KR102616080B1 - 알츠하이머 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

알츠하이머 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 명세서는 저산소 조건에서 높은 적응력을 갖는 줄기세포(stem cell, SC)를 유효성분으로 하는 알츠하이머 병 치료용 약학적 조성물 및 이의 용도를 제공한다. 구체적으로, 본 명세서에서는 저산소환경에서 적응력 또는 생존력이 높은, 하나 이상의 넉아웃 된 HIF1AN 유전자를 포함하는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머 병 증상완화 또는 치료용도의 약학적 조성물이 개시된다.

Description

알츠하이머 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 용도{Pharmaceutical composition for treating Alzheimer's disease and use thereof}
본 출원은 저산소 조건에서 높은 적응력을 갖는 줄기세포(stem cell, SC) 를 유효성분으로 하는 알츠하이머 병 치료용 약학적 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
알츠하이머 병(Alzheimer's Disease, AD)은 학습이나 기억에 관계하는 대뇌의 뉴런(신경세포)이 죽음에 이름으로써 기억을 잃고, 계산력, 언어능력, 시공간 이해력, 그리고 판단력 등의 사고력이 점차 낮아지는 질환이다. 알츠하이머 병은 만성 신경퇴행성 질환의 하나로 치매(dementia)를 유발하는 원인의 60~70%를 차지하고 있다. 알츠하이머 병의 원인은 잘 알려져 있지 않으나, 공통적으로 기억을 관장하는 변연계 신경 경로(limbic pathway)에서 신경세포의 사멸이 관찰되는 소견을 보인다. AD 환자의 주요 특징인 인지 작용의 점진적 상실의 유력한 원인은 비정상적으로 축적된 A
Figure 112021005229858-pat00001
(Amyloid beta)에 의한 것으로 보인다.
최근, 상기 알츠하이머 병의 치료에 있어서 줄기세포를 적용하고자 하는 시도가 있다.
줄기세포 치료제란 질병의 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용하는 의약품으로, 고전적 약물 치료와는 다르게 인체에서 채취한 줄기 세포를 체외에서 조작하여 환자에게 다시 주입하는 새로운 방식의 세포치료제의 한 종류이다. 손상된 조직 및 세포의 재생 및 복구, 회복을 통해 난치성 질환 등 예방, 증상완화 또는 치료에 사용될 수 있다. 줄기세포는 자가분열(self-renewal) 능력을 가져 기존의 유전자 치료의 문제인 번거로운 치료 과정 또는 횟수를 줄일 수 있기 때문에 치료제로서 각광을 받고 있다.
다만, 줄기세포를 이용한 치료는 면역 거부 반응, 다른 조직으로 이동하여 엉뚱하게 분화하는 문제 그리고 줄기세포가 암세포로 변할 수 있는 문제 등을 가지고 있다. 뿐만 아니라, 환자에게 주입된 줄기세포가 안정적으로 생착하여 증식하는 효율이 낮은 문제도 가지고 있다.
[선행기술문헌]
[특허문헌] (특허문헌 0001) COMPOSITION FOR CLEAVING A TARGET DNA COMPRISING A GUIDE RNA SPECIFIC FOR THE TARGET DNA AND CAS PROTEIN-ENCODING NUCLEIC ACID OR CAS PROTEIN, AND USE THEREOF (International Publication Number WO 2014/065596 A1).
[비특허문헌] (비특허문헌 0001) Mahon PC, Hirota K, Semenza GL. FIH-1: a novel protein that interacts with HIF-1alpha and VHL to mediate repression of HIF-1 transcriptional activity. Genes Dev. 2001;15(20):2675-2686. doi:10.1101/gad.924501.
본 명세서에서는 인위적으로 조작된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머 병 치료용 약학적 조성물을 제공하고자 한다.
본 명세서에서는 인위적으로 조작된 줄기세포 및/또는 상기 인위적으로 조작된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머 병 치료용 약학적 조성물을 사용하는 알츠하이머 병 치료 방법을 제공하고자 한다.
본 명세서에서는 인위적으로 조작된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머 병 치료용 약학적 조성물을 제조하는 방법을 제공하고자 한다.
본 명세서에서는 인위적으로 조작된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머 병 치료용 약학적 조성물의 용도를 제공하고자 한다.
본 명세서에서는 인위적으로 조작된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머 병 치료용 약학적 조성물을 제공하며, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 다음을 포함한다: 야생형 HIF1AN 유전자 내에 인델을 가지는 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자, 이때, 상기 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자의 서열은 상기 야생형 HIF1AN 유전자의 서열과 다르고, 이때, 상기 조작된 줄기세포 내에서, FIH-1의 발현 수준은 야생형 세포에 비해 더 낮은 것을 특징으로 하고, 상기 조작된 줄기세포 내에서, HIFα의 발현 수준은 상기 야생형 세포에 비해 더 높은 것을 특징으로 함.
일 실시예로, 상기 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자가 가진 인델은 상기 야생형 HIF1AN 유전자의 엑손 1 영역에 위치하는 것을 특징으로 한다.
일 실시예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 인위적으로 조작된 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 한다.
일 실시예로, 상기 약학적 조성물은 뇌조직 투여용 제형인 것을 특징으로 한다.
일 실시예로, 상기 뇌조직은 해마 또는 CPu(caudate putamen)인 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서는 인위적으로 조작된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머 병 치료용 약학적 조성물을 제공하며, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자를 포함하고, 이때, 상기 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자의 서열은 서열번호 1 내지 9로 이뤄진 군에서 선택된 하나 이상의 서열을 포함하지 않고, 상기 조작된 줄기세포 내에서, FIH-1의 발현 수준은 야생형 세포에 비해 더 낮은 것을 특징으로 하고, 상기 조작된 줄기세포 내에서, HIFα의 발현 수준은 상기 야생형 세포에 비해 더 높은 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서는 다음을 포함하는 알츠하이머 병 치료 방법을 제공한다: 대상 내에 인위적으로 조작된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 것, 이때, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 야생형 HIF1AN 유전자 내에 인델을 가지는 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자를 포함하고, 상기 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자의 서열은 야생형 HIF1AN 유전자의 서열과 다르고, 이때, 상기 조작된 줄기세포 내에서, FIH-1의 발현 수준은 야생형 세포에 비해 더 낮은 것을 특징으로 하고, 상기 조작된 줄기세포 내에서, HIFα의 발현 수준은 상기 야생형 세포에 비해 더 높은 것을 특징으로 함.
일 실시예로, 상기 약학적 조성물의 투여는 상기 대상의 뇌 조직에 약학적 조성물을 직접 주입하는 것을 특징으로 한다.
일 실시예로, 상기 뇌 조직은 해마 또는 CPu(caudate putamen)인 것을 특징으로 한다.
일 실시예로, 상기 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자가 가진 인델은 상기 야생형 HIF1AN 유전자의 엑손 1 영역에 위치하는 것을 특징으로 한다.
일 실시예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 인위적으로 조작된 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서는 다음을 포함하는 알츠하이머 병 치료 방법을 제공한다: 대상 내에 인위적으로 조작된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 것, 이때, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자를 포함하고, 상기 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자의 서열은 서열번호 1 내지 9로 이뤄진 군에서 선택된 하나 이상의 서열을 포함하지 않고, 상기 조작된 줄기세포 내에서, FIH-1의 발현 수준은 야생형 세포에 비해 더 낮은 것을 특징으로 하고, 상기 조작된 줄기세포 내에서, HIFα의 발현 수준은 상기 야생형 세포에 비해 더 높은 것을 특징으로 함.
본 명세서에서는 인위적으로 조작된 줄기세포의 알츠하이머 병 치료 용도를 제공하며, 상기 알츠하이머 병 치료 용도는 대상 내에 인위적으로 조작된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하고, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 다음을 포함한다: 야생형 HIF1AN 유전자 내에 인델을 가지는 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자, 이때, 상기 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자의 서열은 상기 야생형 HIF1AN 유전자의 서열과 다르고, 이때, 상기 조작된 줄기세포 내에서, FIH-1의 발현 수준은 야생형 세포에 비해 더 낮은 것을 특징으로 하고, 상기 조작된 줄기세포 내에서, HIFα의 발현 수준은 상기 야생형 세포에 비해 더 높은 것을 특징으로 함.
일 실시예로, 상기 약학적 조성물의 투여는 상기 대상의 뇌 조직에 약학적 조성물을 직접 주입하는 것을 특징으로 한다.
일 실시예로, 상기 뇌 조직은 해마 또는 CPu(caudate putamen)인 것을 특징으로 한다.
일 실시예로, 상기 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자는 상기 야생형 HIF1AN 유전자가 가지는 인델은 상기 HIF1AN 유전자의 엑손 1 영역에 위치하는 것을 특징으로 한다.
