CN103642828A - 一种基因敲入重组载体及其制备方法和小鼠模型制备方法 - Google Patents
一种基因敲入重组载体及其制备方法和小鼠模型制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于基因敲入的重组载体，其中，所述重组载体包含DNA片段结构IL17A-IRES-luc；其中，IL17A为白细胞介素17A的编码基因，IRES为内部核糖体进入位点，luc为分泌型荧光素酶的编码基因。本发明还提供了该基因敲入重组载体的制备方法及用该重组载体制备的小鼠模型，该小鼠模型能够用来方便地通过检测血液或尿液中分泌型荧光素酶的表达从而对IL17A基因的表达情况进行检测；不需要荧光显微镜等复杂设备；分泌型荧光素酶是通过荧光素酶催化底物腔肠素的氧化反应而发光，不需要激发光，所以荧光背景远低于GFP荧光，且检测灵敏度更高，背景更干净，实验结果也更加准确。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的涉及一种小鼠模型制备方法及基因敲入重组载体。
背景技术
基因敲入(Knockin)是根据实验要求在目的基因位置引进特定的突变或外源基因的技术，例如在目的基因上引入点突变(模拟人类遗传疾病模型)；或将报告基因(如EGFP，mRFP，mCherry等)通过同源重组的方式引入目的基因的特定位点，从而可以通过报告基因的表达跟踪目标基因的表达并研究基因的表达谱。
IL17A（白介素-17A）是细胞因子IL-17家族成员之一，在宿主防御和炎症过程中起关键作用。
目前针对IL17A基因表达进行监测的模式小鼠是IL17A-GFP基因敲入小鼠模型，通过检测小鼠体内T细胞和小肠细胞中绿色荧光蛋白的表达情况来分析IL17A基因的表达。此种模型只能通过可检测绿色荧光的小动物活体成像仪或处死小鼠后提取组织和细胞后用荧光显微镜观察才可检测，对实验仪器和设备要求较高，操作不够方便灵活，且荧光灵敏度低。因此有必要开发一种可通过体外检测分析IL17A基因表达情况的模型小鼠的制备方法。
Gluc（Gaussia luciferase）是分离于夏威夷水域的一种海洋桡脚类动物（Gaussia princeps）的新型荧光素酶。荧光素酶可以催化荧光素(luciferin)氧化成氧化荧光素（oxyluciferin），在荧光素氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定荧光素氧化过程中释放的生物荧光。通过报告基因载体，Gaussia luciferase可用于哺乳动物细胞表达，并可以分泌到细胞外。与其他荧光素酶相比，使用Gaussia luciferase作为报告基因有更多的优势：能分泌到细胞外、灵敏、稳定、无需ATP、分子量小，可通过检测实验动物血液和尿液中荧光素酶活性，间接监测体内的生理过程。与监测体内过程常用的分泌型报告基因SEAP（secreted alkalinephosphatase)相比，Gluc具有实验时间短，线性范围宽和灵敏度高等优点。
发明内容
本发明的目的是克服现有的用于检测IL17A基因表达的模式小鼠中存在的上述缺陷，获得可以通过检测血液或尿液中分泌型荧光素酶的表达从而方便地对IL17A基因的表达情况进行检测的基因敲入模型小鼠及其制备方法。
为了达到上述目的，本发明提供了一种用于基因敲入的重组载体，其中，所述重组载体包含DNA片段结构IL17A-IRES-luc；
其中，IL17A为白细胞介素17A的编码基因，IRES为内部核糖体进入位点，luc为分泌型荧光素酶的编码基因。
本发明还提供了一种重组载体的制备方法，其中，该方法包括将DNA片段结构IRES-luc导入表达载体pIL17A-GFP中。
本发明还提供了一种可以简便的检测体内IL17A基因表达的小鼠模型的制备方法，该方法包括将本发明所提供的重组载体转染进C57BL/6胚胎干细胞中并筛选获得阳性重组胚胎干细胞，用所述阳性重组胚胎干细胞获得F1代杂合子小鼠，使雌雄F1代杂合子小鼠交配获得F2代小鼠，并在F2代小鼠中筛选出携带有所述重组载体的纯合子IL17A-luc模型小鼠。
