致。Yi等(2001)NucleicAcidsRes.29:4818-4825；Cifuentes-RojasandShippen(2011)MutatRes.[印刷前在网上发表的：2011年10月18日]；doi:10.1016/j.mrfmmm.2011.10.003。利用递增量的TERTmRNA的处理导致TERT蛋白表达的剂量依赖性增加，如通过流式细胞术在单细胞测定中测量的(图13C，右图框)。
端粒酶活性被瞬时增强。为了测试经修饰的TERTmRNA递送是否导致功能性TERT蛋白的产生，使用基于凝胶的TRAP测定定量端粒酶活性。端粒酶活性在所有测试的TERTmRNA的剂量(0.25、0.5、1.0和2.0μg/ml)上在成纤维细胞和成肌细胞中检测到，但在未处理细胞或仅用媒介物或编码CITERT的经修饰的mRNA处理的细胞中在甚至2.0μg/ml的最高剂量上未被检测到(图13D)。尽管TERT需要TERC来形成功能性端粒酶复合物，但单独的TERT的递送足以增强端粒酶活性，与TERT通常是有限的(因为TERCRNA拷贝数在缺乏端粒酶活性的许多细胞类型包括成纤维细胞中非常高)的先前发现一致。Yi等(2001)NucleicAcidsRes.29:4818-4825。时间过程显示端粒酶活性在第24小时达到高峰，并且在单次转染后48小时内返回至基线水平。该时帧与先前报导的人TERTmRNA(2-4小时)、人β珠蛋白mRNA(17-18小时：我们的外源TERTmRNA侧翼连接有β珠蛋白5’和3’UTR)的半衰期以及暴露于蛋白质合成的抑制剂的细胞中的端粒酶活性(细胞类型依赖性的，但通常>24小时)一致。Kabnick和Housman(1988)MolCellBiol.8:3244-3250；Holt等(1997)ProcNatlAcadSciUSA.94:10687-10692；Xu等(1999)BrJCancer.80:1156-1161。
端粒的延长。未处理成纤维细胞中的端粒长度如所预期的随时间推移(3个月)下降(62)(图14A)，并且使用两种不同的方法来定量。将单色多通路qPCR法(MMqPCR)用于估量长度，并且利用由SpectraCellLaboratories,Inc.进行的qPCR法独立地验证测量(相关系系数为0.97，P<0.001)。以48小时的间隔连续3次将TERTmRNA递送至成纤维细胞或成肌细胞(分别始于群体倍增(PD)25和6)分别延伸端粒0.9±0.1kb(22±3％)和0.7±0.1kb(12±2％)(图14B,C)。仅利用媒介物的处理或利用CITERTmRNA的处理对端粒长度没有显著影响(相对于未处理细胞)。成纤维细胞中端粒延伸的平均速率为135±15bp/PD。
增殖能力的细胞类型依赖性增强。为了测试经修饰的TERTmRNA递送和随后的端粒延伸对细胞增殖能力的作用，连续转染人成纤维细胞1次、2次或3次。以48小时的间隔递送处理。未处理的、仅用媒介物处理的和CITERTmRNA处理的成纤维细胞在约50-60PD后在细胞数目上展示相同的平台，然而用TERTmRNA处理3次的细胞继续增殖有限的另外28±1.5PD，在细胞数目上比未处理细胞增加总共2.7x108个细胞(图14D，左图框)。对于每一个赋予额外PD的额外处理，作用是剂量依赖性的(图14D，右图框)。增殖能力的递增增强对于第一处理比对于第二或第三处理更大。以48小时的间隔连续处理3次的人成肌细胞获得3.4±0.4PD，等于相较未处理的或媒介物处理的对照细胞数目增加至10倍(图14E)。成肌细胞与成纤维细胞之间的PD的此类差异不是预料之外的，因为先前的研究已发现相似的TERT过表达对少数PD的有限作用，并且显示该限制归因于人成肌细胞中p16介导的生长停止，与成纤维细胞相反。Bodnar等(1998)Science.279:349-352；Zhu等(2007)AgingCell.6:515-523。在成纤维细胞和成肌细胞中，单独的媒介物或CITERTmRNA对增殖能力没有影响(相较于未处理对照)。这些数据显示经修饰的TERTmRNA的递送是用于在培养中增加PD的有效方法。重要地，所研究的所有经处理的细胞展示细胞数目的显著增加，但最终达在它们的生长曲线中达到平台，从而证明永生化不存在。