일 실시예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 인위적으로 조작된 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서는 인위적으로 조작된 줄기세포의 알츠하이머 병 치료 용도를 제공하며, 상기 알츠하이머 병 치료 용도는 대상 내에 인위적으로 조작된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하고, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자를 포함하고, 상기 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자의 서열은 서열번호 1 내지 9로 이뤄진 군에서 선택된 하나 이상의 서열을 포함하지 않고, 상기 조작된 줄기세포 내에서, FIH-1의 발현 수준은 야생형 세포에 비해 더 낮은 것을 특징으로 하고, 상기 조작된 줄기세포 내에서, HIFα의 발현 수준은 상기 야생형 세포에 비해 더 높은 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서는 인위적으로 조작된 줄기세포의 알츠하이머 병 치료제를 제조하기 위한 용도를 제공하며, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 다음을 포함한다: 야생형 HIF1AN 유전자 내에 인델을 가지는 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자, 이때, 상기 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자의 서열은 상기 야생형 HIF1AN 유전자의 서열과 다르고, 이때, 상기 조작된 줄기세포 내에서, FIH-1의 발현 수준은 야생형 세포에 비해 더 낮은 것을 특징으로 하고, 상기 조작된 줄기세포 내에서, HIFα의 발현 수준은 상기 야생형 세포에 비해 더 높은 것을 특징으로 함.
일 실시예로, 상기 알츠하이머 병 치료제는 뇌조직 투여용 제형인 것을 특징으로 한다.
일 실시예로, 상기 뇌조직은 해마 또는 CPu(caudate putamen)인 것을 특징으로 한다.
일 실시예로, 상기 야생형 HIF1AN 유전자가 가지는 인델은 상기 HIF1AN 유전자의 엑손 1 영역에 위치하는 것을 특징으로 한다.
일 실시예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 인위적으로 조작된 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서는 인위적으로 조작된 줄기세포의 알츠하이머 병 치료제를 제조하기 위한 용도를 제공하며, 이때, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자를 포함하고, 상기 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자의 서열은 서열번호 1 내지 9로 이뤄진 군에서 선택된 하나 이상의 서열을 포함하지 않고, 상기 조작된 줄기세포 내에서, FIH-1의 발현 수준은 야생형 세포에 비해 더 낮은 것을 특징으로 하고, 상기 조작된 줄기세포 내에서, HIFα의 발현 수준은 상기 야생형 세포에 비해 더 높은 것을 특징으로 한다.
본 출원은 안정적이고 효과적인 알츠하이머 병 치료제 또는 치료용도 약학적 조성물 및 이를 이용한 알츠하이머 병 치료방법을 제공할 수 있다.
본 출원은 저산소환경에서 적응력 또는 생존력이 높은, 하나 이상의 넉아웃 된 HIF1AN 유전자를 포함하는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머 병 증상완화 또는 치료용도의 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 hHIF1AN 유전자의 뉴클레오타이드 서열 일부를 타겟으로 하는 유전자 조작용 조성물을 처리한 뒤, 유전자 조작 여부를 확인한 실험데이터이다. 구체적으로, 가이드 핵산을 달리한 때 인델(InDel) 발생비율을 확인한 것이다.
도 2는 hHIF1AN 유전자 조작용 조성물을 MSC에 처리한 뒤, deep sequencing 을 통해 본 실험에 적합한 세포를 스크리닝 한 것이다.
도 3은 도 2에서 deep sequencing을 통해 선별된 세포 내에서 HIF1AN 유전자 로부터 전사되는 mRNA 발현량을 qRT-PCR을 이용하여 비교한 자료이다.
도 4는 저산소의 상황에서 흔히 발생하는 산화적 스트레스(reactive oxidative stress; ROS)를 과산화수소 (hydrogen peroxide; H₂O₂) 로 유도하여 MSC의 증식 능력 변화를 측정한 실험 결과로서, CCK-8 assay를 통해 생존 세포된 세포의 수를 측정한 그래프이다. 본 자료에서 SFM이란 serum free medium을 의미한다.
도 5는 C57BL/6 그리고 5xFAD 마우스를 대상으로 하는 in-vivo 실험을 도식화한 것이다.
도 6은 C57BL/6 마우스를 대상으로 하는 in-vivo 실험에서 HIF1AN 유전자가 넉 아웃 된 MSC의 생존량을 qPCR로 측정한 실험결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 5xFAD 마우스를 대상으로 하는 in-vivo 실험에서 HIF1AN 유전자가 넉아웃 된 MSC의 생존량을 qPCR로 측정한 실험결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 5xFAD 마우스를 대상으로 하는 in-vivo 실험에서 대조군 (naive/AAVS1)에 비해 HIF1AN K/O 줄기세포를 투여한 그룹에서 soluble A
Figure 112021005229858-pat00002
발현이 감소하였는지 확인한 그래프이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여, 발명의 내용을 특정한 구현예와 예시들을 통해 더욱 상세하게 설명한다. 상기 첨부된 도면은 발명의 일부 구현예를 포함하지만, 모든 구현예를 포함하고 있지는 않다는 점에 유의해야 한다. 본 명세서에 의해 개시되는 발명의 내용은 다양하게 구현될 수 있으며, 여기에 설명되는 특정 구현예로 제한되지 않는다. 이러한 구현예들은 본 명세서에 적용되는 법적 요건을 만족시키기 위해 제공되는 것으로 보아야 한다. 본 명세서에 개시된 발명이 속한 기술분야에 있어 통상의 기술자라면, 본 명세서에 개시된 발명의 내용에 대한 많은 변형 및 다른 구현예들을 떠올릴 수 있을 것이다. 따라서, 본 명세서에서 개시된 발명의 내용은 여기에 기재된 특정 구현예로 제한되지 않으며, 이에 대한 변형 및 다른 구현예들도 청구범위 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
용어의 정의
약
본 명세서에서 사용되는 "약"이라는 용어는 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
A, T, C, G, 및 U의 의미
본 명세서에서 사용되는 A, T, C, G 및 U 기호는 당업계 통상의 기술자가 이해하는 의미로 해석된다. 문맥 및 기술에 따라 DNA 또는 RNA 상에서 염기, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드로 적절히 해석될 수 있다. 예를 들어, 염기를 의미하는 경우는 각각 아데닌(A), 티민(T), 시토신(C), 구아닌(G) 또는 우라실(U) 자체로 해석될 수 있고, 뉴클레오사이드를 의미하는 경우는 각각 아데노신(A), 티민(T), 시티딘(C), 구아노신(G) 또는 유리딘(U)으로 해석될 수 있으며, 서열에서 뉴클레오타이드를 의미하는 경우는 상기 각각의 뉴클레오사이드를 포함하는 뉴클레오타이드를 의미하는 것으로 해석되어야 한다.
엔지니어링 된
본 명세서에서 사용되는 "엔지니어링 된"이란 용어는 자연계에 이미 존재하는 구성을 가진 물질, 분자 등과 구분하기 위해 사용하는 용어로, 상기 물질, 분자 등에 인위적인 변형이 가해진 것을 의미한다. 예를 들어, "엔지니어링 된 유전자"의 경우, 자연계에 존재하는 유전자의 구성에 인위적인 변경이 가해진 유전자를 의미한다. 또한, 상기 용어는 당업계 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절히 해석될 수 있다.
야생형의
"야생형"은 자연적으로 발생하는 염기서열을 포함하는 유전자 및 그 유전자로부터 발현되는 단백질이 정상적인 기능적 특성을 지니는 것을 의미한다. 야생형 유전자는 집단에서 가장 빈번하게 관찰된다. 본 명세서에서 "야생형"이라는 용어가 인위적으로 조작된(엔지니어링 된) 유전자, 및/또는 세포와 대비해 사용된다면, 이는 인위적으로 조작된 유전자, 및/또는 세포와 상응하는 동종의 "인위적으로 조작되지 않은" 자연적으로 발생하는 염기서열을 포함하는 유전자 및 이를 가지는 세포를 의미하는 것으로 해석될 수 있다. 또한, 상기 용어는 당업계 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절히 해석될 수 있다.
넉아웃(knock-out)
본 명세서에서 사용되는 "넉아웃", 혹은 "넉아웃된 유전자"라는 표현은, 야생형 유전자가 발현하는 단백질을 전사 및/또는 번역 과정을 거쳐 생성하지 못하는 것을 의미한다. 예를 들어, 넉아웃된 유전자 A를 포함하는 세포는 야생형 유전자 A에 의해 발현되는 mRNA 및/또는 단백질을 발현하지 못하는 것 일 수 있다. 넉아웃 된 A 유전자를 포함하는 세포란 세포 내 존재하는 유전자 A 중 하나 만 넉아웃 된 것일 수 있고, 두 개 이상 넉아웃 된 것일 수 있다. 또한, 상기 용어는 당업계 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절히 해석될 수 있다.
