CN105112446A

CN105112446A - 使用单倍体干细胞高效建立遗传修饰动物模型的方法

Info

Publication number: CN105112446A
Application number: CN201510359198.7A
Authority: CN
Inventors: 黄粤; 刘光; 张美丽; 刘语方
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Current assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS; Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Priority date: 2015-06-25
Filing date: 2015-06-25
Publication date: 2015-12-02

Abstract

本发明公开了使用单倍体干细胞高效建立遗传修饰动物模型的方法。具体地，本发明公开了使用单倍体干细胞高效建立遗传修饰动物模型的方法，其包括：a)使用同源重组敲除孤雄单倍体胚胎干细胞的H19基因；b)筛选和鉴定正确敲除H19基因的孤雄单倍体胚胎干细胞；c)将所述正确敲除H19基因的孤雄单倍体胚胎干细胞注射到卵母细胞胞质中，以产生半克隆的遗传修饰动物。本发明的方法通过建立敲除H19基因的孤雄单倍体胚胎干细胞系来模拟精子的功能以高效地生成可育的后代，继而可用于开展新的遗传操作并建立相应的基因修饰动物模型。

Description

使用单倍体干细胞高效建立遗传修饰动物模型的方法

技术领域

本发明涉及建立遗传修饰动物模型的方法，特别涉及使用单倍体干细胞高效建立遗传修饰动物模型的方法。

背景技术

哺乳动物胚胎干(ES)细胞具有自我更新(Self-renewal)的特性和多向分化的潜能(Pluripotency)，它既是再生医学研究和未来临床细胞治疗中的重要资源，也已经成为分子遗传学领域的重要研究工具，被广泛用于遗传修饰动物模型的构建。

传统的用于制作遗传修饰动物的方法是用基因打靶的方法对二倍体ES细胞进行遗传修饰，再将经过特定遗传修饰的ES细胞注射到发育的二倍体囊胚中以生成嵌合体动物及进入生殖系的基因修饰动物⁷¹。该方法已经在制作完全基因敲除或者条件性基因敲除小鼠方面得到了广泛应用。它通过在小鼠模型中有针对性地敲除某个或某几个基因以研究这些基因的在体功能，有助人们了解基因在胚胎发育及疾病发生发展过程中的作用，然而该方法必须首先在ES细胞中进行基因打靶，ES细胞的培养与遗传操作需要丰富的经验，这使得这一技术方法的应用具有很大的局限性。此外，某些动物还不能实现ES细胞的分离建系，也就无法使用基因打靶及囊胚注射的方法制作基因修饰动物。由于是二倍体ES细胞，该方法制作基因敲除小鼠时，需小鼠经过多次交配繁殖才能得到纯合突变小鼠，耗费大量的人力物力，且耗时较长，需要至少6个月的时间，这在一定程度上限制了该技术在基因功能研究中的应用。生殖系传递是决定能否获得目标小鼠的关键因素。生殖系传递的效率往往与ES细胞状态、细胞遗传背景、核型、小鼠状态及嵌合体小鼠嵌合率的高低相关。具有极大的不稳定性，在某些情况下甚至无法获得进入生殖系的目标小鼠。四倍体补偿(Tetraploidcomplementation)技术可以在一定程度上解决上述问题。四倍体胚胎是发育缺陷的，只能形成胚体外的胎盘组织，当将二倍体ES细胞或诱导多能干细胞(Inducedpluripotentstemcell,iPSC)注射到四倍体囊胚时可以发育成来自二倍体细胞的动物个体，它常用于证明二倍体多能干细胞的全能性⁷²。这就是四倍体补偿技术。小鼠ES细胞经遗传修时候再通过四倍体补偿技术即可获得经过人为修饰的目的小鼠。这种方法不需要经过嵌合体小鼠阶段，可以直接获得基因修饰小鼠，缩短了实验周期，节约了科研成本。同时该技术较易获得不同发育期的胚胎，在胚胎致死基因功能研究中有重要应用。然而，由于该技术用来制作基因修饰小鼠需要较多操作环节，如ES细胞的培养与基因修饰、四倍体胚胎的获得与体外培养、囊胚注射、小鼠交配等，目标小鼠的获得效率较低，国际上尚未普及此技术。

近年来研究人员成功实现了将小鼠的ES细胞或iPS细胞体外转化为生殖细胞，并最终培育出具有生殖能力的健康小鼠^73,74。2011年，KatsuhikoHayashi等使用特定的培养条件将培养的小鼠ES细胞或iPS细胞分化形成原始生殖细胞样细胞(PrimordialGermCell-LikeCells,PGCLCs)，并将其植入不能生育的小鼠睾丸中，产生了外观正常的精子。再通过胞浆内精子注射(IntracytoplasmicSpermInjection,ICSI)的方法将这些精子注射到雌性小鼠的卵细胞中，最终产下了可育的健康小鼠后代⁷³。2012年，同一研究小组成功地将雌性ES细胞或iPS细胞诱导成PGCLCs，并将这些细胞与雌鼠性腺细胞共培养，创造一个再造的卵巢。当将再造卵巢移植到小鼠卵巢囊时，PGCLCs成熟为生发泡期卵母细胞，成熟的卵母在细胞进行体外受精后可以生成健康可育的后代⁷⁴。使用胚胎干细胞制造出“人造精子”或“人造卵子”是生物医学领域的巨大突破，这也为男性不育或女性不孕症的治疗带来了希望。但这项技术要应用到人类还有很长的路要走，需要进行更多的研究和探讨伦理学的问题。此外，这项成果也为制作基因修饰动物提供了新思路。可以将经遗传修饰的ES细胞或iPS细胞诱导成PGCLCs，进而在体生成携带遗传修饰的精子或卵母细胞，进而通过体外受精的方法得到遗传修饰小鼠。该方法有很好的前景，但是操作难度较大，目前还难以广泛使用。

近几年，CRISPR-Cas9基因组编辑技术被用于高效地制作基因修饰动物⁷⁵。该方法通过将Cas9mRNA和sgRNA共注射到受精卵细胞质中实现定点基因修饰。Cas9切割基因组后引起DNA双链断裂，当通过NHEJ进行修复时，可以引起断裂点发生几十到几百个基因的插入或缺失；若在同源模板存在的条件下可以通过HDR进行精准修饰，纠正突变或者插入一段序列。该方法用于制作基因修饰动物的优点是不需要对ES细胞进行遗传操作，越过了ES细胞这一障碍，只需要对受精卵进行注射，操作性较强。这对不能建立ES细胞系的动物进行遗传修饰有重要的价值。由于直接对受精卵进行遗传操作，可以直接得到纯合子突变动物，不需要经过长期的动物交配，也没有生殖系传递的限制，缩短了实验周期，节约了人力物力。而且该方法可以同时进行多个基因修饰，可以用于制备多个基因同时敲除的动物模型，以研究多个基因功能的相关性或者存在冗余现象的基因⁷⁵。但是CRISPR-Cas9系统可能存在脱靶效应，造成靶位点之外的区域发生突变。这提示人们使用该方法进行遗传修饰时需谨慎，注意检测是否存在脱靶效应，以明确目的基因突变和表型之间的因果关系。目前，有研究将将Cas9蛋白的HNH或RuvC样结构域进行突变，使其产生单链断裂切割突变型，有效降低了脱靶效应⁷⁶。另外，利用此技术难以制作基因组大片段删除、外源DNA定点敲入(Knock-in)，等遗传修饰动物。

近年来，小鼠孤雄单倍体(Androgenetichaploid,AH)ES细胞系的成功建立，为遗传修饰小鼠的构建提供了全新的途径。将单倍体ES细胞在体外进行遗传修饰后，通过胞质内孤雄单倍体ES细胞注射(IntracytoplasmicAH-ESCsinjection,ICAHCI)注入到卵母细胞中，将这种重组形成的二倍体胚胎移植回代孕鼠子宫，可以发育成为携带遗传修饰的“半克隆”(Semicloned,SC)小鼠。此方法的优势在于：首先，生成的SC小鼠相当于上述传统方法获得的杂合突变小鼠，由此跳过了生殖系传递这一限速步骤，实验结果不再取决于生殖系传递的成功与否；其次，从进行ICAHCI到生成SC小鼠，仅需一个繁殖周期(20天)，极大地提高了实验的效率并节约资源。已有的实验结果表明，虽然AH-ES细胞能够获得可育的SC小鼠，但仍存在一些问题：第一，约有半数的新生小鼠呈现发育异常状态，个体明显较小，在出生后很快死亡；第二，与精子对照相比，AH-ES细胞获得的胚胎出生百分比及活至成年小鼠的百分比均显著降低；第三，高代数的单倍体细胞及经过遗传修饰的单倍体细胞克隆均难以获得健康的SC小鼠，也就是说目前利用该方法构建遗传修饰小鼠并没有实用性。

人们已经对SC小鼠发育异常的原因进行了初步的研究。通过对异常小鼠一些印记基因座(Imprintedgenes)的DNA甲基化状态分析显示：H19区域的甲基化印记发生了丢失，导致Igf2的异常低表达；而正常个体H19区域存在父源甲基化状态从而保持了Igf2的正常表达。结合已有的基因印记研究结果，我们推测导致AH-ES细胞无法支持胚胎正常发育的主要原因可能就在于H19基因的印记状态与精子不一致。由此我们提出本研究的设想：通过人为修正AH-ES细胞中的H19-Igf2印记基因座，使得其维持稳定的基因组印记状态，从而保证高效获得遗传修饰SC小鼠的能力。

发明内容

首先，我们利用CRISPR-Cas9辅助的高效同源重组技术，在小鼠AH-ES细胞中进行了H19基因及其上游DMR的敲除，通过长片段PCR和Southernblot杂交实验证明了敲除的正确性。同时选取8个具有代表性的潜在脱靶位点进行分析，在细胞克隆中未发现存在CRISPR-Cas9导致的脱靶现象。H19敲除后的ES细胞群体内仍存在一定比例的单倍体，并可被连续的流式分选所富集；细胞高表达干细胞标志物Oct4、Sox2、Nanog和SSEA1；碱性磷酸酶染色呈阳性；H19被敲除后其表达量下降为零，而Igf2表达量大幅上升；连续培养传代后的单倍体细胞能够在体外分化形成拟胚体(EB)及形成嵌合体小鼠，表明其具有良好的多潜能性。然后，我们利用H19敲除的小鼠AH-ES细胞系进行ICAHCI注射，生成了三只健康的SC小鼠，未出现发育异常现象，其中2只活到成年并能繁育后代。上述结果充分证明了我们设想的正确性，我们建立的H19敲除小鼠AH-ES细胞系可用来快速高效地制作基因修饰小鼠，是一种行之有效的新的生物技术。