本发明还提供了一种检测本发明所制备的小鼠模型中IL17A基因表达情况的方法，该方法包括对小鼠模型的血液和/或尿液中分泌型荧光素酶的含量进行检测。
本发明还提供了一种IL17A-luc模型小鼠在与IL17A基因表达相关的研究中的应用。
本发明还提供了一种IL17A-luc模型小鼠在筛选可诱导IL17A基因表达的药物中的应用。
本发明还提供了一种IL17A-luc模型小鼠在筛选可抑制IL17A基因表达的药物中的应用。
通过本发明所提供的方法所制备的基因敲入模型小鼠具有C57BL/6遗传背景，小鼠模型的建立过程中不需要进行多次的回交，缩短了模型建立的时间。
此外，利用本发明所提供方法制备的模型小鼠具备以下优点：（1）该模型小鼠能够用来方便地通过检测血液或尿液中分泌型荧光素酶的表达从而对IL17A基因的表达情况进行检测；（2）不需要荧光显微镜等复杂设备；（3）分泌型荧光素酶是通过荧光素酶催化底物腔肠素的氧化反应而发光，不需要激发光，所以荧光背景远低于GFP荧光，且检测灵敏度更高，背景更干净，实验结果也更加准确。
本发明所提供的模型小鼠能够广泛的应用于与自身免疫性和炎性疾病相关：如哮喘、风湿性关节炎、多发性硬化、银屑病、移植排斥及炎症性肠病等疾病的研究，以及相关药物的筛选等方面。
附图说明
图1为根据本发明一种实施方式的重组载体的质粒图谱。
图2为对根据本发明一种实施方式的重组载体进行酶切鉴定的结果图。
图3为对根据本发明一种实施方式获得的F1代杂合子小鼠的基因鉴定。结果图。
图4为根据本发明一种实施方式获得的F2代纯合子小鼠的基因鉴定结果图。
图5为荧光酶标仪对IL17A-Gluc小鼠Gluc表达的鉴定。
图6为利用IL17A-Gluc模型小鼠进行药物筛选的应用效果。
具体实施方式
本发明提供了一种用于基因敲入的重组载体，其特征在于，所述重组载体包含DNA片段结构IL17A-IRES-luc；
其中，IL17A为白细胞介素17A的编码基因，IRES为内部核糖体进入位点，luc为分泌型荧光素酶的编码基因。
本发明所提供的载体可以用于检测小鼠体内IL17A基因的表达情况。
在本发明所提供的载体中，IRES（internal ribosome entry site），是一段非翻译RNA核酸序列，其作用是折叠成类似于起始tRNA的结构，使得连接在其后的基因可以表达。IRES可存在于RNA病毒、DNA病毒、哺乳动物、植物以及酵母中。优选的情况下，本发明所述的IRES具有SEQID NO：2所示的序列。
本发明所提供的重组载体中包括荧光素酶的编码基因，所述荧光素酶可以选自由Gaussia荧光素酶、Gaussia-Dura荧光素酶、Cypridina荧光素酶、Green Renilla荧光素酶和Red Firefly荧光素酶所组成的组。
优选的情况下，所述分泌型荧光素酶为Gaussia荧光素酶，所述分泌型荧光素酶的编码基因的碱基序列如SEQ ID NO:3所示。
在本发明中，所述重组载体优选是将所述DNA片段结构IRES-luc导入表达载体pIL17A-GFP（载体相关文献信息：Peters A,Pitcher LA,et al.″Th17cells induce ectopic lymphoid follicles in central nervous system tissueinflammation.″Immunity.2011,35(6):986-96.）中得到的；表达载体pIL17A-GFP从5’末端至3’末端的结构包括：5’端IL17A基因的同源臂序列，GFP基因序列，转录终止序列SV40 polyA，5’端Cre酶识别位点LoxP，PGK启动子序列，新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，转录终止序列polyA，3’端Cre酶识别位点LoxP，3’端IL17A基因的同源臂序列，负筛选标记基因（白喉毒素A亚基基因）的编码核苷酸序列。
