JP2022531296A

JP2022531296A - Ｔｅｒｔ活性化療法を伴う方法および組成物

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Publication number: JP2022531296A
Application number: JP2021564716A
Authority: JP
Inventors: ロナルドエー．デピーニョ; ヤオチーアランワン; ホンソクシム; ジェームズダブリュー．ホーナー
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 2019-05-02
Filing date: 2020-04-30
Publication date: 2022-07-06
Also published as: EP3962514A1; CN114364392A; US20220313782A1; EP3962514A4; WO2020223475A1; KR20220022126A

Abstract

本開示は、早期老化障害または神経変性障害、特に、アルツハイマー病などのアミロイド沈着およびニューロン死に関連する神経変性障害を処置するための方法および組成物を提供する。したがって、本開示の局面は、その必要がある対象における早期老化障害を処置するための方法であって、対象にTERT活性化療法を投与する段階を含む方法に関する。さらなる局面は、対象における神経変性障害を処置するための方法であって、対象にTERT活性化療法を投与する段階を含む方法に関する。TIFF2022531296000024.tif55128

Description

本出願は、その全体で参照により本明細書に組み入れられる2019年5月2日に出願された米国特許仮出願第62/842,323号への優先権を主張する。

本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金番号CA084628の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

I. 発明の分野
本発明は、医学の分野に関する。具体的には、本発明はアルツハイマー病を処置するための方法および組成物を提供する。

II. 背景
アルツハイマー病（AD）は、進行性の変性疾患である。これは、炎症性サイトカインの増加したレベル、ならびに記憶および学習能力を徐々に破壊する、特に海馬中の有毒なベータ-アミロイド沈着の蓄積によって特徴付けられる。医学の進歩にもかかわらず、ADに対する根治療法はない。FDA承認薬は、これらの投薬を受けた患者のわずか約半数で症状の悪化を一時的に減速するだけである。これによって、メディケア、メディケイド、およびビジネスに与えるADおよび他の認知症の直接および間接コストの合計は毎年1480億ドル超になる。

ADの認知症状に対して現在承認されている薬物処置は、コリンエステラーゼ阻害剤を含むのに対し、ADの行動症状の「適応外」処置は抗うつ薬を含み、これらの薬物クラスは共に、神経伝達物質の利用能を増加させるのに加え、望ましくない副作用を誘発し、腫瘍壊死因子の産生を阻害する。ADの処置における高いコスト、望ましくない副作用、および限られた有効性の問題を解決する必要がある。高いコスト、望ましくない副作用の高い発生率、およびADの効果的な処置に存在する限界などの、ADと関係する問題に対処する治療法の必要性が存在する。

本開示は、早期老化障害または神経変性障害、特にアミロイド沈着およびニューロン死に関連するもの、例えばアルツハイマー病を処置するための方法および組成物を提供する。したがって、本開示の局面は、その必要がある対象における早期老化障害を処置するための方法であって、対象にTERT活性化療法を投与する段階を含む方法に関する。さらなる局面は、対象における神経変性障害を処置するための方法であって、対象にTERT活性化療法を投与する段階を含む方法に関する。さらなる局面は、その必要がある対象において新しいニューロンを生成するための方法であって、対象にTERT活性化療法を投与する段階を含む方法に関する。さらなる局面は、その必要がある対象におけるアミロイドβペプチドを減少させるための方法であって、対象にTERT活性化療法を投与する段階を含む方法に関する。なおさらなる局面は、TERTポリペプチドおよび／またはTERTポリペプチドをコードする核酸を含むナノベシクルを含む組成物に関する。TERT活性化療法は、内在性TERTタンパク質の発現を増加させること、細胞中のTERTタンパク質の濃度を増加させること、TERTタンパク質（内在的に加えられたTERTタンパク質または外来的に加えられたTERTタンパク質のいずれか）の活性を増加させること、ならびにTERTタンパク質および／またはmRNAを安定化することのうちの1つまたは複数を行い得る治療法を指す。

いくつかの態様では、早期老化障害は、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群（HGPS）、ネスター・ギラーモ早老症候群、ウェルナー症候群、コケイン症候群、ブルーム症候群、色素性乾皮症、毛細血管拡張性運動失調症、裂毛症、先天性角化異常症、または多彩異数性モザイク症候群を含む。いくつかの態様では、神経変性障害はアルツハイマー病を含む。いくつかの態様では、早期老化障害は、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群（HGPS）、ネスター・ギラーモ早老症候群、ウェルナー症候群、コケイン症候群、ブルーム症候群、色素性乾皮症、毛細血管拡張性運動失調症、裂毛症、先天性角化異常症、または多彩異数性モザイク症候群を除外する。いくつかの態様では、神経変性障害はアルツハイマー病を除外する。いくつかの態様では、アルツハイマー病は、早期発症型アルツハイマー病を含むまたはそれである。いくつかの態様では、アルツハイマー病は、遅発型アルツハイマー病を含むまたはそれである。いくつかの態様では、早期発症型アルツハイマー病または遅発型アルツハイマー病のいずれかが除外される。いくつかの態様では、神経変性障害は、アミロイド沈着を伴う神経変性障害を含む。いくつかの態様では、神経変性は、神経細胞の変性および／または死滅を含む疾患として定義される。いくつかの態様では、神経変性障害は、ニューロン細胞死を引き起こすものである。いくつかの態様では、処置することは、樹状突起棘の形成を増加させることを含む。いくつかの態様では、皮質ニューロンにおいて樹状突起棘の形成が増加する。いくつかの態様では、処置することは、神経ネットワークを増加させることまたは強化することを含む。いくつかの態様では、処置することは、分子シャペロンの発現を促進し、かつADリスク遺伝子の発現を減少させるシナプスパスウェイ活性化を強化することまたは増加させることを含む。いくつかの態様では、処置することは、アミロイド斑を減少させることを含む。いくつかの態様では、対象は、障害を有すると診断されている。いくつかの態様では、対象は、以前に障害について処置されている。いくつかの態様では、対象は、以前の療法に対して非応答性と決定されている。いくつかの態様では、対象は、以前に障害について処置されていない。いくつかの態様では、対象はヒトである。いくつかの態様では、対象は50歳未満である。いくつかの態様では、対象は、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、もしくは85歳（もしくはその中から導き出せる任意の範囲）を下回るか、または30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、もしくは85歳（もしくはその中から導き出せる任意の範囲）を上回る。

いくつかの態様では、方法はさらに、追加の療法の投与を含む。いくつかの態様では、追加の療法は、ドネペジル、ガランタミン、またはリバスチグミンなどのコリンエステラーゼ阻害剤を含む。いくつかの態様では、追加の療法はメマンチンを含む。いくつかの態様では、本開示の方法および組成物は、ドネペジル、ガランタミン、リバスチグミン、またはメマンチンのうちの1つまたは複数を除外する。

いくつかの態様では、TERT活性化療法は、TERTポリペプチドをコードする核酸の送達を含む。いくつかの態様では、TERT核酸は、SEQ ID NO：1、3、5、7、もしくは9の核酸もしくはその断片、または、SEQ ID NO：1、3、5、7、もしくは9のうちの1つもしくはその断片と少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％の同一性を有する核酸を含む。いくつかの態様では、TERT活性化療法は、対象へのTERTポリペプチドをコードするDNAまたはRNAを含む。いくつかの態様では、TERT活性化療法は、TERTポリペプチドを含む。いくつかの態様では、TERTポリペプチドは、SEQ ID NO：2、4、6、8、もしくは10のポリペプチドもしくはその断片、または、SEQ ID NO：2、4、6、8、もしくは10のうちの1つもしくはその断片と少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％の同一性を有する核酸を含む。いくつかの態様では、TERT活性化療法は、触媒不活性なTERTポリペプチド、例えば遺伝子のトランス活性化が可能であるが、テロメラーゼ逆転写酵素活性を欠如するTERTポリペプチドを含む。いくつかの態様では、TERTポリペプチドは、D712A変異を含む。いくつかの態様では、TERTポリペプチドは、D712A変異を有しない。

いくつかの態様では、TERT活性化療法は、TERTポリペプチドまたはTERTポリペプチドをコードする核酸を含むナノベシクルを含む。いくつかの態様では、ナノベシクルはエクソソームを含む。いくつかの態様では、ナノベシクルは直径が10～1000nmである。いくつかの態様では、ナノベシクルは、直径が少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、もしくは1000nm（もしくはその中から導き出せる任意の範囲）、または多くとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、もしくは1000nm（もしくはその中から導き出せる任意の範囲）である。いくつかの態様では、ナノベシクルはCD47を含む。いくつかの態様では、ナノベシクルは、ナノベシクルの表面上および／または膜内にCD47の発現を含む。いくつかの態様では、ナノベシクルは、狂犬病ウイルス糖タンパク質ペプチドを含む。本開示の態様に有用な例示的な狂犬病ウイルス糖タンパク質ペプチドは、以下を含む。

dR = D-アルギニン

狂犬病ウイルス糖タンパク質ペプチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、もしくは42個（もしくはその中から導き出せる任意の範囲）もしくはそれ以上のバリアントアミノ酸を含む場合があり、あるいは、SEQ ID NO：11～14の少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、もしくは42個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸、もしくはその中から導き出せる任意の範囲、または多くとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、もしくは42個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸、もしくはその中から導き出せる任意の範囲と、少なくとも60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％類似し得るか、同一であり得るか、または相同であり得る。

狂犬病ウイルス糖タンパク質ペプチドは、SEQ ID NO：11～14の3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、または42個またはそれ以上の連続するアミノ酸、またはその中から導き出せる任意の範囲を含む場合がある。

いくつかの態様では、狂犬病ウイルス糖タンパク質ペプチドは、SEQ ID NO：11～14のアミノ酸1～2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、または42（またはその中から導き出せる任意の範囲）を含む。

狂犬病ウイルス糖タンパク質ペプチドは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、もしくは42個、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、もしくは42個、または正確に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、もしくは42個の置換を含む場合がある。

いくつかの態様では、組成物および方法は、TERTのための送達方法としてエクソソームまたはナノベシクルを除外する。

置換は、アミノ酸位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、または42にある場合がある。

本明細書に記載されるポリペプチドは、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、もしくは42個のアミノ酸（もしくはその中から導き出せる任意の範囲）、多くとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、もしくは42個のアミノ酸（もしくはその中から導き出せる任意の範囲）、または正確に5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、もしくは42個のアミノ酸（もしくはその中から導き出せる任意の範囲）の固定長の場合がある。

いくつかの態様では、TERT活性化療法は、ヒストンH3K9メチルトランスフェラーゼ（HMT）の調整を含む。いくつかの態様では、調整は、HMT遺伝子またはタンパク質の抑制を含む。いくつかの態様では、抑制は、1つまたは複数のHMT遺伝子の遺伝子サイレンシングを含む。遺伝子サイレンシングのための方法は、当技術分野において公知である。例えば、相同組み換え修復および遺伝子編集などの方法が、対象における細胞、例えばニューロン細胞または支持細胞中の1つまたは複数のHMT遺伝子を変異させるために使用される場合がある。いくつかの態様では、CRISPRなどの遺伝子編集技術が対象中の1つまたは複数のHMTの発現を減少させるために使用される。いくつかの態様では、1つまたは複数のHMT遺伝子は、SUV39H1/KMT1A、SUV39H2/KMT1B、SETDB1/KMT1E、SETDB2/KMT1F、PRDM2、G9A/KMT1C、GLP/KMT1D、EHMT1、およびRIZ1/KMT8のうちの1つまたは複数を含む。いくつかの態様では、SUV39H1/KMT1A、SUV39H2/KMT1B、SETDB1/KMT1E、SETDB2/KMT1F、PRDM2、G9A/KMT1C、GLP/KMT1D、EHMT1、およびRIZ1/KMT8のうちの1つまたは複数は、HMTの態様として除外される。いくつかの態様では、TERT活性化療法は、HMT阻害剤を含む。いくつかの態様では、HMT阻害剤は、ケトシン、BIX-01294、BIX-01338、UNC0638、およびBRD4770のうちの1つまたは複数を含む。いくつかの態様では、ケトシン、BIX-01294、BIX-01338、UNC0638、およびBRD4770のうちの1つまたは複数は除外される。いくつかの態様では、TERT活性化療法は、ケトシンを含む。いくつかの態様では、TERT活性化療法は、ヒストンH3K9デメチラーゼ（HDM）ポリペプチドまたはHDMをコードする核酸の投与を含む。いくつかの態様では、HDMポリペプチドは、デメチラーゼ活性を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様では、HDMポリペプチドは、KDM1A/LSD1、KDM3A/JHDM2A、KDM3B/JHDM2B、KDM4A/JHDM3A、KDM4B/JMJD2B、KDM4C/JMJD2C、KDM4D/JMJD2D、KDM7/JHDM1D、およびPHF8のうちの1つまたは複数からのポリペプチドを含む。いくつかの態様では、KDM1A/LSD1、KDM3A/JHDM2A、KDM3B/JHDM2B、KDM4A/JHDM3A、KDM4B/JMJD2B、KDM4C/JMJD2C、KDM4D/JMJD2D、KDM7/JHDM1D、およびPHF8のうちの1つまたは複数は、HDMの態様として除外される。

狂犬病ウイルス糖タンパク質の他の態様は、参照により本明細書に組み入れられるOswald et al., Mol. Pharmaceutics, 2017, 14 (7), pp 2177-2196にさらに記載されている。

いくつかの態様では、ナノベシクルは、線維芽細胞または骨髄樹状細胞に由来する。いくつかの態様では、ナノベシクルは、ヒト細胞に由来する。いくつかの態様では、ナノベシクルは非ヒト細胞に由来する。