衰老的标志物的瞬时减少。当成纤维细胞群体终止生长时，它们展示衰老的标志物，包括衰老相关β-半乳糖苷酶(β-gal)染色和扩大的尺寸(图15A-C)。Cristofalo和Kritchevsky(1969)MedExpIntJExpMed.19:313-320；Dimri等(1995)ProcNatlAcadSciUSA.92:9363-9367；Cristofalo等(2004)MechAgeingDev.125:827-848；Lawless等(2010)ExpGerontol.45:772-778。这些变化在用TERTmRNA处理的成纤维细胞中相对于未处理细胞和接受CITERTmRNA或仅接受媒蛤物的细胞瞬时减少。根据其它研究人员的发现，在已进入生长平台的群体中并非所有细胞都在可检测水平上表达β-半乳糖苷酶。Lawless等(2010)ExpGerontol.45:772-778；Binet等(2009)CancerRes.69:9183-9191。然而，TERTmRNA转染的成纤维细胞和成肌细胞表达β-半乳糖苷酶至与在两个群体达到生长平台后每一种类型的对照细胞相同的程度。这些数据显示利用TERTmRNA处理的细胞最终和可预测地停止分裂并表达衰老的标志物，从而不可能被转化。
本实施例表明包含经修饰的核苷酸的TERTmRNA的瞬时递送延伸人端粒并增强细胞增殖能力而不永生化细胞。此处观察到的135±15bp/PD的成纤维细胞的端粒延伸速率可与使用病毒方法报导的从94至>150bp/PD的速率(22,69)相当。经修饰的TERTmRNA在数天内在成纤维细胞中延伸端粒0.9±0.1kb。已报导成纤维细胞端粒长度在人一生中平均缩短约1-2kb。Allsopp等(1992)ProcNatlAcadSciUSA.89:10114-10118。因此，经修饰的TERTmRNA是有效的，但是瞬时的并且非整合的，克服了连续表达的病毒TERTmRNA递送的主要限制。
最感举的人细胞通常在数目上是有限的，包括用于实验或再生医学的干细胞。该问题目前通过各种方法(包括体细胞核转移、用于基因递送的病毒法以及降低端粒缩短速率的培养条件的使用)来解决。Le等(2013)CellStemCell,[印刷前在网上发表的：2013年11月19日]；doi:10.1016/j.stem.2013.11.005；Zimmermann和Martens(2008)CellTissueRes.331:79-90；Mohsin等(2013)CircRes.113:1169-1179。此处描述的经修饰的TERTmRNA处理为这些方法提供了有利的补充或选择，简单来说就是快速延伸端粒，并且不具有插入诱变的风险。TERTmRNA处理的简洁特别吸引人，因为其可避免可随时间推移在培养中发生的干细胞表型的丢失(Gilbert等(2010)Science.329:1078-1081)并且缩短iPSC产生的重编程后阶段，在该阶段过程中端粒延伸(Wang等(2012)CellRes.22:757-768)。此类延伸端粒的方法具有增加不同细胞类型用于疾病建模、筛选改善性药物的效用以及用于细胞疗法。
对于测试的细胞类型观察到一系列对增殖能力的作用，与显示TERT过表达对成肌细胞和成纤维细胞的增殖能力的不同作用的先前研究一致。Bodnar等(1998)Science.279:349-352；Zhu等(2007)AgingCell.6:515-523。此外，端粒延伸的量与增殖能力无关。因此，细胞环境(cellcontext)决定TERT表达对增殖能力的效力并且对介导该作用的因子的理解在克服该限制中是有益的。牵涉在病毒TERT过表达时限制成肌细胞增殖能力的因素包括p16介导的生长停滞、细胞类型和品系以及培养条件。Zhu等(2007)AgingCell.6:515-523。更一般地，所述作用可由非端粒DNA破坏、年龄和线粒体完整性介导。Sahin等(2011)Nature.470:359-365；Mourkioti等(2013)NatCellBiol.15:895-904；López-Otín等(2013)Cell.153:1194-1217。CITERTmRNA转染的细胞中端粒长度或细胞增殖能力的增加的不存在与通过籍以将核苷酸直接添加至端粒的TERT的催化位点起作用的处理一致。TERTmRNA处理的细胞群体在数目上指数增加一段时间，从而最终停止扩增并且抑制衰老的标志物至与未处理群体相似的程度，与永生化的不存在一致。