其中，DNA片段结构IRES-luc插入表达载体的位点位于5’端IL17A基因的同源臂序列和转录终止序列SV40polyA元件之间，替换GFP基因序列。
优选的，本发明所述的重组载体具有SEQ ID NO：1中所示的序列。
本发明还提供了一种重组载体的制备方法，其中，该方法包括将DNA片段结构IRES-luc导入表达载体pIL17A-GFP中。例如可以根据IRES、luc及载体中的克隆位点设计引物，通过PCR法得到IRES和luc序列，纯化回收IRES和luc序列并通过PCR连接获得DNA片段结构IRES-luc，再利用双酶切方法将DNA片段结构IRES-luc插入表达载体中的克隆位点XhoI和XmaI之间，获得重组载体。
在本发明的一个具体的实施方式中，所述制备方法可以包括以下步骤：根据IRES、Gluc及载体中的克隆位点设计引物，通过PCR法从质粒pT7CFE1和pMCS-Gluc中扩增得到IRES和Gluc序列，纯化回收IRES和Gluc序列并通过PCR连接获得DNA片段结构IRES-Gluc，再利用双酶切方法将DNA片段结构IRES-Gluc插入表达载体中的克隆位点XhoI和XmaI之间，获得重组载体。
在本发明中，PCR反应所用的试剂可以为本领域常规使用的PCR反应试剂。
在本发明中，可以利用本领域常用的DNA片段回收方法例如DNA片段回收试剂盒对PCR反应产物进行纯化回收。
在本发明所提供的方法中，可以利用本领域常规的质粒提取试剂盒或提取试剂获得基因敲入载体质粒。
出于简化回交步骤的目的，在本发明的优选实施方式中优选使用了具有C57BL/6（Cheng,J.,A.Dutra,et al.(2004).″Improved generation ofC57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media.″Genesis 39(2):100-4.）小鼠遗传背景的C57BL/6胚胎干细胞，但是，在不脱离本发明的构思的前提下，利用其他种类的胚胎干细胞制备模型小鼠的方法同样应当视作没有脱离本发明的保护范围，例如利用具有129小鼠遗传背景的小鼠的胚胎干细胞制备模型小鼠的方法。
在本发明所提供的方法中，将基因敲入重组载体的质粒转染进入胚胎干细胞的方法没有特别的限制，可以为慢病毒转染法或电转染法，优选采用电转染的方式将基因敲入载体导入胚胎干细胞中，在本发明中，对胚胎干细胞的培养、转染以及阳性克隆的筛选条件没有特别的限制，可以按照本领域常规的方法进行，具体的培养、转染以及阳性克隆筛选可以包括：在筛选获得具有新霉素抗性的neo基因敲入载体的C57BL/6胚胎干细胞后，可以通过PCR和Southern Blot筛选出正确重组有敲入载体的打靶胚胎干细胞。
在本发明所提供的方法中，可以通过囊胚显微注射的方式将所述打靶胚胎干细胞注射入BALB/c小鼠的囊胚的胚泡中，并将注射有打靶胚胎干细胞的囊胚植入假孕KM小鼠的子宫中获得嵌合体小鼠，其中，所述显微注射、囊胚的获得方法、假孕小鼠的获得方法以及囊胚的植入方法均可以按照《小鼠胚胎操作实验手册（第三版）》中的方法进行。
本发明中，假孕小鼠分娩获得的嵌合体小鼠为F0代小鼠，通过检验含有黑色毛发的小鼠来确认携带有基因敲入载体基因（C57BL/6为黑色鼠，BALB/c为白色鼠）的F0代嵌合小鼠。并通过使F0代嵌合小鼠与野生型C57BL/6小鼠交配得到F1代杂合子小鼠。通过基因型检测确认携带有重组载体的F1代杂合子小鼠。并通过使雌雄F1代杂合子小鼠交配得到F2代小鼠，通过基因型检测筛选得到纯合子条件性基因敲入IL17A-luc模型小鼠。
在本发明中，可以通过以下步骤对基因敲入IL17A-luc模型小鼠进行鉴定：
从本发明所提供的基因敲入IL17A-luc模型小鼠提取并分离CD34+T细胞，培养于Th17细胞诱导分化培养液中，培养3天后用荧光素酶检测试剂盒和荧光酶标仪检测分泌型荧光素酶的表达情况；也可对模型小鼠提取外周血和或尿液，利用荧光素酶检测试剂盒和荧光酶标仪对后代转基因小鼠进行检测，通过检测分泌型荧光素酶的表达来确定是否有IL17A基因的表达。