我们的工作表明H19敲除小鼠AH-ES细胞系一方面具有良好的稳定性，印记状态可长期保持在与精子类似的水平，不因长期的培养传代和连续的遗传操作而改变；另一方面又具有较强的类似“精子”活力，可以代替精子行使生殖功能，突破了精子不能进行细胞分裂更无法进行遗传操作的限制。这为未来可能建立的人孤雄单倍体ES细胞系研究提供了启发，在健康生殖医学领域有重要的价值。

本发明提供使用单倍体干细胞高效建立遗传修饰动物模型的方法，其包括：

a)使用同源重组敲除孤雄单倍体胚胎干细胞的H19基因；

b)筛选和鉴定正确敲除H19基因的孤雄单倍体胚胎干细胞；以及

c)将所述正确敲除H19基因的孤雄单倍体胚胎干细胞注射到卵母细胞胞质中，以产生半克隆的遗传修饰动物。

在本文中，单倍体干细胞等同于孤雄单倍体胚胎干细胞。本文所使用的孤雄胚胎干细胞均来自不包含人的哺乳动物。

所述孤雄单倍体胚胎干细胞仅携带单倍染色体，不能发育成完整的动物个体，因此不属于动物品种范畴。

优选地，所述同源重组方法为CRISPR-Cas9方法，优选在步骤a)中使用CRISPR-Cas9方法辅助同源重组以高效敲除孤雄单倍体胚胎干细胞的H19基因。

优选地，在步骤a)中使用含有PGK-neo药物筛选元件的构建体，并在步骤b)中使用G418药物筛选敲除H19基因的单倍体胚胎干细胞。

优选地，在步骤在于在步骤a)中将打靶构建体pCCI-H19、Cas9-sgRNA-4和Cas9-sgRNA-7质粒通过CRISPR-Cas9方法以电转染的方式导入单倍体胚胎干细胞中以敲除H19基因，优选地敲除H19基因及其上游DMR。

优选地，在所述方法的步骤b)筛选和鉴定正确敲除H19基因的单倍体胚胎干细胞的方法选自以下方法中的一个或多个或其组合：用于验证打靶正确性的Southernblot、用于确定基因组范围基因拷贝数变异的比较基因组杂交、潜在脱靶位点鉴定、检测干细胞标志物Oct4、Sox2、Nanog和SSEA1的表达、拟胚体形成实验、嵌合体小鼠实验、检测印迹基因H19、Igf2表达量。

所述方法进一步包括通过流式分选将所述正确敲除H19基因的孤雄单倍体胚胎干细胞分选出，并在连续的传代中富集所述确正确敲除H19基因的孤雄单倍体胚胎干细胞的步骤。

根据本发明的方法，其中所述动物选自不包括人的哺乳动物，优选为啮齿类或灵长类哺乳动物，更有优选为小鼠、大鼠、食蟹猴，最优选为小鼠。

根据本发明的方法，所述单雄单倍体胚胎干细胞选自EG-1或OG-3小鼠单倍体胚胎干细胞，优选OG-3小鼠单倍体胚胎干细胞。

另一方面，本发明还提供一种H19基因敲除的小鼠单倍体胚胎干细胞系。

再一方面，本发明还提供所述的小鼠单倍体胚胎干细胞系在建立遗传修饰动物模型中的应用。

本发明还提供小鼠单倍体胚胎干细胞系在用于治疗雄性动物不育或遗传病的试剂盒中的应用。

附图说明

图1A和图1B。图1A为pCCI18图谱。Hprt-left-arm和Hprt-right-arm为HPRT打靶同源臂，两同源臂之间携带PGK-puro-deltaTK药物筛选元件。图1B为pL452图谱。质粒携带PGK-neo药物筛选元件。

图2为aCGH数据分析流程图。

图3为px330的基本结构。px330为Cas9与guideRNA的联合表达质粒，包含U6启动子，BbsⅠ酶切位点，CBh启动子，核定位信号NLS，Cas9表达元件。

图4为pCCI-H19-neo打靶载体结合CRISPR-Cas9进行基因敲除结构示意图。sgRNA-7，sgRNA-4为左右两侧设计的两个Cas9切割位点。Probe-R为Southernblot所用探针，B为BglⅡ酶切位点。

图5为测量分析实验鉴定CRISPR-Cas9切割活性。上图为左同源臂的4个备选位点，下图为右同源臂的4个备选位点。对照为野生型基因组对照，其中sgRNA-1与sgRNA-2，sgRNA-7与sgRNA-8因位置较为接近，共用一个对照。野生型对照无法被T7EN1切开而产生多个条带，而发生CRISPR-Cas切割的样品可被T7EN1切割形成较小的条带。如图所示，sgRNA-4和sgRNA-7出现最为明显的小条带，证明切割效率较高。

图6为Southernblot实验验证打靶的正确性。

图7为H19^△克隆的流式分选图。

图8为H19^△1和H19^△2的CGH结果展示图。染色体按序号依次排列在横坐标上，纵坐标为Log2_Ratio(H19^△/OG-3)。基线代表无变异，基线上方和下方离横轴较近的散点或区域分别代表基因组在相应位置的扩增和缺失。扩增区域上方或缺失区域下方的实线是对变异区域的展示，不代表数值大小。两株细胞系X染色体整体显示有下移，但Log2_Ratio数值很小，不能认为存在缺失。

图9为H19^△细胞的干细胞标志物免疫荧光检测。标尺为20μm。

图10A和图10B为OG3细胞和H19敲除克隆悬滴法生成的EB不同天数形态，标尺为200μm，图10A为悬滴法培养基为M15(DMEM+15％FBS)；图10B为悬滴法培养基为M15(KO-DMEM+15％FBS)。

图11为将二倍体的H19^ΔESCs注射到二倍体囊胚中，产生的嵌合体小鼠。

图12为H19敲除克隆的印记基因表达情况检测，OG-3细胞为对照。

图13为H19敲除克隆的印记基因Snrpn/Gtl2甲基化状态分析。精子DNA为对照。空心圆圈表示未甲基化的CpG位点，实心圆圈代表甲基化的CpG位点。

图14A-图14H为利用H19^△1细胞系产生ICAHCI可育小鼠。图14A.重构的囊胚显示ahESCs来源的Oct4-EGFP绿色荧光。图14B-图14E.胎儿及成年的H19^Δ半克隆小鼠及其后代。图14F-图14H半克隆小鼠(图14F)及其所生后代(图14G和图14H)中H19敲除情况的PCR鉴定。

图15为H19^Δ半克隆小鼠的印记状态分析。C57BL/6小鼠尾巴DNA为对照。空心圆圈表示未甲基化的CpG位点，实心圆圈代表甲基化的CpG位点。

具体实施方式

实验方法

1.载体的制备

1.1质粒载体

1.1.1感受态细胞的制备

(1)划线涂板：用灭菌的接种环蘸取少量E.coliDH5α菌液，在不含抗生素的LB琼脂平板上划线，使菌液逐渐稀释。倒置放于37℃细菌培养箱，过夜培养12-14h。

(2)挑取单菌落，接种到5ml不含抗生素的LB培养基中。37℃，250rpm摇过夜。

(3)取2ml浑浊的菌液接种到200ml不含抗生素的LB培养基中，37℃振荡培养2-3h。每半小时测一次OD₆₀₀，使其达到0.4-0.6。

(4)将该菌液冰浴20min。将冰浴后的菌液转移至预冷的50ml离心管中。4℃，4000rpm，10min离心。

(5)弃上清。用20ml预冷的0.1MCaCl₂溶液重悬细菌沉淀。4℃，4000rpm，10min离心。

(6)弃上清。按每50ml菌液加入2ml预冷的含20％无菌甘油的0.1MCaCl₂溶液重悬细胞沉淀。

(7)分装(50μl/管)，快速放于液氮中冷冻，再放入-80℃保存。

1.1.2质粒的快速热激活转化

(1)将50μlE.coliDH5α感受态细胞放到冰上融化，加入1-10ng质粒，轻柔混匀。

(2)将感受态细胞与质粒的混合液放到冰上，静置30min。

(3)将上述混合液在42℃水浴中进行热激活(90s)，热激后迅速放到冰上，静置2min。

(4)取适量热激后的感受态细胞均匀涂到有抗生素的LB琼脂平板上。

(5)将LB平板倒置放于37℃细菌培养箱，培养12-16h。可以见到许多独立的细菌菌落。

1.1.3质粒的小提(使用QIAGEN质粒小提试剂盒)

(1)挑取转化后的单菌落，接种到3-5ml含有抗生素的LB培养基中，37℃剧烈振摇下培养过夜。

(2)12000rpm，1min离心，收集细菌沉淀。加入250μlP1buffer(50mMTris·Cl，10mMEDTA，100μg/mlRNaseA)，振荡混匀。

(3)加入250μlP2buffer(200mMNaOH，1％SDS)，轻柔颠倒混匀。

(4)加入350μlN3buffer(3.0MNaAC，pH5.5)，轻柔颠倒混匀。

(5)13000rpm，10min离心。

(6)小心吸取上清，加到QIAprep离心柱中。12000rpm，1min离心，弃废液。

(7)加入0.75mlPEbuffer(1.0MNaCl，50mMMOPS，15％异丙醇)漂洗，12000rpm，1min离心，弃废液。

(8)12000rpm，2min离心，以去除残留的漂洗液。

(9)加入50μlEBbuffer(10mMTris·Cl，pH8.5)，室温放置1min。12000rpm，1min离心洗脱质粒。

1.1.4质粒的中提或大提(使用QIAGEN质粒中提或大提试剂盒)

(1)挑取转化后的单菌落，接种到3-5ml含有抗生素的LB培养基中，37℃剧烈振摇下培养8h。

(2)按1/500到1/1000的比例将菌液接种到含有抗生素的LB培养基中，37℃剧烈振摇下培养12-16h。

(3)4℃，6000g，15min离心，收集菌体。

(4)用4ml(中提)或10ml(大提)P1buffer(50mMTrisxCl，10mMEDTA，100μg/mlRNaseA)重悬细菌沉淀。

(5)加入4ml(中提)或10ml(大提)P2buffer(200mMNaOH，1％SDS)，轻柔混匀，室温放置5min。

(6)加入4ml(中提)或10ml(大提)预冷的P3buffer(3.0MNaAC，pH5.5)，轻柔混匀，冰上放置20min。

(7)4℃，20000g，30min离心。重复一次。

(8)将4ml(中提)或10ml(大提)QBTbuffer(750mMNaCl，50mMMOPS，15％异丙醇，0.15％TritonX-100)加到QIAGEN-tip进行柱平衡。

