KR102607662B1 - 시계 유전자 Period의 발현 억제용 단일 가이드 RNA 조합, 및 이의 용도 - Google Patents
시계 유전자 Period의 발현 억제용 단일 가이드 RNA 조합, 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 시계 유전자 Period의 발현을 억제용 단일 가이드 RNA 조합, 및 이의 용도에 관한 것으로, 시계 유전자(clock gene)인 Period 1(Per1) 및 Period 2(Per2)의 발현을 억제할 수 있는 특정 sgRNA 조합을 설계하고, 이를 포함하는 벡터를 이용하여 시교차상핵(suprachiasmatic nucleus, SCN)에서 일주기 분자 시계 진동이 억제되는 것을 확인하고, 상기 벡터를 포함하는 바이러스를 주입한 동물 모델에서 일주일 운동 활성에 운동 활동이 낮아지고 부정맥이 나타나는 등의 일주기 리듬 억제에 의한 병증이 나타나는 것을 확인함으로써, 상기 sgRNA 조합 및 이를 포함하는 벡터를 일주기 생체 리듬을 변화시킬 수 있는 도구로 제공된다.
Description
본 발명은 시계 유전자 Period의 발현을 억제용 단일 가이드 RNA 조합, 및 이의 용도에 관한 것이다.
모든 생물은 외부 환경에 따라 약 24 시간을 주기로 자율 진동하는 생체 시계를 가지고 있다. 생체 시계는 활동 일주기라고 하는 생물학적인 일주 변동을 일으키고, 수면/각성의 사이클을 비롯하여, 체온 조절, 혈압, 호르몬 분비, 대사, 심신의 활동, 섭식 등의 여러가지 생체 활동의 일주 변동을 조절한다. 최근에 활동일주기의 흐트러짐이 수면장애, 피부질환, 생활습관병, 나아가서는 우울증 등의 신경정신질환 등 여러 가지 심신의 증상 또는 질환의 발병 요인으로서 지적되고 있다. 예를 들면, 항공기 등의 이동에 의한 시차 후유증, 쉬프트 워크(교대 근무) 등에 의한 불규칙한 생활 패턴에 기인한 수면 장해, 야간형 생활(밤샘, 야근 등)에 의한 수면 각성 리듬 등의 변조 등, 생활 환경·노동 환경의 변화 등에 의한 일주기 생체 리듬의 혼란이 일으키는 문제가 많다. 또한, 노화에 따라, 일주기 생체리듬을 조정하는 멜라토닌 등의 호르몬 분비량이 저하되기 때문에, 수면 각성, 체온 조절 등의 다양한 리듬이, 고령자에 있어서는 감쇠하게 된다. 노후의 수면 장해 등에 의한 QOL의 저하도, 최근의 급속한 고령화와 함께, 사회적인 문제로서 우려되고 있다. 이러한 현상을 감안하면, 일주기 생체 리듬의 변조나 감쇠 등을 해소하고, 나아가서는 상기 수면 장애등을 치료, 개선할 수 있는 방법이 요구되고 있지만, 이러한 방법은 아직도 확립되어 있지 않는 상황에 있다.
포유류에서 일주기 생체 리듬은 좌우의 눈의 망막에서부터 뻗은 시신경이 뇌의 시상하부에서 교차하고 있는 시신경 교차 부위(시 교차) 상에 존재하는 시교차상핵(suprachiasmatic nucleus, SCN)에서 제어된다. SCN가 만들어 내고 있는 일주기 생체 리듬은 시계 유전자(Bmal1, Clock, Period, Cryptochrome 등)라고 하는 유전자군에 의해 형성되고 있다. 보다 구체적으로는, 전사 활성화 인자인 BMAL1 및 CLOCK 단백질이 Period 및 Cryptochrome 유전자의 발현을 활성화하고, 이에 따라 전사 번역된 Period(PER1, PER2) 및 Cryptochrome(CRY1, CRY2) 단백질이 BMAL1 및 CLOCK 단백질과 상호작용함에 따라 스스로 전사를 억제하는 음성 피드백을 형성하고 있다. 그 후, PER 및 CRY 단백질은 인산화 및 유비퀴틴화 수식을 받은 후, 프로테아솜(proteasome)으로 분해되기 때문에, 상기 전사 억제제가 해제되게 된다. 그리고, BMAL1 및 CLOCK 단백질에 의한 다음의 사이클이 개시되어 이 사이클의 1주에 약 24시간을 필요로 하는 것이, 일주기 생체 리듬 형성의 분자 메카니즘이다.
