JP2020519306A - ｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞を含むアルツハイマー病の予防または治療用薬学組成物 - Google Patents

Abstract

可溶性ＲＡＧＥを分泌する幹細胞およびそのアルツハイマー病の予防および／または治療のための医薬用途が提供される。【選択図】図２ｇ

Description

ｓＲＡＧＥ−分泌幹細胞（ｓＲＡＧＥ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）およびそのアルツハイマー病の予防および／または治療のための医薬用途が提供される。

アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；ＡＤ）は最も多く発生する神経退行性疾患であり、後期疾病段階では他の症状が優勢であるが、主に認知症の症状を示す。ＡＤ患者の脳の主な神経病理学的な特徴は、細胞内神経原線維のもつれ（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅｓ）およびベータアミロイド（Ａβ）からなる細胞外アミロイドプラークの存在である。Ａβはアミロイド前駆体タンパク質の切断に由来し、約３９〜４３個アミノ酸長さのポリペプチドである。Ａβ_１−４０は体液（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄｓ）内の主要可溶性Ａβ種類（ｓｏｌｕｂｌｅ Ａβ ｓｐｅｃｉｅｓ）であり、Ａβ_１−４２（少数の可溶性種類）はＡβ_１−４０よりｆｉｂｒｉｌｌｏｇｅｎｉｃでありＡＤの発病機構に重要な役割を果たす。

本明細書で、Ａβ_１−４２注入されたＡＤラットモデルでの、ＲＡＧＥ発現抑制を通じた、遺伝子編集技術によって製造されたｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞およびそのＡβ_１−４２注入されたアルツハイマー病（ＡＤ）ラットモデルでのＲＡＧＥ発現抑制効果およびこれを通じたアルツハイマー病治療用途が提案される。

一例は、可溶性（ｓｏｌｕｂｌｅ）の最終糖化産物受容体（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ；ＲＡＧＥ）（ｓＲＡＧＥ）を分泌する幹細胞を提供する。前記幹細胞は、ｓＲＡＧＥコード遺伝子を含む幹細胞であってもよく、例えば、遺伝子編集技術によってｓＲＡＧＥコード遺伝子が形質導入された幹細胞であってもよい。

他の例は、幹細胞にｓＲＡＧＥコード遺伝子を導入させる段階を含む、ｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞の製造方法を提供する。前記製造方法は、前記導入させる段階以後に、ｓＲＡＧＥコード遺伝子が導入された幹細胞を培養してｓＲＡＧＥを（前記幹細胞の内で）発現および／または（前記幹細胞の外に）分泌させる段階を追加的に含むことができる。

他の例は、ｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞を含むアルツハイマー病の予防および／または治療用薬学組成物を提供する。他の例は、ｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞のアルツハイマー病の予防および／または治療に使用するための用途を提供する。他の例は、アルツハイマー病の予防および／または治療を必要とする患者にｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞を投与する段階を含むアルツハイマー病の予防および／または治療方法を提供する。前記アルツハイマー病の予防および／または治療方法は、前記投与する段階以前に、アルツハイマー病の予防および／または治療を必要とする患者を確認する段階を追加的に含むことができる。

他の例は、ｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞を含む、アルツハイマー病患者でのＲＡＧＥリガンドおよび／または炎症性タンパク質の発現抑制用薬学組成物を提供する。他の例は、ｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞のアルツハイマー病患者でのＲＡＧＥリガンドおよび／または炎症性タンパク質の発現抑制に使用するための用途を提供する。他の例は、アルツハイマー病患者にｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞を投与する段階を含む、アルツハイマー病患者でのＲＡＧＥリガンドおよび／または炎症性タンパク質の発現抑制方法を提供する。

他の例は、ｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞を含む、アルツハイマー病患者でのＲＡＧＥ媒介神経細胞死滅および／または炎症の抑制用薬学組成物を提供する。他の例は、ｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞のアルツハイマー病患者でのＲＡＧＥ媒介神経細胞死滅および／または炎症抑制に使用するための用途を提供する。他の例は、アルツハイマー病患者にｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞を投与する段階を含む、アルツハイマー病患者でのＲＡＧＥ媒介神経細胞死滅および／または炎症の抑制方法を提供する。

アルツハイマー病（ＡＤ）は最も多く発生する神経退行性疾患であり、ベータアミロイド（Ａβ）の蓄積による神経細胞損失（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｌｏｓｓ）およびシナプス機能障害（ｓｙｎａｐｔｉｃ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）を誘発する。Ａβは、活性化小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）の活性化によって最終糖化産物受容体（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ；ＲＡＧＥ）リガンドの合成および分泌を促進し、ＡＤマウスモデルで神経細胞死滅を誘発する。一方、可溶性ＲＡＧＥ（ｓｏｌｕｂｌｅ ＲＡＧＥ；ｓＲＡＧＥ）は、炎症を減らし小膠細胞活性化およびＡβ沈着（Ａβ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）を減少させて、ニューロンの死滅を減少させる。しかし、ｓＲＡＧＥタンパク質の半減期は治療目的で使用するには過度に短い。本明細書で、Ａβ沈着を抑制しＡβ_１−４２誘導ＡＤモデルでＲＡＧＥリガンドの合成と分泌を減少させるｓＲＡＧＥ−分泌幹細胞（ｓＲＡＧＥ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ＭＳＣｓ）を提供する。また、ｓＲＡＧＥ−分泌幹細胞は、Ａβ_１−４２誘導ＡＤモデルでＲＡＧＥ／ＲＡＧＥリガンド結合を抑制することによって改善された生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）生存率および向上した保護効果を示した。このような結果はｓＲＡＧＥ−分泌幹細胞がアルツハイマー病でニューロンを保護する効果的な手段であるのを示し、このような保護効果はＲＡＧＥが媒介する細胞死滅や炎症の抑制に起因したものであるのを提案する。

一例は、可溶性（ｓｏｌｕｂｌｅ）の最終糖化産物受容体（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ；ＲＡＧＥ）（ｓＲＡＧＥ）を分泌する幹細胞を提供する。前記幹細胞は、ｓＲＡＧＥコード遺伝子を含む幹細胞であってもよく、例えば、遺伝子編集技術（例えば、遺伝子はさみなど）によってｓＲＡＧＥコード遺伝子が形質導入された幹細胞であってもよい。前記ｓＲＡＧＥコード遺伝子は前記幹細胞のゲノム内のセーフハーバー（ｓａｆｅ ｈａｒｂｏｒ）遺伝子部位に挿入でき、このために、前記遺伝子編集技術は前記セーフハーバー遺伝子を標的化してその部位を切断するように設計されたものであってもよい。

他の例は、幹細胞にｓＲＡＧＥコード遺伝子を導入させる段階を含む、ｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞の製造方法を提供する。前記製造方法は、前記導入させる段階以後に、ｓＲＡＧＥコード遺伝子が導入された幹細胞を培養してｓＲＡＧＥを（前記幹細胞の内で）発現および／または（前記幹細胞の外に）分泌させる段階を追加的に含むことができる。前記ｓＲＡＧＥコード遺伝子を導入させる段階は遺伝子編集技術（例えば、遺伝子はさみなど）によって行うことができ、先に説明したように、前記遺伝子編集技術はセーフハーバー遺伝子を標的化してその部位を切断するように設計されたものであってもよい。

他の例は、ｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞または前記幹細胞の培養物を含むアルツハイマー病の予防および／または治療用薬学組成物を提供する。他の例は、ｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞または前記幹細胞の培養物のアルツハイマー病の予防および／または治療に使用するための用途を提供する。他の例は、アルツハイマー病の予防および／または治療を必要とする患者にｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞または前記幹細胞の培養物を投与する段階を含むアルツハイマー病の予防および／または治療方法を提供する。前記アルツハイマー病の予防および／または治療方法は、前記投与する段階以前に、アルツハイマー病の予防および／または治療を必要とする患者を確認する段階を追加的に含むことができる。

前記ｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞（または前記幹細胞の培養物）またはこれを含む薬学組成物は、アルツハイマー病患者でのアミロイド前駆体タンパク質（ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＡＰＰ）および／またはベータサイトＡＰＰ切断酵素（ｂｅｔａ−ｓｉｔｅ ＡＰＰ ｃｌｅａｖｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ １；ＢＡＣＥ１）の発現抑制、ＲＡＧＥリガンドおよび／または炎症性タンパク質の発現抑制、および／またはＲＡＧＥ媒介神経細胞死滅および／または炎症の抑制活性を有することを特徴とする。

他の例は、ｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞を含む、アルツハイマー病患者でのアミロイド前駆体タンパク質（ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＡＰＰ）および／またはベータサイトＡＰＰ切断酵素（ｂｅｔａ−ｓｉｔｅ ＡＰＰ ｃｌｅａｖｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ １；ＢＡＣＥ１）の発現抑制用薬学組成物を提供する。他の例は、ｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞のアルツハイマー病患者でのアミロイド前駆体タンパク質（ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＡＰＰ）および／またはベータサイトＡＰＰ切断酵素（ｂｅｔａ−ｓｉｔｅ ＡＰＰ ｃｌｅａｖｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ １；ＢＡＣＥ１）の発現抑制に使用するための用途を提供する。他の例は、アルツハイマー病患者にｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞を投与する段階を含む、アルツハイマー病患者でのアミロイド前駆体タンパク質（ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＡＰＰ）および／またはベータサイトＡＰＰ切断酵素（ｂｅｔａ−ｓｉｔｅ ＡＰＰ ｃｌｅａｖｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ １；ＢＡＣＥ１）の発現抑制方法を提供する。

他の例は、ｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞を含む、アルツハイマー病患者でのＲＡＧＥリガンドおよび／または炎症性タンパク質の発現抑制用薬学組成物を提供する。他の例は、ｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞のアルツハイマー病患者でのＲＡＧＥリガンドおよび／または炎症性タンパク質の発現抑制に使用するための用途を提供する。他の例は、アルツハイマー病患者にｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞を投与する段階を含む、アルツハイマー病患者でのＲＡＧＥリガンドおよび／または炎症性タンパク質の発現抑制方法を提供する。前記ＲＡＧＥリガンドはＡＧＥ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ＨＭＧＢ１（Ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｂｏｘ １）、Ｓ１００βなどからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるのではない。

他の例は、ｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞を含む、アルツハイマー病患者でのＲＡＧＥ媒介神経細胞死滅および／または炎症の抑制用薬学組成物を提供する。他の例は、ｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞のアルツハイマー病患者でのＲＡＧＥ媒介神経細胞死滅および／または炎症抑制に使用するための用途を提供する。他の例は、アルツハイマー病患者にｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞を投与する段階を含む、アルツハイマー病患者でのＲＡＧＥ媒介神経細胞死滅および／または炎症の抑制方法を提供する。

以下、本発明をより詳しく説明する：
前記患者は、アルツハイマーを患っている人間、猿などの霊長類、ラット、マウスなどのげっ歯類を含む哺乳動物または前記哺乳動物から分離された細胞（脳細胞）または組織（脳組織）またはこれらの培養物の中から選択でき、例えば、アルツハイマー病を患っている人間またはこれから分離された脳細胞、脳組織またはこれらの培養物の中から選択できる。

本明細書で提供される有効成分であるｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞またはこれを含む薬学組成物は経口投与または非経口投与の多様な投与経路で投与対象に投与でき、例えば、アルツハイマー病患者の病変部位（例えば、脳）に注射（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、輸血（ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ）、挿入（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）または移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）のような、任意の便利な方式で投与されるか、血管投与（静脈投与または動脈投与）、などの投与経路で投与できるが、これに制限されるのではない。

本明細書で提供される薬学組成物は、通常の方法によって剤形化された、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾールなどの経口型剤形、または懸濁剤、油剤、凍結乾燥製剤、外用剤、坐剤、滅菌注射溶液、移植用製剤などの非経口用剤形などに剤形化して使用できる。

本発明の組成物使用量は治療対象の年齢、性別、体重によって異にすることができ、何よりも、治療対象個体の状態、治療対象癌の特定のカテゴリーまたは種類、投与経路、使用される治療剤の属性、および前記特定の治療剤に対する感受性に依存的であり、これを考慮して適切に処方できる。例えば、前記幹細胞はアルツハイマー病患者の体重１ｋｇ当り１×１０^３〜１×１０^９個、例えば、１×１０^４〜１×１０^８個または１×１０^５〜１×１０^７個の量で投与できるが、これに制限されるのではない。

前記ｓＲＡＧＥは、人間、猿などの霊長類、ラット、マウスなどのげっ歯類などを含む哺乳動物由来のｓＲＡＧＥであってもよく、一例で、人間ｓＲＡＧＥタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＰ＿００１１２７．１（遺伝子：ＮＭ＿００１１３６．４）［Ｑ１５１０９−１］、ＮＰ＿００１１９３８５８．１（遺伝子：ＮＭ＿００１２０６９２９．１）［Ｑ１５１０９−６］、ＮＰ＿００１１９３８６１．１（遺伝子：ＮＭ＿００１２０６９３２．１）［Ｑ１５１０９−７］、ＮＰ＿００１１９３８６３．１（遺伝子：ＮＭ＿００１２０６９３４．１）［Ｑ１５１０９−４］、ＮＰ＿００１１９３８６５．１（遺伝子：ＮＭ＿００１２０６９３６．１）［Ｑ１５１０９−９］、ＮＰ＿００１１９３８６９．１（遺伝子：ＮＭ＿００１２０６９４０．１）［Ｑ１５１０９−３］、ＮＰ＿００１１９３８８３．１（遺伝子：ＮＭ＿００１２０６９５４．１）［Ｑ１５１０９−８］、ＮＰ＿００１１９３８９５．１（遺伝子：ＮＭ＿００１２０６９６６．１）［Ｑ１５１０９−３］、ＮＰ＿７５１９４７．１（遺伝子：ＮＭ＿１７２１９７．２）［Ｑ１５１０９−２］など）などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるのではない。

前記幹細胞は胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、成体幹細胞（ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳ ｃｅｌｌｓ）、および前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）を全て包括する意味として使用でき、例えば、前記幹細胞は胚性幹細胞、成体幹細胞、誘導万能幹細胞、および前駆細胞らからなる群より選択された１種以上であってもよい。

胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）は受精卵に由来する幹細胞であって、全ての組織の細胞に分化できる特性を有する幹細胞である。

誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳ ｃｅｌｌｓ）は逆分化幹細胞とも呼ばれ、分化が終わった体細胞に細胞分化関連遺伝子を注入して分化以前の細胞段階に戻すことによって、胚性幹細胞のように万能性を誘導した細胞を意味する。

前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）は幹細胞と同様に特定類型の細胞に分化できる能力を有するが、幹細胞より特異的であり標的化されており、幹細胞とは異なり分裂回数が有限である。前記前駆細胞は間葉系由来の前駆細胞であってもよいが、これに制限されるのではない。本明細書で前駆細胞は幹細胞範疇に含まれ、特別な言及がない限り‘幹細胞’は前駆細胞も含む概念として解釈される。