此处观察到的经修饰的mRNA的瞬时非整合性质和增殖能力的有限增强使其比目前使用的病毒或DNA载体安全。此外，所述方法快速延伸端粒，以使得处理可以是瞬时的，随后保护性端粒缩短机制保持不变。该方法可离体地用于处理介导某些病症和疾病诸如的细胞类型，诸如在免疫衰老或骨髓衰竭的情况下造血干细胞或祖细胞。此外，经修饰的mRNA可在体内被递送至某些组织。Kormann等(2011)NatBiotechnol.29:154-157。总之，此处描述的用于端粒的快速延伸的快速安全的方法导致延迟的衰老和增强的细胞增殖能力而不会永生化人细胞。
方法
mRNA模板的产生和分析。为了产生编码GFP、TERT和CITERT的经修饰的mRNA，将它们各自的开放阅读框架(ORF)插入起始质粒的MCS，所述起始质粒含有T7启动子、人β-珠蛋白(HBB)的5’UTR、MCS、HBB的3’UTR、151bp的多聚A序列和在多聚A序列之后的用于利用II类酶线性化的限制性位点。对所得的中间质粒进行测序，线性化，和使用来自MEGAscriptT7试剂盒(Ambion,Austin,Texas,USA)的缓冲液和RNA聚合酶以及经典与非经典核苷酸的定制混合物(TriLinkBioTechnologies,SanDiego,CA,USA)转录其，在所述定制混合物中，每40μlIVT反应的终核苷酸浓度为7.5mM(对于腺苷-5’-三磷酸(ATP)、5-甲基胞苷-5'-三磷酸(m5C)和假尿苷-5'-三磷酸(ψ)的每一种)、1.5mM(对于鸟苷-5’-三磷酸(GTP))和6mM(对于帽类似物(ARCA)(NewEnglandBiolabs,Ipswitch,MA,USA))或1:1:1:0.2:0.8的ATP:mSC:ψ:GTP:ARCA的摩尔比。为了进一步减小与具有5’-3P的级分相关的mRNA的潜在免疫原性，利用南极磷酸酶(NewEnglandBiolabs)处理IVT产物。使用变性琼脂糖凝胶电泳验证mRNA产物的大小和完整性。用于产生用于mRNA合成的DNA模板的野生型人TERTORF与NCBI人TERT转录物变体1(参照序列NM_198253.2)相同。从pBABE-neo-hTERT质粒(Counter等(1998)ProcNatlAcadSciUSA.95:14723-14728)(质粒1774,Addgene,Cambridge,MA,USA)产生ORF。pBABE-neo-hTERT质粒在TERT的QFP基序(与多聚化和TERT与TERCRNA的相互作用相关的基序)中的残基516上具有非沉默突变，从而避免因该突变导致的人工假像的可能性，我们通过用变化G516D修正突变产生与NCBI参照序列相同的序列。通过引入突变D712A从TERT序列产生CITERT突变体。
细胞培养和处理。在第14代从ATCC(Manassas,VA,USA)获得人原代胚胎肺MRC5成纤维细胞。ATCC未标示PD数值，因此，本文中引用的我们的PD值是指在从ATCC接收细胞后的PD的数值。将MRC5细胞培养基含有20％FBS和青霉素-金霉素的DMEM培养基中。按照供应商的说明书将人30岁的原代骨骼肌的成肌细胞(Lonza,Allendale,NJ,USA)培养在SkGM-2培养基(Lonza)中。群体倍增被计算为收获的细胞与在先前传代中涂板的细胞之间的比率的以2为底的对数，并且如果收获比涂板更少的细胞则被认为是0。使用在OptiMEM减血清培养基(LifeTechnologies,GrandIsland,NY,USA)中制备的LipofectamineRNAiMax(LifeTechnologies,GrandIsland,NY,USA)，利用经修饰的TERTmRNA转染细胞，随后以1:5的v:v比率将它们的正常培养基添加至细胞以获得本文中指定的终浓度。