いくつかの態様では、TERT活性化療法は、静脈内注射によって投与される。いくつかの態様では、TERT活性化療法は全身投与される。いくつかの態様では、TERT活性化療法は、本明細書に記載される投与経路によって投与される。

いくつかの態様では、処置することは、アミロイドβペプチドの減少、学習の改善、記憶の改善、およびニューロン生成のうちの1つまたは複数を含む。減少または改善は、少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、または90％、またはその中から導き出せる任意の範囲の場合がある。

いくつかの態様では、TERTポリペプチドは、テロメラーゼ活性を有するポリペプチドを含む。「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、遺伝子産物を呼ぶ場合に本明細書において互換的に使用される。

「対象」、「哺乳動物」および「患者」という用語は互換的に使用される。いくつかの態様では、対象は哺乳動物である。いくつかの態様では、対象はヒトである。いくつかの態様では、対象は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ロバ、または実験室検査動物、例えばショウジョウバエ、ゼブラフィッシュなどである。

いくつかの態様では、対象は、以前に疾患または障害について処置されている。いくつかの態様では、対象は、以前の処置に抵抗性であった。いくつかの態様では、対象は、以前の処置に対する低応答者と決定された。

方法および組成物が本明細書に記載される態様のいずれかの除外を含むことが考えられている。

本出願を通して、「約」という用語は、値がその値を決定するために採用される装置または方法についての誤差の標準偏差を含むことを示すために、細胞および分子生物学の領域におけるその平易で通常の意味にしたがって使用される。

「a」または「an」という語の使用は、「含んでいる（comprising）」という用語と共に使用される場合、「1つ」を意味する場合があるが、「1つまたは複数」、「少なくとも1つ」、および「1つまたは1つより多い」の意味とも一致する。

本明細書に使用される「または」および「および／または」という用語は、複数の成分を互いに組み合わせてまたは互いに除外して記載するために利用される。例えば、「x、y、および／またはz」は、「x」単独、「y」単独、「z」単独、「x、y、およびz」、「（xおよびy）またはz」、「xまたは（yおよびz）」、または「xまたはyまたはz」を指すことができる。x、y、またはzが態様から特異的に除外される場合があることが具体的に考えられている。

「含んでいる（comprising）」（ならびに「含む（comprise）」および「含む（comprises）」などの、含んでいるの任意の形態）、「有している（having）」（ならびに「有する（have）」および「有する（has）」などの、有しているの任意の形態）、「含んでいる（including）」（ならびに「含む（includes）」および「含む（include）」などの、含んでいるの任意の形態）、「によって特徴付けられる（characterized by）」（および「として特徴付けられる（characterized as）」などの含んでいるの任意の形態）、または「含有している（containing）」（ならびに「含有する（contains）」および「含有する（contain）」などの含有しているの任意の形態）という語は、包括的または非限定的であって、追加的な、記載されない要素または方法段階を除外するものではない。

組成物およびそれらの使用方法は、本明細書にわたり開示される成分または段階のいずれかを「含む」、それ「から本質的になる」、またはそれ「からなる」ことができる。「からなっている」という語句は、特定されていないいかなる要素、段階、または成分も除外する。「から本質的になる」という語句は、記載された対象の範囲を、特定された材料または段階および基本的な新規特徴に実質的に影響しないものに限定する。「含んでいる（comprising）」という用語に関連して記載される態様は、「からなっている（consisting of）」または「から本質的になっている（consisting essentially of）」という用語の文脈でも実現され得ると考えられている。

本発明の一態様に関して説明される任意の限定は、本発明の任意の他の態様に適用され得ることが具体的に考えられている。さらに、本発明の任意の組成物は、本発明の任意の方法に使用される場合があり、本発明の任意の方法は、本発明の任意の組成物を産生または利用するために使用される場合がある。実施例に示される態様の局面はまた、別の実施例の他のどこかまたは本出願の他のどこか、例えば発明の概要、態様の詳細な説明、特許請求の範囲、および図の凡例の説明に述べられる態様の文脈でも実現され得る態様である。

本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、本発明の特定の態様を示す間の詳細な説明および具体例は、単に実例として示されていることを理解するべきである。それは、本発明の精神および範囲内の様々な変化および改変が、この詳細な説明から当業者に明らかになるからである。

以下の図面は本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の局面をさらに実証するために含まれている。本発明は、本明細書において呈示される特定の態様の詳細な説明と共にこれらの図面の1つまたは複数を参照することによってよりよく理解される場合がある。

図1A～I. Tertは、2つの異なるマウスアルツハイマー病ニューロンでダウンレギュレーションされる。（A）3xTg-ADおよび野生型対照（B6129SF2/J）マウス（n=4；3か月齢）の皮質中のTert mRNAレベル。（B）5xFADおよび野生型同腹子対照マウス（n=4；2～3か月齢）の海馬中のTert mRNAレベル。（C）DIV 14の3xTg-ADおよび対照マウス（n=3）から単離された初代皮質および海馬ニューロン中のTert mRNAレベル。（D）DIV 14の5xFADおよび対照マウス（n=3）から単離された初代皮質および海馬ニューロン中のTert mRNAレベル。（E）5xFADおよび対照マウス（n=4；2～3か月齢）から単離された海馬ニューロン中のテロメラーゼ活性。（F）DIV 14の5xFADおよび対照マウス初代ニューロンのTert遺伝子におけるH3K9me3抑制ヒストンマークの占有率の代表図。（G）5xFADおよび野生型同腹子対照マウス（n=4；2～3か月齢）の皮質および海馬ニューロン中のヒストンデメチラーゼKdm1a、Kdm4b、およびKdm4c遺伝子のmRNAレベル。（H）5xFADおよび野生型同腹子対照マウス（2～3か月齢）のCA1海馬亜領域におけるKDM1Aの免疫染色。（I）ケトシンまたはBIX-01294で処置された5xFADマウスの皮質および海馬中のTert mRNAレベル。図2A～C. Cre誘導性Tertノックインマウス（R26-CAG-LSL-mTert-IRES-eGFP-pA）の作出。（A）CAG-LSL-mTert-IRES-eGFP-pAをRosa26座位に導入するために使用された構築物のスキーム。（B）R26-CAG-LSL-mTert-IRES-eGFP-pAアレルを保持する本来のES標的化株の遺伝子型判定結果。（C）標的化ES細胞から得られたキメラマウスの代表的な写真。図3A～D. Tertの活性化は、新規な誘導性TERT-ADマウスモデルにおけるアミロイド病態を緩和する。（A）3xTg-ADまたは5xFADおよびCamk2a-CreERT2マウスを用いたR26-CAG-LSL-mTertの育種戦略。（B）成体（8か月齢）対照およびTert活性化R26-CAG-LSL-mTert；3xTg-AD；Camk2a-CreERT2マウスのCA1海馬亜領域におけるAβの免疫染色。（C）CA1領域（1群n=6；8か月齢）におけるAβ免疫反応性錐体ニューロンの量的比較。（D）成体（7か月齢）対照およびTert活性化R26-CAG-LSL-mTert；5xFAD；Camk2a-CreERT2マウスの海馬におけるAβ免疫染色。図4A～F. 分子シャペロンの発現を促進し、ADリスク遺伝子の発現を減少させる様々なシナプス経路をADニューロンにおけるTert活性化は強化する。（A）R26-CAG-LSL-mTert；3xTg-AD；Camk2a-CreERT2マウス脳のTert活性化ニューロンにおけるTertおよびTercのmRNAレベル。（B）対照群と比較されたR26-CAG-LSL-mTert；3xTg-AD；Camk2a-CreERT2マウスのTert活性化皮質および海馬ニューロンからのRNA-Seqの結果に基づくアップレギュレーションされた生物学的過程の交わりを示すベン図。（C）Tert活性化皮質および海馬ニューロンの両方でアップレギュレーションされた上位5つの重複パスウェイ。（D）対照ニューロンとの比較によるTert活性化皮質および海馬ニューロンにおけるシナプスシグナル伝達遺伝子の相対アップレギュレーションを示す遺伝子セットエンリッチメント解析（GSEA）プロット。（E、F）Tert誘導の存在下または非存在下のApp、ApoE、Hsp70-1およびHsp70-2遺伝子のmRNAレベル。図5A～C. Tertの活性化は、ADマウスモデルにおいて棘の形態および神経ネットワークを強化する。（A）加齢（18か月）対照およびTert活性化R26-CAG-LSL-mTert；3xTg-AD；Camk2a-CreERT2マウスからのゴルジ染色皮質ニューロンの代表的な画像。（B）加齢対照およびTert活性化R26-CAG-LSL-mTert；3xTg-AD；Camk2a-CreERT2マウスの染色された（impregnated）錐体皮質ニューロンにおける高倍率の樹状突起棘。（C）樹状突起棘密度の定量（1群n=4匹のマウスからの1群n=20本の樹状突起；18か月齢）。2群比較のためのStudentのt検定。^****P＜0.0001；平均±s.e.m.。図6A～D. ヒトADニューロンにおけるHMT阻害剤および遺伝子サイレンシングによるヒトTERT遺伝子の活性化。（A）APP^DP患者由来iPSCおよび認知障害のない対照（NDC）個体由来iPSCから分化したニューロンのTERT遺伝子におけるH3K9me3抑制ヒストンマーク占有率の代表的な画像。（B,C）ケトシン処置ヒトADニューロンにおけるTERT mRNAレベル（B）およびTERTタンパク質レベル（C）。（D）ヒストンメチルトランスフェラーゼ遺伝子、G9AまたはSETDB1を標的化するsiRNAで処置されたヒトADニューロンにおけるTERTタンパク質レベルの免疫ブロット。図7A～E. TERT活性化は、ヒトADニューロンにおけるアミロイド病態を緩和する。（A）Flagタグ付きヒトTERTレンチウイルス発現構築物のクローニング。（B、C）APP^DP患者由来iPSC（n=3）から分化したEGFPまたはTERT形質導入ニューロンにおけるサンドイッチELISAによって測定されたAβ_1-40レベル。（D）EGFPまたはTERT形質導入APP^DPニューロンにおける表示の内在性タンパク質についての免疫ブロット。チューブリンをローディング対照として使用した。（E）EGFPまたはTERT形質導入APP^DPニューロン（n=4）における定量RT-PCRによる相対遺伝子発現。図8A～C. TERTのトランス活性化機能はその触媒活性に依存しない。（A）触媒不活性な（CI）ヒトTERTレンチウイルス発現構築物の概略図。白の星印は、タンパク質を触媒不活性にする単一変異D712Aの位置を示す。（B）HEK293細胞におけるFlagタグ付き触媒不活性TERTの発現確認のための免疫ブロット。（C）表示の各遺伝子のmRNA発現レベル。転写レベルをHPRT1 mRNAに対して規準化した。図9A～D. ニューロンTERTの活性化は、ADニューロンにおける学習過程に関連する特異的遺伝子のトランス活性化をトリガーする。（A）各対照群と比較されたR26-CAG-LSL-mTert；3xTg-AD；Camk2a-CreERT2マウス（各群n=4）およびTERT活性化ヒトAPP^DPニューロン（n=3）のTert活性化マウス皮質および海馬ニューロンからの3つの独立したRNA-Seqの結果（すべてp＜0.05）に基づくアップレギュレーションされた生物学的過程の交わりを示すベン図。（B）Tert活性化マウスの皮質および海馬ADニューロンならびにTERT活性化ヒトADニューロンのすべてでアップレギュレーションされた13の重複パスウェイのリスト。（C）各対照群と比較したTert活性化皮質および海馬ADニューロンならびにTERT活性化ヒトADニューロンにおける学習関連遺伝子の相対アップレギュレーションを示すGSEAプロット。（D）訓練日にわたるバーンズ迷路における加齢（22～26か月）対照およびTert活性化R26-CAG-LSL-mTert；3xTg-AD；Camk2a-CreERT2マウス（各群n=9）の逃避潜時。シダックの多重比較検定を行う二元配置ANOVA；2群比較のためのスチューデントt検定；記号1、2、3、または4つは、それぞれP＜0.05、0.01、0.0005、0.0001を意味する；平均±s.e.m。図10A～C. ニューロンTERTは、β-カテニン転写因子およびRNAポリメラーゼII複合体コア成分と物理的に相互作用する。（A）ヒトADニューロンにおける質量分析によって同定されたTERT相互作用タンパク質のリスト。（B）EGFPおよびTERT形質導入ヒトADニューロン（n＝3）におけるWNTシグナル伝達パスウェイ遺伝子のRNA-Seqヒートマップ。（C）ヒトADニューロンからの内在性β-カテニン（活性型）、CREBBP、POLR2A、およびTERTの免疫共沈。図11A～C. ゲノムレベルのTERTおよびβ-カテニン/TCF7の関連のグローバルなエンリッチメント。（A）ヒトADニューロンの遺伝子プロモーターにわたるTERT、β-カテニン（活性型）およびTCF7のChIP-Seq密度ヒートマップ。（B）ChIP-Seqによって決定された場合のWNT9B、ATP1A3、HSPA12A、HSPA6、およびMYC座位についてのβ-カテニン（活性型）、TCF7およびTERT結合ピークを示すクロマチン状態マップ。（C）ADニューロンでの転写活性化におけるTERT作用についてのモデル。ニューロン細胞では、TERTレベルは、ADの初期病理学的ステージで減少する。ニューロンTERTの活性化は、ADニューロンにおけるシナプスシグナル伝達および学習過程に関連する特異的遺伝子の転写誘導をトリガーし、認知障害を緩和できるようにする。