이러한 시계 유전자의 피드백 기구는 간장이나 근육, 폐, 심장이라고 하는 말초 조직, 뇌 안의 SCN 이외의 조직에도 존재하고 있어, 해당 기구에 의해 말초 조직 등에 있어서도 일주기 생체 리듬을 형성하는 것이 밝혀지고 있다. 또한, 그 리듬은 제어의 중심인 SCN가 여러가지 조직을 개입시켜 신경 호르몬 등에 의한 시그널에 의해 제어되고 있다. 이러한 일주기 생체 리듬은 시계 유전자의 발현에 의해 제어된다. 따라서 생체 리듬 변화로 발병되는 수면 장애, 우울증, 정신질환 등을 치료할 수 있는 물질을 탐색하기 위해서는 해당 시계 유전자의 발현을 억제하여 일주기 생체 리듬을 변화시킬 수 있는 유전적 방법의 개발이 요구된다.
한편, CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)은 세균에 존재하는 수십 개 염기쌍의 짧은 반복적 서열로서 박테리오파지, 플라스미드 등과 같은 외래 DNA에 대한 획득 면역 기전에 관여한다. CRISPR의 상류에 있는 Cas 유전자 클러스터 중 하나는 외래 DNA에서 PAM (proto-spacer adjacent motif)으로 불리는 특이적 짧은 서열을 인식하고, 그의 상류에서 수십 개의 염기쌍을 절단하여 이들을 CRISPR 영역 내로 삽입한다. 삽입된 표적 서열은 일련의 CRISPR RNA (crRNA) 전구체로서 반복 서열과 함께 전사되고, 반복 서열은 crRNA에 부분적으로 상보적인 트랜스-활성화 crRNA (tracrRNA)의 작용에 의해 절단되어 성숙 crRNA를 제공하며, 성숙 crRNA는 tracrRNA 및 Cas 유전자 클러스터 중 하나로서 이중 가닥 단절-유도 엔도뉴클리아제인 Cas9와 복합체를 형성한다. 상기 복합체는 외래 DNA에서 PAM 서열을 인식하고, 그에 인접한 표적 서열에 결합하고, Cas9 (CRISPR associated protein 9)는 외래 DNA를 절단하고 제거한다. 이러한 일련의 기전은 CRISPR/Cas9 시스템으로 불린다. 인위적으로 특정 유전자를 억제하는데 CRISPR/Cas9을 활용하기 위해서는 타겟이 되는 유전자의 적절한 시퀀스를 대상으로 하여 single guide RNA (sgRNA)를 디자인하는 것이 핵심적이며, 아직까지 sgRNA의 효율을 정확하게 예측할 수 있는 시스템이 존재하지 않기 때문에 실험적으로 유효성을 입증하는 것이 핵심적으로 요구된다.
본 발명의 목적은 시계 유전자(clock gene)인 Period 1(Per1), 및 Period 2(Per2)의 발현을 동시에 억제할 수 있는 sgRNA 조합 및 이를 포함하는 일주기 리듬 제어용 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명은 시계 유전자(clock gene) Period의 발현 억제용 sgRNA를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 sgRNA; 및 서열번호 2 또는 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 sgRNA를 포함하는 포유류의 일주기 리듬 제어용 벡터를 제공한다.
본 발명에 따르면, 시계 유전자(clock gene)인 Period 1(Per1) 및 Period 2(Per2)의 발현을 동시에 억제할 수 있는 특정 sgRNA 조합을 설계하고, 이를 포함하는 벡터를 이용하여 시교차상핵(suprachiasmatic nucleus, SCN)에서 일주기 분자 시계 진동이 억제되는 것을 확인하고, 상기 벡터를 포함하는 바이러스를 주입한 동물 모델에서 일주일 운동 활성에 운동 활동이 낮아지고 체온 조절 이상이 나타나는 등의 일주기 리듬 억제에 의한 병증이 나타나는 것을 확인함으로써, 상기 sgRNA 및 이를 포함하는 벡터를 일주기 생체 리듬을 변화시킬 수 있는 도구로 제공될 수 있다.
도 1은 일주일 리듬에 관련된 Period 유전자들을 표적으로 하는 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 설정한 결과(a), 이를 포함할 벡터(b) 및 상기 벡터의 효율을 확인한 결과(c)이다.