成体幹細胞（ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）は臍帯（へその緒）、臍帯血（へその緒血液）または成人の骨髄、血液、神経などから抽出した幹細胞であって、具体的臓器の細胞に分化する直前の原始細胞を意味する。前記成体幹細胞は、造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）などからなる群より選択された１種以上であってもよい。成体幹細胞は、増殖が難しくて容易に分化される傾向が強いが、その代わり様々な種類の成体幹細胞を使用して実際医学で必要とする多様な臓器再生をすることができるだけでなく、移植された後に各臓器の特性に合うように分化できる特性を有していて、難治の病／不治の病の治療に有利に適用できる。

一例で、前記成体幹細胞は、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）であってもよい。間葉系幹細胞は間葉系基質細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）とも呼ばれ、骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ）、軟骨芽細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）、筋肉細胞（ｍｙｏｃｙｔｅｓ）、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ）などのような多様な形態の細胞に分化できる多能性細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ）を意味する。間葉系幹細胞は、胎盤（ｐｌａｃｅｎｔａ）、臍帯（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ）、臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）、脂肪組織（ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ）、成体筋肉（ａｄｕｌｔ ｍｕｓｃｌｅ）、角膜基質（ｃｏｒｎｅａｌ ｓｔｒｏｍａ）、乳歯の歯髄（ｄｅｎｔａｌ ｐｕｌｐ）などのような非骨髄組織（ｎｏｎ−ｍａｒｒｏｗ ｔｉｓｓｕｅｓ）などに由来する多能性細胞の中から選択されたものであってもよい。

前記幹細胞は、人間由来の幹細胞であってもよい。

前記ｓＲＡＧＥを分泌する幹細胞（以下、ｓＲＡＧＥ−分泌幹細胞）は、人間由来のｓＲＡＧＥ−分泌間葉系幹細胞（以下、人間ｓＲＡＧＥ−分泌間葉系幹細胞（ＭＳＣ））、人間由来のｓＲＡＧＥ−分泌誘導万能幹細胞（以下、人間ｓＲＡＧＥ−分泌誘導万能幹細胞（ｉＰＳＣ））などからなる群より選択された１種以上であってもよい。

前記ｓＲＡＧＥ−分泌幹細胞は、ｓＲＡＧＥコード遺伝子が幹細胞のゲノムに挿入された幹細胞、例えば間葉系幹細胞または誘導万能幹細胞であってもよい。

一例で、前記ｓＲＡＧＥコード遺伝子は、前記幹細胞のゲノム中のセーフハーバー（ｓａｆｅ ｈａｒｂｏｒ）遺伝子部位に挿入されたものであってもよい。セーフハーバー遺伝子はこの部分のＤＮＡが損傷（切断、および／またはヌクレオチドの欠失、置換、または挿入など）されても細胞損傷を誘発しない安全な遺伝子部位を意味するものであって、例えば、ＡＡＶＳ１（Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ；例えば、人間染色体１９（１９ｑ１３）に位置するＡＡＶＳ１など）などであってもよいが、これに制限されるのではない。

前記ｓＲＡＧＥコード遺伝子の幹細胞ゲノム内への挿入（導入）は、動物細胞のゲノム内への遺伝子導入に通常使用される全ての遺伝子操作技術を通じて行うことができる。一例で、前記遺伝子操作技術は、標的特異的ヌクレアーゼを使用するものであってもよい。前記標的特異的ヌクレアーゼは、先に説明したようなセーフハーバー（ｓａｆｅ ｈａｒｂｏｒ）遺伝子部位を標的にするものであってもよい。

本明細書に使用されたものとして、標的特異的ヌクレアーゼは、遺伝子はさみ（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｎｕｃｌｅａｓｅ）とも呼ばれ、目的とするゲノムＤＮＡ上の特定位置を認識して切断（単一鎖切断または二重鎖切断）することができる全ての形態のヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）をひっくるめて称する。前記標的特異的ヌクレアーゼは、微生物から分離されたものまたは組換え的方法または合成的方法で非自然的生産されたもの（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）であってもよい。前記標的特異的ヌクレアーゼは、真核細胞の核内伝達のために通常使用される要素（例えば、核局在化シグナル（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ；ＮＬＳ）など）を追加的に含むものであってもよいが、これに制限されるのではない。前記標的特異的ヌクレアーゼは精製されたタンパク質形態で使用されるか、これをコードするＤＮＡ、または前記ＤＮＡを含む組換えベクターの形態で使用できる。

例えば、前記標的特異的ヌクレアーゼは、
ゲノム上の特定標的配列を認識するドメインである植物病原性遺伝子に由来したＴＡＬエフェクター（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ）ドメインと切断ドメインが融合されたＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）；
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）；
メガヌクレアーゼ（ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅ）；
微生物免疫機構であるＣＲＩＳＰＲに由来したＲＧＥＮ（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ；例えば、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９など）、Ｃｐｆ１、など）；
ＡＧＯホモログ（Ａｇｏ ｈｏｍｏｌｏｇ、ＤＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）
などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるのではない。

前記標的特異的ヌクレアーゼは、原核細胞、および／または人間細胞をはじめとする動植物細胞（例えば、真核細胞）のゲノムで特定塩基配列を認識して二重鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ、ＤＳＢ）を起こすことができる。前記二重鎖切断はＤＮＡの二重鎖を切断して、平滑末端（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）または粘着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅｅｎｄ）を生成させることができる。ＤＳＢは細胞内で相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）または非相同末端結合（ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｅｎｄ−ｊｏｉｎｉｎｇ、ＮＨＥＪ）機構によって効率的に修復でき、この過程に所望の変異を標的位置に導入することができる。

前記メガヌクレアーゼは、これに制限されるのではないが、自然発生メガヌクレアーゼであってもよく、これらは１５〜４０個の塩基対の切断部位を認識し、これは通常４個のファミリーに分類される：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−Ｃｙｓｔボックスファミリー、およびＨＮＨファミリー。例示的なメガヌクレアーゼは、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩを含む。

自然発生メガヌクレアーゼ、主にＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーに由来するＤＮＡ結合ドメインを用いて植物、酵母、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、哺乳動物細胞およびマウスで位置特異的ゲノム変形が促進されたが、このような接近法はメガヌクレアーゼ標的配列が保存された相同性遺伝子の変形（Ｍｏｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｏｎ．２５５：８８−９３）であって、標的配列が導入される事前操作されたゲノムの変形には限界があった。したがって、医学的にも生命工学的にも関連する部位で新規な結合特異性を示すようにメガヌクレアーゼを操作しようとする試みがあった。また、メガヌクレアーゼに由来する自然発生されたまたは操作されたＤＮＡ結合ドメインが異種性ヌクレアーゼ（例、ＦｏｋＩ）に由来する切断ドメインに作動可能に連結された。

前記ＺＦＮは、選択された遺伝子、および切断ドメインまたは切断ハーフドメインの標的部位に結合するように操作されたジンクフィンガータンパク質を含む。前記ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびＤＮＡ切断ドメインを含む人工的な制限酵素であってもよい。ここで、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、選択された配列に結合するように操作されたものであってもよい。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１；Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０；Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ、（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０；Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７；Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６が本明細書参考資料として含まれ得る。自然発生されたジンクフィンガータンパク質と比較して、操作されたジンクフィンガー結合ドメインは新規な結合特異性を有することができる。操作方法は合理的設計および多様なタイプの選択を含むが、これに限定されない。合理的設計は、例えば三重（または四重）ヌクレオチド配列、および個別ジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの利用を含み、この時、各三重または四重ヌクレオチド配列は特定三重または四重配列に結合するジンクフィンガーの一つ以上の配列と連合される。

標的配列の選択、融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構成は当業者に公知されており、参考資料として米国特許出願公開２００５／００６４４７４および２００６／０１８８９８７の全文に詳しく説明され、前記公開特許の全文が本発明の参考資料として本明細書に含まれる。また、このような参考文献および当業界の他の文献に開示されている通り、ジンクフィンガードメインおよび／または多重フィンガージンクフィンガータンパク質が任意の適切なリンカー配列、例えば５個以上のアミノ酸長さのリンカーを含むリンカーによって共に連結できる。６個以上のアミノ酸長さのリンカー配列の例は米国登録特許６，４７９，６２６；６，９０３，１８５；７，１５３，９４９を参照する。ここに説明されたタンパク質はタンパク質の各ジンクフィンガーの間に適切なリンカーの任意の組み合わせを含むことができる。

また、ＺＦＮのようなヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ活性部分（切断ドメイン、切断ハーフドメイン）を含む。周知された通り、例えばジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと異なるヌクレアーゼからの切断ドメインのように、切断ドメインはＤＮＡ結合ドメインに異種性であってもよい。異種性切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼやエクソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来できる例示的なエンドヌクレアーゼは制限エンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼを含むが、これに限定されない。

同様に、切断ハーフドメインは、前記提示されたように、切断活性のために二量体化を必要とする任意のヌクレアーゼまたはそれの一部に由来できる。融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、一般に２個の融合タンパク質が切断に必要である。代案として、２個の切断ハーフドメインを含む単一タンパク質が用いられてもよい。２個の切断ハーフドメインは同一なエンドヌクレアーゼ（またはそれの機能的断片）に由来することも可能であり、または各切断ハーフドメインが異なるエンドヌクレアーゼ（またはそれの機能的断片）に由来することも可能である。また、２個の融合タンパク質の標的部位は、２個の融合タンパク質とその各標的部位の結合によって切断ハーフドメインが互いに対して空間的に配向されて位置することによって、切断ハーフドメインが、例えば二量体化によって機能性切断ドメインを形成することができるようにする関係で配置されるのが好ましい。したがって、一実施形態で、３〜８個のヌクレオチドまたは１４〜１８個のヌクレオチドによって標的部位の隣接の縁が分離される。しかし、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が２個の標的部位の間に介されてもよい（例、２〜５０個のヌクレオチド対またはそれ以上）。一般に、切断部位は標的部位の間に置かれる。

制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多くの種に存在し、ＤＮＡに配列特異的に結合して（標的部位で）、直ちに結合部位やその近所でＤＮＡを切断することができる。ある制限酵素（例、Ｔｙｐｅ ＩＩＳ）は認識部位から除去された部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合と切断可能なドメインを有する。例えば、Ｔｙｐｅ ＩＩＳ酵素ＦｏｋＩは一本鎖上の認識部位から９個のヌクレオチドで、そして残りの一本鎖上の認識部位から１３個のヌクレオチドでＤＮＡの二重鎖切断を触媒する。したがって、一実施形態で、融合タンパク質は少なくとも１個のＴｙｐｅ ＩＩＳ制限酵素からの切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）と一つ以上の亜鉛フィンガー結合ドメイン（操作されてもよく、そうでなくてもよい）を含む。

“ＴＡＬＥＮ”は、ＤＮＡのターゲット領域を認識および切断することができるヌクレアーゼを示す。ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥドメインおよびヌクレオチド切断ドメインを含む融合タンパク質を示す。本発明で、“ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ”および“ＴＡＬＥＮ”という用語は互換が可能である。ＴＡＬエフェクターはキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）バクテリアが多様な植物種に感染する時にこれらのタイプＩＩＩ分泌システムを通じて分泌されるタンパク質として知られている。前記タンパク質は、宿主植物内のプロモーター配列と結合してバクテリア感染を助ける植物遺伝子の発現を活性化させることができる。前記タンパク質は、３４個以下の多様な数のアミノ酸反復で構成された中心反復ドメインを通じて植物ＤＮＡ配列を認識する。したがって、ＴＡＬＥは、ゲノムエンジニアリングのツールのための新規プラットフォームになり得るとされる。但し、ゲノム編集活性を有する機能ＴＡＬＥＮを製作するために次のように現在まで知られなかった少数の主要媒介変数が定義されなければならない。ｉ）ＴＡＬＥの最小ＤＮＡ−結合ドメイン、ｉｉ）一つのターゲット領域を構成する２個の半分−位置の間のスペーサの長さ、およびｉｉｉ）ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインをｄＴＡＬＥに連結するリンカーまたは融合接合（ｆｕｓｉｏｎ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）。

本発明のＴＡＬＥドメインは、一つ以上のＴＡＬＥ反復モジュールを通じて配列特異的方式でヌクレオチドに結合するタンパク質ドメインを指す。前記ＴＡＬＥドメインは少なくとも一つのＴＡＬＥ反復モジュール、より具体的には１〜３０個のＴＡＬＥ反復モジュールを含むが、これに限定されない。本発明で、“ＴＡＬエフェクタードメイン”および“ＴＡＬＥドメイン”という用語は互換可能である。前記ＴＡＬＥドメインは、ＴＡＬＥ反復モジュールの半分を含むことができる。前記ＴＡＬＥＮに関連して国際公開特許ＷＯ／２０１２／０９３８３３号または米国公開特許２０１３−０２１７１３１号に開示された内容全文が本明細書に参考資料として含まれる。

一例で、前記ｓＲＡＧＥコード遺伝子の幹細胞ゲノム内への挿入（導入）は、標的特異的ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲに由来したＲＧＥＮ）を使用して行うことができる。前記標的特異的ヌクレアーゼは、
（１）ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（またはそのコーディングＤＮＡ、または前記コーディングＤＮＡを含む組換えベクター）、および
（２）標的遺伝子（例えば、ＡＡＶＳ１のようなセーフハーバー（ｓａｆｅ ｈａｒｂｏｒ）位置）の標的部位（例えば、ＡＡＶＳ１のようなセーフハーバー（ｓａｆｅ ｈａｒｂｏｒ）遺伝子内の連続する１５〜３０、１７〜２３、または１８〜２２個のヌクレオチド長さの核酸部位）と混成化可能な（または相補的核酸配列を有する）ガイドＲＮＡまたはそのコーディングＤＮＡ（またはコーディングＤＮＡを含む組換えベクター）
を含むものであってもよい。

前記標的特異的ヌクレアーゼは、標的遺伝子の特定配列を認識しヌクレオチド切断活性を有し標的遺伝子でインデル（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ａｎｄ／ｏｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎ、Ｉｎｄｅｌ）を引き起こすことができる全てのヌクレアーゼより選択された１種以上であってもよい。

一具体例で、前記標的特異的ヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９））、Ｃｐｆ１タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ ｆｒｏｍ Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １）などのようなタイプＩＩおよび／またはタイプＶのＣＲＩＳＰＲシステムに伴うヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）などからなる群より選択された１種以上であってもよい。この場合、前記標的特異的ヌクレアーゼは、ゲノムＤＮＡの標的部位に案内するための標的ＤＮＡ特異的ガイドＲＮＡを追加的に含む。前記ガイドＲＮＡは、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で転写された（ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ）ものであってもよく、例えば、オリゴヌクレオチド二重鎖またはプラスミド鋳型から転写されたものであってもよいが、これに制限されない。前記標的特異的ヌクレアーゼは、生体（細胞）外でまたは生体（細胞）内伝達後、ガイドＲＮＡに結合されたリボ核酸−タンパク質複合体を形成（ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｎｕｃｌｅａｓｅ）してリボ核酸タンパク質（ＲＮＰ）形態で作用できる。