発明の詳細な説明
テロメラーゼ逆転写酵素（TERT）、テロメラーゼの触媒サブユニットは、げっ歯動物およびヒトの両方の複数の組織で多種多様な有益な機能および防御機能を有すると報告されている。しかし、テロメラーゼと、AD病態の主たる特徴であるアミロイド病態との間の関係は研究されていない。ADは、進行性の成人発症型神経変性疾患である。脳に及ぼすTERTの再活性化の影響を試験するために、本発明者らは、TERT遺伝子発現の時間的調節を制御するために誘導性テロメラーゼ活性化AD（TERT-AD）マウスモデルを樹立した。実施例1に示すように、テロメラーゼの活性化は、ADで冒される重要なニューロン転写ネットワークのその直接調節を介してマウスおよびヒトADモデルにおいてAD病態を緩和することができる。脳内のTERTレベルおよび活性を強化することは、アルツハイマー病のアミロイド神経病態の予防および治療のための治療戦略を提供する。

I. TERTポリペプチド
ヒトではCMM9、DKCA2、DKCB4、EST2、PFBMFT1、TCS1、TP2、TRT、hEST2、およびhTRT、ならびにマウスではEST2、TCS1、TP2、TR、およびTRTとしても公知であるTERTは、当技術分野において公知であり、本明細書に記載される以下のmRNAおよびタンパク質配列によって例示される。

例えば、ヒトTERT遺伝子は、以下によって例示される。ホモ・サピエンス（Homo sapiens）テロメラーゼ逆転写酵素（TERT）、転写物バリアント2、mRNA（NCBI参照配列：NM_001193376.1）：

ヒトテロメラーゼ逆転写酵素アイソフォーム2、NCBI参照配列：NP_001180305.1：

ホモ・サピエンステロメラーゼ逆転写酵素（TERT）、転写物バリアント1、mRNA、NCBI参照配列：NM_198253.2：

ヒトテロメラーゼ逆転写酵素アイソフォーム1、NCBI参照配列：NP_937983.2：

ハツカネズミ（Mus musculus）テロメラーゼ逆転写酵素（Tert）、転写物バリアント2、mRNA、NCBI参照配列：NM_001362387.1：

ハツカネズミテロメラーゼ逆転写酵素アイソフォーム2、NCBI参照配列：NP_001349316.1：

ハツカネズミテロメラーゼ逆転写酵素（Tert）、転写物バリアント3、mRNA、NCBI参照配列：NM_001362388.1：

ハツカネズミテロメラーゼ逆転写酵素アイソフォーム3、NCBI参照配列：NP_001349317.1：

ハツカネズミテロメラーゼ逆転写酵素（Tert）、転写物バリアント1、mRNA、NCBI参照配列：NM_009354.2：

ハツカネズミテロメラーゼ逆転写酵素アイソフォーム1、NCBI参照配列：NP_033380.1：

いくつかの態様では、TERTポリペプチドまたは核酸は、ヒトTERTポリペプチドまたはヒトTERT核酸を含む。いくつかの態様では、TERTポリペプチドまたはTERT核酸は非ヒトである。いくつかの態様では、TERTポリペプチドまたはTERT核酸は、マウス、ウマ、イヌ、ウサギ、またはヤギ由来である。

本開示のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、例えばTERTポリペプチドを含むまたはコードするものは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999、もしくは1000個（もしくはその中から導き出せる任意の範
囲）もしくはそれ以上のバリアントアミノ酸もしくは核酸の置換を含む場合があり、あるいは、SEQ ID NO：1～10の少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、
993、994、995、996、997、998、999、もしくは1000個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸もしくは核酸、もしくはその中から導き出せる任意の範囲、または多くとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999、もしくは1000個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸もしくは核酸、もしくはその中から導き出せる任意の範囲と、少なくとも60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％類似し得るか、同一であり得るか、または相同であり得る。

本開示のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、例えばTERTポリペプチドを含むまたはコードするものは、SEQ ID NO：1～10の3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999、1000、1001、1002、1003、1004、1005、1006、
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はその中から導き出せる任意の範囲を含む場合がある。

いくつかの態様では、ポリペプチドは、SEQ ID NO：1～10のアミノ酸または核酸1～2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999、1000、1001、1002、1003、1004、1005、1006、1007、1008、1009、1010、1011、1012、
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いくつかの態様では、ポリペプチドは、SEQ ID NO：1～10の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、または615個（またはその中から導き出せる任意の範囲）の連続するアミノ酸を含む。

いくつかの態様では、ポリペプチドは、SEQ ID NO：1～10のうちの1つと少なくとも60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％類似するか、同一であるか、もしくは相同である、または多くとも60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％類似するか、同一であるか、もしくは相同である、または正確に60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％類似するか、同一であるか、もしくは相同である、SEQ ID NO：1～10の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999、または1000個（またはその中から導き出せる任意の範囲）の連続するアミノ酸を含む。

本開示のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、もしくは600個
の置換、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、もしくは600個の置換、または正確に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、もしくは600個の置換を含む場合がある。

置換は、SEQ ID NO：1～10のうちの1つのアミノ酸位置または核酸位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999、または1000にある場合がある。

本明細書に記載されるポリペプチドは、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、もしくは500個もしくはそれ以上のアミノ酸（もしくはその中から導き出せる任意の範囲）、多くとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、もしくは500個もしくはそれ以上のアミノ酸（もしくはその中から導き出せる任意の範囲）、または正確に5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、もしくは500個もしくはそれ以上のアミノ酸（もしくはその中から導き出せる任意の範囲）の固定長の場合がある。

置換バリアントは、典型的にはタンパク質内の1つまたは複数の部位での1つのアミノ酸と別のアミノ酸との交換を含有し、他の機能または性質を喪失してまたは喪失せずに、ポリペプチドの1つまたは複数の性質を調整するように設計される場合がある。1つのアミノ酸が類似の形状および電荷のアミノ酸と置き換えられる置換は、保存的であり得る。保存的置換は当技術分野において周知であり、例えば、アラニンからセリンへ；アルギニンからリシンへ；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジンへ；アスパルテートからグルタメートへ；システインからセリンへ；グルタミンからアスパラギンへ；グルタメートからアスパルテートへ；グリシンからプロリンへ；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミンへ；イソロイシンからロイシンまたはバリンへ；ロイシンからバリンまたはイソロイシンへ；リシンからアルギニンへ；メチオニンからロイシンまたはイソロイシンへ；フェニルアラニンからチロシン、ロイシンまたはメチオニンへ；セリンからトレオニンへ；トレオニンからセリンへ；トリプトファンからチロシンへ；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニンへ；およびバリンからイソロイシンまたはロイシンへの変化を含む。あるいは、置換は、ポリペプチドの機能または活性が影響されるように非保存的であり得る。非保存的変化は、典型的に非極性または非荷電アミノ酸の代わりに極性または荷電アミノ酸、およびその逆のように、残基を化学的に似ていない残基に置換することを伴う。

タンパク質は、組み換えである場合、またはインビトロで合成される場合がある。あるいは、非組み換えまたは組み換えタンパク質が、細菌から単離される場合がある。そのようなバリアントを含有する細菌が組成物および方法に実現される場合があることも考えられている。その結果、タンパク質を単離する必要はない。

「機能的に等価のコドン」という用語は、本明細書において、アルギニンまたはセリンについての6つのコドンなどの同じアミノ酸をコードするコドンを指すために使用され、生物学的に等価のアミノ酸をコードするコドンも指す。

アミノ酸および核酸配列がそれぞれ追加的なN末端もしくはC末端アミノ酸、または5'もしくは3'配列などの追加的な残基を含む場合があるが、タンパク質の発現が関係する生物学的タンパク質活性の維持を含む上記の基準を該配列が満たすかぎり、それでもなお本質的に本明細書に開示される配列の1つに示されるものであることも理解されるであろう。末端配列の付加は、特に例えばコード領域の5'または3'部分のいずれかに隣接する様々な非コード配列を含み得る核酸配列に適用される。

以下は、等価の、または改良さえされている、第二世代分子を創出するためのタンパク質のアミノ酸の変化に基づく考察である。例えば、相互作用結合能の認識できる喪失なしに、ある特定のアミノ酸でタンパク質構造中の他のアミノ酸が置換される場合がある。例えば、酵素触媒ドメインまたは相互作用成分などの構造は、そのような機能を維持するためにアミノ酸が置換されている場合がある。タンパク質の生物学的機能的活性を定義するのは該タンパク質の相互作用能および性質であるので、ある特定のアミノ酸置換をタンパク質配列中およびその基礎となるDNAコード配列中に行い、それでもなお同様の性質を有するタンパク質を産生することができる。したがって、遺伝子の生物学的有用性または活性に認識可能な喪失なしに、該遺伝子のDNA配列に様々な変化が行われる場合があることが本発明者らによって考えられている。

他の態様では、1つまたは複数の置換を導入することによるポリペプチドの機能の変更が意図される。例えば、相互作用成分の相互作用結合能を改変する意図で、ある特定のアミノ酸でタンパク質構造中の他のアミノ酸が置換される場合がある。例えば、タンパク質相互作用ドメイン、核酸相互作用ドメイン、および触媒部位などの構造は、そのような機能を変更するようにアミノ酸が置換されている場合がある。タンパク質の生物学的機能活性を定義するのは該タンパク質の相互作用能および性質であるので、ある特定のアミノ酸置換をタンパク質配列中およびその基礎となるDNAコード配列中に行い、それでもなお異なる性質を有するタンパク質を産生することができる。したがって、遺伝子の生物学的有用性または活性の認識できる変更を伴って、該遺伝子のDNA配列に様々な変化が加えられる場合があることが本発明者らによって考えられている。

そのような変化を加えるにあたって、アミノ酸のハイドロパシー指数が考慮される場合がある。タンパク質に相互作用的生物学的機能を付与することへのアミノ酸のハイドロパシー指数の重要性が、当技術分野において一般的に理解されている（Kyte and Doolittle, 1982）。結果として生じるタンパク質の二次構造にアミノ酸の相対ハイドロパシー的性質が寄与し、それが今度はタンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、DNA、抗体、抗原などとの相互作用を規定すると受け入れられている。

親水性に基づき類似のアミノ酸の置換を効果的に行うことができることもまた、当技術分野において理解されている。参照により本明細書において組み入れられる米国特許第4,554,101号は、その隣接アミノ酸の親水性によって支配されるようなタンパク質の最大局所平均親水性がタンパク質の生物学的性質と相関することを述べている。アミノ酸で類似の親水性値を有する別のアミノ酸を置換し、それでも生物学的に等価で免疫学的に等価なタンパク質を産生できることが理解されている。

上に概説するように、アミノ酸置換は、一般的にアミノ酸側鎖置換基、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどの相対類似性に基づく。様々な前述の特徴を考慮する例示的な置換が周知であって、アルギニンおよびリシン；グルタメートおよびアスパルテート；セリンおよびトレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンを含む。

特定の態様では、本明細書に記載されるタンパク質のすべてまたは部分はまた、従来技術に従って溶液中または固体支持体上に合成することができる。様々な自動合成装置が市販されており、公知のプロトコールに従って使用することができる。例えば、それぞれ参照により本明細書に組み入れられるStewart and Young, (1984)；Tam et al., (1983)；Merrifield, (1986)；およびBarany and Merrifield (1979)を参照されたい。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が発現ベクター内に挿入され、適切な宿主細胞中に形質転換またはトランスフェクトされ、発現に適した条件下で培養される、組み換えDNA技術が採用される場合がある。一態様は、タンパク質の産生および／または提示のための、微生物を含む細胞への遺伝子移入の使用を含む。関心対象のタンパク質についての遺伝子が適切な宿主細胞中に移入され、続いて適切な条件下で細胞が培養される場合がある。実質的に任意のポリペプチドをコードする核酸が採用される場合がある。組み換え発現ベクターおよびその中に含まれるエレメントの生成は、本明細書に述べられている。あるいは、産生されるべきタンパク質は、タンパク質産生のために使用される細胞によって通常合成される内在性タンパク質であり得る。

II. 遺伝子送達
本開示のある特定の局面は、対象へのTERT活性化療法の投与を含む。これは、対象へのTERT核酸および／またはポリペプチドの投与を含み得る。TERT核酸は、TERT遺伝子、タンパク質、またはDNAもしくはRNAにコードされるmRNAを含み得る。いくつかの態様では、方法は、対象へのTERTポリペプチドをコードするDNAの投与を含む。いくつかの態様では、方法は、対象へのTERTポリペプチドをコードするRNAの投与を含む。細胞内への核酸の導入に関係する技術は、当業者に周知である。例示的な技術を下に述べる。

A. ウイルスベクター
ある特定の態様では、細胞内への発現構築物の移入はウイルスベクターを使用してなし遂げられる。「ウイルスベクター」を使用する技術は、当技術分野において周知である。ウイルスベクターは、（a）発現カセットのパッケージングを支持するため、および（b）その中にクローニングされた組み換え遺伝子構築物を最終的に発現するために十分なウイルス配列を含有する構築物を含むことが意味される。

特定の態様では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターは、幹細胞に感染させることおよび長期発現を提供することにうまく使用されている。

核酸の送達のための別の方法は、アデノウイルスベクターの使用を伴う。アデノウイルスベクターは、ゲノムDNAへの組み込み能が低いことが公知である。アデノウイルスベクターは、高度に効率的な遺伝子移入をもたらす。

アデノウイルスは、臨床状況で遺伝子移入のための、現在もっとも一般的に使用されるベクターである。これらのウイルスの利点の中に、それらが非分裂細胞および分裂細胞の両方への遺伝子送達に効率的であり、大量生産できることがある。ベクターは、アデノウイルスの遺伝子操作された形態を含む（Grunhaus et al, 1992）。レトロウイルスと対照的に、アデノウイルスDNAは潜在的遺伝毒性なしにエピソーム的に複製することができるので、宿主細胞のアデノウイルス感染は、染色体組み込みをもたらさない。また、アデノウイルスは構造が安定であり、大規模な増幅後にゲノム再編成が検出されていない。