넉다운(knock-down)
본 명세서에서 사용되는 "넉다운", 혹은 "넉다운 된 유전자" 라는 표현은, 야생형 유전자보다 적은 양으로 물질을 발현하는 것을 의미한다. 예를들어, 넉다운된 유전자 A를 포함하는 세포는 야생형 유전자 A 에 의해 발현되는 mRNA보다 적은 양의 mRNA를 발현하는 것일 수 있다. A 유전자가 넉다운된 세포란 세포 내 존재하는 유전자 A 중 하나만 넉다운 된 것일 수 있고, 두 개 이상 넉다운 된 것일 수 있다. 또한, 상기 용어는 당업계 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절히 해석될 수 있다.
발현 수준(expression level)
본 명세서에서 사용되는 "발현 수준"이라는 용어는, 특정 유전자로부터 발현된 산물, 예를 들어 mRNA 및/또는 단백질이 얼마나 잘 발현되는지를 의미한다. 일반적으로 세포 내 특정 유전자의 발현 수준이 높은 경우, 세포 내에 포함된 상기 특정 유전자로부터 발현된 mRNA 및/또는 특정 단백질의 양, 또는 세포질 내 상기 발현 산물의 농도가 높은 것으로 나타난다. 반대로 세포 내 특정 유전자의 발현 수준이 낮은 경우, 세포 내에 포함된 상기 특정 유전자로부터 발현된 mRNA 및/또는 특정 단백질의 양, 또는 세포질 내 상기 발현 산물의 농도가 낮은 것으로 나타난다. 본 명세서에서 "발현 수준이 높다" 혹은 "발현 수준이 낮다"고 쓰는 경우, 비교 대상이 달리 명시되지 않는 한, 그 비교 대상은 동종의, 야생형의 세포라고 해석할 수 있다. 또한, 비교 기준이 되는 정량적인 지표는 문맥 상 가장 적합한 것으로 해석되어야 한다. 예를 들어, 각 세포의 절대량, 상대량, 및/또는 농도가 비교 기준이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 제1 세포 내에서 a 유전자의 발현 수준이, 제2 세포 내에서 a 유전자의 발현 수준보다 높다고 표현하는 경우, 제1 세포 내의 a 유전자의 발현 산물(mRNA, 단백질 등)이 제2 세포 내의 a 유전자의 발현 산물보다 절대량이 더 많거나, 상대량이 더 많거나, 및/또는 농도가 더 높을 수 있다. 또한, 상기 용어는 당업계 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절히 해석될 수 있다.
배경기술 - 알츠하이머 병
알츠하이머병(Alzheimer's Disease, AD)은 학습이나 기억에 관계하는 대뇌의 뉴런(신경세포)이 죽음에 이름으로써 기억을 잃고, 계산력, 언어능력, 시공간 이해력, 그리고 판단력 등의 사고력이 점차 낮아지는 질환이다. 알츠하이머 병은 만성 신경퇴행성 질환의 하나로 치매(dementia)를 유발하는 원인의 60~70%를 차지하고 있다. 알츠하이머 병의 원인은 잘 알려져 있지 않으나, 공통적으로 기억을 관장하는 변연계 신경 경로(limbic pathway)에서 신경세포의 사멸이 관찰되는 소견을 보인다. AD 환자의 주요 특징인 인지 작용의 점진적 상실의 유력한 원인은 비정상적으로 축적된 A
Figure 112021005229858-pat00003
(Amyloid beta)에 의한 것으로 보인다.
배경기술 - 세포 치료제
세포 치료제의 개념
최근에 질병의 치료, 진단 및 예방 등의 목적으로 세포를 치료제로서 사용하는 방법이 주목되고 있다. 일반적으로 질병의 치료 또는 망가진 조직이나 기관의 재생을 위하여 그 해당부위에 직접 세포를 투여한다. 투여되는 세포로서 치료물질을 발현할 수 있는 세포 또는 본래 기능을 온전히 가지는 세포를 사용한다. 특정 부위에 투여된 세포는 투여된 부위에서 오랜 기간 생존하여 정상적인 기능을 수행함으로써 상기 치료 또는 재생 목적을 달성할 수 있다.
줄기세포 치료제
줄기세포 치료제란 질병의 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용하는 의약품으로, 고전적 약물 치료와는 다르게 인체에서 채취한 줄기 세포를 체외에서 조작하여 환자에게 다시 주입하는 새로운 방식의 세포치료제의 한 종류이다. 손상 된 조직 및 세포의 재생 및 복구, 회복을 통해 난치성 질환 등 예방, 증상완화 또 는 치료에 사용될 수 있다. 줄기세포는 자가분열(self-renewal) 능력을 가져 기존의 유전자 치료의 문제인 번거로운 치료 과정 또는 횟수를 줄일 수 있기 때문에 치료 제로서 각광을 받고 있다.
다만, 줄기세포를 이용한 치료는 면역 거부 반응, 다른 조직으로 이동하여 엉뚱하게 분화하는 문제 그리고 줄기세포가 암세포로 변할 수 있는 문제 등을 가지고 있다. 뿐만 아니라, 환자에게 주입된 줄기세포가 안정적으로 생착하여 증식하는 효율이 낮은 문제도 가지고 있다.
배경기술 - HIF1 단백질 및 그 활성을 저해하는 인자
HIF1 단백질
저산소환경에서 놓인 세포는 생존하기 위하여 다량의 HIF1(Hypoxia- Inducible Factor 1) 단백질을 발현한다는 사실이 알려져 있다. HIF1 단백질이란 저산소 환경에서 혈관신생(angiogenesis, vascularization), 에너지대사(energy metabolism) 등에 관여하여 세포가 생존할 수 있는 환경을 만드는 역할을 하는 유전자의 전사조절인자(transcriptional regulator)로서, 서브 유닛으로 HIF1α 및 HIF1
Figure 112021005229858-pat00004
가 있다. HIF1α 및 HIF1
Figure 112021005229858-pat00005
는 각각 HIF1A 및 HIF1B 유전자에 의하여 암호화된다. 따라서, 저산소 환경 하 세포가 생존하기 위해서는, HIF1 단백질, 또는 그 서브 유닛들의 발현 수준이 높거나, 그 활성이 높게 유지되어야 한다.
HIF1 단백질 활성을 저해하는 인자 - FIH1
FIH-1은 HIF1AN 유전자에 의하여 암호화된 단백질이고 HIF1α의 post-translational control에 관여하는 단백질이다. 보다 구체적으로 FIH-1은 Asparaginyl hydroxylase이다. FIH-1은 HIF1α와 핵수용체활성화인자인 p300/CBP 사이에 상호작용하는 것을 방해함으로써 HIF1의 활성을 감소시키는 역할을 한다. 심지어 FIH-1는 심한 저산소 환경(severe hypoxia) 하에서도 작동(working)하므로 저산소환경하에서 세포의 생존과 직결된 단백질에 해당한다.
종래 기술의 한계점
현재까지 AD에 관한 연구는, 주로 세크레타제 저해제와 같은 A
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생성 억제제 또는 항산화제 같은 신경세포 독성 저해제들을 이용한 AD 예방 및 치료 제가 개발되었다. 현재 Nicotin receptor agonist인 ABT-418; Muscarin receptor agonist인 Xanomeline, YM-796; Metal chelator인 Desferrioxamine, Clioquinol; 아밀로이드베타 억제제인 Aducanumab, Bapineuzumab , CAD106, Gantenerumab, Solanezumab; BACE(
Figure 112021005229858-pat00007
-site amyloid precursor protein cleaving enzyme) 억제제인 AZD3293, E2609, JNJ-54861911, MK-8931; Tau 단백질 억제제인 TRx-0237; Intranasal insulin; PPAR-γ 수용체 작용제인 Pioglitazone; dihydropyridine calcium channel blocker인 Nilvadipine 등이 개발되고 있으나, 아직 효과가 약간의 병리적 증상을 완화 또는 진행 정도를 늦추는 정도로 생겨 미미하거나 자체의 독성 때문에 실제 적용이 어려운 물질이 대부분이어서 안정적이고 효과적인 AD 치료제의 개발이 시급하다.
최근, AD 예방 및 치료에 전술한 세포 치료제, 구체적으로 줄기세포 치료제를 도입하려는 시도가 있었다. 그러나, 체외에서 치료 등을 위한 세포를 선별하여 증식한 뒤, 상기 세포를 체내에 투여하는 경우, 체내에서 특수하게 유지되는 환경에 의하여 빠른 시일 내에 투여된 세포가 사멸하는 문제가 발생한다. 세포가 사멸하는 대표적인 이유는 i) 체외에서 배양되는 환경과 체내의 환경이 서로 다르거나, ii) 체내의 투여된 부위가 저산소환경(hypoxia)으로 유지되기 때문이다. 따라서, AD 예방 및 치료에 줄기세포 치료제를 적용하기 위해서는, 투여된 세포가 저산소환경 하 사멸하는 문제를 해결할 것이 요구된다.