Ｃａｓタンパク質はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの主要タンパク質構成要素であって、活性化されたエンドヌクレアーゼまたはニッカーゼ（ｎｉｃｋａｓｅ）を形成することができるタンパク質である。

Ｃａｓタンパク質または遺伝子情報は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎＢａｎｋのような公知のデータベースから得ることができる。例えば、前記Ｃａｓタンパク質は、
ストレプトコッカスｓｐ．（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、例えば、ストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質（例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｑ９９ＺＷ２（ＮＰ＿２６９２１５．１））；
カンピロバクター属、例えば、カンピロバクタージェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来のＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質；
ストレプトコッカス属、例えば、ストレプトコッカスサーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）またはストレプトコッカスアウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質；
ナイセリアメニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質；
パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、例えば、パスツレラムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）由来のＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質；
フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、例えば、フランシセラノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）由来のＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質
などからなる群より選択された一つ以上であってもよいが、これに制限されるのではない。

Ｃｐｆ１タンパク質は、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムとは区別される新たなＣＲＩＳＰＲシステムのエンドヌクレアーゼであって、Ｃａｓ９に比べて相対的に大きさが小さくてｔｒａｃｒＲＮＡが必要なく、単一ガイドＲＮＡによって作用できる。また、チミン（ｔｈｙｍｉｎｅ）が豊富なＰＡＭ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ−ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）配列を認識しＤＮＡの二重鎖を切断して粘着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ；ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ）を生成する。

例えば、前記Ｃｐｆ１タンパク質は、カンジダツス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ）属、ラクノスピラ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ）属、ブチリビブリオ（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ）属、ペレグリニバクテリア（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ）、アシドミノコッカス（Ａｃｉｄｏ ｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、カンジダツスメタノプラズマ（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ）、またはユバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属由来のものであってもよく、例えば、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＭＣ２０１７）、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｉｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（ＢＶ３Ｌ６）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＮＤ２００６）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ（２３７）、Ｓｍｉｉｈｅｌｌａ ｓｐ．（ＳＣ＿ＫＯ８Ｄ１７）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＭＡ２０２０）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ（Ｕ１１２）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐａｃｅｉｂａｃｔｅｒ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓなどの微生物由来のものであってもよいが、これに制限されるのではない。

前記標的特異的ヌクレアーゼは、微生物から分離されたものまたは組換え的方法または合成的方法などのように人為的または非自然的生産されたもの（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）であってもよい。前記標的特異的ヌクレアーゼは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで予め転写されたｍＲＮＡまたは予め生産されたタンパク質形態、または標的細胞または生体内で発現するために組換えベクターに含まれた形態で使用できる。一例で、前記標的特異的ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、など）は、組換えＤＮＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ；ｒＤＮＡ）によって作られた組換えタンパク質であってもよい。組換えＤＡＮは、多様な有機体から得られた異種または同種遺伝物質を含むために分子クローニングのような遺伝子組換え方法によって人工的に作られたＤＮＡ分子を意味する。例えば、組換えＤＮＡを適切な有機体で発現させて標的特異的ヌクレアーゼを生産（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ）する場合、組換えＤＮＡは、製造しようとするタンパク質をコーディングするコドンの中から前記有機体に発現するに最適化されたコドンを選択して再構成されたヌクレオチド配列を有するものであってもよい。

本明細書で使用された前記標的特異的ヌクレアーゼは、変異された形態の変異標的特異的ヌクレアーゼであってもよい。前記変異標的特異的ヌクレアーゼはＤＮＡ二重鎖を切断するエンドヌクレアーゼ活性を喪失するように変異されたものを意味することができ、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を喪失しニッカーゼ活性を有するように変異された変異標的特異的ヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ活性とニッカーゼ活性を全て喪失するように変異された変異標的特異的ヌクレアーゼの中から選択された１種以上であってもよい。このような標的特異的ヌクレアーゼの変異（例えば、アミノ酸置換など）は、少なくともヌクレアーゼの触媒活性ドメイン（例えば、Ｃａｓ９の場合、ＲｕｖＣ触媒ドメイン）で起こることであってもよい。一例で、前記標的特異的ヌクレアーゼがストレプトコッカスピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｑ９９ＺＷ２（ＮＰ＿２６９２１５．１）；配列番号４）である場合、前記変異は、触媒活性を有するアスパラギン酸残基（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｓｐａｒｔａｔｅ ｒｅｓｉｄｕｅ；例えば、配列番号４の場合、１０番目位置のアスパラギン酸（Ｄ１０）など）、配列番号４の７６２番目位置のグルタミン酸（Ｅ７６２）、８４０番目位置のヒスチジン（Ｈ８４０）、８５４番目位置のアスパラギン（Ｎ８５４）、８６３番目位置のアスパラギン（Ｎ８６３）、９８６番目位置のアスパラギン酸（Ｄ９８６）などからなる群より選択された一つ以上任意の他のアミノ酸で置換された突然変異を含むことができる。この時、置換される任意の他のアミノ酸はアラニン（ａｌａｎｉｎｅ）であってもよいが、これに制限されない。

他の例で、前記変異標的特異的ヌクレアーゼは、野生型Ｃａｓ９タンパク質と異なるＰＡＭ配列を認識するように変異されたものであってもよい。例えば、前記変異標的特異的ヌクレアーゼは、ストレプトコッカスピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質の１１３５番目位置のアスパラギン酸（Ｄ１１３５）、１３３５番目位置のアルギニン（Ｒ１３３５）、および１３３７番目位置のトレオニン（Ｔ１３３７）のうちの一つ以上、例えば、３個が全て他のアミノ酸で置換されて、野生型Ｃａｓ９のＰＡＭ配列（ＮＧＧ）と異なるＮＧＡ（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、およびＣの中から選択された任意の塩基である）を認識するように変異されたものであってもよい。

一例で、前記変異標的特異的ヌクレアーゼは、ストレプトコッカスピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）中、
（１）Ｄ１０、Ｈ８４０、またはＤ１０＋Ｈ８４０；
（２）Ｄ１１３５、Ｒ１３３５、Ｔ１３３７、またはＤ１１３５＋Ｒ１３３５＋Ｔ１３３７；または
（３）（１）と（２）残基全て
でアミノ酸置換が起こったものであってもよい。

本明細書に使用されたものとして、前記‘他のアミノ酸’は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、バリン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、ライシン、前記アミノ酸の公知された全ての変形体のうち、野生型タンパク質が元来変異位置に有するアミノ酸を除いたアミノ酸の中から選択されたアミノ酸を意味する。一例で、前記‘他のアミノ酸’は、アラニン、バリン、グルタミン、またはアルギニンであってもよい。

本発明で、用語“ガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）”は、標的遺伝子内の標的部位内の特異的な塩基配列（標的配列）に混成化可能な標的化配列を含むＲＮＡを意味し、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または生体（または細胞）内でＣａｓタンパク質、Ｃｐｆ１などのようなヌクレアーゼと結合してこれを標的遺伝子（または標的部位）に導く役割を果たす。

前記ガイドＲＮＡは、複合体を形成するヌクレアーゼの種類および／またはその由来微生物によって適切に選択できる。

例えば、前記ガイドＲＮＡは、
標的配列と混成化可能な部位（標的化配列）を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）；
Ｃａｓタンパク質、Ｃｐｆ１などのようなヌクレアーゼと相互作用する部位を含むｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）；および
前記ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの主要部位（例えば、標的化配列を含むｃｒＲＮＡ部位およびヌクレアーゼと相互作用するｔｒａｃｒＲＮＡの部位）が融合された形態の単一ガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ；ｓｇＲＮＡ）
からなる群より選択された１種以上であってもよく、
具体的に、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む二重ＲＮＡ（ｄｕａｌ ＲＮＡ）、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの主要部位を含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよい。

前記ｓｇＲＮＡは、標的遺伝子（標的部位）内の標的配列と相補的な配列（標的化配列）を有する部分（これをＳｐａｃｅｒ ｒｅｇｉｏｎ、Ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎなどとも命名する）およびＣａｓタンパク質結合のためのヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ）構造を含むことができる。より具体的に、標的遺伝子内の標的配列と相補的な配列（標的化配列）を含む部分、Ｃａｓタンパク質結合のためのｈａｉｒｐｉｎ構造、およびＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ配列を含むことができる。前述の構造は５’から３’の順に順次に存在するものであってもよいが、これに制限されるのではない。前記ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの主要部分および標的ＤＮＡの相補的な部分を含む場合であれば、いかなる形態のガイドＲＮＡも本発明で使用できる。

例えば、Ｃａｓ９タンパク質は標的遺伝子編集のために二つのガイドＲＮＡ、即ち、標的遺伝子の標的部位と混成化可能なヌクレオチド配列を有するＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とＣａｓ９タンパク質と相互作用するｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ；Ｃａｓ９タンパク質と相互作用する）を必要とし、これらｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡは互いに結合された二重鎖ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体形態、またはリンカーを通じて連結されて単一ガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ；ｓｇＲＮＡ）形態で使用できる。一例で、ストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質を使用する場合、ｓｇＲＮＡは少なくとも前記ｃｒＲＮＡの混成化可能なヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡ一部または全部と前記Ｃａｓ９のｔｒａｃｒＲＮＡのＣａｓ９タンパク質と相互作用する部位を少なくとも含むｔｒａｃｒＲＮＡ一部または全部がヌクレオチドリンカーを通じてヘアピン構造（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ構造）を形成するものであってもよい（この時、ヌクレオチドリンカーがループ構造に該当するものであり得る）。

前記ガイドＲＮＡ、具体的にｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは標的遺伝子内標的配列と相補的な配列（標的化配列）を含み、ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡのアップストリーム部位、具体的にｓｇＲＮＡまたはｄｕａｌＲＮＡのｃｒＲＮＡの５’末端に一つ以上、例えば、１〜１０個、１〜５個、または１〜３個の追加のヌクレオチドを含むことができる。前記追加のヌクレオチドはグアニン（ｇｕａｎｉｎｅ、Ｇ）であってもよいが、これに制限されるのではない。

他の例で、前記ヌクレアーゼがＣｐｆ１である場合、前記ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡを含むものであってもよく、複合体を形成するＣｐｆ１タンパク質種類および／またはその由来微生物によって適切に選択できる。

前記ガイドＲＮＡの具体的配列はヌクレアーゼ（Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）の種類（即ち、由来微生物）によって適切に選択することができ、これはこの発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に分かる事項である。

一例で、標的特異的ヌクレアーゼとしてストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質を使用する場合、ｃｒＲＮＡは次の一般式１で表現できる：
５’−（Ｎ_ｃａｓ９）_ｌ−（ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ）−（Ｘ_ｃａｓ９）_ｍ−３’（一般式１）
上記一般式１で、
Ｎ_ｃａｓ９は標的化配列、即ち、標的遺伝子（ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ）の標的部位（ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ）の配列によって決定される部位（標的部位の標的配列と混成化可能）であり、ｌは前記標的化配列に含まれているヌクレオチド数を示すものであって、１５〜３０、１７〜２３、または１８〜２２の整数、例えば２０であってもよく、
前記標的化配列の３’方向に隣接して位置する連続する１２個のヌクレオチド（ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ）（配列番号１）を含む部位はｃｒＲＮＡの必須的部分であり、
Ｘ_ｃａｓ９はｃｒＲＮＡの３’末端側に位置する（即ち、前記ｃｒＲＮＡの必須的部分の３’方向に隣接して位置する）ｍ個のヌクレオチドを含む部位であって、ｍは８〜１２の整数、例えば、１１であってもよく、前記ｍ個のヌクレオチドは互いに同一であるか異なってもよく、それぞれ独立してＡ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群より選択できる。

一例で、前記Ｘ_ｃａｓ９はＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号２）を含むことができるが、これに制限されない。

また、前記ｔｒａｃｒＲＮＡは、次の一般式２で表現できる：
５’−（Ｙ_ｃａｓ９）_ｐ−（ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ）−３’（一般式２）
上記一般式２で、
６０個のヌクレオチド（ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ）（配列番号３）で表された部位は、ｔｒａｃｒＲＮＡの必須的部分であり、
Ｙ_ｃａｓ９は前記ｔｒａｃｒＲＮＡの必須的部分の５’末端に隣接して位置するｐ個のヌクレオチドを含む部位であって、ｐは６〜２０の整数、例えば、８〜１９の整数であってもよく、前記ｐ個のヌクレオチドは互いに同一であるか異なってもよく、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群よりそれぞれ独立して選択できる。

また、ｓｇＲＮＡは、前記ｃｒＲＮＡの標的化配列と必須的部位を含むｃｒＲＮＡ部分と前記ｔｒａｃｒＲＮＡの必須的部分（６０個ヌクレオチド）を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分がオリゴヌクレオチドリンカーを通じてヘアピン構造（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ構造）を形成するものであってもよい（この時、オリゴヌクレオチドリンカーがループ構造に該当する）。より具体的に、前記ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの標的化配列と必須的部分を含むｃｒＲＮＡ部分とｔｒａｃｒＲＮＡの必須的部分を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分が互いに結合された二重鎖ＲＮＡ分子で、ｃｒＲＮＡ部位の３’末端とｔｒａｃｒＲＮＡ部位の５’末端がオリゴヌクレオチドリンカーを通じて連結されたヘアピン構造を有するものであってもよい。

一例で、ｓｇＲＮＡは、次の一般式３で表現できる：
５’−（Ｎ_ｃａｓ９）_ｌ−（ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ）−（オリゴヌクレオチドリンカー）−（ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ）−３’（一般式３）
上記一般式３で、（Ｎ_ｃａｓ９）_ｌは標的化配列であって、先に一般式１で説明したとおりである。

前記ｓｇＲＮＡに含まれるオリゴヌクレオチドリンカーは３〜５個、例えば４個のヌクレオチドを含むものであってもよく、前記ヌクレオチドは互いに同一であるか異なってもよく、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群よりそれぞれ独立して選択できる。

前記ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５’末端（即ち、ｃｒＲＮＡのターゲッティング配列部位の５’末端）に１〜３個のグアニン（Ｇ）を追加的に含むことができる。

前記ｔｒａｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡの必須的部分（６０ｎｔ）の３’末端に５個〜７個のウラシル（Ｕ）を含む終結部位を追加的に含むことができる。

前記ガイドＲＮＡの標的配列は、標的ＤＮＡ上のＰＡＭ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ配列（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の場合、５’−ＮＧＧ−３’（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、またはＣである））の５’に隣接して位置する約１７個〜約２３個または約１８個〜約２２個、例えば２０個の連続する核酸配列であってもよい。

前記ガイドＲＮＡの標的配列と混成化可能なガイドＲＮＡの標的化配列は、前記標的配列が位置するＤＮＡ鎖（即ち、ＰＡＭ配列（５’−ＮＧＧ−３’（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、またはＣである）が位置するＤＮＡ鎖）またはその相補的な鎖のヌクレオチド配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、または１００％の配列相補性を有するヌクレオチド配列を意味するものであって、前記相補的鎖のヌクレオチド配列と相補的結合が可能である。