アデノウイルスは、特に遺伝子移入ベクターとしての使用に適す。それは、その中間サイズのゲノム、操作の容易さ、高い力価、広い標的細胞範囲および高い感染性の理由からである。当業者ならば、アデノウイルスベクターを使用する実験方法に精通しているであろう。

アデノウイルスベクターは、複製欠損、または少なくとも条件付き欠損であり得、アデノウイルスベクターの性質が本発明の実施成功のために重要であるとは考えられていない。アデノウイルスは、42種の異なる公知の血清型または亜群A～Fのいずれかであり得、他の血清型または亜群が想定されている。アデノウイルス5型亜群Cは、本発明における使用のための条件付き複製欠損アデノウイルスベクターを得るための出発材料である。これは、アデノウイルス5型が、多量の生化学情報および遺伝情報が公知であるヒトアデノウイルスであり、それがアデノウイルスをベクターとして採用している大部分の構築のために歴史的に使用されてきたからである。アデノウイルスの増殖および操作は、当業者に公知であり、インビトロおよびインビボで広い宿主範囲を示す。CARドメインの変更を有するアデノウイルスなどの改変ウイルスも使用される場合がある。送達を強化するためまたは免疫応答を回避するための方法、例えばウイルスのリポソーム封入もまた想定されている。レトロウイルスは、逆転写過程により感染細胞中でそれらのRNAを二本鎖DNAに変換できることを特徴とする一本鎖RNAウイルスの群である（Coffin, 1990）。それで、結果として生じたDNAはプロウイルスとして細胞染色体に安定的に組み込まれ、ウイルスタンパク質の合成を指示する。組み込みは、レシピエント細胞およびその子孫でのウイルス遺伝子配列の保持をもたらす。レトロウイルスゲノムは、ウイルスゲノムの5'および3'末端に存在する2つの長末端反復（LTR）配列を含有する。これらは、強いプロモーターおよびエンハンサー配列を含有し、宿主細胞ゲノムへの組み込みのためにも必要とされる（Coffin, 1990）。

レトロウイルスベクターを構築するために、関心対象の核酸または遺伝子をコードする核酸がある種のウイルス配列の代わりにウイルスゲノム中に挿入されて、複製欠損ウイルスが産生される。当業者ならば、レトロウイルスベクターを構築するために利用可能な周知の技術に精通しているであろう。

アデノ随伴ウイルス（AAV）は、本発明への使用のために魅力的なベクター系である。それは、AAVが高い組み込み頻度を有し、AAVが非分裂細胞に感染することができ、それによってAAVが組織培養での哺乳動物細胞中への遺伝子送達に有用になるからである（Muzyczka, 1992）。AAVは、感染性について広い宿主範囲を有するが（Tratschin et al., 1984；Laughlin et al, 1986；Lebkowski et al, 1988；McLaughlin et al, 1988）、このことはAAVが本発明での使用に適用可能であることを意味する。rAAVベクターの生成および使用に関する詳細は、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,139,941号および同第4,797,368号に記載されている。

典型的に、組み換えAAV（rAAV）ウイルスは、2つのAAV末端反復によって隣接される関心対象の遺伝子を含有するプラスミド（それぞれ参照により本明細書に組み入れられるMcLaughlin et al, 1988；Samulski et al, 1989）と、野生型AAVコード配列を含有し、末端反復を有しない発現プラスミド、例えばpIM45（McCarty et al., 1991；参照により本明細書に組み入れられる）とを共トランスフェクトすることによって製造される。当業者であれば、AAVウイルスを使用してベクターを生成するために利用可能な技術に精通しているであろう。

単純ヘルペスウイルス（HSV）は、ニューロン細胞へのその向性の理由から神経系障害の処置にかなりの関心を呼び起こしたが、その広い宿主範囲からしてこのベクターを他の組織のためにも活用することができる。HSVを魅力的なベクターにしている別の要因は、ゲノムのサイズおよび編成である。HSVは大型であるので、複数の遺伝子または発現カセットの組み込みが、他のより小さなウイルス系よりも問題が少ない。加えて、様々な性能（時間、強度など）を有する異なるウイルス制御配列を入手できることは、発現を制御する可能性を他の系よりもより大きくする。ウイルスが有するスプライスされたメッセージが比較的少なく、遺伝子操作がさらに容易になることも利点である。

HSVはまた、操作が比較的容易であり、高力価まで増殖することができる。したがって、送達は十分なMOIを達成するために必要な体積の点、および繰り返し投薬の必要性低下の両方で問題がより少ない。遺伝子療法ベクターとしてのHSVの総説については、Glorioso et al. (1995)を参照されたい。当業者であれば、ベクターとしてのHSVの使用のための周知の技術に精通しているであろう。

ワクシニアウイルスベクターは、その構築の容易さ、得られる発現の比較的高いレベル、広い宿主範囲および高いDNA保有能から広く使用されている。ワクシニアは、顕著な「A-T」選好性を示す約186kbの直鎖状二本鎖DNAゲノムを含有する。約10.5kbの末端逆位配列がゲノムに隣接する。

他のウイルスベクターが本発明における構築物として採用される場合がある。例えば、ポックスウイルスなどのウイルス由来のベクターが採用される場合がある。ベネズエラウマ脳炎（VEE）ウイルスの分子クローニングされた株が、異種ウイルスタンパク質の発現のための複製可能なワクチンベクターとして遺伝的に洗練されている（Davis et al., 1996）。研究によって、VEE感染が強力なCTL応答を刺激することが実証されており、VEEが免疫処置のために極めて有用なベクターであり得ると示唆されている（Caley et al., 1997）。VEEウイルスが樹状細胞の標的化に有用であり得ることが本発明において考えられている。

ポリヌクレオチドは、特異的結合リガンドを発現するように操作されたウイルスベクター内に収容される場合がある。したがって、ウイルス粒子は、標的細胞の同族受容体に特異的に結合し、細胞に内容物を送達する。レトロウイルスベクターの特異的標的化を可能にするように設計された新規なアプローチが、ウイルスエンベロープへのラクトース残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学修飾に基づき開発された。この修飾は、シアロ糖タンパク質受容体を介する肝細胞の特異的感染を許すことができる。

レトロウイルスエンベロープタンパク質および特異的細胞受容体に対するビオチン化抗体が使用された、組み換えレトロウイルスの標的化への別のアプローチが計画された。ストレプトアビジンを使用することによってビオチン成分を介してこれらの抗体を結合させた（Roux et al., 1989）。主要組織適合遺伝子複合体クラスIおよびクラスII抗原に対する抗体を使用して、それらは、それらの表面抗原を有した多種多様なヒト細胞のエコトロピックウイルスによるインビトロ感染を示した（Roux et al., 1989）。

B. 非ウイルス性遺伝子移入
細胞内への核酸の移入のためのいくつかの非ウイルス方法もまた、本発明のある特定の局面により考えられている。これらは、リン酸カルシウム沈殿（Graham and Van Der Eb, 1973；Chen and Okayama, 1987；Rippe et al, 1990）、DEAE-デキストラン（Gopal, 1985）、エレクトロポレーション（Tur-Kaspa et al, 1986；Potter et al, 1984）、ヌクレオフェクション（Trompeter et al, 2003）、直接微量注入（Harland and Weintraub, 1985）、DNA負荷リポソーム（Nicolau and Sene, 1982；Fraley et al, 1979）およびリポフェクタミン-DNA複合体、ポリアミノ酸、細胞超音波処理（Fechheimer et al, 1987）、高速マイクロ発射体を使用する遺伝子銃（Yang et al, 1990）、ポリカチオン（Boussif et al, 1995）および受容体媒介トランスフェクション（Wu and Wu, 1987；Wu and Wu, 1988）を含む。これらの技術のいくつかは、インビボまたはエクスビボ使用のためにうまく適合され得る。当業者ならば、非ウイルスベクターの使用に関する技術に精通しているであろうし、本明細書において開示されたもの以外の種類の非ウイルスベクターが本発明によって考えられていることを理解しているであろう。本発明のさらなる態様では、発現カセットがリポソームまたは脂質製剤中に内封される場合がある。リポソームは、リン脂質二重膜および内部の水性媒質によって特徴付けられる小胞構造である。マルチラメラリポソームは、水性媒質によって分離された複数の脂質層を有する。リポフェクタミン（Gibco BRL）と複合体を形成した遺伝子構築物もまた考えられている。当業者ならば、リポソームおよび脂質製剤を利用する技術に精通しているであろう。

C. 脂質ベースナノベシクル
いくつかの態様では、脂質ベースナノベシクル、例えばリポソーム、エクソソーム、脂質調製物、脂質ベース小胞（例えば、DOTAP：コレステロール小胞）が本開示の方法に採用される。いくつかの態様では、TERTポリペプチドまたはTERTポリペプチドをコードする核酸を含むナノベシクルが対象に投与される。脂質ベースナノベシクルは、正に荷電している、負に荷電しているまたは中性である場合がある。

1. リポソーム
「リポソーム」は、囲い込まれた脂質二重層または凝集物の生成によって形成される多種多様なシングルラメラおよびマルチラメラ脂質ビヒクルを包含する一般名称である。リポソームは、一般的にリン脂質を含む二重膜および一般的に水性組成物を含む内部の媒質を有する小胞構造を有すると特徴付けられる場合がある。本明細書に提供されるリポソームは、ユニラメラリポソーム、マルチラメラリポソーム、および多重小胞リポソーム（multivesicular liposome）を含む。本明細書に提供されるリポソームは、正に荷電している、負に荷電しているまたは中性荷電である場合がある。ある特定の態様では、リポソームは中性荷電である。

マルチラメラリポソームは、水性媒質によって分離された多重脂質膜を有する。そのようなリポソームは、リン脂質を含む脂質が過剰の水溶液中に懸濁されている場合に自然に形成する。脂質成分は、閉じた構造を形成する前に自己再編成を受け、脂質二重層の間に水および溶解した溶質を封入する。脂溶性分子または親油性領域を有する分子もまた脂質二重層に溶解するまたは会合する場合がある。

いくつかの態様では、ポリペプチド、核酸、または小分子薬は、例えば、リポソームの水性内部に封入される、リポソームの脂質二重層内に散在する、リポソームおよびポリペプチド／核酸の両方に結合する連結分子を介してリポソームに付属する、リポソーム中に封入される、リポソームと複合体を形成するなどであり得る。

本態様により使用されるリポソームを、当業者に公知であろう種々の方法によって製造することができる。例えば、リン脂質、例えば中性リン脂質ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）は、tert-ブタノール中に溶解される。次いで、脂質は、ポリペプチド、核酸、および／または他の成分と混合される。Tween 20が組成物の重量の約5％であるようにTween 20が脂質混合物に添加される。tert-ブタノールの体積が少なくとも95％であるように過剰のtert-ブタノールがこの混合物に添加される。混合物がボルテックス撹拌され、ドライアイス／アセトン浴中で凍結され、一晩凍結乾燥される。凍結乾燥された調製物が-20°で保存され、それを3か月までに使用することができる。必要により、凍結乾燥されたリポソームは0.9％食塩水中に再構成される。

あるいはリポソームを、例えばコップ、洋ナシ型フラスコといった容器に入った溶媒中に脂質を混合することによって調製することができる。容器は、リポソームの予想される懸濁液の体積よりも10倍大きい体積を有するべきである。ロータリーエバポレーターを使用して、溶媒は陰圧下、約40℃で除去される。溶媒は通常、リポソームの所望の体積に応じて約5分～2時間以内に除去される。組成物を、真空デシケーター中でさらに乾燥することができる。乾燥された脂質は、時間と共に変質する傾向があるので、一般的に約1週間後に捨てられる。

乾燥された脂質を、脂質薄膜のすべてが再懸濁されるまで振盪することによって、発熱物質を含まない無菌水中に約25～50mMリン脂質で水和することができる。次いで、水性リポソームをアリコートに分け、それぞれをバイアルに入れ、凍結乾燥し、真空下で密封することができる。

上記のように調製された乾燥脂質または凍結乾燥リポソームは、脱水され、タンパク質またはペプチドの溶液中で再構成され、適した溶媒、例えば、DPBSと共に適切な濃度に希釈される場合がある。次いで、この混合物はボルテックスミキサーで激しく撹拌される。非限定的にホルモン、薬物、核酸構築物などを含む作用物質などの、封入されていない追加的な材料が29,000×gの遠心分離によって除去され、リポソームのペレットが洗浄される。洗浄されたリポソームは、適切な総リン脂質濃度、例えば約50～200mMで再懸濁される。封入された追加的な物質または活性作用物質の量を標準的な方法により決定することができる。リポソーム調製物中に封入された追加的な材料または活性作用物質の量の決定後、リポソームは適切な濃度に希釈され、使用まで4℃で保存される場合がある。リポソームを含む薬学的組成物は、通常、無菌の薬学的に許容される担体または希釈剤、例えば水または食塩水を含むであろう。

本開示の態様で有用であり得る追加的なリポソームは、例えば、そのすべてがディスクレーマーなしでそれらの全体で参照により本明細書に組み入れられるWO02/100435A1、米国特許第5,962,016号、米国特許出願公開第2004/0208921号、WO03/015757A1、WO04029213A2、米国特許第5,030,453号、および米国特許第6,680,068号に記載されるような陽イオン性リポソームを含む。

そのようなリポソームの調製にあたり、本明細書に記載される、または当業者に公知であろう任意のプロトコールが使用される場合がある。リポソームを調製する追加的な非限定的な例は、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,728,578号、同第4,728,575号、同第4,737,323号、同第4,533,254号、同第4,162,282号、同第4,310,505号、および同第4,921,706号；国際出願PCT/US85/01161およびPCT/US89/05040に記載されている。