本发明还提供了一种检测本发明所制备的小鼠模型中IL17A基因表达情况的方法，该方法包括对小鼠模型的血液和/或尿液中分泌型荧光素酶的含量进行检测。
在本发明所述的检测方法中，对荧光素酶含量的检测方法没有特别的限制，可以采用本领域常规的血液和尿液中分泌型荧光素酶检测方法进行，例如可以通过分泌型荧光素酶检测试剂盒完成检测。
根据本发明所提供的方法制备获得的IL17A-luc模型小鼠可以应用于与IL17A基因表达相关的研究。
根据本发明所提供的方法制备获得的IL17A-luc模型小鼠可以应用于筛选可诱导IL17A基因表达的药物。
根据本发明所提供的方法制备获得的IL17A-luc模型小鼠可以应用于筛选可抑制IL17A基因表达的药物。
以下通过实施例对本发明进行进一步的说明，在以下实施例中：
C57BL/6小鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；表达载体由Biocytogen公司提供；（载体相关文献信息：Peters A,Pitcher LA,et al.″Th17cells induce ectopic lymphoid follicles in centralnervous system tissue inflammation.″Immunity.2011,35(6):986-96.）；转染试剂盒LipofectamineLTX&Plus Reagent购自Invitrogen，货号为15338-100；
Top10感受态细胞购自Tiangen公司，货号为CB104-02；
AscI酶购自NEB，货号为R0558S；
EcoRV酶购自NEB，货号为R0195S；
KpnI酶购自NEB，货号为R0142S；
AflII酶购自NEB，货号为R0520S；
NdeI酶购自NEB，货号为R0111S；
SacI酶购自NEB，货号为R0156S；
BglII酶购自NEB，货号为R0144M；
MfeI酶购自NEB，货号为R0589S；
FseI酶购自NEB，货号为R0588S；
XmaI酶购自NEB，货号为R0180S；
XhoI酶购自NEB，货号为R0146S；
IRES基因DNA序列为从pT7CFE1质粒（购自Fisher，货号88860）中PCR得到；
Gluc基因DNA序列为从pMCS-Gluc质粒（购自Fisher，货号16146）中PCR得到。
实施例1
本实施例用于说明本发明所提供的基因敲入载体的构建方法。
1、分别通过PCR反应扩增IRES的编码序列和荧光素酶Gluc的编码序列，所用引物见表1。
（1）、引物：
表1
| 引物名 | 核酸序列 |
| IRES-F | 5’-atctctcgaggttaacgaattccgccccccccccctaacgtta-3’ |
| IRES-R | 5’-gaactttgactcccatggttgtggccatattatcatcgtgtttttcaaag-3’ |
| Gluc-F | 5’-ctttgaaaaacacgatgataatatggccacaaccatgggagtcaaagttc-3’ |
| Gluc-R | 5’-acatcccgggcttagtcaccacc-3’ |
其中，
引物对IRES-F和IRES-R用于从pT7CFE1质粒扩增IRES基因的编码核苷酸序列；
引物对Gluc-F和Gluc-R用于从pMCS-Gluc质粒扩增Gluc基因的编码核苷酸序列。
引物对IRES-F和Gluc-R用于扩增并连接IRES和Gluc序列。其中，IRES-F引物5’末端含有XhoI酶切位点，用于IRES-Gluc片段与表达载体pIL17A-GFP的5’端同源臂连接；Gluc-R引物3’末端含有XmaI酶切位点，用于IRES-Gluc片段与表达载体pIL17A-GFP的3’端SV40pA连接。
（2）、反应体系
（3）、循环参数条件：
95℃ 5min；
95℃ 30sec，56℃ 30sec，72℃ 2min，共30个循环;
72℃ 5min;
4℃ 10min.