他の例で、標的特異的ヌクレアーゼがＣｐｆ１システムである場合、ガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は次の一般式４で表現できる：
５’−ｎ１−ｎ２−Ａ−Ｕ−ｎ３−Ｕ−Ｃ−Ｕ−Ａ−Ｃ−Ｕ−ｎ４−ｎ５−ｎ６−ｎ７−Ｇ−Ｕ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｕ−（Ｎｃｐｆ１）ｑ−３’（一般式４）。

上記一般式４で、
ｎ１は存在しないか、Ｕ、Ａ、またはＧであり、ｎ２はＡまたはＧであり、ｎ３はＵ、Ａ、またはＣであり、ｎ４は存在しないかＧ、Ｃ、またはＡであり、ｎ５はＡ、Ｕ、Ｃ、Ｇ、または存在せず、ｎ６はＵ、ＧまたはＣであり、ｎ７はＵまたはＧであり、
Ｎｃｐｆ１は遺伝子標的部位と混成化可能なヌクレオチド配列を含むターゲッティング配列であって標的遺伝子の標的配列によって決定され、ｑは含まれているヌクレオチド数を示すものであって、１５〜３０の整数であってもよい。前記標的遺伝子の標的配列（ｃｒＲＮＡと混成化する配列）はＰＡＭ配列（５’−ＴＴＮ−３’または５’−ＴＴＴＮ−３’；Ｎは任意のヌクレオチドであって、Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣの塩基を有するヌクレオチドである）の３’方向に隣接して位置する（例えば、連続する）１５〜３０個の標的遺伝子の標的部位のヌクレオチド配列である。

前記一般式４で、５’末端からカウンティングして６番目から１０番目までの５個のヌクレオチド（５’末端ステム部位）と１５番目（ｎ４が存在する場合、１６番目）から１９番目（ｎ４が存在する場合、２０番目）までの５個ヌクレオチド（３’末端ステム部位）は互いに逆平行（ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ）なように相補的ヌクレオチドからなって二重鎖構造（ステム構造）を形成し、前記５’末端ステム部位と３’末端ステム部位の間の３〜５個ヌクレオチドがループ構造を形成することができる。

前記Ｃｐｆ１タンパク質のｃｒＲＮＡ（例えば、一般式４で表現される）は、５’末端に１〜３個のグアニン（Ｇ）を追加的に含むことができる。

Ｃｐｆ１由来微生物によって使用可能なＣｐｆ１タンパク質のｃｒＲＮＡ配列の５’末端部位配列（ターゲッティング配列部位除いた部分）を表１に例示的に記載した：

本明細書で、遺伝子標的部位と混成化可能なヌクレオチド配列は、遺伝子標的部位のヌクレオチド配列（標的配列）と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、または１００％の配列相補性を有するヌクレオチド配列を意味する（以下、特別な言及がない限り、同一な意味として使用され、前記配列相同性は通常の配列比較手段（例えば、ＢＬＡＳＴ）を使用して確認できる）。

ＲＡＧＥおよびそのリガンドは、アルツハイマー病に係る炎症において重要な標的である。可溶性ＲＡＧＥ（ｓＲＡＧＥ）はＲＡＧＥの細胞外部位であって、ＲＡＧＥとそのリガンド間の細胞外結合を遮断することができる。

しかし、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）でのｓＲＡＧＥによるＲＡＧＥの遮断は制限的である：（１）ｓＲＡＧＥの生体内半減期が短い。例えば、ｓＲＡＧＥタンパク質をアルツハイマー病（ＡＤ）患者の脳内に注入すれば、ｓＲＡＧＥは急速に分解される。（２）また、ｓＲＡＧＥはＡＤでＲＡＧＥ−依存性炎症を抑制するが、ＡＤの一部炎症媒介体はｓＲＡＧＥを使用して阻害させることができる。（３）間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ＭＳＣｓ）の移植によるアルツハイマー病治療が試みられている。ＭＳＣｓは多様な細胞親和性因子（ｃｙｔｏｔｒｏｐｉｃ ｆａｃｔｏｒ）を分泌するため、細胞成長を促進し細胞死滅を減少させ自食現象（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）を増加させる。また、ＭＳＣ移植は活性化された小膠細胞と関連された神経炎症を調節してＡβ沈着を減少させる。しかし、移植されたＭＳＣも細胞表面にＲＡＧＥを発現し、これはリガンド結合後にＲＡＧＥ連鎖反応（ＲＡＧＥ ｃａｓｃａｄｅ）を誘発する。

本明細書の一実施形態では、ｓＲＡＧＥタンパク質の短い半減期問題を克服するために、ｓＲＡＧＥ−分泌ＭＳＣｓ（ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣｓ）またはｓＲＡＧＥ−分泌ｉＰＳＣｓ（ｓＲＡＧＥ−ｉＰＳＣｓ）を製作し、代表的にｓＲＡＧＥ−分泌ＭＳＣｓその効能を見るために、Ａβ_１−４２注入されたラットの脳での効能を試験した。その結果、Ａβ_１−４２注入されたラットの脳で、ＭＳＣ処理後と比較して、ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ処理後に、注入されたＭＳＣの生存率増加、およびＡβ沈着、炎症および神経細胞死滅減少を示した（図２ａ、３ａ、３ｂおよび６参照）。

ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ処理によって細胞当り０．０１１ｐｇのｓＲＡＧＥが分泌され、これは処理されたｓＲＡＧＥタンパク質の濃度に比べては低い水準であった（図１ｇ）。また、ｓＲＡＧＥ処理時と比較して、ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣｓ処理時に一層効果的であったが、その理由はｓＲＡＧＥ−ＭＳＣが数代にわたってｓＲＡＧＥを持続的に分泌するためである（図８ａおよび８ｂ参照）。さらに、ｓＲＡＧＥを用いた人間ＭＳＣの遺伝的変形は幹細胞特性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）を変化させなかった（図１ｈ）。分泌されたｓＲＡＧＥはＲＡＧＥ発現を減少させることによって細胞死滅からＭＳＣを保護し（図１ｄ〜１ｇ）、Ａβ_１−４２注入されたラットの脳で、ＭＳＣ処理時と比較して、ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣの処理時にｓＲＡＧＥ−ＭＳＣの生存期間がさらに長かった（図１ｂおよび１ｃ）。このような結果は、ｓＲＡＧＥがＡβ_１−４２注入されたラットの脳でＭＳＣｓに対するＲＡＧＥ−リガンド結合を抑制することによって、Ａβ_１−４２誘導された環境のニッチコントローラー（ｎｉｃｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ）として作用する可能性を示す。

ＡＧＥ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ；ＲＡＧＥリガンド）は小膠細胞によるＡβ合成を増加させ、ＡＧＥ水準は、ＢＡＣＥ１水準を上向調節することによってＡＤを悪化させる陽性フィードバックループによって維持され、Ａβ生産を増加させる。本実施形態で免疫蛍光法と免疫ブロッティングを通じてｓＲＡＧＥ−ＭＳＣがＡβ_１−４２注入されたラットの脳でＢＡＣＥ１（Ｂｅｔａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ １）水準とＡβ蓄積を減少させるのを確認した（図３ａ〜３ｅ）。Ａβ_１−４２露出は小膠細胞の活性化を増加させて活性化された小膠細胞はＲＡＧＥリガンドを発現する。本実施形態の結果は、ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ注入によってＡβ_１−４２注入されたラットの脳で活性化された小膠細胞の数が減少するのを示す（図４ａおよび４ｂ）。小膠細胞の活性化だけでなく、発現されたＲＡＧＥリガンドの水準も、ｓＲＡＧＥまたはＭＳＣを処理した場合と比較して、ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣを処理した場合により減少した（図４ｅ）。ＲＡＧＥリガンドのｓｏｕｒｃｅを決定するために、Ａβ_１−４２露出されたＳＨ−ＳＹ５Ｙニューロン培地（ＣＭ）を投与して人間小膠細胞株（ＨＭＯ６）を活性化させた。ｓＲＡＧＥタンパク質、ＭＳＣ培地、およびｓＲＡＧＥ培地を前記ＣＭ処理したＨＭＯ６細胞に投与した。ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣから分泌されたｓＲＡＧＥは上清液、細胞溶解物、および動物組織（図４ｃおよび４ｄ）でのＲＡＧＥリガンドの発現を弱化させるだけでなく、ＲＡＧＥとそのリガンド間の相互作用も減少させた（図５ｂ〜５ｄ）。

ＡＧＥ、ＨＭＧＢ１（Ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｂｏｘ １）、およびＳ１００β（優勢なＲＡＧＥリガンド）はニューロン疾患に関与し、これらの相互作用は炎症および神経細胞死滅（ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）と関連するＲＡＧＥ ｃａｓｃａｄｅを誘導した。ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣによって分泌されたｓＲＡＧＥは、Ａβ_１−４２注入されたラットの脳でＲＡＧＥとそのリガンドの間の結合、ＲＡＧＥ関連炎症の水準、およびｐＳＡＰＫ／ＪＮＫ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｓｔｒｅｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ／ｃ−Ｊｕｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ）のような細胞死滅関連分子の水準を顕著に減少させた。また、ｓＲＡＧＥタンパク質またはＭＳＣと比較して、ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣによって分泌されたｓＲＡＧＥはＡβ_１−４２注入されたラットの脳でｃａｓｐａｓｅ ３、ｃａｓｐａｓｅ ８、ｃａｓｐａｓｅ ９およびＮＦ（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒｓ）も顕著に減少させた（図４ｃ、５および６）。細胞内ストレス後、細胞内カルシウム過負荷によって誘導されたＳＡＰＫ／ＪＮＫのようなタンパク質キナーゼ活性化はアポトーシス細胞死（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ）を誘発することがある。本実施形態で、Ａβ_１−４２がＡβ_１−４２注入されたラットの脳での細胞死滅、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ、およびｃａｓｐａｓｅｓに及ぼす影響を確認した。その結果、ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣがＳＡＰＫ／ＪＮＫ−Ｃａｓｐａｓｅ ｐａｔｈｗａｙの不活性化によって促進されるニューロン細胞死滅に対して保護活性を有するのを確認した（図５ｂおよび図６）。最後に、Ａβ_１−４２注入されたラットの脳で、ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣｓは、ｓＲＡＧＥまたはＭＳＣｓと比較して、ニューロン細胞死滅を防止する効果が優れているのを確認した（図６）。

本明細書に提供されているように、アルツハイマー病動物モデルの脳に対して、ｓＲＡＧＥ分泌ＭＳＣを有効成分として使用することによって、ｓＲＡＧＥまたはＭＳＣを使用した場合と比較して、Ａβ沈着と活性化された小膠細胞数値を効果的に減少させることができる。また、ｓＲＡＧＥ分泌ＭＳＣを使用することによって、ｓＲＡＧＥまたはＭＳＣを使用した場合と比較して、活性化された小膠細胞でのＲＡＧＥリガンド水準および活性化された小膠細胞でのＲＡＧＥとＲＡＧＥリガンド間の相互作用を顕著に減少させることができる。また、ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣｓはｓＲＡＧＥを持続的に分泌することによってアルツハイマー病モデル（例えば、Ａβ_１−４２注入されたラット）の脳で神経細胞保護効果を示すことができる。したがって、ｓＲＡＧＥ分泌ＭＳＣは、アルツハイマー病の予防および／または治療に効果的に適用できる。

