RU2766120C2 - Соединения, композиции, способы и наборы, связанные с удлинением теломер - Google Patents
Соединения, композиции, способы и наборы, связанные с удлинением теломер Download PDFInfo
- Publication number
- RU2766120C2 RU2766120C2 RU2015140125A RU2015140125A RU2766120C2 RU 2766120 C2 RU2766120 C2 RU 2766120C2 RU 2015140125 A RU2015140125 A RU 2015140125A RU 2015140125 A RU2015140125 A RU 2015140125A RU 2766120 C2 RU2766120 C2 RU 2766120C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cell
- cells
- tert
- telomere
- modrna
- Prior art date
Links
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 title claims abstract description 296
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 title claims abstract description 296
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 title claims abstract description 296
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 134
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 49
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 91
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 583
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 claims abstract description 382
- 102100032938 Telomerase reverse transcriptase Human genes 0.000 claims abstract description 266
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 122
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 claims abstract description 79
- 230000032683 aging Effects 0.000 claims abstract description 26
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 claims abstract description 20
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims abstract description 20
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims abstract description 9
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 claims abstract description 9
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 claims abstract description 8
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 claims abstract description 3
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 40
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 39
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 39
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 33
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 30
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 30
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 18
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims description 14
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 10
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims description 9
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 9
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 9
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 7
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 claims description 7
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000035882 stress Effects 0.000 claims description 7
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 6
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 5
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 claims description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 5
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 claims description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 claims description 4
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000009894 physiological stress Effects 0.000 claims description 4
- 206010056340 Diabetic ulcer Diseases 0.000 claims description 3
- 230000036737 immune function Effects 0.000 claims description 3
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 claims description 3
- 230000008733 trauma Effects 0.000 claims description 3
- 230000006735 deficit Effects 0.000 claims description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 abstract description 24
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 abstract 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 132
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 60
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 48
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 45
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 38
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 37
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 36
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 36
- 101000655352 Homo sapiens Telomerase reverse transcriptase Proteins 0.000 description 31
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 30
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 30
- 108010057210 telomerase RNA Proteins 0.000 description 23
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 18
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 17
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 17
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 15
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 15
- -1 cationic lipid Chemical class 0.000 description 15
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 15
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 15
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 14
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 14
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 14
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 14
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 14
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 13
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 210000004924 lung microvascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 12
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 12
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 12
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 12
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 11
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 10
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 10
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 230000008943 replicative senescence Effects 0.000 description 10
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 10
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 9
- 240000001970 Raphanus sativus var. sativus Species 0.000 description 9
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 9
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 9
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 9
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 9
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 8
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 8
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 8
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 8
- 230000009758 senescence Effects 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 8
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 8
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 7
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 7
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 description 7
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 7
- 210000002985 organ of corti Anatomy 0.000 description 7
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 7
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 7
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 6
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 6
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 6
- XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N Guanosine-5'-triphosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 6
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 6
- 241000270322 Lepidosauria Species 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 229960001456 adenosine triphosphate Drugs 0.000 description 6
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 6
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 6
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000002743 insertional mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 6
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 6
- XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N rGTP Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 5
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 5
- 230000032677 cell aging Effects 0.000 description 5
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 5
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 5
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 5
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 5
- 210000002248 primary sensory neuron Anatomy 0.000 description 5
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 5
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 5-Methylcytidine Natural products O=C1N=C(N)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 5-methylcytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 0.000 description 4
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 4
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 101000899111 Homo sapiens Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 4
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 4
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 4
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 4
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 4
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 4
- 229930185560 Pseudouridine Natural products 0.000 description 4
- PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N Pseudouridine C Natural products OC1C(O)C(CO)OC1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 4
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 description 4
- WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N beta-Pseudouridine Natural products OC1OC(CN2C=CC(=O)NC2=O)C(O)C1O WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 4
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 108091008695 photoreceptors Proteins 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N pseudouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 230000003716 rejuvenation Effects 0.000 description 4
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 4
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 208000037051 Chromosomal Instability Diseases 0.000 description 3
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 3
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 3
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 3
- 201000009794 Idiopathic Pulmonary Fibrosis Diseases 0.000 description 3
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 3
- 241000283092 Loxodonta Species 0.000 description 3
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241000276569 Oryzias latipes Species 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 3
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 3
- 102100033254 Tumor suppressor ARF Human genes 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 3
- 230000003592 biomimetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 125000001369 canonical nucleoside group Chemical group 0.000 description 3
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 3
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 3
- 238000002509 fluorescent in situ hybridization Methods 0.000 description 3
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 3
- 210000001156 gastric mucosa Anatomy 0.000 description 3
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 210000004919 hair shaft Anatomy 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 3
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 3
- 208000036971 interstitial lung disease 2 Diseases 0.000 description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 210000000110 microvilli Anatomy 0.000 description 3
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 3
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- 210000000106 sweat gland Anatomy 0.000 description 3
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 3
- 210000002105 tongue Anatomy 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 210000001213 vestibule labyrinth Anatomy 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 239000000277 virosome Substances 0.000 description 3
- GJTBSTBJLVYKAU-XVFCMESISA-N 2-thiouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=S)NC(=O)C=C1 GJTBSTBJLVYKAU-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100036126 60S ribosomal protein L37a Human genes 0.000 description 2
- IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N Alexa Fluor 555 Chemical compound C=12C=CC(=N)C(S(O)(=O)=O)=C2OC2=C(S(O)(=O)=O)C(N)=CC=C2C=1C1=CC=C(C(O)=O)C=C1C(O)=O IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000019901 Anxiety disease Diseases 0.000 description 2
- 208000032467 Aplastic anaemia Diseases 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000018240 Bone Marrow Failure disease Diseases 0.000 description 2
- 206010065553 Bone marrow failure Diseases 0.000 description 2
- 229940123587 Cell cycle inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 206010062759 Congenital dyskeratosis Diseases 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 102100031249 H/ACA ribonucleoprotein complex subunit DKC1 Human genes 0.000 description 2
- 101001092424 Homo sapiens 60S ribosomal protein L37a Proteins 0.000 description 2
- 101000741885 Homo sapiens Protection of telomeres protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000800312 Homo sapiens TERF1-interacting nuclear factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 239000012098 Lipofectamine RNAiMAX Substances 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100033986 Neurotensin receptor type 1 Human genes 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 2
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 2
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 2
- 102100038745 Protection of telomeres protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 2
- 101900083372 Rabies virus Glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 102100033085 TERF1-interacting nuclear factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 2
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 2
- 201000004810 Vascular dementia Diseases 0.000 description 2
- YIJVOACVHQZMKI-JXOAFFINSA-N [[(2r,3s,4r,5r)-5-(4-amino-5-methyl-2-oxopyrimidin-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 YIJVOACVHQZMKI-JXOAFFINSA-N 0.000 description 2
- VEWJOCYCKIZKKV-GBNDHIKLSA-N [[(2r,3s,4r,5s)-5-(2,4-dioxo-1h-pyrimidin-5-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=O VEWJOCYCKIZKKV-GBNDHIKLSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 2
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000002255 anal canal Anatomy 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-L aspartate group Chemical class N[C@@H](CC(=O)[O-])C(=O)[O-] CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-L 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 125000002680 canonical nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000010094 cellular senescence Effects 0.000 description 2
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 210000000695 crystalline len Anatomy 0.000 description 2
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 2
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 201000010063 epididymitis Diseases 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 2
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 2
- 210000002980 germ line cell Anatomy 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108091005708 gustatory receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 210000002570 interstitial cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 2
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000009126 molecular therapy Methods 0.000 description 2
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 2
- 210000004699 muscle spindle Anatomy 0.000 description 2
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001706 olfactory mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 210000002394 ovarian follicle Anatomy 0.000 description 2
- 230000004792 oxidative damage Effects 0.000 description 2
- 210000001711 oxyntic cell Anatomy 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 230000000849 parathyroid Effects 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 2
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 230000009979 protective mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003007 single stranded DNA break Effects 0.000 description 2
- 210000001057 smooth muscle myoblast Anatomy 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 210000004500 stellate cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000009092 tissue dysfunction Effects 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005233 tubule cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003708 urethra Anatomy 0.000 description 2
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 2
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 2
- NNJPGOLRFBJNIW-HNNXBMFYSA-N (-)-demecolcine Chemical compound C1=C(OC)C(=O)C=C2[C@@H](NC)CCC3=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C3C2=C1 NNJPGOLRFBJNIW-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102000000872 ATM Human genes 0.000 description 1
- 102100022410 ATP-dependent DNA/RNA helicase DHX36 Human genes 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 208000000044 Amnesia Diseases 0.000 description 1
- 101100004408 Arabidopsis thaliana BIG gene Proteins 0.000 description 1
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 108010004586 Ataxia Telangiectasia Mutated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000012639 Balance disease Diseases 0.000 description 1
- 208000006373 Bell palsy Diseases 0.000 description 1
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Betaine Natural products C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 108010051479 Bombesin Proteins 0.000 description 1
- 102000013585 Bombesin Human genes 0.000 description 1
- 208000010392 Bone Fractures Diseases 0.000 description 1
- 102100025248 C-X-C motif chemokine 10 Human genes 0.000 description 1
- 101710098275 C-X-C motif chemokine 10 Proteins 0.000 description 1
- 101100494448 Caenorhabditis elegans cab-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000002177 Cataract Diseases 0.000 description 1
- 241001608562 Chalazion Species 0.000 description 1
- 101800001982 Cholecystokinin Proteins 0.000 description 1
- 102100025841 Cholecystokinin Human genes 0.000 description 1
- 108091060290 Chromatid Proteins 0.000 description 1
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000028698 Cognitive impairment Diseases 0.000 description 1
- 206010053138 Congenital aplastic anaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102100039116 DNA repair protein RAD50 Human genes 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NNJPGOLRFBJNIW-UHFFFAOYSA-N Demecolcine Natural products C1=C(OC)C(=O)C=C2C(NC)CCC3=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C3C2=C1 NNJPGOLRFBJNIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 101100485279 Drosophila melanogaster emb gene Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 206010014561 Emphysema Diseases 0.000 description 1
- 102000009025 Endorphins Human genes 0.000 description 1
- 108010049140 Endorphins Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 208000035874 Excoriation Diseases 0.000 description 1
- 102100029095 Exportin-1 Human genes 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102400000921 Gastrin Human genes 0.000 description 1
- 108010052343 Gastrins Proteins 0.000 description 1
- 206010061459 Gastrointestinal ulcer Diseases 0.000 description 1
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- 102100034411 H/ACA ribonucleoprotein complex subunit 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710167047 H/ACA ribonucleoprotein complex subunit DKC1 Proteins 0.000 description 1
- 102100027685 Hemoglobin subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 108091005902 Hemoglobin subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 206010019909 Hernia Diseases 0.000 description 1
- 208000007446 Hip Dislocation Diseases 0.000 description 1
- 101000901942 Homo sapiens ATP-dependent DNA/RNA helicase DHX36 Proteins 0.000 description 1
- 101000743929 Homo sapiens DNA repair protein RAD50 Proteins 0.000 description 1
- 101000994912 Homo sapiens H/ACA ribonucleoprotein complex subunit 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000844866 Homo sapiens H/ACA ribonucleoprotein complex subunit DKC1 Proteins 0.000 description 1
- 101000579423 Homo sapiens Regulator of nonsense transcripts 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000653533 Homo sapiens Telomerase Cajal body protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 206010023204 Joint dislocation Diseases 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 101150117895 LAMP2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150048357 Lamp1 gene Proteins 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000000637 Melanocyte-Stimulating Hormone Substances 0.000 description 1
- 108010007013 Melanocyte-Stimulating Hormones Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000026139 Memory disease Diseases 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 208000001145 Metabolic Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 101100434906 Mus musculus Angptl8 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100496858 Mus musculus Colec12 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100523604 Mus musculus Rassf5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000428199 Mustelinae Species 0.000 description 1
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O N,N,N-trimethylglycinium Chemical compound C[N+](C)(C)CC(O)=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 108700022034 Opsonin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102400000050 Oxytocin Human genes 0.000 description 1
- 101800000989 Oxytocin Proteins 0.000 description 1
- XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N Oxytocin Natural products N1C(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C1CC1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 208000005764 Peripheral Arterial Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000030831 Peripheral arterial occlusive disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N PicoGreen Chemical compound CN(C)CCCN(CCCN(C)C)C1=CC(=CC2=[N+](C3=CC=CC=C3S2)C)C2=CC=CC=C2N1C1=CC=CC=C1 ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150054142 Pinx1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 208000008425 Protein deficiency Diseases 0.000 description 1
- 229940123573 Protein synthesis inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 108010071563 Proto-Oncogene Proteins c-fos Proteins 0.000 description 1
- 102000007568 Proto-Oncogene Proteins c-fos Human genes 0.000 description 1
- 206010071368 Psychological trauma Diseases 0.000 description 1
- 102000000528 Pulmonary Surfactant-Associated Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010041520 Pulmonary Surfactant-Associated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020005073 RNA Cap Analogs Proteins 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 102100028287 Regulator of nonsense transcripts 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100485284 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) CRM1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010086019 Secretin Proteins 0.000 description 1
- 102100037505 Secretin Human genes 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 108091081400 Subtelomere Proteins 0.000 description 1
- 229940126530 T cell activator Drugs 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100030629 Telomerase Cajal body protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010033710 Telomeric Repeat Binding Protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000007316 Telomeric Repeat Binding Protein 2 Human genes 0.000 description 1
- SEQDDYPDSLOBDC-UHFFFAOYSA-N Temazepam Chemical compound N=1C(O)C(=O)N(C)C2=CC=C(Cl)C=C2C=1C1=CC=CC=C1 SEQDDYPDSLOBDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 208000009205 Tinnitus Diseases 0.000 description 1
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000723792 Tobacco etch virus Species 0.000 description 1
- 108010039203 Tripeptidyl-Peptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100034197 Tripeptidyl-peptidase 1 Human genes 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 206010046543 Urinary incontinence Diseases 0.000 description 1
- 208000036826 VIIth nerve paralysis Diseases 0.000 description 1
- GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N Vasopressin Natural products N1C(=O)C(CC=2C=C(O)C=CC=2)NC(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1CC1=CC=CC=C1 GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010004977 Vasopressins Proteins 0.000 description 1
- 102000002852 Vasopressins Human genes 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 1
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 101150094313 XPO1 gene Proteins 0.000 description 1
- 201000000690 abdominal obesity-metabolic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000005299 abrasion Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 210000003486 adipose tissue brown Anatomy 0.000 description 1
- 210000000593 adipose tissue white Anatomy 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000001919 adrenal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001800 adrenalinergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 206010064930 age-related macular degeneration Diseases 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002383 alveolar type I cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000004596 appetite loss Effects 0.000 description 1
- KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N argipressin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N1)=O)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)C1=CC=CC=C1 KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002453 autonomic neuron Anatomy 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002947 bartholin's gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- DNDCVAGJPBKION-DOPDSADYSA-N bombesin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1NC2=CC=CC=C2C=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C(C)C)C1=CN=CN1 DNDCVAGJPBKION-DOPDSADYSA-N 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000000233 bronchiolar non-ciliated Anatomy 0.000 description 1
- 210000002533 bulbourethral gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 210000001011 carotid body Anatomy 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007348 cell dedifferentiation Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000006727 cell loss Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000003986 cell retinal photoreceptor Anatomy 0.000 description 1
- 210000000250 cementoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000001431 cementocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N chembl413654 Chemical compound C([C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000004691 chief cell of stomach Anatomy 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940107137 cholecystokinin Drugs 0.000 description 1
- 230000001713 cholinergic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003737 chromaffin cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004756 chromatid Anatomy 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000011278 co-treatment Methods 0.000 description 1
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 210000002777 columnar cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 201000004425 congenital hypoplastic anemia Diseases 0.000 description 1
- 230000006552 constitutive activation Effects 0.000 description 1
- 230000037011 constitutive activity Effects 0.000 description 1
- 210000000555 contractile cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000014510 cooky Nutrition 0.000 description 1
- 208000021921 corneal disease Diseases 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004246 corpus luteum Anatomy 0.000 description 1
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 1
- 210000001257 corticotroph Anatomy 0.000 description 1
- 230000003131 corticotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000007711 cytoplasmic localization Effects 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007402 cytotoxic response Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003074 dental pulp Anatomy 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 210000001038 distal kidney tubule Anatomy 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000002183 duodenal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 208000009356 dyskeratosis congenita Diseases 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 210000001162 elastic cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 1
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000222 eosinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005175 epidermal keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003426 epidermal langerhans cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003499 exocrine gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 108700002148 exportin 1 Proteins 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000000744 eyelid Anatomy 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 210000000968 fibrocartilage Anatomy 0.000 description 1
- 210000004904 fingernail bed Anatomy 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 1
- 210000001282 glomerular podocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 210000002175 goblet cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004368 gonadotroph Anatomy 0.000 description 1
- 230000001456 gonadotroph Effects 0.000 description 1
- 210000003772 granulosa lutein cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 239000007952 growth promoter Substances 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 210000002768 hair cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000010370 hearing loss Effects 0.000 description 1
- 231100000888 hearing loss Toxicity 0.000 description 1
- 208000016354 hearing loss disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004024 hepatic stellate cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000002557 hidradenitis Diseases 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 210000003035 hyaline cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 1
- 210000000067 inner hair cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 210000001613 integumentary system Anatomy 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000012332 laboratory investigation Methods 0.000 description 1
- 210000004561 lacrimal apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 210000001756 lactotroph Anatomy 0.000 description 1
- 230000001381 lactotroph Effects 0.000 description 1
- 210000001542 lens epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002332 leydig cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000000210 loop of henle Anatomy 0.000 description 1
- 208000019017 loss of appetite Diseases 0.000 description 1
- 235000021266 loss of appetite Nutrition 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000001730 macula densa epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000006984 memory degeneration Effects 0.000 description 1
- 208000023060 memory loss Diseases 0.000 description 1
- 210000000716 merkel cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003584 mesangial cell Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 230000002025 microglial effect Effects 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000002395 mineralocorticoid Substances 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008450 motivation Effects 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000282 nail Anatomy 0.000 description 1
- 230000004719 natural immunity Effects 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000001719 neurosecretory cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004882 non-tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000030147 nuclear export Effects 0.000 description 1
- 230000025308 nuclear transport Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000002417 nutraceutical Substances 0.000 description 1
- 235000021436 nutraceutical agent Nutrition 0.000 description 1
- 210000004416 odontoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000002560 odontocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001517 olfactory receptor neuron Anatomy 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002380 oogonia Anatomy 0.000 description 1
- 230000021368 organ growth Effects 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 1
- 210000004409 osteocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004663 osteoprogenitor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N oxytocin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](N)C(=O)N1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N 0.000 description 1
- 229960001723 oxytocin Drugs 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 210000000277 pancreatic duct Anatomy 0.000 description 1
- 210000002705 pancreatic stellate cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002655 parathyroid chief cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000002263 peptidergic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003668 pericyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002856 peripheral neuron Anatomy 0.000 description 1
- 210000004332 phalangeal cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 229940037129 plain mineralocorticoids for systemic use Drugs 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004043 pneumocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000000272 proprioceptive effect Effects 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 210000005267 prostate cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000007 protein synthesis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000003370 receptor cell Anatomy 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 102000053632 repetitive DNA sequence Human genes 0.000 description 1
- 108091035233 repetitive DNA sequence Proteins 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000028617 response to DNA damage stimulus Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002976 reverse transcriptase assay Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 210000004116 schwann cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001732 sebaceous gland Anatomy 0.000 description 1
- 229960002101 secretin Drugs 0.000 description 1
- OWMZNFCDEHGFEP-NFBCVYDUSA-N secretin human Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(N)=O)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 OWMZNFCDEHGFEP-NFBCVYDUSA-N 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 210000000697 sensory organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008786 sensory perception of smell Effects 0.000 description 1
- 230000014860 sensory perception of taste Effects 0.000 description 1
- 230000009919 sequestration Effects 0.000 description 1
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 description 1
- 210000000717 sertoli cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M sodium;3-acetamido-5-[acetyl(methyl)amino]-2,4,6-triiodobenzoate;(2r,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound [Na+].CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I.O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- 210000001875 somatotroph Anatomy 0.000 description 1
- 230000009295 sperm incapacitation Effects 0.000 description 1
- 206010041569 spinal fracture Diseases 0.000 description 1
- 208000005198 spinal stenosis Diseases 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 230000033863 telomere maintenance Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 1
- 210000003684 theca cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001000 thyrotroph Anatomy 0.000 description 1
- 231100000886 tinnitus Toxicity 0.000 description 1
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 1
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 229960003726 vasopressin Drugs 0.000 description 1
- 230000004304 visual acuity Effects 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 239000008207 working material Substances 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7115—Nucleic acids or oligonucleotides having modified bases, i.e. other than adenine, guanine, cytosine, uracil or thymine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/45—Transferases (2)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/22—Anxiolytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/24—Antidepressants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
- A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
- A61P27/12—Ophthalmic agents for cataracts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/16—Otologicals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1276—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. reverse transcriptase or telomerase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12Y207/07049—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. telomerase or reverse-transcriptase
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Virology (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ удлинения теломер. В клетку животного вводят соединение, содержащее синтетическую рибонуклеиновую кислоту, кодирующую обратную транскриптазу теломеразы, в результате чего обратная транскриптаза теломеразы временно экспрессируется в клетке. Указанная рибонуклеиновая кислота содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеозид, который снижает иммуногенность рибонуклеиновой кислоты. По меньшей мере один уридин, содержащийся в указанной синтетической рибонуклеиновой кислоте, заменен на модифицированный уридин. Изобретение обеспечивает быстрое и безопасное удлинение теломер без риска, связанного с инсерционным мутагенезом, приводящее к замедлению старения и повышению пролиферативного потенциала клеток без их иммортализации. 28 з.п. ф-лы, 35 ил., 9 табл., 7 пр.
Description
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ
[0001] Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США №61/768047, поданной 22 февраля 2013 г., содержание которой в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Теломеры содержат повторяющиеся последовательности ДНК на концах линейных хромосом, которые в случае, если они имеют достаточную длину, делают возможным образование каждым концом хромосомы петли, защищающей концы от выполнения функции разрывов двухцепочечной или одноцепочечной ДНК. Artandi & DePinho (2010) Carcinogenesis 31:9-18. Со временем теломеры укорачиваются частично вследствие окислительного повреждения и неполной репликации ДНК, что в итоге приводит к критическому укорочению теломер и неспособности образовывать защитные петли, обнажению концов хромосом, слиянию между хромосомами, ответам на повреждение ДНК и клеточному старению, апоптозу или злокачественным образованиям. O'Sullivan and Karlseder (2010) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11:171-181; Calado el al. (2012) Leukemia 26:700-707; Artandi and DePinho (2010) Carcinogenesis 31:9-18.
[0003] Ферментативный комплекс теломераза удлиняет теломеры и содержит два основных компонента: обратную транскриптазу теломеразы (TERT) и РНК-компонент, известный как РНК-компонент теломеразы (TERC). Другие компоненты комплекса теломеразы включают белки ТСАВ1, Dyskerin, Garl, Nhp2, NoplO, и RHAU. Brouilette el al. (2003) Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 23:842-846. TERT представляет собой ограничивающий компонент комплекса теломеразы и, следовательно, лечение, включающее повышение уровня TERT, может повышать активность теломеразы. Активность теломеразы, как правило, определяют, используя протокол амплификации теломерных повторов (TRAP), в котором количественно оценивают способность клеточного лизата или другого образца удлинять синтетическую теломероподобную последовательность ДНК.
[0004] Как и ожидается в связи с важностью сохранения длины теломер для предотвращения клеточного старения и апоптоза и возникающей в результате клеточной дисфункции, генетические мутации TERT и TERC связаны с фатальными наследственными заболеваниями, связанными с нарушением сохранения теломер, включая формы идиопатического легочного фиброза, врожденного дискератоза и апластической анемии. Эффект преждевременного клеточного старения и апоптоза вследствие укорочения теломер при этих заболеваниях сам по себе является пагубным и может усугубляться повышенным риском появления рака. Artandi and DePinho (2010) Carcinogenesis 31:9-18; Alter el al. (2009) Blood 113:6549-6557. Кроме многочисленных коррелирующих между собой данных, связывающих наличие коротких теломер с раком (Wentzensen et al. (2011) Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 20:1238-1250), исследования апластической анемии предоставляют первые прямые свидетельства того, что критическое укорочение теломер и обусловленная этим хромосомная нестабильность приводят к предрасположенности клеток к злокачественному перерождению у людей (Calado et al. (2012) Leukemia 26:700-707). Существуют свидетельства, что короткие теломеры определяют развитие фатальной или нефатальной мышечной дистрофии (Sacco et al. (2010) Cell 143:1059-1071), а удлинение теломер предотвращает старение эндотелиальных клеток (Matsushita et al. (2001) Cire. Res. 89:793-798), которое связано с атеросклерозом, повышенным кровяным давлением и заболеванием сердца (Perez-Rivero et al. (2006) Circulation 114:309-317). Кроме роли в этих и других заболеваниях, короткие теломеры также ограничивают амплификацию клеток для клеточной терапии и применений в биоинженерии. Mohsin et al. (2012) Journal of the American College of Cardiology doi: 10.1016/j.jacc.2012.04.0474.
[0005] Полученный из натурального продукта активатор теломераз, ТА-65®, продавался на коммерческой основе в качестве нутрицевтика компанией Т.А. Sciences, Inc. Harley et al. (2011) Rejuvenation Research 14:45-56. Это соединение предположительно содержит эндогенный ген hTERT, тем самым активируя экспрессию нативной теломеразы. При этом непонятно, как этот вид лечения преодолевает проблему нормальной регуляции активности нативной теломеразы.
[0006] Человеческие клетки со слабой или отсутствующей теломеразной активностью трансфицировали векторами, кодирующими человеческую TERT (hTERT). Смотрите, например, Bodnar el al. (1998) Science 279:349-352. Было обнаружено, что трансфицированные клетки экспрессируют теломеразу, демонстрируют удлинение теломер, активно делятся и демонстрируют сниженное старение по сравнению с клетками с отсутствием теломеразы, но геномная модификация, являющаяся следствием этого лечения, повышает риск и ограничивает применение данного подхода.
[0007] Ограниченная способность к репликации является одной из основополагающих характеристик большинства нормальных клеток. Конечной точкой этого ограниченного репликативного процесса является старение - законсервированное состояние, в котором клетка остается жизнеспособной, но более не делится. Старые клетки часто характеризуются измененным профилем генной экспрессии, измененной морфологией и сниженной способностью или неспособностью выполнять свои нормальные функции.