(9)将离心后的上清液加到平衡好的QIAGEN-tip柱子中。液体在重力的作用下流出。

(10)用10ml(中提)或30ml(大提)QCbuffer(1.0MNaCl，50mMMOPS，15％异丙醇)漂洗QIAGEN-tip柱子。重复一次。

(11)用5ml(中提)或15ml(大提)QFbuffer(1.25MNaCl，50mMTrisxCl，15％异丙醇)洗脱质粒。

(12)加入3.5ml(中提)或10.5ml(大提)异丙醇到洗脱后的DNA中。混匀后，4℃，8000g，40min离心。管底部可以见到DNA沉淀。

(13)弃上清。加入2ml(中提)或5ml(大提)70％乙醇漂洗沉淀。4℃，6000g，60min离心。

(14)弃上清。室温干燥5-10min。加入TEbuffer(10mMTrisxCl，pH8.0)溶解质粒。

1.1.5质粒的鉴定

1.1.5.1质粒的质量检测

使用NanoPhotometer^TMPearl(IMPLEN)超微量紫外可见分光光度计测定质粒浓度及纯度。记录质粒浓度、OD260/280、OD260/230比值。

1.1.5.2琼脂糖凝胶电泳检测

(1)用1×TAE电泳缓冲液配制0.9-1.5％的琼脂糖凝胶，微波加热溶解。待冷却至55-60℃左右，以1/20000的比例加入EtBr(溴化乙锭)。短期可放于55℃水浴中备用。

(2)将配制好的琼脂糖凝胶倒入插有合适大小的梳子的制胶模具，室温待其凝固。

(3)拔掉梳子，取100-500ng质粒与6×loadingbuffer混匀后，加样。

(4)使用5-7V/cm的电压进行电泳。

(5)电泳结束后，使用LHR凝胶成像系统(Syngene)扫胶，拍照。

1.1.5.3质粒的酶切鉴定

根据质粒的酶切图谱，选择合适的限制性内切酶进行切割。借助酶切后产生的特异性酶切片段的大小来确定所提取的质粒是否正确。一般选择一种使质粒产生线性化片段的限制性内切酶进行单酶切，选择两组使质粒产生两个或两个以上酶切片段的限制性内切酶进行单酶切或双酶切。

1.2细菌人工染色体(BAC)

1.2.1BAC的提取

BAC是以转化的E.coliDH10B菌液的形式由Invitrogen公司提供的。

(1)在含12.5μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上划线，37℃温育12-16h。

(2)每种BAC挑取4个转化菌落，分别加入到含12.5μg/ml氯霉素的LB培养基中。37℃剧烈振摇12-14h。

(3)4℃，4000g，离心5min，收集细菌。小心弃去培养液，用吸头吸净残液。

(4)将沉淀重悬于200μl碱性裂解液Ⅰ(50mMTris·Cl，10mMEDTA，100μg/mlRNaseA)中，轻微振荡使团块分散。

(5)向管中加入200μl碱性裂解液Ⅱ(200mMNaOH，1％SDS)，轻轻翻转离心管数次，室温放置5min。

(6)向管中加入300μl碱性裂解液Ⅲ(3.0MNaAC，pH5.5)，轻轻翻转离心管数次，冰上放置10min。

(7)在微量离心机上以最大转速4℃离心10min。将上清转移至一新的微量离心管中。室温下加入700μl异丙醇，轻轻翻转离心管数次，混匀。

(8)立即在微量离心机上以最大转速离心10min，使核酸沉淀。

(9)用1ml70％乙醇小心漂洗沉淀2次。

(10)离心去除乙醇，室温下干燥10min。将沉淀溶于50μlTEbuffer(pH8.0)中。

(11)测定BAC浓度及纯度，琼脂糖凝胶电泳鉴定BAC的完整性。

1.2.2BAC的鉴定

1.2.2.1BAC的质量检测及琼脂糖凝胶电泳检测

检测方法同1.1.5.1和1.1.5.2。

1.2.2.2BAC的酶切鉴定

选择切割后产生特异带型的限制性内切酶。酶切方法与1.1.5.3类似。

酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳，观察特异性带型。

1.2.2.3BAC的PCR鉴定

在BAC与基因组同源的序列的起始、中间和末端部位各选择一段序列，分别设计引物，进行PCR，鉴定所提取的BAC是否正确。

1.3小鼠H19基因区域打靶载体的构建

1.3.1敲除位点的选择

2004年，TomohiroKono等人(65)将两个不同发育阶段的卵母细胞进行融合，其中一个细胞进行了H19区域长达13kb的敲除，这样的融合胚胎可以以极低的概率(0.6％)生成“单性生殖”的小鼠。此研究为我们提供了较为可靠的线索，即敲除H19及其上游共13kb左右的区域，可有效将卵母细胞转换成为“精子”而在发育中起作用。Leighton,P.A等(69)的研究最先利用此种H19大片段敲除的细胞进行基因印记相关的研究，并详细描述了敲除实验的设计。我们根据文献报道，选取相似的敲除区域，并设计同源臂。

1.3.2同源臂的设计

根据基因打靶载体同源臂设计的原则，分别设计左右两侧同源臂如下：

H19左臂：chr7:142,588,822-142,590,883(2,062bp)

H19右臂：chr7:142,571,298-142,575,207(3,910bp)

1.3.3组装同源臂的酶切位点的设计和选择

打靶载体构建的基本骨架为pCCI18，结构简图如图1A所示，包含左右两条HPRT同源臂和puro-deltaTK正负双元药物筛选元件，及DTA负筛选元件。将pCCI18的左右同源臂替换为H19左右同源臂。因预实验发现单倍体ES细胞在puro药物筛选作用下状态较差，后将打靶载体进一步进行了改造，将puro-deltaTK元件替换为neo筛选元件。Neo元件来源为质粒pL452，见图1B。

1.3.4打靶载体构建

1.4BAC克隆的选择与订购

应用UCSC基因组数据库信息查找小鼠H19基因位置覆盖同源臂区域的合适的BAC克隆，最终确定为RP23-209O22。该克隆包含小鼠基因组序列chr7:142,495,342-142,715,421，全长220,084bp，向BACPAC公司订购该BAC克隆。

1.5pCCI-H19打靶载体的构建

①载体骨架使用pCCI18，将其用PacⅠ+NotⅠ双酶切，胶回收备用。

②左同源臂使用H19-EaLF+H19-LRPa一对引物进行PCR，BAC为模板，使用试剂盒纯化后，用PacⅠ+EagⅠ双酶切，胶回收备用。

③右同源臂使用H19-XhloRF+H19-RRSa一对引物进行PCR，BAC为模板，使用试剂盒纯化后，用XhoⅠ+SalⅠ双酶切，胶回收备用。

④将胶回收后的左侧同源臂与骨架进行连接后，挑选出正确连接的克隆，再进行XhoⅠ单酶切，CIP去磷处理，并与右侧同源臂片段连接，酶切鉴定插入方向。

1.6pCCI-H19-neo打靶载体的构建

将pCCI-H19和pL452分别用AgeⅠ+XbaⅠ双酶切，胶回收所需片段并进行连接。

2.细胞实验

2.1饲养层细胞的制备

2.1.1MEF细胞的分离、传代与冻存

(1)将小鼠合笼后每天早晨(8点以前)检查母鼠精栓。发现精栓的当天为0.5天，第13.5天取材。

(2)将孕鼠引颈处死后，全身浸泡于70％乙醇中。

(3)在超净台中，将小鼠腹部向上，置于一个无菌的10cm培养皿中，依次剪开腹部皮肤和腹膜，暴露出双角子宫。

(4)将双角子宫剪下，移到另一无菌的10cm培养皿，每次用适量PBS洗3遍。

(5)换一把干净的眼科剪和眼科镊，在无菌的10cm培养皿中纵向剪开子宫膜，取出所有胚胎(一只孕鼠)，放于另一含无菌PBS的10cm培养皿中，用PBS洗三次，然后将胚胎分别移入新的无菌的6孔板中，1胚胎/1孔，加适量PBS。

(6)去掉胚胎的头部，内脏和四肢，然后移入另一装有PBS的6孔板中，漂洗后用真空泵小心吸干残余的PBS，换新的PBS洗，直到看不到红色组织。

(7)将得到的胚胎组织移入一个无菌24孔板中，1胚胎/1孔，用剪刀将组织完全剪碎(剪100下左右)，每孔加入1ml0.05％的胰酶，用200μl粗口枪头上下吹打10-20次，37℃20-30min，隔10分钟摇一次，可见胚胎成絮状，说明消化的比较好。

(8)加入1mlM10至每孔中和，用1ml枪头将细胞吹散，移入预先用0.1％gelatin处理的10cm培养皿中，补加培养基至12ml，放于37℃，5％CO2培养，此时细胞标记为P0代。原则上是一个胚胎对应一个10cm培养皿。

(9)第二天早上，更换新鲜培养基。

(10)等细胞长到90％后，将一个10cm的细胞消化后传至一个15cm皿中，此时的细胞标记为P1代，于37℃，5％CO2孵箱中培养。第二天换液，等细胞长到90％后，常规方法消化细胞后准备冻存细胞，冻存前应用77μm的滤器过滤(主要滤掉大块的组织)。用M10重悬细胞，再加入等体积的2×冻存液，混匀后放入冻存盒中，于-80℃冻存(一般一个15cm皿可冻存3个1ml冻存管)，第二天转入液氮(注：在转入液氮前应先做支原体检测)。

2.1.2MEF及DR4细胞扩大培养及处理

(1)培养皿明胶处理

在15cm皿中加入15ml0.1％明胶，使其完全覆盖培养皿底面，室温放置至少30min。至时间，吸去明胶，室温放置使明胶完全晾干(如果急用，也可先吸去明胶，再用PBS洗一遍，备用)。向培养皿中加入24mlM10，放入37℃孵箱。

(2)细胞复苏

从液氮中取出MEF或DR4细胞，于37℃干浴器中快速融化。待液体差不多完全融化时取1mlM10加入冻存管中，将细胞轻柔吹打混匀后迅速转移至装有6mlM10的15ml离心管中，混匀稀释，于270g离心3min。去上清，用1mlM10重悬细胞，吹打5次左右将细胞转移至含有M10的15cm皿中，37℃，5％的CO2环境下贴壁培养。

(3)细胞换液及传代

第二天换25mlM10，观察细胞状态，以后两天换一次液。待细胞铺满培养皿的90％时，先用PBS洗两遍，加4ml0.05％胰酶消化细胞约3min，加5mlM10中和胰酶，用移液器吹打细胞约10次，使细胞完全分散。将细胞悬液移至50ml离心管中270g，离心3min，去上清，用3mlM10重悬细胞，分别取1ml加入3个装有24mlM10的15cm皿中，“米字法”将细胞摇匀后于37℃，5％的CO2环境下贴壁培养。MEF传代的代数不宜过高(不超过6代，一般用P2-P4细胞进行实验)。