図１は、ｓＲＡＧＥ分泌ＭＳＣの特性を例示的に示すものである。図１ａは、ＣＲＩＳＰＲ媒介ｓＲＡＧＥ分泌ＭＳＣ（ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ）の生産に使用可能な発現ベクターの開裂地図である。 ｓＲＡＧＥ特異的核酸配列を使用するｊｕｎｃｔｉｏｎ ＰＣＲによって決定されたｓＲＡＧＥ−ＭＳＣから分泌されたｓＲＡＧＥのｇＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）水準を示す。 ＥＬＩＳＡによって決定された１．５×１０^６ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ条件培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ；ＣＭ）でｓＲＡＧＥ水準を示すグラフである。 および 条件培地（ｄ）および細胞溶解物（ｅ）でのｓＲＡＧＥ接合Ｆｌａｇ発現水準を示す免疫ブロッティング結果である。 ＤＡＰＩ染色された核が青色で示されたｓＲＡＧＥ接合されたＦｌａｇ（Ｆｌａｇ、ｒｅｄ）および幹細胞マーカー（Ｅｎｄｏｇｌｉｎ、緑色）の発現を示す二重染色共焦点顕微鏡イメージである（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝１００μｍ、倍率＝２００ｘ）。 前記図１ｆの代表的な共焦点顕微鏡イメージでのＦｌａｇ強さを示すグラフである（＊＊、＜０．０１ ｖｅｒｓｕｓ ＭＳＣ、＊＊＊、＜０．００１ ｖｅｒｓｕｓ ＭＳＣ）。 ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣの陽性幹細胞マーカー（ＣＤ４４、ＣＤ７３）および陰性マーカー（ＣＤ３４）の発現水準を示すグラフである。 図２は、ＲＡＧＥ誘導細胞死滅の遮断を通じたｓＲＡＧＥ−ＭＳＣの生存率増加を示すものである（ＭＳＣおよびｓＲＡＧＥ−ＭＳＣのＡβ_１−４２注入されたラットの脳内の移植を最終注入後、４週目に免疫蛍光およびｑＲＴ−ＰＣＲ分析によって確認した）。図２ａは、ＣＤ４４陽性細胞（赤色）の分布を免疫蛍光分析で確認した免疫蛍光イメージである。 ＣＤ４４陽性細胞の数を示すグラフである。 人間特異的幹細胞マーカー（ＣＤ４４遺伝子）の発現水準をｑＲＴ−ＰＣＲ分析で確認した結果を示すグラフであって（（＊、＜０．０５ ｖｅｒｓｕｓ ＭＳＣ ｔｒｅａｔｅｄ Ａβ_１−４２ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｒａｔ ｂｒａｉｎｓ）、各遺伝子マーカーの発現水準はラットＧＡＤＰＨ遺伝子の発現水準を１にしてこれに対する倍数で示した相対値である。 人間特異的幹細胞マーカー（ＣＤ９０遺伝子）の発現水準をｑＲＴ−ＰＣＲ分析で確認した結果を示すグラフであって（（＊、＜０．０５ ｖｅｒｓｕｓ ＭＳＣ ｔｒｅａｔｅｄ Ａβ_１−４２ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｒａｔ ｂｒａｉｎｓ）、各遺伝子マーカーの発現水準はラットＧＡＤＰＨ遺伝子の発現水準を１にしてこれに対する倍数で示した相対値である。 人間特異的幹細胞マーカー（ＣＤ１１７遺伝子）の発現水準をｑＲＴ−ＰＣＲ分析で確認した結果を示すグラフであって（（＊、＜０．０５ ｖｅｒｓｕｓ ＭＳＣ ｔｒｅａｔｅｄ Ａβ_１−４２ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｒａｔ ｂｒａｉｎｓ）、各遺伝子マーカーの発現水準はラットＧＡＤＰＨ遺伝子の発現水準を１にしてこれに対する倍数で示した相対値である。 ９６時間１ｕＭ Ａβ_１−４２またはＰＢＳ処理後、免疫蛍光法で確認したＭＳＣおよびｓＲＡＧＥ−ＭＳＣでのＲＡＧＥ発現（緑色）を示す蛍光イメージである。 前記図２ｆで得られた免疫蛍光の強度を定量して示すグラフである。 ＴＵＮＥＬ分析によって確認されたＭＳＣおよびｓＲＡＧＥ−ＭＳＣのａｐｏｐｔｏｓｉｓ（赤色）を示す蛍光イメージである。 全体細胞に対するａｐｏｐｔｏｔｉｃ細胞比率（％）を示すグラフである（図２で、ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝１００μｍ、＊、＜０．０５、＊＊＊、＜０．００１、ｖｅｒｓｕｓ ＭＳＣ ｇｒｏｕｐ。ＤＡＰＩ ｓｔａｉｎｅｄ ｎｕｃｌｅｉ ａｒｅ ｂｌｕｅ ｃｏｌｏｒｅｄ）。 図３は、Ａβ_１−４２注入されたラット脳でのｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ処理によるＡＰＰ（Ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）およびＢＡＣＥ１（Ｂｅｔａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ １）発現水準の減少を示すものである。図３ａは、ＡＰＰ発現（緑色）を共焦点顕微鏡で観察した蛍光イメージである（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝１００μｍ）。 図３ａで観察された各細胞で得られたＡＰＰ発現（緑色）蛍光強度を定量して平均値を示すグラフであって、ＭＳＣ処理されたＡβ_１−４２注入ラットの脳とｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ処理されたＡβ_１−４２注入ラットの脳の間に統計的に有意差がないのを示す。 ＢＡＣＥ１の発現（緑色）を共焦点顕微鏡で観察した蛍光イメージである（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝１００μｍ）。 図３ｃで観察された各細胞から得られたＢＡＣＥ１発現（緑色）蛍光強度を定量して平均値を示したグラフであって、ＭＳＣ処理されたＡβ_１−４２注入ラットの脳とｓＲＡＧＥタンパク質処理されたＡβ_１−４２注入ラットの脳の間には統計的差がないのを示す。 Ａβ_１−４２注入、Ａβ_１−４２注入およびｓＲＡＧＥタンパク質処理、Ａβ_１−４２注入およびＭＳＣ処理、またはＡβ_１−４２注入およびｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ処理されたラットの脳でのＡＰＰおよびＢＡＣＥ１タンパク質水準を示す免疫ブロッティング分析結果である（図３で、§§§、＜０．００１、ｖｅｒｓｕｓ ｎａｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌｓ、＊＊＊、＜０．００１、ｖｅｒｓｕｓ Ａβ_１−４２ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｒａｔ ｂｒａｉｎｓ、＃＃＜０．０１、＃＃＃、＜０．００１、ｖｅｒｓｕｓ ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ ｔｒｅａｔｅｄ Ａβ_１−４２ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｒａｔ ｂｒａｉｎｓ）。 図４は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ処理による小膠細胞活性化およびＲＡＧＥリガンドを含む炎症関連タンパク質発現の減少を示すものである。図４ａは、Ａβ_１−４２注入、Ａβ_１−４２注入およびｓＲＡＧＥタンパク質処理、Ａβ_１−４２注入およびＭＳＣ処理、またはＡβ_１−４２注入およびｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ処理されたラット脳での活性化された小膠細胞（Ｉｂａ１；緑色）分布を示す共焦点顕微鏡イメージである（核はＤＡＰＩ染色されて青色で表示される）（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝１００μｍ）。 発現された全体細胞に対するＩｂａ１陽性細胞の比率を示すグラフであり（＜０．００１、ｖｅｒｓｕｓ ｎａｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌｓ、＊＊＊、＜０．００１、ｖｅｒｓｕｓ Ａβ_１−４２ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｒａｔ ｂｒａｉｎｓ、＃＃＃、＜０．００１、ｖｅｒｓｕｓ ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ ｔｒｅａｔｅｄ Ａβ_１−４２ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｒａｔ ｂｒａｉｎｓ）、ｓＲＡＧＥタンパク質処理されたＡβ_１−４２注入ラットとＭＳＣ処理されたＡβ_１−４２注入ラットの脳の間には大きな差がないのを示す。 Ａβ_１−４２注入されたラットの脳でのＩＬ−１βおよびＮＦκＢを含む炎症タンパク質の発現水準を示す免疫ブロッティング結果であり、Ｍ１およびＭ２マーカーに対してｉＮＯＳおよびＡｒｇ１がそれぞれ使用された。 ２４時間ＣＭ、ｓＲＡＧＥタンパク質、ＭＳＣ培地（ＭＳＣ ｍｅｄ）、またはｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ培地（ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ ｍｅｄ）でそれぞれ処理後のＨＭＯ６細胞溶解物でのＲＡＧＥリガンドであるＡＧＥ、ＨＭＧＢ１およびＳ１００βの水準をＥＬＩＳＡで測定した結果を示すグラフである。 Ａβ_１−４２注入ラットの脳組織でのＡＧＥ、ＨＭＧＢ１およびＳ１００β水準を示すグラフである（図４ｄおよび４ｅで、§、＜０．０５、ｖｅｒｓｕｓ ｎａｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌｓ、＊、＜０．０５、ｖｅｒｓｕｓ Ａβ１−４２ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｒａｔ ｂｒａｉｎｓ、＃＜０．０５、ｖｅｒｓｕｓ ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ ｔｒｅａｔｅｄ Ａβ１−４２ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｒａｔ ｂｒａｉｎｓ）。 図５は、Ａβ_１−４２注入ラット脳でｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ処理によるＲＡＧＥ関連細胞死滅経路およびＲＡＧＥ発現の減少を示すものである。図５ａは、Ａβ_１−４２注入、Ａβ_１−４２注入およびｓＲＡＧＥタンパク質処理、Ａβ_１−４２注入およびＭＳＣ処理、またはＡβ_１−４２注入およびｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ処理されたラット脳でのＲＡＧＥ発現（緑色）を示す共焦点顕微鏡イメージである（核はＤＡＰＩ染色されて青色で表示される）（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝１００μｍ）。 Ａβ_１−４２注入、Ａβ_１−４２注入およびｓＲＡＧＥタンパク質処理、Ａβ_１−４２注入およびＭＳＣ処理、またはＡβ_１−４２注入およびｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ処理されたラット脳でのＳＡＰＫ／ＪＮＫ、ｐＳＡＰＫ／ＪＮＫ、Ｃａｓｐａｓｅ ３、Ｃａｓｐａｓｅ ８、およびＣａｓｐａｓｅ ９の水準を測定した免疫ブロッティング分析結果を示す。 図６は、Ａβ_１−４２注入ラット脳でｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ処理によるＲＡＧＥ媒介神経細胞死滅の改善を示すものである。図６ａは、Ａβ_１−４２注入、Ａβ_１−４２注入およびｓＲＡＧＥタンパク質処理、Ａβ_１−４２注入およびＭＳＣ処理、またはＡβ_１−４２注入およびｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ処理されたラットの脳の共焦点顕微鏡写真であって（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝１００μｍ）、ＴＵＮＥＬ陽性細胞が赤色で表示される。 ｉｍａｇｅ Ｊ ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して計数したＴＵＮＥＬ陽性細胞数を示すグラフである。 ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓを示すＣｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔ染色イメージである（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝２００μｍ）。 ｉｍａｇｅ Ｊ ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して計数された染色された細胞の数を示すグラフである（§、＜０．０５、ｖｅｒｓｕｓ ｎａｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌｓ、＊、＜０．０５、ｖｅｒｓｕｓ Ａβ_１−４２ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｒａｔ ｂｒａｉｎｓ、＃＜０．０５、ｖｅｒｓｕｓ ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ ｔｒｅａｔｅｄ Ａβ_１−４２ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｒａｔ ｂｒａｉｎｓ）。 ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣからの生成されたｓＲＡＧＥの配列整列結果を示す。 図７ａの続きである。 図７ａの続きである。 図７ａの続きである。 図７ａの続きである。 図７ａの続きである。 図８は、ＭＳＣ、バックボーンベクターｐＺＤ／ＭＳＣ、およびｓＲＡＧＥ−ＭＳＣでのｓＲＡＧＥ接合されたＦｌａｇの発現を示したものである。図８ａは、ＭＳＣ、ｐＺＤ−ＭＳＣ、および継代培養ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ（Ｓ１、Ｓ２、およびＳ３）でｓＲＡＧＥ接合Ｆｌａｇ（赤色）、核（ＤＡＰＩ、青色）、およびＭＳＣ特異的マーカー（Ｅｎｄｏｇｌｉｎ、緑色）によって得られた共焦点顕微鏡イメージである。 図８ａの代表的な結果からＦｌａｇ発現を定量したグラフである（ｐＺＤ／ＭＳＣ；ｐＺＤｏｎｏｒ−ＡＡＶＳ１ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｖｅｃｔｏｒ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ＭＳＣ、Ｓ１；ｆｉｒｓｔ ｃｅｌｌ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ、Ｓ２；ｓｅｃｏｎｄ ｃｅｌｌ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ、Ｓ３；ｔｈｉｒｄ ｃｅｌｌ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝１００μｍ、Ｄａｔａ ａｒｅ ｍｅａｎｓ ± Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｄｅｖｉａｔｉｏｎ、＊＊＊、ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ（Ｐ＜０．００１）、ＮＳ；Ｎｏｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）。 図９は、ｓＲＡＧＥを分泌するｉＰＳＣの特性を示すものである。図９ａは、ｓＲＡＧＥコード遺伝子挿入されたｐＺＤｏｎｏｒ−ＡＡＶＳ１ベクターで形質感染されたｉＰＳＣのＰＣＲ結果を示す電気泳動イメージである。 ｓＲＡＧＥの発現および分泌水準をウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡで確認した結果である。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明しようとするが、これは例示的なものに過ぎず、本発明の範囲を制限しようとするのではない。以下に記載された実施例は発明の本質的な要旨を逸脱しない範囲で変形できるのは当業者において自明である。

参考例
１．ＭＳＣｓ、ＨＭＯ６細胞、およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の培養
人間臍帯由来間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）は、ＣＥＦＯｂｉｏ（Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）で購入した。ｓＲＡＧＥを発現する間葉系幹細胞（ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣｓ）は、ＭＳＣ（ＣＥＦＯｂｉｏ）にｓＲＡＧＥ（ｃａｔ．ＲＤ１７２１１６１００、Ｂｉｏｖｅｎｄｏｒ；配列番号６）を含むドナーベクター（図１ａ参照）を導入させて準備した（参考例２参照）。ｐａｒａｃｒｉｎｅ効果検証（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）に使用するために、前記ＭＳＣｓとｓＲＡＧＥ−ＭＳＣｓをそれぞれＭＳＣ培地（ＭＳＣ ｍｅｄ；ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．）またはｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ培地（ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ ｍｅｄ；ｓＲＡＧＥ分泌ＭＳＣｓの培養時使用、ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．）で２日間培養した。タンパク質分解を防止するために、前記二つの培地全てにプロティナーゼ阻害剤（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）およびホスファターゼ阻害剤（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）（ＴＡＫＡＲＡ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を添加した。ＭＳＣ培地およびｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ培地をそれぞれのｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ ｕｎｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に収集し、４℃で５０分間３，２２０ｘｇで遠心分離した。このように得られた濃縮培養液は使用時まで−８０℃で保管した。

ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（ヒト神経芽細胞腫細胞株；ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２２６６）およびＨＭＯ６細胞（小膠細胞株）を使用して神経細胞試験を行った。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は最小必須栄養培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｓｏｕｔｈ Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）で培養し、ＨＭＯ６細胞はＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）で培養した。二つの培地は全て１０％ ｈｅａｔ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）および１％ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含んでいる。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（ａｔ ７０％ ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）を９６時間１ｕＭベータアミロイド（Ａβ_１−４２；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有する新鮮な培養培地で９６時間培養した。このように得られたＳＨ−ＳＹ５Ｙ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ（ＣＭ）を収集し、先にＭＳＣ ｍｅｄおよびｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ ｍｅｄについて説明した方法によって濃縮した。活性化された小膠細胞からＲＡＧＥリガンドが合成および分泌されるのを確認するために、ＨＭＯ６細胞をｓＲＡＧＥタンパク質、濃縮ＭＳＣ ｍｅｄ、またはｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ ｍｅｄで２４時間処理した後、ＣＭで２４時間処理した。以下、実施例で使用された全ての細胞は３７℃の５％ ＣＯ_２培養器で維持させた。

２．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたｓＲＡＧＥ ＭＳＣｓの製作
ｓＲＡＧＥを分泌するＭＳＣ（ｓＲＡＧＥ ＭＳＣｓ）を製作するために、ＡＡＶＳ１（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ １）のｓａｆｅ ｈａｒｂｏｒ ｓｉｔｅｓを標的化するｍＲＮＡ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（ＴｏｏｌＧｅｎ、Ｉｎｃ；Ｃａｓ９：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来（配列番号４）、およびｓｇＲＮＡのＡＡＶＳ１標的部位：５’−ｇｔｃａｃｃａａｔｃｃｔｇｔｃｃｃｔａｇ−３’（配列番号７））をＡＡＶＳ１に形質感染させた。

前記ｓｇＲＮＡは、次のヌクレオチド配列を有する：
５’−（標的配列）−（ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ；配列番号１）−（ヌクレオチドリンカー）−（ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ；配列番号３）−３’
（前記標的配列は配列番号７のＡＡＶＳ１標的部位配列で“Ｔ”を“Ｕ”に変換した配列であり、前記ヌクレオチドリンカーはＧＡＡＡのヌクレオチド配列を有する）。

ここに、１０μｌのｓＲＡＧＥ配列（図１ａのドナーベクター形態で使用される）および形質感染基質（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）を使用して次の条件下でＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎを行った；１０５０ ｖｏｌｔｓ、ｐｕｌｓｅ ｗｉｄｔｈ ３０、ｐｕｌｓｅ ｎｕｍｂｅｒ ２、ＮＥＯＮ Ｍｉｃｒｏｐｏｒａｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）使用。１０^６細胞を６０ｍｍ培養皿（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）に接種した後、注射前７日間３７℃の５％ ＣＯ２培養器で安定化させた。培地は毎日交替した。

３．試料準備
３．１．Ｆｒｏｚｅｎ ｂｌｏｃｋ ｔｉｓｓｕｅ ｓｌｉｄｅ
脳試料を収集するために、ラットを麻酔させ、１８℃で食塩水２００ｍＬで経心腔的灌流（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｌ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）させた後、４％パラホルムアルデヒドを含有する０．１Ｍリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）２００ｍＬで経心腔的灌流させた。抽出した脳を４℃で４時間固定液（ｆｉｘａｔｉｖｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に浸漬した後、２０％スクロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する氷冷却された０．１Ｍ ＰＢＳに移した。このように準備された脳はｃｒｙｏｔｏｍｅを使用して１０または３０μｍで冠状に切断して使用時まで−２０℃で保管した。