端粒酶活性测量。在转染期开始后24小时，收获细胞并将其在CHAPS缓冲液中裂解。使用TRAPeze试剂的改进形式(EMDMillipore,Billerica,MA,USA)(其中在其间延伸人工端粒底物的步骤之后而非之前添加引物和聚合酶)进行TRAP测定。PCR程序是94℃30秒/59℃30秒/72℃45秒，进行30个循环，随后将产物在15％聚丙烯酰胺凝胶上于0.5XTBE中运行，利用SYBR金核酸凝胶染料(LifeTechnologies,GrandIsland,NY,USA)染色。使用TRAPezeRT试剂盒(EMDMillipore,Billerica,MA,USA)进行端粒酶活性的时间过程。
免疫印迹。通过用PBS洗涤细胞一次，随后在RIPA缓冲液(CellSignalingTechnology,DanversMA,USA)中裂解细胞来收获蛋白质。将蛋白质在NuPAGENovexTris-Acetate凝胶(LifeTechnologies,GrandIsland,NY,USA)上电泳，在35V下转移至PVDF膜，进行2小时，随后以1:10,000与抗-α微管蛋白(Sigma,St.Louis,MO,USA)和以1:1000与抗-TERT抗体(ABCAM,Cambridge,MA,USA,32020，以1:1000；或RocklandImmunochemicals,Gilbertsville,PA,USA,600-401-252S，以1:500)杂交，并在4℃下孵育过夜。使用红外(680nm和800nm)抗体(LI-COR,Lincoln,NE,USA)和Odyssey成像仪(LI-COR)进行检测。使用ImageJ(NIH,Bethesda,MD,USA)定量每一个条带的强度。将每一个TERT条带的强度针对其对应的微管蛋白条带进行标准化。
流式细胞术。在用指定剂量(图16A-C)的TERTmRNA转染后24小时收获细胞，随后以1:500用抗-TERT抗体(RocklandImmunochemicals,Gilbertsville,PA,USA；600-401-252S)对其进行染色。
由SpectraCellLaboratories,Inc进行端粒长度的测量。使用酚氯仿提取基因组DNA，并使用Quant-iTTM dsDNA测定试剂盒(LifeTechnologies,GrandIsland,NY,USA)进行定量。在SpectraCellLaboratoriesInc.(Houston,TX,USA)基本上如由Cawthon等Cawthon(2002)NucleicAcidsRes.30(10):e47；Cawthon(2009)NucleicAcidsRes.37(3):e21描述的，使用CLIA批准的高通量qPCR测定进行端粒长度分析。所述测定通过测量样品籍以在其端粒重复拷贝数对单基因(36B4)拷贝数的比率的比率上与参照DNA样品相异的因素来测定相对端粒长度。该比率(T/S比率)被认为与平均端粒长度成正比。以至少一式两份运行所有样品，存在至少一个阴性对照和具有两个不同的已知端粒长度(高和低)的两个阳性对照，看到达到8％的平均变化。将结果报告为与以kb表示的平均端粒长度相等的端粒评分。
通过MMqPCR进行的端粒长度测量。使用具有下列变化的由Cawthon(Cawthon(2009)NucleicAcidsRes.37(3):e21)开始的MMqPCR方案的改进形式测量端粒长度：添加另外的PCR预扩增循环以使端粒产物较早扩增，使端粒与单拷贝基因信号之间的差异放大；实验性地测定两种Taq聚合酶的混合物以产生比每一种酶本身更好的PCR反应效率；将SYBRGreen浓度从0.75X降至0.5X导致较早的信号。使用PureGene试剂盒(QiagenGermantown,MD,USA)，通过RNA消化从细胞收获基因组DNA，使用NanoDrop2000(ThermoFisherScientific,Waltham,MA,USA)定量所述DNA，每15μl使用LightCycler480PCR系统(Roche,Basel,Switzerland)以一式四份进行的qPCR反应使用10-40ng。