[0008] Укорочение теломер играет непосредственную роль в клеточном старении в тканях животных во время старения. Кроме того, накапливаются свидетельства взаимосвязи коротких теломер и различных заболеваний, включая те, которые были описаны выше. Возможность предотвращения заболевания посредством удлинения теломер обуславливает необходимость в безопасных и эффективных видах лечения, направленных на удлинение теломер в клетках животных in vivo и/или in vitro. Кроме того, существует потребность в безопасном и быстром удлинении теломер в клетках для применения в клеточной терапии, клеточной и тканевой инженерии и регенеративной медицине.
[0009] В то же время, однако, существует опасность конститутивной активации теломеразной активности. Действительно, для применений в клеточной терапии первостепенное значение имеет предотвращение риска иммортализации клеток. В связи с этим в целях безопасности преимущественной может являться скорее временная, чем конститутивная теломеразная активность, в особенности, если повышенная теломеразная активность является не только краткосрочной, но также удлиняет теломеры достаточно быстро для того, чтобы отсутствовала необходимость постоянно повторять лечение. Существующие в настоящее время способы удлинения теломер включают вирусную доставку TERT под управлением индуцибельного промотора, доставку TERT с применением векторов на основе аденовируса и аденоассоциированного вируса и применение низкомолекулярных активаторов теломеразы. Эти способы связаны с риском инсерционного мутагенеза, непрерывного повышения теломеразной активности или с ними обоими.
[0010] Таким образом, существует сильная мотивация для разработки терапии, которая безопасно удлиняет теломеры, для потенциального предотвращения, замедления, облегчения или лечения этих и других патологических состояний и заболеваний, для осуществления того же в отношении постепенного ухудшения физической формы и функции, а также умственной функции, которое сопутствует возрастному старению, и для возможности осуществления терапии и регенеративной медицины. Такая терапия была бы очень востребована для омоложения всех животных, включая людей, домашних животных, сельскохозяйственных животных, животных из зоопарков и животных, которые относятся к исчезающим видам.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0011] Настоящее изобретение направлено на эти и другие проблемы и предлагает альтернативный вариант, преимуществом которого является кратковременное повышение теломеразной активности в комбинации с быстрым удлинением теломер, вследствие чего снимается необходимость в непрерывном или даже часто повторяемом лечении и отсутствует риск, связанный с геномным инсерционным мутагенезом. В частности, в данном изобретении предложены композиции, способы и наборы для удлинения теломер путем временной трансляции экзогенной теломеразной активности в клетке.
[0012] В одном аспекте в данном изобретении предложены соединения для удлинения теломер, содержащие: синтетическую рибонуклеиновую кислоту, содержащую по меньшей мере один модифицированный нуклеозид и кодирующую обратную транскриптазу теломеразы; при этом в клетке, обрабатываемой указанным соединением, происходит удлинение теломер.
[0013] В некоторых вариантах реализации изобретения обратная транскриптаза теломеразы представляет собой обратную транскриптазу теломеразы млекопитающего, птицы, рептилии или рыбы или вариант, который сохраняет теломеразную каталитическую активность, а в конкретном варианте реализации изобретения она представляет собой обратную транскриптазу теломеразы человека.
[0014] В некоторых вариантах реализации изобретения рибонуклеиновая кислота содержит 5'-кэп, 5'-нетранслируемую область, З'-нетранслируемую область и поли(А)-хвост. 5'-кэп может быть неиммуногенным и 5'-кэп может быть обработан фосфатазой.
[0015] В предпочтительных вариантах реализации изобретения поли(А)-хвост повышает стабильность рибонуклеиновой кислоты.
[0016] В других предпочтительных вариантах реализации изобретения 5'-нетранслируемая область или 3'-нетранслируемая область содержит последовательность из стабильной мРНК или эффективно транслируемой мРНК, или они обе содержат последовательность из стабильной мРНК или эффективно транслируемой мРНК.
[0017] В других предпочтительных вариантах реализации изобретения 5'-кэп, 3'-нетранслируемая область или 3'-нетранслируемая область стабилизирует рибонуклеиновую кислоту, повышает скорость трансляции рибонуклеиновой кислоты или модулирует иммуногенность рибонуклеиновой кислоты.
[0018] В наиболее предпочтительных вариантах реализации изобретения по меньшей мере один нуклеозид модулирует иммуногенность рибонуклеиновой кислоты.
[0019] В некоторых вариантах реализации изобретения рибонуклеиновая кислота представляет собой очищенную синтетическую рибонуклеиновую кислоту.
[0020] В предпочтительных вариантах реализации изобретения синтетическая рибонуклеиновая кислота очищена с целью удаления иммуногенных компонентов.
[0021] В конкретных вариантах реализации изобретения рибонуклеиновая кислота кодирует обратную транскриптазу теломеразы человека, кошки, собаки, мыши, лошади, коровы, овцы, свиньи, африканского слона, курицы, крысы, данио, японской медаки или шимпанзе или полипептид, обладающий по меньшей мере 95% идентичности последовательности с обратной транскриптазой теломеразы.
[0022] В другом аспекте в данном изобретении предложены композиции, содержащие соединение согласно изобретению и РНК-компонент теломеразы, который, в некоторых вариантах реализации изобретения представляет собой РНК-компонент теломеразы млекопитающего, птицы, рептилии или рыбы. В более конкретных вариантах реализации изобретения РНК-компонент теломеразы представляет собой РНК-компонент теломеразы человека. В некоторых вариантах реализации изобретения соединения и композиции согласно изобретению дополнительно содержат носитель для доставки.
[0023] В некоторых вариантах реализации изобретения носитель для доставки представляет собой экзосому, липидную наночастицу, полимерную наночастицу, природную или искусственную липопротеиновую частицу, катионный липид, белок, комплекс белок-нуклеиновая кислота, липосому, виросому или полимер. В конкретных вариантах реализации изобретения носитель для доставки представляет собой катионный липид.
[0024] В предпочтительных вариантах реализации изобретения носитель для доставки является неиммуногенным. В других предпочтительных вариантах реализации изобретения носитель для доставки является частично иммуногенным. В частности в некоторых обстоятельствах желательно, чтобы носитель сохранял некоторую степень иммуногенности.
[0025] В соответствии с другим аспектом данного изобретения предложены способы удлинения теломер, включающие этап введения любого из раскрытых соединений или композиций в клетку животного, при этом происходит удлинение по меньшей мере одной теломеры в клетке.
[0026] В некоторых вариантах реализации способов изобретения клетка содержит по меньшей мере одну укороченную теломеру перед этапом введения.
[0027] В некоторых вариантах реализации изобретения клетка получена от или принадлежит субъекту, страдающему от или подверженному риску развития возрастного заболевания, возрастного патологического состояния или возрастного ухудшения функциональности или внешнего вида.
[0028] В некоторых вариантах реализации изобретения клетка получена от или принадлежит субъекту, страдающему от или подверженному риску развития рака, заболевания сердца, инсульта, диабета, диабетических язв, болезни Альцгеймера, остеопороза, ухудшения физических данных или внешнего вида, физической травмы или хронического физического стресса, физиологической травмы или хронического физиологического стресса, снижения иммунной функции, старения иммунной системы или макулярной дегенерации.
[0029] В некоторых вариантах реализации изобретения клетка представляет собой соматическую клетку эндодермальной, мезодермальной или эктодермальной линии дифференцировки, или зародышевой линии, или эмбриональную клетку.
[0030] В некоторых вариантах реализации изобретения клетка представляет собой индуцированную плюрипотентную стволовую клетку или клетку, применяемую для получения индуцированной плюрипотентной стволовой клетки.
[0031] В некоторых вариантах реализации изобретения клетка представляет собой трансдифференцированную клетку или клетку, применяемую для получения трансдифференцированной клетки.
[0032] В некоторых вариантах реализации изобретения клетка представляет собой выделенную клетку, а этап введения длится не более 48 часов. В других вариантах реализации изобретения клетка представляет собой выделенную клетку, а этап введения длится по меньшей мере 2 часа.
[0033] В некоторых вариантах реализации изобретения клетка представляет собой выделенную клетку, а этап введения осуществляют не более четырех раз. В других вариантах реализации изобретения клетка представляет собой выделенную клетку, а этап введения осуществляют по меньшей мере два раза.
[0034] В некоторых вариантах реализации изобретения клетка представляет собой выделенную клетку, а способ дополнительно включает этап измерения теломеразной активности в клетке. В конкретных вариантах реализации изобретения этап введения приводит к повышению теломеразной активности в клетке, а в более конкретных вариантах реализации изобретения теломеразная активность временно повышается по меньшей мере на 5%. В других конкретных вариантах реализации изобретения время полужизни повышенной теломеразной активности составляет не более 48 часов.
[0035] В некоторых вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает этап измерения длины теломер в клетке. В конкретных вариантах реализации изобретения средняя длина теломер увеличивается по меньшей мере на 0,1 т.п.н.
[0036] В некоторых вариантах реализации изобретения клетка представляет собой выделенную клетку, а способ дополнительно включает этап измерения потенциала удвоения популяции в клетке. В конкретных вариантах реализации изобретения потенциал удвоения популяции увеличивается в некоторых случаях по меньшей мере на одно удвоение популяции.
[0037] В предпочтительных вариантах реализации изобретения клетка получена от млекопитающего субъекта, а в более предпочтительных вариантах реализации изобретения клетка получена от субъекта-человека.
[0038] В некоторых вариантах реализации изобретения клетка представляет собой выделенную клетку, а в других вариантах реализации изобретения клетка не является выделенной клеткой. В некоторых вариантах реализации изобретения этап введения включает электропорацию. В некоторых вариантах реализации изобретения происходит временное удлинение по меньшей мере одной теломеры в клетке.
[0039] В соответствии с другим аспектом изобретения предложены наборы для удлинения теломер в клетке животного, при этом наборы содержат любое из вышеуказанных соединений или композиций и инструкции по применению соединения или композиции для удлинения теломер.
[0040] В некоторых вариантах реализации изобретения наборы дополнительно содержат упаковочные материалы. В некоторых конкретных вариантах реализации изобретения упаковочные материалы являются воздухонепроницаемыми. В некоторых конкретных вариантах реализации изобретения упаковочные материалы включают контейнер из металлической фольги.
[0041] В некоторых вариантах реализации изобретения наборы дополнительно содержат осушитель, культуральную среду или ингибитор РНКазы.
[0042] В некоторых вариантах реализации изобретения композиция является стерильной. В некоторых вариантах реализации изобретения набор содержит соединение согласно изобретению, инструкции по применению композиции для удлинения теломер и РНК-компонент теломеразы, носитель для доставки или как РНК-компонент теломеразы, так и носитель для доставки.
[0043] В другом аспекте в изобретении предложены способы лечения, включающие введение соединения или композиции согласно изобретению субъекту-животному, который нуждается или для которого может оказаться полезным удлинение теломер. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект-животное страдает от или подвержено риску развития заболевания или патологического состояния, обусловленного укорочением теломер.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0044] Фигура 1. Трансфекция клеток MRC-5 модифицированной рибонуклеиновой кислотой (модРНК), кодирующей TERT, но не каталитически неактивную TERT (CI TERT), временно повышает теломеразную активность, (а) Схематическое изображение конструкта модРНК и подхода, применяемого в этих исследованиях. Конструкт модРНК кодирует человеческую TERT и содержит 5' и 3' НТО, которые придают стабильность, например, из мРНК β-глобина. CI TERT содержит мутацию одной п.н. (b) Трансфекция модРНК TERT или CI TERT приводит к повышению уровней экзогенной мРНК TERT в обрабатываемых клетках в отличие от необрабатываемых контрольных клеток, которые превышают уровни эндогенной РНК TERT. (с) Уровни белка, распознаваемого анти-TERT антителом, значительно выше в клетках MRC-5 через 24 часа после трансфекции модРНК, кодирующей TERT или CI TERT (Ρ<0,03 или 0,01, соответственно), чем в случае необработанных или обработанных только носителем клетках, (d) Обработка модРНК, кодирующей TERT, но не CI TERT, приводит к временному повышению теломеразной активности в клетках MRC-5.
[0045] Фигура 2. Применение экзосом в качестве носителя для доставки для терапевтических средств на основе рибонуклеиновой кислоты.
[0046] Фигура 3. Графическая иллюстрация применения множественной быстрой и временной теломеразной обработки для удлинения теломер в клетке.
[0047] Фигура 4. Обработка модРНК TERT приводит к быстрому удлинению теломер в клетках MRC-5. (а) Обработка и схема анализа, применяемая в этих исследованиях. Обработка длилась 5 часов. (b) Иллюстрация саузерн-блоттинга TRF (вставка) и его количественная оценка, в которой хемолюминесцентный сигнал нормировали, чтобы учесть количество зондов на единицу длины теломеры, после чего строили график зависимости средней интенсивности каждого элементного ряда в каждой гелевой дорожке от длины теломеры (n=3 биологических реплики для каждой обработки), (с) Распределение по средней длине теломер на Фигуре 4b, указывающее на то, что теломеры в клетках, обработанных модРНК TERT, значительно (Р<0,014) длиннее, чем в необработанных или обработанных одним носителем клетках, (d) Содержание теломер, имеющих длину, превышающую произвольный порог (4,2 т.п.н.), выше в клетках, обработанных модРНК TERT, чем в необработанных или обработанных одним носителем клетках, (е) Типовая флуоресцентная микрофотография метафазной пластинки фибробластов MRC-5, применяемой в количественной in situ гибридизации (Q-FISH) для сравнения длин теломер, иллюстрирующая теломерный зонд (светлые пятнистые участки) и ДНК (однородные затененные области), (f) Количественный анализ Q-FISH измерений длины теломер в обработанных и контрольных клетках (n=15 клеток для каждой из двух биологических реплик для каждой), иллюстрирующий быстрое удлинение теломер в обработанных клетках. (Следует отметить, что TRF позволяет определять длину как теломерной, так и субтеломерной ДНК, в то время как Q-FISH позволяет оценить только теломерную ДНК, что объясняет разницу в результатах Q-FISH и TRF). (g) (i) Стандартная кривая, отображающая взаимосвязь между кумулятивным удвоением популяции клеток MRC-5 после поступления от поставщика и длиной теломер, измеренной при помощи Q-FISH путем количественной оценки средней общей флуоресценции теломерных зондов на клетку, которая прямо пропорциональна длине теломер. (g) (ii) Количественная оценка средней длины теломер на клетку в клетках MRC-5, три раза обработанных модРНК TERT через 48-часовые интервалы, согласно данным Q-FISH.
[0048] Фигура 5. Кратковременная обработка модРНК TERT дозозависимым образом повышает способность к репликации, но не приводит к иммортализации клеток MRC-5. (а) Кривые роста клеток, обработанных модРНК TERT один раз, дважды или трижды или трижды с последующей дополнительной обработкой через 8 недель после первой обработки. Контрольные образцы или не обрабатывали или обрабатывали только носителем или CI TERT четырежды, (n=3 для каждой обработки). (b) Кривые роста клеток, обработанных модРНК TERT и РНК TERC в молярном соотношении 1:5 (n=3). (с) Обработка один раз, дважды или трижды модРНК TERT дозозависимым образом обеспечивает дополнительную способность к репликации клеток MRC-5 по сравнению с необработанными клетками. Постепенное повышение пролиферативного потенциала, обеспечиваемого второй и третьей обработками, проводимыми через 48 часов после первой обработки, не настолько велико, как повышение пролиферативного потенциала, обеспечиваемого первой обработкой; при этом дополнительная четвертая обработка, проводимая через несколько недель после первых трех обработок, обеспечивает такой же дополнительный пролиферативный потенциал, как и первая обработка, что свидетельствует о том, что время обработки важно для оптимизации величины пролиферативного потенциала, обеспечиваемого обработкой. Обработка трижды совместно модРНК TERT и модРНК TERC в молярном соотношении 1:5 обеспечивает более высокий пролиферативный потенциал, чем обработка одной модРНК TERT. Обработка одним носителем или модРНК CI TERT не обеспечивает дополнительный пролиферативный потенциал, (n=3).
[0049] Фигура 6. Высокая эффективность трансфекции клеток MRC-5, обработанных модРНК, кодирующей ядерный ЗФБ (яЗФБ). (а) Процентная доля клеток с флуоресценцией, превышающей на более чем два СО среднюю величину для необработанных клеток (n=10000). (b) Средняя флуоресценция (n=10000). (с) Флуоресцентная микрофотография яЗФБ в трансфицированных клетках MRC-5 с контрокрашиванием DAPI.
[0050] Фигура 7. График доза-ответ теломеразной активности.
[0051] Фигура 8. Обработка модРНК TERT замедляет клеточный отек в клетках MRC-5. (а) Клетки MRC-5 из ранних пассажей (слева) имеют в несколько раз меньшую площадь, чем клетки в более поздних пассажах (справа), как проиллюстрировано на типовых микрофотографиях необработанных клеток PD 2 и PD 53, как видно на гемоцитометре. (b) Клетки MRC-5 из раннего (PD 2) и среднего (PD 35) пассажа демонстрировали слабый клеточный отек с диаметром, превышающим 25 мкм согласно визуальному наблюдению на гемоцитометре (где одна небольшая клетка имеет длину 50 мкм), в то время как существенно большая фракция клеток из позднего пассажа (PD 53) характеризовалась клеточным отеком. Клетки PD 53, которые были обработаны модРНК TERT, в отличие от тех, которые были обработаны модРНК CI TERT, в PD 40 демонстрировали слабый клеточный отек.
[0052] Фигура 9. Кривая роста клеток микрососудистого эндотелия человека (HMDEC).
[0053] Фигура 10. Влияние обработки модРНК TERT на количество клеток HMDEC. СО: контрольная обработка; hTERT-CI: каталитически неактивная hTERT; hTERT-WT: hTERT дикого типа.
[0054] Фигура 11. Влияние обработки модРНК TERT на рост HMDEC. UT: необработанные; СО: контрольная обработка; CI: каталитически неактивная hTERT; WT: hTERT дикого типа.
[0055] Фигура 12. Влияние обработки модРНК TERT на старение HMDEC. NT: необработанные; hTERT-CI: каталитически неактивная hTERT; hTERT-WT: hTERT дикого типа.
[0056] Фигура 13. Повышение уровня белка TERT и теломеразной активности после доставки модифицированной мРНК TERT. (А) Схематическое изображение модифицированной мРНК, содержащей кодирующую последовательность полноразмерной функциональной формы TERT или каталитически неактивной (CI) формы TERT, фланкируемой нетранслируемыми областями (НТО) НВВ и 151-нуклеотидным поли(А)-хвостом, синтезированной с применением модифицированных нуклеотидов псевдоуридина и 5-метилцитидина. (В) Эффективность трансфекции миобластов (n=2000), обработанных 0,8 мкг/мл модифицированной мРНК, кодирующей ЗФБ, определенная методом проточной цитометрии, через 24 ч после трансфекции превышала 95% (дополнительные графики на Фигуре 16А). (С) Общие уровни белка TERT определяли методом количественного вестерн-блоттинга (панель С, слева; Фигура 17). Количественная оценка уровней белка TERT через 24 часа после трансфекции 1 мкг/мл мРНК TERT или CI TERT (n=3). Количественную оценку белка TERT в ответ на разные дозы мРНК проводили на одноклеточном уровне методом проточной цитометрии (n=10000) (панель С, справа). *Р<0,05, **Р<0,01 по сравнению с необработанными клетками. «Усы» представляют s.e.m. (D) Выявление теломеразной активности в фибробластах и миобластах, трансфицированных 1 мкг/мл модифицированной мРНК TERT, осуществляемое с применением протокола амплификации теломерных повторов (TRAP). Стрелкой указаны внутренние контрольные образцы для определения эффективности ПЦР.
[0057] Фигура 14. Увеличение длины теломер и пролиферативного потенциала после доставки модифицированной мРНК TERT (модРНК). (А) Средняя длина теломер в необработанных фибробластах со временем уменьшалась согласно данным ММкПЦР и SpectraCell (коэффициент корреляции 0,97, Ρ<0,001). Эксперимент повторяли дважды с четырьмя техническими репликами в каждом. (В) Средняя длина теломер в фибробластах, трансфицированных 1 мкг/мл модРНК TERT, мРНК CI TERT или одним носителем один, два или три раза подряд с 48-часовым интервалом. Эксперимент повторяли дважды с четырьмя техническими репликами в каждом. **Р<0,01, ***Р<0,001 по сравнению с клетками, обработанными одним носителем. (С) Средняя длина теломер в миобластах, обработанных аналогично (В). Эксперимент повторяли дважды с четырьмя техническими репликами в каждом. ***Р<0,001 по сравнению с клетками, обработанными одним носителем. (D) Кривые роста фибробластов, обработанных аналогично (В), где зеленые стрелки указывают на время обработки. Кривые роста получали дважды, при этом каждую популяцию культивировали в трех параллелях. Способность к репликации возрастала дозозависимым образом (правая панель). *Р<0,05, **Р<0,01 по сравнению с клетками, обработанными одним носителем. (Е) Потенциал пролиферации миобластов, обработанных аналогично (В) (зеленые стрелки). Кривые роста получали дважды, при этом каждую популяцию культивировали в трех параллелях. Все данные представлены в виде среднего ± s.e.m.
[0058] Фигура 15. Временное снижение уровней ассоциированных со старением маркеров после доставки модифицированной мРНК TERT. (А) Количественная оценка β-gal-экспрессирующих фибробластов после трансфекции модифицированной мРНК TERT три раза подряд с 48-часовым интервалом (зеленые стрелки). Контрольные клетки, содержащие необработанные, обработанные только носителем и мРНК CI TERT популяции, прекращали размножаться в PD 53, а обработанные модРНК TER Τ популяции прекращали размножаться в PD 80. Каждый эксперимент проводили дважды с>50 клеток на образец, подсчитываемых вручную. Типовые изображения иллюстрируют β-гал-окрашенные обработанные модРНК TERT фибробласты в PD 53 (вверху) и PD 80 (внизу). Длина масштабной метки составляет 200 мкм. (В) Количественная оценка экспрессии β-гал в миобластах, обработанных аналогично (А). Контрольные образцы такие же, как в (А). Контрольные и обработанные модРНК TERT популяции прекращали размножаться в PD 8 и PD 11, соответственно. Каждый эксперимент проводили дважды с>50 клеток на образец, подсчитываемых вручную. Типовые изображения иллюстрируют миобласты в PD 2 (вверху) и обработанные модРНК TERT миобласты в PD 11 (внизу). (С) Количественная оценка увеличенных клеток, ассоциируемых с репликативным старением, в фибробластах, трижды трансфицированных модифицированной мРНК TERT. Популяционные плато такие же, как в (А). Контрольные образцы представляют собой образцы, обработанные только носителем и мРНК CI TERT. Каждый эксперимент проводили дважды с>50 клеток на образец, подсчитываемых вручную. Типовые изображения иллюстрируют необработанные фибробласты в PD 2 (вверху) и PD 53 (внизу). Все данные представлены в виде среднего ± s.e.m. Длина масштабной метки составляет 200 мкм.
[0059] Фигура 16. Высокоэффективная трансфекция модифицированной мРНК человеческих миобластов. (А,В) Количественная оценка ЗФБ флуоресцентных миобластов (n=2000), трансфицированных 0,1-0,8 мкг/мл модифицированной мРНК, кодирующей ЗФБ, согласно данным проточной цитометрии через 24 ч после начала обработки. (С) Средняя флуоресценция трансфицированных модифицированной мРНК ЗФБ миобластов в ответ на увеличение дозы. (D) Количественная оценка экзогенной модРНК TERT в фибробластах через 24 ч после трансфекции 1 мкг/мл модРНК TERT или CI TERT согласно данным РВ-кПЦР. Соотношение между TERT и CI TERT рассчитывали при помощи метода Pfaffl, используя RPL37A и GAPDH в качестве эталонных генов (n=3). (Е) Количественная оценка эндогенной модРНК TERT в фибробластах через 24 ч после трансфекции 1 мкг/мл модРНК TERT или CI TERT согласно данным кПЦР, рассчитанная как в (D). Все данные представлены в виде среднего ± s.e.m.
[0060] Фигура 17. Экспрессия TERT после доставки модифицированной мРНК. Экспрессию белка TERT в фибробластах, собранных через 24 ч после начала обработки 1 мкг/мл модРНК TERT, определяли при помощи мультиплексного инфракрасного вестерн-блоттинга. Для получения стандартной кривой использовали серийное разведение общего белка, чтобы сравнивать относительные количества белка TERT с контрольными образцами. Специфичность применяемого антитела к TERT была всестороннее исследована (Wu, 2006).
[0061] Фигура 18. TRAP-гель, иллюстрирующий повышенную теломеразную активность в мононуклеарных клетках, электропорированных модРНК TERT, при этом использовали следующие параметры: 200 В, 25 мкФ, 1000 Ом, в 1 мм кювете с 10 мкл клеточной суспензии и модРНК TERT. Термообработанная линия образцов содержит праймерный димерный артефакт метода, на что указывает интенсивная полоса на четвертой ступеньке лестницы.
[0062] Фигура 19. Микроскопические изображения мононуклеарных клеток, флуоресцирующих после электропорации модРНК, кодирующей ЗФБ.
[0063] Фигура 20. Электропорация модРНК ЗФБ в человеческие лейкоциты (мононуклеарные клетки) приводит к высокой эффективности трансфекции.
[0064] Фигура 21. Изображение геля из анализа TRAP, иллюстрирующее повышение теломеразной активности в фибробластах, электропорированных возрастающими дозами модРНК TERT.
[0065] Фигура 22. Флуоресцентные микрофотографии, иллюстрирующие, что CD8+ Т-клетки, активированные CD3/CD28 и электропорированные модРНК ЗФБ экспрессируют активность ЗФБ. Темные точки представляют собой CD3/CD28-покрытые гранулы.
[0066] Фигура 23. Электропорация человеческих кератиноцитов модРНК TERT приводит к экспрессии теломеразной активности.
[0067] Фигура 24. Экспрессия модРНК люциферазы после in vivo доставки грызунам.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0068] Теломеры представляют собой последовательности ДНК на концах хромосом, которые защищают концы, но которые со временем укорачиваются. Критическое укорочение теломер может привести к прекращению функционирования клеток должным образом или к их гибели. Критическое укорочение теломер также может привести к слиянию хромосом, что в свою очередь может привести к раку. Даже в отсутствие точно диагностированного заболевания короткие теломеры связаны с постепенным ухудшением умственных и физических функций и с возрастными проявлениями старения.
[0069] В то же время укорочение теломер может играть защитную роль в случае рака, например, в ситуации, когда в клетке появляется мутация, которая заставляет ее пролиферировать быстрее, чем нормальные клетки. В такой ситуации укорочение теломер предотвращает неограниченную пролиферацию клетки и развитие рака. Следовательно, постоянное удлинением теломер не обязательно является преимущественным.
[0070] У млекопитающих теломеры содержат тандемные повторы последовательности TTAGGG, а у других животных, таких как птицы, рептилии и рыбы повторяемая последовательность варьируется. У всех этих видов животных теломеры являются двухцепочечными и и содержат большое количество тысяч пар оснований (т.п.н.). Средняя длина теломер отличается для разных видов, как показано в Таблице 1.