ある特定の態様では、脂質ベースナノベシクルは中性リポソーム（例えば、DOPCリポソーム）である。本明細書に使用される「中性リポソーム」または「非荷電リポソーム」は、本質的に中性の実効電荷（実質的に非荷電）をもたらす1つまたは複数の脂質成分を有するリポソームとして定義される。「本質的に中性」または「本質的に非荷電」によって、所与の集団（例えばリポソームの集団）内で別の成分の反対電荷によって解消されない電荷を含む脂質成分は、たとえあったとしてもほとんどない（すなわち、成分の10％未満、より好ましくは5％未満、もっとも好ましくは1％未満が解消されない電荷を含む）ことが意味される。ある特定の態様では、中性リポソームは、生理学的条件下で（すなわち、約pH7で）それ自体中性の、主として脂質および／またはリン脂質を含む場合がある。

本態様のリポソームおよび／または脂質ベースナノベシクルは、リン脂質を含む場合がある。ある特定の態様では、リポソームの創出に1種類のリン脂質が使用される場合がある（例えば、中性リン脂質、例えばDOPCが、中性リポソームの生成に使用される場合がある）。他の態様では、1種類よりも多いリン脂質が、リポソームを創出するために使用される場合がある。リン脂質は、天然または合成起源の場合がある。リン脂質は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、およびホスファチジルエタノールアミンを含み；ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンは生理学的条件下で（すなわち約pH7で）非荷電であるので、これらの化合物は、中性リポソームを生成するために特に有用であり得る。ある特定の態様では、リン脂質DOPCは、非荷電リポソームを産生するために使用される。ある特定の態様では、リン脂質ではない脂質（例えばコレステロール）が使用される場合がある。

リン脂質は、グリセロリン脂質およびある特定のスフィンゴ脂質を含む。リン脂質は、ジオレオイルホスファチジルコリン（「DOPC」）、卵ホスファチジルコリン（「EPC」）、ジラウリロイルホスファチジルコリン（「DLPC」）、ジミリストイルホスファチジルコリン（「DMPC」）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（「DPPC」）、ジステアロイルホスファチジルコリン（「DSPC」）、1-ミリストイル-2-パルミトイルホスファチジルコリン（「MPPC」）、1-パルミトイル-2-ミリストイルホスファチジルコリン（「PMPC」）、1-パルミトイル-2-ステアロイルホスファチジルコリン（「PSPC」）、1-ステアロイル-2-パルミトイルホスファチジルコリン（「SPPC」）、ジラウリロイルホスファチジルグリセロール（「DLPG」）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（「DMPG」）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（「DPPG」）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（「DSPG」）、ジステアロイルスフィンゴミエリン（「DSSP」）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（「DSPE」）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（「DOPG」）、ジミリストイルホスファチジン酸（「DMPA」）、ジパルミトイルホスファチジン酸（「DPPA」）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（「DMPE」）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（「DPPE」）、ジミリストイルホスファチジルセリン（「DMPS」）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（「DPPS」）、脳ホスファチジルセリン（「BPS」）、脳スフィンゴミエリン（「BSP」）、ジパルミトイルスフィンゴミエリン（「DPSP」）、ジミリスチルホスファチジルコリン（「DMPC」）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（「DAPC」）、1,2-ジアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（「DBPC」）、1,2-ジエイコセノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（「DEPC」）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（「DOPE」）、パルミトイルオレオイル（palmitoyloeoyl）ホスファチジルコリン（「POPC」）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（「POPE」）、リソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールアミン、およびジリノレオイルホスファチジルコリンを含むが、それに限定されるわけではない。

2. エクソソーム
本明細書に使用される「ナノベシクル」および「エクソソーム」という用語は、約10nm～約1000nm、より典型的には30nm～1000nm、もっとも典型的には約50nm～750nmの直径（または粒子が球状でない場合は最大径）を有する膜状粒子であって、エクソソームの膜の少なくとも一部が細胞から直接得られる膜状粒子を指す。もっとも一般的には、エクソソームは、ドナー細胞のサイズの最大5％であるサイズ（平均直径）を有するであろう。したがって、特に考えられるエクソソームは、細胞から脱落しているものを含む。

エクソソームは、任意の適切な試料種類、例えば体液中に検出されるまたはそれから単離される場合がある。本明細書に使用される「単離された」という用語は、その自然環境からの分離を指し、少なくとも部分精製を含むことが意味され、実質的な精製を含み得る。本明細書に使用される「試料」という用語は、本発明によって提供される方法に適した任意の試料を指す。試料は、検出または単離に適したエクソソームを含む任意の試料であり得る。試料の起源は、血液、骨髄、胸水、腹水、脳脊髄液、尿、唾液、羊水、悪性腹水、気管支肺胞洗浄液、滑液、母乳、汗、涙液、関節液、および気管支洗浄液を含む。一局面では、試料は、例えば、全血またはその任意の画分もしくは成分を含む血液試料である。本発明で使用するために適した血液試料は、血液細胞またはその成分、例えば静脈、動脈、末梢、組織、臍帯などを含む任意の公知の起源から抽出される場合がある。例えば、試料は周知で日常的な臨床方法（例えば、全血を抜き取って処理するための手順）を用いて入手および加工される場合がある。一局面では、例示的な試料は、疾患を有する対象から抜き取られた末梢血であり得る。

エクソソームは、新鮮収集された試料、または凍結保存もしくは冷蔵されていた試料から単離される場合がある。いくつかの態様では、エクソソームは、細胞培養培地から単離される場合がある。必要でないものの、試料から任意のデブリを除去するために、液体試料が体積排除ポリマーを用いた沈殿の前に透明化されるならば、より高い純度のエクソソームが得られる場合がある。透明化の方法は、遠心分離、超遠心分離、濾過、または限外濾過を含む。もっとも典型的には、エクソソームを当技術分野において周知の数多くの方法によって単離することができる。好ましい一方法は、体液または細胞培養上清からの分画遠心分離である。エクソソームの単離のための例示的な方法は、（Losche et al., 2004；Mesri and Altieri, 1998；Morel et al., 2004）に記載されている。あるいは、エクソソームはまた、（Combes et al., 1997）に記載されるようにフローサイトメトリーを介して単離される場合がある。

エクソソームの単離のための受け入れられた一プロトコールは、比較的低密度のエクソソームを浮かべるためのスクロース密度勾配またはスクロースクッションとしばしば組み合わされた超遠心分離を含む。連続分画遠心分離によるエクソソームの単離は、他の微小胞または高分子複合体とサイズ分布が重複する可能性によって複雑にされている。さらに、遠心分離は、小胞をそのサイズに基づき分離するための不十分な手段を提供し得る。しかし、連続遠心分離は、スクロース勾配超遠心分離と組み合わされた場合、エクソソームの高い濃縮を提供する場合がある。

超遠心分離経路の代替を用いる、エクソソームのサイズに基づく単離は、別の選択肢である。超遠心分離よりも時間がかからず、特別な設備の使用を必要としない限外濾過の手順を用いるエクソソームの精製の成功が報告されている。同様に、細胞、血小板、および細胞デブリの1つのマイクロフィルター上での除去ならびに液体を流すために陽圧を用いる第2のマイクロフィルター上での30nmよりも大きい小胞の捕捉を可能にする市販のキット（EXOMIR（商標） Bioo Scientific）が入手可能である。しかし、この工程のために、エクソソームは回収されず、そのRNA内容物が第2のマイクロフィルター上に捉えた物質から直接抽出され、次いでそれをPCR分析のために使用することができる。HPLCベースのプロトコールは、高純度エクソソームを得ることを潜在的に可能にすることもできるが、これらの工程は、専用の設備を必要とし、スケールアップが困難である。重大な問題は、血液および細胞培養培地の両方がエクソソームと同じサイズ範囲に多数のナノ粒子（一部は非小胞性）を含有することである。例えば、一部のmiRNAはエクソソームよりもむしろ細胞外タンパク質複合体内に含有される場合がある；しかし、「エクソソーム外」タンパク質の任意の混入の可能性を除去するためにプロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼK）処理を行うことができる。

a. 細胞培養物からエクソソームを収集するための例示的なプロトコール
1日目に、T225フラスコ中の10％ FBSを含有する培地中に、翌日に細胞が約70％集密になるために十分な細胞（例えば、約500万個細胞）を播種する。2日目に、細胞上の培地を吸引し、細胞をPBSで2回洗浄し、次いで基礎培地（すなわち、PenStrepもFBSもなし）25～30mLを細胞に添加する。細胞を24～48時間インキュベートする。48時間のインキュベーションが好ましいが、一部の細胞株は無血清培地に対する感受性がより高いので、インキュベーション時間を24時間に減らすべきである。FBSが、NanoSightの結果を大きく歪めるであろうエクソソームを含有することに留意されたい。

3/4日目に、培地を収集し、室温、800×gで5分間遠心分離して、死細胞および大きなデブリをペレット化する。上清を新しいコニカルチューブに移し、再度、培地を2,000×gで10分間遠心分離して、他の大きなデブリおよび大きな小胞を除去する。培地を0.2μmフィルターに通し、次いで35mL／チューブを用いて超遠心分離チューブ（例えば25×89mm Beckman Ultra-Clear）中に小分けする。チューブ1本あたりの培地体積が35mL未満ならば、チューブの残りにPBSを満たして35mLに到達させる。SW 32 Tiロータ（kファクター 266.7、最大RCF 133,907）を使用して培地を28,000rpm、4℃で2～4時間超遠心分離する。残りの液体がおよそ1インチになるまで上清を慎重に吸引する。チューブを傾け、残りの培地をアスピレーターのピペットにゆっくりと入らせる。所望であれば、エクソソームペレットをPBS中に再懸濁し、超遠心分離を28,000rpmで1～2時間繰り返してエクソソーム集団をさらに精製することができる。

最後に、エクソソームペレットをPBS 210μL中に再懸濁する。各試料について複数の超遠心分離チューブがあるならば、同じPBS 210μLを使用して各エクソソームペレットを連続的に再懸濁する。各試料について、10μLを採取し、H2O 990μLに添加してナノ粒子トラッキング分析に使用する。残りのエクソソーム含有懸濁液200μLを下流の工程のために使用するか、または-80℃で直ちに保存する。

b. 血清試料からエクソソームを抽出するための例示的なプロトコール
最初に、血清試料を氷上で解凍させる。次いで、無細胞血清試料250μLをPBS 11mL中に希釈する；孔径0.2μmのフィルターを通して濾過する。希釈した試料を150,000×g、4℃で一晩超遠心分離する。翌日、上清を慎重に捨て、エクソソームペレットをPBS 11mL中で洗浄する。第2ラウンドの超遠心分離を150,000×g、4℃で2時間行う。最後に、上清を慎重に捨て、分析のためにエクソソームペレットをPBS 100μL中に再懸濁する。

c. エクソソームおよびリポソームのエレクトロポレーションのための例示的なプロトコール
1×108個のエクソソーム（NanoSight分析により測定）または100nmリポソーム（例えば、Encapsula Nano Sciencesから購入）および1μg siRNA（Qiagen）またはshRNAをエレクトロポレーション緩衝液（1.15mM リン酸カリウム、pH7.2、25mM 塩化カリウム、21％ Optiprep）400μL中に混合する。4mmキュベットを使用してエクソソームまたはリポソームをエレクトロポレーションする（例えば、Alvarez-Erviti et al., 2011；El-Andaloussi et al., 2012を参照されたい）。エレクトロポレーション後、エクソソームまたはリポソームをプロテアーゼ不含RNアーゼで処理し、続いて10倍濃度のRNアーゼ阻害剤を添加する。最後に、上記のような超遠心分離方法下で、エクソソームまたはリポソームをPBSで洗浄する。

d. 治療用エクソソームの投与
本開示のある特定の局面は、TERTポリペプチドまたは核酸などの治療用作用物質を発現するまたはそれを含むエクソソームで患者を処置することを提供する。エクソソームは、mRNAの転写およびタンパク質の翻訳を完了するために必要な機構を含むことが公知であるので（その全体で参照により本明細書に組み入れられるPCT/US2014/068630参照）、治療用タンパク質をコードするmRNAまたはDNA核酸がエクソソーム中にトランスフェクトされる場合がある。あるいは、治療用タンパク質自体がエクソソーム中にエレクトロポレーションされる、またはリポソーム中に直接組み込まれる場合がある。いくつかの態様では、エクソソームはさらに、本明細書に記載される治療用作用物質などの追加的な治療用作用物質を含む。疾患の処置のための送達システムとして操作されたリポソームおよびエクソソームを使用する方法および薬物が本明細書において提供される。

3. CD47発現ナノベシクル
いくつかの態様では、その表面にCD47を含む脂質ベースナノベシクルを含む薬学的組成物が提供され、その際、脂質ベースナノベシクルは、TERTポリペプチドまたはTERTポリペプチドをコードする核酸を含む。

いくつかの局面では、脂質ベースナノ粒子はリポソームまたはエクソソームである。ある特定の局面では、エクソソームは、CD47を過剰発現している細胞から単離される。いくつかの局面では、エクソソームは、処置を必要とする患者から単離される。いくつかの局面では、エクソソームは線維芽細胞から単離される。いくつかの局面では、リポソームはシングルラメラリポソームである。いくつかの局面では、リポソームはマルチラメラリポソームである。

いくつかの局面では、組成物は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、または腹腔内注射などの非経口投与のために製剤化される。

いくつかの局面では、組成物は、抗菌作用物質を含む。抗菌作用物質は、ベンザルコニウム塩化物、ベンゼトニウム塩化物、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド（centrimide）、セチルピリジニウム塩化物、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン（exetidine）、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール（phenylethl alcohol）、硝酸フェニル水銀（phenlymercuric nitrate）、プロピレングリコール、またはチメロサールであり得る。