(4)γ射线处理细胞

当细胞长满至90％时，15mlPBS洗两遍，4ml胰酶消化3min，5mlM10中和后用移液器吹打细胞使其分散，270g离心3min后用适量M10重悬，计数。再离心，用适量M10(+20mMHEPES)重悬细胞,γ射线(剂量：65Gy)处理细胞。处理后的细胞以270g离心3min后去上清，加M10重悬细胞，再加入等体积的2×冻存液(DMEM:FBS:DMSO＝3:1:1)，混匀后按3×10⁶/ml冻存。做好标记放于冻存盒中，置于-80℃冰箱，如果长期保存(超过3个月)则于24h后转移入液氮罐。

2.1.3饲养层细胞的测试

饲养层细胞的质量是ES细胞培养成败的关键，制备的饲养层细胞经测试合格后方可使用。合格的标准为：

(1)以低密度接种制备好的饲养层细胞，连续观察15-30天，未见细胞分裂。

(2)将ES细胞接种到制备好的饲养层细胞上，连续传3-5代，细胞状态良好，分化的细胞较少。

(3)以500-1000个细胞/孔的密度将ES细胞接种到铺有饲养层细胞的6孔板上，使ES细胞长成单克隆。7-8天后，应达到以下要求：90％以上的克隆形态较好，AP染色阳性，克隆形成率在5-20％。

2.2mES细胞的培养

EG1单倍体小鼠胚胎干细胞株，由中国科学院上海生命科学研究院李劲松研究员惠赠。C57遗传背景，携带Actin-EGFP转基因。

OG3单倍体小鼠胚胎干细胞株，由中国科学院上海生命科学研究院李劲松研究员惠赠。C57遗传背景，携带Oct4-EGFP转基因。

2.2.1血清测试

(1)选择几种不同批次的胎牛血清(FBS)，按10％FBS，15％FBS，30％FBS分别配制ES细胞培养基。

(2)提前1天或2天将饲养层细胞铺到6孔细胞培养板中。

(3)消化处于对数生长期的ES细胞，并进行细胞计数。

(4)按500个细胞/孔的密度将ES细胞接种到铺有饲养层细胞的6孔细胞培养板上。

(5)每隔一天更换一次细胞培养液，培养7天左右，观察克隆形态，进行亚甲基蓝染色，并计数克隆数，计算克隆形成效率。根据实验结果选择适合ES细胞生长的血清。

适合ES细胞生长的血清应是对细胞的毒性比较小，克隆形成能力在5-20％，克隆形态较好，边缘光滑，少有部分分化或者完全分化的细胞。

2.2.2EG-1与OG-3细胞的复苏、传代与冻存

(1)将γ射线照射过的饲养层细胞复苏。按相应的铺板密度将其接种到0.1％gelatin处理的细胞培养板上。铺好的饲养层细胞应在1-7天内使用。

(2)mES细胞的复苏：从液氮罐中取出mES细胞，于37℃迅速解冻，加入5mlES细胞培养基进行稀释，270g，3min离心。弃上清，用ES细胞培养基重悬细胞沉淀。将细胞接种到预先铺有饲养层细胞的细胞培养皿中。37℃，5％CO₂条件下培养。如无特殊说明，ES细胞应每天更换培养基。

(3)mES细胞的传代：待mES细胞密度达到80-85％，应对培养的细胞进行传代。传代前2-4h应更换ES细胞培养基。用PBS洗两遍后，加入0.05％胰酶溶液，置于37℃消化5min，再用M10培养基终止胰酶消化。吹散，离心后，按1:3-1:5的密度将ES细胞接种到预先铺有饲养层细胞的细胞培养板中。37℃，5％CO₂条件下培养。

(4)mES细胞的冻存：将处于对数生长期的mES细胞消化后，离心，用ES细胞培养基重悬细胞沉淀，加入等体积冻存液，轻柔混匀后，冻于-80℃，第二天后可转入液氮中，长期保存。

操作流程基本与2.2.2相同，使用0.05％胰酶，消化5min，离心时间为4min。

2.2.3EG-1与OG-3细胞的分选

(1)常规消化细胞，收集细胞悬液至离心管，270g离心4min，弃上清

(2)加入适量M10，轻柔颠倒离心管数次，漂洗细胞，270g离心4min，弃上清

(3)用37℃预热的M10稀释Hochest33342至10μg/ml，按2×10⁶/ml染液重悬细胞，37℃避光水浴染色30-40min，期间每10-15min摇匀一次。

(4)配制sortingbuffer：DPBS+2％FBS+20mMHEPES+PS(3X)

(5)270g离心4min，弃上清，按1～1.5×10⁷/mlsortingbuffer重悬细胞，过40μm细胞筛，置于冰上备用。

(6)用BDFACSAriaⅡ流式细胞仪进行细胞分选。利用二倍体细胞作为对照确定2n和4n细胞位置，分选处于G0/G1期的1n单倍体干细胞。

(7)分选获得的1n细胞，按1×10⁶/孔的密度接种于铺有MEF的6孔培养板中，培养基加入3xPS，第二天换正常培养基。

2.3质粒DNA电穿孔法转染mES细胞

(1)载体的准备：相关质粒的提取与鉴定、同源重组载体的线性化。

(2)将处于对数生长期的ES细胞消化后，270g，3min离心。

(3)PBS洗一遍，270g，3min离心。重复一次。

(4)细胞计数。按1×10⁷个细胞/800μl的密度，用PBS重悬细胞沉淀。

(5)向细胞悬液中加入10μg转座酶质粒和200ng转座子质粒，混匀后，转入电转杯。

(6)电穿孔：以260V、500μF、800Ω的条件进行ES细胞的电穿孔。

(7)电穿孔后，将ES细胞室温静置2min，加入ES细胞培养基后，静置3min。

(8)将电穿孔后的细胞接种到铺有饲养层细胞的10cm细胞培养皿中。37℃，5％CO₂条件下培养。

(9)培养24h后，可以加G418等药物进行克隆的筛选。如需加Puromycin等杀伤作用较强的药物，可到培养36h后再加药筛选。

2.4mES细胞单克隆的挑取

待克隆长至合适的大小，需要将每个独立的克隆挑取到96孔细胞培养板中进行扩大培养。

(1)挑取克隆前1-2天铺饲养层细胞。

(2)挑取克隆前2-4h将ES细胞克隆和饲养层细胞更换ES细胞培养基。

(3)根据要挑取单克隆的数目，向圆底96孔细胞培养板中加入胰酶溶液(50μl胰酶溶液/孔)。

(4)挑取克隆时，先用PBS洗2遍ES细胞克隆，第二遍无需吸掉液体。将显微镜及台面清洁消毒后，将显微镜物镜调至4×，微量加样器调至4μl。挑取克隆时，Tip头在一侧推动单克隆并顺势将ES细胞克隆吸入。再将ES细胞克隆转移至盛有胰酶溶液的圆底96孔细胞培养板中，吹打数次。

(5)挑完克隆后，将圆底96孔细胞培养板中的单克隆放到37℃消化5-10min。

(6)终止消化后，吹散。将细胞悬液转移至铺有饲养层细胞的平底96孔细胞培养板中。37℃，5％CO₂条件下培养。

(7)待ES细胞克隆密度达80-90％，进行ES细胞的传代。

2.5亚甲基蓝染色

(1)吸掉ES细胞培养皿中的培养基，用PBS洗两遍。

(2)加入1％亚甲基蓝溶液，室温放置15-30min。

(3)用流水冲洗后，加入70％酒精，放到摇床上漂洗。

(4)晾干后，计数阳性克隆数。

2.6干细胞特征的检测

2.6.1碱性磷酸酶染色(AP染色)

(1)以较低的密度接种ES细胞，待其生长至第5天，可以进行AP染色。

(2)弃去ES细胞培养基，用4％多聚甲醛固定1-2min。

(3)弃去固定液，用1×TBST漂洗一遍。

(4)配制反应液：

①取450μl去离子水，平衡至室温。

②配制diazoniumsaltsolution：将10μlSodiumNitriteSolution与10μlFRV-AlkalineSolution混匀，室温放置2min。

③将diazoniumsaltsolution加至去离子水中，混匀后，加入10μlNaphtholAS-BIAlkalineSolution，混匀后使用。

(5)将上述反应液加入到固定过的ES细胞中，室温避光放置30min。

(6)弃去反应液，用1×TBST漂洗一遍。

(7)加入1×PBS，计数阳性克隆数。

(8)加入含有20％甘油的1×PBS，4℃保存。

2.6.2免疫荧光染色

(1)将处于对数生长期的mES细胞差速贴壁后，接种到laminin预处理的细胞爬片上。在37℃，5％CO₂条件下培养。

(2)待mES细胞在细胞爬片上达到合适的密度，用预冷的PBS洗两次。

(3)用4％多聚甲醛，于室温条件下，固定15min。

(4)用PBS洗细胞3次，每次4min。

(5)用0.5％X-100透膜10min。

(6)用3％BSA室温封闭1h。

(7)用一抗稀释液以适当的比例稀释一抗。滴加50μl适当稀释的一抗溶液到细胞爬片上。将细胞爬片放到湿盒内。4℃过夜。

(8)用PBS洗细胞3次，每次4min。

(9)用PBS稀释二抗，滴加100μl稀释的二抗溶液到细胞爬片上，室温孵育1h。

(10)用PBS洗细胞4次，每次5min。

(11)将细胞爬片取出，滴加DAPI染细胞核，并用指甲油封住盖玻片四周。

(12)于正置荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察拍照。

2.6.3实时荧光定量PCR

2.6.3.1培养的细胞总RNA的提取

(1)吸掉ES细胞培养液，加入Trizol裂解细胞。

(2)按200μl三氯甲烷/mlTrizol的比例加入三氯甲烷，振荡混匀后，室温放置5min。

(3)12000g，15min离心。

(4)小心缓慢地用粗口枪头吸取上清至一新的离心管中，加入等体积异丙醇，并充分混匀。

(5)-20℃，放置30min。

(6)12000g，10min离心。

(7)弃上清，用70％乙醇漂洗沉淀，重复一次。

(8)室温干燥10min。加入20-50μl无RNase水溶解RNA沉淀。

(9)测定RNA浓度，进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定所提取RNA的质量和完整性。

2.7拟胚体(EB)形成实验

2.7.1悬滴法

(1)将处于对数生长期的ES细胞消化后，差速贴壁。收集细胞后，进行细胞计数。

(2)将ES细胞稀释到3×10⁴个细胞/ml，转移到加样槽中(以下操作过程中注意经常混匀细胞悬液)。

(3)用12道排枪在15cm细胞培养皿的盖子上点成12×12的点阵，向培养皿中加入适量PBS。将培养皿的盖子扣到培养皿上，于37℃，5％CO₂条件下进行悬滴培养。记为第0天。