[0071] У людей исходная длина теломер до рождения составляет 15-20 т.п.н., а уже при рождении их длина составляет 12-15 т.п.н. Теломеры быстро укорачиваются в детском возрасте, а затем, во взрослом возрасте, - в среднем на около 0-100 п. н. в год, при этом скорость зависит от типа клеток, подверженности физиологическому и окислительному стрессу и других факторов.
[0072] Теломеры являются частью теломерного комплекса, который защищает концы хромосом. Теломерный комплекс также содержит группу белков с общим названием «шелтерины». Белки теломерного комплекса включают РОТ1, ТРР1, ATM, DAT, TRFT, TRF2, Rapl, Rifl, TIN2, NBS, MRE17 и RAD50, а также их гомологи, относящиеся к разным видам млекопитающих. Podlevsky and Chen (2012) Mutat. Res. 730:3-11. У многих видов окончание теломеры находится в одноцепочечном «липком» 3'-конце, который встраивается в двухцепочечную область в ассоциации с белками теломерного комплекса, образуя петлю в пределах теломерного комплекса.
[0073] Теломеры со временем укорачиваются вследствие окислительного повреждения и сестринского хроматидного обмена, а также вследствие проблем репликации концов, когда во время митоза концы хромосом дублируются не полностью. При критическом укорочении теломер теломерный комплекс больше не способен защищать концы и хромосома становится «некэпированной». Некэпированные концы хромосом могут стать причиной слияния между хромосомами, которое может привести к раку. O'Sullivan and Karlseder (2010) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11:171-181; Calado et al. (2012) Leukemia 26:700-707; Artandi and DePinho Carcinogenesis 31:9-18. Также отсутствие кэпирования может привести к распознаванию концов хромосом как поврежденной ДНК, что приводит к активации ответов на повреждение ДНК и стимуляции клеточного апоптоза или старения. Старение представляет собой законсервированное состояние, в котором клетка сохраняет жизнеспособность, но больше не делится, при этом старые клетки, как правило, прекращают выполнять свои полезные функции должным образом или полностью. Таким образом, укорочение теломер приводит к тканевой дисфункции, утрате физических способностей и внешнего молодого вида, утрате умственных способностей и заболеваниям частично вследствие накопления старых клеток, а частично вследствие потери клеток в результате апоптоза. Действительно, у старых людей с короткими теломерами приблизительно на 200-750% больше вероятность развития инфаркта миокарда (200%) (von Zglinicki et al. (2000) Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology 80:1739-1747), сосудистой деменции (200%) (Testa et al. (2011) Diabetic Medicine 28:1388-1394), диабета с осложнениями (400%) (Blackburn et al. (2010) Cancer Prevention Research 3:394-402, рака (Stem and Bryan (2008) Cytogenetic and Genome Research 122:243-254), инсульта, болезни Альцгеймера, инфекции (750%), идиопатического легочного фиброза и других заболеваний. У людей с наличием коротких теломер в одной ткани существует большая вероятность того, что короткие теломеры присутствуют и в большинстве других тканей, и, следовательно, короткие теломеры связаны с риском развития у индивида многих заболеваний. Takubo et al. (2010) Geriatr Gerontol Int. 10 Suppl 1:S197-206; doi:10.1111/j. 1447-0594.2010.00605.X. Короткие теломеры также ограничивают способность клеток к репликации, что в свою очередь ограничивает возможности клеточной терапии и регенеративной терапии. И наоборот, увеличение длины теломер у мышей с короткими теломерами при помощи методов генетической инженерии на основе вирусов приводит к омоложению мышей по нескольким параметрам, включая толщину и эластичность кожи, функцию печени и нюх. Jaskelioff (2011) Nature 469:102-107.
[0074] Так как теломераза удлиняет теломеры, целесообразным подходом к удлинению теломер является повышение уровня теломеразной активности в клетках. Сообщалось о большом количестве агентов и условий, которые повышают теломеразную активность в клетках, включая агенты и условия, перечисленные в Таблице 2.
[0075] Примеры видов лечения, приведенные в Таблице 2, однако, не исключают появления нежелательных явлений. Например, лечение факторами роста, гормонами и цитокинами может привести к появлению побочных явлений, может активировать множественные сигнальные пути, может привести к нежелательной репликации клеток, может вызвать иммунный ответ и в общем случае не является специфическим. Генетические виды лечения с применением плазмид или вирусов несут риск геномной модификации путем инсерционного мутагенеза и риск развития рака. Трансфекция немодифицированной РНК приводит к сильному иммунному ответу и согласно имеющимся данным не приводит к удлинению теломер. Лечение физическими методами может повредить геномную ДНК. Было обнаружено, что лечение небольшими молекулами, полученными из растений приводит к удлинению теломер только в некоторых субъектах и клетках, приводит только к очень медленному удлинению теломер и требует постоянной доставки и, следовательно, связано с риском развития рака.
[0076] Экспрессия в клетках нуклеотидных последовательностей, кодирующих hTERT и TERC, и применение самих этих компонентов было предложено для применения в диагностике, прогнозировании и лечении человеческих заболеваний (см., например, патенты США №№5583016 и 6166178), но при этом не было продемонстрировано удлинение теломер, которое было бы одновременно быстрым и временным и, следовательно, потенциально безопасным в связи с причинами, описанными выше. В Saebe-Larssen et al. (2002) J. Immunol. Methods 259:191-203 сообщается о трансфекции дендритных клеток мРНК, кодирующей hTERT, и о том, что такие клетки приобретали теломеразную активность, но в трансфекции применяли стандартную мРНК, что приводило к сильному ответу цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) на hTERT, а не к удлинению теломер.
[0077] Кроме того, все существующие виды лечения при помощи небольших молекул являются очень неэффективными и медленными (Harley et al. (2011) Rejuvenation Research 14:45-56) главным образом потому, что они действуют посредством каталитического компонента теломеразы, TERT, который тяжело подвергается посттрансляционной регуляции, ограничивая действие существующих видов лечения небольшой подгруппой клеток, и исключая клетки, находящиеся в интерфазе или G0, такие как многие стволовые клетки и клетки-предшественники. Cifuentes-Rojas and Shippen (2012) Mutat. Res. 730:20-27; doi:10.1016/j.mrfmmm.2011.10.003; Cong et al. (2002) Microbiology and Molecular Biology Reviews 66:407-425. Эта регуляция частично опосредуется взаимодействиями между компонентами теломеразного комплекса, теломерного комплекса и другими молекулами. Например, TERT фосфорилируется или дефосфорилируется в разных участках разными киназами и фосфатазами, и в некоторых участках фосфорилирование приводит к повышению теломеразной активности (например, фосфорилирование Akt), в то время как в других участках фосфорилирование снижает теломеразную активность (например, фосфорилирование Srcl или сАЫ). Также TERT убиквитинируется и деубиквитинируется в определенных участках. Также TERT взаимодействует с другими белками в определенных участках TERT и эти взаимодействия могут инактивировать TERT (например, взаимодействия с Pinxl или cAb1) или переносить TERT в сторону от хромосом (например, взаимодействия с CRM1 и Pinx1), предотвращая или замедляя удлинение теломер. Более того, некоторые белки связываются с теломерами или теломерным комплексом, блокируя TERT (например, РОТ1), предотвращая удлинение теломер. Более того, некоторые белки косвенно способствуют удлинению теломер, например, геликазы и UPF1. В связи с регуляторными механизмами пик теломеразной активности приходится на S-фазу клеточного цикла и, следовательно, виды лечения, которые повышают теломеразную активность, могут оказывать благоприятное действие именно на быстро делящиеся клетки. Однако часто необходимо, чтобы клетки находились в состоянии медленного деления или не делились; например, стволовые клетки или клетки-предшественники часто характеризуются медленным делением и, следовательно, большую часть времени могут находиться в интерфазе или G0. Таким образом, в общем случае существующие виды лечения являются медленными и неэффективными для большинства типов клеток и для всех типов клеток во время интерфазы и G0. Медленные виды лечения являются менее безопасными, так как они требуют лечения на протяжении более длительного времени. Так как укорочение теломер может обеспечивать защитный механизм от неконтролируемой клеточной пролиферации, например, в случае рака, лечение, при котором происходит быстрое удлинение теломер, в общем случае является более безопасным, так как его можно осуществлять на протяжении коротких периодов времени и не часто, что позволяет нормальному механизму безопасности, связанному с укорочением теломер, оставаться действенным большую часть времени. Следовательно, существует необходимость в способе, обеспечивающем временное преодоление теломеразной регуляции для быстрого удлинения теломер во время кратковременного лечения.
[0078] TERT регулирует сотни генов, включая те, которые перечислены в Таблице 3.
[0079] Во многих случаях модуляция генов или путей, приведенных в Таблице 3, является нежелательной, потому что может привести к нежелательным изменениям в клетках. Например, TERT активирует эпигенетические регуляторы, которые могут менять фенотип клетки или препятствовать попыткам перепрограммировать или трансдифференцировать клетки в терапевтических целях. TERT активирует стимуляторы роста, но пролиферация часто является нежелательной, например, часто те стволовые клетки, которые обладают наибольшим регенеративным потенциалом, делятся медленно. TERT модулирует регуляторы предопределения и дифференцировки клеток, что может помешать попыткам дифференцировать клетки в определенные типы клеток. Также TERT активирует протоонкогены, что может привести к раку. Таким образом, необходимо минимизировать количество времени, на протяжении которого происходит искусственное повышение уровней TERT, включая любое лечение, которое приводит к удлинению теломер при помощи TERT. Следовательно, необходимо лечение, которое приводит к удлинению теломер путем только лишь временного повышения уровней теломеразной активности.
[0080] Было показано, что в некоторых типах клеток TERT влияет на экспрессию других генов (Young et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:19904-19908; Perrault et al. (2005) Biochem. Biophys. Res. Commun. 335:925-936), что в некоторых случаях может быть нежелательным. Следовательно, необходимо лечение, которое минимизирует количество времени, на протяжении которого происходит повышение уровней TERT.
Соединения
[0081] Настоящее изобретение направлено на эти и другие проблемы и предлагает в одном аспекте новые соединения для временной экспрессии экзогенной теломеразы в клетке. Соединения содержат синтетическую рибонуклеиновую кислоту, содержащую по меньшей мере один модифицированный нуклеозид и кодирующую обратную транскриптазу теломеразы (TERT), при этом в клетке, обработанной соединением происходит удлинение теломер.
Синтетические рибонуклеиновые кислоты
[0082] Рибонуклеиновые кислоты, применяемые для временной экспрессии TERT в соответствии с разными аспектами настоящего изобретения, содержат рибонуклеиновую кислоту, кодирующую белок TERT. Как правило, рибонуклеиновые кислоты дополнительно содержат последовательности, которые оказывают влияние на экспрессию и/или стабильность рибонуклеиновой кислоты в клетке. Например, как показано на Фигуре 1а, рибонуклеиновые кислоты могут содержать 5'-кэп и нетранслируемую область (НТО) с 5' и/или 3' стороны кодирующей последовательности. Рибонуклеиновые кислоты могут дополнительно содержать 3' хвост, например, (поли)А-хвост.(Поли)А-хвост может, например, повышать стабильность рибонуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации изобретения (поли)А-хвост содержит по меньшей мере 75 нуклеотидов, 100 нуклеотидов, 125 нуклеотидов, 150 нуклеотидов или даже более.
[0083] В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-кэп рибонуклеиновой кислоты представляет собой неиммуногенный кэп. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-кэп может усиливать трансляцию рибонуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-кэп можно обрабатывать фосфатазой, чтобы модулировать естественную иммуногенность рибонуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-кэп представляет собой анти-инвертированный аналог кэп («ARCA»), такой как 3'-0-Me-m7G(5')ppp(5')G РНК аналог кэп-структуры.
[0084] Как хорошо известно в данной области техники, вышеуказанные или другие признаки могут усиливать трансляцию белка TERT, кодируемого рибонуклеиновой кислотой, могут улучшать стабильность самой рибонуклеиновой кислоты или могу делать и то и другое. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-НТО и/или 3'-НТО получены из гена очень стабильной мРНК и/или мРНК, которая быстро транслируется, например, α-глобина, β-глобина, c-fos или вируса гравировки табака. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-НТО и 3'-НТО получены из разных генов или от видов, отличных от вида, которому осуществляют доставку композиций. Также НТО могут быть собраны из частей НТО из мРНК разных генов, при этом части подбирают так, чтобы достичь определенной комбинации стабильности и эффективности трансляции.
[0085] Рибонуклеиновые кислоты согласно изобретению предпочтительно представляют собой нуклеозид-модифицированные РНК («модРНК»). Большинство зрелых молекул РНК в эукариотических клетках содержат нуклеозиды, которые являются модифицированными версиями канонических немодифицированных нуклеозидов РНК аденина, цитидина, гуанозина и уридина. Эти модификации могут предотвращать распознавание РНК как чужеродной РНК. Kariko et al. (2005) Immunity 23:165-175. Синтетические молекулы РНК, полученные с использованием определенных нуклеозидов, являются намного менее иммуногенными, чем немодифицированная РНК. Иммуногенность можно снизить даже больше путем очистки синтетической модРНК, например, при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Модифицированные нуклеозиды, например, могут быть выбраны из нуклеозидов, приведенных в Таблице 4. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеозиды представляют собой псевдоуридин, 2-тиоуридин или 5-метилцитидин. В некоторых обстоятельствах может быть желательно, чтобы модифицированная РНК сохраняла некоторую степень иммуногенности.
[0086] Не привязываясь к теории, можно сказать, что наличие модифицированных нуклеозидов позволяет модРНК избежать активации иммунного ответа, опосредованной различными рецепторами, включая толл-подобные рецепторы и PJG-1. Неиммуногенную модРНК применяли на мышах в качестве терапевтического агента путем местной доставки. Kormann et al. (2011) Nature Biotechnology 29:154-157. Открытие нуклеотид-модифицированной мРНК облегчает доставку РНК-кодируемых терапевтических белков или их мутантов в клетки, а также экспрессию этих белков в клетках.
[0087] Соответственно, в некоторых вариантах реализации изобретения рибонуклеиновые кислоты настоящих композиций содержат псевдоуридин, 2-тиоуридин, 5-метилцитидин или нуклеозид из Таблицы 4. В некоторых вариантах реализации изобретения рибонуклеиновые кислоты содержат более одного из вышеуказанных нуклеозидов или комбинацию вышеуказанных нуклеозидов. В особенно предпочтительных вариантах реализации изобретения рибонуклеиновые кислоты содержат псевдоуридин и 5-метилцитидин.
[0088] В некоторых вариантах реализации изобретения иммунный ответ на модРНК может быть желательным, а РНК может быть модифицирована так, чтобы индуцировать оптимальный уровень природного иммунитета. В некоторых вариантах реализации изобретения иммунный ответ на модРНК может быть нежелательным, а РНК может быть модифицирована так, чтобы минимизировать такую реакцию. РНК может быть модифицирована для любой ситуации.
[0089] Рибонуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению предпочтительно представляют собой синтетические рибонуклеиновые кислоты. Употребляемый в данном документе термин «синтетический» означает, что в некоторых вариантах реализации изобретения рибонуклеиновые кислоты получены методами молекулярной биологии под управлением человека, например, как описано ниже. Синтетические рибонуклеиновые кислоты могут, например, быть получены при помощи in vitro синтеза с использованием клеточных экстрактов или очищенных ферментов и нуклеотидных матриц. Синтетические рибонуклеиновые кислоты могут в некоторых вариантах реализации изобретения быть получены при помощи химического синтеза, как частично, так и полностью. В альтернативном или дополнительном варианте синтетические рибонуклеиновые кислоты могут в некоторых вариантах реализации изобретения быть получены путем искусственной экспрессии в клетке с последующим разрушением клетки и по меньшей мере частичной очисткой рибонуклеиновой кислоты. Синтетическая рибонуклеиновая кислота, однако, не является рибонуклеиновой кислотой природного происхождения, так как она экспрессируется в немодифицированной клетке в отсутствие экстракции и очистки.
[0090] Рибонуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению могут быть получены при помощи большого количества стандартных методов, как понятно специалисту в данной области техники. В некоторых вариантах реализации изобретения рибонуклеиновые кислоты могут быть получены при помощи in vitro синтеза, как описано, например, в заявках на патенты США №№2009/0286852 и 2011/0143397. В некоторых вариантах реализации изобретения рибонуклеиновые кислоты могут быть получены при помощи химического синтеза. В некоторых вариантах реализации изобретения рибонуклеиновые кислоты могут быть получены при помощи комбинации in vitro синтеза и химического синтеза. Как описано выше, термин «синтетический» следует понимать как такой, который включает рибонуклеиновые кислоты, полученные при помощи химического синтеза, in vitro синтеза, in vivo экспрессии и по меньшей мере частичной очистки или при помощи комбинации этих или других методов химии или молекулярной биологии.
[0091] Рибонуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению могут в некоторых вариантах реализации изобретения быть очищены. Как отмечалось выше, очистка может снижать иммуногенность рибонуклеиновых кислот, что в некоторых обстоятельствах может давать преимущество. Смотрите также заявку на патент США №2011/0143397. В предпочтительных вариантах реализации изобретения рибонуклеиновые кислоты очищены при помощи ВЭЖХ или аффинного захвата и элюирования.
[0092] Белковая структура TERT содержит по меньшей мере три уникальных домена: длинный удлиняющий сегмент в амино-конце (N-концевой удлиняющий сегмент, ΝΤΕ), который содержит консервативные домены и неструктурированную линкерную область; домен каталитической обратной транскриптазы в середине первичной последовательности, которая содержит семь консервативных RT-мотивов; и короткий удлиняющий сегмент в карбоксил-конце (С-концевой удлиняющий сегмент, СТЕ). Autexier and Lue (2006) Annu Rev Biochem. 75:493- 517. В некоторых вариантах реализации изобретения рибонуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению кодирует полноразмерную TERT. В некоторых вариантах реализации изобретения рибонуклеиновая кислота кодирует домен каталитической обратной транскриптазы TERT. В некоторых вариантах реализации изобретения рибонуклеиновая кислота кодирует полипептид, обладающий активностью TERT.
[0093] TERT, кодируемая рибонуклеиновыми кислотами согласно настоящему изобретению, предпочтительно представляет собой TERT млекопитающего, птицы, рептилии или рыбы. Более предпочтительно TERT представляет собой TERT млекопитающего, например, TERT человека. Meyerson et al. (1997) Cell 90:785-795; Nakamura et al. (1997) Science 277:955-959; Wick et al. (1999) Gene 232:97-106. Аминокислотные последовательности двух изоформ человеческой TERT доступны в виде стандартных последовательностей NCBI: NP_937983.2 и NP 001180305.1. Другие неограничивающие типовые аминокислотные последовательности, кодируемые рибонуклеиновыми кислотами предложенных композиций, включают TERT кошки (Стандартная последовательность NCBI: ХР_003981636.1), собаки (Стандартная последовательность NCBI: NP_001026800.1), мыши (Стандартная последовательность NCBI: NP_033380.1), коровы (Стандартная последовательность NCBI: NP_001039707.1), овцы (Стандартная последовательность NCBI: ХР_004017220.1), свиньи (Стандартная последовательность NCBI: NP_001231229.1), африканского слона (Стандартная последовательность NCBI: ХР 003408191.1), курицы (Стандартная последовательность NCBI: NP_001026178.1), крысы (Стандартная последовательность NCBI: NP_445875.1), данио (Стандартная последовательность NCBI: NP_001077335.1); японской медаки (Стандартная последовательность NCBI: NP_001098286.1); и шимпанзе (Стандартная последовательность NCBIs: ХР 003950543.1 и ХР_003950544.1).
[0094] Следует понимать, что рибонуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению могут кодировать варианты любой из вышеперечисленных аминокислотных последовательностей, в частности, варианты, которые сохраняют теломеразную каталитическую активность, включая усеченные варианты. В некоторых вариантах реализации изобретения рибонуклеиновые кислоты предложенных композиций кодируют одну из вышеперечисленных аминокислотных последовательностей или последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную этой последовательности. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновые кислоты предложенных композиций кодируют одну из вышеперечисленных аминокислотных последовательностей или последовательность, по меньшей мере на 98%, 99%, 99,9% или даже более идентичную этой последовательности.
[0095] Следует также понимать, что предложенные рибонуклеиновые кислоты могут соответствовать нативным генным последовательностям, кодирующим вышеуказанные белки TERT, или могут соответствовать вариантам, возможным вследствие избыточности генетического кода, как понятно специалисту в данной области техники. В некоторых вариантах реализации изобретения селекция кодонов может быть оптимизирована в целях оптимизации экспрессии белка при помощи алгоритмов и способов, известных специалистам в данной области техники. Fath et al. (2011) PLoS ONE 6:3.
Композиции
[0096] В другом аспекте в настоящем изобретении предложены композиции для удлинения теломер в клетке, содержащие соединение согласно изобретению, как описано выше, и дополнительный компонент. В некоторых вариантах реализации изобретения композиции дополнительно содержат РНК-компонент теломеразы (TERC). (Смотрите также Таблицу 6, ниже). В некоторых вариантах реализации изобретения композиции дополнительно содержат носитель для доставки.
Носители для доставки
[0097] Как было отмечено непосредственно выше, композиции согласно настоящему изобретению могут дополнительно содержать носитель для доставки рибонуклеиновой кислоты. Носитель для доставки может в некоторых случаях облегчать нацеливание и поглощение рибонуклеиновой кислоты из композиции клеткой-мишенью. В частности, композиции согласно настоящему изобретению могут содержать любой известный в данной области техники носитель для генной доставки, например, наночастицы, липосомы, баллистические частицы для генной пушки, вирусы, катионные липиды, коммерческие продукты, такие как Lipofectamine® RNAiMax, или другие носители. В некоторых вариантах реализации изобретения носитель для доставки представляет собой экзосому, липидную наночастицу, полимерную наночастицу, природную или искусственную липопротеиновую частицу, катионный липид, белок, комплекс белок-нуклеиновая кислота, липосому, виросому или полимер. В некоторых предпочтительных вариантах реализации изобретения носитель для доставки представляет собой форму, содержащую катионный липид. Как правило, вирусная доставка не является предпочтительной, так как она может привести к инсерционному мутагенезу.
[0098] В некоторых предпочтительных вариантах реализации изобретения носитель для доставки представляет собой экзосому, липидную наночастицу или полимерную наночастицу. В наиболее предпочтительных вариантах реализации изобретения носитель для доставки представляет собой экзосому. Экзосомы представляют собой бислоевые липидные везикулы природного происхождения диаметром 40-100 нм. Экзосомы содержат группу специфических белков, включая мембранные белки Lamp-1 и Lamp-2, которые являются исключительно многочисленными. Lakhal and Wood (2011) BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology 33:737-741. В 2007 г. было обнаружено, что экзосомы являются природными носителями РНК и белка, включая более 1300 типов мРНК и 121 тип некодирующих микроРНК. Экзосомы также могут переносить мРНК между видами: обработка человеческих клеток мышиными экзосомами, несущими мышиную РНК, приводит к трансляции мышиной мРНК в человеческих клетках.
[0099] В качестве средств доставки РНК, белка или ДНК экзосомы обладают большим количеством преимуществ по сравнению с альтернативными носителями. В частности, экзосомы можно получить из собственных клеток пациента, что делает их неиммуногенными и, следовательно, они не подвергаются атаке со стороны антител, комплемента, факторов свертывания крови или опсонинов. Кроме того экзосомы можно нагружать нуклеиновыми кислотами методом электропорации и они являются носителями природного происхождения, которые переносят мРНК и белок между клетками человека. Экзосомы защищают нагруженные на них РНК и белки во время транспорта, а груз доставляется непосредственно в цитозоль. Они могут проникать из кровотока во внесосудистые ткани и даже пересекать гематоэнцефалический барьер, и также их можно нацеливать. Кроме того, экзосомы не накапливаются в нецелевых органах, таких как, например, печень. Следовательно, экзосомы можно использовать как «липосомы» клеточного происхождения для доставки терапевтической мРНК или другого груза при лечении заболевания. Mizrak et al. (2013) Molecular Therapy 21:101-108; doi:10.1038/mt.2012.161. Графическая иллюстрация доставки экзосомой мРНК в клетку приведена на Фигуре 2. Смотрите также van den Boom et al. (2011) Nature Biotechnology 29:325-326.
[00100] Полагают, что генерировать экзосомы способно большинство типов клеток, а экзосомы можно обнаружить в большинстве биологических жидкостей, включая кровь, слюну, мочу, цереброспинальную жидкость, грудное молоко и околоплодную жидкость. Экзосомы вырабатываются большинством типов клеток в разном количестве. Большое количество экзосом, на которые не реагируют активаторы Т-клеток, можно получить из незрелых дендритных клеток, которые присутствуют в человеческой крови. O'Doherty et al. (1994) Immunology 82:487-493. Также экзосомы можно получить искусственным способом, например, комбинируя рекомбинантные экзосомальные белки с липидами и фосфолипидами, такими как те, которые можно обнаружить в экзосомальных мембранах. В альтернативном варианте экзосомы можно сконструировать путем in vitro самосборки липосом с подгруппой экзосомальных поверхностных белков.
[00101] Потенциал экзосом в отношении доставки лекарственных веществ был впервые продемонстрирован в 2011 г. Alvarez-Erviti et al. (2011) Nature Biotechnology 29:341 -345. В частности, экзосомы получали из дендритных клеток, сконструированных для экспрессии белка слияния Lamp2B, слитого с 28 а.к. нацеливающим лигандом гликопротеина вируса бешенства (RVG), затем электропорировали миРНК в экзосомы и инъецировали экзосомы мышам, иммуносовместимым с мышами, от которых были получены дендритные клетки. Таким образом, экзосомы были аутологичными и не вызывали иммунный ответ согласно измеренным уровням IL-6, IP-10, TNF-α и IFN-α. Кроме того, повторные дозы через один месяц приводили к таким же ответам, демонстрируя, что адаптивный иммунный ответ также отсутствовал.
[00102] Как описано выше, экзосомы могут быть аутологичными и, таким образом, обладать низкой иммуногенностью. Так как модРНК также обладает низкой иммуногенностью, комбинация из модРНК в качестве рибонуклеиновой кислоты и экзосомы в качестве носителя для доставки в композициях согласно настоящему изобретению является в особенности предпочтительной. Таким образом, в этих вариантах реализации в изобретения предложен новый путь доставки мРНК или модРНК в клетки или ткани с применением экзосом. Такая доставка обеспечивает удобный способ для временного повышения уровня любого белка в клетки in vivo с применением РНК, доставляемой в экзосомах путем внутривенной или местной инъекции, и, в частности, для доставки РНК, кодирующей TERT. Соответственно, в предпочтительных вариантах реализации изобретения носители для доставки предложенных в данном изобретении композиций являются неиммуногенными. В некоторых обстоятельствах, однако, может быть желательно, чтобы носитель сохранял некоторую степень иммуногенности.