알츠하이머 병 치료용 약학적 조성물
개괄
본 명세서에서는 인위적으로 조작된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머 병 치료용 약학적 조성물을 개시한다. 상기 약학적 조성물은 야생형 HIF1AN 유전자가 인위적으로 조작된 줄기세포를 포함한다. 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 HIF1AN 유전자에 의해 전사되는 mRNA 및/또는 FIH-1 단백질의 발현 수준이 야생형 세포에 비해 낮은 것을 특징으로 하며, 이에 의해 세포 내 HIFα의 발현 수준, 및/또는 활성 수준이 야생형 세포에 비해 높다는 특징을 가진다. 본 명세서에서 개시되는 상기 알츠하이머 병 치료용 약학적 조성물은 상기 인위적으로 조작된 줄기세포 외에도 약학적으로 허용되는 담체 등을 포함할 수 있으며, 다양하게 제제화, 또는 제형화 된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 알츠하이머 병 치료용 약학적 조성물은 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자를 포함하는, 인위적으로 조작된 줄기세포를 유효성분으로 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자는 야생형의 HIF1AN 유전자 내에 인델을 가지는 것일 수 있다. 이때, 상기 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자의 서열은 상기 야생형의 HIF1AN 유전자의 서열과 다를 수 있다. 일 구현예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포 내에서, FIH-1의 발현 수준은 야생형 세포에 비해 더 낮을 수 있다. 일 구현예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포 내에서, HIF1α의 발현 수준 및/또는 활성 수준은 야생형 세포에 비해 더 낮을 수 있다.
인위적으로 조작된 줄기세포 1 - 세포 종류
일 구현예로, 본 명세서에서 개시하는 인위적으로 조작된 줄기세포는 저산소환경에서 향상된 생존능(viability)을 가지는 배아 줄기세포, 신경 줄기세포, 중간엽 줄기세포, 성체 줄기세포, 예를 들면 지방, 자궁, 골수, 간, 근육, 태반, 신경, 제대혈 또는 피부(상피) 등의 조직 유래 줄기세포일 수 있다. 또는 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 일 수 있다. 일 구현예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)일 수 있다. 일 구현예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 인간 와튼 젤리 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다. 일 구현예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 CD34, 및/또는 CD45 마커에 대해 음성인 중간엽 줄기세포일 수 있다. 일 구현예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 CD73, 및/또는 CD90 마커에 대해 양성인 중간엽 줄기세포일 수 있다.
인위적으로 조작된 줄기세포 2 - 엔지니어링 된 HIF1AN 포함
상기 인위적으로 조작된 줄기세포에서는 HIF1 단백질의 전사, 발현, 및/또는 활성을 저해하는 물질을 발현하는 야생형 HIF1AN 유전자가 인위적으로 편집되어 있는 것을 특징으로 한다. 달리 표현해, 상기 세포는 게놈 서열 상에서 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자를 포함하고, 세포 내 HIF1 단백질의 전사, 발현, 및/또는 활성을 저해하는 물질을 발현하는 기능이 감소되어 있다.
일 구현예로, 상기 세포는 엔지니어링 된 HIF1AN을 포함할 수 있다. 이때, 상기 HIF1AN 유전자는 인간 HIF1AN 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이때, 상기 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자의 서열은 야생형 HIF1AN 유전자의 서열과 다르다.
인위적으로 조작된 줄기세포 3 - 엔지니어링 된 HIF1AN의 특징
상기 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자는 야생형의 HIF1AN 유전자와 다른 서열을 가지는 것을 특징으로 한다. 상기 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자는 엔지니어링 되지 않은 야생형의 HIF1AN 유전자가 발현하는 물질을 발현하지 못할 수 있다. 상기 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자는 야생형의 HIF1AN 유전자가 발현하는 물질을 야생형의 유전자에 비해 더 적게 발현할 수 있다. 이때, 상기 야생형의 HIF1AN 유전자가 발현하는 물질은 FIH-1 단백질일 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자는 야생형의 HIF1AN 유전자의 돌연변이(mutation) 형태일 수 있다. 이때, 상기 돌연변이 형태는 자연계에 이미 존재하는 돌연변이가 아닌, 인위적으로 생성된 돌연변이 일 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자는 이와 대응되는 야생형 HIF1AN 유전자가 넉아웃(knock-out) 된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자는 이와 대응되는 야생형 HIF1AN 유전자가 넉다운(knock-down) 된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자는 이와 대응되는 야생형 HIF1AN 유전자와 비교해 하나 이상의 뉴클레오타이드가 삽입, 결실, 치환, 및/또는 역위된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자는 이와 대응되는 야생형 HIF1AN 유전자 내에 인델을 포함하는 것일 수 있다. 이때, 상기 인델은 세포 내의 NHEJ(Non-homologous end joining) 메커니즘에 의해 발생하는 것으로, 상기 NHEJ 메커니즘에 의해 상기 야생형 유전자 내의 하나 이상의 뉴클레오타이드가 삽입, 결실, 및/또는 치환될 수 있다. 이때, 상기 "유전자 내에 인델을 포함한다"는 표현은 상기 야생형 유전자 내의 하나 이상의 뉴클레오타이드가 삽입, 결실, 및/또는 치환된 것, 및/또는 그 결과물을 일컫는다.
예를 들어, 야생형의 A 유전자 내에 인델을 포함하는, 엔지니어링 된 A 유전자는 상기 야생형의 A 유전자의 임의의 위치에 하나 이상의 뉴클레오타이드가 삽입된 것일 수 있다. 또 다른 예를 들어, 야생형의 A 유전자 내에 인델을 포함하는, 엔지니어링 된 A 유전자는 상기 야생형의 A 유전자 내 임의의 위치의 하나 이상의 뉴클레오타이드가 결실된 것일 수 있다. 또 다른 예를 들어, 야생형의 A 유전자 내에 인델을 포함하는, 엔지니어링 된 A 유전자는 상기 야생형의 A 유전자 내 임의의 위치의 하나 이상의 뉴클레오타이드가 다른 것으로 치환된 것일 수 있다.
인위적으로 조작된 줄기세포 4 - 엔지니어링 된 HIF1AN 영역
상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 HIF1 단백질의 전사, 발현, 및/또는 활성을 저해하는 물질을 발현하는 야생형 HIF1AN 유전자가 인위적으로 편집된 것을 특징으로 하며, 이는 상기 야생형 HIF1AN 유전자 내의 하나 이상의 영역이 엔지니어링 된 것을 의미한다. 이때, 상기 야생형 HIF1AN 유전자 내의 엔지니어링 된 영역은 상기한 목적을 달성할 수 있는 영역이라면 특별히 제한되지 않는다.
일 구현예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 상기 야생형 HIF1AN 유전자 내 엑손 영역, 인트론 영역 및/또는 조절 영역이 편집된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 야생형 HIF1AN 유전자의, 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, ??, 및 엑손 N에서 선택된 하나 이상의 영역이 인위적으로 편집된, 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자를 포함할 수 있다. 이때, 상기 N은 임의의 정수이다. 일 구현예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 야생형 HIF1AN 유전자의, 인트론 1, 인트론 2, 인트론 3, 인트론 4, 인트론 5, ??, 및 인트론 M에서 선택된 하나 이상의 영역이 인위적으로 편집된, 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자를 포함할 수 있다. 이때, 상기 M은 임의의 정수이다.
일 구현예로, 상기 세포는 야생형의 HIF1AN 유전자 내의 엑손 1 영역이 인위적으로 편집된, 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자를 포함할 수 있다.
인위적으로 조작된 줄기세포 5 - 엔지니어링 된 HIF1AN 서열 예시
일 구현예로, 본 명세서에서 제공하는 인위적으로 조작된 줄기세포는 HIF1AN 유전자 내 서열번호 1 내지 9에서 선택된 하나 이상의 서열이 인위적으로 편집된 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자를 포함하고, 상기 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자의 서열은 서열번호 1 내지 9에서 선택된 하나 이상의 서열을 포함하지 않을 수 있다. 달리 표현해, 상기 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자의 서열 중 서열번호 1 내지 9에서 선택된 하나 이상의 서열과 일치하는 서열은 존재하지 않을 수 있다.
인위적으로 조작된 줄기세포 6 - 엔지니어링 된 HIF1AN의 발현 산물
본 명세서에서 개시하는 인위적으로 조작된 줄기세포는, HIF1 단백질의 발현을 저해하는 물질을 발현하는 야생형 HIF1AN 유전자가 인위적으로 조작되어, 상기 야생형 HIF1AN 유전자가 발현하는 물질을 발현하지 못하거나, 더 적게 발현하는 것을 특징으로 한다. 따라서, 상기 세포는 HIF1 단백질의 발현을 저해하는 물질(negative regulator of HIF1 expression)의 발현량이 야생형의 세포보다 감소되어 있다. 이때, 상기 HIF1 단백질의 발현을 저해하는 물질(negative regulator of HIF1 expression)은 FIH-1 단백질일 수 있다.