도 2는 일주일 리듬에 관련된 Period 유전자들을 표적으로 하는 다중 sgRNA 발현 카세트를 포함하는 벡터(a) 및 상기 벡터를 이용하여 PERIOD 단백질들의 발현을 억제한 결과(b)이다.
도 3는 동물 모델에서 Period 유전자들을 타겟하는 sgRNA를 포함하는 벡터가 우동 활동 및 체온에 미치는 영향을 평가하기 위해, 상기 벡터를 포함하는 아데노-관련 바이러스(AAV)를 동물의 시교차상핵(suprachiasmatic nucleus, SCN)에 주입하는 모식도(a), 형광 리포터 단백질 사진(b), 및 바이러스 감염 부위(c)를 나타내는 결과이다.
도 4는 동물 모델에서 Period 유전자를 타겟하는 sgRNA를 포함하는 벡터가 동물의 일주일 운동 활성에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 5은 동물 모델에서 Period 유전자를 타겟하는 sgRNA를 포함하는 벡터가 동물의 일주일 체온 변화에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 6은 동물 모델에서 Period 유전자를 타겟하는 sgRNA를 포함하는 벡터가 명암 조건에 따른 평균 운동 활동 및 체온 변화를 평가한 결과이다.
도 2는 일주일 리듬에 관련된 Period 유전자들을 표적으로 하는 다중 sgRNA 발현 카세트를 포함하는 벡터(a) 및 상기 벡터를 이용하여 PERIOD 단백질들의 발현을 억제한 결과(b)이다.
도 3는 동물 모델에서 Period 유전자들을 타겟하는 sgRNA를 포함하는 벡터가 우동 활동 및 체온에 미치는 영향을 평가하기 위해, 상기 벡터를 포함하는 아데노-관련 바이러스(AAV)를 동물의 시교차상핵(suprachiasmatic nucleus, SCN)에 주입하는 모식도(a), 형광 리포터 단백질 사진(b), 및 바이러스 감염 부위(c)를 나타내는 결과이다.
도 4는 동물 모델에서 Period 유전자를 타겟하는 sgRNA를 포함하는 벡터가 동물의 일주일 운동 활성에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 5은 동물 모델에서 Period 유전자를 타겟하는 sgRNA를 포함하는 벡터가 동물의 일주일 체온 변화에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 6은 동물 모델에서 Period 유전자를 타겟하는 sgRNA를 포함하는 벡터가 명암 조건에 따른 평균 운동 활동 및 체온 변화를 평가한 결과이다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 시계 유전자(clock gene) Period의 발현 억제용 sgRNA를 제공한다.
상기 sgRNA는 편집하려는 DNA 위치를 찾아내는 역할을 수행하는 단일 가이드 RNA이며, 상기 sgRNA는 시계 유전자인 Period 1(Per1) 또는 Period 2(Per2)에 특이적으로 결합할 수 있는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
상기 sgRNA는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 sgRNA이고, 시계 유전자인 Period 1(Per1)의 발현을 억제할 수 있다. 또한, 상기 sgRNA는 서열번호 2 또는 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 sgRNA이고, 시계 유전자인 Period 2(Per2)의 발현을 억제할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 sgRNA; 및 서열번호 2 또는 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 sgRNA를 포함하는 포유류의 일주기 리듬 제어용 벡터를 제공한다.
상기 벡터는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
상기 벡터는 CRISPR/Cas9 기술에 적용이 가능하며, 일반적으로 진행생물에서RNA 서열의 발현을 유도하는 프로모터일 수 있고, 구체적으로 U6 프로모터를 포함하는 발현 벡터일 수 있고, 보다 구체적으로 pAAV-hU6-gRNA-hSyn-mCherry-KASH일 수 있다. 상기 프로모터는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다.
상기 벡터는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 sgRNA, 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 sgRNA, 및 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 sgRNA를 포함하고, Period 단백질의 발현을 억제한다.