３．２．タンパク質分離
ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでタンパク質発現水準を決定するために、ＥｚＲＩＰＡ ｌｙｓｉｓ ｋｉｔ（ＡＴＴＯ、Ｔｏｋｙｏ）を使用して収集された脳または細胞を溶解させた。その後、内嗅皮質（Ｅｎｔｏｒｈｉｎａｌ ｃｏｒｔｉｃｅｓ；ＥＮＴ）を均質化し４℃で１３，０００ｘｇで２０分間遠心分離した。上清液を新しいチューブに移し、Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してタンパク質含量を測定した。

３．３．ＲＮＡ分離
Ｔｒｉｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して製造社の使用説明によってラット脳脂肪内の総ＲＮＡを分離した。簡略に説明すれば、ＥＮＴをクロロホルム（Ａｍｒｅｓｃｏ、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ）０．２ｍＬと混合した前記Ｔｒｉｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ １ｍＬで均質化させ、４℃で１２，０００ｘｇで１５分間遠心分離した。上澄み液を新しいチューブに入れて１００％イソプロパノール０．５ｍＬと混合し１０分間１２，０００ｘｇで遠心分離した。このように得られたＲＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し７，５００ｘｇで５分間遠心分離し、乾燥させたペレットをｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ（ＤＥＰＣ） ｗａｔｅｒ ３０μｌに溶解させてＮａｎｏｄｒｏｐ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量した。

４．ＭＳＣｓによるｓＲＡＧＥ分泌を確認するためのＪｕｎｃｔｉｏｎ ＰＣＲ
ＭＳＣｓでｓＲＡＧＥ発現を確認するために、ＧｅｎｅＪＥＴ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＭＳＣおよびｓＲＡＧＥ分泌ＭＳＣ（ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ）のｇＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）を抽出した。その後、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００を使用してｇＤＮＡの濃度を測定した。同量のｇＤＮＡを次の条件でＰＣＲ増幅させた：１５ ｃｙｃｌｅｓ ｏｆ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ（３０ ｓｅｃ ａｔ ９０℃）ａｎｄ ａｎｎｅａｌｉｎｇ（９０ ｓｅｃ ａｔ ６８℃）ａｎｄ ２０ ｃｙｃｌｅｓ ｏｆ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ（３０ ｓｅｃ ａｔ ９５℃）、ａｎｎｅａｌｉｎｇ（３０ ｓｅｃ ａｔ ５８℃）ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（９０ ｓｅｃ ａｔ ７２℃）、ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（５ ｍｉｎｓ ａｔ ７２℃）。前記ＰＣＲに使用されたプライマー配列を表２に整理した。

５．免疫ブロッティング（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）
タンパク質発現水準を測定するために、同量のタンパク質を１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）で分離し、Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｙｓｔｅｍ（ＡＴＴＯ）を使用して２５Ｖで１０分間ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレンに移した。その後、メンブレンを０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）を含有するＴｒｉｓ−緩衝食塩水（ＴＢＳ）（ｐＨ７．６）に含まれている５％（ｗ／ｖ）ｓｋｉｍｍｅｄ ｍｉｌｋで２時間遮断し、洗浄し、ブロッキング溶液（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ｎｏｒｍａｌ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ、Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で一次抗体と共に４℃で一晩インキュベーティングした後にＴＢＳＴで洗浄し、適当な２次抗体と共にインキュベーティングし洗浄した。目的タンパク質はＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ−４０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）上でＥｚＷｅｓｔＬｕｍｉおよびｌｕｍｉｎｏｌ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＡＴＴＯ）を使用して検出した。前記分析に使用された抗体を表３に整理した：

６．免疫蛍光分析法（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）
冷凍された脳組織切片（１０μｍ）を１％正常血清で培養して非特異的抗原と抗体結合を遮断した後、抗体（表３参照）を４℃で一晩インキュベーティングした。脳切片を１時間蛍光接合された２次抗体と共に１時間インキュベーティングし、ＰＢＳで再び洗浄した。核はＤＡＰＩ（４’６−ｄｉａｍｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で室温で５分間対照染色し、発生する蛍光信号を共焦点顕微鏡（ＬＳＭ ７１０、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で検出した。前記検出された蛍光信号の分析は、Ｉｍａｇｅ Ｊ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を使用して行った。

７．ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）およびＳａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ
ＭＳＣおよびｓＲＡＧＥ−ＭＳＣからのｓＲＡＧＥ分泌を測定するために、使用される全てのＥＬＩＳＡ試薬、ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｔａｎｄａｒｄｓ、および試料は製造者（Ａｖｉｓｃｅｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）指針書によって準備した。試料を抗体が予備コーティングされたマイクロプレートのウェルに添加した。その次に、表３に記載された抗体接合体を各ウェルに添加してインキュベーティングした後、マイクロプレート判読機を使用して４５０ｎｍで光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｉｅｓ）を測定した。ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＡＧＥリガンドの発現およびＲＡＧＥとそのリガンドの間の相互作用を測定するために、９６−ウェルマイクロプレートのウェルを１００ｍＭ ｃａｒｂｏｎａｔｅ／ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．６）に含まれているＡＧＥ、ＨＭＧＢ１、およびＳ１００β抗体で４℃で一晩コーティングした。０．１％ ｔｒｉｔｏｎ ｘ−１００（ＴＰＢＳ）を含有するＰＢＳでウェルを洗浄した後、室温で２時間５％ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋを添加して残っているタンパク質結合部位を遮断した。ＰＢＳで洗浄した後、他の組織抽出物、細胞溶解物、または上澄み液試料を前記ウェルに添加して４℃で一晩インキュベーティングした。ＴＰＢＳで洗浄した後、ＲＡＧＥ抗体を添加して室温で２時間放置した。プレートをＴＰＢＳで洗浄した後、試料をペルオキシダーゼ接合２次抗体と共に室温で２時間インキュベーティングした。その次に、ＴＭＢ基質溶液を添加し、５〜１０分間インキュベーティングした後、同一な体積の停止液（２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４）を添加した。光学密度は４５０ｎｍで測定した。使用された抗体濃度は前記表３に記載されている。

８．ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）
ＦＡＣＳを使用してＭＳＣマーカーのＣＤ４４（陽性）、ＣＤ７３（陽性）、およびＣＤ３４（陰性）を検査してＭＳＣｓおよびｓＲＡＧＥ−ＭＳＣｓを同定した。細胞はｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）で標識された一次抗体と共に暗条件で１時間インキュベーティングした後、ＰＢＳで３回洗浄した。染色後、１０^６個のＭＳＣまたはｓＲＡＧＥ−ＭＳＣに対してＦＡＣＳ（Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）分析を実施した。

９．試験動物の準備
下記の実施例に７週齢Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットを使用した。動物は個別的に収容し、標準食べ物と水を自由に摂取することができるようにしながら１２時間の明暗周期条件の温度調節式（２４℃）施設で維持させた。動物試験は嘉泉大学校のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＡＡＡＬＡＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で承認された国際指針によって行った。

１０．試薬
人間Ａβタンパク質断片１−４２（Ａβ_１−４２；ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ ＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦ ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ ＩＡ；配列番号５；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；ｃａｔ．Ａ９８１０）はジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）（ＤＭＳＯ）に４ｍＭの濃度で溶解して準備した。人間ｓＲＡＧＥタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ａｃｃ．ｎｏ．Ｑ１５１０９）はＢｉｏｖｅｎｄｏｒ（ｃａｔ．ＲＤ１７２１１６１００、Ｂｒｎｏ、Ｃｚｅｃｈ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ；配列番号６（Ｔｏｔａｌ ３３９ ＡＡ．ＭＷ：３６．５ ｋＤａ．ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｑ１５１０９．Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｈｉｓ−ｔａｇ １４ ＡＡ））から購入して、アセテート緩衝液（ｐＨ４）に０．５ｍｇ／ｍｌ濃度で溶解させた。前記準備されたＡβ_１−４２ペプチドとｓＲＡＧＥは、使用時まで−８０℃で保管した。使用前に、Ａβ_１−４２ペプチドおよびｓＲＡＧＥをＰＢＳを使用してそれぞれ２００ｎＭまたは６．７ｎＭに希釈した。

１１．アルツハイマー病（ＡＤ）動物モデル
外科的手術前にＳＤラット（参考例９）をＺｏｌｅｔｉｌ ５０（５０ｍｇ／ｋｇ）およびＲｏｍｐｕｎ（１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔させた。Ａβ_１−４２ペプチドまたはｓＲＡＧＥをそれぞれ２００ｕＭまたは６．７ｎＭの濃度でリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解させた。頭皮正中線切開後、頭蓋骨のｂｒｅｇｍａから後方８．３ｍｍおよび側方５．４ｍｍ地点を生物学的電気ドリルで穴をあけた。その後、５μｌ Ｈａｍｉｌｔｏｎ注射器の針（３０ゲージ）を標的領域（深さ、４．５ｍｍ）に到達するまで垂直に下ろした。ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ ｇｕｉｄａｎｃｅ下でＥＮＴに試薬と細胞を次のように注入した：２００ｕＭ Ａβ_１−４２溶液 ５μｌ、６．７ｎＭ ｓＲＡＧＥタンパク質 ３μｌ、１０^６個のｓＲＡＧＥ−ＭＳＣまたは１０^６個のＭＳＣ ５μｌ。

標的領域にＡβ_１−４２溶液を先に注射した後、数分後にｓＲＡＧＥタンパク質、ＭＳＣ、またはｓＲＡＧＥ−ＭＳＣを注射した。試薬の逆流を防止するために、試薬を分当り１μｌの速度で徐々に注射した。注射後、針を徐々に抜き、手術部位をｗｏｕｎｄ ｃｌｉｐで縫合した。

対照群としてＡβ_１−４２溶液を注入されない正常の健康なラットを使用した。

１２．ｑＲＴ−ＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を使用して分離された脳ＲＮＡからｃＤＮＡ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ）を合成した。ｑＲＴ−ＰＣＲはＣＦＸ３８６ ｔｏｕｃｈ（Ｂｉｏ−ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して行い、反応効率および閾値サイクル（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）数はＣＦＸ３８６ ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して決定した。使用された全てのプライマーは人間特異的な配列を使用して設計され、前記配列は表２に示したとおりである。

１３．ＴＵＮＥＬ（ＴｄＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ−Ｘ ｎｉｃｋ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ）
ＰＢＳで洗浄された冷凍脳切片にＩｎ Ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴＵＮＥＬ；Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｕｒｇｅｓｓ Ｈｉｌｌ、ＵＫ）を使用してＴＵＮＥＬを行った。簡略に説明すれば、組織切片を透過性化溶液（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ；０．１％（ｗ／ｖ） Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００含有０．１％（ｗ／ｖ） ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ溶液）で氷で２分間インキュベーティングし、ＰＢＳで洗浄した後、ＴＵＮＥＬ反応混合物で処理し、ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ ｃｈａｍｂｅｒ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅで２時間インキュベーティングした（３７℃および暗条件）。その後、切片をＰＢＳで３回洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を使用してｇｌａｓｓ ｓｌｉｄｅの上に置いてｃｏｖｅｒｓｌｉｐを覆った。Ｉｍａｇｅ Ｊ（ＮＩＨ）ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して細胞自殺死（Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）細胞比率を決定した。

１４．Ｃｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔ染色およびニューロンカウンティング
先に準備された冷凍されたラット脳組織スライドを室温で５分間乾燥させ、ＰＢＳで１０分間洗浄した後、ｇｒａｄｅｄ ｅｔｈａｎｏｌ ｓｅｒｉｅｓ（１００％（ｖ／ｖ）エタノール：３分、９０％エタノール：３分、８０％エタノール：３分、７０％エタノール：５分）でインキュベーティングし蒸留水で洗浄した後、ｇｌａｃｉａｌ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ含有０．１％ Ｃｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔ染色溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で２０分間染色し、蒸留水、７０％エタノールで１分、８０％エタノールで３０秒、９０％エタノールで２０秒、１００％エタノールで２０秒、最後にキシレン（ｘｙｌｅｎｅ）で５分間洗浄した。組織学的分析（ＢＢＣ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｍｔ Ｖｅｒｎｏｎ、ＷＡ）のために前記切片をＯｐｔｉｃＭｏｕｎｔ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍを使用してマウンティングし、前記分析は光学顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を使用して行った。Ｉｍａｇｅ Ｊ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＮＩＨ）を使用してニューロンを計数した。

１５．統計的分析
小さな試料の大きさを勘案して、ｎｏｎ−ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ分析を使用した。ＩＢＭ ＳＰＳＳ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ２３ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＳＰＳＳ、Ｉｎｃ．、Ａｒｍｏｎｋ、ＮＹ）でＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔｅｓｔを使用してグループ間比較を行った（Ｎｕｌｌ ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ ｏｆ ｎｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｗｅｒｅ ｒｅｊｅｃｔｅｄ ｗｈｅｎ ｐ−ｖａｌｕｅｓ ｗｅｒｅ＜０．０５）。結果は、独立的な三回の試験から得られた値を平均して表わした。

実施例１．ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣｓの特性試験（ｎｏｒｍａｌ ＭＳＣ特徴を有する）
参考例で製作したｓＲＡＧＥ分泌ＭＳＣ（ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ）の特性を試験して、正常的なＭＳＣの特徴を示すのを確認した。

まず、先に説明したように、ＭＳＣがｓＲＡＧＥを分泌するように誘導するのにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用し、ｓＲＡＧＥはＦｌａｇで標識して使用した（図１ａ参照）。配列分析を通じて内因性および人為的に生成されたｓＲＡＧＥ（図７ａ〜ｃおよび７ｅ〜ｆ）の配列相同性を評価し、ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣのゲノムＤＮＡをｊｕｎｃｔｉｏｎ ＰＣＲによって確認してその結果を図１ｂに示した。図１ｂに示されているように、ＲＡＧＥ発現が確認された。

ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣｓの細胞内および細胞外のｓＲＡＧＥ発現（存在）をＥＬＩＳＡ、免疫ブロッティング、および免疫蛍光分析で確認してその結果を図１ｃ〜図１ｇに示した。

図１ｃはｓＲＡＧＥ−ＭＳＣｓおよびＭＳＣｓで分泌されたｓＲＡＧＥの量をＥＬＩＳＡによって分析した結果であり、ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣｓによって分泌されたｓＲＡＧＥの量がＭＳＣｓによって分泌される量より８９２．８０倍さらに多いのを示す。

図１ｄおよび１ｅは、ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ上澄み液（ｄ）および細胞溶解物（ｅ）でのｓＲＡＧＥ−接合Ｆｌａｇ発現水準を示す免疫ブロッティング結果である。