将横跨100ng/μl至1.23ng/μl的5个点的参照DNA的系列稀释物包含在每一个测定中以产生样品DNA定量所需的标准曲线。每一个15μlPCR反应中的试剂的终浓度为：20mMTris-HClpH8.4、50mMKCl、3mMMgCl2、0.2mM的每一种dNTP、1mMDTT、1M甜菜碱(Affymetrix,SantaClara,CA,USA)、0.5XSYBRGreenI(LifeTechnologies,GrandIsland,NY,USA)、0.1875UPlatinumTaq(LifeTechnologies,GrandIsland,NY,USA)、0.0625XTitaniumTaq(Clontech)和900nM的每一种引物(Cawthon(2009)NucleicAcidsRes.37(3):e21中指定的telg、tele、hbgu和hbgd引物序列)。热循环程序为：95℃，2分钟；随后6个循环：95℃，15秒，49℃，15秒；随后40个循环：95℃，15秒，62℃，10秒，72℃，15秒(对于信号获得)，84℃，15秒以及88℃，10秒(对于信号获得)。将RocheLightCycler480软件用于产生标准曲线和计算每一个样品的端粒及单拷贝基因的DNA浓度。计算每一个样品重复的T/S比率，将结果平均化以产生样品T/S比率，使用送至上所SpectraCell的参照细胞的盲重复样品标准化所述T/S比率。使用MMqPCR和通过SpectraCell测量的相同样品的T/S比率的独立获得的相对值是高度一致的(相关系数＝0.97，P<0.001)。
反转录PCR。引物使用Primer3(Untergasser等(2012)NucleicAcidsRes.40:el15)来设计并且除当另外指出外，列于表9中。在处理开始后24小时，用PBS洗涤细胞3次，随后在缓冲液RLT(Qiagen,Germantown,MD,USA)中收获所述细胞。使用HighCapacityRNA-to-cDNAMaster混合物(LifeTechnologies,GrandIsland,NY,USA)将RNA转化成cDNA。使用TERT的开放阅读框架中的正向引物和内源TERTmRNA的3’UTR中的反向引物扩增内源TERTmRNA。使用TERTmRNA的开放阅读框架中的正向引物和存在于我们的外源TERT和CITERTmRNA中但非内源TRETmRNA中的HBB的3’UTR中的反向引物扩增外源TERTmRNA。使用Pfaffl法计算相对水平。参照基因为RPL37A(使用Greber等(2011)EMBOJ.30:4874-4884中指定的引物)和GAPDH，所述基因在对照或处理细胞中都未显示Ct值的显著变化。
表9：引物序列
衰老相关/3-半乳糖苷酶染色和细胞大小评分。使用衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(CellSignalingTechnology,DanversMA,USA)进行β-gal染色。以一式二份对每群体至少50个细胞进行评分。在于血细胞计数器载网上进行胰蛋白酶处理后手工地对细胞直径评分。Cristofalo和Kritchevsky(1969)MedExpIntJExpMed.19:313-320。
统计。使用MicrosoftExcel进行学生氏T检验和皮尔逊相关系数计算。误差条代表平均值±s.e.m。
实施例4.通过电穿孔进行的TERTmodRNA至细胞的递送
还可通过如图18-20中举例说明的电穿孔，使用适合用于在给定的细胞类型中获得最中佳转染效率和活力的电穿孔参数(包括TERTmodRNA的浓度、电压波形和电极几何形状)将本发明的TERTmodRNA化合物递送至细胞。图21显示通过电穿孔递送的TERTmodRNA的剂量的端粒酶活性的依赖性。
实施例5.modRNA至人血细胞的递送