또한, 본 발명은 상기 벡터를 포함하는 CRISPR/Cas9 기반 단일 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터 시스템을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 벡터 시스템으로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 형질전환체에 시험 물질을 처리하는 단계; 및 상기 시험 물질이 처리된 형질전환체의 활동 일주기 리듬 변화를 분석하는 단계를 포함하는 일주기 리듬 개선용 약물 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 시험물질은 일주기 리듬 개선 효과를 확인할 물질을 의미하며, 예컨대 추출물, 단백질, 올리고펩티드, 소형 유기분자, 다당류, 폴리뉴클레오티드 및 광범위한 화합물 등의 임의 분자를 포함할 수 있다. 이러한 시험물질은 또한 천연물질뿐 아니라, 합성물질도 포함한다. 상기 활동일주기의 변화는 관련 유전자의 발현을 통해 확인될 수 있으며, 시험물질의 처리에 따른 세포주의 활동일주기의 주기 및 진폭의 변화를 미처리 대조군 및 정상세포와 비교하여 판단될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실험예 및 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실험예 및 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실험예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실험예 및 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험예> 실험 재료 및 방법
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 동물
모든 마우스는 표준 마우스 케이지(16 x 36 x 12.5 cm)에서 태어나고 사육되었으며, 음식과 물을 자율배식하였다. 마우스는 생후 3-4 주에 젖을 뗀 후, 케이지당 최대 4 마리씩 동성 형제/자매와 함께 사육되었다. 마우스는 22±1℃에서 12 시간 명암 주기로 사육되었다. 모든 절차는 대구경북과학기술원(DGIST)의 동물실험 실험윤리 위원회의 승인을 받았다. PER2::LUC knock-in 마우스는 Joseph Takahashi로부터 얻었고, Cas9-표현형 마우스는 Feng Zhang으로부터 제공받았다.
2. 세포 배양 및 돌연변이 검출
Neuro2a 및 Neuro2a Cas9-GFP-Hygorres(CSC-RO0033, Genecopeoia, Rockville, MD, USA) 세포들은 1 x 페니실린/스트렙토마이신(Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany), 10 mg/mL hygromycin (H-34274, Merck Millipore, Burlington, MA, USA), 및 10% FBS(fetal bovine serum, Hyclone)를 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium, Hyclone, Chicago, IL, USA)에 37℃ 5% CO2 조건으로 배양되었다. Neuro2a-Cas9 세포는 제조사의 지침에 따라 Lipofectamine 2000 형질감염 시약(#11668019, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 pAAV-U6-sgBMAL-hSyn-mCherry, pAAV-U6-sgCRY-hSyn-mCherry, pAAV-U6-sgPER-hSyn-mCherry, 또는 pAAV-U6-sgLacZ-hSyn-mCherry로 형질 감염되었다. 48 시간 후에 세포를 수집하고, 제조사의 지침에 따라 조직 미니 키트(Cosmo Genetech, Seoul, South Korea)를 사용하여 게놈 DNA를 준비하였다. 제조사의 지침에 따라 Surveyor 돌연변이 검출 분석(Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, USA)을 수행하였다.
3. 플라스미드 및 벡터 생산
CHOPCHOP를 사용하여 설계된 sgRNA의 DNA 올리고머는 클로닝용 어댑터를 추가한 후 Bionics(Seoul, South Korea)에서 상업적으로 합성하였다. 어닐링 후, sgRNA를 포함하는 DNA 단편을 sgRNA 발현 벡터인 pAAV-hU6-gRNA-hSyn-mCherry-KASH에 클로닝하였다. U6-sgRNA 발현 카세트는 Goldengate 조립 방법을 사용하여 다중화되어 pAAV-(hU6-gRNA)X3-hSyn-mCherry-KASH에 조립된 3개의 다중화 카세트를 생성하였다. 플라스미드 DNA 서열은 Sanger sequencing (Macrogen, Seoul, South Korea)에 의해 검증되었다. AAV(adeno-associated virus)는 삼중 형질 감염 방법을 사용하여 생산되고, iodixanol 구배 방법으로 정제되었다. 본 실시예에서 투여된 모든 AAV(adeno-associated virus) 벡터는 qPCR에 의해 정량화된 바와 같이, 밀리리터 당 1012 내지 1013 바이러스 게놈 개수(GC/mL)으로 입력하였다: AAV-DJ-hU6-sgLacZ-hSyn-mCherry-KASH 1.8 x 1013 GC/mL; AAV-DJ-CSAC-Pers-hSyn-mCherry-KASH 3.1 x 1013 GC/mL; AAV-2-hSyn-mCherry 4.7 x 1012 GC/mL.