Дополнительные компоненты
[00103] Раскрытые в данном документе композиции могут дополнительно содержать дополнительные компоненты, которые повышают доставку композиции в клетку-мишень, повышают удлинение теломер внутри клетки или и то, и другое. Например, композиции могут дополнительно содержать одно или более соединений и условий из Таблицы 2. Как понятно специалисту в данной области техники, комбинации активных ингредиентов часто демонстрируют синергетическое действие на необходимую активность, как, например, временная экспрессия экзогенной теломеразной активности в клетке, и такие комбинации входят в объем изобретения. Дополнительные примеры белков, которые могут быть включены в состав композиций согласно настоящему изобретению, приведены в Таблице 5. Следует понимать, что композиции могут содержать как сами белки, так и нуклеотидные последовательности, предпочтительно РНК или модРНК, которые кодируют эти белки, или белки, обладающие идентичностью последовательностей, которая позволяет сохранить активность указанного белка.
[00104] Другие примеры агентов, которые можно включать в состав композиций согласно настоящему изобретению, приведены в Таблице 6.
[00105] Так как TERT является наиболее активной во время определенных фаз клеточного цикла, композиции согласно настоящему изобретению также могут необязательно содержать один или более временных активаторов клеточной пролиферации, чтобы увеличить эффективность лечения TERT. Такие агенты могут включать, например, агент РНКи, который временно снижает количество ингибиторов клеточного цикла, таких как Rb или P19/Arf, в клетке. Специалисту в данной области техники понятно, что в состав представленных композиций можно включать другие временные активаторы клеточной пролиферации.
Способы удлинения теломер и способы лечения
[00106] В другом аспекте в настоящем изобретении предложены способы удлинения теломер, включающие этап введения любого из вышеописанных соединений или композиций в клетку с укороченными теломерами, при этом происходит удлинение теломер в клетке. Также в настоящем изобретении предложены способы лечения, включающие этап введения любого из вышеописанных соединений или композиций субъекту-животному, которое нуждается или для которого может оказаться полезным удлинение теломер.
[00107] В предпочтительных вариантах реализации изобретения соединения и композиции вводят в клетку, при этом клетка является выделенной клеткой или является частью клеточной культуры, выделенной тканевой культуры, выделенного органа и тому подобного (т.е. введения осуществляют in vitro).
[00108] В других предпочтительных вариантах реализации изобретения соединения и композиции вводят без выделения клетки или клеток, ткани или органа из субъекта (т.е. введения осуществляют in vivo). В некоторых из этих вариантов реализации изобретения соединение или композицию доставляют во все или практически все клетки организма субъекта. В некоторых вариантах реализации изобретения соединение или композицию доставляют в определенную клетку или ткань организма субъекта.
[00109] В некоторых вариантах реализации изобретения субъект представляет собой млекопитающее, птицу, рыбу или рептилию. В предпочтительных вариантах реализации изобретения субъект представляет собой млекопитающее и более предпочтительно -человека. В других предпочтительных вариантах реализации изобретения субъект представляет собой домашнее животное, животное из зоопарка, сельскохозяйственное животное или животное, принадлежащее находящемуся под угрозой виду. Примеры предпочтительных видов субъектов перечислены в Таблице 7.
[00110] В случае in vitro применений соединения и композиции можно вводить любым удобным способом, как понятно специалистам в области клеточной биологии, клеточного культивирования, тканевого культивирования, культивирования органов и тому подобного. В случае in vivo применений соединения и композиции удобно вводить путем инъекции, местного применения, ингаляции или любого другого подходящего способа введения, как понятно специалистам в области медицины и тому подобного.
[00111] Как описано выше, клетки, которые можно эффективно лечить в соответствии со способами согласно данному изобретению, включают клетки как в организме субъекта (для in vivo введения), так и полученные от субъекта (для in vitro введения), для которого может оказаться полезным удлинение теломер. Так как короткие теломеры присущи практически всем типам клеток у большинства животных, удлинение теломер может оказаться целесообразным для большинства животных. Лечение, включающее удлинение теломер, являющееся временным и короткодействующим, потенциально является безопасным, как описано выше. Следовательно, удлинение теломер посредством раскрытого в данном документе временного лечения может быть эффективным для всех или большинства индивидов в качестве превентивной меры, например, для того, чтобы предотвратить или отложить начало многих заболеваний и патологических состояний, связанных с укорочением теломер, или в качестве лечения этих заболеваний и патологических состояний. Лечение может быть целесообразным в случае субъектов, подверженных риску развития возрастных заболеваний или патологических состояний, или тех, кто уже страдает от этих заболеваний, а также может быть целесообразным в случае субъектов, которые перенесли, имеют или подвержены риску физической травмы или хронического физического стресса, такого как тяжелые физические тренировки или ручной труд, или психологической травмы, или хронического психологического стресса, так как все эти патологические состояния приводят к укорочению теломер; физический стресс или травма требуют клеточного деления с целью исправления полученного повреждения, что приводит к укорочению теломер, также эти патологические состояния могут вызывать окислительный стресс, который также приводит к укорочению теломер. Такие заболевания и патологические состояния включают, например, метаболический синдром, диабет, диабетические язвы, заболевание сердца, многие формы рака, сосудистую деменцию, болезнь Альцгеймера, инсульт, возрастную макулярную дегенерацию, старение иммунной системы, недостаточность костного мозга, желудочно-кишечные язвы, цирроз, грыжу, инфекцию, такую как вторичная пневмония вследствие нарушения иммунной функции, хроническую инфекцию, легкое или тяжелое когнитивное нарушение, нарушение подвижности, остеопороз, остеоартрит, ревматоидный артрит, возрастное тревожное расстройство, нарушение равновесия, тиннитус, паралич Белла, катаракты, ХОЗЛ, истирание роговицы, ишемическую болезнь сердца, заболевание периферических артерий, конъюнктивит, халазион, обезвоживание, депрессию, эмфизему, различные заболевания глаз, отсутствия прибавки в весе, гриппа, общее тревожное расстройство, глаукому, потерю слуха, потерю чувства вкуса, потерю аппетита, вывих бедра, потерю памяти, болезнь Паркинсона, спинальный стеноз, недержание мочи, перелом позвоночника и другие.
[00112] Клетки, которые можно эффективно лечить в соответствии с предложенными способами, также включают клетки в организме субъекта или полученные от субъекта, который страдает от возрастного заболевания или патологического состояния или подвержен риску развития такого заболевания или патологического состояния. Такие возрастные заболевания или патологические состояния могут включать генетические заболевания, в которых гены, кодирующие компоненты теломеразного комплекса или теломерного комплекса, мутированы, что приводит к укорочению теломер. Такие заболевания включают, например, формы идиопатического легочного фиброза, врожденного дискератоза и апластической анемии.
[00113] В случае генетических заболеваний композиции могут дополнительно содержать дополнительные нуклеиновые кислоты, такие как нормальные функциональные версии кодирующих последовательностей генов, которые поражаются при таких заболеваниях, например, DKC1, TINF2, NOPIO, NHP2, TERC или других генов. Примеры таких генов приведены в Таблице 8. Смотрите также Armarnos (2009) Ann. Rev. Genomics Hum. Genet. 10: 45-61.
[00114] Дополнительно, лечение может быть целесообразным для субъектов, страдающих от или подверженных риску развития других типов генетических заболеваний, в которых играет роль укорочение теломер, таких как, например, мышечная дистрофия. В случае таких заболеваний необходимость в репликации клеток для решения проблемы, причиняемой генетической мутацией, быстрее чем обычно укорачивает теломеры, результатом чего является более быстрое чем обычно укорочение теломер, что в свою очередь снижает способность клеток к репликации, приводя к тканевой дисфункции, усугублению или появлению дополнительных симптомов, недееспособности и часто к смерти. Кроме того лечение соединениями согласно данному изобретению может лечить или замедлять развитие разных типов рака, так как считается, что слияние между хромосомами вследствие критического укорочения теломер является причиной рака. Также теломеры можно избирательно удлинять в здоровых клетках индивида, не удлиняя при этом теломеры в раковых клетках, что позволяет применять предложенные соединения, композиции и способы, например, для удлинения теломер иммунной системы для повышения ее способности бороться с раком. Кроме того, клетки иммунной системы можно также получать от индивида для лечения согласно данному изобретению ex vivo с последующим повторным внесением индивиду.
[00115] В некоторых вариантах реализации изобретения клетки, обрабатываемые в соответствии с предложенными способами, получены от субъектов, у которых еще не проявлялись признаки болезненного состояния, но которые подвержены риску развития патологического состояния или заболевания, связанного с укорочением теломер, или клетки содержат укороченные теломеры. В некоторых вариантах реализации изобретения возрастным заболеванием является просто преклонный возраст. Предложенные виды лечения также можно применять в качестве косметической помощи для предотвращения, замедления или смягчения возрастных ухудшений состояния кожи, волос, костной структуры, осанки, остроты зрения или других признаков, которые ухудшаются с возрастом. Например, лечение можно применять для сохранения эластичности, толщины, гладкости и внешнего вида кожи, так как удлинение теломер улучшает эти параметры. В случае физической травмы, такой как перелом костей или разрыв тканей, или резанная рана, или ожог, изобретение можно применять для увеличения длины теломер в клетках, которые участвуют в заживлении раны для повышения их способности к репликации. В случаях хронического физического стресса, который является причиной укорочения теломер, лечение согласно изобретению сожжет удлинять теломеры в пораженных клетках, повышая их способность к репликации и способность восстанавливать поврежденные ткани. Так как теломерное укорочение накапливается из поколения в поколение, например, у людей с гаплонедостаточностью теломеразных компонентов, таких как hTR или hTERT, Armanios (2009) Аппи. Rev. Genomics Hum. Genet. 10:45-61, лечение согласно настоящему изобретению можно осуществлять в отношении зародышевых линий, таких как яйцеклетки, сперма или их предшественники, или в отношении оплодотворенных яйцеклеток или эмбрионов, например, во время in vitro процедур оплодотворения. Также лечение может быть полезным как вспомогательное при других видах лечения разных заболеваний или патологических состояний, например, при трансдифференцировке клеток in vivo. Способы лечения также могут быть полезными перед или во время хирургической операции или химиотерапии, или лучевой терапии для повышения способности клеток к репликации для восстановления повреждений вследствие этих процедур.
[00116] Указанные способы также могут быть полезными для обработки клеток in vitro для различных применений, включая аутологичную и гетерологичную клеточную терапию, биоинженерию, тканевую инженерию, выращивание искусственных органов, генерацию индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) и клеточную дифференцировку, дедифференцировку или трансдифференцировка. В этих применениях может требоваться многократное деление клеток, что может привести к уменьшению длины теломер, что можно компенсировать согласно данному изобретению до, во время или после указанного применения.
[00117] Кроме того, возрастными заболеваниями могут считаться различные типы рака, в частности, в случае, если раковые клетки содержат укороченные теломеры. В некоторых случаях клетки, обрабатываемые в соответствии с предложенными способами, получены от субъектов, у которых еще не проявлялись признаки болезненного состояния, но клетки которых содержат укороченные теломеры. В некоторых вариантах реализации изобретения возрастным заболеванием является просто изменение формы или функции, которая обычно ассоциируется у людей с преклонным возрастом.
[00118] Клетки, в которые целесообразно вводить соединения или композиции согласно настоящему изобретению в соответствии с предложенными способами, включают клетки любой ткани или клеточного типа, которые могут пострадать вследствие укорочения теломер или для которых может быть целесообразным удлинение теломер в клетках. Клетки могут включать соматические клетки или зародышевые клетки, а также стволовые клетки и другие клетки-предшественники и/или недефференцированные клетки. Клетки могут включать опухолевые клетки и неопухолевые клетки.
[00119] Примеры клеток, в которые целесообразно вводить соединения или композиции в соответствии с предложенными способами, включают клетки, которые получены главным образом из эндодермы, клетки, которые получены главным образом из эктодермы, и клетки, которые получены главным образом из мезодермы. Клетки, полученные главным образом из эндодермы, включают, например, экзокринные секреторные эпителиальные клетки и клетки, секретирующие гормоны. Клетки, полученные главным образом из эктодермы, включают, например, клетки покровной системы (например, ороговевшие эпителиальные клетки и клетки влажного многослойного барьерного эпителия) и нервной системы (например, сенсорные клетки-трансдукторы, автономные нейроны, поддерживающие клетки органов чувств и периферических нейронов, нейроны центральной нервной системы и глиальные клетки, а также клетки хрусталика). Клетки, полученные главным образом из мезодермы, включают, например, клетки метаболизма и памяти, клетки барьерной функции (например, клетки легких, кишечника, экзокринной железы и урогенитального тракта), клетки внеклеточного матрикса, сократительные клетки, клетки кровеносной и иммунной системы, зародышевые клетки, питающие клетки и интерстициоциты. Соответственно, в некоторых вариантах реализации предложенных способов клетка, в которую вводят композицию, представляет собой соматическую клетку эндодермальной, мезодермальной или эктодермальной линии дифференцировки. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка представляет собой зародышевую клетку или эмбриональную клетку.
[00120] Конкретные примеры клеток, в которые можно вводить соединение или композицию в соответствии с предложенными способами, включают, например, клетки слизистой оболочки слюнной железы, серозные клетки слюнной железы, клетки железы Эбнера на языке, клетки молочной железы, клетки слезной железы, клетки церуминозной железы в ухе, темные клетки эккриновой потовой железы, прозрачные клетки эккриновой потовой железы, клетки апокринной потовой железы, клетки потовой железы Моля глазного века, клетки сальной железы, клетки боуменовой железы носа, клетки бруннеровой железы двенадцатиперстной кишки, клетки семенной железы, клетки предстательной железы, клетки бульбоуретральной железы, клетки бартолиновой железы, клетки железы Литтре, клетки эндометрия матки, изолированные бокаловидные клетки дыхательного и пищеварительного трактов, клетки слизистой оболочки желудка, зимогенные клетки желудочной железы, обкладочные клетки желудочной железы, ацинарные клетки поджелудочной железы, панетовские клетки тонкого кишечника, пневмоциты легких типа И, клетки Клары легких, клетки передней доли гипофиза (например, соматотрофы, лактотрофы, тиротрофы, гонадотрофы и кортикотрофы), клетки средней доли гипофиза (например, секретирующие меланоцит-стимулирующий гормон), крупноклеточные нейросекреторные клетки (например, секретирующие окситоцин или вазопрессин), клетки кишечного и дыхательного тракта, (например, секретирующие серотонин, эндорфин, соматостатин, гастрин, секретин, холецистокинин, инсулин, глюкагон или бомбезин), клетки щитовидной железы (например, эпителиальные клетки щитовидной железы и парафолликулярные клетки), клетки паращитовидной железы (например, главные клетки паращитовидной железы и оксифильные клетки), клетки надпочечной железы (например, хромаффинные клетки и клетки, секретирующие стероидные гормоны, такие как минералокортикоиды и глюкокортикоиды), клетки Лейдига семенников, клетки внутренней оболочки овариального фолликула, клетки желтого тела раскрытого овариального фолликула, гранулезные лютеиновые клетки, клетки теки желтого тела, юкстагломерулярные клетки, клетки плотного пятна почек периполярные клетки почек, мезангиальные клетки почек, эпидермальные кератиноциты, эпидермальные базальные клетки, кератиноциты ногтей рук и ног, базальные клетки ногтевого ложа, медуллярные клетки волосяного стержня, кортикальные клетки волосяного стержня, кутикулярные клетки волосяного стержня, кутикулярные клетки капсул корней волос, клетки капсул корней волос слоя Хаксли, клетки капсул корней волос слоя Хенле, внешние клетки капсул корней волос, клетки матрицы волоса, поверхностные эпителиальные клетки многослойного плоского эпителия роговой оболочки, языка, полости рта, пищевода, анального канала, дистальной части уретры и вагины, базальные клетки эпителия роговой оболочки, языка, полости рта, пищевода, анального канала, дистальной части уретры и вагины, эпителиальные клетки мочевого канала (например, выстилающие мочевой пузырь и мочевыводящие протоки), ушные внутренние волосковые клетки в кортиевом органе, ушные внешние волосковые клетки в кортиевом органе, базальные клетки обонятельного эпителия, холодочувствительные первичные сенсорные нейроны, теплочувствительные первичные сенсорные нейроны, клетки Меркеля эпидермиса, обонятельные рецепторные нейроны, чувствительные к боли первичные сенсорные нейроны, фоторецепторные клетки сетчатки глаза (например, фоторецепторные палочки, фоторецепторные колбочки, чувствительные к синему цвету, фоторецепторные колбочки, чувствительные к зеленому цвету, фоторецепторные колбочки, чувствительные к красному цвету), проприоцептивные первичные сенсорные нейроны, чувствительные к прикосновению первичные сенсорные нейроны, клетки каротидного тельца типа I и II, ушные клетки вестибулярного аппарата уха типа I и II, клетки вкусовых рецепторов типа I, холинергические нервные клетки, адренергические нервные клетки, пептидергические нервные клетки, внутренние и внешние столбовые клетки кортиева органа, внутренние и внешние фалангеальные клетки кортиева органа, пограничные клетки кортиева органа, клетки Гензена кортиева органа, поддерживающие клетки вестибулярного аппарата, поддерживающие клетки вкусовых рецепторов, поддерживающие клетки обонятельного эпителия, шванновские клетки, глиальные клетки-спутники, кишечные глиальные клетки, астроциты, нервные клетки, олигодендроциты, веретеновидные нейроны, эпителиальные клетки передней поверхности хрусталика, кристаллин-содержащие волокнистые клетки хрусталика, гепатоциты, адипоциты (например, клетки белой жировой ткани и клетки бурой жировой ткани), печеночные липоциты, обкладочные клетки почек, подоциты почечных клубочков, клетки щеточной каймы проксимального почечного канальца, клетки тонкого сегмента петли Генле, клетки дистального почечного канальца, клетки собирающего протока почки, пневмоциты типа I, клетки протока поджелудочной железы, гладкие дуктальные клетки (например, главные клетки и дополнительные клетки), дуктальные клетки (семенной железы, предстательной железы и т.д.), клетки щеточной каймы кишечника (с микроворсинками), полосатые дуктальные клетки экзокринной железы, эпителиальные клетки желчного пузыря, клетки безреснитчатых эфферентных канальцев, эпидидимальные главные клетки, эпидидимальные базальные клетки, эпителиальные клетки энамелобластов, эпителиальные клетки planum semilunatum вестибулярного аппарата уха, интердентальные эпителиальные клетки кортиева органа, фибробласты рыхлой соединительной ткани, фибробласты роговицы (кератиноциты роговицы), фибробласты сухожилий, фибробласты ретикулярной ткани костного мозга, другие неэпителиальные фибробласты, перициты, клетки пульпозного ядра межпозвоночного диска, цементобласты/цементоциты, одонтобласты/одонтоциты, хондроциты гиалинового хряща, хондроциты волокнистого хряща, хондроциты эластического хряща, остеобласты/остеоциты, остеопрогениторные клетки, гиалоциты стекловидного тела глаза, звездчатые клетки перилимфатического пространства уха, звездчатые клетки печени (клетки Ито), звездчатые клетки поджелудочной железы, клетки скелетных мышц (например, клетки красных скелетных мышц (медленные) и клетки белых скелетных мышц (быстрые)), клетки промежуточных скелетных мышц, сумчато-ядерные клетки мышечного веретена, цепочно-ядерные клетки мышечного веретена, сателлитные клетки, клетки сердечной мышцы (например, обыкновенные клетки сердечной мышцы, узловые клетки сердечной мышцы и волокнистые клетки Пуркинье), клетки гладкой мускулатуры (различные типы), миоэпителиальные клетки радужной оболочки, миоэпителиальные клетки экзокринной железы, эритроциты, мегакариоциты, моноциты, макрофаги соединительной ткани (различные типы), эпидермальные клетки Лангерганса, остеокласты, дендритные клетки, микроглиальные клетки, нейтрофильные гранулоциты, эозинофильные гранулоциты, базофильные гранулоциты, клетки гибридомы, тучные клетки, хелперные Т-клетки, Т-клетки-супрессоры, цитотоксичные Т-клетки, естественные киллерные Т-клетки, В-клетки, естественные киллерные клетки, ретикулоциты, стволовые клетки и потомство коммитированных клеток кровеносной и иммунной системы (различные типы), оогонии/ооциты, сперматиды, сперматоциты, сперматогонии, сперматозоиды, питающие клетки, клетки овариального фолликула, клетки Сертоли, эпителиальные клетки вилочковой железы и интерстициальные клетки почек.
[00121] В предпочтительном варианте реализации изобретения клетки, в которые вводят соединение или композицию в соответствии с предложенными способами, представляют собой стволовые клетки или клетки-предшественники, так как из этих клеток развиваются другие клетки организма. В другом предпочтительном варианте реализации изобретения обрабатываемые клетки представляют собой клетки, в которых укорочение теломер происходит быстрее, чем в других типах клеток, например, эндотелиальные клетки, фибробласты, кератиноциты, клетки иммунной системы, включая клетки щитовидной и паращитовидной железы, а также лейкоциты и их предшественники, клетки кишечника, печени, клетки слизистой оболочки, например, пищевода и толстой кишки, и клетки десен и зубной пульпы.
[00122] Соответственно, в некоторых вариантах реализации изобретения клетки представляют собой клетки фибробластов, кератиноцитов, эндотелиальные клетки, эпителиальные клетки или кровяные клетки.
[00123] Этап введения можно проводить один или более раз в зависимости от необходимой степени удлинения теломер. В некоторых вариантах реализации предложенных способов клетка представляет собой выделенную клетку, а этап введения длится не более 96 часов, не более 72 часов, не более 48 часов, не более 36 часов, не более 24 часов, не более 18 часов, не более 12 часов, не более 8 часов, не более 4 часов или даже меньшее количество времени. В некоторых вариантах реализации изобретения этап введения длится по меньшей мере 2 часа, по меньшей мере 4 часа, по меньшей мере 8 часов, по меньшей мере 12 часов, по меньшей мере 18 часов, по меньшей мере 24 часа, по меньшей мере 36 часов, по меньшей мере 48 часов или даже большее количество времени. В предпочтительных вариантах реализации изобретения этап введения длится не более 48 часов, не более 96 часов или не более 1 недели. В других предпочтительных вариантах реализации изобретения этап введения длится по меньшей мере 2 часа. Следует понимать, что в случае, когда введение осуществляется путем трансфекции, время введения включает время, необходимое для восстановления клетки после трансфекции.
[00124] В некоторых вариантах реализации предложенных способов клетка представляет собой выделенную клетку, а этап введения проводят не более 6 раз, не более 5 раз, не более 4 раз, не более 3 раз, не более 2 раз или даже не более 1 раза. В некоторых вариантах реализации изобретения этап введения проводят не менее 2 раз, не менее 3 раз, не менее 4 раз, не менее 5 раз, не менее 6 раз или даже чаще.
[00125] В некоторых вариантах реализации изобретения этап введения проводят один раз или несколько раз на протяжении относительно короткого периода времени для повторного удлинения теломер, и после этого его не проводят на протяжении длительного периода времени до тех пор, пока снова не появится необходимость в удлинении теломер. Этот цикл можно повторять неограниченное количество раз. Такая схема лечения обеспечивает периодическое повторное удлинение теломер с интервалами между этапами введения, во время которых происходит укорочение теломер. Периодические способы лечения можно осуществлять как путем in vivo введения, так и путем in vitro введения, по желанию. В некоторых вариантах реализации изобретения этап введения в такой серии проводят не более 6 раз, не более 5 раз, не более 4 раз, не более 3 раз, не более 2 раз или даже не более 1 раза. В некоторых вариантах реализации изобретения этап введения проводят не менее 2 раз, не менее 3 раз, не менее 4 раз, не менее 5 раз, не менее 6 раз или даже чаще. Варьируя количество проведений этапа введения и применяемую дозу соединений или композиций согласно изобретению, можно контролировать достигаемую степень удлинения теломер.
[00126] В некоторых вариантах реализации изобретения способы согласно настоящему изобретению дополнительно включают этап культивирования клетки на специальном субстрате, предпочтительно эластичном субстрате. Известно, что такие субстраты предотвращают появление нежелательных изменений в клетке, которые обычно возникают на субстратах как следствие нефизиологической эластичности этих субстратов. Смотрите международную публикацию согласно РСТ № W02012/009682, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки. Эластичные субстраты могут дополнительно стимулировать выживаемость клеток.
[00127] Введение соединений или композиций согласно настоящему изобретению приводит к временной экспрессии теломеразной активности в клетке. Повышение активности легко определяется при помощи разных методов анализа, таких как, например, набор для детекции теломеразы Trapeze® RT (Millipore), который обеспечивает чувствительный, in vitro анализ в режиме реального времени, в котором используется флуориметрическая детекция и количественная оценка теломеразной активности, при этом возможно применение других способов измерения. В некоторых вариантах реализации изобретения теломеразная активность повышается по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 50% или даже более. В предпочтительных вариантах реализации изобретения теломеразная активность повышается по меньшей мере на 5%.
[00128] Как отмечалось ранее, одно из преимуществ предложенных способов состоит в том, что экспрессия теломеразной активности в обрабатываемых клетках является временной. В частности, такая временная экспрессия представляет собой противоположность более ранним способам, в которых ген обратной транскриптазы теломеразы вставляли в геномную последовательность клетки или каким-либо другим образом перманентно модифицировали генетическую основу клеток-мишеней, что приводило к конститутивной активности нуклеотидной последовательности.
[00129] Фигура 3 иллюстрирует некоторые из преимуществ раскрытых в данном документе соединений, композиций и способов. В частности, скорость удлинения теломер, которую обеспечивают эти соединения, композиции и способы, делает возможным поддержания состояния теломер путем очень нечастой доставки модРНК TERT. Экспрессируемая теломеразная активность приводит к быстрому удлинению теломер за короткий период до своего прекращения, позволяя, таким образом, защитному противораковому механизму, связанному с укорочением теломер, действовать большую часть времени. В период между этапами лечения сохраняется нормальная теломеразная активность и укорочение теломер и, следовательно, противораковый механизм, связанный с укорочением теломер и направленный на предотвращение неконтролируемой пролиферации, остается интактным, в то же время риск развития заболеваний, связанных с укорочением теломер, остается низким. В противоположность этому, наиболее эффективное лечение с применением небольших молекул для удлинения теломер требует постоянной доставки и, таким образом, сохраняется постоянный риск развития рака, и при всем этом оказывает слабое, неустойчивое влияние на длину теломер с полным отсутствием обнаруживаемого влияния на длину теломер приблизительно у половины пациентов.