如下用modRNA转染CD8+T-细胞。将来自人全血的棕黄层在Lymphoprep(Axis-Shield)密度梯度介质上离心以获得单核细胞，将所述单核细胞洗涤2次，随后使用DynabeadsUntouchedHumanCD8TCells试剂盒(LifeTechnologies)耗竭非CD8+白细胞。使用DynabeadsHumanT-A激活物CD3.CD28(LifeTechnologies)刺激CD8+细胞，并使用补充有30,000U/mlIL-2的OpTimizerT-Cell培养基培养4天。随后用编码核GFP和TERT的modRNA以50μg/ml的浓度于20μl含有补充物1的NucleofectorP3溶液的终体积中转染T细胞。转染后24小时测定细胞的荧光和活力。转染结果示于图22中。明亮的荧光表示高拷贝数，转染效率高于90％，具有高活力。
实施例6.使用端粒酶modRNA在人角质形成细胞中进行的端 粒酶的表达
如图23中所示，利用TERTmodRNA对人角质形成细胞的电穿孔导致细胞中端粒酶活性的表达。将人原代角质形成细胞以3x107个细胞/ml的密度悬浮于含有50μg/ml编码无催化活性(CI)的TERT或野生型TERT的modRNA的OptiMEM培养基(LifeTechnologies)中。将10μ1的细胞悬浮液置于1mm缝隙样品池(gapcuvette)中，并使用200V、1000Ohm和25微法拉，利用GenePulser(BioRad)进行电穿孔。将细胞立即返回至KGM-2培养基(Lonza)并孵育24小时，随后收获细胞以使用基于凝胶的TRAPeze测定(Millipore)测量端粒酶活性。使用1μg的总蛋白质进行每一个25μlTRAP反应，将一式两份样品在85℃加热10分钟以灭活端粒酶。未处理的仅进行电穿孔的ERT样品和CITERT样品用作阴性对照，并且将293T细胞和TSR8用作阳性对照。
实施例6.通过体内递送进行的modRNA-编码的蛋白质的表达
体内递送的modRNA可导致由编码的功能性蛋白的表达。Kormann等(2012)NatureBiotechnology29:154-157；Kariko等(2012)MolecularTherapy20:948-93。这在本文中已通过将2μg编码荧光素酶的modRNA与阳离子脂质媒介物(TransIT)复合和将其于50μl的OptiMEM(LifeTechnologies)中静脉内注射入啮齿类动物的尾来确认。收获脾，用荧光素进行处理，使用IVIS生物发光成像仪(Perkin-Elmer)测定测定其荧光素酶活性。如图24中显示的，在注射部位和在脾中检测到荧光素酶活性(箭头)。
本文中提及的所有专利、专利申请和其它公开的参考资料在此通过引用整体并入，就如同每一个已单独且具体地通过引用并入本文。
尽管已经提供了具体的实施例，但上述说明是说明性的而不是限制性的。可以以任何方式将前述实施例的任何一个或更多特征与本发明的任何其它实施方案的一个或多个特征组合。此外，在阅读本说明书后本发明的许多变化对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。因此，本发明的范围应当通过参考所附权利要求及其等同物的完全范围来确定。

Claims (65)

1.一种用于延伸端粒的化合物，其包含：
含有至少一个经修饰的核苷并且编码端粒酶逆转录酶的合成核糖核酸；
其中在利用所述化合物处理的细胞内端粒被延伸。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述端粒酶逆转录酶是哺乳动物、禽类、爬行类动物或鱼的端粒酶逆转录酶或保留端粒酶的催化活性的变体。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中所述端粒酶逆转录酶是人端粒酶逆转录酶。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中所述核糖核酸含5'帽、5'非翻译区、3'非翻译区和多聚腺苷酸尾。
5.根据权利要求4所述的化合物，其中所述5’帽是非免疫原性的。
6.根据权利要求4所述的化合物，其中所述5'帽已用磷酸酶处理。
7.根据权利要求4所述的化合物，其中所述多聚腺苷酸尾增强所述核糖核酸的稳定性。
8.根据权利要求4所述的化合物，其中所述5'非翻译区或所述3'非翻译区包含来自稳定的mRNA或经高效翻译的mRNA的序列。