いくつかの局面では、単一脂質ベースナノベシクルは、TERTポリペプチドまたは核酸および本明細書に記載される1つまたは複数の追加的な治療用作用物質などの1種よりも多い作用物質を含む。

一態様では、TERT活性化療法を患者に投与するための方法であって、TERT活性化療法治療剤がエクソソームを含む方法が提供される。いくつかの局面では、本開示は、TERTポリペプチドをコードする核酸（例えばDNAまたはRNA）をエクソソームにトランスフェクトすること、トランスフェクトされたエクソソームを、エクソソーム内でTERTの発現を可能にする条件下でインキュベートすること、およびインキュベートされたエクソソームを患者に提供し、それにより、患者にTERT活性化療法を投与することに関する。

III. 治療用組成物の投与
本明細書に提供される治療法は、例えば第1のTERT活性化療法および第2の治療法などの治療用作用物質の組み合わせの投与を含む場合がある。治療法は、当技術分野において公知の任意の適切な方法で投与される場合がある。例えば、第1および第2の処置は、順次に（異なる時間に）または同時に（同じ時間に）投与される場合がある。いくつかの態様では、第1および第2の治療法は、別々の組成物として投与される。いくつかの態様では、第1および第2の治療法は、同じ組成物として投与される。いくつかの態様では、本開示の方法および組成物は、追加の療法の投与を含む。いくつかの態様では、追加の療法は、ドネペジル、ガランタミン、またはリバスチグミンなどのコリンエステラーゼ阻害剤を含む。いくつかの態様では、追加の療法はメマンチンを含む。

本開示の態様は、治療用組成物を含む組成物および方法に関する。異なる治療法が1つの組成物として、または1つよりも多い組成物、例えば2つの組成物、3つの組成物、もしくは4つの組成物として投与される場合がある。作用物質の様々な組み合わせが採用される場合があり、例えば、第1の処置が「A」であり、第2の処置が「B」である、以下である。

本開示の治療用作用物質は、同じ投与経路または異なる投与経路により投与される場合がある。いくつかの態様では、治療法は、静脈内、筋肉内、皮下、局所、経口、経皮、腹腔内、眼窩内に、移植により、吸入により、髄腔内、脳室内、または鼻腔内に投与される。いくつかの態様では、抗生物質が静脈内、筋肉内、皮下、局所、経口、経皮、腹腔内、眼窩内に、移植により、吸入により、髄腔内、脳室内、または鼻腔内に投与される。適切な投薬量は、処置されるべき疾患の種類、疾患の重症度および経過、個体の臨床状態、個体の臨床歴および処置に対する応答、ならびに担当医師の判断に基づき決定される場合がある。

処置は、様々な「単位用量」を含む場合がある。単位用量は、所定量の治療用組成物を含有すると定義される。投与されるべき量ならびに特定の経路および製剤は、臨床分野の専門家の決定技能の範囲内である。しかし、単回注射として投与される必要のない単位用量は、設定期間にわたる連続注入を含む場合がある。いくつかの態様では、単位用量は、単回投与可能な用量を含む。

処置回数および単位用量の両方に基づく投与量は、所望の処置効果に依存する。有効用量は、特定の効果を達成するために必要な量を指すと理解される。ある特定の態様における実施では、10mg/kg～200mg/kgの範囲の用量がこれらの作用物質の防御能に影響することができると考えられている。したがって、用量は約0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、および200、300、400、500、1000μg/kg、約0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、および200、300、400、500、1000mg/kg、約0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、および200、300、400、500、1000μg/日、または約0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、および200、300、400、500、1000mg/日またはその中から導き出せる任意の範囲の用量を含むことが考えられている。さらに、そのような用量を1日に複数回、および／または複数の日、週、もしくは月に投与することができる。

ある特定の態様では、薬学的組成物の有効用量は、約1μM～150μMの血中レベルを提供することができるものである。別の態様では、有効用量は、約4μM～100μM；または約1μM～100μM；または約1μM～50μM；または約1μM～40μM；または約1μM～30μM；または約1μM～20μM；または約1μM～10μM；または約10μM～150μM；または約10μM～100μM；または約10μM～50μM；または約25μM～150μM；または約25μM～100μM；または約25μM～50μM；または約50μM～150μM；または約50μM～100μM（またはその中から導き出せる任意の範囲）の血中レベルを提供する。他の態様では、用量は、対象に投与されている治療用作用物質の結果として生じる、作用物質の以下の血中レベルを提供することができる：約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100μMもしくはその中から導き出せる任意の範囲、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100μMもしくはその中から導き出せる任意の範囲、または多くとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100μMもしくはその中から導き出せる任意の範囲。ある特定の態様では、対象に投与される治療用作用物質は、代謝された治療剤に体内で代謝され、その場合、血中レベルは、その作用物質の量を指す場合がある。あるいは、本明細書に述べられる血中レベルは、治療用作用物質が対象によって代謝されない範囲で、代謝されていない治療用作用物質を指す場合がある。

治療用組成物の正確な量はまた、医師の判断に依存し、各個体に独特である。用量に影響する要因は、患者の身体状態および臨床状態、投与経路、処置の意図される目標（症状の緩和に対する治癒）ならびに特定の治療物質または対象が受けている場合がある他の治療法の効力、安定性および毒性を含む。

μg/kgまたはmg/kg体重の投薬単位を、μg/mlまたはmM（血中レベル）、例えば4μM～100μMの同等の濃度単位に換算および表現できることは、当業者によって理解され、気付かれるであろう。取り込みは、種および器官／組織依存性であることも理解される。取り込みおよび濃度測定に関して行うべき適用可能な換算係数および生理学的仮定は周知であり、当業者が1つの濃度測定を別のものに換算し、本明細書に記載される用量、有効性および結果に関する合理的な比較および結論ができるようにするであろう。

IV. 疾患の処置
本開示の方法は、ある特定の加齢性疾患、状態、または障害を治療または予防するために使用される場合がある。加齢性疾患、状態、または障害の非限定的な例は、インスリン抵抗性（すなわち、耐糖能異常）、良性前立腺肥大、難聴、骨粗鬆症、加齢性黄斑変性、神経変性疾患、皮膚病、皮膚老化（aging skin）、または癌を含む。神経変性疾患の非限定的な例は、アルツハイマー病；てんかん；ハンチントン病；パーキンソン病；脳卒中；脊髄損傷；外傷性脳損傷；レビー小体認知症；ピック病；ニーマン・ピック（Niewmann-Pick）病；アミロイド血管症；脳アミロイド血管症；全身性アミロイドーシス；アミロイドーシスを伴う遺伝性大脳出血－オランダ型；封入体筋炎；軽度認知障害；ダウン症候群；および筋萎縮性側索硬化症（ALS）、多発性硬化症、ならびにデュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型（ランドジー・デジェリン型）筋ジストロフィー、および肢帯型筋ジストロフィー（LGMD）を含む筋ジストロフィーを含む神経筋障害を含む。脳卒中、頭部外傷、脊椎損傷、または脳、末梢神経、中枢神経、もしくは筋神経系への他の傷害による神経変性疾患も含まれる。

本明細書に示される方法のある特定の態様は、対象における疾患または健康関連状態を予防する方法に関する。予防戦略は、今日の医学において極めて重要である。

いくつかの態様では、処置は、早老または早老に関連する疾患のためのものである。早期老化障害の例は、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群（HGPS）、ネスター・ギラーモ早老症候群、ウェルナー症候群、コケイン症候群、ブルーム症候群、色素性乾皮症、毛細血管拡張性運動失調症、裂毛症、先天性角化異常症、および多彩異数性モザイク症候群を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載される早老疾患、早老関連疾患、加齢性疾患、神経変性疾患、または障害のうちの1つまたは複数は、本開示の方法から除外される。

V. キット
ある特定の局面は、本明細書に記載される組成物または本明細書に記載される方法を実現するための組成物を含有するキットに関する。

様々な局面では、治療用作用物質ならびに／または他の治療用作用物質および送達剤を含有するキットが想定されている。いくつかの態様では、本明細書に記載される治療法を調製および／または投与するためのキットが提供される場合がある。キットは、薬学的組成物、治療用作用物質ならびに／または他の治療用作用物質および送達剤のいずれかを含有する1つまたは複数の密封されたバイアルを含む場合がある。いくつかの態様では、脂質が1つのバイアル中にあり、治療用作用物質が別のバイアル中にある。キットは、例えば、少なくとも1つのTERT活性化療法、1つまたは複数の脂質成分のみならず、本明細書に記載される成分を調製、製剤化、および／もしくは投与するための、または方法の1つもしくは複数の段階を行うための試薬を含む場合がある。いくつかの態様では、キットはまた、キットの成分と反応しない容器、例えばエッペンドルフチューブ、アッセイプレート、シリンジ、ボトル、またはチューブである適切な容器手段を含む場合がある。容器は、プラスチックまたはガラスなどの滅菌可能な材料からできている場合がある。

キットはさらに、本明細書に示される方法の手順段階の概要を述べる説明書を含む場合があり、本明細書に記載されるものと実質的に同じ手順に従う、または当業者に公知である。説明書の情報は、コンピューターを使用して実行された場合に治療用作用物質の薬学的有効量を送達する現実的または仮想的な手順の表示を引き起こす、機械可読な説明書を含有するコンピューター可読媒体中にあり得る。

いくつかの態様では、キットは、TERTまたは関連分子の発現を評価するために提供される場合がある。そのようなキットを、容易に入手可能な材料および試薬から調製することができる。例えば、そのようなキットは、以下の材料：酵素、反応チューブ、緩衝剤、洗剤、プライマーおよびプローブ、核酸増幅、および／またはハイブリダイゼーション剤のうちの任意の1つまたは複数を含むことができる。特定の態様では、これらのキットは、医師が血液、涙液、精液、唾液、尿、組織、血清、便、結腸、直腸、痰、脳脊髄液および細胞溶解物からの上清中の試料を得られるようにする。別の態様では、これらのキットは、RNA抽出、RT-PCR、およびゲル電気泳動を行うための必要な装置を含む。アッセイを行うための説明書もまた、キットに含まれることができる。

キットは、容器、例えばチューブ、ボトル、バイアル、シリンジ、または他の適切な容器手段中に個別にパッケージされるまたは入れられる場合がある成分を含む場合がある。成分は、プローブ、プライマー、抗体、アレイ、陰性および／または陽性対照を含む場合がある。個別の成分はまた、濃縮された量でキット中に提供される場合がある；いくつかの態様では、成分は、他の成分と共に溶液中にある場合と同じ濃度で個別に提供される。成分の濃度は、1×、2×、5×、10×、または20×またはそれ以上として提供される場合がある。

キットはさらに、試料中のTERTを標識するための試薬を含むことができる。キットはまた、アミン修飾ヌクレオチド、ポリ（A）ポリメラーゼ、およびポリ（A）ポリメラーゼ緩衝液の少なくとも1つを含む標識試薬を含む場合がある。標識試薬は、アミン反応色素または当技術分野において公知の任意の色素を含むことができる。

キットの成分は、水性媒質中に、または凍結乾燥形態としてのいずれかでパッケージされる場合がある。キットの容器手段は、一般的に、中に成分が入れられ、好ましくは適切に小分けされている場合がある、少なくとも1つのバイアル、試験チューブ、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器手段を含むであろう。キット中に1つよりも多い成分がある場合（標識試薬および標識は一緒にパッケージされる場合がある）、キットはまた、一般的に、その中に追加的な成分が別々に入れられる場合がある第2、第3またはその他の追加的な容器を含有するであろう。しかし、成分の様々な組み合わせがバイアル中に含まれる場合がある。キットはまた、核酸、抗体または任意の他の試薬容器を市販のために厳密に閉じ込めて含有するための手段を含む場合がある。そのような容器は、中に所望のバイアルが保持される射出成形または中空成形されたプラスチック容器を含む場合がある。

キットの成分が1つおよび／または複数の液体溶液中に提供される場合、液体溶液は水溶液であり、無菌水溶液が特に好ましい。

あるいは、キットの成分は乾燥粉末として提供される場合がある。試薬および／または成分が乾燥粉末として提供される場合、粉末を、適切な溶媒の添加によって再構成することができる。溶媒はまた、別の容器手段内に提供され得ることも想定されている。いくつかの態様では、標識色素は乾燥粉末として提供される。ある特定の局面では、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、900、1000μgまたは少なくとももしくは多くともそれらの量の乾燥粉末がキット中に提供されることが考えられている。次いで、色素はDMSOなどの任意の適切な溶媒中に再懸濁される場合がある。

容器手段は、一般的に、中に核酸製剤が入れられる、好ましくは適切に分配された少なくとも1つのバイアル、試験チューブ、フラスコ、ボトル、シリンジおよび／または他の容器手段を含むであろう。キットはまた、無菌の薬学的に許容される緩衝液および／または他の希釈剤を含有するための第2の容器手段を含む場合がある。

キットは、例えば、中に所望のバイアルが保持される射出成形および／または中空成形されたプラスチック容器などの、市販のための厳密に閉じ込められたバイアルを含有するための手段を含む場合がある。

キットはまた、キットの成分を採用するためのみならず、キット中に含まれない任意の他の試薬の使用のための説明書を含む場合がある。説明書は、実現されることができるバリエーションを含む場合がある。

VI. 実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために含まれている。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施にうまく機能することが本発明者らによって発見された技術を表し、したがって、その実施にとって好ましい様式を構成すると見なすことができると当業者によって認識されるべきである。しかし当業者は、本開示に照らして、開示された特定の態様に多数の変化を加えても本発明の精神および範囲から逸脱せずに同様または類似の結果を得ることができることを認識するべきである。