2、用DNA片段回收试剂盒纯化回收PCR产物，分别获得IRES片段和Gluc片段。再用PCR方法连接IRES片段和Gluc片段；
用IRES-F和Gluc-R引物通过PCR反应扩增DNA片段结构IRES-Gluc；引物序列中已含有XhoI和XmaI限制性酶切位点，用于与表达载体pIL17A-GFP进行酶切和连接；
纯化回收酶切后的IRES-Gluc片段并与pIL17A-GFP表达载体在16℃条件下连接孵育2h获得重组载体。
3、重组载体的扩增
将重组载体转化入大肠杆菌TOP10中，涂平板并挑取单菌落接种于含50mg/L卡纳霉素的LB培养基中，37℃振荡培养16小时，8000g离心10min收集菌体。使用Tiangen去内毒素大提试剂盒提取质粒。
4、重组载体的鉴定
用限制性内切酶SacI、AscI、KpnI、EcoRV、AflII、NdeI对重组载体进行酶切，而后进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶上显示的电泳结果如图2所示（其中：M为DNA Marker，分子量标记），根据电泳结果图中条带的大小初步判断重组载体是否构建正确，将酶切阳性的条带切胶回收质粒并进行测序再将酶切结果正确的质粒进行测序验证，结果表明获得了目的重组载体的质粒，将其命名为pIL17A-IRES-Gluc，该质粒的谱图见图1。
实施例2
本实施例用于说明本发明提供的小鼠模型的制备方法：
（一）、胚胎干细胞的培养、转染以及阳性克隆筛选：
1、胚胎干细胞的培养
在铺有饲养细胞的培养皿中培养C57BL/6胚胎干细胞，并置于37℃、5%CO2、饱和湿度的孵育箱培养。所用培养基的成分如下表2：
表2
| 培养基组成成分 | 体积 |
| Knockout DMEM | 500ml |
| FBS | 90ml |
| MEM NEAA | 6ml |
| L-谷氨酰胺 | 6ml |
| ESGRO LiF | 60μL |
| β-巯基乙醇 | 600μL |
2、电穿孔转染
将长满细胞的100mm培养皿从CO2培养箱中取出后，吸走100mm平皿的干细胞培养基。每皿沿壁加入5ml PBS，轻轻摇晃后吸出，清洗两遍。每皿沿壁加入1.5ml 0.25%胰酶，铺匀后置37℃孵育箱消化3min。每皿沿壁加入3.5ml ES培养基终止消化，充分吹打15次/皿，使大部分细胞都处于单个悬浮状态。将细胞悬浮液加入50ml离心管，轻轻吹打混匀。计数细胞。（台盼蓝40μL，细胞悬液20μL，稀释倍数：3倍）取出1.2×107的细胞悬液加入50ml离心管中。1200rpm、4℃离心5min。吸走上清，轻轻拍散细胞，加入20ml冰浴的PBS后重悬混匀。1200rpm、4℃离心5min。将高速离心（12000rpm，5min）除菌的线性化DNA悬液转入1.5ml无菌EP管中，弃50ml离心管上清，用手轻轻拍散细胞，加入适量冰浴的无酚红RPMI，将细胞重悬混匀后转入含DNA的1.5ml无菌离心管中，轻轻混匀。冰水浴5min，转入冰浴的4mm电击杯中。280V，500μF进行电击，记录电击时间10ms。将电击杯冰水浴5min后常温静置5min。将电击杯内的细胞悬液转入含40ml胚胎干细胞培养基的50ml离心管中，轻轻吹打混匀，沿壁均分至4个含MMC饲养细胞的100mm平皿。“8”字水平轻摇平皿使细胞均匀分布于皿底上。标记后37℃、5% CO2孵育箱培养。20小时后更换G418培养基。
3、正负筛选