図１ｆは、ｓＲＡＧＥ接合されたＦｌａｇ（Ｆｌａｇ、ｒｅｄ）および幹細胞マーカー（Ｅｎｄｏｇｌｉｎ、緑色）の発現を示す二重染色共焦点顕微鏡イメージである（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝１００μｍ、倍率＝２００ｘ；核はＤＡＰＩ染色されて青色で示される）。図１ｆのように、ＭＳＣとｓＲＡＧＥ−ＭＳＣはＭＳＣマーカーであるＥｎｄｏｇｌｉｎを発現し、ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣｓによって合成されたｓＲＡＧＥが細胞質ＭＳＣで観察され、分泌されたｓＲＡＧＥは凝集して小さくて赤色の粒子を形成した。

図１ｇは前記図１ｆの代表的な共焦点顕微鏡イメージでのＦｌａｇ強さを示すグラフである（＊＊、＜０．０１ ｖｅｒｓｕｓ ＭＳＣ、＊＊＊、＜０．００１ ｖｅｒｓｕｓ ＭＳＣ）。図１ｇで確認されるように、ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣのＦｌａｇ発現強度はＭＳＣでの強度より５．０２倍さらに高かった。

図８ａはＭＳＣ、ｐＺＤ−ＭＳＣ、および継代培養ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ（Ｓ１、Ｓ２、およびＳ３）でｓＲＡＧＥ接合Ｆｌａｇ（赤色）、核（ＤＡＰＩ、青色）、およびＭＳＣ特異的マーカー（Ｅｎｄｏｇｌｉｎ、緑色）を確認した共焦点顕微鏡イメージであり、図８ｂは図８ａの代表的な結果からＦｌａｇ発現を定量したグラフである。図８ａおよび８ｂに示されているように、細胞培養プレートでｓＲＡＧＥ−ＭＳＣが増殖する間、局所的に発現されたＦｌａｇの水準は継続して減少したが、Ｆｌａｇ強度は高く維持された（図８ａおよび８ｂ）。

図１ｈは、ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣの陽性幹細胞マーカー（ＣＤ４４、ＣＤ７３）および陰性マーカー（ＣＤ３４）の発現水準を示すグラフである。図１ｈに示されているように、遺伝子変形にもかかわらず、ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣｓはよく知られたＭＳＣ特異マーカーを発現した。図１ｈのＦｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ結果は、ＣＤ４４とＣＤ７３を含む陽性マーカーがｓＲＡＧＥ−ＭＳＣｓとＭＳＣｓの全てで発現され、陰性マーカーであるＣＤ３４は二つの細胞株全てで発現されないのを示す。

実施例２．ｓＲＡＧＥの効果試験１−ｓＲＡＧＥはＲＡＧＥ発現を減少させることによって移植された細胞の生存率を増加させる
ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣｓまたはＭＳＣｓをＡβ_１−４２注射されたラットの脳に移植して、ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣｓの効果を試験した。人間特異的抗体（表３参照）およびプライマー（表２参照）を使用して免疫蛍光法およびｑＲＴ−ＰＣＲを行って、移植されたｓＲＡＧＥ−ＭＳＣとＭＳＣの移植後４週目の蛍光イメージを得て生存率を測定し、その結果を図２ａ〜２ｅに示した。

図２ａはＣＤ４４陽性細胞（赤色）の分布を免疫蛍光分析で確認した免疫蛍光イメージであり、図２ｂはＣＤ４４陽性細胞の数を示すグラフである。図２ｃ〜２ｅは人間特異的幹細胞マーカー（ＣＤ４４遺伝子（２ｃ）、ＣＤ９０遺伝子（２ｄ）、およびＣＤ１１７遺伝子（２ｅ））の発現水準をｑＲＴ−ＰＣＲ分析で確認した結果を示すグラフである（（＊、＜０．０５ ｖｅｒｓｕｓ ＭＳＣ ｔｒｅａｔｅｄ Ａβ_１−４２ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｒａｔ ｂｒａｉｎｓ）。図２ａ〜２ｅに示されているように、人間特異的ＣＤ４４を発現するＭＳＣ（ＣＤ４４−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌ）の個数はＭＳＣを移植した場合よりｓＲＡＧＥ−ＭＳＣを移植した場合に１．４３倍さらに多く（図２ａおよびｂ）、ＣＤ４４、ＣＤ９０およびＣＤ１１７ ｍＲＮＡの発現水準もｓＲＡＧＥ−ＭＳＣでそれぞれ２．３１倍、２．７７倍、および４．０８倍高く示された（図２ｃ−ｅ）。このような結果は、同一容量でｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ生存率がＭＳＣより高いということを示す。

図２ｆは９６時間１ｕＭ Ａβ_１−４２またはＰＢＳ処理後に免疫蛍光法で確認したＭＳＣおよびｓＲＡＧＥ−ＭＳＣでのＲＡＧＥ発現（緑色）を示す蛍光イメージであり、図２ｇは前記図２ｆで得られた免疫蛍光の強度を定量して示したグラフである。図２ｆおよび２ｇに示されているように、ＭＳＣとｓＲＡＧＥ−ＭＳＣの生存率を比較するために、ＭＳＣｓとｓＲＡＧＥ−ＭＳＣでＲＡＧＥ発現を確認し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＡＧＥ関連細胞死滅を調査した。ＭＳＣｓとｓＲＡＧＥ−ＭＳＣを１ｕＭのＡβ_１−４２で９６時間処理した後、ＭＳＣｓでのＲＡＧＥ発現強度はＰＢＳ処理に比べて６４．９７倍増加したが、ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣｓでのＲＡＧＥ発現強度は２５．７８倍増加して、ＭＳＣｓに比べて２．５２倍低い水準を示した。

図２ｈはＴＵＮＥＬ分析によって確認されたＭＳＣおよびｓＲＡＧＥ−ＭＳＣのａｐｏｐｔｏｓｉｓ（赤色）を示す蛍光イメージであり、図２ｉは全体細胞に対するａｐｏｐｔｏｔｉｃ細胞比率（％）を示すグラフである。図２ｈおよび２ｉに示されているように、同じ条件で、Ａβ１−４２処理後、ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ＭＳＣｓの比率は７９．００％まで増加したが、ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣｓの比率はＭＳＣｓと比較して１．８３倍減少した４３．１９％であった。このような結果は、分泌されたｓＲＡＧＥによるＲＡＧＥ遮断がＡβ_１−４２注射されたラットの脳でのｓＲＡＧＥ−ＭＳＣの生存率を増加させるのを示す。

実施例３．ｓＲＡＧＥの効果試験２−ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣｓはＡβ_１−４２注入ラット脳でＡＰＰおよびＢＡＣＥ１の発現を減少させる
アルツハイマー病ラットモデルを作るためにＡβ_１−４２をラットのＥＮＴ領域に注射した。Ａβ_１−４２注射はアミロイド前駆体タンパク質（ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＡＰＰ）およびベータサイトＡＰＰ切断酵素（ｂｅｔａ−ｓｉｔｅ ＡＰＰ ｃｌｅａｖｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ １；ＢＡＣＥ１）の水準を増加させることが観察された。

ＡＰＰおよびＢＡＣＥ１の発現水準は、免疫蛍光法で測定して、その結果を図３ａ〜３ｄに示した。

図３ａはＡＰＰ発現（緑色）を共焦点顕微鏡で観察した蛍光イメージであり（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝１００μｍ）、図３ｂは図３ａで観察された各細胞から得られたＡＰＰ発現（緑色）蛍光強度を定量して平均値を示したグラフである。図３ａおよび３ｂに示されているように、Ａβ_１−４２注射後、ＡＰＰ強度（発現水準）はＡβ_１−４２注射後、Ａβ_１−４２注射前と比較して、４．４６倍増加した反面、Ａβ_１−４２とｓＲＡＧＥタンパク質を処理した場合には、Ａβ１−４２注射した場合に比べて、１．１３倍減少した。また、Ａβ１−４２注射した場合と比較して、Ａβ_１−４２とＭＳＣを処理した場合のＡＰＰ強度は１．９６倍減少し、Ａβ１−４２とｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ処理の強度水準は１．８８倍減少した。

図３ｃはＢＡＣＥ１の発現（緑色）を共焦点顕微鏡で観察した蛍光イメージであり（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝１００μｍ）、図３ｄは図３ｃで観察された各細胞から得られたＢＡＣＥ１発現（緑色）蛍光強度を定量して平均値を示したグラフである。図３ｃおよび３ｄで示されるように、ＢＡＣＥ１発現変化はｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ処理後のＡＰＰ発現結果と類似していた。ＢＡＣＥ１強度は、Ａβ_１−４２注射後に注射前と比較して１２．１０倍増加した反面、Ａβ_１−４２とｓＲＡＧＥタンパク質処理後にはＡβ_１−４２注射後と比較して１．５７倍減少し、Ａβ_１−４２とＭＳＣ処理後にはＡβ_１−４２注射後と比較して１．８７倍減少し、Ａβ_１−４２とｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ処理後にはＡβ_１−４２注射後と比較して２．６１倍減少した。ＢＡＣＥ１タンパク質水準はＡβ_１−４２注射されたラットの脳で増加し、ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ処理によるＢＡＣＥ１タンパク質水準減少効果はｓＲＡＧＥタンパク質またはＭＳＣ処理時より効果的であった。

図３ｅはＡβ_１−４２注入、Ａβ_１−４２注入およびｓＲＡＧＥタンパク質処理、Ａβ_１−４２注入およびＭＳＣ処理、またはＡβ_１−４２注入およびｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ処理されたラット脳でのＡＰＰおよびＢＡＣＥ１タンパク質水準を示す免疫ブロッティング分析結果である。図３ｅで示されるように、Ａβ_１−４２処理時と比較して、Ａβ_１−４２とｓＲＡＧＥ−ＭＳＣを処理した場合、ＡＰＰおよびＢＡＣＥ１の発現が顕著に減少した。図３ｅで観察された発現変化は先に免疫蛍光法で測定された結果と類似していた。

実施例４．ｓＲＡＧＥの効果試験３−ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣｓは小膠細胞の活性化およびＲＡＧＥリガンドと炎症性タンパク質の発現を減少させる
Ａβ_１−４２注射されたラットの脳で炎症性タンパク質と活性化された小膠細胞間の関連性を調査するために、Ｉｂａ１（ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍａｒｋｅｒ）陽性細胞をカウンティングして活性化された小膠細胞の分布を調査して、その結果を図４ａおよび４ｂに示した。図４ａはＡβ_１−４２注入、Ａβ_１−４２注入およびｓＲＡＧＥタンパク質処理、Ａβ_１−４２注入およびＭＳＣ処理、またはＡβ_１−４２注入およびｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ処理されたラット脳での活性化された小膠細胞（Ｉｂａ１；緑色）分布を示す共焦点顕微鏡イメージであり、図４ｂは発現された全体細胞に対するＩｂａ１陽性細胞の比率を示すグラフである。図４ａおよび４ｂで示されるように、Ｉｂａ１陽性細胞の数はＡβ_１−４２注射されたラットの脳でｎａｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌｓより２．０２倍多く、Ａβ_１−４２とｓＲＡＧＥタンパク質またはＭＳＣを処理した場合には若干減少した。しかし、Ａβ_１−４２とｓＲＡＧＥ−ＭＳＣを処理した場合にはＩｂａ１陽性細胞数がＡβ_１−４２注射した場合と比較して有意的に低く示された（３．０８倍さらに低い）。

ＩＬ−１βおよびＮＦκＢのような炎症性タンパク質の水準を測定して図４ｃに示した。図４ｃはＡβ_１−４２注入されたラットの脳でのＩＬ−１βおよびＮＦκＢを含む炎症タンパク質の発現水準を示す免疫ブロッティング結果を示す。図４ｃに示されているように、ＩＬ−１βおよびＮＦκＢのような炎症性タンパク質の水準はＡβ_１−４２注射されたラットの脳で増加したが、Ａβ_１−４２注射された場合と比較して、Ａβ_１−４２とｓＲＡＧＥ−ＭＳＣが処理されたラットの脳では確実に減少した。興味深いことに、ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣはＡβ１−４２注射されたラットの脳でＭ１またはＭ２小膠細胞をｍｏｄｕｌａｔｉｎｇすることができる。Ａβ_１−４２とｓＲＡＧＥ−ＭＳＣが処理後、Ｍ１小膠細胞マーカーであるｉＮＯＳの水準は減少し、Ｍ２小膠細胞マーカーであるＡｒｇ１の水準は増加した。

図４ｄは２４時間ＣＭ、ｓＲＡＧＥタンパク質、ＭＳＣ培地（ＭＳＣ ｍｅｄ）、またはｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ培地（ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ ｍｅｄ）でそれぞれ処理後のＨＭＯ６細胞溶解物でのＲＡＧＥリガンドであるＡＧＥ、ＨＭＧＢ１およびＳ１００βの水準をＥＬＩＳＡで測定した結果を示すグラフであり、図４ｅはＡβ_１−４２注入ラットの脳組織でのＡＧＥ、ＨＭＧＢ１およびＳ１００β水準を示すグラフである。図４ｄおよび４ｅに示されているように、炎症性タンパク質と小膠細胞ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇだけでなく、ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣは活性化された小膠細胞でＲＡＧＥリガンドであるＡＧＥ、ＨＭＧＢ１およびＳ１００βの発現水準（ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでＥＬＩＳＡで測定）を減少させた。ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験で、９６時間１ｕＭのＡβ_１−４２が処理されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｌｌｓ）によって誘導された活性化されたＨＭＯ６からＲＡＧＥリガンドを合成した。ＨＭＯ６細胞をｓＲＡＧＥ−ＭＳＣのＣＭ（条件培地）と共に処理した場合、ｓＲＡＧＥタンパク質またはＭＳＣ培地を処理した場合と比較してＲＡＧＥリガンドの発現水準が顕著に減少された（図４ｄ）。脳組織でＡβ_１−４２とｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ処理された場合のＲＡＧＥリガンド水準はｓＲＡＧＥタンパク質やＭＳＣ処理時より効果的に減少し（図４ｅ）、このような結果はｉｎ ｖｉｔｒｏ結果と類似している。

実施例５．ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣｓの効果試験４−Ａβ_１−４２注射されたラット脳でのＲＡＧＥ媒介神経細胞死滅に対して保護活性
ＲＡＧＥ媒介神経細胞死滅に対するｓＲＡＧＥ−ＭＳＣｓの保護効果を試験するために、免疫蛍光法でＡβ_１−４２注射されたラットの脳でのＲＡＧＥ発現を確認した。図５ａはＡβ_１−４２注入、Ａβ_１−４２注入およびｓＲＡＧＥタンパク質処理、Ａβ_１−４２注入およびＭＳＣ処理、またはＡβ_１−４２注入およびｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ処理されたラット脳でのＲＡＧＥ発現（緑色）を示す共焦点顕微鏡イメージである。図５ａに示されているように、ＲＡＧＥの発現を示す蛍光強さは、Ａβ_１−４２注射によって増加した反面、Ａβ_１−４２とｓＲＡＧＥ−ＭＳＣと共に処理した場合にはＡβ_１−４２注射した場合と比較して減少した。また、図５ｂはＡβ_１−４２注入、Ａβ_１−４２注入およびｓＲＡＧＥタンパク質処理、Ａβ_１−４２注入およびＭＳＣ処理、またはＡβ_１−４２注入およびｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ処理されたラット脳でのＳＡＰＫ／ＪＮＫ、ｐＳＡＰＫ／ＪＮＫ、Ｃａｓｐａｓｅ ３、Ｃａｓｐａｓｅ ８、およびＣａｓｐａｓｅ ９の水準を測定した免疫ブロッティング分析結果を示す。図５ｂに示されているように、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ、Ｃａｓｐａｓｅ ３、Ｃａｓｐａｓｅ ８およびＣａｓｐａｓｅ ９のようなＲＡＧＥ媒介神経細胞死滅関連タンパク質の発現水準は、Ａβ１−４２注射されたラットの脳と比較して、Ａβ１−４２とｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ処理されたラットの脳で有意に低く示された（図５ｂ）。