実施例1 - 新規な誘導性TERT-ADマウスモデルを使用するアルツハイマーの病態を緩和するための治療戦略としてのテロメラーゼ活性化の同定
本発明者らは、Tert遺伝子発現がADの2つの別個の十分に確立したマウスモデル、すなわちアミロイドおよびタウ病態の両方を発生する3xTg-AD（Oddo et al., Neuron, 2003）、アミロイド病態のみを発生する5xFAD（Oakley et al., J Neurosci, 2006）の、高レベルのAβを示すが、最小の神経変性徴候を示す3か月齢マウスにおける脳組織中で有意にダウンレギュレーションされたことを観察した（図1A、B）。特にニューロン集団に焦点を合わせ、本発明者らは、E18.5～E19.5のADマウス脳から初代皮質および海馬ニューロンを単離および培養し、それまでにシナプスネットワークが成熟する14インビトロ日（DIV）にTert mRNAレベルを調べた。インビボマウス脳組織からの以前の結果と一致して、野生型対照と比べて3xTg-ADおよび5xFAD初代ニューロンの両方でTertの発現がダウンレギュレーションされた（図1C、D）。それに応じて、野生型対照と比べて5xFAD脳から新鮮単離された海馬ニューロンの方がテロメラーゼ活性も低かった（図1E）。より興味深いことに本発明者らは、遺伝子内部（gene body）に主に蓄積され、ニューロン遺伝子での遺伝子抑制に重要であることが公知である、抑制性エピジェネティックマークH3K9me3が5xFADマウスニューロンのTert遺伝子内部およびプロモーター領域に高く占有されることを観察した（図1F）。ヒストンメチル化は可逆的であり、ヒストンデメチラーゼは、ヒストン上のリシン残基からのメチル基の除去を媒介する（Greer and Shi, Nat Rev Genet, 2012）。興味深いことに、本発明者らは、ヒストンメチルトランスフェラーゼおよびデメチラーゼのレベルを調べ、H3K9デメチラーゼKdm1a、Kdm4bおよびKdm4cが野生型対照と比べてマウスAD脳の皮質および海馬ニューロン中で有意にダウンレギュレーションされたことを明らかにした（図1G、H）。可逆的H3K9メチル化がTertの抑制に関与するかどうかを検討するために、本発明者らは、それぞれ非選択的補因子競合阻害剤および選択的基質競合阻害剤であるヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤ケトシンおよびBIX-01294の影響をADマウスモデルにおいて評価した（Greiner et al., Nat Chem Biol, 2005；Kubicek et al., Mol Cell, 2007；Yuan et al., ACS Chem Biol, 2012）。これらの化合物の末梢投与は、中枢神経系におけるH3K9メチル化マークを減少させることが記述されている（Dixit et al., Cell Death Dis, 2014；Chase et al., PLoS One, 2019）。両方の小分子ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤は、ADマウスの皮質および海馬におけるTert遺伝子発現の抑制解除をもたらした（図1I）。このエピジェネティックマークが遺伝子内部に蓄積し、ニューロン遺伝子の転写抑制に重要であることを示す以前の研究と共に（Liu et al., J Neurosci, 2015）、本発明者らは、可溶性AβがADマウスニューロン中のH3K9デメチラーゼまたはメチルトランスフェラーゼの発現変更によりTert遺伝子発現の負の調節を行い得る可能性を確認した。

ADマウスモデルにおけるアミロイド蓄積初期のTert遺伝子の発現抑制を考えると、本発明者らは、ADニューロンにおけるTert遺伝子の発現増加がアミロイドの病態生理を改善または予防することもできるかどうかを試験した。その目的のために、本発明者らは、遍在的に発現されるCAGプロモーターに続く、loxP隣接終止カセットおよびマウスTertオープンリーディングフレーム（R26-CAG-LSL-mTert）からなるCre誘導性Tertノックインアレルを生成した。C57BL/6由来JM8F6胚性幹（ES）細胞のRosa26座位にこの線状化構築物をエレクトロポレーションによって標的化した（図2A）。本発明者らは、以下のプライマーを使用するロングレンジPCR（New England Biolabs）によって陽性クローンを同定した：

。本発明者らは、配列決定および核型分析によって正しい組み換えであることを確認した。最終的に、本発明者らは、2つの独立したクローンを同定し、C57BL/6アルビノ胚盤胞内に注射してキメラマウスを生成し、各クローンからのキメラマウスは、生殖細胞系列伝達（germline transmission）を生じることができた（図2C）。

ADマウスモデルに果たすテロメラーゼ活性化の役割をさらに検討するために、本発明者らは、最初に、この新しいCre誘導性Tertノックインアレルを3xTg-ADまたは5xFADと交配した。続いて、ADマウスモデルのニューロン集団におけるTert発現を選択的に推進するために、本発明者らは、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼII型アルファプロモーターの制御下でニューロン特異的Creアレル（Camk2a-CreERT2）を組み入れた（Madisen et al., Nat Neurosci, 2010）。本発明者らは、タモキシフェン投与後にloxP導入ストッパー配列の欠失をもたらし、各ADマウス株のニューロンにおけるmTert遺伝子発現のスイッチを入れることにつながるR26-CAG-LSL-mTert；3xTg-AD；Camk2a-CreERT2およびR26-CAG-LSL-mTert；5xFAD；Camk2a-CreERT2株の両方の樹立に成功した（図3A）。これらのモデルは、2つの独立した広く研究されているAD（3xTg-ADおよび5xFAD）マウスモデルにおけるTert遺伝子発現の空間的（ニューロン特異的）および時間的（タモキシフェン誘導性）制御を可能にした。

AD病態へのテロメラーゼ活性化の潜在的なインビボ影響を調べるために、本発明者らは、細胞内および細胞傷害性Aβオリゴマーが脳内に蓄積し始める2～3か月齢のR26-CAG-LSL-mTert；3xTg-AD；Camk2a-CreERT2をタモキシフェンで処置し、アミロイド病態に対するTert発現強化の効果を評価した。本発明者らは、Tert活性化R26-CAG-LSL-mTert；3xTg-AD；Camk2a-CreERT2マウスモデルの海馬中のAβ沈着における顕著な低下を明らかにした（図3B、C）。類似のアミロイド負荷の減少がR26-CAG-LSL-mTert；5xFAD；Camk2a-CreERT2モデルで観察された（図3D）。

本発明者らは次に、アミロイド斑の負荷量の減少を推進する分子メカニズムを検討した。ニューロン集団におけるTertの役割の総合的理解を達成するために、本発明者らは、ゲノムワイドRNA配列（RNA-Seq）解析を行った。本発明者らは、ADニューロンにおけるTertの発現をインビボで誘導するためにタモキシフェンを用いてR26-CAG-LSL-mTert；3xTg-AD；Camk2a-CreERT2マウスを調べ、タモキシフェン処置後の成体マウス脳から皮質および海馬ニューロンを別々に単離して、テロメラーゼ活性化の初期転写応答を探索した。このプロファイルによってタモキシフェン処置を受けた本発明者らのモデルの単離されたニューロンにおけるTert遺伝子の発現増加、およびテロメラーゼRNA成分をコードするTerc遺伝子の発現の無変化が確認された（図4A）。コンピューター解析によって、皮質および海馬ADニューロンにおけるTert誘導がシナプスシグナル伝達、シナプス構造または活性の調節、シナプス集合の調節、シナプス集合の正の調節、およびシナプス組織化の調節に関連する複数のシグナル伝達パスウェイの活性化と相関したことが明らかになった（図4B、C）。遺伝子セットエンリッチメント解析（GSEA）によって、シナプスシグナル伝達に関与する遺伝子がTert誘導後に両方のニューロン集団でグローバルにアップレギュレーションされたことも示された（図4D）。本発明者らはまた、ADの生物学に不可欠な遺伝子の発現も調べた。際立ったことに、本発明者らは、App（アミロイドβ前駆タンパク質）およびApoE（アポリポタンパク質E、ADについての強力な遺伝リスク因子）遺伝子の発現がTert活性化ADニューロンにおいて有意に減少したことを見出した（図4E）。同時に、Aβ誘導性細胞毒性を減少させることができるHsp70、分子シャペロンの遺伝子発現は、様々なAD動物モデルにおいてニューロンを効果的に防御することが示されており、Tertの誘導下で顕著に誘導された（図4F）。これらの不偏性トランスクリプトーム解析を利用することによって、本発明者らは、ニューロンにおけるTert誘導がADの病理生物学と強く連鎖し、シナプス形成およびニューロン活性の中心となる有糸分裂後ニューロンにおける大きな遺伝子群の発現にインビボで影響できることを特定した。

シナプスの喪失および機能障害は、ADにおける認知低下と主に相関関係がある（Palop and Mucke, Nat Neurosci, 2010；Hong et al., Science, 2016；Selkoe and Hardy, EMBO Mol Med, 2016）。ニューロンTertの誘導がAD脳におけるシナプスおよびネットワーク機能障害に対する防御につながることができたかどうかを試験するために、本発明者らは、ゴルジ・コックス染色を使用してニューロンの形態をインビボで調べた。本発明者らは、Tertの誘導が対照と比べたTert活性化R26-CAG-LSL-mTert；3xTg-AD；Camk2a-CreERT2マウスの加齢大脳皮質中の増加したニューロン複雑性および樹状突起棘の密度と関連したことを観察した（図5A、B、C）。本発明者らは、ニューロン中の上昇したTert発現がシナプスシグナル伝達カスケードを活性化し、脊椎萎縮およびマウスAD脳のニューロン中のシナプス喪失を減少させると結論する。

これらのマウスの観察と共に、本発明者らはまた、ヒトADに関連するTERT誘導の生物学的影響も評価しようとした。本発明者らは、APP遺伝子のゲノム重複（APP^DP）を保有する家族性AD患者に由来した、十分に樹立された誘導多能性幹細胞（iPSC）を採用した（Israel et al., Nature, 2012）。マウスモデルからの本発明者らの知見と一致して、本発明者らは、APP^DP患者に由来するヒトADニューロンがまた、非認知症対照と比べてTERT遺伝子内部の抑制性エピジェネティックマークH3K9me3の高い占有率を有したことも見出した（図6A）。ヒトTERT発現のためのH3K9メチル化の必要性をさらに探査するために、本発明者らは、次にヒトADニューロンにおけるH3K9メチルトランスフェラーゼの阻害の効果を検討した。マウスのインビボ知見と一致して（図1I）、H3K9メチル化を阻害することはまた、ヒトADニューロンにおけるTERTのmRNAおよびタンパク質の両方の発現も回復させた（図6B、C、D）。

TERT活性化がヒトの状況でのAβ病態にも影響できるかどうかを調べるために、本発明者らは、EF1aプロモーター下でのレンチウイルスヒトTERT構築物を生成し、TERTまたはEGFPを発現しているレンチウイルスベクターに感染した分化ヒトADニューロン中のAβ蓄積に対するTERT誘導の影響を測定した（図7A）。マウスの研究に類似して、本発明者らは、サンドイッチELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）によって測定された場合、ヒトADニューロン中の細胞内Aβ蓄積における有意な用量および時間依存的減少をTERT誘導がもたらしたことを見出した（図7B、C）。ニューロン中のアミロイド負荷のTERT媒介性の低下の基礎となるメカニズムをさらに理解するために、本発明者らは、可能性のある分子標的を同定しようとした。Aβ蓄積を減らすことに加えて、TERT誘導はAPPタンパク質レベルを低下させただけでなく、抗加齢遺伝子（SIRT1）、分子シャペロンおよびストレスセンサー遺伝子（HSP70およびHSF1）、シナプス可塑性関連遺伝子（BDNFおよびPSD-95）、ならびに抗酸化剤遺伝子（NRF2およびHO1）の活性化もトリガーした（図7D、E）。これらの遺伝子は、Aβのプロセシングおよび細胞毒性を減少させることならびに成体脳におけるシナプス可塑性および記憶形成を改善することに重要であることが公知である（Evans et al., J Biol Chem, 2006；Qin et al., J Biol Chem, 2006；Herskovits and Guarente, Neuron, 2014；Lackie et al., Front Neurosci-Switz, 2017）。本発明者らの知見は、TERT活性化がAβ産生を減らすことができるだけでなく、神経保護メディエーターの産生によりADニューロンに神経保護作用を発揮できることを示唆している。

触媒活性がTERT依存性遺伝子調節に転写レベルで必要とされるかをさらに確認するために、本発明者らは、部位特異的変異誘発を用いて712位の残基のアスパラギン酸（Weinrich et al., Nat Genet, 1997）をアラニンで置換することによって触媒不活性（CI）TERT発現構築物を生成した（図8A、B）。本発明者らは、触媒不活性なTERT変異体がこれらの遺伝子のアップレギュレーションにもつながったことを明らかにしたが（図8C）、これは、TERTのトランス活性化の機能が触媒活性に依存しないことを示している。

ADにおけるニューロンTERT活性化の機能的重要性への洞察を得るために、本発明者らは、マウスAD皮質ニューロン、マウスAD海馬ニューロン、およびヒトADニューロンのRNA-seq転写プロファイルおよびパスウェイ解析の交わりを調べた（intersect）。ニューロンTERT活性化ネットワークの統合的種間解析（integrative cross-species analysis）を使用して、本発明者らは、複数のニューロン特異的パスウェイのオーバーラップを同定した（図9A）。TERT活性化下流の結果として、学習過程がもっとも顕著にエンリッチされたパスウェイであり（すべてp＜0.001）、膜の脱分極、グルタメート受容体シグナル伝達、活動電位、およびシナプスシグナル伝達が続いた（図9B）。本発明者らはまた、3つの群からのエンリッチメントプロファイルがすべて、マウスおよびヒトADニューロンにおける学習過程に関与する遺伝子セットの高レベルの一致した調節を示したことも見出したが（図9C）、これは、TERTがAD脳において重要な疾患関連パスウェイを調節することを示唆している。