(4)至悬滴培养的第2天，用ES细胞培养基将悬滴冲到低吸附10cm培养皿中，进行悬浮培养。

(5)在EB生长的第4、6、8、10天以沉降EB的方式更换培养液。

悬滴法培养形成的EB大小均一，但数目较少，适于观察EB的形态，可以用来评价EB的形成能力。

2.7.2悬浮法

(2)以1-1.5×10⁶个细胞/10cm培养皿的密度接种ES细胞，使用低吸附10cm培养皿，培养基为M15。接种时记为第0天。

(3)每天轻轻摇动培养皿，并在显微镜下观察。在EB生长的第2、4、6、8、10天以沉降EB的方式换液，并取出一部分用Trizol试剂裂解，用于总RNA的提取。

沉降EB：

①用10ml刻度管轻轻地吸取EB悬液至50ml离心管中。

②室温下，静置30min。

③弃去大部分上清，加入新鲜的M15培养基，轻柔重悬EB后，将其接种到低吸附10cm培养皿中进行悬浮培养。

悬浮法培养形成的EB大小不一，但产量较高，适于收集提取EB的RNA和蛋白质等实验。

2.8ES细胞囊胚注射

(1)复苏一支ES细胞，常规培养一代后传代，待细胞长至70％-80％后，提前2h换新鲜的培养基，至时间，常规方法消化，离心。

(2)配囊胚注射缓冲液(DMEM+15％KSR或FBS+20mMHEPES),混匀后0.2μm滤器过滤。

(3)离心后的细胞去上清，用注射缓冲液洗一遍细胞，离心。

(4)弃上清，加1ml注射缓冲液重悬细胞，安全柜中静置5-10min沉降饲养层细胞。

(5)至时间，小心取上层0.5-0.6ml细胞悬液至另一干净冻存管中，做好标记，用封口膜封好后放于冰上，送动物中心进行注射。

2.9卵母细胞胞质内孤雄单倍体胚胎干细胞注射(ICAHCI)

(1)将细胞用Tip头轻吹，使部分细胞克隆从培养皿底部脱落。

(2)将脱落的细胞悬液转移至离心管中，离心，弃上清，加入200-500μl0.25％胰酶，37℃消化4min。

(3)等量培养基中和，吹散细胞，离心，弃上清，加入50μl培养基，送注射。

(4)CD-1小鼠超排卵后收集处于MII期的卵母细胞并用含10mMSrCl2的无钙CZB培养基预先激活20分钟。

(5)利用显微操作装置用持卵针(外径约809m，内径约401lm)吸取MII期的卵母细胞将其固定好，使纺锤体部分固定在大约9点位置上。在透明带上用Piezo打孔，然后用平口注射针(直径约13μm)吸取ahES细胞，并在Piezo破膜后注射进卵母细胞中。重构的胚胎继续用含10mMSrCl2的无钙CZB培养基激活培养3小时，然后转移到KSOM-AA培养基中，在含5％C02的37℃培养箱培养。培养至2-细胞或囊胚阶段的胚胎进行胚胎移植。

3.DNA实验

3.1mES细胞基因组DNA的提取与质量检测

3.1.1生长在96孔细胞培养板上的mES细胞基因组DNA的提取

(1)待生长在96孔细胞培养板上的ES细胞密度达到90％左右，弃去培养基，用PBS洗两遍，每孔加入50μlES细胞裂解液，用胶带封好培养板四周，放入湿盒中，55℃消化过夜。

(2)从55℃拿出湿盒，室温放置20min。

(3)缓慢加入冰冷的无水乙醇/NaCl混合液(现用现配)，每孔120μl，室温放置1h。

(4)将96孔板垂直倒扣于一叠吸水纸上，压重物后，使孔内液体自然流净，此时DNA应粘附在孔底部或侧壁上。

(5)缓慢加入70％乙醇洗涤沉淀，每孔200μl，重复一次。

(6)室温下干燥10-20min，使残存的乙醇挥发。

(7)每孔加入35-50μlTEbuffer(pH8.0)，55℃溶解过夜。

3.1.2生长在24孔细胞培养板上的mES细胞基因组DNA的提取

(1)待生长在24孔细胞培养板上的ES细胞密度达到90％左右，弃去培养基，用PBS洗两遍，每孔加入180μlES细胞裂解液，用胶带封好培养板四周，放入湿盒中，55℃消化过夜。

(2)从55℃拿出湿盒，室温平衡20min。

(3)缓慢加入冰冷的无水乙醇/NaCl混合液(现用现配)，每孔450μl，室温放置1h。DNA将沉淀于孔的底部。

(4)用无核酸酶的玻璃棒缠绕孔底部的DNA沉淀，在70％乙醇中洗两遍。

(5)室温下5-10min，使残存的乙醇挥发。

(6)将玻璃棒缠有DNA的一端插入到EP管中，每管加入150-200μlTEbuffer(pH8.0)。待DNA沉淀从玻璃棒脱离后，将其放于55℃溶解过夜。

3.1.3生长在6孔细胞培养板或10cm细胞培养皿上的mES细胞基因组DNA的提取

(1)待生长在6孔细胞培养板或10cm细胞培养皿上的ES细胞密度达到90％左右，弃去培养基，用PBS洗两遍，加入胰酶溶液消化细胞。

(2)270g，3min离心。PBS洗两遍。

(3)加入300-500μlES细胞裂解液，55℃消化过夜。

(4)缓慢加入1ml冰冷的无水乙醇/NaCl混合液(现用现配)，上下颠倒数次，可见白色DNA沉淀。

(5)加入1ml70％乙醇洗涤沉淀。12000g，2min离心。重复一次。

(6)弃上清，室温下5-10min，使残存的乙醇挥发。

(7)加入200-300μlTEbuffer(pH8.0)，55℃溶解过夜。

3.1.4基因组DNA的质量检测

使用NanoPhotometer^TMPearl(IMPLEN)超微量紫外可见分光光度计测定基因组DNA的浓度及纯度。进行琼脂糖凝胶电泳，分析基因组DNA的完整性。

3.2PCR鉴定基因组完整性及H19敲除区域

在同一体系中使用D5-S/D5-A,delta-H19-S/delta-H19-A两对引物。

94℃预变性5min，94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸40sec，循环30次，72℃10min，8℃停止。

3.3长片段PCR鉴定同源重组

左右两侧分别使用两对引物：H19-l-arm-s/H19-l-arm-a，H19-r-arm-s/H19-r-arm-a。

配制PCR体系：

反应条件：

94℃预变性5min，98℃变性10sec，60℃退火30sec，72℃延伸1kb/min，循环30次，72℃10min，8℃停止。

3.4SouthernBlot鉴定同源重组情况

3.4.1探针的准备

(1)用于Southern杂交的探针必须特异性好，纯度高。因此，要用高保真酶以BAC为模板进行PCR扩增，长度一般为500-1000bp比较适宜。扩增后的片段用试剂盒进行胶回收，并进行浓度测定。

(2)以BAC为模板进行PCR扩增所需探针，体系如下：反应条件：95℃2min；98℃10sec、60℃15sec、72℃40sec、循环35次；72℃7min；4℃停止。

(3)产物鉴定：1.5％琼脂糖凝胶电泳检样。

(4)PCR产物用QIAGEN胶回收试剂盒进行切胶回收；

(5)胶回收后的产物测浓度，电泳检测，于4℃保存备用。

3.4.2基因组酶切及电泳

(1)用某种限制性内切酶(从酶切效率、对基因组甲基化位点是否敏感等角度考虑选择合适的内切酶)将待检测细胞的基因组DNA过夜酶切，一般10μg为宜。

(2)消化结束后先取少量样品进行电泳检测酶切效率，在酶切较完全的情况下用乙醇沉淀浓缩DNA片段，将DNA溶解于25μlTE(pH8.0)。

(3)向DNA中加入6×loadingbuffer，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段(根据目的条带大小选择胶的浓度)，用较低的电压(1.5V/cm)使DNA以较慢的速率迁移。

(4)电泳约8-10小时，待二甲苯青跑至中间位置，溴酚蓝已跑到凝胶的下缘，停止电泳，扫胶。

3.4.3转膜

(1)用荧光尺将凝胶上面的加样孔和最下端的约1cm的溴酚蓝切去，并在凝胶的右上角切去一小三角形(加样孔位置为上)，量取胶的长宽，用铲子将凝胶缓慢平推至去离子水中，洗一遍后，加入适量碱性转移缓冲液(0.4mol/LNaOH,1mol/LNaCl)使其没过胶表面，放于水平摇床，以最慢速度摇20min(盖保鲜膜)。至时间，用手掌轻轻固定胶，将缓冲液弃去，重复一次。

(2)在变性过程中，根据量取胶的长和宽剪好尼龙膜和滤纸。正电荷尼龙膜较凝胶每边大0.5cm，用干净的剪刀切去膜的一角，与凝胶切下的一角相一致；再切3张每边比凝胶长1cm的厚滤纸，然后切5张与胶长宽一致的厚滤纸，滤纸及膜应逐张放到碱性转移液中浸湿。

(3)在桌面上铺上适当长度的Labsoaker，上面铺上保鲜膜，防止起褶皱并检查有无渗漏。然后逐张将3张较长的厚滤纸放置在保鲜膜上，用吸管赶走气泡；然后将凝胶从变性液中取出并倒转使凝胶底面向上，放在厚滤纸的中央，用刻度吸管或玻璃棒赶走气泡，用封口膜围绕凝胶周围；然后将浸湿的膜放于凝胶上，用吸管赶走气泡；将5张短滤纸逐张放于膜上，用吸管赶走气泡；上面放置一叠略小于短滤纸的纸巾(5-8cm高)，在纸巾顶部放一块玻璃板然后用500g重物压实。最后四周用保鲜膜封好，以防水分流失。

(4)DNA转移需12小时以上，逐层去掉膜上的重物及吸水纸，用镊子夹住滤纸弃掉，再用平头镊子将膜慢慢夹起，见二甲苯青和溴酚蓝已完全转至膜上，胶压缩凝固成一薄层，透亮而干净，说明转膜较好。

(5)将膜靠近胶的一面(膜的正面)用铅笔标记，室温晾5min，再将其用干净厚滤纸夹住，放于80℃烘箱2h(提前用温度计测试温度)，将转移到膜上的DNA固定。随后，可以将膜放于干净的厚滤纸中，并用锡箔纸包好，保存在室温干燥的环境中。

3.4.4探针标记及杂交

(1)提前将同位素室的杂交炉调至65℃，并用温度计测试，干浴器(0.6ml)调至37℃，准备好可加热到100℃的电饭锅，用monitor检测室内环境，及检测杂交管的放射性，确定无放射性方可使用。用高压过的去离子水将杂交管洗两遍，并检查是否漏水。轻柔混匀杂交液，检查有无沉淀，若有沉淀可放置杂交炉几分钟，每个杂交管中倒入15ml(大的杂交管)，放于杂交炉内65℃预热。