[00130] Соответственно, в некоторых вариантах реализации предложенных способов экспрессия активности обратной транскриптазы теломеразы, т.е. время полужизни теломеразной активности, сохраняется не более 48 часов, не более 36 часов, не более 24 часов, не более 18 часов, не более 12 часов, не более 8 часов, не более 4 часов или даже меньшее количество времени. В некоторых вариантах реализации изобретения экспрессия активности обратной транскриптазы теломеразы сохраняется по меньшей мере 2 часа, по меньшей мере 4 часа, по меньшей мере 8 часов, по меньшей мере 12 часов, по меньшей мере 18 часов, по меньшей мере 24 часа, по меньшей мере 36 часов, по меньшей мере 48 часов или даже большее количество времени. В предпочтительных вариантах реализации изобретения экспрессия активности обратной транскриптазы теломеразы сохраняется не более 48 часов. В других предпочтительных вариантах реализации изобретения экспрессия активности обратной транскриптазы теломеразы сохраняется по меньшей мере 2 часа.
[00131] В некоторых вариантах реализации предложенных способов временная экспрессия не зависит от клеточного цикла.
[00132] Как отмечалось выше, временная экспрессия активности обратной транскриптазы теломеразы приводит к удлинению укороченных теломер в обрабатываемых клетках. Длину теломер легко можно определить такими методами как анализ длины терминального рестрикционного фрагмента (ТРФ), кПЦР, ММкПЦР и Q-FISH, как понятно специалисту в данной области техники. Сотрите, например, Kimura et al. (2010) Nat Protoc. 5:1596-607; doi:10.1038/nprot.2010.124. В некоторых вариантах реализации предложенных способов происходит увеличение длины теломер в обрабатываемых клетках по меньшей мере на 0,1 т.п.н., по меньшей мере на 0,2 т.п.н., по меньшей мере на 0,3 т.п.н., по меньшей мере на 0,4 т.п.н., по меньшей мере на 0,5 т.п.н., по меньшей мере на 1 т.п.н., по меньшей мере на 2 т.п.н., по меньшей мере на 3 т.п.н., по меньшей мере на 4 т.п.н., по меньшей мере на 5 т.п.н. или даже более.
[00133] Одним из преимуществ предложенных соединений, композиций и способов является скорость удлинения теломер, достигаемая при помощи этих способов. Указанные способы обеспечивают возможность кратковременного и, следовательно, безопасного лечения, так как нормальный защитный механизм, связанный с укорочением теломер, остается интактным большее количество времени. Лечение раскрытыми в данном документе соединениями и композициями приводит к доставке десятков или сотен копий модРНК TERT на клетку согласно измерениям при помощи абсолютно РВ-кПЦР, что существенно превышает количество копий эндогенной мРНК TERT, обнаруживаемое в клетках с высокой теломеразной активностью. Как правило, такие клетки содержат менее одной копии мРНК TERT на клетку. (Yi et al. (2001) Nucl. Acids Res. 29:4818-4825). Таким образом, лечение приводит к временному внесению большого количества копий модРНК, кодирующей TERT, в клетку, что приводит к быстрому удлинению теломер. Не привязываясь к теории, можно сказать, что большое количество копий модРНК, кодирующей TERT, может временно подавлять ингибиторный регуляторный механизм, который обычно препятствует настолько быстрому удлинению теломер при помощи TERT и других способов удлинения теломер, которое обеспечивают раскрытые в данном документе соединения, композиции и способы.
[00134] Временная экспрессия обратной транскриптазы теломеразы также приводит к повышению способности к репликации в обрабатываемых клетках. Повышение способности к репликации легко отслеживать в клетках, которые приближаются к репликативному старению, путем определения дополнительных удвоений популяции в таких клетках. Деление старых клеток невозможно стимулировать путем пассажа в культуре или обработки сывороткой. Кроме того, старые клетки часто характеризуются экспрессией активности рН-зависимой β-галактозидазы, экспрессией ингибиторов клеточного цикла р53 и р19 и другими измененными профилями генной экспрессии, а также увеличенным размером клеток. В отсутствие лечения соединениями и композициями согласно настоящему изобретению человеческие клетки легочных фибробластов, как правило, удваиваются 50-60 раз. При этом после применения серии из от одного до трех этапов обработки на протяжении всего нескольких дней для этих клеток наблюдали дополнительные 16-28 удвоений популяции. Повторная обработка через несколько недель снова обеспечивала дополнительный пролиферативный потенциал. Этот способ периодической обработки для периодического повторного удлинения теломер можно применять дополнительное количество раз с интервалами между обработками, которые будут зависеть от таких факторов, как скорость укорочения теломер, скорость деления клеток и степень удлинения теломер, которую обеспечивает обработка. Аналогично для человеческих микрососудистых дермальных эндотелиальных клеток, полученных от индивида преклонного возраста, в отсутствие предложенными композициями можно достичь только 1-2 удвоений популяции, в то время как для обрабатываемых клеток можно достичь 3, 4 и даже более удвоений популяции.
[00135] Соответственно, в некоторых вариантах реализации изобретения предложенные способы лечения увеличивают число удвоений популяции по меньшей мере на одно, два, четыре или даже более удвоений популяции. В некоторых вариантах реализации изобретения способы лечения увеличивают число удвоений популяции по меньшей мере на 5, 10, 15, 20 или даже более удвоений популяции.
[00136] В некоторых из вариантов реализации предложенных способов соединения или композиции согласно изобретению вводят в клетку животного путем электропорации. В конкретных вариантах реализации изобретения соединение согласно изобретению вводят в клетку животного путем электропорации в отсутствие носителя для доставки. В другом конкретном варианте реализации изобретения соединение согласно изобретению и РНК-компонент теломеразы вводят в клетку животного путем электропорации.
Наборы
[00137] В другом аспекте в настоящем изобретении предложены готовые к применению наборы для применения для удлинения теломер в клетках млекопитающих. Наборы содержат любые из вышеописанных соединений или композиций с прилагающимися инструкциями по их применению. В некоторых вариантах реализации изобретения наборы дополнительно содержат упаковочные материалы. В предпочтительных вариантах реализации изобретения упаковочные материалы являются воздухонепроницаемыми. В этих вариантах реализации изобретения упаковочные материалы, необязательно, могут быть наполнены инертным газом, таким как, например, азот, аргон и тому подобные. В некоторых вариантах реализации изобретения упаковочные материалы включают контейнер из металлической фольги, такой как, например, запечатанный алюминиевый пакет и тому подобное. Такие упаковочные материалы хорошо известны специалистам в данной области техники.
[00138] В некоторых вариантах реализации изобретения набор может дополнительно содержать осушитель, культуральную среду, ингибитор РНКазы или другие компоненты. В некоторых вариантах реализации изобретения набор может дополнительно содержать комбинацию из более чем одного из этих дополнительных компонентов. В некоторых вариантах реализации наборов композиция набора является стерильной.
Дополнительные аспекты
[00139] В еще одном аспекте в данном изобретении предложены новые соединения, композиции, наборы и способы в соответствии с нижеприведенными пронумерованными пунктами:
1. Композиция для удлинения теломер, содержащая:
рибонуклеиновую кислоту, содержащую по меньшей мере один модифицированный нуклеозид и кодирующую обратную транскриптазу теломеразы; и
носитель для доставки для рибонуклеиновой кислоты; при этом в клетке, обработанной композицией, происходит удлинение теломер.
2. Композиция по пункту 1, отличающаяся тем, что обратная транскриптаза теломеразы представляет собой обратную транскриптазу теломеразы млекопитающего, птицы, рептилии или рыбы или вариант, который сохраняет теломеразную каталитическую активность.
3. Композиция по пункту 2, отличающаяся тем, что обратная транскриптаза теломеразы представляет собой обратную транскриптазу теломеразы человека.
4. Композиция по пункту 1, отличающаяся тем, что рибонуклеиновая кислота содержит 5'-кэп, 5'-нетранслируемую область, 3'-нетранслируемую область и поли(А)-хвост.
5. Композиция по пункту 4, отличающаяся тем, что поли(А)-хвост повышает стабильность рибонуклеиновой кислоты.
6. Композиция по пункту 4, отличающаяся тем, что 5'-нетранслируемая область или 3'-нетранслируемая область содержит последовательность из стабильной мРНК или эффективно транслируемой мРНК.
7. Композиция по пункту 4, отличающаяся тем, что 5'-нетранслируемая область и 3'-нетранслируемая область обе содержат последовательность из стабильной мРНК или эффективно транслируемой мРНК.
8. Композиция по пункту 4, отличающаяся тем, что 5'-кэп, 5'-нетранслируемая область или 3'-нетранслируемая область стабилизирует рибонуклеиновую кислоту, повышает скорость трансляции рибонуклеиновой кислоты или модулирует иммуногенность рибонуклеиновой кислоты.
9. Композиция по пункту 1, отличающаяся тем, что по меньшей мере один модифицированный нуклеозид снижает иммуногенность рибонуклеиновой кислоты.
10. Композиция по пункту 1, отличающаяся тем, что рибонуклеиновая кислота представляет собой синтетическую рибонуклеиновую кислоту.
11. Композиция по пункту 10, отличающаяся тем, что синтетическая рибонуклеиновая кислота представляет собой очищенную синтетическую рибонуклеиновую кислоту.
12. Композиция по пункту 11, отличающаяся тем, что синтетическая рибонуклеиновая кислота очищена с целью удаления иммуногенных компонентов.
13. Композиция по пункту 1, отличающаяся тем, что рибонуклеиновая кислота кодирует обратную транскриптазу теломеразы человека, кошки, собаки, мыши, коровы, овцы, свиньи, африканского слона, курицы, крысы, данио, японской медаки или шимпанзе или полипептид, обладающий по меньшей мере 95% идентичности последовательности с обратной транскриптазой теломеразы.
14. Композиция по пункту 1, отличающаяся тем, что композиция дополнительно содержит РНК-компонент теломеразы.
15. Композиция по пункту 14, отличающаяся тем, что РНК-компонент теломеразы представляет собой РНК-компонент теломеразы млекопитающего, птицы, рептилии или рыбы.
16. Композиция по пункту 15, отличающаяся тем, что РНК-компонент теломеразы представляет собой РНК-компонент теломеразы человека.
17. Композиция по пункту 1, отличающаяся тем, что носитель для доставки представляет собой экзосому, липидную наночастицу, полимерную наночастицу, природную или искусственную липопротеиновую частицу, катионный липид, белок, комплекс белок-нуклеиновая кислота, липосому, виросому или полимер.
18. Композиция по пункту 17, отличающаяся тем, что носитель для доставки представляет собой катионный липид.
19. Композиция по пункту 1, отличающаяся тем, что носитель для доставки является неиммуногенным.
20. Способ удлинения теломер, включающий этап: введения композиции по любому из пунктов 1-19 в клетку животного, при этом происходит удлинение по меньшей мере одной теломеры в клетке.
21. Способ по пункту 20, отличающийся тем, что клетка содержит по меньшей мере одну укороченную теломеру перед этапом введения.
22. Способ по пункту 20, отличающийся тем, что клетка получена от субъекта, страдающего от или подверженного риску развития возрастного заболевания, возрастного патологического состояния или возрастного ухудшения функциональности или внешнего вида.
23. Способ по пункту 20, отличающийся тем, что клетка получена от субъекта, страдающего от или подверженного риску развития рака, заболевания сердца, инсульта, диабета, болезни Альцгеймера, остеопороза, ухудшения физических данных или внешнего вида, физической травмы или хронического физического стресса, или физиологической травмы или хронического физиологического стресса.
24. Способ по пункту 20, отличающийся тем, что клетка представляет собой соматическую клетку эндодермальной, мезодермальной или эктодермальной линии дифференцировки, или зародышевой линии, или эмбриональную клетку.
25. Способ по пункту 20, отличающийся тем, что клетка представляет собой индуцированную плюрипотентную стволовую клетку или клетку, применяемую для получения индуцированной плюрипотентной стволовой клетки.
26. Способ по пункту 20, отличающийся тем, что клетка представляет собой трансдифференцированную клетку или клетку, применяемую для получения трансдифференцированной клетки.
27. Способ по пункту 20, отличающийся тем, что клетка представляет собой выделенную клетку, а этап введения длится не более 48 часов.
28. Способ по пункту 20, отличающийся тем, что клетка представляет собой выделенную клетку, а этап введения осуществляют не более четырех раз.
29. Способ по пункту 20, отличающийся тем, что клетка представляет собой выделенную клетку, а способ дополнительно включает этап измерения теломеразной активности в клетке.
30. Способ по пункту 29, отличающийся тем, что этап введения приводит к повышению теломеразной активности в клетке.
31. Способ по пункту 30, отличающийся тем, что теломеразная активность временно повышается по меньшей мере на 5%.
32. Способ по пункту 30, отличающийся тем, что время полужизни повышенной теломеразной активности составляет не более 48 часов.
33. Способ по пункту 20, отличающийся тем, что клетка представляет собой выделенную клетку, а способ дополнительно включает этап измерения средней длины теломер в клетке.
34. Способ по пункту 33, отличающийся тем, что средняя длина теломер увеличивается по меньшей мере на 0,1 т.п.н.
35. Способ по пункту 20, отличающийся тем, что клетка представляет собой выделенную клетку, а способ дополнительно включает этап измерения потенциала удвоения популяции в клетке.
36. Способ по пункту 35, отличающийся тем, что потенциал удвоения популяции увеличивается по меньшей мере на 25%.
37. Способ по пункту 20, отличающийся тем, что клетка получена от млекопитающего субъекта.
38. Способ по пункту 37, отличающийся тем, что клетка получена от субъекта-человека.
39. Способ по пункту 20, отличающийся тем, что клетка представляет собой выделенную клетку.
40. Способ по пункту 20, отличающийся тем, что клетка не является выделенной клеткой.
41. Набор для удлинения теломер в клетке животного, содержащий: композицию по любому из пунктов 1-19; и инструкции по применению композиции для удлинения теломер.
42. Набор по пункту 41, дополнительно содержащий упаковочные материалы.
43. Набор по пункту 42, отличающийся тем, что упаковочные материалы являются воздухонепроницаемыми.
44. Набор по пункту 42, отличающийся тем, что упаковочные материалы включают контейнер из металлической фольги.
45. Набор по пункту 41, дополнительно содержащий осушитель.
46. Набор по пункту 41, дополнительно содержащий культуральную среду.
47. Набор по пункту 41, дополнительно содержащий ингибитор РНКазы.
48. Набор по пункту 41, отличающийся тем, что композиция является стерильной.
[00140] Для специалиста в данной области техники совершенно очевидно, что в отношении описанных в данном документе соединений, композиций, способов и наборов можно реализовывать другие подходящие модификации, не отступая при этом от объема изобретения или любого варианта его реализации. После подробного описания настоящего изобретения более четкое его понимание обеспечат нижеприведенные Примеры, которые включены в данный документ исключительно в иллюстративных целях и не ограничивают данное изобретение.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Высокоэффективное удлинение теломер в человеческих клетках с применением модифицированной мРНК, кодирующей теломеразу
[00141] Заболевания, связанные с недостаточным сохранением длины теломер, и необходимость в повышенной репликативной способности клеток для клеточной терапии и применений в биоинженерии мотивируют разработку безопасных способов удлинения теломер. Blackburn et al. (2010) Cancer Prev Res (Phila) 3:394-402; Calado et al. (2012) Leukemia 26:700-707; Alter et al. (2009) Blood 113:6549-6557; Mohsin et al. (2012) Journal of the American College of Cardiology doi:10.1016/j.jacc.2012.04.047. Доставка мРНК для временного повышения количества кодируемого мРНК белка для терапевтических применений облегчается путем внесения модифицированных нуклеозидов для снижения иммуногенности и повышения стабильности. Kariko et al. (2005) Immunity 23:165-175; Kariko et al. (2011) Nucleic Acids Res. 39:el42; doi:10.1093/nar/gkr695.
[00142] Чтобы быть терапевтически эффективным, лечение, направленное на удлинение теломер, в идеале должно быть неимуногенным; специфическим; его можно инициировать до того, как произойдет укорочение теломер до критически короткой длины, что приводит к нестабильности хромосом и повышенному риску развития рака (Wentzensen et al. (2011) Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 20:1238-1250; Calado et al. (2012) Leukemia 26:700-707; Artandi and DePinho (2010) Carcinogenesis 31:9-18); временным и периодическим, чтобы нормальный противораковый механизм, связанный с укорочением теломер, мог действовать практически непрерывно; эффективным даже в случае медленно делящихся клеток, таких как некоторые популяции клеток-предшественников и стволовых клеток; доставляемым in vitro и in vivo при помощи неиммуногенных носителей; и наконец, обеспечивающим количество дополнительных клеточных делений достаточное только для потенциального облегчения или предотвращения заболеваний, связанных с недостаточным сохранением теломер, или обеспечивающим достаточную амплификацию клеток для клеточной терапии или применений в биоинженерии. Существующие виды лечения, включая лечение при помощи небольших молекул, не отвечают всем этим критериям. Harley et al. (2011) Rejuvenation Res. 14:45-56. Вирусная доставка TERT, хотя и осуществима, но несет риск, связанный с инсерционным мутагенезом, и, таким образом, ее безопасность вызывает серьезные сомнения. Виды лечения, включающие постоянную сверхэкспрессию теломеразы, являются потенциально небезопасными, так как в клетке, содержащей онкогенную мутацию, связанную как с критическим укорочением теломер и обусловленной им нестабильностью хромосом (O'Sullivan and Karlseder (2010) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11:171-181), так и с другой причиной, постоянная экспрессия теломеразы, как вследствие второй мутации, так и действия лекарственного препарата, может способствовать злокачественному развитию, стимулируя неограниченную пролиферацию. Artandi and DePinho (2010) Carcinogenesis 31:9-18; Ding et al. (2012) Cell 148:896-907.
[00143] Критериям безопасного удлинения теломер отвечает подход на основе РНК, чему способствует недавнее открытие, что некоторые нуклеозиды природного происхождения, которые можно обнаружить в РНК, повышают стабильность и снижают иммуногенность экзогенной РНК при доставке в клетки. Kariko et al. (2005) Immunity 23:165-175. Примеры таких нуклеозидов перечислены в Таблице 4. Не привязываясь к теории, можно сказать, что эти модифицированные версии канонических нуклеозидов могут приводить к тому, что толл-подобные рецепторы врожденной иммунной системы будут отличать эндогенную модРНК от чужеродной РНК, не содержащей эти нуклеозиды. Доставка в достаточной степени очищенной синтетической модРНК, содержащей эти неканонические нуклеозиды, в клетки приводит к повышению стабильности модРНК и временному повышению уровня белка, кодируемого мод РНК, при сниженном или отсутствующем иммунном ответе. Kariko et al. (2011) Nucleic Acids Res. 39:el42; doi:10.1093/nar/gkr695. Таким образом, доставка экзогенной модРНК представляет беспрецедентные возможности для применений, в которых требуется временная выработка белка. Например, биомиметики модРНК трансфицировали в фибробласты, перепрограммируя их таким образом в плюрипотентные стволовые клетки. Yakubov et al. (2010) Biochem. Biophys. Res. Commun. 394:189-193. Биомиметики модРНК также инъецировали мышам для эффективного лечения в модели дефицита белка легочного сурфактанта и для повышения уровней эритропоэтина и гематокрита. Kormann el al. (2011) Nat. Biotechnol. 29:154-157. Как описано выше, нуклеозиды, применяемые в модРНК, применяемой в данном документе, выбирали не только для повышения стабильности, но также для снижения или устранения иммуногенности, а также для повышения трансляционной эффективности РНК. Трансфекция дендритных клеток немодифицированной мРНК, кодирующей hTERT, хоть и приводит к повышению теломеразной активности в клетках, но также вызывает сильный hTERT-специфический цитотоксичный ответ Т-лимфоцитов. Saeboe-Larssen et al. (2002) Journal of Immunological Methods 259:191-203. Следовательно, подходы, в которых применяется немодифицированная РНК, скорее всего, являются неэффективными в отношении удлинения теломер в клетках.
[00144] Таким образом, доставку в клетки модРНК, кодирующей TERT, можно применять для временного повышения уровней белка TERT и теломеразной активности, которых достаточно для удлинения теломер и повышения способности к репликации до конечного количества. Повышение уровней теломеразной активности происходит достаточно быстро, чтобы сделать возможным лечение, направленное на удлинение теломер, краткосрочным и нечастым (смотрите Фигуру 1а и Фигуру 3).
[00145] Чтобы продемонстрировать возможности указанного подхода, синтезировали модРНК TERT, используя соотношения между каноническими и неканоническими нуклеозидами, которые обеспечивают стабильность, эффективную трансляцию и сниженную или отсутствующую иммуногенность. Yakubov et al. (2010) Biochem. Biophys. Res. Commun. 394:189-193; Kariko et al. (2011) Nucleic Acids Res. 39:el42; doi: 10.1093/nar/gkr695. Синтетическая модРНК содержит 5' и 3' НТО мРНК бета-глобина, которая характеризуется относительно большим временем полужизни. Для дополнительного повышения стабильности модРНК содержит длинный, 151-нуклеотидный поли(А)-хвост. Чтобы максимизировать соответствие длинной ДНК-матрицы TERT, применяемой для реакции in vitro транскрипции для получения РНК, ДНК-матрица получали при помощи подхода на основе плазмид, а не на основе ПЦР.
[00146] Чтобы отличить действительное удлинение теломер от выборки клеток с длинными теломерами из гетерологичной исходной популяции, синтезировали контрольную модРНК, которая кодирует каталитически неактивную форму TERT (CI TERT) с мутацией в одном остатке D712A, где один из триады металл-координирующих аспартатов в каталитическом сайте домена обратной транскриптазы замещен аланином, что приводит к утрате каталитической активности CI TERT, но сохранению ее структурной невредимости в той степени, которая позволяет связываться с матричной ДНК, и сохранению стабильности TERT в лизате ретикулоцитов. Wyatt (2009) "Structure-Function Analysis of the Human Telomerase Reverse Transcriptase" University of Calgary, Ph.D. Thesis (http://dspace.ucalgary.ca/bitstream/1880/47511/1/2009_Wyatt_PhD.pdf).
[00147] Человеческие фетальные легочные фибробласты MRC-5 были выбраны в качестве тестируемых клеток в этом примере, так как эти и другие штаммы человеческих фибробластов на протяжении десятилетий служили рабочим материалом в области изучения теломер и, следовательно, обеспечивают многочисленные данные для разработки экспериментального дизайна и анализа. Клетки MRC-5 также характеризуются относительно низкой эндогенной теломеразной активностью и демонстрируют укорочение теломер и в конечном итоге старение. Так как окислительный стресс повышает скорость укорочения теломер в клетках MRC-5 (von Zglinicki et al. (2000) Free Radie. Biol. Med. 28:64-74) и приводит к локализации TERT в цитоплазме, где она не может удлинять теломеры (Ahmed et al. (2008) J. Cell. Sci. 121:1046-1053), клетки культивировали в среде с 5% превышающим содержанием кислорода. Чтобы дополнительно увеличить вероятность успеха, клетки культивировали в среде, оптимизированной для выработки белка в клетках MRC-5 (Wu et al. (2005) Cytotechnology 49:95-107).
[00148] Эффективность удлинения теломер при помощи модРНК зависит от нескольких факторов, включая эффективность трансфекции, трансляции и сборки в функциональную теломеразу, а также способность по меньшей мере временно обходить экстенсивные механизмы посттрансляционной регуляции, которые ингибируют TERT и теломеразу во многих типах клеток, включая клетки MRC-5. Хотя эффективность трансляции при применении более мелких видов модРНК, таких как яЗФБ (0,8 т.п.н.), в клетках MRC-5, как правило превышает 90% даже при низких концентрациях модРНК (Фигура 6), открытая рамка считывания TERT является относительно крупной (3399 п. н.), вследствие чего конструкция модРНК TERT содержит НТО и поли(А)-хвост, что делает конструкцию даже более крупной (3751 п. н.). Однако, как показано на Фигуре 1b, как TERT, так и CI TERT были эффективно трансфицированы в клетки MRC-5 при помощи катионного липида (согласно данным РТ-ПЦР для мРНК, полученной в конце обработки из клеток MRC-5, обрабатываемых 1 мкг/мл модРНК TERT на протяжении 5 часов). Кроме того, доставка модРНК TERT или CI TERT модРНК приводила к эквивалентному и существенному (Р<0,03 и <0,01, соответственно) повышению количества белка, распознаваемого анти-TERT антителом, с размером приблизительно 122 кДа, что близко к оценочному размеру TERT, составляющему 127 кДа (Фигура 1e). Wick et al. (1999) Gene 232:97-106. Уровни белка измеряли методом количественного инфракрасного флуоресцентного вестерн-блоттинга. Уровни белка TERT существенно не отличаются для клеток, обработанных TERT, и клеток, обработанных CI TERT (n=3).
[00149] Для образования функциональной теломеразы TERT должна надлежащим образом свернуться и образовать комплекс по меньшей мере с TERC. Также теломераза подвергается сильной посттрансляционной регуляции, включая цитоплазматическую локализацию и ингибиторное фосфорилирование. Cifuentes-Rojas and Shippen (2012) Mutât. Res. 730:20-27; doi:10.1016/j.mrfmmm.2011.10.003. Действительно, не все клетки, экспрессирующие TERT, способны сохранять теломеры. Counter et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:14723-14728. Доставка модРНК TERT повышает теломеразную активность дозозависимым образом вплоть до максимума при концентрации, составляющей приблизительно 0,6 мкг/мл (смотрите Фигуру 7), а в последующих экспериментах использовали концентрацию 1 мкг/мл. Уровни теломеразной активности быстро повышались, но возвращались к базовым уровням в пределах приблизительно 48 часов, а модРНК CI TERT не приводила к изменению теломеразной активности (Фигура 1d). Теломеразную активность определяли при помощи анализа TRAPeze® RT на основе кПЦР (n=3).
[00150] Так как посттрансляционная регуляция TERT частично опосредуется цитоплазматической секвестрацией в клетке цикл-зависимым образом, также исследовали субклеточную локализацию TERT в обработанных и необработанных клетках. Cifuentes-Rojas et al. (2011) Mutat. Res. doi:10.1016/j.mrfmmm.2011.10.003. В полном соответствии с результатами вестерн-блоттинга, иммуноцитохимия показала наличие многочисленного, хотя, возможно, ингибированного, белка, распознаваемого антителом к TERT, в необработанных клетках MRC-5, что приводит к трудностям в отличии эндогенной TERT от экзогенной (данные не показаны).