TERTは、細胞および組織レベルで樹状突起棘の形成を誘導するのみならず、分子レベルで学習過程遺伝子を活性化させるので、本発明者らは次に、TERTの活性化がインビボADモデルの学習欠損を改善することができたかを検討した。そのために、R26-CAG-LSL-mTert；3xTg-AD；Camk2a-CreERT2モデルで空間記憶学習能をAD対照と比べて評価した。高齢のAD対照がバーンズ迷路で空間学習の習得障害を示したのに対し、逃避穴に入るまでの潜時の減少によって示されるように、年齢および性別がマッチするTert活性化ADマウスは学習能力および記憶保持に有意な改善を達成した（図9D）。上記の細胞および分子データと整合して、本発明者らの知見は、Tert活性化がADマウスの加齢性学習障害を減弱することを示している。

本発明者らは、最終分化した有糸分裂後ニューロンに果たすTERTの役割の基礎となる機構的詳細をさらに検討した。TERT活性化および遺伝子調節の機構的基礎を同定するために、本発明者らは、ニューロンにおけるTERTの潜在的相互作用パートナーのプロテオームワイド解析を行った。TERT含有タンパク質複合体の質量分析による特徴付けによって、転写調節因子であるCREB結合タンパク質（CREBBP）およびRELA、RNAポリメラーゼII最大触媒サブユニットPOLR2A、およびヒトニューロン中で転写調節因子をRNAポリメラーゼIIに連結する複数のメディエーター複合体サブユニット（MED1、4、12、15、16、23、24）が同定された（図10A）。本発明者らはまた、様々なWNTおよびWNTパスウェイ成分がTERT活性化ADニューロンにおいて上昇したこともRNA-Seq解析によって明らかにしたが（図10B）、WNTシグナル伝達が神経変性疾患において神経保護作用を有することが知られていることに照らすと、これはさらに重要性を増す。これらの観察に基づき、本発明者らは、有糸分裂後ニューロンにおいて内在性TERTが、WNTシグナル伝達の中枢的なプレーヤーであるβ-カテニンを含有する転写調節複合体と物理的に相互作用するかを評価した。免疫共沈アッセイによって、実際に、ニューロンTERTタンパク質が、完全に分化したヒトニューロン中で活性化核型のβ-カテニンならびにCREBBPおよびPOLR2Aと内在性レベルで物理的に相互作用することが確認された（図10C）。

本発明者らは、TERTおよびβ-カテニン／TCF7のゲノムレベルでの関連性のグローバルなエンリッチメントの可能性をさらに評価した。本発明者らは、ヒトニューロンにおけるTERTおよびβ-カテニン／TCF7のゲノムワイド分布を、特異的抗体を使用するChIP-Seqによって決定し、TERTおよびβ-カテニンの両方ならびに転写複合体パートナーであるTCF7が、ヒトニューロンにおける遺伝子プロモーターの転写開始部位（TSS）を主に占有したことを発見した（図11A）。本発明者らはまた、TERT結合部位がWNTファミリーメンバーWNT9B、Na⁺/K⁺-ATPアーゼ触媒サブユニットATP1A3（本発明者らの研究においてTERT活性化ヒトおよびマウスニューロンの両方でアップレギュレーションされる5つのオーバーラップ遺伝子の1つ）、HSP70ファミリーメンバーHSPA12AおよびHSPA6、ならびにTERTの正のフィードフォワード調節因子MYCを含む、高度に関連する遺伝子のプロモーター領域でβ-カテニンおよびTCF7の両方によって占有されたことも明確にした（図11B）。ADニューロンにおけるTERTとβ-カテニン／TCF転写複合体との物理的会合ならびにβ-カテニン／TCF転写活性のTERT強化の本発明者らの知見（図11C）は、AD疾患の進行におけるTERTおよびWNTシグナル伝達の重要な役割を指摘している。

本発明において、本発明者らは、アミロイドベースのADモデルからのマウスおよびヒトニューロンがニューロンTERT発現のエピジェネティック抑制を示し、アミロイド蓄積とTERT遺伝子発現との間の関係、およびTERT発現の回復が疾患の軌跡に影響することもできるかどうかの探索を促すことを特定した。本発明者らは、TERTの活性化が2つのADマウスモデルの脳内の海馬および皮質ニューロンならびにゲノムAPP重複を有する培養ヒトiPSC由来ADニューロン中のAβレベルの顕著な減少をもたらすことを観察した。機構的に、TERTは遺伝子発現を誘導し、そして、シナプスシグナル伝達および学習パスウェイを支配している、ならびにマウスおよびヒトニューロンの両方でニューロンの健康を保護している、主要なニューロン遺伝子の転写開始部位でコア転写およびβ-カテニン/TCF7複合体成分と物理的に相互作用した。ニューロンTERT発現は、加齢ADマウスモデルにおける樹状突起棘の形成および認知機能を改善した。まとめると、これらの知見は、ADに対する潜在的疾患修飾戦略としての体細胞TERT活性化療法の開発を支持している。

実施例2 - アルツハイマー病脳におけるTERT mRNAのエクソソーム媒介送達
エクソソームは、細胞から放出され、かつ大部分の生体液中に見出される細胞外小胞（40～100nM）であって、核酸およびタンパク質などの高分子の標的細胞への伝達の有用な手段を提供する。エクソソーム療法が抗癌臨床試験で探究されており、血液脳関門を容易に通過する能力のせいで神経変性疾患を処置するためにも使用できるのに対し、リポソームは、標的部位に送達される前に、酵素、機械的ひずみおよび／または食作用の攻撃によって優先的に分解される。エクソソーム表面でのCD47およびRVG脳標的化ペプチドの提示は、自らを分解から保護することによって生物学的安定性を増加させるだけでなく、脳内の標的細胞への生物活性エクソソーム核酸の全体的な送達効率もまたリポソームと比較して改善する場合がある。脳にTERT mRNAを送達する優れた能力を示す標的化エクソソームは、AD処置のための有効な治療戦略として役立つことができる。

A. 手順
1. エクソソーム生成のための細胞調製
ヒト線維芽細胞および／または骨髄樹状細胞（BMDC）をエクソソーム源として使用することができる。これらの細胞を、10％エクソソーム枯渇FBSおよび1％ペニシリン-ストレプトマイシンを補充したDMEM中で培養することができる。

2. RVG脳標的化ペプチドの提示およびCD47「ドントイートミー」シグナルによる標的化エクソソームの生成
X-tremeGENEトランスフェクション試薬（Roche）またはLipofectamine 2000試薬（Invitrogen）を使用して、CD47およびRVG（狂犬病ウイルス糖タンパク質）由来ペプチドをコードするプラスミドを細胞にトランスフェクトすることができる。CD47リガンドタンパク質は、シグナル調節タンパク質α（SIRPα）と相互作用し、次いでエクソソームを食作用から保護し得る「ドントイートミー」シグナルを開始し得る。エクソソーム表面の標的上のRVG由来ペプチドは、アセチルコリン受容体を発現しているニューロン細胞に結合するようにエクソソームを案内し、標的化エクソソームの中枢神経系への経血管送達を可能にする場合がある。

3. 精密濾過および超遠心分離法による標的化エクソソームの単離
標的化エクソソームは、分画遠心分離段階によって精製することができる。エクソソーム枯渇FBSを補充した上清を細胞から収集し、0.2μmフィルターを使用して濾過し、120,000×g、4℃で70分間超遠心分離することができる。次いで、エクソソームのペレットをPBS中に再懸濁し、続いて120,000×g、4℃でさらに70分間超遠心分離することができる。エクソソームペレットをエレクトロポレーション緩衝液中に再懸濁することができる。

4. エレクトロポレーションによるエクソソームへのTERT mRNAの負荷
単離されたエクソソームを、エレクトロポレーション緩衝液中でTERT mRNAと混合し、400mVおよび静電容量125μFでエレクトロポレーションすることができる。次いで、すべてのエクソソームをPBS中に再懸濁し、120,000×gにおいて4℃でさらに70分間超遠心分離することができる。

5. アルツハイマー病対象へのエクソソームの全身（i.v.）投与
負荷されたエクソソームをPBS中に再懸濁し、次いで、アルツハイマー病対象に静脈内注射することができる。

6. アルツハイマー病態に対するTERT mRNAの送達のエクソソーム媒介治療効果の特徴付け
対照核酸またはTERT mRNAを負荷された標的化エクソソームで処置されたAD対象を、学習および記憶課題について定期的に評価することができる。治療用エクソソームの投与は、処置された対象の学習および記憶を改善し、かつ／または対象の脳内のアミロイドベータのクリアランスを増加させると考えられている。

本明細書において開示される方法および請求される方法のすべては、本開示に照らして過度の実験を行うことなく、なされ、実行されることができる。本発明の組成物および方法を好ましい態様により説明してきたが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱せずに本明細書に記載される方法および該方法の段階または段階の配列にバリエーションが適用され得ることは、当業者に明らかであろう。より具体的には、化学的および生理学的に関係するある特定の作用物質が本明細書に記載される作用物質の代わりに用いられ得るが、それでも同じまたは類似の結果が達成されることが明らかである。当業者に明らかなそのような類似の代用物および改変は、すべて、添付の特許請求の範囲によって定義されるように本発明の精神、範囲および概念の範囲内であると見なされる。

本明細書に開示される参考文献は、例示的な手順の詳細または本明細書に示されるものを補足する他の詳細を提供する範囲で、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。

Claims

その必要がある対象において新しいニューロンを生成するための方法であって、該対象にTERT活性化療法を投与する段階を含む、前記方法。
対象における神経変性障害を処置するための方法であって、該対象にTERT活性化療法を投与する段階を含む、前記方法。
神経変性障害がアルツハイマー病を含む、請求項2記載の方法。
その必要がある対象におけるアミロイドβペプチドを減少させるための方法であって、該対象にTERT活性化療法を投与する段階を含む、前記方法。
その必要がある対象における早期老化障害を処置するための方法であって、該対象にTERT活性化療法を投与する段階を含む、前記方法。
早期老化障害が、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群（HGPS）、ネスター・ギラーモ早老症候群、ウェルナー症候群、コケイン症候群、ブルーム症候群、色素性乾皮症、毛細血管拡張性運動失調症、裂毛症、先天性角化異常症、または多彩異数性モザイク症候群を含む、請求項5記載の方法。
対象が障害を有すると診断されている、請求項1～6のいずれか一項記載の方法。
対象が、以前に障害について処置されている、請求項1～7のいずれか一項記載の方法。
対象が、以前の療法に対して非応答性と決定されている、請求項8記載の方法。
対象がヒトである、請求項1～9のいずれか一項記載の方法。
対象が50歳未満である、請求項10記載の方法。
追加の療法の投与をさらに含む、請求項1～11のいずれか一項記載の方法。
TERT活性化療法が、TERTポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含む、請求項1～12のいずれか一項記載の方法。
TERT活性化療法が、対象へのTERTポリペプチドをコードするDNAまたはRNAを含む、請求項13記載の方法。
TERT活性化療法がTERTポリペプチドを含む、請求項1～12のいずれか一項記載の方法。
TERT活性化療法が、TERTポリペプチドまたはTERTポリペプチドをコードする核酸を含むナノベシクルを含む、請求項1～15のいずれか一項記載の方法。
ナノベシクルがCD47を含む、請求項16記載の方法。
ナノベシクルが狂犬病ウイルス糖タンパク質ペプチドを含む、請求項16または17記載の方法。
ナノベシクルが、線維芽細胞または骨髄樹状細胞に由来する、請求項16～18のいずれか一項記載の方法。
ナノベシクルがヒト細胞に由来する、請求項16～19のいずれか一項記載の方法。
TERT活性化療法が、ヒストンH3K9メチルトランスフェラーゼ（HMT）の調整を含む、請求項1～20のいずれか一項記載の方法。
前記調整が、HMT遺伝子またはタンパク質の抑制を含む、請求項21記載の方法。
前記抑制が、1つまたは複数のHMT遺伝子の遺伝子サイレンシングを含む、請求項22記載の方法。
1つまたは複数のHMT遺伝子が、SUV39H1/KMT1A、SUV39H2/KMT1B、SETDB1/KMT1E、SETDB2/KMT1F、PRDM2、G9A/KMT1C、GLP/KMT1D、EHMT1、およびRIZ1/KMT8のうちの1つまたは複数を含む、請求項23記載の方法。
TERT活性化療法がHMT阻害剤を含む、請求項22記載の方法。
HMT阻害剤が、ケトシン、BIX-01294、BIX-01338、UNC0638、およびBRD4770のうちの1つまたは複数を含む、請求項25記載の方法。
TERT活性化療法が、ヒストンH3K9デメチラーゼ（HDM）ポリペプチドまたはHDMをコードする核酸の投与を含む、請求項1～20のいずれか一項記載の方法。
HDMポリペプチドが、KDM1A/LSD1、KDM3A/JHDM2A、KDM3B/JHDM2B、KDM4A/JHDM3A、KDM4B/JMJD2B、KDM4C/JMJD2C、KDM4D/JMJD2D、KDM7/JHDM1D、およびPHF8のうちの1つまたは複数からのポリペプチドを含む、請求項27記載の方法。
TERT活性化療法が静脈内注射によって投与される、請求項1～28のいずれか一項記載の方法。
処置することが、アミロイドβペプチドの減少、学習の改善、記憶の改善、およびニューロンの生成のうちの1つまたは複数を含む、請求項1～29のいずれか一項記載の方法。
TERTポリペプチドが、テロメラーゼ活性を有するポリペプチドを含む、請求項15～30のいずれか一項記載の方法。