일 구현예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 야생형 HIF1AN 유전자 내에 인델을 가지는, 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자를 가지는 것을 특징으로 하며, 상기 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자에서 발현되는 mRNA의 서열은 상기 야생형 HIF1AN 유전자에서 발현되는 mRNA의 서열과 상이할 수 있다. 일 구현예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 야생형 HIF1AN 유전자 내에 인델을 가지는, 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자를 가지는 것을 특징으로 하며, 상기 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자에서 발현되는 mRNA의 서열은 상기 야생형 HIF1AN 유전자에서 발현되는 mRNA의 서열과 동일하고, 이때, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포 내에서, 상기 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자에서 발현되는 mRNA의 발현 수준은 야생형 세포 내의, 야생형 HIF1AN 유전자에서 발현되는 mRNA의 발현 수준에 비해 더 낮을 수 있다.
일 구현예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 HIF1AN 유전자로부터 발현되는 mRNA 양이 감소된 세포일 수 있다. 일 구현예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포 내에서, HIF1AN 유전자로부터 발현되는 mRNA의 발현 수준은 야생형 세포에 비해 더 낮을 수 있다.
일 구현예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 HIF1AN 유전자 내에 인델을 가지는, 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자를 포함할 때, 상기 세포 내 포함된 HIF1AN으로부터 발현되는 mRNA 및/또는 FIH-1의 농도는 야생형 세포 내 포함된 농도보다 더 낮을 수 있다. 일 구현예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 HIF1AN 유전자 내에 인델을 가지는, 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자를 포함할 때, 상기 세포 내 HIF1AN으로부터 발현되는 mRNA 및/또는 FIH-1의 발현 수준은 야생형 세포 내 발현 수준보다 더 낮을 수 있다.
인위적으로 조작된 줄기세포 7 - 엔지니어링 된 HIF1AN의 발현 산물 관련 정량 지표 예시
일 구현예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 야생형 HIF1AN 유전자로부터 발현되는 mRNA의 발현 수준이 야생형의 세포에 비해 약 0.9배, 약 0.85배, 약 0.8배, 약 0.75배, 약 0.7배, 약 0.65배, 약 0.6배, 약 0.55배, 약 0.5배, 약 0.45배, 약 0.4배, 약 0.35배, 약 0.3배, 약 0.25배, 약 0.2배, 약 0.15배, 약 0.10배, 약 0.05배, 약 0.04배, 약 0.03배, 약 0.02배, 또는 약 0.01배 이하일 수 있다. 일 구현예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 야생형의 세포와 비교해 바로 이전 문장에서 선택된 두 수치범위 내의 mRNA 발현 수준을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 야생형의 세포와 비교해 약 0.6배 내지 약 0.7배의 mRNA 발현 수준을 나타낼 수 있다.
일 구현예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 FIH-1 발현 수준이 야생형의 세포에 비해 약 0.9배, 약 0.85배, 약 0.8배, 약 0.75배, 약 0.7배, 약 0.65배, 약 0.6배, 약 0.55배, 약 0.5배, 약 0.45배, 약 0.4배, 약 0.35배, 약 0.3배, 약 0.25배, 약 0.2배, 약 0.15배, 약 0.10배, 약 0.05배, 약 0.04배, 약 0.03배, 약 0.02배, 또는 약 0.01배 이하일 수 있다. 일 구현예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 야생형의 세포와 비교해 바로 이전 문장에서 선택된 두 수치범위 내의 FIH-1 발현 수준을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 야생형의 세포와 비교해 약 0.6배 내지 약 0.7배의 FIH-1 발현 수준을 나타낼 수 있다.
인위적으로 조작된 줄기세포 8 - HIFα 단백질 발현 수준
본 명세서에서 개시하는 저산소 환경 하 높은 적응력을 가지는 세포는 세포 내 HIF1α 발현 수준이 높거나, HIF1α의 활성이 높게 나타난다.
일 구현예로, 상기 저산소 환경 하 높은 적응력을 가지는 세포는 야생형의 세포에 비해 HIF1α 발현 수준이 높을 수 있다. 이때, 상기 HIF1α 발현 수준은 세포 내 HIF1α의 양, 및/또는 농도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예로, 상기 저산소 환경 하 높은 적응력을 가지는 세포는 야생형의 세포에 비해 HIF1α의 활성이 높게 나타날 수 있다.
인위적으로 조작된 줄기세포 9 - HIFα 단백질 발현 수준 관련 정량 지표 예시
일 구현예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 HIF1α의 발현 수준이 야생형의 세포에 비해 약 1.1배, 약 1.2배, 약 1.3배, 약 1.4배, 약 1.5배, 약 1.6배, 약 1.7배, 약 1.8배, 약 1.9배, 약 2.0배, 약 2.1배, 약 2.2배, 약 2.3배, 약 2.4배, 약 2.5배, 약 2.6배, 약 2.7배, 약 2.8배, 약 2.9배, 또는 약 3.0배 이상일 수 있다. 일 구현예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 야생형의 세포와 비교해 바로 이전 문장에서 선택된 두 수치범위 내의 HIF1α 발현 수준을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 야생형의 세포와 비교해 약 1.1배 내지 약 1.5배의 HIF1α 발현 수준을 나타낼 수 있다.
일 구현예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 HIF1α의 활성 수준이 야생형의 세포에 비해 약 1.1배, 약 1.2배, 약 1.3배, 약 1.4배, 약 1.5배, 약 1.6배, 약 1.7배, 약 1.8배, 약 1.9배, 약 2.0배, 약 2.1배, 약 2.2배, 약 2.3배, 약 2.4배, 약 2.5배, 약 2.6배, 약 2.7배, 약 2.8배, 약 2.9배, 또는 약 3.0배 이상일 수 있다. 일 구현예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 야생형의 세포와 비교해 바로 이전 문장에서 선택된 두 수치범위 내의 HIF1α 활성 수준을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 야생형의 세포와 비교해 약 1.1배 내지 약 1.5배의 HIF1α 활성 수준을 나타낼 수 있다.
인위적으로 조작된 줄기세포 10 - 세포 배양 환경
일 구현예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 저산소환경에서 배양된 것 일 수 있다. 일 구현예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 in vitro 또는 in vivo 상의 저산소환경에서 pre-conditioning 된 것 일 수 있다. 이 때, 저산소환경에서 pre-conditioning 함으로써 저산소환경 하에서 더 높은 적응력 또는 생존력을 갖게될 수 있다.
인위적으로 조작된 줄기세포의 특징 1 - 저산소 환경 하 높은 생존율
본 명세서에서 개시하는 인위적으로 조작된 줄기세포는 저산소 환경에서 개선된 적응력, 또는 생존력을 보이는 것을 특징으로 한다. 이때, "저산소 환경"이란 낮은 농도의 산소(O2)를 포함하는 기체환경 하에 있는 것을 의미한다. 결과적으로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포가 살아있는 유기체(예를 들어, 인간)의 체내에 주입되는 경우, 개선된 적응력 또는 생존력을 보인다.
일 구현예로, 본 명세서에서 개시하는 인위적으로 조작된 줄기세포는 저산소 환경 하 야생형의 세포보다 더 오랜 기간 생존하는 것을 특징으로 한다.
인위적으로 조작된 줄기세포의 특징 2 - 저산소 환경 하 높은 생존율의 정량 지표 예시
일 구현예로, 상기 저산소 환경은 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 또는 약 21% 이하의 O2 퍼센트농도를 가지는 기체 환경을 의미할 수 있다. 일 구현예로, 상기 저산소 환경은 인위적으로 상기 저산소환경을 모방한(mimetic) 환경일 수 있다. 일 구현예로, 상기 저산소 환경은 H2O2를 처리하여 인위적으로 상기 저산소 환경에서 흔히 발생하는 산화적 스트레스(reactive oxidative stress; ROS)를 유도한 환경일 수 있다.
일 구현예로, 하나 이상의, 본 명세서에서 개시하는 인위적으로 조작된 줄기세포 및 야생형의 세포를 동일한 저산소 환경 하 일정 시간 두었을 때, 살아남은 상기 저산소 환경 하 높은 적응력을 가지는 세포의 수가 살아남은 상기 야생형의 세포의 수에 비해 약 1.01배, 약 1.02배, 약 1.03배, 약 1.04배, 약 1.05배, 약 1.06배, 약 1.07배, 약 1.08배, 약 1.09배, 약 1.1배, 약 1.15배, 약 1.2배, 약 1.25배, 약 1.3배, 약 1.35배, 약 1.4배, 약 1.45배, 약 1.5배, 약 1.55배, 약 1.6배, 약 1.65배, 약 1.7배, 약 1.75배, 약 1.8배, 약 1.85배, 약 1.9배, 약 1.95배, 약 2.0배, 약 2.1배, 약 2.2배, 약 2.3배, 약 2.4배, 약 2.5배, 약 2.6배, 약 2.7배, 약 2.8배, 약 2.9배, 약 3.0배, 약 4배, 약 5배, 또는 약 10배 이상일 수 있다. 일 구현예로, 상기 살아남은 인위적으로 조작된 줄기세포의 수는 상기 살아남은 야생형 세포의 수에 비해 바로 이전 문장에서 선택된 두 수치범위 이내의 숫자일 수 있다. 예를 들어, 상기 살아남은 인위적으로 조작된 줄기세포의 수는 상기 살아남은 야생형 세포 수의 약 1.5배 내지 약 2.5배일 수 있다.