[00151] Клетки в пределах приблизительно 10 удвоений популяции (УП) в начале репликативного старения использовали для определения действия лечения при помощи модРНК TERT на длину теломер и способность к репликации. Решение использовать именно эти клетки основывалось по меньшей мере на двух факторах. Во-первых, клетки на этой стадии содержат относительно короткие теломеры, а так как теломераза удлиняет преимущественно короткие теломеры, в том числе в клетках MRC-5, обработка клеток на этой стадии должна приводить к более заметному и легко выявляемому эффекту. Britt-Compton et al. (2009) FEBS Lett. 583:3076-3080. Во-вторых, при обработке клеток на этой стадии снижается количество времени, необходимое для определения того, привела ли обработка к повышению способности к репликации. В существующих условиях репликативное старение начинается приблизительно через 50 У Π после получения клеток MRC-5 от поставщика (более подробно смотрите в разделе, описывающем Способы), поэтому было решено обрабатывать клетки приблизительно через 40 УП. Средняя длина теломер в клетках MRC-5 на этой стадии составляет приблизительно 5-7 т.п.н. в зависимости от истории культивирования и УП на момент получения от поставщика. Sitte et al. (1998) Free Radie. Biol. Med. 24:885-893; MacKenzie et al. (2000) Exp. Cell Res. 259:336-350.
[00152] При разработке дизайна схемы обработки принимали во внимания несколько факторов (Фигура 4а). Скорость удлинения теломер при вирусной транедукции TERT в клетки MRC-5 варьируется, но остается порядка около 0,2 т.п.н. на одно деление. MacKenzie et al. (2000) Exp. Cell Res. 259:336-350. Скорость укорочения теломер в клетках MRC-5 варьируется в зависимости от условий и практической реализации культивирования (Sitte et al. (1998) Free Radie. Biol. Med. 24:885-893; von Zglinicki et al. (2000) Free Radie. Biol. Med. 28:64-74), но соответствует приблизительно 0,1 т.п.н. на УП в атмосфере кислорода окружающей среды (Sitte et al. (1998) Free Radie. Biol. Med. 24:885-893). Клетки культивировали в 5% кислороде, так как теломеры клеток MRC-5 в окислительных условиях укорачиваются медленнее, von Zglinicki et al. (2000) Free Radie. Biol. Med. 28:64-74. Наблюдаемое время УП для клеток MRC-5 на этапе УП 40 составляло приблизительно 33 часа. Учитывая эти данные, можно ожидать, что понадобится многоразовая обработка, чтобы зарегистрировать удлинение теломер в пределах разрешения выбранных методов измерения длины теломер, а именно, анализа рестрикционного фрагмента теломер (РФТ) и количественной флуоресцентной in situ гибридизации (Q-FISH). Выбранный интервал между обработками составил 48 часов, так как было обнаружено, что за это время уровни теломеразной активности возвращаются к базовому уровню после единичной обработки.
[00153] Как показано на Фигурах 3(b)-(d), обработка клеток MRC-5 модРНК hTERT приводит к существенному увеличению длины теломер в этих клетках по сравнению как с необработанными клетками, так и обработанными одним средством доставки. На флуоресцентных микрофотографиях метафазных клеток MRC-5 после обработки показано расположение теломерного зонда в хромосомах этих клеток (Фигура 4(e)).
[00154] Влияние обработки на длину теломер определяли также методом количественной флуоресцентной in situ гибридизации (Q-FISH) (Фигура 4(f)), так как этот метод обеспечивает относительно высокое разрешение (0,3 т.п.н.) и так как флуоресценция теломерных зондов Q-FISH прямо пропорциональна длине теломер. Lansdorp et al. (1996) Hum. Mol. Genet. 5:685-691; Martens et al. (1998) Nat. Genet. 18:76-80. Так как способность к репликации является функциональным параметром, повышение которого в результате удлинения теломер представляет наибольший интерес, строили стандартную кривую зависимости количества удвоения популяции клеток MRC-5 от длины теломер, определенной методом Q-FISH (Фигура 4(g)(i)). После трех обработок УП 40 MRC-5 при помощи мРНК TERT с 48-часовыми интервалами средняя общая длина теломер на клетку увеличивалась на 56+/-5% (n=15 клеток для каждой из двух биологических реплик на каждом этапе обработки; «усы» представляют s.e.m.). Длина теломер в обработанных клетках УП 40 была сходна с длиной в необработанных клетках УП 3 (Фигура 4(g)(ii)) (верхняя пунктирная линия), и таким образом, обработка приводит к удлинению теломер на величину их укорочения в этих клетках за 37 УП. При таком количестве УΠ в стандартных культуральных условиях теломеры MRC-5 укорачиваются на >1 т.п.н. Sitte et al. (1998) Free Radie. Biol. Med. 24:885-893. В соответствии с этим, наблюдаемое увеличение длины теломер на 56% соответствует увеличению средней длины теломер, составляющему приблизительно 0,6-2,5 т.п.н. на основании факта, что клетки MRC-5 на этапе УП 40 характеризуются средней длиной теломер 5-7 т.п.н. согласно данным РФТ (Sitte et al. (1998) Free Radie. Biol. Med. 24:885-893; MacKenzie et al. (2000) Exp. Cell Res. 259:336-350), что превышает длину теломер приблизительно на 2,5-4 т.п.н., и, следовательно, фактическая средняя длина теломер в клетках MRC-5 на этапе УП 40 соответствует диапазону 1-4,5 т.п.н. Aubert et al. Mutat. Res. 730:59-67. Так как общее время обработки составляет 144 часа, а время удвоения популяции клеток составляло приблизительно 33 ч, за это время произошло приблизительно 4-5 УП клеток. Таким образом, скорость удлинения теломер составила приблизительно 0,1-0,6 т.п.н. на УП, при этом верхний диапазон соответствует максимальной скорости, которую когда-либо регистрировали после вирусной транедукции ДНК, кодирующей TERT, а нижний диапазон сопоставим с типичной скоростью, наблюдаемой при вирусной доставке. Как и ожидалось, длина теломер в необработанных клетках такая же, как и в УП 40 клетках во время получения стандартной кривой (нижняя пунктирная линия на Фигуре 4(g)).
[00155] После этого исследовали влияние обработки мРНК TERT на способность клеток к репликации. Как и ожидалось, необработанные клетки и клетки, обработанные только носителем, старели в пределах стандартного диапазона в 50-60 УП (Фигура 5а). В отличие от них, клетки, обработанные мРНК TERT, продолжали дозозависимым образом пролиферировать после УП, при котором контрольные популяции достигали репликативного старения, при этом каждая дополнительная обработка обеспечивала существенное количество дополнительных УП.
[00156] Три обработки мРНК TERT приводили к повышению способности к репликации, составляющему 28+/-1,5 УП. Этот результат согласуется с оценкой, согласно которой удлинение теломер составило >1 т.п.н., так как теломеры MRC-5 укорачиваются приблизительно на 0,1 т.п.н. за УП (Sitte et al. (1998) Free Radie. Biol. Med. 24:885-893) в атмосфере кислорода окружающей среды (20%), а обрабатываемые клетки культивировали в 5% кислорода, при этом теломеры укорачиваются медленнее. Наблюдаемое увеличение реплйкативной способности обрабатываемых клеток, составляющее 28 УП, соответствует утрате реплйкативной способности, которая наступает для человеческих фибробластов за более чем десять лет нормального человеческого старения. Takubo et al. (2010) Geriatr Gerontol Int. 10 Suppl 1:S197-206; doi:10.1111/j.1447- 0594.2010.00605.x.; Allsopp, R. C. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10114-10118.
[00157] Для терапевтических применений важно то, что все обрабатываемые клетки, изучаемые к настоящему времени, в конечном итоге старели, и в действительности старели за меньшее количество УП, чем необработанные клетки с такой же длиной теломер, что можно было ожидать, так как обработанные клетки прошли десятки дополнительных УП по сравнению с необработанными клетками с теломерами аналогичной длины, во время которых происходило накопление повреждений ДНК, не связанных с теломерами, или других повреждений, которые могут влиять на скорость укорочения теломер или каким-либо другим образом способствовать индукции репликативного старения.
[00158] После того, как клетки MRC-5 достигают и входят в период репликативного старения, они увеличиваются в несколько раз по сравнению с диаметром, характерным для ранних пассажей (Фигура 8а). Как и в случае репликативного старения, это преобразование было замедлено в клетках, обработанных модРНК TERT, но не в клетках, обработанных модРНК CI TERT или одним носителем (Фигура 8b).
[00159] В соответствии с тем, что модРНК CI TERT не приводит к повышению теломеразной активности (Фигура 1d), обработка при помощи модРНК CI TERT не изменяет распределение длины теломер по сравнению с необработанными клетками, и также модРНК CI TERT не повышает способность к репликации, несмотря на то, что она приводит к повышению уровня белка TERT, эквивалентному тому, которое обеспечивает модРНК TERT (Фигура 1с). Так как единственной разницей между TERT и CI TERT является замещение в одном остатке, которое лишает CI TERT способности переносить нуклеотиды в теломеры, эти результаты подтверждают гипотезу, что увеличение длины теломер и способности к репликации, наблюдаемое в клетках, обработанных модРНК TERT, происходит действительно вследствие удлинения теломер по меньшей мере в некоторых из обработанных клеток, а не выборки клеток с более длинными теломерами из предсуществующей подпопуляции.
[00160] Результаты этого примера демонстрируют, что доставка модРНК TERT в человеческие клетки временно повышает теломеразную активность, приводит к быстрому удлинению теломер и повышает способность к репликации до конечного и, следовательно, безопасного предела. Очищенные биомиметики модРНК также являются гипоиммуногенными. Kariko et al. (2011) Nucleic Acids Res. 39:el42; doi:10.1093/nar/gkr695. Таким образом, доставка модРНК соответствует нескольким важным критериям для терапевтического лечения, включающего удлинение теломер, и также является перспективной в отношении других критериев, включая специфичность, нацеленную доставку и способность преодолевать посттрансляционную регуляцию. В контексте специфичности сверхэкспрессия TERT также может оказывать влияние на другие гены, такие как Wnt (Park et al. (2009) Nature 460:66-72), но такого влияния можно избежать путем доставки модРНК, кодирующей TERT с мутациями в участках связывания факторов, которые опосредуют любые такие неспецифические эффекты. В контексте доставки недавнее открытие того, что в организме человека модРНК транспортируется в экзосомах между клетками посредством крови и других жидкостей организма, делает возможной доставку модРНК с применением экзосом для удлинения теломер и других применений. Lakhal and Wood (2011) Bioessays 33:737-741. Экзосомы успешно использовали для доставки миметиков модРНК в клетки in vitro (данные не показаны). В контексте посттрансляционной регуляции зависимой и независимой от клеточного цикла ингибиторной посттрансляционной регуляции TERT можно избежать путем доставки мод РНК, кодирующей TERT с мутациями в одном или более известных участков, которые опосредуют такую активность, таких как последовательность ядерного экспорта, или путем совместной доставки модРНК, кодирующей другие компоненты теломеразных или теломерных комплексов. Эти подходы делают возможным удлинение теломер даже в медленно делящихся или неделящихся клетках, что делает лечение при помощи модРНК TERT подходящим для покоящихся или медленно делящихся популяций стволовых клеток и клеток-предшественников. Таким образом, удлинение теломер на основе модРНК находит непосредственное применение в повышении способности к репликации клеток для исследований и дополнительно для клеточной терапии, применений в биоинженерии и, in vivo лечении, которое направлено на заболевания и патологические состояния, связанные с нарушением сохранения теломер.
[00161] Подводя итог, следует отметить, что модРНК, кодирующую обратную транскриптазу теломеразы (TERT) человека, доставляли в человеческие легочные фибробласты MRC-5 три раза на протяжении 96 часов. Для теломер в обработанных клетках наблюдали удлинение на>1 т.п.н., которое соответствует величине укорочения теломер фибробластов в среднем за более чем десять лет старения человека. Takubo et al. (2010) Geriatr Gerontol Int. 10 Suppl 1:S197-206; doi:10.1111/j.1447-0594.2010.00605.x. Теломеразная активность возвращается к уровням, наблюдаемым до обработки, а начало репликативного старения в обработанных клетках было отложено приблизительно на 30 удвоений популяции и зависело от дозы. Таким образом, доставка РНК теломеразы, содержащей модифицированные нуклеозиды, в клетки обеспечивает быстрый и гипоиммуногенный или неиммуногенный способ, а применение РНК является целесообразным подходом для удлинения теломер для разнообразных применений.
СПОСОБЫ
[00162] Генерация и синтез матрицы модРНК. Открытую рамку считывания (ОРС) человеческой TERT дикого типа (ДТ), используемую для генерации ДНК-матриц для синтеза модРНК и идентичную стандартной последовательности NCBI-варианта 1 транскрипта человеческой TERT NM 198253.2, генерировали путем внесения модификации G516D в ОРС плазмиды pBABE-neo-hTERT (плазмида Addgene 1774). Остаток 516 находится в мотиве QFP N-концевого удлинения TERT, мотиве, который связывают с мультимеризацией и РНК-связыванием TERT. Каталитически неактивный мутант TERT (CI TERT) генерировали из последовательности ДТ TERT путем введения мутации D712A. ОРС TERT, ДТ и CI, вставляли в MCS (участок множественного клонирования) исходной плазмиды, содержащей промотор Т7, 5' НТО человеческого бета-глобина (hBB), MCS, 3' НТО hBB, 151 п.н. поли(А)-последовательность и рестрикционный сайт для линеаризации с ферментом класса IIs за поли(А)-последовательностью. Полученную в результате промежуточную плазмиду секвенировали по меньшей мере в четырех повторах, чтобы гарантировать соответствие, линеаризовали и транскрибировали в кэпированную РНК при помощи РНК-полимеразы из набора MEGAscript Т7 (Ambion, Austin, Texas) и специальной нуклеотидной смеси из канонических и неканонических нуклеотидов (TriLink BioTechnologies), в которой конечные концентрации нуклеотидов на 40 мкл IVT реакции составляли 7,5 мМ для каждого из аденозин-5'-трифосфата (АТР), 5-метилцитидин-5'-трифосфата (т5С) и псевдоуридин-5'-трифосфата (ψ), 1,5 мМ для гуанозин-5'-трифосфата (GTP) и 6 мМ для кэп-аналога (ARCA, NEB), что соответствовало молярному соотношению ATP:m5C:ψ:GTP:ARCA of 1:1:1:0.2:0,8. Для дополнительного снижения потенциальной иммуногенности мРНК, связанной с 5'-3Р-несущей фракцией (-20% от общего количества), продукты IVT обрабатывали фосфатазой (антарктическая фосфатаза, NEB). Размер и структурную целостность продуктов модРНК подтверждали при помощи денатурирующего арагозного гель-электрофореза.
[00163] Клетки и клеточные культуры. Человеческие фетальные легочные фибробласты MRC-5 (АТСС CCL-171) получали от АТСС в пассаже 14, что является текущим номером пассажа в их товарной описи. Так как АТСС не указывает номер УП, приведенные в данном документе значения УП относятся к количеству УП после получения клеток от АТСС, которое соответствует УП 0. Для укорочения теломер в препарате для экспериментов по удлинению теломер клетки культивировали, используя руководства АТСС, в DMEM с 10% ФБС в кислородной атмосфере окружающей среды и 5% СО2. Обработку, направленную на удлинение теломер, начинали приблизительно на этапе УП 40 после получения клеток от АТСС. По меньшей мере за 48 часов до начала обработки модРНК клетки переносили в среду с 5% кислорода и DMEM, содержащую 20% ФБС и пенициллин-стрептомицин. Клетки обрабатывали по меньшей мере через 24 часа после посева и за 24 часа до обработки трипсином.
[00164] Трансфекция модРНК. Клетки трансфицировали при помощи 0,4 нМ модРНК TERT и 2,0 нМ РНК TERC, если не указано иное, используя катионный липид Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen), в восстановленной сывороточной среде Opti-MEM (Invitrogen) на протяжении 4-5 часов, после чего их возвращали в нормальную среду.
[00165] Определение теломеразной активности. Через 24 часа после начала трансфекционного периода клетки промывали ФСБ, обрабатывали трипсином, таблетировали при 500 г на протяжении 5 мин и промывали ФСБ, повторно таблетировали, а затем лизировали, следуя инструкциям из набора TRAPeze RT (Millipore). Этапы обратной транскрипции и кПЦР проводили при помощи Roche LightCycler 480 II и ABI 7900 HT. Теломеразную активность образцов всегда сравнивали с эталонным стандартом, прилагающимся к набору, так как кратность увеличения оказалась очень изменчивой, возможно, вследствие низкой теломеразной активности в клетках MRC-5.
[00166] Иммуноцитохимия. Через 24 часа после начала трансфекционного периода клетки промывали ФСБ, фиксировали в 2% параформальдегиде на протяжении 20 минут, промывали три раза ФСБ, блокировали в ФСБ, содержащем 7,5% БСА и 0,1% Тритон Х-100 на протяжении 1 часа, промывали три раза, инкубировали на протяжении ночи при 4°С в шейкере с анти-TERT антителом (АВСАМ 32020 при 1:50 или Rockland 600-401-252S при 1:500) в ФСБ с 5% БСА, промывали три раза, инкубировали на протяжении одного часа с вторичным антителом, промывали два раза, а затем еще два раза в шейкере по 3 минуты каждый раз, затем инкубировали в 0,1 мкг/мл DAPI на протяжении 3 минут и промывали четыре раза в ФСБ.
[00167] Проточная цитометрия. Клетки обрабатывали 0,5-1,5 мкг/мл модРНК TERT, а контрольные образцы обрабатывали трипсином через 22 часа после начала трансфекции, промывали, фиксировали в 2% параформальдегиде, пермеабилизировали в 7,5% БСА с 0,1% Тритон Х-100 на протяжении 20 мин, промывали три раза ФСБ, блокировали в 7,4% БСА на протяжении 1 ч, инкубировали с анти-TERT антителом (АВСАМ 32020 при 1:50) в ФСБ с 5% БСА, промывали три раза, инкубировали с вторичным антителом (1:200) в ФСБ, затем промывали три раза и перерастворяли в буфере F АС S и анализировали на проточном цитометре Accuri С6 (Becton Dickinson). Среднюю величину флуоресценции рассчитывали как среднюю флуоресценцию по всем клеткам в обработанных и контрольных образцах. Данные анализировали при помощи программного обеспечения CFlow.
[00168] РВ-ГЩР. Всю РНК собирали при помощи набора RNeasy Mini kit (Qiagen) и конвертировали в кДНК, используя набор High-Capacity RNA-to-cDNA Kit (Invitrogen). кДНК амплифицировали при помощи ПЦР, используя нижеприведенные праймеры:
hTERT-F: 5'-GCCCTCAGACTTCAAGACCA (SEQ ID NO: 1)
3'-hBB-R: 5'-AGGCAGAATCCAGATGCTCA (SEQ ID NO: 2)
GAPDH-F: 5'-GTGGACCTGACCTGCCGTCT (SEQ ID NO: 3)
GAPDH-R: 5'-GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT (SEQ ID NO: 4)
[00169] Вестерн-блоттинг. Белок собирали путем промывания клеток один раз ФСБ и последующего лизиса клеток в буфере RIPA. Белок проводили через Трис-ацетатные гели NuPAGE No vex, переносили на ПВДФ мембрану на 2 ч при 35 В, затем гибридизировали с анти-альфа тубулином (Sigma при 1:10000) и анти-TERT антителом (АВСАМ 32020 при 1:1000 или Rockland 600-401-252S при 1:500) на протяжении ночи при 4°С. Вторичную детекцию проводили при помощи инфракрасных (680 нм и 800 нм) антител (LI-COR) и устройства для визуализации Odyssey (LI-COR). Изображения анализировали при помощи Image J.
[00170] Q-FISH. Клетки инкубировали в 0,1 мкг/мл колцемида на протяжении 4 часов перед фиксацией и подготовкой метафазных пластинок после процедуры согласно Lansdorp et al.41. Затем препараты окрашивали при помощи Telomere PNA FISH Kit/FITC kit (Dako, Denmark), заменяя AlexaFluor 555-меченым теломерным зондом (Bio-Synthesis, USA) зонд из набора. Каждую клетку визуализировали на микроскопе DeltaVision (Applied Precision, Inc., Washington) при помощи программного обеспечения SoftWoRx, используя 60Х или 100Х масляный объектив с интервалами 0,2 мкм в 3-мкм диапазоне, используя механизированный предметный столик, и специальное программное обеспечение применяли для определения изображения, на котором каждое теломерное пятно находилось в фокусе, и определения его интенсивности на этом сфокусированном изображении. Временные изменения интенсивности освещения компенсировали, используя фотосенсор DeltaVision, который регистрировал интенсивность освещения каждого изображения, а изменение пространственной интенсивности, темновой ток ПЗС и ошибку считывания компенсировали, получая изображения с плоским полем и изображения с темным полем, соответственно. В каждую реплику входил материал по меньшей мере 15 метафазных клеток, а измерения для каждого образца проводили по меньшей мере дважды в по меньшей мере двух отдельных экспериментах.
[00171] Кривые роста. Клетки собирали и пересчитывали на гемоцитометре, так как автоматизированный счетчик не мог точно сосчитать клетки посте того, как популяция становилась гетерогенной в отношении диаметра, когда популяция входила в фазу репликативного старения. Изображения получали для того, чтобы оценить диаметр клеток. УП рассчитывали как log2 соотношения количества клеток в конце и в начале каждого культурального периода между пассажами.
[00172] Статистика. Статистический анализ проводили при помощи Microsoft Excel. «Усы» представляют среднее ± s.e.m. Сравнение длины теломер проводили, используя Т-критерий, при этом Ρ<0,05 (двухсторонний) считали статистически значимым.
Пример 2. Действие обработки модРНК TERT на человеческие эндотелиальные клетки
[00173] Действие обработки модРНК TERT не ограничивается клетками фибробластов. Как показано на Фигуре 9, человеческие микрососудистые дермальные эндотелиальные клетки («HMDEC») характеризуются типичными кривыми удвоения с ранним началом старения, которое приходится приблизительно на пассаж #12, а полное старение клеток приходится на пассаж #17. Как показано на Фигуре 10, обработка этих клеток в пассаже #18 модРНК hTERT дикого типа (правый столбик в каждой группе) приводит к обращению старения, в то время как контрольная обработка (левый столбик в каждой группе) или обработка мутантной модРНК hTERT (средний столбик в каждой группе) не оказывает влияние на клеточное старение.
[00174] Фигура 11 иллюстрирует влияние разных видов обработки на рост HMDEC. В частности, клетки, трижды обработанные модРНК TERT дикого типа (ДТ) между пассажем #10 и пассажем #11, продолжали расти, в то время как необработанные клетки (НК), клетки, обработанные только носителем (ТН), и клетки, обработанные каталитически неактивной TERT (CI), прекращали удваиваться.
[00175] Фигура 12 иллюстрирует результаты окрашивания β-галактозидазой (bГАЛ) HMDEC в пассаже #14 после обработки модРНК ДТ и CI. Это окрашивание позволяет определить активность β-галактозидазы при рН 6, которая присуща старым клеткам и не свойственна предстарым, покоящимся или иммортальным клеткам. Смотрите Dimri et al. (1995) Proc. NaflAcad. Sci. USA 92:9363-7.
СПОСОБЫ
[00176] Кумулятивную популяционную кривую удвоения HMDEC строили на основании формата 12-луночного планшета. Для каждой временной точки приблизительно 105 HMDEC пересевали в трех репликах и проводили подсчет клеток на 4 день после предыдущего пересева. Как показано на Фигуре 9, пассаж #12 был определен как ранняя точка начала старения HMDEC.
[00177] Как показано на Фигуре 10, приблизительно 105 HMDEC трансфицировали дважды через день при помощи 0,75 мг модРНК, кодирующих hTERT-CI и -ДТ в присутствии только носителя (ТО, RNiMAX) в качестве контроля. Подсчет клеток проводили в пассажах #19, 20 и 21 каждый раз на 5 день после пересева. [00178] В эксперименте, проиллюстрированном на Фигуре 11, в интервале между пассажами #10 и #11 (как отмечалось выше, пассаж #12 соответствует раннему началу старения HMDEC), приблизительно 5x10 HMDEC на 75 см пробирку культивировали на среде ЕВМ-2, обогащенной EGM-2 MV (оба компонента от Lonza, Walkersville, MD USA, номер в каталоге СС-3156 и СС-4176, соответственно). Микрососудистые клетки трансфицировали трижды через день при помощи 5 мкг модРНК, кодирующих hTERT-WT (ДТ) и hTERT-CI (CI) в присутствии необработанных (НО) и обработанных только носителем (ТО, RNAiMAX) контрольных пробирок. Для каждой временной точки высевали 5×105 клеток и, начиная с пассажа #11, проводили подсчет клеток при помощи гемоцитометра на 5 день после пересева. Для каждой временной точки каждые экспериментальные условия повторяли трижды.
[00179] В экспериментах, проиллюстрированных на Фигуре 12, приблизительно 105 каждых HMDEC из НО, hTERT-CI и hTERT-WT из пассажа #14 обрабатывали, как описано на Фигуре 10. Затем клетки подвергали анализу старения клеток на основании гистохимического окрашивания в отношении активности β-галактозидазы при рН 6 при помощи набора для гистохимического окрашивания стареющих клеток (Sigma, номер в каталоге CS0030). Слева приведены типовые изображения необработанных (НО) клеток и клеток, обработанных модРНК hTERT-CI (CI) или hTERT-WT (ДТ). Все изображения были получены в одинаковых условиях получения изображений. Каждые экспериментальные условия повторяли трижды, а процентное содержание клеток, положительных в отношении активности β-галактозидазы (как представлено на графике), для каждых условий рассчитывали как среднее по положительным клеткам по трем случайно выбранным участкам.