转染细胞培养48小时后，在培养液中加入G418进行正负筛选。当出现细胞集落时，将细胞集落挑出，转移到96孔板内。待细胞长满后依次转移到48孔、24孔、12孔、6孔及60mm平皿中，其中部分细胞抽提DNA，用于PCR和Southern杂交检测外源基因的整合情况部分细胞冷冻保存。
4、囊胚的制备
打开C57BL/6小鼠腹腔，用精细的镊子在靠近子宫颈的部位抓住，用锋利的小剪刀在子宫颈的位置剪开，向上拉伸子宫牵引洗膜，用锋利的小剪刀将子宫角壁上的洗膜剥离，然后在输卵管和卵巢之间剪开，保证输卵管和子宫之间的连接完整；把子宫放到35mm的组织培养基上，滴一滴M2培养液；在靠近子宫输卵管连接部的子宫上端插入26号针头，朝子宫颈的方向冲洗子宫角，同样方法冲洗另一侧子宫角；将针头插入到子宫颈内朝子宫角方向冲洗一侧子宫角，同样方法冲洗另一侧子宫角；用移卵管收集胚胎并在几滴新鲜的M2培养液中洗涤几次，以去除杂质，然后将胚胎转移到平衡好的培养滴中，37℃、5%CO2下培养。
5、囊胚的显微注射
按照《小鼠胚胎操作实验手册（第三版）》中的方法进行胚胎的显微注射，并将注射后的囊胚移植入假孕小鼠的子宫中发育，获得14只F1代小鼠。
6、阳性克隆的鉴定
对6只F1代小鼠的鼠尾基因组DNA进行PCR分析，用琼脂糖凝胶电泳鉴定其是否为转基因阳性小鼠。基因型鉴定所用引物如表3所示。
表3
其中，
引物对WT-F和WT-R用于扩增野生型小鼠IL17A基因序列，用以验证重组载体是否正确插入基因组IL17A位点。如果重组载体插入正确，则电泳显示无PCR扩增条带；如果重组载体未插入，则电泳显示有扩增条带。
循环参数条件为：
95℃ 5min；
95℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 30sec，共35个循环；
72℃ 10min；
4℃ 10min.
引物对NEO-F和WT-R用于扩增重组载体NEO元件部分序列，用以验证插入小鼠基因组IL17A位点的载体序列是否完整。如果载体序列完整，则电泳显示有扩增条带；如果载体序列不完整，则电泳显示无扩增条带。
循环参数条件为
95℃ 5min；
95℃ 30sec，58℃ 30sec，72℃ 30sec，共35个循环；
72℃ 10min；
4℃ 10min.
6只小鼠中，共有2只PCR鉴定为阳性转基因小鼠。2只小鼠的PCR鉴定结果见图3A和图3B。图3中，2和5为阳性F1代杂合子小鼠。
（二）、获得F2代纯合子pIL17A-Gluc小鼠
使雌雄F1代阳性杂合子小鼠交配获得6只F2代小鼠，用PCR方法对F2代小鼠进行基因检测。PCR引物序列如表4所示。
表4
其中，
引物对WT-F和WT-R用于扩增野生型小鼠IL17A基因序列，用以验证重组载体是否正确插入基因组IL17A位点。如果重组载体插入正确，则电泳显示无PCR条带；如果重组载体未插入，则电泳显示有PCR条带。
循环参数条件为：
95℃ 5min；
95℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 30sec，共35个循环；
72℃ 10min；
4℃ 10min.
引物对Hom-F和Hom-R用于扩增重组载体NEO元件部分序列，用以验证插入小鼠基因组IL17A位点的载体序列是否完整。如果载体序列完整，则电泳显示有扩增条带；如果载体序列不完整，则电泳显示无扩增条带。
循环参数条件为
95℃ 5min；
95℃ 30sec，58℃ 30sec，72℃ 30sec，共35个循环；
72℃ 10min；
4℃ 10min.