9.根据权利要求4所述的化合物，其中所述5'非翻译区和所述3'非翻译区都包含来自稳定的mRNA或经高效翻译的mRNA的序列。
10.根据权利要求4所述的化合物，其中所述5'帽、5'非翻译区或3'非翻译区使所述核糖核酸稳定，增加所述核糖核酸的翻译率或调节所述核糖核酸的免疫原性。
11.根据权利要求1所述的化合物，其中所述至少一个经修饰的核苷调节所述核糖核酸的免疫原性。
12.根据权利要求1所述的化合物，其中所述合成核糖核酸是纯化的合成核糖核酸。
13.根据权利要求12所述的化合物，其中纯化所述合成核糖核酸以除去免疫原性组分。
14.根据权利要求1所述的化合物，其中所述核糖核酸编码人、猫、狗、小鼠、马、牛、绵羊、猪、非洲象、鸡、大鼠、斑马鱼、日本青鳉或黑猩猩的端粒酶逆转录酶，或与所述端粒酶逆转录酶具有至少95％序列同一性的多肽。
15.一种组合物，其包含权利要求1所述的化合物和端粒酶RNA组分。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述端粒酶RNA组分是哺乳动物、禽类、爬行类动物或鱼的端粒酶RNA组分。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述端粒酶RNA组分是人端粒酶RNA组分。
18.一种组合物，其包含权利要求1-14中任一项所述的化合物或权利要求15-17中任一项所述的组合物和递送媒介物。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述递送媒介物是外来体、脂质纳米颗粒、多聚体纳米颗粒、天然或人工脂蛋白颗粒、阳离子脂质、蛋白质、蛋白质-核酸复合物、脂质体、病毒体或聚合物。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述递送媒介物是阳离子脂质。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述递送媒介物是非免疫原性的。
22.一种延伸端粒的方法，其包括以下步骤：
向动物细胞施用权利要求1-14中任一项所述的化合物或权利要求15-21中任一项所述的组合物，其中至少一个端粒在细胞内被延伸。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述细胞在所述施用步骤之前具有至少一个缩短的端粒。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述细胞来自或存在于受试者中，所述受试者患有年龄相关疾病、年龄相关病症或功能或外貌的年龄相关衰退或处于发生所述疾病、病症或衰退的风险中。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述细胞来自或存在于受试者中，所述受试者患有癌症、心脏病、中风、糖尿病、糖尿病性溃疡、阿尔茨海默病、骨质疏松症、体能或外貌上的衰退、身体创伤或长期生理压力、精神创伤或长期心理压力、降低的免疫功能、免疫衰老或黄斑变性或处于发生所述疾病的风险中。
26.根据权利要求22所述的方法，其中所述细胞是内胚层、中胚层或外胚层谱系的细胞或生殖细胞系或胚胎细胞。
27.根据权利要求22所述的方法，其中所述细胞是诱导性多能干细胞或用于产生诱导性多能干细胞的细胞。
28.根据权利要求22所述的方法，其中所述细胞是转分化细胞或用于产生转分化细胞的细胞。
29.根据权利要求22所述的方法，其中所述细胞是分离的细胞，并且施用步骤持续不超过48小时。
30.根据权利要求22所述的方法，其中所述细胞是分离的细胞，并且施用步骤持续至少2小时。
31.根据权利要求22所述的方法，其中所述细胞是分离的细胞，并且进行施用步骤不超过4次。
32.根据权利要求22所述的方法，其中所述细胞是分离的细胞，并且进行施用步骤至少2次。
33.根据权利要求22所述的方法，其中所述细胞是分离的细胞，并且所述方法还包括测量细胞中的端粒酶活性的步骤。
34.根据权利要求22所述的方法，其中所述施用步骤增强细胞中的端粒酶活性。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述端粒酶活性被瞬时增强至少5％。