일 구현예로, 상기 일정 시간은 약 10분, 약 30분, 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 8시간, 약 12시간, 약 24시간, 약 48시간, 약 72시간, 약 98시간, 약 120시간, 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 또는 약 한 달 이상의 기간일 수 있다. 일 구현예로, 상기 일정 시간은 바로 이전 문장에서 선택된 두 수치범위 이내의 기간일 수 있다. 예를 들어, 상기 일정 시간은 약 3시간 내지 약 12시간일 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체
일 구현예로, 본 명세서에서 제공하는 알츠하이머 병 치료용 약학적 조성물은 상기 인위적으로 조작된 줄기세포 외에 약학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 약학적으로 허용되는 담체는 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일, 식염수, PBS(phosphate buffered saline) 및/또는 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
약학적 조성물의 제제
일 구현예로, 상기 약학적 조성물은 비경구 투여 형태로 제형화 될 수 있다. 이때, 비경구 투여는 비강 투여, 점안 투여, 정맥 내 주입, 근육 주입, 복강주입, 경피 투여, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사, 뇌조직 내 주사, 해마(hippocampus) 내 주사, caudate putamen(CPu) 내 주사, 관절 내 주사, 연골 내 주사 또는 흉부 내 주입하는 방법 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현예로, 상기 약학적 조성물을 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 유효 성분인 세포를 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조할 수 있다. 더 나아가 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 일 구현예로, 상기 약학적 조성물은 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또 는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화 할 수 있다.
알츠하이머 병 치료용 약학적 조성물의 장점
본 명세서에서 제공하는 알츠하이머 병 치료용 약학적 조성물은 일반적으로 뇌 조직에 직접, 간접적으로 투여하는 방식으로 사용된다. 이때, 상기 약학적 조성물의 유효성분인 줄기세포는 상기 뇌 조직 내에서 저산소 환경에 처하게 된다. 따라서, 일반적인 줄기세포의 경우, 저산소 환경 내에서 쉽게 사멸하게 되므로, 알츠하이머 병 치료 용도로 사용되더라도 치료 효과를 보는 것이 힘들다.
이와 비교할 때, 본 발명에서 제공하는 알츠하이머 병 치료용 약학적 조성물의 유효성분인 조작된 줄기세포는 저산소 환경에서 더 잘 생존할 수 있는 것이 특징이므로, 뇌 조직에 투여되었을 때 더 오래 살아남아 의도하는 치료 효과를 낼 수 있는 것이 장점이다.
약학적 조성물의 용도
상기 약학적 조성물은 알츠하이머 병의 예방, 증상 완화, 및/또는 치료용 용도로 사용될 수 있다.
알츠하이머 병 치료 방법
개괄
본 명세서에서는 인위적으로 조작된 줄기세포, 또는 상기 인위적으로 조작된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 사용한 알츠하이머 병 치료 방법을 제공한다. 상기 알츠하이머 병 치료 방법은 상기 인위적으로 조작된 줄기세포, 또는 상기 인위적으로 조작된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함한다. 상기 인위적으로 조작된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물이 대상에게 투여되는 경우, 투여 부위의 저산소 환경에서 오랜 기간 생존하면서 현저한 치료효과를 제공할 수 있다.
일 구현예로, 상기 알츠하이머 병 치료 방법은 대상 내에 인위적으로 조작된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 대상은 인간 및/또는 동물일 수 있다. 일 구현예로, 상기 약학적 조성물의 투여는 상기 대상의 뇌 조직에 약학적 조성물을 직접 주입하는 것일 수 있다. 이때, 상기 뇌 조직은 해마 또는 CPu(caudate putamen)일 수 있다.
알츠하이머 병 치료용 약학적 조성물
상기 알츠하이머 병 치료 방법은 대상 내에 인위적으로 조작된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 이때, 상기 약학적 조성물은 "알츠하이머 병 치료용 약학적 조성물" 단락에서 설명된 것과 동일한 것이다.
투여 대상
상기 알츠하이머 병 치료 방법은 알츠하이머 병을 앓고 있는 인간, 및/또는 동물을 투여 대상으로 한다.
일 구현예로, 상기 알츠하이머 병 치료 방법은 상기 인위적으로 조작된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 인간 및/또는 동물에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 알츠하이머 병 치료 방법은 상기 인위적으로 조작된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 인간에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 알츠하이머 병 치료 방법은 상기 인위적으로 조작된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 알츠하이머 병에 걸린 인간에 투여하는 것을 포함할 수 있다.
투여 부위 및 방법
상기 인위적으로 조작된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 대상에 비경구 투여될 수 있다. 일 구현예로, 상기 알츠하이머 치료 방법은 상기 인위적으로 조작된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 정맥 내 주입, 근육 주입, 복강주입, 경피 투여, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사, 뇌조직 내 주입, 해마(hippocampus) 내 주입, 및/또는 caudate putamen(CPu) 내 주입하는 방법으로 대상에 투여하는 과정을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 알츠하이머 치료 방법은 상기 인위적으로 조작된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 대상의 뇌조직, 해마(hippocampus), 및/또는 caudate putamen(CPu)에 직접 주입(injection)하는 것을 포함할 수 있다.
투여량
일 구현예로, 상기 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
병용 치료 방법 예시
일 구현예로, 상기 약학적 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료, 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법, 및/또는 항체 치료방법과 병용하여 사용할 수 있다.
알츠하이머 병 치료 방법 수행 결과
상기 알츠하이머 병 치료 방법 수행 결과, 대상의 뇌 조직에 축 적된 아밀로이드 베타의 양이 감소될 수 있다. 이때, 상기 아밀로이드 베타는 insoluble 또는 soluble 아밀로이드 베타일 수 있다. 그 결과 상기 알츠하이머 병 치료 방법 수행 결과, 대상의 알츠하이머 병의 증상이 완화되거나, 알츠하이머 병의 증상이 개선되거나, 알츠하이머 병의 진행 속도가 완화되거나, 및/또는 알츠하이머 병이 치료될 수 있다.
알츠하이머 병 치료용 약학적 조성물 제조 방법
개괄
이하, 본 명세서에서 개시하는 인위적으로 조작된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법을 설명한다. 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 줄기세포 유전자 조작용 조성물을 줄기세포 내에 도입함으로써 제조될 수 있으며, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포에 약학적으로 허용되는 담체를 첨가하거나, 적절한 어쥬번트(adjuvant)를 추가하거나, 및/또는 제형화 내지 제제화하여 인위적으로 조작된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제조할 수 있다.
줄기세포 유전자 조작용 조성물
본 명세서에서는 상기 인위적으로 조작된 줄기세포를 제조하기 위해 사용할 수 있는, CRISPR/Cas9 시스템을 포함하는 조성물을 개시한다. 상기 CRISPR/Cas9 시스템을 포함하는 조성물은 상기 인위적으로 조작된 줄기세포의 유전자형, 및/또는 표현형을 나타낼 수 있도록, 적합한 세포 내 표적 서열을 인지하고 이를 편집할 수 있도록 설계된 것이다.
일 구현예로, 상기 줄기세포 유전자 조작용 조성물은 Cas9 단백질 또는 이를 암호화하는 DNA, 및 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 DNA를 포함할 수 있다. 이때, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 유래 Cas9 단백질일 수 있다. 이때, 상기 가이드 RNA의 서열은 서열번호 22 내지 30으로 이뤄진 군에서 선택된 서열일 수 있다.
인위적으로 조작된 줄기세포 제조 방법
본 명세서에서는 상기 인위적으로 조작된 줄기세포를 제조하는 방법을 개시한다. 상기 인위적으로 조작된 줄기세포를 제조하는 방법 상기 줄기세포 유전자 조작용 조성물을 줄기세포 내에 도입하는 과정을 포함한다.
일 구현예로, 상기 유전자 조작 방법은 생체외(in vitro)에서, 유기체에서 분리된 줄기세포에 대해(ex vivo) 수행될 수 있다. 이때, 상기 유기체는 인간 또는 동물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포 제조 방법은 줄기세포 유전자 조작용 조성물을 줄기세포 내로 도입하는 것을 포함할 수 있다. 이때, 상기 줄기세포 유전자 조작용 조성물은 "줄기세포 유전자 조작용 조성물" 단락에서 설명된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포 제조 방법은, Cas9 단백질 및 가이드 RNA가 결합된 리보뉴클레오프로틴(ribonucleoprotein; RNP)을 포함하는 줄기세포 유전자 조작용 조성물을 줄기세포 내에 도입하는 것을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포 제조 방법은, Cas9 단백질을 암호화하는 DNA 및 가이드 RNA를 암호화하는 DNA가 단일 벡터 형태로 포함된 줄기세포 유전자 조작용 조성물을 줄기세포 내에 도입하는 것을 포함할 수 있다.