由图4A和图4B可见，转基因小鼠1有WT-F/WT-R扩增条带，而没有Hom-F/Hom-R扩增条带，说明为野生型小鼠；转基因小鼠2有WT-F/WT-R扩增条带，也有Hom-F/Hom-R扩增条带，说明为杂合子小鼠；转基因小鼠3、4、5和6没有WT-F/WT-R扩增条带，而有Hom-F/Hom-R扩增条带，说明为纯合子小鼠。转基因小鼠3、4、5和6已经携带纯合的外源敲入基因。已获得了具有C57BL/6背景的IL17A-Gluc模型小鼠。
测试例1
本测试例用于验证IL17A-Gluc模型小鼠中Gluc基因表达的鉴定。
从实施例2获得的IL17A-Gluc模型小鼠体内收集T细胞，用磁珠细胞分离法（MACS）分离CD4+T细胞并用培养基以1：4的体积比稀释后，用Th17细胞诱导分化培养基培养在96孔板中（可诱导IL17A基因表达）。培养3天后用荧光酶标仪检测Gluc表达。如图5所示（5A：Gluc表达量与细胞数目的关系；5B：Gluc表达量取log值后与细胞数目的关系），说明IL17A-Gluc模型小鼠体内的CD4+T可表达Gluc，且Gluc表达水平随CD4+T细胞数目的增加而增加。
测试例2
本测试例用于说明IL17A-Gluc模型小鼠在筛选可抑制IL17A基因表达的药物中的应用。
取6周龄实施例2获得的IL17A-Gluc模型小鼠，用胶原诱导风湿性关节炎后（参考文献Kelchtermans H,et al.,“Effector mechanisms ofinterleukin-17 in collagen-induced arthritis in the absence ofinterferon-gamma and counteraction by interferon-gamma”,Arthritis Res Ther.2009;11(4):R122），静脉注射化合物AC-55649和Cortexolone，24hrs后取外周血2.5ul，用荧光酶标仪检测Gluc表达。如图6所示（1.空白对照组；2.空白对照组；3.AC-55649组；4.Cortexolone组。），说明化合物AC-55649和Cortexolone可抑制IL17A基因表达。本测试例说明，检测Gluc信号可以用于筛选可抑制IL17A基因表达的药物。
以上测试例的结果表明，按照本发明所提供方法制备的IL17A-Gluc模型小鼠具备以下特点：（1）可以通过对荧光素酶Gluc的表达情况来确认小鼠体内IL17A基因的表达情况；（2）可以用于筛选可诱导或抑制IL17A基因表达的药物。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (13)
1.一种用于基因敲入的重组载体，其特征在于，所述重组载体包含DNA片段结构IL17A-IRES-luc；
其中，IL17A为白细胞介素17A的编码基因，IRES为内部核糖体进入位点，luc为分泌型荧光素酶的编码基因。
2.根据权利要求1所述的重组载体，其中，所述重组载体是将DNA片段结构IRES-luc导入表达载体pIL17A-GFP得到的。
3.根据权利要求1或2所述的重组载体，其中，所述分泌型荧光素酶选自由Gaussia荧光素酶、Gaussia-Dura荧光素酶、Cypridina荧光素酶、Green Renilla荧光素酶和Red Firefly荧光素酶所组成的组。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其中，所述分泌型荧光素酶为Gaussia荧光素酶。
5.根据权利要求2或4所述的重组载体，其中，所述表达载体pIL17A-GFP从5’末端至3’末端的结构包括：5’端IL17A基因的同源臂序列，转录终止序列SV40 polyA，5’端Cre酶识别位点LoxP，PGK启动子序列，新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，转录终止序列polyA，3’端Cre酶识别位点LoxP，3’端IL17A基因的同源臂序列，负筛选标记基因的编码核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其中，所述DNA片段结构IRES-luc导入表达载体pIL17A-GFP的位点位于5’端IL17A基因的同源臂序列和转录终止序列SV40 polyA元件之间。
7.根据权利要求1、2、4或6所述的重组载体，其中，所述重组载体具有SEQ ID NO：1所示的碱基序列。
8.权利要求1-7中任意一项所述的重组载体的制备方法，其中，该方法包括将DNA片段结构IRES-luc导入表达载体pIL17A-GFP中。
9.一种小鼠模型制备方法，该方法包括将权利要求1-7中任意一项所述的重组载体转染进C57BL/6胚胎干细胞中并筛选获得阳性重组胚胎干细胞，用所述阳性重组胚胎干细胞获得F1代杂合子小鼠，使雌雄F1代杂合子小鼠交配获得F2代小鼠，并在F2代小鼠中筛选出携带有所述重组载体的纯合子IL17A-luc模型小鼠。
10.一种检测根据权利要求9所述的制备方法制备获得的小鼠模型中IL17A基因表达情况的方法，该方法包括对小鼠模型的血液和/或尿液中分泌型荧光素酶的含量进行检测。
11.一种IL17A-luc模型小鼠在与IL17A基因表达相关的研究中的应用。
12.一种IL17A-luc模型小鼠在筛选可诱导IL17A基因表达的药物中的应用。
13.一种IL17A-luc模型小鼠在筛选可抑制IL17A基因表达的药物中的应用。
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