4. 웨스턴 블롯 분석
세포를 인산염-완충 식염수(phosphate-buffered saline)로 2 회 세척하고, 방사선 면역 침전 분석 (RIPA) 완충액(#9806, Cell Signaling, Danvers, MA, USA)에서 초음파 처리로 용해하고 얼음 위에서 30분 동안 배양하였다. 용해물은 원심분리하여 Laemmli 샘플 용액(#NP0007, Invitrogen, Waltham, MA, USA)에서 5분 동안 끓인 상층액을 얻었다. 단백질을 TG(Tris-glycine) 완충액(#45101080003-2, SMOBIO, Hsinchu, Taiwan)에 담긴 4-15% TG 겔에서 분리하고, PVDF(polyvinylidene fluoride) 막(#A16646282, GE Healthcare, Chicago, IL, USA)으로 옮겼다. 막을 1% BSA(bovine serum albumin)를 포함하는 TTBS(Tween-20)로 완충된 Tris에서 차단하고, 0.1% BSA 및 하기 1차 항체를 포함하는 TTBS에서 4℃ 조건으로 배양하였다: mPer1 (#AB2201, Merck Millipore), PER2 (#AB2202, Merck Millipore) 및 β-actin-HRP (#SC-47778, Santa Cruz, Dallas, TX, USA). Anti-Rabbit (SKU#31460, Thermo Scientific) 또는 antigoat (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA) 이차 항체를 사용하였다. enhanced chemiluminescence (ECL) Select Solution (GE healthcare) 및 ECL Pico System (ECL-PS100, Dongin, Seoul, Korea)을 사용하여 단백질 밴드를 검출하였다.
5. 정위 주입(Stereotaxic injection)
수술은 무균 기술을 사용하여 수행되었다. 마우스를 100 mg/kg 케타민(ketamine) 및 10 mg/kg 자일라진(xylazine)의 혼합물로 마취하고, 정위 장치 (RWD Life Science, Shenzhen, China)에 Nanoliter 주입기 시스템(WPI)을 사용하여 0.1 μL/min 이하의 속도로 AAV를 뇌의 SCN 양측에 각각 250 nL씩 주입하였다(AP = -0.8 mm, ML = 브레그마에서 ± 0.22 mm, DV = 뇌 표면에서 5.85 mm).
6. 운동 활동 및 체온 측정
마우스의 운동 활동과 체온은 무선 송신기 기반 원격 측정 시스템(Starr Life Science, Oakmont, PA, USA)인 E-mitter를 사용하여 측정되었다. E-mitter는 복강 내 100 mg/kg 케타민(ketamine) 및 10 mg/kg 자일라진(xylazine) 주사로 유도된 전신 마취 하에서 무균 기술을 사용하여 마우스의 등 피부 아래에 이식되었다. 이식 후, 마우스는 적어도 1 주일 동안 회복하고, 규칙적인 12 시간 명암 주기에 순응되었다. 이식된 센서에서 감지된 활동 및 온도 데이터는 수신기(ER-4000 engergizer receiver, Starr Life Science)로 전송되었다. 데이터 수집 및 디지털 변환은 6분 마다 VitalView software(Starr Life Science)를 사용하여 수행되었다.
7. 조직 샘플 준비 및 공초점 현미경
바이러스 발현 3 주 후, 마우스를 4% 파라포름알데히드로 심장 내 관류하고, 4℃에서 밤새 고정시켰다. Leica VT1000 S vibratome (Leica, Wetzlar, Germany)를 사용하여 50-μm 두께의 코로나 섹션을 수집하였다. 핵은 DAPI(4'6'-diamidino-2-phnylindole)로 대조 염색하고, Nikon C2+ 공초점 현미경 시스템을 사용하여 이미지를 촬영하고 피지로 선형 조정하였다.
8. 데이터 및 통계 분석
카이-스퀘어 주기도 분석은 R의 xsp 패키지를 사용하여 수행되었다. 실시간 생물 발광은 cosinor 절차에 의해 분석되었다. 그래프는 Prism 8 (GraphPad, SanDiego, CA, USA) 또는 ggplot2를 사용하여 구성되었다. 통계적 유의성에 대한 임계 값은 P <0.05로 설정되었다.