(2)配制3×SSC，倒入玻璃瓷盘中，将膜夹住一角放入(DNA面朝上)，使其自上而下浸湿约2min，夹于几层厚滤纸中间，备用。取75μl鲑鱼精DNA(10mg/ml)于一个EP管中，100℃5min(干浴)后迅速放于冰上，使之成单链，然后加至15ml杂交液中，终浓度为50μg/ml。

(3)使用TaKaRa探针标记试剂盒进行探针标记。首先在在0.6mlPCR小管中加入以下混合液：ddH₂O10μl、RandomPrimer2μl、探针1μl、λ-HindIII1μl。

以上混合液(记为溶液Ⅰ)95℃变性3min，迅速置于冰上。

(4)向预热的杂交液中加入75ul处理好的鲑鱼精DNA，混匀。将膜卷起(DNA面朝内),插入杂交管中至中间位置，均匀晃动杂交管，使膜尽量展开，避免膜与杂交管之间的气泡，65℃预杂交15-30min。

(5)在溶液Ⅰ中加入以下试剂：10×Buffer2.5μl、dNTPMixture2.5μl、Klenow1μl、[α-³²P]dCTP(挡板后加)5μl。

4.ES细胞中期染色体制备

(1)待mES细胞生长至对数期，加入秋水仙素，终浓度为0.2μg/ml，37℃继续培养2-4h。

(2)用PBS将细胞洗两遍，加入0.05％胰酶溶液，置于37℃，消化10min。

(3)终止消化后，270g，3min离心，弃上清。

(4)用PBS洗一遍细胞，270g，3min离心，弃上清，留下大约0.5mlPBS，轻柔重悬细胞。

(5)加入0.5％KCl溶液5ml，缓慢轻柔地混匀，避免出现大的细胞团，37℃温育15min。

(6)加入几滴预冷的固定液(甲醇：冰醋酸＝3:1)，混匀后，270g，5min离心。弃上清，留下大约0.5ml上清，轻柔重悬细胞。

(7)加入5ml新鲜配制的固定液，轻柔混匀细胞，室温放置20min。

(8)270g，5min离心。弃上清，留下大约0.5ml上清，轻柔重悬细胞。重复1-2次。

(9)将细胞悬液以一定的高度滴在冰冷的载玻片上，室温过夜老化。

(10)用Giemsa染液扣染5min，自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗，晾干。

(11)使用中性树胶封片。

(12)干燥后，放于油镜下观察。

5.微阵列比较基因组杂交(arrayCGH，aCGH)

5.1基本原理

微阵列比较基因组杂交(aCGH)是检测基因组DNA片段扩增或缺失的有效方法。它通过在一张芯片上同时杂交不同荧光素标记的实验样品和参照样品来检测实验样品相对于参照样品的DNA拷贝数变化。它可以直观地反映出基因组DNA在整个染色体组的扩增或缺失。

我们使用的小鼠CGH芯片是Agilent公司的SurePrintG3MouseCGHMicroarrayKit,4x180K芯片。

5.2实验方法

5.2.1基因组DNA的制备：使用GenomicDNAPurificationKit

(1)将处于对数期的ES细胞消化后，差速贴壁去除饲养层细胞，PBS洗一遍，加入600μlNucleiLysisSolution，55℃消化3-4h，直至无可见细胞团。

(2)加入3μlRNase溶液，混匀。37℃孵育30min。

(3)室温放置5min。

(4)加入200μlProteinPrecipitationSolution，以最大速度漩涡振荡20s。冰上放置5min。

(5)16000g，5min离心。

(6)轻柔吸取上清至一新的1.5ml离心管中，加入等体积异丙醇。颠倒混匀，直至DNA沉淀可见。

(7)16000g，1min离心。

(8)弃上清。加入1ml70％乙醇洗涤沉淀。重复一次。

(9)室温干燥10-15min。

(10)加入150-200μlTEbuffer(pH8.0)，放于55℃溶解。

(11)测定DNA浓度及纯度。进行琼脂糖凝胶电泳，测定DNA的完整性。

5.2.2杂交实验

将基因组DNA样品送于博奥公司(BioCapitalIncorporation)，进行aCGH杂交实验。实验过程为：

(1)gDNA质检：检测纯度及完整性。

(2)gDNA标记：使用Cy3或Cy5荧光素标记。

(3)标记产物的沉淀与纯化。

(4)芯片杂交：将不同荧光素标记的实验样品和参照样品共杂交。

(5)芯片清洗和扫描。

5.3数据分析

数据分析流程见图2。

6.CRISPR-Cas9基因组编辑技术

6.1CRISPR切割载体的设计和构建

6.1.1载体设计

(1)我们使用的通用表达载体为px330，其结构见图3。

(2)设计原则：

在需要进行切割的基因组区域，选取如下形式的序列：G(N……20)GG。若首位不是G，可在合成oligo时人为添加一个G。向公司订购合成oligo，合成结构为：BbsⅠ粘性末端+G(N……19)。同时合成正反两条链，溶解至100uM备用。合成序列情况见表1

表1.gRNA相关引物合成表

6.1.2载体构建

(1)将px330用BbsⅠ酶切后，胶回收主要大片段备用。

(2)将每对引物退火形成含有BbsⅠ粘性末端的双链结构。10μl体系，内含退火PBbuffer1μl，S/A引物各1μl(100uM)95℃5min后，关闭PCR程序自然降至室温，备用。

(3)连接：10μl体系，内含载体50ng，插入片段与载体摩尔比10:1，T4Buffer1μl,T4连接酶1μl,16℃过夜。

(4)将连接产物转化，挑取克隆进行测序鉴定。

6.2测量分析(Surveyorassay)

6.2.1实验原理：

CRISPR切割产生DNA双链断裂后，会发生NHEJ，在断裂点造成随机的插入或缺失。此时将野生型基因组DNA与切割后修复的DNA相对应区域的PCR产物进行互补配对，即可形成不完全匹配的异源双链，T7EN1可识别此种不匹配的位点并将其切断，形成2条较小的片段。而未被CRISPR切割的DNA则无法形成不匹配双链，不能被T7EN1识别切开，仍保持一个DNA片段。

6.2.2实验方法

(1)电转染ES细胞，每1×106细胞为一个电转体系，使用invitrogen的Neon电转染仪，加入一种构建的CRISPR质粒3μg，同时加入pPB-puro0.5μg，用于瞬时药物筛选。参数为1400V，10ms，3pulses。

(2)每个电转体系接种于1x3.5cm培养皿，12h后加puro1.0ug/ml，筛选36h后，提取基因组DNA。

设计不同引物，将切割靶点周围～300bp的片段扩增出来，相邻的靶点可使用同一对引物，见表2。

表2

(3)每个PCR扩增区域(每对引物)做一个对照，用野生型细胞DNA做模板。实验组用转染相应gRNA的细胞DNA做模板。

(4)给每个PCR反应编号：(1)sgRNA-1(2)sgRNA-2(3)sgRNA-1/2-C(4)sgRNA-3(5)sgRNA-3-C(6)sgRNA-4(7)sgRNA-4-C(8)sgRNA-5(9)sgRNA-5-C(10)sgRNA-6(11)sgRNA-6-C(12)sgRNA-7(13)sgRNA-8(14)sgRNA-7/8-C，每个编号的PCR反应做2个50μl体系，并使用试剂盒纯化后混合。

(5)每个实验组取300ngPCR产物，与其对应的野生型对照300ng混合，每个野生型对照自身取600ng作为对照组。设置如下(按PCR反应编号)：(1)+(3)、(2)+(3)、(3)、(4)+(5)、(5)、(6)+(7)、(7)、(8)+(9)、(9)、(10)+(11)、(11)、(12)+(14)、(13)+(14)、(14)，共14个T7EN1反应体系。

(6)退火体系：30μl，内含：退火PBbuffer3ul、DNA(1或2种)共600ng，ddH2O，另加矿物油25ul/管。

(7)沸水浴5min，取出置于漂浮板上，放入盛有沸水的保温桶内，加盖过夜后进行T7EN1酶切，电泳观察条带情况。

实验结果

1.单倍体ES细胞的培养、鉴定及分选

本论文中我们使用了两株孤雄单倍体ES细胞系：EG-1(有Actin-EGFP转基因)和OG-3(有Oct4-EGFP转基因)。EG-1采用无血清培养体系，培养基为K20L+2i。OG-3采用血清培养体系，培养基为E15L+2i。这两株细胞的培养都需要饲养层细胞DR4-MEF的支持。

1.1单倍体ES细胞基本特性的鉴定

在正式实验开展之前，我们对EG-1与OG-3细胞系的基本特性进行了鉴定。在本实验室的培养系统中，两个细胞系均能在DR4-MEF饲养层细胞的支持下进行连续传代培养，细胞呈克隆样生长，克隆饱满，边缘清晰，表面光滑，具有典型的ES细胞形态。由于EG-1、OG-3细胞中分别存在Actin-EGFP和Oct4-EGFP转基因，在荧光显微镜下细胞克隆呈现绿色荧光。碱性磷酸酶(AP)染色是检测ES细胞干细胞特征的重要实验，EG-1和OG-3AP染色均呈阳性，提示其具有典型的干细胞特征。随后，我们对这两株细胞分裂中期的染色体数目进行计数，发现大部分细胞含有20条染色体，提示细胞呈单倍体状态。单倍体细胞所占比例：EG-1为53.1％，OG-3为56.1％。最后，我们将EG-1细胞系进行二倍体囊胚注射，生成了较高嵌合率的嵌合体，说明此细胞系可参与个体发育过程中多种细胞的形成，具有多向分化的潜能。

1.2单倍体ES细胞的分选

由于单倍体ES细胞具有自发二倍体化的特性，该细胞必须在连续传代过程中不断进行流式分选，才能保证单倍体的比例维持在较高水平。我们对培养的EG-1细胞进行的流式分析表明，培养的细胞在33代时，单倍体细胞(1n峰)所占的比例约为28.7％，随着传代过程中不断地进行流式分选富集，当细胞培养至38代时，单倍体细胞所占的比例上升到47％。类似地，OG-3细胞也可以在传代过程中不断被分选富集。值得注意的是，EG-1细胞二倍体化的速率快于OG-3细胞。

2.H19印记基因的敲除

2.1使用同源重组方法敲除H19基因

为检测传统打靶方法敲除H19基因的效率，我们首先在二倍体ES细胞系JM8A3中使用同源重组方法敲除H19基因区域。JM8A3细胞系为C57BL/6遗传背景，与我们的单倍体ES细胞系一致。本课题组之前完成的两个基因打靶实验(Kdm6a基因的条件性基因敲除及Tamoxifen诱导型cre在Rosa26位点的敲入)均使用此细胞系完成，打靶效率分别为79.2％和21.9％。