알츠하이머 병 치료용 약학적 조성물 제형화 및 제제화 - 공지된 방법 사용 가능
상기 인위적으로 조작된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머 병 치료용 약학적 조성물을 제조하기 위해, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포에 약학적으로 허용되는 담체를 첨가하거나, 적절한 어쥬번트(adjuvant)를 추가하거나, 및/또는 제형화 내지 제제화 할 수 있다. 이때, 상기 유효성분에 적절한 물질을 첨가하거나 추가하고, 또 적절히 처리하여 약학적 조성물을 만드는 방법은, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포의 알츠하이머 병 치료 효과를 해치지 않는 방법이라면 특별히 제한되지 않는다. 일 구현예로, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포에 약학적으로 허용되는 담체를 첨가하거나, 적절한 어쥬번트(adjuvant)를 추가하거나, 및/또는 제형화 내지 제제화하여 약학적 조성물을 제조하기 위해 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있다.
실험예
이하, 실험예 및 실시예를 통해 본 명세서가 제공하는 발명에 대해 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 명세서에 의해 개시되는 내용을 예시하기 위한 것으로, 본 명세서에 의해 개시되는 내용의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험예 1 HIF1AN 넉아웃된 MSC의 제조
실험예 1-1 중간엽 줄기세포 배양
인간 와튼 젤리로부터 유래한 MSC는 삼성서울병원 내 GMP (Good Manufacturing Practice) 시설에서 공급받아 사용하였다. MSC는 10% FBS(fetal bovine serum, Gibco) 및 Gentamicin 0.05 mg/mL (Thermo Fisher Scientific) 이 포함되어 있는 MEM alpha 1x media (Gibco, Rockville, MD) 배지를 37℃및 5% CO2 조건하에서 배양하였다.
실험예 1-2 가이드 RNA 제조
RNA는 MEGA short script T7 kit (Ambion)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 생체 외 전사하였다. sgRNA에 대한 주형 (template)은 두 상보적인 올리 고 뉴클레오티드의 결합 (annealing) 및 신장 (extension)을 통해 제조하였다. gRNA의 가이드 도메인 서열은 아래 표 1에 나타나있다.
[표 1]
상기 각각의 가이드 도메인과 연결된 뉴클레오타이드(crRNA 반복 서열, 링커(GAAA), 및 tracrRNA)의 서열은 서열번호 19이다. 상기 sgRNA의 전장 서열은 아래 표 2에 나타나있다.
[표 2]
실험예 1-3 CRISPR/Cas9 시스템의 MSC 내로의 형질도입 (Transfection)
MSC는 제조사의 지침에 따라 Program EW-104를 이용하여 Amaxa P1 Primary Cell 4D Nucleofector kit로 형질도입 하였다. 구체적으로, 4 x 105 개의 세포에 생체 외 전사된 sgRNA (4μg)와 함께 미리 혼합된 Cas9 단백질 (4μg)을 상온에서 10분동안 인큐베이션한 후 형질도입 하였다.
실험예 1-4 표적화 딥시퀀싱 (Targeted deep sequencing)
Phusion polymerase (New England BioLabs)를 이용하여 표적 및 잠 재적인 비표적 위치를 포괄하는 유전체 DNA 절편 (segment)을 증폭시켰다. Illumina MiSeq를 이용하여 상기 PCR 앰플리콘 산물을 쌍-말단 서열분석 (paired￢end sequencing)하였다.
이러한 결과를 통해, CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 성공적으로 HIF1AN 서열 내 인위적으로 인델(indel)을 도입시켰음을 확인하였다(도 1 및 도 2).
실험예 2 HIF1AN 넉아웃된 MSC의 생존율 (Viability) 측정
실험예 1에서 수득한 상기 HIF1AN 넉아웃된 MSC가 생존율 (viability)을 가지는지 확인하기 위해서, 저산소의 상황에서 흔히 발생하는 산화적 스트레스(reactive oxidative stress; ROS)로부터 MSC의 증식 능력 변화를 측정하였다. 산화적 스트레스 반응을 유도하는 H2O2(hydrogen peroxide)를 처리하기 24시 간 전 96 well plate의 각 well에 1Х104의 세포로 배양하였다. 24시간 후에 serum free 배지에 500 μM의 H2O2를 첨가하여 배양하였다. H2O2처리 72시간 후 세포의 생존율을 보기 위해 CCK-8 cell proliferation kit (Dojindo, Japan )를 이용하여 세포의 생존율을 측정하였다(도 4). 그 결과, 산화적 스트레스 반응을 유도하는 H2O2 (hydrogen peroxide)를 처리한 환경에서 상기 HIF1AN이 넉아웃된 MSC가 대조군보다 생존율이 향상되었음을 확인하였다.
실험예 3 HIF1AN 넉아웃(K/O)된 MSC의 알츠하이머 치료 효과
실험예 3-1 정상 마우스에 대해 MSC 투여
마우스 뇌 내부에 MSC 투여 후, 대조군과 HIF1AN K/O 줄기세포의 뇌내 잔존량 차이를 확인하고자 실험을 수행하였다. 동물 모델로서는 정상 마우스 (C57BL/6, 7-8 주령)를 사용하였다. 먼저, 2 Х 105 세포 수 (2 Х 105/5μL)의 인간 유래 중간엽 줄기세포를 정상 마우스의 해마에 투여하였다. Stereotaxic기기 (Harvard apparatus, USA) 를 이용하여, bregma를 기준으로 좌표를 잡은 후 (A/P -2.06 mm, M/L -1.3 mm, and D/V -2.0 mm) 0.5 μL/min 속도로 왼쪽 해마에 투여하였다. 대조군으로는 유전자 편집기술을 사용하지 않은 줄기세포 (naive MSC)와 유전자 편집 기술을 적용하되 타겟 유전자가 없는 줄기세포 (AAVS1 MSC)를 투여하였다.
실험예 3-2 정상 마우스에 투여한 세포의 잔존량 측정
투여 1주일 후에, 정상 마우스를 관동맥 관류로 안락사 시킨 후, 뇌를 적출하였다. 적출된 뇌조직을 균질기(homogenizer)를 사용해 파쇄한 후, Gentra puregene kit (QIAGEN, USA)를 사용하여 genomic DNA를 추출하였다. 마우스 뇌조직에서 인간 유래 줄기세포의 잔존량을 확인하기 위해 인간 특이적 DNA sequence를 검출할 수 있는 ALU element를 이용하여 real time PCR을 진행하였다. Primer 정보는 다음과 같다: ALU forward: 5' - CAT GGT GAA ACC CCG TCT CTA - 3' (서열번호 31), ALU reverse: 5' - GCC TCA GCC TCC CGA GTA G -3' (서열번호 32). Primer와 SYBR green master mix (Life Technologies, USA)를 섞은 혼합액에 각 샘플 DNA를 20ng씩 넣고 real time PCR을 진행하였다. PCR 조건은 다음과 같다: 총 40 cycles, 95°C (10 분), 95°C (15 초), 68°C (30 초), and 72°C (30 초).
그 결과 naive 그리고 AAVS1 대조군에 비해 HIF1AN K/O 줄기세포의 잔존량이 각각 8.9그리고 7.6배 더 높았다 (도 6).
실험예 3-3 알츠하이머 병 마우스 모델에 MSC 투여
마우스 뇌 내부에 MSC 투여 후, 대조군에 비해 HIF1AN K/O 줄기세포의 뇌내 잔존량 차이를 확인하고자 실험을 수행하였다. 동물 모델로서는 알츠하이머 병 마우스(5xFAD, 7-8 개월령)를 사용하였다. 먼저, 2 Х 105세포 수 (2 Х 105/5μL)의 인간 유래 중간엽 줄기세포를 알츠하이머 병 마우스인 5xFAD의 해마에 투여하였다. Stereotaxic기기 (Harvard apparatus, USA)를 이용하여, bregma를 기준으로 좌표를 잡은 후 (A/P -2.06 mm, M/L ±1.3 mm, and D/V -2.0 mm) 0.5 μL/min 속도로 왼쪽 및 오른쪽 해마에 투여하였다. 대조군으로는 유전자 편집기술을 사용하지 않은 줄기세포 (naive MSC)와 유전자 편집 기술을 적용하되 타겟 유전자가 없는 줄기세포 (AAVS1 MSC)를 투여하였다.