실시예 1. 핵심 시계 유전자 계열 구성원을 표적으로 하는 sgRNA의 설계 및 평가
일주일 시계의 필수 분자 구성 요소를 제거할 수 있는 단일 가이드 RNA(sgRNA) 세트를 얻기 위해, CRISPR-Cas9에 대한 웹 구현 표적 사이트 선택 알고리즘인 CHOPCHOP를 사용하여 Period 유전자(Per1 및 Per2)를 표적으로 하는 sgRNA를 설계하였다. 도 1a에 나타난 바와 같이, 예측된 sgRNA 중에서 프레임 이동 매개 넌센스 돌연변이의 효과를 극대화하기 위해, 초기 엑손을 타겟으로 하는 3개를 선별하였다. 그 후, 도 1b에 나타난 바와 같이, 개별 sgRNA를 U6 프로모터 구동 sgRNA 발현 벡터에 복제하여 돌연변이 유도 효율을 평가하였다. 각각 sgRNA-발현 플라스미드를 SpCas9-발현 플라스미드로 Neuro2a 신경모세포종 세포주로 형질 감염시켰다. 수확된 게놈 DNA의 돌연변이율은 형질 감염된 세포의 게놈 DNA에서 유도된 가능한 돌연변이를 검출할 수 있는 Surveyor 핵산 불일치 절단 분석(Surveyor nuclease mismatch cleavage assay)을 사용하여 평가되었다.
도 1c에 나타난 바와 같이, Per1를 표적으로 하는 sgRNA(sgPer1)를 발현하는 플라스미드로 형질 감염된 Neuro2a 세포의 모든 게놈 DNA는 돌연변이 불일치 절단 분석에서 절단된 DNA 밴드(화살표)를 생성하였다. sgPer2 그룹에서도 유사한 불일치 절단 분석 결과를 얻었다. 단일 AAV는 최대 3개의 sgRNA 발현 카세트를 수용할 수 있으므로, 강력한 돌연변이 유도 효율을 가진 Per1을 표적으로 하는 하나의 sgRNA(서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 sgPer1-3)와 Per2를 표적으로 하는 2 개의 sgRNA(서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 sgPer2-1 및 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 sgPer2-2)를 조합하여 Per1 및 Per2를 동시에 녹아웃시킬 가능성을 높였다. sgRNA 서열은 하기 표 1과 같다.
| 서열번호 | sgRNA | 염기서열 (5'-> 3') | Strand | 엑손 |
ATG와의 거리
(bp) |
| 1 | sgPer1-3 | GGATGCGCTCGGCAATGAGTAGG | - | 8 | 1013 |
| 2 | sgPer2-1 | GGATGGCGAGCATCAAGGGCCGG | + | 10 | 1118 |
| 3 | sgPer2-2 | GAGCACAACCCCTCCACGAGCGG | - | 3 | 278 |
또한, 단백질 발현을 감소시킬 때 다중화된 sgRNA의 게놈 편집 효능을 조사하였다. 단백질 추출물을 분리하고, PER 에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하기 전에 Cas9:EGFP를 안정적으로 발현하는 Neuro2a 세포(이하, Neuro2a-Cas9 세포라 함)는 도 2a와 같은 다중화된 U6-매개 sgRNA 발현 카세트를 포함하는 플라스미드로 형질감염 되었다. 도 2b에 나타난 바와 같이, sgPer-형질 감염된 그룹에서 PER1 및 PER2 단백질의 높은 수준은 sgLacZ 대조군 그룹의 절반 미만이었다. 일관되게, 형질감염된 세포로부터의 게놈 DNA의 돌연변이 분석 및 웨스턴 블롯 분석은 성공적인 표적 유전자 KO를 나타냈다. 따라서 상기 다중 sgRNA 발현 AAV 벡터 시스템을 이하 실시예에서 CSAC로 명명하였다.
실시예 2. SCN-주입 CSAC가 운동 활동 및 체온에 미치는 영향
생체 내에서 CSAC의 유용성을 입증하기 위해, 도 3a에 나타난 바와 같이 Cas9를 구성적으로 발현하는 마우스의 SCN에 CSAC-Per 또는 대조군 AAV를 주입하였다. AAV 전달은 SCN을 포함하는 뇌 섹션의 공 초점 현미경으로 조직학적으로 확인되었다. 도 3c-d에 나타난 바와 같이, SCN을 덮고 있는 바이러스 감염 부위가 마우스에 나타났다.