Пример 3. Дополнительные характеристики действия обработки модРНК TERT на человеческие клетки
[00180] В этом примере мРНК трансфицировали при помощи катионного липида в первичные человеческие фибробласты и миобласты (Фигура 13А) - клетки, которые, как известно, имеют ограниченный пролиферативный потенциал. Webster and Blau (1990) Somat Cell Mol Genet. 16:557-565; Hayflick and Moorhead (1961) Exp Cell Res. 25:585-621; Yakubov et al. (2010) Biochem Biophys Res Commun. 394:189-193. Эффективность трансфекции определяли методом проточной цитометрии при помощи количественной оценки флуоресценции единичной клетки после доставки мРНК ЗФБ, которая показала, что большинство клеток (>90%) были трансфицированы даже при относительно низких концентрациях модифицированной мРНК (0,1 мкг/мл) (Фигура 13В и Фигура 16А-С). Обработка клеток одинаковыми концентрациями экзогенной мРНК TERT или мРНК, кодирующей каталитически неактивную (CI) форму TERT, приводила к интернализаций одинаковых количеств мРНК (Фигура 16D) согласно данным РВ-кПЦР через 24 ч после первой обработки. CI TERT содержит замещающую мутацию в одном из триады металл-координирующих аспартатов в каталитическом сайте домена обратной транскриптазы TERT. В результате CI TERT не может добавлять нуклеотиды к теломерам, оставаясь при этом структурно интактной и способной связываться с матричной ДНК, а также проявляет стабильность по сравнению с TERT дикого типа в лизатах ретикулоцитов. Wyatt (2009) Structure-Function Analysis of the Human Telomerase Reverse Transcriptase. Обработка мРНК как TERT, так и CI TERT не влияла на уровни эндогенной мРНК TER Τ по сравнению с необработанными клетками согласно данным РВ-кПЦР (Фигура 16Е). Трансфекция 1 мкг/мл мРНК TERT или CI TERT приводила к одинаковому 50% повышению (Р<0,05 и <0,01, соответственно) количества белка TERT в фибробластах (Фигура 13С, левая панель). Wick et al. (1999) Gene. 232:97-106; Ahmed et al. (2008) J Cell Sci. 121:1046-1053. Присутствие эндогенного белка TERT в клетках со слабой эндогенной теломеразной активностью согласуется с относительно большим количеством неактивных сплайс-вариантов TERT во многих типах клеток и экстенсивной посттрансляционной ингибиторной регуляцией активности TERT, как сообщалось ранее. Yi et al. (2001) Nucleic Acids Res. 29:4818-4825; Cifuentes-Rojas and Shippen (2011) Mutat Res. [опубликованная он-лайн перед печатью: 18 октября, 2011 г.]; doi:10.1016/j.mrfmmm.2011.10.003. Обработка возрастающими количествами мРНК TER Τ приводила к дозозависимому повышению экспрессии белка TERT согласно данным одноклеточного анализа методом проточной цитометрии (Фигура 13С, правая панель).
[00181] Теломеразная активность повышается временно. Чтобы исследовать, приводит ли доставка модифицированной мРНК TERT к генерации функционального белка TERT, проводили количественную оценку теломеразной активности методом гель-анализа TRAP. Теломеразную активность зарегистрировали в фибробластах и миобластах для всех исследуемых доз мРНК TERT (0,25, 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/мл), и не зарегистрировали в необработанных клетках или клетках, обработанных только носителем или модифицированной мРНК, кодирующей CI TERT, даже в случае самой высокой дозы в 2,0 мкг/мл (Фигура 13D). Хотя для образования функционального теломеразного комплекса TERT требует участия TERC, доставки одной TERT было достаточно для повышения теломеразной активности, что согласуется с ранее полученными данными, что TERT часто служит ограничителем, так как количество копий РНК TERC во многих клетках с отсутствующей теломеразной активностью, включая фибробласты, является большим. Yi et al. (2001) Nucleic Acids Res. 29:4818-4825. Исследования в динамике по времени показали, что теломеразная активность достигает пика через 24 часа и возвращается к базовой линии в пределах 48 часов после единичной трансфекции. Эти временные рамки согласуются с более ранее опубликованными данными по временам полужизни человеческой мРНК TERT (2-4 ч), человеческой мРНК β-глобина (17-18 ч: экзогенная мРНК TER Τ фланкируется 5' и 3' НТО β-глобина) и теломеразной активности в клетках в присутствии ингибитора синтеза белка (зависит от типа клеток, но, как правило, >24 ч). Kabnick and Housman (1988) Mol Cell Biol. 8:3244-3250; Holt et al. (1997) Proc Natl Acad Se i USA. 94:10687-10692; Xu et al. (1999) Br J Cancer. 80:1156-1161.
[00182] Удлинение теломер. Длина теломер в необработанных фибробластах уменьшалась со временем (3 месяца), как и ожидалось (62) (Фигура 14А), а ее количественную оценку проводили двумя разными способами. Монохромный мультиплексный метод кПЦР (ММкПЦР) применяли для оценки длины, а результаты измерений проверяли на достоверность методом кПЦР, проводимым SpectraCell Laboratories, Inc. (коэффициент корреляции 0,97, Ρ<0,001). Последовательная трехразовая доставка мРНК TERT с 48-часовыми интервалами в фибробласты и миобласты, начиная с удвоения популяции (УП) 25 и 6, соответственно, приводила к удлинению теломер на 0,9±0,1 т.п.н. (22±3%) и 0,7±0,1 т.п.н. (12±2%), соответственно (Фигура 14В, С). Обработка только носителем или мРНК CI TERT не оказывала существенного влияния на длину теломер по сравнению с необработанными клетками. Средняя скорость удлинения теломер в фибробластах составила 135±15 п. н./УП.
[00183] Повышение пролиферативного потенциала в зависимости от типа клеток. Чтобы исследовать влияние доставки модифицированной мРНК TERT и последующего удлинения теломер на пролиферативный потенциал клеток, человеческие фибробласты последовательно трансфицировали один, два или три раза. Обработку осуществляли в 48-часовыми интервалами. Необработанные, обработанные только носителем и обработанные мРНК CI TERT выходили на одинаковое плато в отношении числа клеток приблизительно через 50-60 УП, в то время как клетки, трижды обработанные мРНК TERT, продолжали пролиферировать до конечных дополнительных 28±1,5 УП с общим увеличением числа клеток, на 2,7×10 превышающим необработанные клетки (Фигура 14D, левая панель). Данный эффект был дозозависимым, а каждая дополнительная обработка обеспечивала дополнительные УП (Фигура 14D, правая панель). Пошаговое повышение пролиферативного потенциала было большим в случае первой обработки, чем в случае второй или третьей обработки. Человеческие миобласты, которые три раза последовательно обрабатывали каждые 48 часов, достигали 3,4±0,4 УП, что соответствует 10-кратному увеличению числа клеток по сравнению с необработанными или обработанными только носителем контрольными образцами (Фигура 14Е). Такая разница в УП между миобластами и фибробластами не является неожиданной, так как в предыдущих исследованиях было обнаружено то же самое ограниченное несколькими УП действие сверхэкспрессии TERT и показано, что это ограничение связано с р16-опосредованной блокировкой роста в человеческих миобластах в отличие от фибробластов. Bodnar et al. (1998) Science. 279:349-352; Zhu et al. (2007) Aging Cell. 6:515-523. Как в фибробластах, так и в миобластах один носитель или мРНК CI TERT не оказывали влияние на пролиферативный потенциал по сравнению с необработанными контрольными образцами. Эти данные демонстрируют, что доставка модифицированной мРНК TER Τ является эффективным способом увеличения числа УП в культуре. Важно отметить, что, все исследуемые обработанные клетки демонстрировали существенное увеличение числа клеток, но в итоге кривые их роста выходили на плато, демонстрируя отсутствие иммортализации.
[00184] Временное снижение количества маркеров старения. Так как рост популяций фибробластов прекращался, они демонстрировали наличие маркеров старения, включая ассоциируемое со старением окрашивание β-галактозидазой (β-гал) и увеличение в размерах (Фигура 15А-С). Cristofalo and Kritchevsky (1969) Med Exp IntJExp Med. 19:313-320; Dimri et al. (1995) Proc Natl Acad Sci USA. 92:9363-9367; Cristofalo et al. (2004) Mech Ageing Dev. 125:827-848; Lawless et al. (2010) Exp Gerontol. 45:772-778. Эти изменения временно снижались в фибробластах, обработанных мРНК TERT по сравнению с необработанными клетками и клетками, обработанными мРНК CI TERT или только носителем. В соответствии с известными по другим работам данными, не все клетки в популяции, которые вышли на плато роста демонстрировали экспрессию β-галактозидазы на определяемых уровнях. Lawless et al. (2010) Exp Gerontol. 45:772-778; Binet et al. (2009) Cancer Res. 69:9183-9191. При этом трансфицированные мРНК TERT фибробласты и миобласты экспрессировали β-галактозидазу в той же мере, что и контрольные клетки каждого типа после выхода на плато роста двух популяций. Эти данные демонстрируют, что клетки, обработанные мРНК TERT в конечном итоге предсказуемо прекращают деление и экспрессируют маркеры старения и, следовательно, не трансформируются.
[00185] Этот пример демонстрирует, что временная доставка мРНК TERT, содержащей модифицированные нуклеотиды, приводит к удлинению человеческих теломер и повышению пролиферативного потенциала клеток без иммортализации клеток. Наблюдаемая скорость удлинения фибробластов, составляющая 135±15 п.н./УП, сопоставима со скоростями при применении вирусных способов, от 94 до >150 п.н./УП (22, 69). Модифицированная мРНК TERT за несколько дней приводит к удлинению теломер в фибробластах на 0,9±0,1 п. н. Сообщалось, что длина теломер фибробластов уменьшается за время жизни человека в среднем приблизительно на 1-2 т.п.н.. Allsopp et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:10114-10118. Следовательно, модифицированная мРНК TER Τ является эффективной, но при этом временной и не включающей интеграцию, а также преодолевающей основные ограничения конститутивно экспрессируемой вирусной мРНК TERT mRNA доставкой.
[00186] Человеческие клетки, представляющие наибольший интерес для применения в экспериментах или регенеративной медицине, часто ограничены в количестве, включая стволовые клетки. В настоящее время эту проблему решают различными способами, включая соматический ядерный транспорт, вирусные способы генной доставки и применение условий культивирования, которые снижают скорость укорочения теломер. Le et al. (2013) Cell Stem Cell, [опубликованная он-лайн перед печатью: 19 ноября 2013 г. ]; doi:10.1016/j.stem.2013.11.005; Zimmermann and Martens (2008) Cell Tissue Res. 331:79-90; Mohsin et al. Cire Res. 113:1169-1179. Описанная в данном документе обработка модифицированной мРНК TER Τ предлагает дополнение или альтернативу этим способам, преимущество которой состоит в том, что она является кратковременной, приводит к быстрому удлинению теломер и не несет риска, связанного с инсерционным мутагенезом. Кратковременность обработки мРНК TERT является исключительно привлекательной с той точки зрения, что в этом случае удается избежать потери фенотипа стволовых клеток, которая со временем может произойти в культуре (Gilbert et al. (2010) Science. 329:1078-1081), и сократить следующий за перепрограммированием этап iPSC-генерации, во время которого происходит удлинение теломер (Wang et al. (2012) Cell Res. 22:757-768). Такой способ удлинения теломер потенциально может привести к расширению применения разных видов клеток для моделирования заболеваний, разработки мелиоративных лекарственных препаратов и применения в клеточной терапии.
[00187] Для исследуемых типов клеток наблюдали целый ряд эффектов, связанных с пролиферативным потенциалом, в соответствии с предыдущими исследованиями, демонстрирующими разные эффекты сверхэкспрессии TERT на пролиферативный потенциал миобластов и фибробластов. Bodnar et al. (1998) Science. 279:349-352; Zhu et al. (2007) Aging Cell. 6:515-523. Кроме того, степень удлинения теломер не коррелирует с пролиферативным потенциалом. Следовательно, эффективность экспрессии TERT в отношении пролиферативного потенциала определяет клеточный контекст, а понимание факторов, которые опосредуют этот эффект, представляет интерес в свете преодоления этого ограничения. Факторы, связанные с ограничением пролиферативного потенциала миобластов после вирусной сверхэкспрессии TERT, включают р16-опосредованную блокировку роста, тип и штамм клеток и условия культивирования. Zhu et al. (2007) Aging Cell. 6:515-523. В общем случае эффект может опосредоваться не связанными с теломерами повреждениями ДНК, возрастом и митохондриальной целостностью. Sahin et al. (2011) Nature. 470:359-365; Mourkioti et al. (2013) Nat Cell Biol. 15:895-904; Lopez-Otm et al. (2013) Cell. 153:1194-1217. Отсутствие увеличения длины теломер или пролиферативного потенциала в трансфицированных мРНК CI TERT клетках согласуется с тем, что действие обработки происходит через каталитический сайт TERT, посредством которого происходит непосредственное добавление нуклеотидов к теломерам. Для клеточных популяций, обработанных мРНК TERT, наблюдали экспоненциальное увеличение количества клеток на протяжении определенного периода времени, а затем прекращение размножения и появление маркеров старения в той же мере, что и в случае необработанных популяций, что согласуется с отсутствием иммортализации.
[00188] Временная природа модифицированной мРНК с отсутствием интеграции, а также конечное повышение пролиферативного потенциала, которые наблюдали в данной работе, обеспечивают большую безопасность, чем в случае применяемых в настоящее время вирусных или ДНК векторов. Кроме того, указанный способ приводит к быстрому удлинению теломер, так что обработка может быть краткосрочной, после чего защитный связанный с укорочением теломер механизм остается интактным. Этот способ можно применять ex vivo для обработки тех типов клеток, которые опосредуют определенные патологические состояния или заболевания, таких как гематопоэтические стволовые клетки или предшественники в случаях иммуностарения или недостаточности костного мозга. Кроме того, модифицированную мРНК можно доставлять в определенные ткани in vivo. Kormann et al. (2011) Nat Biotechnol. 29:154-157. Подводя итоги, можно сказать, что быстрый и безопасный способ быстрого удлинения теломер, описанный в данном документе, приводит к замедлению старения и повышению пролиферативного потенциала клеток без иммортализации человеческих клеток.
СПОСОБЫ
[00189] Генерация и синтез матрииы модРНК. Чтобы получить модифицированную мРНК, кодирующую ЗФБ, TERT и CI TERT, их соответствующие открытые рамки считывания (ОРС) вставляли в MCS исходной плазмиды, содержащей промотор Т7, 5' НТО человеческого b-глобина (НВВ), MCS, 3' НТО НВВ, 151 п. н. поли(А)-последовательность и рестрикционный сайт для линеаризации с ферментом класса II за поли(А)-последовательностью. Полученную в результате промежуточную плазмиду секвенировали, линеаризовали и транскрибировали при помощи буфера и РНК-полимеразы из набора MEGAscript T7 Kit (Ambion, Austin, Texas, USA) и специальной смеси из канонических и неканонических нуклеотидов (TriLink BioTechnologies, San Diego, CA, USA), в которой конечные концентрации нуклеотидов на 40 мкл IVT реакции составляли 7,5 мМ для каждого из аденозин-5'-трифосфата (АТР), 5-метилцитидин-5'-трифосфата (ш5С) и псевдоуридин-5'-трифосфата (ψ), 1,5 мМ для гуанозин-5'-трифосфата (GTP) и 6 мМ для кэп-аналога (ARCA) (New England Biolabs, Ipswitch, MA, USA), что соответствовало молярному соотношению ATP:m5C:T:GTP:ARCA of 1:1:1:0.2:0,8. Для дополнительного снижения потенциальной иммуногенности мРНК, связанной с 5'-3Р-несущей фракцией, продукты IVT обрабатывали антарктической фосфатазой (New England Biolabs). Размер и структурную целостность продуктов мРНК подтверждали при помощи денатурирующего арагозного гель-электрофореза. ОРС человеческой TERT дикого типа, используемая для генерации ДНК-матриц для синтеза мРНК, идентична NCBI-варианту 1 транскрипта человеческой TERT (стандартная последовательность NM_198253.2). ОРС получали из плазмиды рВАВЕ-пео-hTERT (Counter et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA. 95:14723-14728) (плазмида 1774, Addgene, Cambridge, MA, USA). Плазмида pBABE-neo-hTERT содержит немолчащую мутацию в остатке 516 в мотиве QFP TERT, мотиве, который связывают с мультимеризацией и взаимодействием TERT с РНК TERC, поэтому, чтобы избежать возможности появления артефактов вследствие этой мутации, была получена последовательность, идентичная стандартной последовательности NCBI, путем коррекции мутации при помощи изменения G516D. Мутант CI TER Τ получали из последовательности TERT путем внесения мутации D712A.
[00190] Клеточные культуры и обработка. Человеческие первичные фетальные легочные фибробласты MRC5 получали от АТСС АТСС (Manassas, VA, USA) в пассаже 14. АТСС не указывает номер УП, поэтому приведенные в данном документе значения УП относятся к количеству У Π после получения клеток от АТСС. Клетки MRC5 культивировали в DMEM с 20% ФБС и пенициллином-стрептомицином. Первичные миобласты скелетной мышцы человека в возрасте 30 лет (Lonza, Allendale, N J, USA) культивировали в среде SkGM-2 (Lonza) в соответствии с инструкциями производителя. Удвоение популяции рассчитывали как log с основанием 2 соотношения между собранными клетками и клетками, которые высевали в предыдущем пассаже, и полагали таким, которое равно нулю, если количество собранных клеток было меньше количества высеянных клеток. Клетки трансфицировали модифицированной мРНК TERT, используя Lipofectamine RNAiMax (Life Technologies, Grand Island, NY, USA), приготовленный в восстановленной сывороточной среде OptiMEM (Life Technologies, Grand Island, NY, USA), и добавляли к клеткам в соотношении 1:5 об:об с их нормальной средой для достижений указанной в данном документе конечной концентрации.
[00191] Определение теломеразной активности. Через двадцать четыре часа после начала трансфекционного периода клетки собирали и лизировали в буфере CHAPS. Анализ TRAP проводили, используя модифицированную версию TRAPeze kit (EMD Millipore, Billerica, MA, USA), в которой праймеры и полимеразу добавляют после, а не до этапа, на котором происходит удлинение искусственного теломерного субстрата. Последовательность ПЦР была следующей: 94°С 30 с/59°С 30 с/72°С 45 с, всего 30 циклов, после чего продукты проводили через 15% полиакриламидный гель в 0,5Х ТВЕ, окрашенном SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (Life Technologies, Grand Island, NY, USA). Исследование теломеразной активности в динамике проводили при помощи TRAPeze RT kit (EMD Millipore, Billerica, MA, USA).
[00192] Вестерн-блоттинг. Белок собирали путем промывания клеток один раз ФСБ и последующего лизиса клеток в буфере RIPA (Cell Signaling Technology, Danvers MA, USA). Белок проводили через Трис-ацетатные гели NuPAGE Novex (Life Technologies, Grand Island, NY, USA), переносили на ПВДФ мембрану на 2 ч при 35 В, затем гибридизировали с антиальфа тубулином (Sigma, St. Louis, МО, USA) при 1:10000 и тти-ТЕЛΤ антителом (АВСАМ, Cambridge, MA, USA, 32020 npnt 1:1000; или Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA, 600-401-252S при 1:500) и инкубировали на протяжении ночи при 4°С. Детекцию проводили при помощи инфракрасных (680 нм и 800 нм) антител (LI-COR, Lincoln, NE, USA) и устройства для визуализации Odyssey (LI-COR). Общую интенсивность каждой полосы количественно оценивали при помощи ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA). Интенсивность каждой полосы TERT нормировали относительно соответствующей полосы тубулина.
[00193] Проточная цитометрш. Клетки собирали через 24 ч после трансфекции указанными дозами (Фигура 16А-С) мРНК TERT и окрашивали amn-TERT антителом (Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, РА, USA; 600-401-252S) при 1:500. [00194] Определение длины теломер в SpectraCell Laboratories, Inc. Геномную ДНК экстрагировали, используя фенол-хлороформ и количественно оценивали при помощи Quant-iT™ PicoGreen® dsDNA Assay Kit (Life Technologies, Grand Island, NY, USA). Анализ длины теломер проводили в SpectraCell Laboratories Inc. (Houston, TX, USA), используя утвержденный CLIA, анализ кПЦР с высокой пропускной способностью, главным образом так, как описано в Cawthon et al. Cawthon (2002) Nucleic Acids Res. 30(10):e47; Cawthon (2009) Nucleic Acids Res. 37(3):e21. Этот анализ позволяет определить относительную длину теломер путем определения фактора, которым образец отличается от образца стандартной ДНК по соотношению числа копий теломерных повторов и числа копий одного гена (36В4). Считается, что это соотношение (соотношение T/S) пропорционально средней длине теломер. Все образцы исследовали по меньшей мере дважды с по меньшей мере одним негативным контролем и по меньшей мере двумя позитивными контролями для двух разных известных длин теломер (длинной и короткой), при этом наблюдаемая средняя вариация составляла до 8%. Результаты были представлены как оценка теломер, эквивалентная средней длине теломер в т.п.н.
[00195] Определение длины теломер методом ММкПЦР. Длину теломер измеряли, используя модифицированную версию протокола ММкПЦР, разработанного Cawthon (Cawthon (2009) Nucleic Acids Res. 37(3):e21) со следующими изменениями: добавляли дополнительные, предшествующие амплификации ПЦР циклы, чтобы амплификация теломерных продуктов произошла раньше, расширяя гэп между сигналами теломеры и однокопийного гена; экспериментально определили, что смесь двух Taq полимераз приводит к лучшей эффективности ПЦР реакции, чем каждая из них в отдельности; снижение концентрации SYBR Green от 0,75Х до 0,5Х приводило к более раннему сигналу. Геномную ДНК получали из клеток, используя PureGene kit (Qiagen Germantown, MD, USA) с расщеплением РНКазой, количественно оценивали при помощи NanoDrop 2000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA), и использовали 10-40 нг на 15 мкл кПЦР реакции, проводимой в четырех повторах при помощи ПЦР-системы LightCycler 480 (Roche, Basel, Switzerland). Серийное разведение стандартной ДНК, охватывающее пять точек от 100 нг/мкл до 1,23 нг/мкл, включали в каждый анализ для получения стандартной кривой, необходимой для количественной оценки образцы ДНК. Конечные концентрации реагентов в каждых 15 мкл ПЦР-реакции составили: 20 мМ Трис-HCl, рН 8,4, 50 мМ КС1, 3 мМ MgC12, 0,2 мМ каждого dNTP, 1 мМ ДТТ, 1 M бетаина (Affymetrix, Santa Clara, СА, USA), 0,5Х SYBR Green I (Life Technologies, Grand Island, NY, USA), 0,1875U Platinum Taq (Life Technologies, Grand Island, NY, USA), 0625X Titanium Taq (Clontech) и 900 нМ каждого праймера (последовательности праймеров telg, tele, hbgu и hbgd определены в Cawthon (2009) Nucleic Acids Res. 37(3):e21). Программа циклического изменения температуры была следующей: 2 минуты при 95°С; с последующими 6 циклами по 15 с при 95°С, 15 с при 49°С; с последующими 40 циклами по 15 с при 95°С, 10 с при 62°С, 15 с при 72°С с получением сигнала, 15 с при 84°С и 10 с при 88°С с получением сигнала. Программное обеспечение Roche LightCycler 480 использовали для генерации стандартных кривых и расчета концентраций ДНК и однокопийных генов для каждого образца. Соотношения T/S рассчитывали для каждой копии образца, а результат усредняли, чтобы получить соотношение T/S для образца, которое калибровали, используя контрольные пробы стандартных образцов, отосланные в SpectraCell, как описано выше. Независимо полученные относительные величины соотношений T/S, измеренные методом ММкПЦР и в SpectraCell для одних и тех же образцов, хорошо согласовались (коэффициент корреляции = 0,97, Р<0,001).
[00196] кПЦР с обратной транскрипцией. Праймеры были получены при помощи Primer3 (Untergasser et al. (2012) Nucleic Acids Res. 40:ell5) и перечислены в Таблице 9, если не указано иное. Через двадцать четыре часа после начала обработки клетки трижды промывали ФСБ перед тем, как собрать их в буфер RLT (Qiagen, Germantown, MD, USA). РНК конвертировали в кДНК, используя High Capacity RNA-to-cDNA Master Mix (Life Technologies, Grand Island, NY, USA). Эндогенную мРНК TERT амплифицировали, используя прямой праймер в открытой рамке считывания TERT и обратный праймер в 3' НТО эндогенной мРНК TERT. Экзогенную мРНК TERT амплифицировали, используя прямой праймер в открытой рамке считывания мРНК TERT и обратный праймер в 3' НТО НВВ, который присутствует в мРНК экзогенной TERTh CI TERT, но не в мРНК эндогенной TERT. Относительные уровни рассчитывали по методу Pfaffl. Стандартными генами служили RPL37A (с применением праймеров, определенных в Greber et al. (2011) EMBO J. 30:4874-4884) и GAPDH, ни один из которых не демонстрировал существенного изменения по величине Ct в контрольных или обработанных клетках.
[00197] Ассоциируемое со старением окрашивание β-галактозидазой и оценка размера клеток. Окрашивание β-гал проводили при помощи набора Senescence β-Galactosidase Staining Kit (Cell Signaling Technology, Danvers MA, USA). По меньшей мере 50 клеток на популяцию оценивали в двух репликах. Диаметр клеток оценивали вручную после обработки трипсином на решетке гемоцитометра. Cristofalo and Kritchevsky (1969) Med Exp Int J Exp Med. 19:313-320.
[00198] Статистика. Расчеты t-критериев Стьюдента и корреляционного коэффициента Пирсона проводили, используя Microsoft Excel. «Усы» представляют среднее ± s.e.m.
Пример 4. Доставка модРНК TERT в клетки путем электропорации [00199] Соединения модРНК TERT согласно данному изобретению также можно доставлять в клетки путем электропорации, как проиллюстрировано на Фигурах 18-20, используя параметры электропорации, включая концентрацию модРНК TERT, форму сигнала напряжения и геометрию электродов, подходящие для достижения оптимальной эффективности трансфекции и жизнеспособности заданного типа клеток. На Фигуре 21 приведена зависимость теломеразной активности от дозы модРНК TERT, доставляемой путем электропорации.
Пример 5. Доставка модРНК в человеческие кровяные клетки
[00200] CD8+ Т-клетки трансфицировали модРНК следующим образом. Светлый слой из цельной человеческой крови центрифугировали в среде с градиентом плотности Lymphoprep (Axis-Shield), чтобы получить мононуклеарные клетки, которые дважды промывали, а затем очищали от отличных от CD8+ лейкоцитов при помощи набора Dynabeads Untouched Human CD8 Τ Cells Kit (Life Technologies). Клетки CD8+стимулировали при помощи Dynabeads Human Τ-Activator CD3.CD28 (Life Technologies) и культивировали на протяжении 4 дней в среде OpTimizer T-Cell, обогащенной 30000 Е/мл IL-2. Затем Т-клетки трансфицировали модРНК, кодирующей ядерный ЗФБ и TERT в концентрации 50 мкг/мл в объеме 20 мкл раствора Nucleofector РЗ, содержащего добавку 1. Клетки анализировали в отношении флуоресценции и жизнеспособности через 24 часа после трансфекции. Результаты трансфекции приведены на Фигуре 22. Яркая флуоресценция соответствует большому числу копий с эффективностью трансфекции более 90% с высокой жизнеспособностью.
Пример 6. Экспрессия теломеразы в человеческих кератиноцитах при помощи теломеразной модРНК
[00201] Как показано на Фигуре 23, электропорация человеческих кератиноцитов модРНК TERT приводит к экспрессии теломеразной активности в клетках. Человеческие первичные кератиноциты (Lonza) суспендировали при плотности 3x107 клеток/мл в среде OptiMEM (Life Technologies), содержащей 50 мкг/мл модРНК, кодирующей как каталитически неактивную (CI) TERT, так и TERT дикого типа. 10 мкл клеточной суспензии помещали в 1 мм кювету с отверстиями и проводили электропорацию при помощи Gene Puiser (BioRad) при 200 В, 1000 Ом и 25 микрофарад. Клетки немедленно возвращали в среду KGM-2 (Lonza) и инкубировали на протяжении 24 часов перед сбором для измерения теломеразной активности, используя гель-анализ TRAPeze (Millipore). Каждые 25 мкл реакции TRAP проводили, используя 1 мкг общего белка, с двумя копиями образцов, которые нагревали при 85°С на протяжении 10 минут, чтобы инактивировать теломеразу. Необработанные, прошедшие только электропорацию и CI TERT образцы служили отрицательными контролями, а клетки 293Т и TSR8 служили в качестве положительных контролен.