Ａβ_１−４２注射されたラットの脳でＲＡＧＥとＲＡＧＥ関連細胞死滅タンパク質の発現増加がＲＡＧＥ媒介神経細胞死滅と関連あるのを試験して図６ａおよび６ｂに示した。図６ａはＡβ_１−４２注入、Ａβ_１−４２注入およびｓＲＡＧＥタンパク質処理、Ａβ_１−４２注入およびＭＳＣ処理、またはＡβ_１−４２注入およびｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ処理されたラットの脳の共焦点顕微鏡写真であり、図６ｂはｉｍａｇｅ Ｊ ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して計数したＴＵＮＥＬ陽性細胞数を示すグラフである。図６ａおよび６ｂに示したように、ＴＵＮＥＬ分析によって、Ａβ_１−４２注射ラットの脳でのＴＵＮＥＬ陽性細胞比率（％）はＡβ_１−４２処理しない対照群よりさらに高く示されるのを確認した。Ａβ_１−４２注射されたラットの脳にｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ処理時、ｓＲＡＧＥタンパク質またはＭＳＣ処理時と比較して、ＴＵＮＥＬ陽性細胞数が顕著に減少した。

最後に、ｓＲＡＧＥ−ＭＳＣによって分泌されたｓＲＡＧＥがＡβ_１−４２注射されたラットの脳でニューロンの生存を向上させるか確認するために、Ｃｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔ染色法を行った。前記Ｃｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔ染色から得られたイメージを図６ｃに示し、これを定量した結果を図６ｄに示した。図６ｃおよび６ｄで示されるように、Ａβ_１−４２注射されたラットの脳では生きているニューロンの数が対照群（Ａβ_１−４２未処理群）より低く示された反面、Ａβ_１−４２注射されたラットの脳にｓＲＡＧＥタンパク質、ＭＳＣ、またはｓＲＡＧＥ−ＭＳＣを処理した場合には処理前と比較してニューロン細胞の数が顕著に増加した。また、Ａβ_１−４２注射されたラットの脳にｓＲＡＧＥ−ＭＳＣ処理時、生きているニューロンの数がｓＲＡＧＥタンパク質またはＭＳＣｓを処理した場合に比べて１．５５倍と１．１５倍増加した。

実施例６．ｓＲＡＧＥ−ｉＰＳＣの製造および特性試験
ｓＲＡＧＥを分泌するｉＰＳＣを生成するために、ｐＺＤｏｎｏｒベクター（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に人間ＥＦ１−αプロモーター、ｓＲＡＧＥコーディング配列、およびｐｏｌｙ Ａ ｔａｉｌをクローニング方法で挿入して製作したｓＲＡＧＥドナーベクター（図１ａ参照）およびＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ ＲＮＰシステムを使用してｉＰＳＣの形質感染（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を行った。ガイドＲＮＡは１９番染色体でＡＡＶＳ１と知られたｓａｆｅ ｈａｒｂｏｒ ｓｉｔｅを標的にするように設計した（Ｃａｓ９：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来（配列番号４）、ｓｇＲＮＡの標的部位：ｇｔｃａｃｃａａｔｃｃｔｇｔｃｃｃｔａｇ（配列番号７））。形質感染は４Ｄ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ（（Ｌｏｎｚａ）を使用して行った。形質感染条件はウェブサイト上のＬｏｎｚａプロトコル（ｃｅｌｌ ｔｙｐｅ ‘ｈＥＳ／Ｈ９’）に提供されている条件に従った。Ｐ３ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌ ４Ｄ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｘ ｋｉｔ Ｌ（Ｌｏｎｚａ、Ｖ４ＸＰ−３０２４）を使用してｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎを行った。２×１０＾５個の人間ｉＰＳＣ（Ｋｏｒｅａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）をｃａｓ９タンパク質１５ｕｇ、ｇＲＮＡ２０ｕｇおよびｓＲＡＧＥドナーベクター１ｕｇで形質感染させて、ｓＲＡＧＥを分泌するｉＰＳＣを製造した。

形質感染３日後に、形質感染されたｉＰＳＣからゲノムＤＮＡを分離して、ｉＰＳＣのゲノムＤＮＡでｓＲＡＧＥのＫＩ（ｋｎｏｃｋ−ｉｎ）有無を決定した。ＰＣＲプライマーはＡＡＶＳ１ Ｆｗｄ（ｉＰＳＣ自体配列）およびＰｕｒｏ ｒｅｖ（挿入配列）（ＡＡＶＳ１ ＦＷＤ ｐｒｉｍｅｒ：ＣＧＧ ＡＡＣ ＴＣＴ ＧＣＣ ＣＴＣ ＴＡＡ ＣＧ；Ｐｕｒｏ Ｒｅｖ ｐｒｉｍｅｒ：ＴＧＡ ＧＧＡ ＡＧＡ ＧＴＴ ＣＴＴ ＧＣＡ ＧＣＴ）で準備した。

ＰＣＲは５６℃および３０ｃｙｃｌｅｓ条件で行い、電気泳動後、ＵＶ光下でバンドを観察した。前記得られた結果を図９ａに示した。図９ａはｓＲＡＧＥの遺伝子が成功的にＡＡＶＳ１サイトに統合されたのを示す。

ｓＲＡＧＥの発現および分泌水準を免疫ブロッティングおよびＥＬＩＳＡで確認した。

まず、免疫ブロッティングは次のように行った：全体細胞溶解物をＲＩＰＡ（ｒａｄｉｏ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（ＡＴＴＡ、ＷＳＥ７４２０）およびｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＡＴＴＡ、ＷＳＥ７４２０）で準備した後、超音波処理した。前記準備された細胞溶解物を４℃で２０分間１７，０００ｘｇで遠心分離し、上澄み液を収集した。１０％ポリアクリルアミドゲル上で同量（３０μｇ）のタンパク質を分離し２００ｍＡで２時間ニトロセルロースメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。５％ ｎｏｎ−ｆａｔ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋを使用して室温で１時間非特異的抗体結合を遮断した。前記準備されたメンブレンを１次タンパク質特異的抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｆ−７４２５）およびｂ−アクチン（Ａｂｃａｍ、ａｂ８２２７）と共に４℃で一晩インキュベーティングし、２次抗体と共に室温で１時間インキュベーティングした。数回洗浄後、ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＣＬ）を使用してタンパク質を検出した。

ＥＬＩＳＡは次のように行った：ｈｕｍａｎ ｓＲＡＧＥ（ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ａｖｉｓｃｅｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＳＫ００１１２−０２）を使用して全体分泌された溶解性ＲＡＧＥを定量した。人間ｓＲＡＧＥ抗体が予めコーティングされており希釈緩衝液１００μｌが含まれている９６−ウェルマイクロプレートに試料と標準溶液１００μｌ（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎの逆順に）を添加した。その後、プレートを密封剤（ｓｅａｌ）で覆って室温でマイクロプレートシェーカー上で２時間インキュベーティングした。インキュベーション後、溶液を全て吸引し洗浄液で４回洗浄した。ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎに希釈された検出抗体１００μｌを各ウェルに添加した後、プレートを密封剤で覆って室温でマイクロプレートシェーカー上で２時間インキュベーティングした後、吸引および洗浄段階を繰り返して行った。ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅ Ｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）接合された２次抗体１００μｌを各ウェルに添加し、光が遮断された室温条件でマイクロプレートシェーカー上で１時間インキュベーティングした後、吸引および洗浄段階を繰り返して行った。最後に、基質溶液１００μｌを各ウェルに添加して５〜８分間反応させた後、停止溶液１００μｌを加えて反応を終了させた。４５０ｎｍに設定されたマイクロプレート判読機を使用して光学密度を測定した。

前記免疫ブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）およびＥＬＩＳＡを行って得られた結果を図９ｂに示した。図９ｂのウェスタンブロット結果から確認できるように、ｐｚＤｏｎｏｒベクターが形質感染されたｓＲＡＧＥ−ｉＰＳＣでＦｌａｇの発現が観察された。図９ｃの培地で全体ｓＲＡＧＥの分泌水準を示すＥＬＩＳＡ結果に示されているように、ｓＲＡＧＥ−ｉＰＳＣの培養培地で１５．６ｎｇ／ｍｌのｓＲＡＧＥが検出され、これはｍｏｃｋ−ｉＰＳＣの培地で０．８ｎｇ／ｍｌのｓＲＡＧＥが検出されたのと比較して、顕著に高い水準である。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明しようとするが、これは例示的なものに過ぎず、本発明の範囲を制限しようとするのではない。以下に記載された実施例は発明の本質的な要旨を逸脱しない範囲で変形できるのは当業者において自明である。
本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．可溶性（ｓｏｌｕｂｌｅ）の最終糖化産物受容体（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ；ＲＡＧＥ）（ｓＲＡＧＥ）をコードする遺伝子を含み、ｓＲＡＧＥを分泌する、幹細胞。
２．前記幹細胞は、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、成体幹細胞（ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳ ｃｅｌｌｓ）、および前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）からなる群より選択された１種以上である、上記１に記載の幹細胞。
３．前記幹細胞は、誘導万能幹細胞または間葉系幹細胞である、上記１に記載の幹細胞。
４．上記１〜３のうちのいずれかの幹細胞を含むアルツハイマー病の予防または治療用薬学組成物。
５．前記薬学組成物は、アルツハイマー病患者で以下のうちの一つ以上の活性を有するものである、上記４に記載の薬学組成物：
アミロイド前駆体タンパク質（ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＡＰＰ）またはベータサイトＡＰＰ切断酵素（ｂｅｔａ−ｓｉｔｅ ＡＰＰ ｃｌｅａｖｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ １；ＢＡＣＥ１）の発現抑制、
ＲＡＧＥリガンドまたは炎症性タンパク質の発現抑制、または
ＲＡＧＥ媒介神経細胞死滅または炎症の抑制。
６．上記１〜３のうちのいずれかの幹細胞を含む、アルツハイマー病患者でのアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）またはベータサイトＡＰＰ切断酵素（ＢＡＣＥ１）の発現抑制用薬学組成物。
７．上記１〜３のうちのいずれかの幹細胞を含む、アルツハイマー病患者でのＲＡＧＥリガンドまたは炎症性タンパク質の発現抑制用薬学組成物。
８．前記ＲＡＧＥリガンドは、ＡＧＥ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ＨＭＧＢ１（Ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｂｏｘ １）、およびＳ１００βからなる群より選択される１種以上である、上記７に記載の薬学組成物。
９．上記１〜３のうちのいずれかの幹細胞を含む、アルツハイマー病患者でのＲＡＧＥ媒介神経細胞死滅または炎症の抑制用薬学組成物。
１０．上記１の幹細胞をアルツハイマー病患者に投与する段階を含む、アルツハイマー病の予防または治療方法。
１１．上記１の幹細胞をアルツハイマー病患者に投与する段階を含む、アルツハイマー病患者でのアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）またはベータサイトＡＰＰ切断酵素（ＢＡＣＥ１）の発現抑制方法。
１２．上記１の幹細胞をアルツハイマー病患者に投与する段階を含む、アルツハイマー病患者でのＲＡＧＥリガンドまたは炎症性タンパク質の発現抑制方法。
１３．上記１の幹細胞をアルツハイマー病患者に投与する段階を含む、アルツハイマー病患者でのＲＡＧＥ媒介神経細胞死滅または炎症抑制方法。

Claims (13)

1. 可溶性（ｓｏｌｕｂｌｅ）の最終糖化産物受容体（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ；ＲＡＧＥ）（ｓＲＡＧＥ）をコードする遺伝子を含み、ｓＲＡＧＥを分泌する、幹細胞。
2. 前記幹細胞は、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、成体幹細胞（ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳ ｃｅｌｌｓ）、および前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）からなる群より選択された１種以上である、請求項１に記載の幹細胞。
3. 前記幹細胞は、誘導万能幹細胞または間葉系幹細胞である、請求項１に記載の幹細胞。
4. 請求項１〜３のうちのいずれか一項の幹細胞を含むアルツハイマー病の予防または治療用薬学組成物。
5. 前記薬学組成物は、アルツハイマー病患者で以下のうちの一つ以上の活性を有するものである、請求項４に記載の薬学組成物：
   アミロイド前駆体タンパク質（ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＡＰＰ）またはベータサイトＡＰＰ切断酵素（ｂｅｔａ−ｓｉｔｅ ＡＰＰ ｃｌｅａｖｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ １；ＢＡＣＥ１）の発現抑制、
   ＲＡＧＥリガンドまたは炎症性タンパク質の発現抑制、または
   ＲＡＧＥ媒介神経細胞死滅または炎症の抑制。
6. 請求項１〜３のうちのいずれか一項の幹細胞を含む、アルツハイマー病患者でのアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）またはベータサイトＡＰＰ切断酵素（ＢＡＣＥ１）の発現抑制用薬学組成物。
7. 請求項１〜３のうちのいずれか一項の幹細胞を含む、アルツハイマー病患者でのＲＡＧＥリガンドまたは炎症性タンパク質の発現抑制用薬学組成物。
8. 前記ＲＡＧＥリガンドは、ＡＧＥ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ＨＭＧＢ１（Ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｂｏｘ １）、およびＳ１００βからなる群より選択される１種以上である、請求項７に記載の薬学組成物。
9. 請求項１〜３のうちのいずれか一項の幹細胞を含む、アルツハイマー病患者でのＲＡＧＥ媒介神経細胞死滅または炎症の抑制用薬学組成物。
10. 請求項１の幹細胞をアルツハイマー病患者に投与する段階を含む、アルツハイマー病の予防または治療方法。
11. 請求項１の幹細胞をアルツハイマー病患者に投与する段階を含む、アルツハイマー病患者でのアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）またはベータサイトＡＰＰ切断酵素（ＢＡＣＥ１）の発現抑制方法。
12. 請求項１の幹細胞をアルツハイマー病患者に投与する段階を含む、アルツハイマー病患者でのＲＡＧＥリガンドまたは炎症性タンパク質の発現抑制方法。
13. 請求項１の幹細胞をアルツハイマー病患者に投与する段階を含む、アルツハイマー病患者でのＲＡＧＥ媒介神経細胞死滅または炎症抑制方法。