깨어 있는 행동 동물에서 일주일 리듬의 행동 및 생리학적 측면에 대한 CSAC의 효과를 결정하기 위해, 원격 측정 기반 방법을 사용하여 운동 활동과 체온을 동시에 기록하였다. 도 4a에 나타난 바와 같이, 일주일 운동 활성은 AAV 발현 형광 단백질이 주입된 대조군 동물에서 정상으로 나타났고, 이는 빛의 단계 동안 빛이 억제된 운동과 빛이 꺼진 지점과 일치되는 뚜렷한 행동 개시를 나타냈다. 일정한 어둠 속에서, 대조군 동물은 C57BL/6J 군의 특징인 24 시간 보다 약간 짧은 기간으로 일주기 각성 및 휴식 주기를 명확하게 보여주었다. 그러나 도 4b에 나타난 바와 같이, CSAC-Per를 주사한 마우스는 일정한 어둠(DD) 하에서 일주기성이 망가진 활동성을 나타냈다. 카이-제곱 주기도 분석은 CSAC가 일주기 운동 활동을 방해한다는 것을 명확하게 나타낸다. 도 4c에 나타난 바와 같이, 대조군 동물에서 평균 Qp 값은 24 시간 전에 유의하게 정점에 이르렀으며, 전형적인 일주기 운동 활동의 전형이다. 도 4d에 나타난 바와 같이, CSAC-Per 그룹의 평균 Qp 값은 어느 시점에서도 유의하지 않는 것으로 나타났다.
체온은 실험 동물의 운동 활동과 거의 동일한 패턴으로 나타났다. 도 5a,b에 나타난 바와 같이, 대조군 동물은 LD 및 DD 조건 모두에서 전형적인 일주기 액토그램을 보인 반면, CSAC-Per 군은 가벼운 신호 없이 자유 실행 조건에서 체온의 일주기 변화가 없는 것으로 나타났다. 즉, 도 5c,d에 나타난 바와 같이, 카이-제곱 주기도는 CSAC-Per 군의 마우스와 달리 대조군 동물의 평균 Qp 값이 약 24 시간에 유의성 임계값을 초과하는 결과를 뒷받침한다.
또한, SCN에서 일주기 단백질의 CSAC 매개 형질감염이 기준 활동 수준 또는 온도에 영향을 미치는지 평가하기 위해, 각각 평균 활동 및 체온을 계산하였다. 도 6에 나타난 바와 같이, 평균 운동 활동과 체온이 대조군과 CSAC 그룹 사이에 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다. 상기 결과는 SCN으로의 CSAC 주입이 평균 운동 활동 또는 체온에 영향을 미치지 않고 생체 내에서 일주기 리듬의 생리적 특징을 효율적이고 특이적으로 억제했음을 나타낸다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.
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<120> Single guide RNA combination for suppressing the expression of
clock gene Period, and use thereof
<130> ADP-2021-0027
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<213> Artificial Sequence
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ggatgcgctc ggcaatgagt agg 23
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ggatggcgag catcaagggc cgg 23
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<211> 23
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgPer2-2
<400> 3
gagcacaacc cctccacgag cgg 23
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- 삭제
- 삭제
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- 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 sgRNA; 및 서열번호 2 또는 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 sgRNA를 포함하는 포유류의 일주기 리듬 제어용 벡터로서,
상기 벡터는 시계 유전자인 Period 1(Per1) 및 시계 유전자인 Period 2(Per2)를 동시에 녹아웃(Knockout)시키는 것을 특징으로 하는 포유류의 일주기 리듬 제어용 벡터. - 제4항에 있어서, 상기 벡터는 CRISPR/Cas9 기술에 적용이 가능한 것을 특징으로 하는 벡터.
- 삭제
- 제4항 및 제5항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 CRISPR/Cas9 기반 단일 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터 시스템.
- 제7항의 벡터 시스템으로 형질전환된 형질전환체.
- 제8항의 형질전환체에 시험 물질을 처리하는 단계; 및
상기 시험 물질이 처리된 형질전환체의 활동 일주기 리듬 변화를 분석하는 단계를 포함하는 일주기 리듬 개선용 약물 스크리닝 방법.
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| BioRxiv Preprint, DOI: https://doi.org/10.1101/2020.02.28.967752 (2020.02.28.) 1부.* |
| BioRxiv Preprint, DOI: HTTPS://DOI.ORG/10.1101/2020.07.02.184119, (2020.07.02.) 1부.* |
| Nature Communications,s41467,1-14면(2018) 1부.* |
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