我们首先以本课题组的pCCI18打靶载体为基本骨架，构建pCCI-H19打靶载体。左、右侧同源臂均使用细菌人工染色体(BAC,RP23-209O22)进行扩增。扩增时，将EagⅠ和PacⅠ限制性内切酶酶切位点加到左侧同源臂上，SmaⅠ和XhoⅠ位点加到右侧同源臂上。然后将左侧同源臂进行EagⅠ和PacⅠ双酶切，并克隆到NotⅠ和PacⅠ酶切后的pCCI18骨架上。克隆产物再使用XhoⅠ酶切，并与SmaⅠ和XhoⅠ酶切后的右侧同源臂连接。构建成功的pCCI-H19载体进行NotⅠ酶切时产生12557bp大小的片段，进行EcoRI酶切时产生7697bp和4860bp两个片段。

随后，我们将构建好的pCCI-H19打靶载体以NotI酶切线性化后以电转染的方式导入JM8A3细胞系(1×10⁷cells)，使用puromycin(1.5μg/ml)筛选5.5天后，出现1264个阳性克隆。我们挑取了288个克隆，并使用内参基因D5鉴定基因组DNA的提取质量，使用ΔH19(P5-P6)引物检测H19基因区域是否被敲除(单等位基因或双等位基因)。如果H19基因的单等位基因敲除，相对于内参基因D5被扩增出的条带亮度，ΔH19(P5-P6)引物扩增出的条带亮度降低。如果发生H19基因的双等位基因敲除，ΔH19(P5-P6)引物将扩增不出条带或只有很弱的条带(可能有少量MEF基因组DNA存在)。然后用H19左右同源臂的鉴定引物(P3-P4和P1-P2)进行PCR，发生H19基因打靶的克隆应能够扩增出符合预期大小的条带。在DNA提取质量较好的206个克隆中，最终能扩增出条带的克隆有3个，打靶效率为1.5％。

2.2在单倍体ES细胞中使用CRISPR-Cas9方法辅助同源重组敲除H19基因

随后，我们使用同源重组的方法在单倍体ES细胞系EG-1中进行H19区域的基因打靶，但经过多次尝试，并未得到任何阳性克隆。在实际操作中我们发现EG-1对puromycin药物的作用较为敏感，使用1×10⁷细胞进行打靶仅能得到数十个克隆，其克隆形成效率不足以支撑后续的高通量筛选实验。基于以上结果，我们将H19打靶载体上的PGK-puro-deltaTK药物筛选元件替换为PGK-neo筛选元件(pCCI-H19-neo)，并对构建的载体进行了酶切鉴定，改用G418进行药物筛选，以期得到足够数量的抗性克隆。同时结合CRISPR-Cas9基因组编辑技术，在同源臂内侧设计两个Cas9切割位点，用于提高同源重组的效率(图4)。我们在左右同源臂内侧位置分别设计了4个Cas9切割位点，并通过测量分析鉴定了各个靶点的切割活性，最终选用左侧的sgRNA-7和右侧的sgRNA-4位点进行后续实验(图5)。随后，我们在EG-1和OG-3中分别进行了借助CRISPR-Cas9的基因打靶。我们首先将pCCI-H19,Cas9-sgRNA-4和Cas9-sgRNA-7质粒以电转染的方式导入EG-1和OG-3中，然后使用G418筛选7天，EG-1细胞长出250个G418抗性的克隆，OG-3细胞长出300个克隆。我们在EG-1细胞长出的克隆中挑取了168个克隆，左右同源臂全部阳性的克隆共50个，阳性率为29.8％；在OG-3细胞长出的克隆中挑取了96个克隆，左右同源臂全部阳性的克隆32个，阳性率为33.3％。由此可见，结合使用CRISPR-Cas9技术后，单倍体ES细胞中H19敲除的效率由0％上升到了30％左右。说明CRISPR-Cas9技术可以提高单倍体ES细胞中同源重组的发生效率。

2.3阳性克隆基本性质的鉴定

我们将部分阳性克隆进行流式分选时发现大部分克隆由于打靶过程中较长时间未分选已完全二倍体化。尽管如此，一些克隆中仍存在少量具有1n峰的单倍体ES细胞。我们使用流式分选的方法将这些单倍体细胞分选出来，并在连续传代培养的过程中富集单倍体ES细胞。因OG-3细胞系二倍体化速度较EG-1慢，更利于单倍体的富集，故选用OG-3进行后续实验。接着，我们从OG-3阳性敲除克隆中挑选状态较好的2个克隆(H19^△1/H19^△2)，进行基本性质的鉴定。

2.3.1Southernblot进一步确认打靶正确性

我们在基因组H19敲除区域的上下游分别设计杂交探针Probe-R。当用BglⅡ酶切基因组DNA后再进行Probe-R探针杂交，野生细胞产生11.6kb的条带，H19敲除的细胞产生8.7kb的条带(图4)。Southernblot结果表明，H19^△1和H19^△2克隆的基因组DNA经酶切杂交后均产生符合预期大小的条带，表明发生了正确的打靶(图6)。

2.3.2流式分选建立单倍体ES细胞系

我们将阳性克隆进行流式分选，并将分选得到的单倍体细胞(流式分选中处于1n峰的细胞)继续培养10天左右，再次进行流式分选，经过2-3次不断流失分选富集单倍体细胞，H19基因敲除的细胞可以被成功地建立起单倍体ES细胞系。(图7)。

2.3.3中期染色体计数

为分析上述流式分选富集的两株单倍体H19^△细胞的染色体数目，我们将分选得到的细胞培养4-5天后，加入秋水仙素处理，制备中期染色体分裂相。我们计数了40个中期染色体分裂相，发现10个染色体数目以20条为主，13个染色体数目以40条为主，表明建立的H19^△细胞是单倍体细胞系。以40条染色体为主的细胞是单倍体细胞二倍体化的结果。

2.3.4比较基因组杂交(Comparativegenomichybridization,CGH)

为精确分析基因组范围基因拷贝数有无变异，我们对H19敲除的两株细胞系H19^△1和H19^△2进行CGH阵列实验。OG-3基因组DNA作为本实验的共同参照。两株细胞系H19^△1和H19^△2的基因组DNA都与OG-3基因组DNA进行杂交。结果表明，两株H19^△细胞系基因组整体上没有发生大片段的扩增或缺失，只出现了几个小区段的变异(表3，7)，这些变异是细胞培养过程中正常出现的现象。其中H19^△1基因组变异更少，故选用H19^△1进行ICAHCI实验。

表3CGH阵列实验检测H19^△单倍体ES细胞的基因组完整性。

2.3.5潜在脱靶位点检测

为分析CRISPR-Cas9是否对细胞产生了脱靶效应，我们使用在线分析工具(http://crispr.mit.edu/)预测了sgRNA-4和sgRNA-7可能存在的潜在脱靶位点。根据网站给出的脱靶位点预测情况，我们制定如下标准：评分score>0.5且错配碱基数≤4，且位置在编码基因内部，列为潜在脱靶位点。我们发现sgRNA-4不存在符合条件的潜在脱靶位点，sgRNA-7存在8个符合条件的潜在脱靶位点(表4)。我们随后对阳性克隆H19^△1和H19^△2的8个潜在脱靶位点进行PCR及测序分析，结果显示，在评分最高的8个潜在脱靶位点上，未发现任何突变，这表明CRISPR-Cas9未对两株H19敲除的单倍体ES细胞产生脱靶效应(表5)。

表4.sgRNA-7潜在脱靶位点预测情况。

表中列出了所有score>0.5的位点，黄色表示符合筛选条件的8个位点。

表5.潜在脱靶位点的鉴定。

2.3.6干细胞标志物检测

我们对培养的H19^△1和H19^△2单倍体ES细胞克隆进行免疫荧光实验，检测干细胞标志物的表达，发现这些细胞高表达干细胞标志物Oct4，Sox2，Nanog和Ssea1，具有典型的干细胞特征，提示其具有正常ES细胞的自我更新能力(图9)。

2.3.7分化能力检测

为分析H19^△1和H19^△2单倍体ES细胞的体外分化能力，我们对两株细胞系进行了EB(拟胚体)形成实验，结果表明，在悬浮培养条件下，这两株细胞可以聚集形成典型的EB结构，具有多向分化的能力(图10)。

2.3.8嵌合体形成实验

为分析H19^△单倍体ES细胞的体内多向分化能力，我们将H19^△1细胞系进行二倍体囊胚(ICR)注射，可以生成嵌合体小鼠，进一步证明H19敲除细胞系具备全能性(图11)。

2.3.9印记基因表达量检测

我们使用RT-qPCR方法检测H19^△1和H19^△2两株单倍体ES细胞中H19，Igf2，Snrpn，Grb10四个印记基因的表达量，发现敲除H19基因区域后，H19不表达，同时Igf2表达量大幅上升，符合预期表达，这是因为H19与Igf2存在互为印记的现象。同时另外两个印记基因Snrpn(父源表达)和Grb10(母源表达)的表达量无明显变化，证明细胞印记状态整体保持稳定(图12)。

2.3.10印记基因甲基化状态检测

为进一步分析H19^△1和H19^△2单倍体ES细胞中印记基因的甲基化状态有无变异，我们对两个印记基因Snrpn和Gtl2的启动子区域进行甲基化检测，结果显示印记状态与精子保持一致，说明H19^△单倍体ES细胞的印记基因具备精子的甲基化状态(图13)。与精子相比，OG-3细胞Gtl2基因的启动子区未被甲基化的位点增多，这可能与检测时OG-3细胞的培养代数较高(P65)有关。

3.利用H19敲除的单倍体胚胎干细胞构建半克隆(semicloned,SC)小鼠

在鉴定了H19^△1/H19^△2两株细胞的基本性质后，我们选取H19^△1细胞系进行了显微注射实验，即卵母细胞胞质内孤雄单倍体胚胎干细胞注射(intracytoplasmicahES-cellinjection,ICAHCI)。发育的囊胚产生的绿色荧光表明H19^△1细胞参与了胚胎形成(图14A)，这是因为这株细胞来源于OG-3，有Oct4-EGFP转基因。本次实验使用的H19^△1细胞为56代，是较高代数的细胞。我们总共注射了120个卵细胞，对80枚二细胞期的胚胎进行移植，最终获得了3只发育完全的胎儿，其中2只活到成年并可以生育后代(表6，图14B-14E)，这些SC小鼠有H19基因被敲除(图14F)，且以孟德尔遗传的方式传递给后代小鼠(图14G)。另外1只在出生2天后死亡，但不是由生长阻滞导致的。在本次实验中，我们未得到任何发育阻滞型的小鼠，证明H19敲除后，ahESCs的印记状态趋于稳定，不再影响发育；另一方面，3只健康可育小鼠的出生，证明了我们的细胞系在较高代数的状态下仍较好地保留了“精子样”的活性，可以完成小鼠胚胎的重构。对半克隆小鼠的印记状态分析显示，其印记状态与野生型小鼠保持一致(图15)。