Пример 7. Экспрессия кодируемого модРНК белка in vivo
[00202] Доставляемая in vivo модРНК может привести к экспрессии функционального белка, кодируемого модРНК. Kormann et al. (2012) Nature Biotechnology 29:154-157; Kariko et al. (2012) Molecular Therapy 20:948-93. Это подтвердили в данной работе путем создания комплекса из 2 мкг модРНК, кодирующей люциферазу, с катионным липидным носителем (TransIT) и проведения внутривенной инъекции в 50 мкл OptiMEM (Life Technologies) в хвост грызуна. Селезенку извлекали и обрабатывали люциферином и оценивали в отношении люциферазной активности, используя биолюминесцентное устройство для визуализации IVIS (Perkin-Elmer). Как показано на Фигуре 24, люциферазную активность обнаружили в месте инъекции и селезенке (стрелки).
[00203] Все патенты, патентные публикации и другие ссылочные материалы, приведенные в данном документе, в полном объеме включены посредством ссылки как в случае, если бы каждый из них был отдельно и специально включен в данный документ посредством ссылки.
[00204] Несмотря на то что были описаны конкретные примеры, вышеприведенное описание является иллюстративным и неограничивающим. Любой один или более признаков описанных вариантов реализации можно комбинировать любым образом с одним или более признаками других вариантов реализации настоящего изобретения. Кроме того, для специалистов в данной области техники после ознакомления с сущностью изобретения будет очевидно существование большого количества вариаций данного изобретения. Следовательно, объем изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения вместе с полным объемом ее эквивалентов.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> THE BOARD OF TRUSTEES OF THE LELAND STANFORD JUNIOR
UNIVERSITY
RAMUNAS, John
YAKUBOV, Eduard
BLAU, Helen M.
COOKE, John
<120> Соединения, композиции, способы и наборы, связанные с удлинением теломер
<130> S12-001WO1
<150> US 61/768,047
<151> 2013-02-22
<160> 10
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ПЦР праймер
<400> 1
gccctcagac ttcaagacca 20
<210> 2
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ПЦР праймер
<400> 2
aggcagaatc cagatgctca 20
<210> 3
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ПЦР праймер
<400> 3
gtggacctga cctgccgtct 20
<210> 4
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ПЦР праймер
<400> 4
ggaggagtgg gtgtcgctgt 20
<210> 5
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ПЦР праймер
<400> 5
gtcacctacg tgccactcct 20
<210> 6
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ПЦР праймер
<400> 6
agcaagaaag cgagccaat 19
<210> 7
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ПЦР праймер
<400> 7
gccctcagac ttcaagacca 20
<210> 8
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ПЦР праймер
<400> 8
gctgctggtg tctgctctc 19
<210> 9
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ПЦР праймер
<400> 9
caatgacccc ttcattgacc 20
<210> 10
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> ПЦР праймер
<400> 10
ttgattttgg agggatctcg
Claims (33)
1. Способ удлинения теломер, включающий этап
введения соединения в клетку животного,
где указанное соединение содержит синтетическую рибонуклеиновую кислоту, содержащую по меньшей мере один модифицированный нуклеозид и кодирующую обратную транскриптазу теломеразы, где указанные по меньшей мере один модифицированный нуклеозид снижает иммуногенность рибонуклеиновой кислоты и где по меньшей мере один уридин, содержащийся в указанной синтетической рибонуклеиновой кислоте, заменен на модифицированный уридин;
где указанная обратная транскриптаза теломеразы временно экспрессируется в указанной клетке,
где происходит удлинение по меньшей мере одной теломеры в указанной клетке.
2. Способ по п. 1, где клетка содержит по меньшей мере одну укороченную теломеру перед этапом введения.
3. Способ по п. 1, где клетка получена от субъекта, страдающего от или подверженного риску развития возрастного заболевания, возрастного патологического состояния или возрастного ухудшения функциональности или внешнего вида, или принадлежит указанному субъекту.
4. Способ по п. 1, где клетка получена от субъекта, страдающего от или подверженного риску развития рака, заболевания сердца, инсульта, диабета, диабетических язв, болезни Альцгеймера, остеопороза, ухудшения физических данных или внешнего вида, физической травмы или хронического физического стресса, физиологической травмы или хронического физиологического стресса, снижения иммунной функции, старения иммунной системы или макулярной дегенерации, или принадлежит указанному субъекту.
5. Способ по п. 1, где клетка представляет собой соматическую клетку эндодермальной, мезодермальной или эктодермальной линии дифференцировки или зародышевой линии или эмбриональную клетку.
6. Способ по п. 1, где клетка представляет собой индуцированную плюрипотентную стволовую клетку или клетку, применяемую для получения индуцированной плюрипотентной стволовой клетки.
7. Способ по п. 1, где клетка представляет собой трансдифференцированную клетку или клетку, применяемую для получения трансдифференцированной клетки.
8. Способ по п. 1, где клетка представляет собой выделенную клетку, а этап введения длится не более 48 часов.
9. Способ по п. 1, где клетка представляет собой выделенную клетку, а этап введения длится по меньшей мере 2 часа.
10. Способ по п. 1, где клетка представляет собой выделенную клетку, а этап введения осуществляют не более четырех раз.
11. Способ по п. 1, где клетка представляет собой выделенную клетку, а этап введения осуществляют по меньшей мере дважды.
12. Способ по п. 1, где клетка представляет собой выделенную клетку, а способ дополнительно включает этап измерения теломеразной активности в клетке.
13. Способ по п. 1, где этап введения приводит к повышению теломеразной активности в клетке.
14. Способ по п. 13, где теломеразная активность временно повышается по меньшей мере на 5%.
15. Способ по п. 13, где время полужизни повышенной теломеразной активности составляет не более 48 часов.
16. Способ по п. 13, где время полужизни повышенной теломеразной активности составляет по меньшей мере 2 часа.
17. Способ по п. 1, где способ дополнительно включает этап измерения длины теломер в клетке.
18. Способ по п. 1, где этап введения приводит к увеличению средней длины теломер в клетке.
19. Способ по п. 18, где средняя длина теломер увеличивается по меньшей мере на 0,1 т.п.н.
20. Способ по п. 1, где клетка представляет собой выделенную клетку, а способ дополнительно включает этап измерения потенциала удвоения популяции в клетке.
21. Способ по п. 1, где этап введения приводит к увеличению потенциала удвоения популяции в клетке.
22. Способ по п. 21, где потенциал удвоения популяции увеличивается по меньшей мере на одно удвоение популяции.
23. Способ по п. 1, где клетка получена от субъекта-млекопитающего или принадлежит субъекту-млекопитающему.
24. Способ по п. 23, где клетка получена от субъекта-человека или принадлежит субъекту-человеку.
25. Способ по п. 1, где клетка является выделенной клеткой.
26. Способ по п. 1, где этап введения включает электропорацию.
27. Способ по п. 1, где в клетке происходит временное удлинение по меньшей мере одной теломеры.
28. Способ по п. 1, где указанное соединение не вводят непрерывно.
29. Способ по п. 1, где клетка животного является частью культуры клеток, выделенной тканевой культуры или выделенного органа.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201361768047P | 2013-02-22 | 2013-02-22 | |
US61/768,047 | 2013-02-22 | ||
PCT/US2014/017867 WO2014130909A1 (en) | 2013-02-22 | 2014-02-22 | Compounds, compositions, methods, and kits relating to telomere extension |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2022101438A Division RU2022101438A (ru) | 2013-02-22 | 2014-02-22 | Соединения, композиции, способы и наборы, связанные с удлинением теломер |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2015140125A RU2015140125A (ru) | 2017-03-28 |
RU2015140125A3 RU2015140125A3 (ru) | 2018-02-28 |
RU2766120C2 true RU2766120C2 (ru) | 2022-02-08 |
Family
ID=51388399
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2022101438A RU2022101438A (ru) | 2013-02-22 | 2014-02-22 | Соединения, композиции, способы и наборы, связанные с удлинением теломер |
RU2015140125A RU2766120C2 (ru) | 2013-02-22 | 2014-02-22 | Соединения, композиции, способы и наборы, связанные с удлинением теломер |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2022101438A RU2022101438A (ru) | 2013-02-22 | 2014-02-22 | Соединения, композиции, способы и наборы, связанные с удлинением теломер |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
US (6) | US20140242154A1 (ru) |
EP (2) | EP2959005B1 (ru) |
JP (3) | JP2016514953A (ru) |
CN (2) | CN105164269A (ru) |
AU (1) | AU2014218667A1 (ru) |
CA (1) | CA2902237C (ru) |
CY (1) | CY1125092T1 (ru) |
DK (1) | DK2959005T3 (ru) |
ES (1) | ES2901402T3 (ru) |
HK (1) | HK1218934A1 (ru) |
HR (1) | HRP20211842T1 (ru) |
HU (1) | HUE056638T2 (ru) |
IL (2) | IL240680B2 (ru) |
LT (1) | LT2959005T (ru) |
PL (1) | PL2959005T3 (ru) |
PT (1) | PT2959005T (ru) |
RS (1) | RS62824B1 (ru) |
RU (2) | RU2022101438A (ru) |
SI (1) | SI2959005T1 (ru) |
WO (1) | WO2014130909A1 (ru) |
Families Citing this family (42)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013086008A1 (en) | 2011-12-05 | 2013-06-13 | Factor Bioscience Inc. | Methods and products for transfecting cells |
KR20150014483A (ko) | 2012-05-11 | 2015-02-06 | 주식회사 카엘젬백스 | 항염증 활성을 갖는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물 |
KR101799904B1 (ko) | 2012-07-11 | 2017-11-22 | 주식회사 젬백스앤카엘 | 세포 투과성 펩티드, 그를 포함한 컨쥬게이트 및 그를 포함한 조성물 |
EP3786298A1 (en) | 2012-11-01 | 2021-03-03 | Factor Bioscience Inc. | Methods and products for expressing proteins in cells |
AU2014218667A1 (en) | 2013-02-22 | 2015-10-08 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Compounds, compositions, methods, and kits relating to telomere extension |
BR112016009803B1 (pt) | 2013-10-30 | 2022-02-08 | The Curators Of The University Of Missouri | Método para especificação e cultivo de linhagem muscular esquelética escalonável |
JP6367950B2 (ja) | 2013-12-17 | 2018-08-01 | ジェムバックス アンド カエル カンパニー,リミティド | 前立腺癌治療用組成物 |
DK3690056T5 (da) | 2014-01-31 | 2024-08-26 | Factor Bioscience Inc | Fremgangsmåder og produkter til fremstilling og indgivelse af nukleinsyre |
KR102413243B1 (ko) | 2014-12-23 | 2022-06-27 | 주식회사 젬백스앤카엘 | 안질환 치료 펩티드 및 이를 포함하는 안질환 치료용 조성물 |
CA3197849A1 (en) | 2014-12-29 | 2016-07-07 | Novartis Ag | Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells |
AU2016218977C1 (en) | 2015-02-13 | 2023-03-23 | Factor Bioscience Inc. | Nucleic acid products and methods of administration thereof |
CN107405380B (zh) * | 2015-02-27 | 2021-04-20 | 珍白斯凯尔有限公司 | 用于预防听觉损伤的肽及其包含该肽的组合物 |
CA2982996A1 (en) | 2015-04-17 | 2016-10-20 | David Maxwell Barrett | Methods for improving the efficacy and expansion of chimeric antigen receptor-expressing cells |
ES2861001T3 (es) * | 2015-06-30 | 2021-10-05 | Ethris Gmbh | Polirribonucleótidos que codifican la familia del casete de unión a ATP y formulaciones de los mismos |
JP6923453B2 (ja) | 2015-07-02 | 2021-08-18 | ジェムバックス アンド カエル カンパニー,リミティド | 抗ウイルス活性効能を有するペプチド及びこれを含む組成物 |
JP7146632B2 (ja) | 2015-07-21 | 2022-10-04 | ノバルティス アーゲー | 免疫細胞の有効性および増大を改善する方法 |
KR20180064434A (ko) * | 2015-11-03 | 2018-06-14 | 주식회사 젬백스앤카엘 | 신경세포 손실 예방 및 재생 효능을 가지는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물 |
WO2017091702A1 (en) * | 2015-11-25 | 2017-06-01 | The Methodist Hospital System | Telomere extension and anti-inflammatory agents for cell regeneration |
JP7114481B2 (ja) | 2016-04-07 | 2022-08-08 | ジェムバックス アンド カエル カンパニー,リミティド | テロメラーゼ活性の増加及びテロメアの延長の効能を有するペプチド、及びこれを含む組成物 |
EP3472342A1 (en) * | 2016-06-19 | 2019-04-24 | Yissum Research Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. | Screening for chemotherapy resistance in human haploid cells |
WO2018035377A1 (en) | 2016-08-17 | 2018-02-22 | Factor Bioscience Inc. | Nucleic acid products and methods of administration thereof |
EP3612623B1 (en) | 2017-05-06 | 2024-07-03 | Upside Foods, Inc. | Compositions and methods for increasing the culture density of a cellular biomass within a cultivation infrastructure |
WO2019014652A1 (en) | 2017-07-13 | 2019-01-17 | Memphis Meats, Inc. | COMPOSITIONS AND METHODS FOR INCREASING THE EFFICACY OF CELL CULTURES USED IN FOOD PRODUCTION |
SG11202003177RA (en) | 2017-10-25 | 2020-05-28 | Novartis Ag | Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells |
EP3844265A2 (en) | 2018-08-31 | 2021-07-07 | Novartis AG | Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells |
WO2020047452A2 (en) | 2018-08-31 | 2020-03-05 | Novartis Ag | Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells |
CN112654244B (zh) * | 2018-09-06 | 2023-07-25 | 德克萨斯大学系统董事会 | 端粒酶全酶复合体及其使用方法 |
JP2022501050A (ja) * | 2018-10-02 | 2022-01-06 | ステムオン インコーポレーテッドStemon Inc. | 細胞のテロメアを伸長させる方法 |
KR102209234B1 (ko) * | 2018-10-02 | 2021-02-01 | 주식회사 스템온 | 세포의 텔로미어를 신장시키는 방법 |
JP7320302B2 (ja) * | 2018-10-02 | 2023-08-03 | ステムオン インコーポレーテッド | 細胞のテロメアを伸長させる組成物およびその製造方法 |
AU2020217747A1 (en) * | 2019-02-08 | 2021-09-02 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Telomerase-containing exosomes for treatment of diseases associated with aging and age-related organ dysfunction |
WO2020210678A1 (en) | 2019-04-12 | 2020-10-15 | Novartis Ag | Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells |
JP2022531296A (ja) * | 2019-05-02 | 2022-07-06 | ボード オブ リージェンツ,ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム | Tert活性化療法を伴う方法および組成物 |
US10501404B1 (en) | 2019-07-30 | 2019-12-10 | Factor Bioscience Inc. | Cationic lipids and transfection methods |
WO2021108661A2 (en) | 2019-11-26 | 2021-06-03 | Novartis Ag | Chimeric antigen receptors and uses thereof |
CN115335083A (zh) * | 2020-01-10 | 2022-11-11 | 斯特姆詹尼克斯公司 | 用于表达所关注基因和/或调控信号传导通路的纳米颗粒 |
AU2021224535A1 (en) * | 2020-02-17 | 2022-09-29 | Figene, Llc | Telomere length modulation using fibroblasts |
US20230174933A1 (en) | 2020-02-27 | 2023-06-08 | Novartis Ag | Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells |
CN116870195A (zh) * | 2020-09-22 | 2023-10-13 | 浙江愈方生物科技有限公司 | 一种灭活性端粒酶、具有其的腺病毒和人造mRNA及应用 |
CN116916936A (zh) * | 2020-12-29 | 2023-10-20 | 再生技术有限责任公司 | 用于递送rna的组合物和方法 |
US20220347112A1 (en) * | 2021-03-31 | 2022-11-03 | Rejuvenation Technologies Inc. | Compositions and methods for delivery of rna |
TW202423983A (zh) | 2022-09-15 | 2024-06-16 | 瑞士商諾華公司 | 使用嵌合抗原受體療法的自體免疫性障礙的治療 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20110143397A1 (en) * | 2005-08-23 | 2011-06-16 | Katalin Kariko | Rna preparations comprising purified modified rna for reprogramming cells |
RU2443777C2 (ru) * | 2010-03-24 | 2012-02-27 | Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН | Способ одномоментного определения длины теломер и количества делений популяции пролиферирующих клеток in vitro |
US8323975B2 (en) * | 2002-01-04 | 2012-12-04 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Telomere-encoding synthetic DNA nanocircles, and their use for the elongation of telomere repeats |
Family Cites Families (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5686306A (en) | 1992-05-13 | 1997-11-11 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and reagents for lengthening telomeres |
US5583016A (en) | 1994-07-07 | 1996-12-10 | Geron Corporation | Mammalian telomerase |
US5770422A (en) | 1996-07-08 | 1998-06-23 | The Regents Of The University Of California | Human telomerase |
US6093809A (en) | 1996-10-01 | 2000-07-25 | University Technology Corporation | Telomerase |
SG94355A1 (en) | 1996-10-01 | 2003-02-18 | Geron Corp | Human telomerase catalytic subunit |
US6610839B1 (en) | 1997-08-14 | 2003-08-26 | Geron Corporation | Promoter for telomerase reverse transcriptase |
US7897752B2 (en) | 2002-02-20 | 2011-03-01 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of telomerase gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
AU2004271215B2 (en) | 2003-09-09 | 2009-07-16 | Geron Corporation | Modified oligonucleotides for telomerase inhibition |
DE102004035227A1 (de) * | 2004-07-21 | 2006-02-16 | Curevac Gmbh | mRNA-Gemisch zur Vakzinierung gegen Tumorerkrankungen |
EP4332227A1 (en) | 2005-08-23 | 2024-03-06 | The Trustees of the University of Pennsylvania | Rna containing modified nucleosides and methods of use thereof |
CA2623256A1 (en) | 2005-09-29 | 2007-04-12 | Nektar Therapeutics | Receptacles and kits, such as for dry powder packaging |
GB0720486D0 (en) | 2007-10-19 | 2007-11-28 | Univ Edinburgh | Cationic lipids |
WO2010036813A1 (en) | 2008-09-24 | 2010-04-01 | University Of South Florida | Materials and methods for preventing or treating neurodegenerative conditions associated with abeta peptide accumulation |
US8808982B2 (en) | 2009-12-07 | 2014-08-19 | Cellscript, Llc | Compositions and methods for reprogramming eukaryotic cells |
EP3072961A1 (en) * | 2010-04-16 | 2016-09-28 | Children's Medical Center Corporation | Sustained polypeptide expression from synthetic, modified rnas and uses thereof |
WO2012009682A2 (en) | 2010-07-15 | 2012-01-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Elastic substrates and methods of use in cell manipulation and culture |
CN102433297A (zh) * | 2011-10-14 | 2012-05-02 | 黄必录 | 延伸成体多能干细胞端粒的方法 |
WO2013086008A1 (en) | 2011-12-05 | 2013-06-13 | Factor Bioscience Inc. | Methods and products for transfecting cells |
US8497124B2 (en) | 2011-12-05 | 2013-07-30 | Factor Bioscience Inc. | Methods and products for reprogramming cells to a less differentiated state |
DK2791160T3 (da) | 2011-12-16 | 2022-05-30 | Modernatx Inc | Modificerede mrna-sammensætninger |
AU2014218667A1 (en) | 2013-02-22 | 2015-10-08 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Compounds, compositions, methods, and kits relating to telomere extension |
JP6123561B2 (ja) | 2013-08-08 | 2017-05-10 | ソニー株式会社 | 発光素子及びその製造方法、並びに、表示装置 |
-
2014
- 2014-02-22 AU AU2014218667A patent/AU2014218667A1/en not_active Abandoned
- 2014-02-22 LT LTEPPCT/US2014/017867T patent/LT2959005T/lt unknown
- 2014-02-22 JP JP2015559027A patent/JP2016514953A/ja active Pending
- 2014-02-22 IL IL240680A patent/IL240680B2/en unknown
- 2014-02-22 PT PT147545453T patent/PT2959005T/pt unknown
- 2014-02-22 IL IL296870A patent/IL296870A/en unknown
- 2014-02-22 EP EP14754545.3A patent/EP2959005B1/en active Active
- 2014-02-22 RS RS20220007A patent/RS62824B1/sr unknown
- 2014-02-22 US US14/187,264 patent/US20140242154A1/en not_active Abandoned
- 2014-02-22 PL PL14754545T patent/PL2959005T3/pl unknown
- 2014-02-22 RU RU2022101438A patent/RU2022101438A/ru unknown
- 2014-02-22 US US14/187,265 patent/US10525075B2/en active Active
- 2014-02-22 RU RU2015140125A patent/RU2766120C2/ru not_active Application Discontinuation
- 2014-02-22 CA CA2902237A patent/CA2902237C/en active Active
- 2014-02-22 DK DK14754545.3T patent/DK2959005T3/da active
- 2014-02-22 HR HRP20211842TT patent/HRP20211842T1/hr unknown
- 2014-02-22 SI SI201431929T patent/SI2959005T1/sl unknown
- 2014-02-22 EP EP21200777.7A patent/EP3988112A1/en active Pending
- 2014-02-22 CN CN201480021010.1A patent/CN105164269A/zh active Pending
- 2014-02-22 CN CN202410035855.1A patent/CN117838716A/zh active Pending
- 2014-02-22 WO PCT/US2014/017867 patent/WO2014130909A1/en active Application Filing
- 2014-02-22 ES ES14754545T patent/ES2901402T3/es active Active
- 2014-02-22 HU HUE14754545A patent/HUE056638T2/hu unknown
-
2016
- 2016-06-14 HK HK16106812.5A patent/HK1218934A1/zh unknown
-
2019
- 2019-07-16 JP JP2019131040A patent/JP7103653B2/ja active Active
-
2020
- 2020-01-06 US US16/735,681 patent/US11007210B2/en active Active
- 2020-01-06 US US16/735,684 patent/US12053483B2/en active Active
- 2020-01-06 US US16/735,683 patent/US11872243B2/en active Active
-
2021
- 2021-12-28 CY CY20211101135T patent/CY1125092T1/el unknown
-
2022
- 2022-06-30 JP JP2022105849A patent/JP7486836B2/ja active Active
-
2024
- 2024-04-17 US US18/637,899 patent/US20240277752A1/en active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8323975B2 (en) * | 2002-01-04 | 2012-12-04 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Telomere-encoding synthetic DNA nanocircles, and their use for the elongation of telomere repeats |
US20110143397A1 (en) * | 2005-08-23 | 2011-06-16 | Katalin Kariko | Rna preparations comprising purified modified rna for reprogramming cells |
RU2443777C2 (ru) * | 2010-03-24 | 2012-02-27 | Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН | Способ одномоментного определения длины теломер и количества делений популяции пролиферирующих клеток in vitro |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
BOCCARDI V., HERBIG U., Telomerase gene therapy: a novel approach to combat aging, EMBO Molecular Medicine, 2012, Volume 4, Issue 8, pp.685-687. * |
BOCCARDI V., HERBIG U., Telomerase gene therapy: a novel approach to combat aging, EMBO Molecular Medicine, 2012, Volume 4, Issue 8, pp.685-687. KARIKO K. et al., Incorporation of Pseudouridine Into mRNA Yields Superior Nonimmunogenic Vector With Increased Translational Capacity and Biological Stability, Molecular Therapy, 2008, Vol.16, Issue 11, pp.1833-1840. DE JESUS B.B. et al., Telomerase gene therapy in adult and old mice delays aging and increases longevity without increasing cancer, EMBO Molecular Medicine, 2012, Volume 4, Issue 8, pp.691-704. KARIKO K. et al., Suppression of RNA Recognition by Toll-like Receptors: The Impact of Nucleoside Modification and the Evolutionary Origin of RNA, Immunity, 2005, Volume 23, Issue 2, pp.165-175. РУБЦОВА М.П. и др., Функции теломеразы: удлинение теломер и не только, Acta naturae (русскоязычная версия), 2012, Т.4, No. 2 <13>, с.44-61. * |
DE JESUS B.B. et al., Telomerase gene therapy in adult and old mice delays aging and increases longevity without increasing cancer, EMBO Molecular Medicine, 2012, Volume 4, Issue 8, pp.691-704. * |
KARIKO K. et al., Incorporation of Pseudouridine Into mRNA Yields Superior Nonimmunogenic Vector With Increased Translational Capacity and Biological Stability, Molecular Therapy, 2008, Vol.16, Issue 11, pp.1833-1840. * |
KARIKO K. et al., Suppression of RNA Recognition by Toll-like Receptors: The Impact of Nucleoside Modification and the Evolutionary Origin of RNA, Immunity, 2005, Volume 23, Issue 2, pp.165-175. * |
РУБЦОВА М.П. и др., Функции теломеразы: удлинение теломер и не только, Acta naturae (русскоязычная версия), 2012, Т.4, No. 2 <13>, с.44-61. * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7486836B2 (ja) | テロメア伸長に関する化合物、組成物、方法及びキット | |
KR101835018B1 (ko) | 엑소좀 또는 엑소좀 유래 리보핵산을 포함하는 간섬유증 예방 또는 치료용 조성물 | |
CN110177578B (zh) | modRNA的细胞特异性表达 | |
JP2021511803A (ja) | ヒト心筋細胞におけるジストロフィン変異を修正するための組成物および方法 | |
US20180360924A1 (en) | Telomere extension and anti-inflammatory agents for cell regeneration | |
Liu et al. | Modification of COL1A1 in Autologous Adipose Tissue‐Derived Progenitor Cells Rescues the Bone Phenotype in a Mouse Model of Osteogenesis Imperfecta | |
JP2021522865A (ja) | 栄養要求性調節可能な細胞を使用する遺伝子療法の方法および組成物 | |
US9458464B2 (en) | Treatment of neuropathic pain | |
KR102616080B1 (ko) | 알츠하이머 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 용도 | |
JP2022531930A (ja) | 栄養要求性調節可能な細胞を使用する方法および組成物 | |
JPWO2018011989A1 (ja) | 歯髄細胞を含む神経損傷治療用移植材 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
FA92 | Acknowledgement of application withdrawn (lack of supplementary materials submitted) |
Effective date: 20180621 |
|
FZ9A | Application not withdrawn (correction of the notice of withdrawal) |
Effective date: 20190617 |