36.根据权利要求34所述的方法，其中增强的端粒酶活性的半衰期不超过48小时。
37.根据权利要求34所述的方法，其中增强的端粒酶活性的半衰期为至少2小时。
38.根据权利要求22所述的方法，其中所述方法还包括测量细胞中的端粒长度的步骤。
39.根据权利要求22所述的方法，其中所述施用步骤步增加细胞的平均端粒长度。
40.根据权利要求39所述的方法，其中平均端粒长度增加至少0.1kb。
41.根据权利要求22所述的方法，其中所述细胞是分离的细胞，并且所述方法还包括测量细胞的群体倍增能力的步骤。
42.根据权利要求22所述的方法，其中所述施用步骤增强细胞的群体倍增能力。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述群体倍增能力增加至少一个群体倍增。
44.根据权利要求22所述的方法，其中所述细胞来自或存在于哺乳动物受试者中。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述细胞来自或存在于人受试者中。
46.根据权利要求22所述的方法，其中所述细胞是分离的细胞。
47.根据权利要求22所述的方法，其中所述细胞不是分离的细胞。
48.根据权利要求22所述的方法，其中所述施用步骤包括电穿孔。
49.根据权利要求22所述的方法，其中所述至少一个端粒在细胞内被瞬时延伸。
50.一种试剂盒，其用于延伸动物细胞的端粒，其包含：权利要求1-14中任一项所述的化合物或权利要求15-21中任一项所述的组合物；和
使用所述化合物或组合物延伸端粒的说明书。
51.根据权利要求50所述的试剂盒，其还包含包装材料。
52.根据权利要求51所述的试剂盒，其中所述包装材料是气密性的。
53.根据权利要求51所述的试剂盒，其中所述包装材料包含金属箔容器。
54.根据权利要求50所述的试剂盒，其还包含干燥剂。
55.根据权利要求50所述的试剂盒，其还包含培养基。
56.根据权利要求50所述的试剂盒，其还包含RNA酶抑制剂。
57.根据权利要求50所述的试剂盒，其中所述化合物或组合物是无菌的。
58.根据权利要求50所述的试剂盒，其包含：
权利要求1-14中任一项所述的化合物；
使用所述组合物延伸端粒的说明书；和
端粒酶RNA组分、递送媒介物或端粒酶RNA组分和递送媒介物。
59.一种治疗方法，其包括：
向需要端粒延伸或可从端粒延伸受益的动物受试者施用权利要求1-14中任一项所述的化合物或权利要求15-21中任一项所述的组合物。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述动物受试者患有由缩短的端粒引起的疾病或处于发生所述疾病的风险中。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述疾病选自由以下组成的组：代谢综合征、糖尿病、糖尿病性溃疡、心脏病、许多形式的癌症、血管性痴呆、阿尔茨海默症、中风、老年性黄斑变性、免疫衰老、骨髓衰竭、消化道溃疡、肝硬化、疝气、感染如继发于受损的免疫功能的肺炎、慢性感染、轻度或严重认知障碍、行动不便、骨质疏松症、骨关节炎、类风湿关节炎、年龄相关焦虑、平衡障碍、耳鸣、贝尔氏麻痹、白内障、慢性阻塞性肺疾病、角膜擦伤、冠状动脉疾病、外周动脉疾病、结膜炎、霰粒肿、脱水、抑郁症、肺气肿、眼疾病、无法茁壮成长、流感、广泛性焦虑症、青光眼、听力损失、味觉减退、食欲不振、髋关节脱位、记忆力减退、帕金森氏病、椎管狭窄、尿失禁和脊椎骨折。
62.根据权利要求59所述的方法，其中所述动物受试者患有年龄相关疾病、年龄相关病症或功能或外貌上的年龄相关衰退或处于发生所述疾病、病症或衰退的风险中。
63.根据权利要求59所述的方法，其还包括步骤：测量受试动物中的或来自其的细胞的端粒长度和如果检测到缩短的端粒长度则施用所述化合物或组合物。
64.根据权利要求63所述的方法，其中重复所述测量和施用步骤至少一次。
65.根据权利要求59所述的方法，其中所述端在所述受试动物的细胞内瞬时延伸。
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