表6.H19^Δ1ahESCs进行ICAHCI发育效率表

讨论

在本研究中，我们利用CRISPR-Cas9辅助的高效同源重组技术，在小鼠孤雄单倍体ES细胞(ahESCs)中进行了H19基因及其上游DMR的敲除。H19敲除(H19^Δ)的单倍体ES细胞高表达干细胞标志物，能够分化形成EB及生成嵌合体小鼠，表明其具备多潜能性。H19敲除后其表达量下降为零，Igf2的表达量大幅上升，其它印记基因的表达和甲基化状态无明显变化，表明H19敲除不会对整个基因组的印记状态产生影响，H19^ΔahES细胞的印记状态已被稳定到了类似精子的状态。当将其进行ICAHCI后，得到了3只健康的SC小鼠，没有出现发育迟滞现象，其中2只活至成年期并能繁育后代。然后，我们使用Cre重组酶删掉H19^ΔahES细胞系中的PGK-neo药物筛选元件，得到新的经遗传修饰的孤雄单倍体ES细胞系(H19^Δ-neoΔahES)，并将其再次进行了ICAHCI注射，产生了发育正常的小鼠后代。这说明我们建立的H19^ΔahES细胞系是一种新的生物资源，它可以用来模拟精子的功能高效地生成可育的后代小鼠，又可以被遗传操作高效地制作基因修饰小鼠。

1.提高单倍体ES细胞中H19基因的打靶效率及生成后代SC小鼠的效率

在本研究中，我们旨在敲除H19基因及其上游DMR区域长度为13kb的片段，以抑制H19表达并增强Igf2表达。LeightonPA等人的研究结果表明，在二倍体小鼠ES细胞中使用同源重组的方法对该区域进行基因打靶敲除效率很低，约为0.5％⁷⁰。本研究中我们首先使用同源重组的方法对一株C57BL/6小鼠来源的二倍体ES细胞JM8A3进行了H19基因敲除效率的测试，发现发生正确打靶的效率约为1.5％。这与同期在JM8A3细胞中使用同源重组方法进行的其它基因打靶相比，效率是很低的。例如，在该细胞系中Kdm6a基因的条件性基因敲除效率约为79.2％，Tamoxifen诱导型cre在Rosa26位点的敲入效率约为21.9％。随后，我们使用同源重组的方法在ahES细胞EG-1中进行H19基因打靶，多次尝试后未得到阳性克隆，打靶效率为0％。为提高H19基因在ahES细胞中的敲除效率，我们借助了CRISPR-Cas9这一高效的基因组编辑技术，并结合同源重组，进行H19基因区域的敲除。借助该方法，H19基因在EG-1和OG-3ahES细胞中的敲除效率分别上升到了29.8％和33.3％，而且不存在脱靶效应。这表明CRISPR-Cas9这一技术结合同源重组方法应用于基因敲除具有潜在的价值，尤其针对传统打靶敲除效率很低或者难以敲除的基因。与单纯同源重组方法相比，CRISPR-Cas9技术提高打靶效率的原理在于，Cas9在H19基因敲除区域上下游识别sgRNA(位于同源臂内侧)，产生DNA双链切口，进而使得该切口附近的DNA与打靶载体上同源臂区域的重组效率大大提高。CRISPR-Cas9辅助同源重组的方法将来可能在人ES细胞的遗传操作及疾病治疗上有重要应用。

2004年，TomohiroKono等人发现H19DMR敲除的卵子与正常卵子重构形成的胚胎可以生成可育的后代小鼠，这也就是所谓的孤雌生殖⁶⁵。虽然生成小鼠的效率很低(0.6％)，这已经是极大的突破，说明改变基因的印记状态可以实现单性生殖。在我们的研究中，当将ahES细胞的H19基因及其DMR敲除后，生成的后代SC小鼠均健健可育，没有出现发育阻滞现象。此外，H19基因敲除解决了高代数ahES细胞实现不了的生成健康SC小鼠的问题。这说明H19基因敲除大大提高了ahES细胞生成健康可育的后代SC小鼠的能力。2007年，ManabuKawahara等人通过数代的繁殖，在H19敲除的基础上又加入了Dlk1-Dio3印记区域的敲除，进一步提高了后代小鼠产生的效率⁶⁶。在本实验中我们并未对Dlk1-Dio3区域进行修饰，其SC小鼠产生效率已经有了明显的提高，不再出现发育阻滞的胎儿。关于Dlk1-Dio3与胚胎发育的关系尚需进一步研究。

在本研究中，我们建立的H19^ΔahESC中H19和Igf2的表达得到了修正，它可以模拟精子的功能，高效地获得遗传修饰的SC小鼠。我们对H19^ΔahESCs进行了ICAHCI实验，成功得到了三只SC小鼠，并且三只小鼠是同窝出生，并未出现发育阻滞的现象，证明H19^ΔahESCs具有良好的代替精子支持个体发育的能力，我们的策略成功地解决了ahESCs印记状态不稳定的问题，出生的SC小鼠发育正常率达到100％，可以作为构建遗传修饰小鼠的良好资源。由于实验规模所限，我们尚未进行大量的ICAHCI实验，而且SC小鼠的产生与细胞本身的状态、假孕鼠的状态、小鼠饲养环境等因素均有关系，与之前的研究相比，我们产生健康SC小鼠的效率已经显示出极大的优势。而H19^Δ1-neoΔSC小鼠的产生，进一步证明了此细胞系进行遗传操作后仍能够长期保持基因组印记稳定性与“精子”活力，为以后的应用提供了可靠的证据支持。因此，H19^ΔahESCs在制作基因修饰动物时有重要的应用价值，它不但有无限增殖与自我跟新的能力，能够进行遗传操作，又可以模拟精子的功能，直接注射到卵母细胞浆中，高效地获得杂合突变的小鼠。与传统二倍体ES细胞相比，它无需经过嵌合体生殖系传递步骤，直接生成目标小鼠，逾越了生殖系传递的随机性与不可控性。另外，在某些无法产生嵌合体的动物中，如灵长类动物猴，二倍体ES细胞则完全无法用于遗传修饰动物模型的构建。大鼠⁷以及食蟹猴⁸孤雌单倍体ES细胞系的成功建立为基于单倍体ES细胞的遗传修饰动物研究开创了新的途径和思路。但由于此技术方法仍然基于ES细胞，它将来要应用到人的研究存在一定的伦理问题。

2.H19基因敲除的ahESCs在生殖医学上的潜在应用

在生殖医学领域，胚胎植入前遗传学诊断(PreimplantationGeneticDiagnosis,PGD)一直是研究的热点。PGD的常规操作是：从受精的胚胎中提取极少量的细胞，并提取DNA，利用PCR等技术确定其中的相应遗传信息，进而判断胚胎所携带基因的状况。虽然PGD技术的发展已经越来越完善，但在提取细胞时，仍不可避免地对胚胎造成机械性的损伤。目前男性遗传病的治疗仍面临较大的困难。精子属于终末分化细胞，无法在体外继续分裂，这使得直接对精子进行遗传修饰变得不可能。基于精原干细胞(SSC)的研究在一定程度上将有利于男性不育的治疗。对SSC进行基因修饰后可以将修饰的基因传递给后代，但该修饰必须要移植入内源性生精缺陷的小鼠睾丸内才能分化形成精子⁷⁷，这存在安全性的问题。基于H19基因敲除的ahESCs的成功建立为男性遗传病的治疗提供了新的方法。此细胞系具有类似精子的印记状态，可以模拟精子的功能，高效地生成后代。因此对男性亲本有遗传性疾的情况，为避免后代获得遗传病，可以先在体外培养的H19^ΔahESCs进行基因修正，再将修饰完成的ahES细胞模拟精子直接注入卵细胞中完成胚胎的重构。此方法一方面避免了对胚胎的损伤，另一方面克服了PGD需要多个备选胚胎、依赖于孟德尔遗传概率的局限性，所有重构胚胎均为100％健康的胚胎。另外，基于ahES细胞进行的治疗则完全在体外进行，先挑选被正确修正的的胚胎，再将其移植入病人体内，由于胚胎移植技术已在临床广泛开展，这在一定程度上避免了伦理学及安全性的问题。H19敲除的ahES细胞系的成功建立是再生医学领域的一个里程碑，它将为男性不育症及遗传病的治疗带来希望。总之，H19敲除的ahESCs在一方面在制作基因修饰动物模型中有重要的使用价值，另一方面，它又将为男性遗传病的治疗带来希望，推动生殖医学的发展。虽然基于H19敲除的ahESCs的研究目前还停留在基础科研阶段，随着表观遗传学和发育生物学研究的不断深入，我们将获得更多有价值的研究成果，从而真正实现从科研到临床的转化，为“精准医疗”的发展做出贡献。

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Claims

1.一种使用单倍体干细胞高效建立遗传修饰动物模型的方法，其包括：

a)使用同源重组敲除孤雄单倍体胚胎干细胞的H19基因；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤a)中使用CRISPR-Cas9方法辅助同源重组以高效敲除孤雄单倍体胚胎干细胞的H19基因。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于在步骤a)中使用含有PGK-neo药物筛选元件的构建体，并在步骤b)中使用G418药物筛选敲除H19基因的单倍体胚胎干细胞。

4.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于在步骤a)中将打靶构建体pCCI-H19、Cas9-sgRNA-4和Cas9-sgRNA-7质粒通过CRISPR-Cas9方法以电转染的方式导入单倍体胚胎干细胞中以敲除H19基因，优选地敲除H19基因及其上游DMR。

5.根据前述权利要求所述的方法，其中步骤b)筛选和鉴定正确敲除H19基因的单倍体胚胎干细胞的方法选自以下方法中的一个或多个或其组合：用于验证打靶正确性的Southernblot，用于确定基因组范围基因拷贝数变异的比较基因组杂交，潜在脱靶位点鉴定，检测干细胞标志物Oct4、Sox2、Nanog和SSEA1的表达，拟胚体形成实验，嵌合体小鼠实验，检测印迹基因H19、Igf2表达量。

6.根据前述权利要求所述的方法，其中进一步包括通过流式分选将正确敲除H19基因的孤雄单倍体胚胎干细胞分选出，并在连续的传代中富集所述孤雄单倍体胚胎干细胞的步骤。

7.根据前述权利要求所述的方法，所述动物选自不包括人的哺乳动物，优选为啮齿类或灵长类哺乳动物，更有优选为小鼠、大鼠、食蟹猴，最优选为小鼠。

8.根据前述权利要求所述的方法，所述孤雄单倍体胚胎干细胞选自EG-1或OG-3小鼠单倍体胚胎干细胞，优选OG-3小鼠单倍体胚胎干细胞。

9.H19基因敲除的小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞系在建立遗传修饰动物模型中的应用。

10.H19基因敲除的小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞系在用于治疗雄性动物不育或遗传病的试剂盒中的应用。