실험예 3-4 알츠하이머 병 마우스 모델에 투여한 세포의 잔존량 측정
투여 2주일 후에, 5xFAD 마우스를 관동맥 관류로 안락사 시킨 후, 뇌를 적출하였다. 적출된 뇌조직을 균질기 (homogenizer)를 사용해 파쇄한 후, Gentra puregene kit (QIAGEN, USA)를 사용하여 genomic DNA를 추출하였다. 마우스 뇌조직에서 인간 유래 줄기세포의 잔존량을 확인하기 위해 인간 특이적 DNA sequence를 검출할 수 있는 ALU element를 이용하여 real time PCR을 진행하였다. Primer 정보는 다음과 같다: ALU forward: 5' - CAT GGT GAA ACC CCG TCT CTA - 3' (서열번호 31), ALU reverse: 5' - GCC TCA GCC TCC CGA GTA G -3' (서열번호 32). Primer와 SYBR green master mix (Life technologies, USA)를 섞은 혼합액에 각 샘 플 DNA를 20ng씩 넣고 real time PCR을 진행하였다. PCR 조건은 다음과 같다: 총 40 cycles, 95°C (10 분), 95°C (15 초), 68°C (30 초), and 72°C (30 초).
그 결과 naive 그리고 AAVS1 대조군에 비해 HIF1AN K/O 줄기세포의 잔존량이 더 높았다 (도 7).
실험예 3-5 알츠하이머 병 마우스 모델에서 HIF1AN K/O 줄기세포의 치료 효과 분석
상기 실험예 3-3과 동일한 방법으로 줄기세포를 알츠하이머 병 마우스 해마에 투여한 뒤, 2주일 후에 알츠하이머 병 마우스를 관동맥 관류로 안락사 시킨 후, 뇌를 적출하였다. 적출된 뇌조직은 약사발을 사용해 파쇄한 후, soluble 단백질을 추출하였다. Soluble 단백질을 추출하기 위해 파쇄한 뇌조직을 homogenization buffer (20mM Tris pH 7.4, 250 mM sucrose, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1Хprotease inhibitor cocktail)에 용해한 후 4°C 10,000 g에 1시간 동안 원심 분리를 하였다. 위 상층액을 따로 분리하여 soluble 단백질 검출에 사용하였다. A
Figure 112021005229858-pat00010
42 ELISA Kit (Thermo Scientific, USA)를 사용하여 각 샘플에서 아밀로이드 단백질의 발현 차이를 확인하였다. Soluble A
Figure 112021005229858-pat00011
발현 여부를 확인하기 위해 각 샘플을 2μg 사용하였다.
그 결과, 대조군 (naive/AAVS1)에 비해 HIF1AN K/O 줄기세포를 투여 한그룹에서 soluble A
Figure 112021005229858-pat00012
발현이 유의미하게 감소하였다(도 8).
이러한 결과들을 통해, HIF1AN K/O 줄기세포는 저산소환경 하에서 향상된 생존능을 보임을 확인하였고, 뇌조직에 투여하는 경우 아밀로이드 베타의 양이 유의미하게 감소함을 확인하여 알츠하이머 병 치료 효과가 있음을 확인하였다. 알츠하이머 병에 대해서는 아직 제대로 된 세포치료제가 없는 바, 앞으로 본 출원에서 개시된 발명은 당업계에서 알츠하이머 병 증상완화 또는 치료제로서 유용할 것이다.
<110> Toolgen INC. SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION(KR) <120> Pharmaceutical composition for treating Alzheimer's disease and use thereof <130> OPP20-081-PCT <150> KR 10-2020-004615 <151> 2020-01-14 <160> 32 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> protospacer of HIF1AN with PAM <400> 1 gaagctataa ctgcgcaact ggg 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> protospacer of HIF1AN with PAM <400> 2 ggaagctata actgcgcaac tgg 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> protospacer of HIF1AN with PAM <400> 3 gcagttatag cttcccgact agg 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> protospacer of HIF1AN with PAM <400> 4 gacgcggaat gggcctagtc ggg 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> protospacer of HIF1AN with PAM <400> 5 agacgcggaa tgggcctagt cgg 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> protospacer of HIF1AN with PAM <400> 6 ctctgactca gacgcggaat ggg 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> protospacer of HIF1AN with PAM <400> 7 gggtcgctct gactcagacg cgg 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> protospacer of HIF1AN with PAM <400> 8 gtctgagtca gagcgacccc cgg 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> protospacer of HIF1AN with PAM <400> 9 caataagctc ctctgcccgg ggg 23 <210> 10 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA guide domain for HIF1AN <400> 10 gaagcuauaa cugcgcaacu 20 <210> 11 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA guide domain for HIF1AN <400> 11 ggaagcuaua acugcgcaac 20 <210> 12 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA guide domain for HIF1AN <400> 12 gcaguuauag cuucccgacu 20 <210> 13 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA guide domain for HIF1AN <400> 13 gacgcggaau gggccuaguc 20 <210> 14 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA guide domain for HIF1AN <400> 14 agacgcggaa ugggccuagu 20 <210> 15 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA guide domain for HIF1AN <400> 15 cucugacuca gacgcggaau 20 <210> 16 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA guide domain for HIF1AN <400> 16 gggucgcucu gacucagacg 20 <210> 17 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA guide domain for HIF1AN <400> 17 gucugaguca gagcgacccc 20 <210> 18 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA guide domain for HIF1AN <400> 18 caauaagcuc cucugcccgg 20 <210> 19 <211> 83 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA scaffold sequence for SpCas9 <400> 19 gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60 ggcaccgagt cggtgctttt ttt 83 <210> 20 <211> 67 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA sequence for SpCas9 <400> 20 uagcaaguua aaauaaggcu aguccguuau caacuugaaa aaguggcacc gagucggugc 60 uuuuuuu 67 <210> 21 <211> 12 <212> RNA 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cucugcccgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ALU <400> 31 catggtgaaa ccccgtctct a 21 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ALU <400> 32 gcctcagcct cccgagtag 19

Claims (6)

  1. 인위적으로 조작된 인간 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머 병 치료용 약학적 조성물로,
    상기 인위적으로 조작된 인간 줄기세포는 다음을 포함함:
    야생형 HIF1AN 유전자 내에 인델을 가지는 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자,
    이때, 상기 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자의 서열은 상기 야생형 HIF1AN 유전자의 서열과 다르고,
    이때, 상기 조작된 인간 줄기세포 내에서, FIH-1의 발현 수준은 야생형 인간 세포에 비해 더 낮은 것을 특징으로 하고,
    상기 조작된 인간 줄기세포 내에서, HIFα의 발현 수준은 상기 야생형 인간 세포에 비해 더 높은 것을 특징으로 하고,
    상기 조작된 인간 줄기세포는 저산소 환경 하 야생형 인간 세포에 비하여 생존율 (viability)이 높다는 것을 특징으로 함.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자가 가진 인델은 상기 야생형 HIF1AN 유전자의 엑손 1 영역에 위치하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 인위적으로 조작된 줄기세포는 인위적으로 조작된 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 뇌조직 투여용 제형인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 뇌조직은 해마 또는 CPu(caudate putamen)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. 인위적으로 조작된 인간 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머 병 치료용 약학적 조성물로,
    상기 인위적으로 조작된 인간 줄기세포는 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자를 포함하고,
    이때, 상기 엔지니어링 된 HIF1AN 유전자의 서열은 서열번호 1 내지 9로 이뤄진 군에서 선택된 하나 이상의 서열을 포함하지 않고,
    상기 조작된 인간 줄기세포 내에서, FIH-1의 발현 수준은 야생형 인간 세포에 비해 더 낮은 것을 특징으로 하고,
    상기 조작된 인간 줄기세포 내에서, HIFα의 발현 수준은 상기 야생형 인간 세포에 비해 더 높은 것을 특징으로 하고,
    상기 조작된 인간 줄기세포는 저산소 환경 하 야생형 인간 세포에 비하여 생존율 (viability)이 높다는 것을 특징으로 함.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5993113B2 (ja) * 2011-01-31 2016-09-14 株式会社 バイオミメティクスシンパシーズ アルツハイマー病治療に向けたヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞
CN110066775B (zh) 2012-10-23 2024-03-19 基因工具股份有限公司 用于切割靶dna的组合物及其用途
JP2020519306A (ja) * 2017-04-26 2020-07-02 エヌセイジ コーポレーション ｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞を含むアルツハイマー病の予防または治療用薬学組成物
JP2020536501A (ja) * 2017-09-28 2020-12-17 ツールゲン インコーポレイテッドＴｏｏｌｇｅｎ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ 遺伝子発現調節のための人為的なゲノム操作

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Aging Cell. 2007. Vol.6, pp.745-757.*
Current Medicinal Chemistry. 2011. Vol.18, No.28, pp.4335-4343.*
Journal of Biological Chemistry. 2018. Vol.293, No.40, pp.15370-15380.*

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